ES2339798T3

ES2339798T3 - Materiales y metodos para la administracion minimamente invasiva de una composicion fluida que contiene celulas.

Info

Publication number: ES2339798T3
Application number: ES05848586T
Authority: ES
Inventors: Helen Marie Nugent; Elazer Edelman; Steve Bollinger
Original assignee: Pervasis Therapeutics Inc
Current assignee: Pervasis Therapeutics Inc
Priority date: 2004-12-08
Filing date: 2005-12-06
Publication date: 2010-05-25
Anticipated expiration: 2025-12-06
Also published as: ATE474608T1; IL212764A0; US20080125858A1; CA2589871A1; DE602005022481D1; IL183784A0; AU2005314226B2; JP2012176260A; IL209574A; CN103055350B; ES2490610T3; EP1824526B1; US20080119946A1; JP5674256B2; WO2006062962A2; AU2005314312B2; CA2589597C; JP2008532565A; AU2005314263A1; EP2184077B1

Abstract

Composición fluida que comprende una matriz biocompatible y células para su uso en el tratamiento de un sitio lesionado o enfermo en la luz interior de una estructura anatómica tubular en la que dicha composición fluida se suministra mediante inyección percutánea a una superficie extraluminal en o adyacente a o en la proximidad del sitio lesionado o enfermo en una cantidad eficaz para tratar el sitio lesionado o enfermo.

Description

Materiales y métodos para la administración mínimamente invasiva de una composición fluida que contiene células.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades cardiovasculares representan más de 50 millones de muertes en el mundo y un millón de muertes en los Estados Unidos cada año. Aproximadamente 1,5 millones de procedimientos se realizan cada año en los Estados Unidos en un intento por aliviar las lesiones arteriales obstructivas que se originan espontáneamente a partir de estas enfermedades. Estos procedimientos incluyen la angioplastia con balón asistida por láser, aterectomía, endoprótesis endovasculares e injertos de derivación, para nombrar unos pocos. Las arteriopatías aceleradas tras tales procedimientos limitan la eficacia a largo plazo de la angioplastia, los injertos de derivación vascular e incluso el trasplante de órganos. La pérdida de integridad endotelial, la trombosis oclusiva, el espasmo y la migración y proliferación de células del músculo liso que dan como resultado la hiperplasia de la íntima tipifican estas arteriopatías. Por ejemplo, la reestenosis conduce a lesiones arteriales obstructivas en del 20 al 50% de tales pacientes. En el plazo de tres a seis meses después de la angioplastia coronaria, más de un tercio de los pacientes requieren una intervención adicional, otra angioplastia o incluso cirugía de derivación. Los dispositivos de aterectomía no son mejores; puesto que el número de pacientes sometidos a este procedimiento aumenta, las tasas de reestenosis han subido desde el 10 hasta el 47%. El uso de endoprótesis endovasculares ha sido también un tanto decepcionante en este sentido. Un estudio reciente notifica una tasa del 35% de reestenosis además de aproximadamente un 5% de pacientes que sufrieron una complicación aguda, tal como un cierre repentino en el plazo de los primeros días después de la inserción.

Se han observado problemas similares en pacientes que se someten a cirugía de derivación vascular. El tiempo de vida medio de un injerto de interposición aortocoronario de vena safena es de sólo siete años. El diez por ciento de todos los injertos de este tipo se ocluyen en el plazo de las primeras semanas tras la cirugía. Al año y a los cinco años, el 20 y el 35% de los injertos están ocluidos, respectivamente. Las fístulas arteriovenosas en pacientes sometidos a diálisis presentan la misma patología, limitando la eficacia de la hemodiálisis.

La marca distintiva de las arteriopatías aceleradas, tal como la reestenosis, es la proliferación exuberante de células del músculo liso y la deposición de una gran cantidad de matriz extracelular generada por estas células. Ahora ha resultado evidente que tanto la aterosclerosis nativa como las arteriopatías aceleradas tras intervenciones mecánicas comparten un acontecimiento patológico inicial común, la pérdida de integridad y función de las células endoteliales.

La monocapa endotelial reviste la pared arterial y sirve como un biorregulador doble de la fisiología vascular. El endotelio proporciona integridad estructural al vaso sanguíneo formando una barrera continua, permeable de manera selectiva, no trombogénica entre la sangre circulante y la pared arterial. Sin embargo, se aprecia cada vez más que el endotelio también produce y suministra productos que controlan el flujo sanguíneo, el tono de los vasos, la trombosis oclusiva, la activación plaquetaria, la adhesión y agregación, la adhesión leucocitaria, la infiltración monocítica, y la migración y proliferación de células del músculo liso. Puesto que los mitógenos de las células del músculo liso son ubicuos dentro de la pared arterial, es la presencia de un endotelio intacto lo que mantiene el vaso sanguíneo normal en un estado quiescente. Tras el daño o la eliminación del endotelio, también se eliminan los compuestos secretados por el endotelio, y se activa una secuencia de acontecimientos que conduce a la proliferación y migración incontroladas de células del músculo liso, dando como resultado lesiones arteriales obstructivas.

Muchas intervenciones clínicas empleadas actualmente para tratar enfermedades cardiovasculares, incluyendo angioplastia coronaria, colocación de endoprótesis coronarias y aterectomía, pueden llevarse a cabo usando procedimientos quirúrgicos cerrados no invasivos. Estas estrategias de intervención endovascular no invasiva deben ir acompañadas de un modo de suministro endovascular mínimamente invasivo similar de un material terapéutico al sitio de la intervención vascular para tratar el endotelio objetivo lesionado o enfermo resultante.

Además, los métodos actuales de suministro de materiales terapéuticos por vía endovascular se basan en la administración de los materiales a la superficie luminal interior del vaso sanguíneo. Sin embargo, la administración de materiales o agentes terapéuticos a la superficie luminal interior proporciona sólo un beneficio transitorio a un endotelio objetivo lesionado o enfermo, puesto que el contacto con la sangre circulante limita la eficacia y duración de la actividad.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar materiales para el suministro no invasivo o mínimamente invasivo de una formulación terapéutica de células a un sitio extraluminal o perivascular en, adyacente a o en la proximidad de un sitio del endotelio luminal lesionado o enfermo y reducir posteriormente la incidencia de trombosis oclusiva, reestenosis, hiperplasia de la íntima y otras secuelas clínicas asociadas con las intervenciones vasculares o enfermedades cardiovasculares. El documento US-A-8 723 131, se refiere a un material de injerto de médula ósea compuesto que comprende una matriz implantable biocompatible porosa que se enriquece con una población de células progenitoras y un material de coágulos en forma de un coágulo sanguíneo, médula ósea, gel de plaquetas o un material de coágulos de fibrina, estando dicha matriz compuesta de una superficie biocompatible porosa. El documento US-A-2003/0163192, se refiere a un método para el tratamiento de una arteria enferma que comprende el suministro de una composición fluida al sitio vascular afectado en condiciones en las que la composición forma in situ una película sólida que se adhiere a la pared vascular, aislando así el sitio vascular del flujo sanguíneo sistémico. El documento US-A-2002/0090398, da a conocer una composición fluida que contiene una matriz de un polímero biocompatible y un agente bioactivo, mediante lo cual dicha composición puede administrarse dentro de una matriz sólida in situ como un implante. El documento US-A-2001/0036451, se refiere a composiciones embólicas que comprenden una estructura principal polimérica que contiene cadenas que portan grupos reticulables que pueden formar hidrogeles mediante reticulación.

Resumen de la invención

La presente invención explota el descubrimiento de que las células injertadas en, sobre o dentro de una composición fluida implantable, pueden formularse para múltiples modos de suministro mínimamente invasivo, por ejemplo, administración endovascular y deposición perivascular en, adyacente a o en la proximidad de una superficie extraluminal de una estructura anatómica tubular, tal como, pero sin limitarse a, un vaso sanguíneo. También se contempla en el presente documento el suministro mínimamente invasivo en, sobre o alrededor de una superficie exterior de una estructura anatómica tubular. En el caso del vaso sanguíneo, los materiales de la presente invención son adecuados para tratar y manejar las secuelas clínicas asociadas con las intervenciones vasculares o enfermedades cardiovasculares.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición fluida según las reivindicaciones. Según una realización, la estructura anatómica tubular es un vaso sanguíneo. La composición fluida se proporciona, según algunas realizaciones, en una cantidad eficaz para reducir la proliferación de células del músculo liso, la trombosis oclusiva, la hiperplasia de la íntima, la reestenosis, la vasodilatación o la inflamación crónica o aguda, para nombrar unos pocos, en el sitio lesionado o enfermo. Para los fines de la presente invención, la composición fluida significa una composición susceptible de la administración usando una inyección o un dispositivo de suministro de tipo inyección tal como, pero sin limitarse a, una aguja, una jeringa o un catéter. También se contemplan en el presente documento otros dispositivos de suministro que emplean extrusión, eyección o expulsión.

Según una realización, las células de la composición fluida son células endoteliales o células que tienen un fenotipo de tipo endotelial. Según otra realización, las células son un cocultivo de dos o más tipos de célula. Los dos o más tipos de célula se seleccionan del grupo que consiste en células endoteliales, células epiteliales, células del músculo liso, fibroblastos, células madre, células progenitoras endoteliales y cardiomiocitos. Una preparación de células apropiadas para su uso con la presente invención puede obtenerse a partir de un solo donante o múltiples donantes.

Según otra realización, la matriz biocompatible es un gel, una espuma o una suspensión. La matriz biocompatible, en aún otra realización, comprende partículas o microportadores. En ciertas realizaciones, las partículas o microportadores comprenden además gelatina, colágeno, fibronectina, fibrina, laminina o péptido de unión. Un péptido de unión a modo de ejemplo es un péptido de secuencia arginina-glicina-aspartato (RGD). Según otra realización, la partícula o el microportador tiene un diámetro de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 500 micrómetros, preferiblemente un diámetro de aproximadamente 200 micrómetros.

En otra realización, la composición fluida comprende además un fluido portador. En una realización particularmente preferida, la composición fluida conserva su forma, permitiendo de ese modo al médico controlar la deposición hasta un grado necesario dado un sitio de deposición particular.

La presente invención encuentra aplicación en un método de tratamiento de un sitio lesionado o enfermo en una luz interior de una estructura anatómica tubular que comprende la etapa de poner en contacto con una composición fluida una estructura extraluminal de la estructura anatómica tubular en o adyacente a o en la proximidad del sitio lesionado o enfermo en la luz interior de la estructura anatómica tubular. En el presente documento se contempla que una superficie no luminal, denominada también extraluminal, puede ser una superficie exterior o perivascular de un vaso. Para los fines de esta invención, el sitio no luminal o extraluminal es cualquier sitio excepto una superficie interior de la luz. En el caso de una vaso sanguíneo, por ejemplo, un sitio extraluminal o no luminal puede estar dentro de la adventicia, media o íntima de un vaso sanguíneo; en el caso de las estructuras anatómicas tubulares no vasculares, los sitios no luminales correspondientes están dentro del alcance de la presente invención.

Según una realización, se lleva a cabo el suministro atravesando o penetrando en una pared interior de la estructura anatómica tubular y depositando luego la composición fluida en una superficie exterior de la estructura anatómica tubular en o adyacente a o en la proximidad del sitio lesionado o enfermo. Según otra realización, el método comprende además la etapa de identificar un sitio para depositar la composición fluida en una superficie extraluminal de la estructura anatómica tubular. Según una realización, la etapa de identificación se produce antes de o coincidiendo con la etapa de paso a través o penetración. La etapa de identificación, en una realización, se lleva a cabo mediante la obtención de imágenes. La etapa de identificación, en otra realización, se lleva a cabo mediante palpación táctil.

En una realización, el suministro se lleva a cabo entrando en el espacio perivascular mediante administración percutánea y depositando luego la composición fluida en una superficie exterior de la estructura anatómica tubular en o adyacente a o en la proximidad del estado lesionado o enfermo. Según otra realización, este método comprende además la etapa de identificar un sitio para depositar la composición fluida en una superficie exterior de la estructura anatómica tubular. La etapa de identificación puede producirse antes de o coincidiendo con la etapa de entrada. La etapa de identificación, según una realización, se lleva a cabo mediante la obtención de imágenes. La etapa de identificación, en otra realización, se lleva a cabo mediante palpación táctil.

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La superficie exterior de la estructura anatómica tubular puede ser una superficie no luminal o puede ocupar un espacio perivascular como se describió en otra parte en el presente documento. Según una realización preferida, la estructura anatómica tubular es un vaso sanguíneo. Según otra realización preferida, el vaso sanguíneo comprende una endoprótesis. En aún otra realización preferida, la estructura anatómica tubular tratada es una estructura no vascular tal como, pero sin limitarse a, una trompa de Falopio.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una curva de crecimiento celular representativa según una realización ilustrativa de la invención.

Descripción detallada de la invención

Como se explica en el presente documento, la invención se basa en el descubrimiento de que puede usarse un tratamiento a base de células para tratar, mejorar, manejar y/o reducir la progresión de las secuelas clínicas asociadas con intervenciones vasculares o enfermedades cardiovasculares, particularmente trombosis oclusiva, reestenosis, hiperplasia de la íntima, inflamación y vasodilatación. La invención se beneficia además del descubrimiento adicional de que una composición fluida no descrita hasta la fecha, por ejemplo una formulación particulada, puede mantener una población confluente de células suficientemente viables y que esta composición que comprende células injertadas en, sobre o dentro de una matriz biocompatible, por ejemplo un material particulado implantable, puede administrarse eficazmente usando un modo de administración mínimamente invasivo, por ejemplo un suministro endovascular o percutáneo local durante un procedimiento cerrado, sin reducir la eficacia clínica o la viabilidad de las células injertadas de la composición fluida implantable. Las enseñanzas presentadas a continuación proporcionan la suficiente orientación para preparar y usar los materiales de la presente invención, y proporciona además la suficiente orientación para identificar los criterios y sujetos apropiados para el someter a prueba, medir y monitorizar el rendimiento de los materiales de la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención encuentra aplicación en un tratamiento a base de células para intervenciones vasculares que se manejan clínicamente o enfermedades cardiovasculares. Una realización a modo de ejemplo de la presente invención comprende una matriz biocompatible y células adecuadas para su uso con los modelos de tratamiento descritos en el presente documento. Específicamente, en una realización preferida, la composición fluida implantable comprende una matriz biocompatible y células endoteliales o células de tipo endotelial. En otra realización preferida, la composición fluida implantable comprende células endoteliales o células de tipo endotelial, preferiblemente células endoteliales aórticas humanas y una matriz biocompatible de tipo particulada.

La composición fluida implantable de la presente invención comprende células injertadas sobre, en y/o dentro de una matriz biocompatible. Injertadas significa unidas de forma segura mediante interacciones célula-célula y/o célula-matriz, de modo que las células resistan los rigores de las manipulaciones preparatorias descritas en el presente documento. Como se explica en otra parte en el presente documento, una realización operativa de la composición fluida implantable comprende una población de células casi confluente, confluente o posconfluente que tiene un fenotipo preferido. Se entiende que las realizaciones de la composición fluida implantable probablemente pierden células durante las manipulaciones preparatorias y/o que ciertas células no se unen de forma tan segura como las otras células. Todo lo que se requiere es que la composición fluida implantable comprenda células que cumplan los criterios funcionales o fenotípicos expuestos en el presente documento.

La composición fluida implantable de la presente invención se desarrolló sobre los principios de la modificación por ingeniería de tejidos, y representa un enfoque novedoso para satisfacer las necesidades clínicas anteriormente descritas. La composición fluida implantable de la presente invención es única porque las células viables injertadas sobre, en y/o dentro de la matriz biocompatible, pueden suministrar a la estructura anatómica tubular múltiples productos a base de células en las proporciones fisiológicas bajo control por retroalimentación fisiológico. Como se describe en otra parte en el presente documento, las células adecuadas para su uso con la composición fluida implantable, son células endoteliales o de tipo endotelial. El suministro local de múltiples compuestos mediante estas células y una dosificación fisiológicamente dinámica proporcionan una regulación más eficaz de los procesos responsables del mantenimiento de un endotelio luminal funcional. De manera importante, las células endoteliales, por ejemplo, en la composición fluida implantable de la presente invención se protegen del fluido sanguíneo erosivo dentro de la luz interior de un vaso sanguíneo debido a su colocación preferida en un sitio no luminal o extraluminal.

La composición fluida implantable de la presente invención, cuando se envuelve, se deposita o se pone en contacto de otra manera con un sitio extraluminal o no luminal en, adyacente a o en la proximidad de una luz objetivo lesionada o enferma, sirve para restablecer la homeostasis. Es decir, cuando se administra de forma extraluminal, la composición fluida implantable de la presente invención puede proporcionar un ambiente que imita la fisiología de soporte y es propicio para promover la luz interior funcional. Como se contempla en el presente documento, las estructuras anatómicas tubulares son aquellas que tienen una superficie luminal interior y una superficie extraluminal. En algunas estructuras, la superficie luminal interior es una capa de células endoteliales; en algunas otras estructuras, la superficie luminal interior es una capa de células no endoteliales. De nuevo, para los fines de la presente invención, una superficie extraluminal o no luminal puede ser, pero sin limitarse a, una superficie exterior de una estructura tubular como se describió en otra parte en el presente documento.

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Por ejemplo, las células endoteliales pueden liberar una amplia variedad de agentes que en combinación pueden inhibir o mitigar los acontecimientos fisiológicos adversos asociados con las complicaciones agudas tras una intervención vascular o enfermedad cardiovascular. Como se ejemplifica en el presente documento, una composición y método de uso que recapitula la fisiología y dosificación normales es útil para potenciar la funcionalidad del endotelio así como promover la permeabilidad a largo plazo de tal endotelio luminal. Normalmente, el tratamiento incluye depositar la composición fluida implantable de la presente invención en, adyacente a o en la proximidad de un endotelio objetivo lesionado o enfermo, por ejemplo, en el espacio perivascular externo a la luz de la vasculatura del sujeto. Cuando se deposita o se pone en contacto de otra manera con un vaso sanguíneo lesionado, traumatizado o enfermo, las células de la composición fluida implantable pueden proporcionar compuestos reguladores del crecimiento a la vasculatura del sujeto, por ejemplo a las células del músculo liso subyacentes dentro del vaso sanguíneo. Mientras está fuera del vaso sanguíneo, la composición fluida implantable de la presente invención proporciona un suministro eficaz de múltiples compuestos reguladores de las células mientras están protegidas de los efectos mecánicos del flujo sanguíneo en la luz interior del/de los vaso(s).

El tratamiento de un vaso sanguíneo lesionado o enfermo con una realización preferida de la presente invención puede estimular la curación normal o casi normal y la fisiología normal. Por el contrario, en ausencia de tratamiento con una realización preferida de la presente invención, la curación fisiológica normal se altera, por ejemplo, las células endoteliales nativas y las células del músculo liso pueden crecer de manera anómala a una tasa exuberante o incontrolada, tras una intervención vascular o enfermedad cardiovascular. Por consiguiente, como se contempla en el presente documento, el tratamiento con la composición fluida implantable de la presente invención dará como resultado la curación normal o casi normal del tejido nativo en el sitio de la intervención vascular o enfermedad cardiovascular, por ejemplo, lo suficiente para mantener la permeabilidad del vaso normal o casi normal.

La composición fluida implantable de la presente invención puede colocarse en una variedad de configuraciones en la vasculatura que va a tratarse. Los vasos pueden ponerse en contacto en su totalidad o en parte; por ejemplo, la composición fluida implantable de la presente invención puede aplicarse a los vasos de modo circunferencial o en una configuración en arco. Un vaso sólo necesita estar en contacto con una cantidad de la composición fluida implantable suficiente para mejorar la funcionalidad de la vasculatura.

Para los fines de la presente invención, ponerse en contacto significa interactuar directa o indirectamente con una superficie extraluminal o no luminal como se define en otra parte en el presente documento. En el caso de ciertas realizaciones preferidas, no se requiere el contacto físico real para la eficacia. En otras realizaciones, se prefiere el contacto físico real. Todo lo que se requiere para poner en práctica la presente invención es la deposición extraluminal o no luminal de un material implantable en, adyacente a o en la proximidad de un sitio lesionado o enfermo, en una cantidad eficaz para tratar el sitio lesionado o enfermo. En el caso de ciertas enfermedades o lesiones, un sitio enfermo o lesionado puede manifestarse clínicamente en una superficie de la luz interior. En el caso de otras enfermedades o lesiones, un sitio enfermo o lesionado puede manifestarse clínicamente en una superficie extraluminal o no luminal. En algunas enfermedades o lesiones, un sitio enfermo o lesionado puede manifestarse clínicamente tanto en una superficie de la luz interior como en una superficie extraluminal o no luminal. La presente invención es eficaz para tratar cualquier de las manifestaciones clínicas anteriores.

Las realizaciones de la composición fluida implantable de la presente invención pueden aplicarse a cualquier estructura anatómica tubular que requiere tratamiento intervencionista para mantener la homeostasis. Como se contempla en el presente documento, las estructuras anatómicas tubulares son aquellas que tienen una superficie luminal interior y una superficie extraluminal o no luminal. Para los fines de la presente invención, una superficie extraluminal puede ser, pero no se limita a, una superficie exterior de una estructura tubular. En ciertas estructuras tubulares, la superficie luminal interior es una capa de células endoteliales; en algunas otras estructuras, la superficie luminal interior es una capa de células no endoteliales. La presente invención es eficaz para tratar una estructura tubular revestida por endotelio y no revestida por endotelio.

Las estructuras anatómicas tubulares incluyen estructuras del sistema vascular, el sistema reproductor, el sistema genitourinario, el sistema gastrointestinal, el sistema pulmonar, el sistema respiratorio y el sistema ventricular del cerebro y la medula espinal. Ejemplos representativos de las estructuras anatómicas tubulares incluyen las arterias y las venas, los conductos lagrimales, la tráquea, los bronquios, los bronquiolos, las fosas nasales (incluyendo los senos) y otras vías respiratorias, las trompas de Eustaquio, el conducto auditivo externo, la cavidad bucal, el esófago, el estómago, el duodeno, el intestino delgado, el intestino grueso, los conductos biliares, el uréter, la vejiga, la uretra, las trompas de Falopio, el útero, la vagina y otros conductos del aparato reproductor femenino, el conducto deferente y otros conductos del aparato reproductor masculino, una envoltura vascular y el sistema ventricular (líquido cefalorraquídeo) del cerebro y la médula espinal. Para los fines de la presente invención, las estructuras anatómicas tubulares pueden producirse de manera natural o pueden producirse de manera no natural tal como, pero sin limitarse a, una anastomosis creada quirúrgicamente.

Endotelio lesionado o enfermo: En ciertas realizaciones preferidas, las intervenciones vasculares que dan como resultado lesiones vasculares susceptibles de tratamiento con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, angioplastia, aterectomía, colocación vascular de endoprótesis incluyendo endoprótesis de metal puro y que eluyen fármacos, cirugías de derivación vascular incluyendo injertos de derivación arterial e injertos de derivación periférica, trasplante de órganos, fístula arteriovenosa y otra formación de anastomosis vascular, formación de injertos arteriovenosos, periféricos y otros, y posteriores lesiones asociadas a accesos vasculares, incluyendo pinchazos de aguja sufridos durante el acceso a un vaso para diálisis u otros tratamientos intervencionistas. Cada intervención da como resultado un grado de lesión del revestimiento de las células endoteliales de la luz vascular. A su vez, la luz vascular lesionada experimenta una cascada de acontecimientos bioquímicos que dan como resultado una variedad de secuelas identificables clínicamente, incluyendo, pero sin limitarse a, trombosis oclusiva, reestenosis, hiperplasia de la íntima, inflamación aguda y crónica, proliferación de células del músculo liso, remodelación vascular, vasodilatación y la formación de lesiones vulnerables de la placa.

La trombosis o trombosis oclusiva se asocia a la adhesión, agregación y organización de las plaquetas; la trombosis oclusiva se asocia generalmente con un trombo organizado. La trombosis se caracteriza por la pérdida de flujo sanguíneo en la zona de trombosis. Las células endoteliales o de tipo endotelial liberan compuestos antitrombóticos incluyendo, pero sin limitarse a, proteoglicanos de heparán sulfato, prostaciclina y óxido nítrico. El tratamiento con la composición fluida implantable de la presente invención mejora la permeabilidad del vaso tratado.

La estenosis, reestenosis, hiperplasia de la íntima y proliferación de células del músculo liso se caracterizan por las lesiones obstructivas en la luz de un vaso sanguíneo asociadas con el crecimiento exuberante de células del músculo liso en la luz. Las células endoteliales o de tipo endotelial liberan compuestos en la zona luminal que inhiben la proliferación de células del músculo liso. Los compuestos terapéuticos a modo de ejemplos producidos por células endoteliales o de tipo endotelial, incluyen, pero no se limitan a, heparán sulfato, TGF-\beta y óxido nítrico. La estenosis, reestenosis, hiperplasia de la íntima y proliferación de células del músculo liso se identifican, por ejemplo, mediante angiografía, ecografía intravascular u otras técnicas de ecografía. El tratamiento con la composición fluida implantable de la presente invención reduce el porcentaje de estenosis, el grado de la oclusión y/o mejora la permeabilidad asociada con el vaso tratado.

La inflamación se asocia con la captación, adhesión e infiltración de células inflamatorias, incluyendo, pero sin limitarse a, granulocitos, neutrófilos, monocitos, macrófagos y linfocitos. Además, un aumento en la permeabilidad vascular conduce a la acumulación local de fluido, inmunoglobulinas, complemento y otras proteínas sanguíneas en el tejido adyacente a un sitio de lesión que, a su vez, inducen la expresión de moléculas de adhesión, que se unen a la superficie de los monocitos y neutrófilos circulantes, y en gran medida potencian la velocidad a la que estas células fagocíticas pueden migran a través de la superficie de la luz y al interior del tejido adyacente. Tras la activación, estas células pueden liberar enzimas hidrolíticas, citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento. En estadios crónicos avanzados de inflamación, el sitio lesionado se cubre con una capa fibrosa que recubre un núcleo de tejido lipídico y necrótico. Las células endoteliales y de tipo endotelial liberan compuestos antiinflamatorios en la zona luminal que reduce la respuesta inflamatoria. El tratamiento con la composición fluida implantable de la presente invención puede inhibir la actividad y/o la acumulación de células inflamatorias, reduciendo de ese modo la producción y secreción de factores de crecimiento y reduciendo la infiltración vascular local de los macrófagos para evitar, reducir o mejorar la respuesta inflamatoria aguda en el sitio de la lesión vascular. La mejora o prevención de la respuesta inflamatoria aguda puede interrumpir los acontecimientos que conducen a la inflamación crónica, minimizando de ese modo el compromiso luminal eventual y/o la disfunción vascular. Adicionalmente, la mejora o rehabilitación de tejido inflamado de manera crónica puede reducir los riesgos de aparición de riesgos a largo plazo tales como enfermedades cardiovasculares incluyendo, pero sin limitarse a, placa vulnerable o aterosclerosis.

Además, las enfermedades cardiovasculares que se producen espontáneamente que son susceptibles de tratamiento con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, inflamación aguda o crónica, trombosis oclusiva, hiperplasia de la íntima, reestenosis, proliferación de células del músculo liso, vasodilatación, remodelación vascular negativa, lesiones vulnerables de la placa dentro de la luz de la estructura vascular, y diversos síndromes arteriales inestables para nombrar unos pocos. Los estados vasculares vulnerables adicionales que son susceptibles de tratamiento con la presente invención incluyen cualquier estado isquémico, hipóxico o de lesión en el que existe un suministro sanguíneo inadecuado en relación con la demanda. Los estados vasculares vulnerables pueden resultar de cualquier lesión o reparación que influya negativamente en el suministro sanguíneo. Las vulnerabilidades a modo de ejemplo incluyen los síndromes arteriales inestables tales como isquemia, angina inestable en el corazón incluyendo un espectro de inestabilidad que oscila desde angina inducida por ejercicio hasta angina en reposo, isquemia aórtica, isquemias periféricas incluyendo un espectro de estados que oscilan desde claudicación intermitente hasta gangrena, isquemia intestinal en el intestino e isquemia renal, para nombrar unos pocos.

Un endotelio objetivo lesionado o enfermo puede tratarse con la composición fluida implantable de la presente invención en el momento de una intervención vascular primaria, por ejemplo, angioplastia, colocación de endoprótesis o creación de anastomosis. Un tratamiento de este tipo puede reducir la lesión que resulta de la intervención vascular, por ejemplo, la denudación endotelial que resulta de la angioplastia. La composición fluida implantable también puede administrarse para rescatar un endotelio objetivo lesionado o enfermo posterior a una intervención vascular y el desarrollo de arteriopatías clínicas asociadas con la intervención, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, reestenosis o trombosis oclusiva.

Los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse ante de, coincidiendo con y/o tras la administración de la composición fluida implantable. Por ejemplo, pueden administrarse agentes que evitan o reducen la formación de coágulos sanguíneos, la agregación plaquetaria u otros bloqueos similares. Los agentes a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, heparán sulfato y TGF-\beta. Otras citocinas o factores de crecimiento también pueden incorporarse en la composición fluida implantable, dependiendo de la indicación del implante, incluyendo VEGF para promover la reendotelización y b-FGF para promover la integración de los vasos. Otros tipos de agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes antiproliferativos y agentes antineoplásicos. Los ejemplos incluyen rapamicina, paclitaxel y los agentes señuelo de E2F. Cualquiera de los anteriores puede administrarse local o sistemáticamente; si es localmente, la composición fluida implantable pueden contener ciertos agentes.

Fuente de células: Como se describe en el presente documento, la composición fluida implantable de la presente invención comprende células. Las células pueden ser alogénicas, xenogénicas o autólogas. En ciertas realizaciones, una fuente de células vivas puede derivarse de un donante adecuado o de múltiples donantes. En algunas otras realizaciones, una fuente de células puede derivarse de un cadáver o de un banco de células.

En una realización preferida actualmente, las células son células endoteliales. En una realización particularmente preferida, tales células endoteliales se obtienen de tejido vascular, preferiblemente, pero sin limitarse a, tejido arterial. Como se muestra a modo de ejemplo a continuación, un tipo de célula endotelial vascular adecuada para su uso es una célula endotelial aórtica. Otro tipo de célula endotelial vascular adecuada para su uso son las células endoteliales de la vena del cordón umbilical. Y, otro tipo de célula endotelial vascular adecuada para su uso son las células endoteliales de la arteria coronaria. Aún otros tipos de células endoteliales vasculares adecuadas para su uso con la presente invención incluyen células endoteliales de la arteria pulmonar y células endoteliales de la arteria iliaca.

En otra realización preferida actualmente, las células endoteliales adecuadas pueden obtenerse de tejido no vascular. El tejido no vascular puede derivarse de cualquier estructura anatómica tubular como se describe en otra parte en el presente documento o puede derivarse de cualquier órgano o tejido no vascular.

En aún otra realización, las células endoteliales pueden derivarse de células progenitoras endoteliales o células madre; en todavía otra realización, las células endoteliales pueden derivarse de células progenitoras o células madre en general. En otras realizaciones preferidas, las células pueden ser células no endoteliales que son alogénicas, xenogénicas o autólogas derivadas de un órgano o tejido vascular o no vascular. La presente invención también contempla cualquiera de las anteriores que se alteran, modifican o modifican mediante ingeniería genéticamente.

En una realización adicional, dos o más tipos de células se cocultivan para preparar la presente composición. Por ejemplo, puede introducirse una primera célula en el material implantable biocompatible y cultivarse hasta confluencia. El primer tipo de célula puede incluir, por ejemplo, células del músculo liso, células endoteliales, fibroblastos, células madre, células progenitoras endoteliales, cardiomiocitos, una combinación de células del músculo liso y fibroblastos, cualquier otro tipo de célula deseado o una combinación de los tipos de célula deseados adecuados para crear un entorno propicio para el crecimiento de células endoteliales. Una vez que el primer tipo de célula ha alcanzado la confluencia, un segundo tipo de célula se siembra encima del primer tipo de células confluentes en, sobre o dentro del material implantable biocompatible, y se cultivan hasta que tanto el primer tipo de célula como el segundo tipo de célula han alcanzado la confluencia. El segundo tipo de célula puede incluir, por ejemplo, células endoteliales o cualquier otro tipo de célula o combinación de tipos de célula deseados. Los tipos de célula primero y segundo pueden incluir el mismo tipo de célula derivado de dos o más donantes o fuentes diferentes. Se contempla que los tipos de célula primero y segundo puedan introducirse gradualmente, o como una sola mezcla. También se contempla que pueda modificarse la densidad celular para alterar la razón de células del músculo liso con respecto a células endoteliales de aproximadamente 2:1 para una aplicación de injerto AV, una razón de aproximadamente 1:1 para una aplicación de derivación periférica u otra proporción adecuada para otra aplicación clínica.

Para evitar la sobreproliferación de células del músculo liso u otro tipo de célula propenso a la proliferación excesiva, puede modificarse el procedimiento de cultivo. Por ejemplo, después de la confluencia del primer tipo de célula, el cultivo puede recubrirse con un factor de unión adecuado para el segundo tipo de célula antes de la introducción del segundo tipo de célula. Los factores de unión a modo de ejemplo incluyen recubrir el cultivo con gelatina para mejorar la unión de células endoteliales. Según otra realización, puede añadirse heparina a los medios de cultivo durante el cultivo del segundo tipo de célula para reducir la proliferación del primer tipo de célula y optimizar la razón de primer tipo de célula con respecto al segundo tipo de célula deseado. Por ejemplo, después de un crecimiento inicial de las células del músculo liso, puede administrarse heparina para controlar el crecimiento de las células del músculo liso para conseguir una mayor razón de células endoteliales con respecto a células del músculo liso.

En una realización preferida, se crea un cocultivo sembrando en primer lugar una matriz biocompatible con células del músculo liso para crear las estructuras de los vasos. Una vez que las células del músculo liso han alcanzado la confluencia, se siembran las células endoteliales encima de las células del músculo liso cultivadas en la material implantable, para crear un vaso sanguíneo simulado. Esta realización puede administrarse, por ejemplo, a un injerto AV o un injerto de derivación periférica según los métodos descritos en el presente documento para promover la integración del material de injerto prostético.

Todo lo que se requiere de las células de la presente composición es que presenten una o más propiedades fenotípicas o funcionales preferidas. Como se describió anteriormente en el presente documento, la presente invención se basa en el descubrimiento de que una célula que tiene un fenotipo fácilmente identificable cuando se asocia con una matriz biocompatible preferida, (descrito en otra parte en el presente documento) puede facilitar, restaurar y/o modular de otra manera la fisiología de las células endoteliales y/o la homeostasis luminal asociada con el tratamiento de un endotelio vascular objetivo lesionado o enfermo, o una luz objetivo lesionada o enferma de otra estructura anatómica tubular.

Para los fines de la presente invención, uno de tales fenotipos preferidos, fácilmente identificables, típicos de células de la presente invención es una capacidad para inhibir o interferir de otra manera con la proliferación de células del músculo liso según se mide mediante los ensayos in vitro descritos a continuación. Esto se denomina en el presente documento el fenotipo inhibidor.

Otro fenotipo fácilmente identificable que presentan las células de la presente composición es que son antitrombóticos o pueden inhibir la adhesión y agregación plaquetarias. La actividad antitrombótica puede determinarse usando un ensayo de heparán sulfato in vitro y/o un ensayo de agregación plaquetaria in vitro, descritos a continuación.

En una realización operativa típica de la presente invención, las células no necesitan presentar más de uno de los fenotipos anteriores. En ciertas realizaciones, las células pueden presentar más de uno de los fenotipos anteriores.

Aunque los fenotipos anteriores tipifican cada uno una célula endotelial funcional, tal como, pero sin limitarse a, una célula endotelial vascular, una célula no endotelial que presente un(os) fenotipo(s) de este tipo se considera de tipo endotelial para los fines de la presente invención y por tanto adecuada para su uso con la presente invención. Las células que son de tipo endotelial también se denominan en el presente documento análogos funcionales de células endoteliales; o imitadores funcionales de células endoteliales. Por tanto, sólo a modo de ejemplo, las células adecuadas para su uso con los materiales y métodos dados a conocer en el presente documento también incluyen células madre o células progenitoras que dan origen a células de tipo endotelial; células que son células no endoteliales en origen, pero actúan funcionalmente como una célula endotelial usando los parámetros expuestos en el presente documento; células de cualquier origen que se modifican mediante ingeniería o se modifican de otra manera para tener funcionalidad de tipo endotelial usando los parámetros expuestos en el presente documento.

Normalmente, las células para su uso en la presente invención presentan uno o más de los fenotipos anteriores cuando se presentan en poblaciones confluentes, casi confluentes o posconfluentes y se asocian con una matriz biocompatible preferida tal como las descritas en el presente documento. Como apreciará un experto habitual en la técnica, las poblaciones de células casi confluentes, confluentes o posconfluentes pueden identificarse fácilmente mediante una variedad de técnicas, la más común y ampliamente aceptada de las cuales es el examen microscópico directo. Otras incluyen la evaluación del número de células por área superficial usando técnicas de recuento celular convencionales tales como, pero sin limitarse a, un hemocitómetro o contador Coulter.

Adicionalmente, para los fines de la presente invención, las células de tipo endotelial incluyen, pero no se limitan a, células que emulan o imitan funcional y fenotípicamente las células endoteliales casi confluentes, confluentes o posconfluentes según se mide mediante los parámetros expuestos en el presente documento.

Por tanto, usando la descripción y orientación detalladas expuestas a continuación, el médico experto habitual en la técnica apreciará cómo preparar, usar, someter a prueba e identificar realizaciones operativas de la composición fluida implantable dada a conocer en el presente documento. Es decir, las enseñanzas proporcionadas en el presente documento describen todo lo que es necesario para preparar y usar las composiciones fluidas implantables de la presente invención. Y además, las enseñanzas proporcionadas en el presente documento dan a conocer todo lo que es necesario para identificar, preparar y usar operativamente composiciones que contienen células equivalentes. En el fondo, todo lo que se requiere es que tales equivalentes sean eficaces para tratar, manejar, modular o mejorar una lesión o enfermedad luminal, tal como las asociadas con una intervención vascular o enfermedad cardiovascular como ejemplo no limitativo según los métodos dados a conocer en el presente documento. Como apreciará el médico experto, las realizaciones equivalentes de la presente composición pueden identificarse usando sólo experimentos rutinarios junto con las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.

En ciertas realizaciones preferidas, las células endoteliales usadas en la composición fluida implantable de la presente invención se aíslan de la aorta de donantes cadavéricos humanos. Cada lote de células puede derivarse de un solo donante o de múltiples donantes. Cada lote se somete a prueba exhaustivamente para determinar la pureza de las células endoteliales, función biológica, la presencia de bacterias, hongos, patógenos humanos conocidos y otros agentes extraños. Las células se crioconservan y depositan en banco usando técnicas bien conocidas para la expansión posterior en cultivo para la posterior formulación en composiciones implantables.

Preparación de células: Como se indicó anteriormente, pueden obtenerse células adecuadas a partir de una variedad de tipos de tejido y tipos de célula. En ciertas realizaciones preferidas, las células endoteliales aórticas humanas usadas en la composición fluida implantable se aíslan de la aorta de donantes cadavéricos. En otras realizaciones, las células endoteliales aórticas porcinas (Cell Applications, San Diego, CA) se aíslan de aorta porcina normal mediante un procedimiento similar usado para aislar células endoteliales aórticas humanas. Cada lote de células puede derivarse de un solo donante o de múltiples donantes y se somete a prueba luego exhaustivamente para determinar la viabilidad de las células endoteliales, pureza, función biológica, la presencia de micoplasma, bacterias, hongos, patógenos humanos conocidos y otros agentes extraños. Además, las células se expanden, caracterizan y crioconservan para formar un banco de células de trabajo en el tercer a sexto pase usando técnicas bien conocidas para la expansión posterior en cultivo y la posterior formulación en el material implantable biocompatible.

Las células endoteliales aórticas humanas o porcinas se preparan en matraces T-75 pretratados mediante la adición de aproximadamente 15 ml de medios de crecimiento de células endoteliales por matraz. Las células endoteliales aórticas humanas se preparan en Endothelial Growth Media (medios de crecimiento endotelial) (EGM-2, Cambrex Bioscience, East Rutherford, NJ). EGM-2 consiste en Endothelial Basal Media (medios basales endoteliales) (EBM-2, Cambrex Bioscience) complementados con alícuotas individuales de EGM-2, que contienen FBS al 2%. Las células porcinas se preparan en EBM-2 complementado con FBS al 5% y gentamicina 50 \mug/ml. Los matraces se colocan en una incubadora mantenida a aproximadamente 37ºC y un 5% de CO_{2}/95% de aire, humedad del 90% durante un mínimo de 30 minutos. Uno o dos viales de las células se extraen del congelador de -160ºC a -140ºC y se descongelan a aproximadamente 37ºC. Cada vial de células descongeladas se siembra en dos matraces T-75 a una densidad de aproximadamente 3 x 10^{3} células por cm^{3}, preferiblemente, pero no menos de 1,0 x 10^{3} y no más de 7,0 x 10^{3}; y los matraces que contienen las células se devuelven a la incubadora. Después de aproximadamente 8-24 horas, se retiran los medios gastados y se reemplazan con medios nuevos. Después de esto, los medios se cambian cada dos a tres días, hasta que las células alcanzan aproximadamente el 85-100% de confluencia preferiblemente, pero no menos del 60% y no más del 100%. Cuando la composición fluida implantable está concebida para la aplicación clínica, sólo se usan medios libres de antibiótico en el cultivo tras la descongelación de las células endoteliales aórticas humanas y la fabricación de la composición fluida implantable de la presente invención.

Entonces, se eliminan los medios de crecimiento de células endoteliales y se aclara la monocapa de células con 10 ml de solución salina tamponada con HEPES (HEPES). Se retira el HEPES y se añaden 2 ml de tripsina para de separar la células de la superficie del matraz T-75. Una vez que se ha producido la separación, se añaden 3 ml de disolución neutralizante de tripsina (TNS) para detener la reacción enzimática. Se añaden 5 ml adicionales de HEPES y se enumeran las células usando un hemocitómetro. La suspensión de células se centrifuga y se ajusta a una densidad de, en el caso de células humanas, aproximadamente 1,75 x 10^{6} células/ml usando EGM-2 sin antibióticos, o en el caso de células porcinas, aproximadamente 1,50 x 10^{6} células/ml usando EBM-2 complementado con FBS al 5% y gentamicina 50 \mug/ml.

Matriz biocompatible: Según la presente invención, una realización preferida de la composición fluida implantable comprende una matriz biocompatible en forma de un gel, una espuma, una suspensión, un microportador, una microcápsula, una estructura fibrosa fluida u otro material fluido. La matriz biocompatible permite el crecimiento celular y se une a, sobre o dentro de la matriz. La matriz biocompatible, cuando se implanta en una superficie exterior de un vaso sanguíneo, por ejemplo, puede permanecer en el sitio de implante durante aproximadamente 7-90 días, preferiblemente al menos aproximadamente 7-14 días, más preferiblemente al menos aproximadamente 14-28 días, lo más preferiblemente al menos aproximadamente 28-90 días antes que se erosione biológicamente.

Para los fines de la presente invención, composición fluida significa una composición susceptible de administración usando una inyección o un dispositivo de suministro de tipo inyección tales como, pero sin limitarse a, una aguja, una jeringa o un catéter. También se contemplan en el presente documento otros dispositivos de suministro que emplean extrusión, expulsión o eyección. Se contempla en el presente documento cualquier formulación no sólida de una matriz biocompatible para su uso con un dispositivo de suministro de tipo inyección que sea susceptible o bien de administración endovascular desplazándose a lo largo de la longitud interior de un vaso sanguíneo o bien de administración percutánea local. Una composición fluida preferida mantiene su forma. Una composición fluida implantable que comprende células injertadas en una matriz particulada fluida como se contempla en el presente documento, se formula para su uso con cualquier dispositivo de suministro inyectable que contiene una aguja con un diámetro interno que oscila desde calibre 22 hasta calibre 26, una aguja con una longitud que oscila desde aproximadamente 1 hasta 20 mm. Un dispositivo de suministro inyectable preferido puede suministrar aproximadamente 50 mg de material particulado implantable que contiene aproximadamente 1 millón de células en de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 ml de medio.

Según una realización preferida actualmente de la presente invención, la composición fluida comprende una matriz particulada biocompatible tal como partículas de Gelfoam®, polvo de Gelfoam®, o Gelfoam® pulverizado (Pfizer Inc., Nueva York, NY) (en lo sucesivo en el presente documento "partículas de Gelfoam"), un producto derivado de gelatina dérmica porcina. Según otra realización, el material particulado biocompatible es microportador Cytodex-3 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), compuesto de colágeno desnaturalizado acoplado a una matriz de dextrano reticulado. Según realizaciones alternativas, la matriz particulada implantable biocompatible está compuesta de partículas de alginato modificado; un polímero biocompatible tal como un polímero sintético degradado mediante hidrólisis, por ejemplo, polihidroxiácidos como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o copolímeros de los mismos; poliortoésteres, polianhídridos; proteínas tales como gelatina, colágeno, gel de fibrina; o hidratos de carbono o polisacáridos tales como celulosa y celulosas derivatizadas, quitosano, alginato o combinaciones de los mismos. Una matriz biocompatible es un material que puede desaparecer gradualmente a lo largo del transcurso de varios días, semanas o meses después de la administración de la composición fluida. La tasa de degradación depende de la matriz biocompatible elegida y las tasas de degradación pueden modificarse basándose en la naturaleza del tratamiento y las circunstancias clínicas.

Según otra realización, la matriz particulada implantable puede ser una matriz particulada modificada. Las modificaciones a la matriz particulada implantable pueden seleccionarse para optimizar y/o controlar la función de las células, incluyendo el fenotipo de las células (por ejemplo, el fenotipo inhibidor) como se describió anteriormente, cuando las células se asocian con la matriz particulada implantable. Según una realización, las modificaciones a la matriz particulada implantable incluyen recubrir las partículas con factores de unión o péptidos de adhesión que potencian la capacidad de las células para inhibir la proliferación de células del músculo liso, reducir la inflamación, aumentar la producción de heparán sulfato, aumentar la producción de prostaciclina y/o aumentar la producción de TGF-\beta_{1}. Los factores de unión a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, fibronectina, gel de fibrina, y ligandos de adhesión celular unidos covalentemente (incluyendo por ejemplo RGD) que utilizan la química de la carbodiimida acuosa convencional. Los ligandos de adhesión celular adicionales incluyen péptidos que tienen secuencias de reconocimiento de adhesión celular, incluyendo, pero sin limitarse a: RGDY, REDYY, GRGDF, GDPSGR, GRGDY y REDV.

Según otra realización, la matriz particulada implantable es una partícula distinta de Gelfoam. Las matrices particuladas adicionales a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, gel de fibrina, alginato, microportadores de sulfonato sódico de poliestireno, microportadores de dextrano recubiertos con colágeno, PLA/PGA y copolímeros de pHEMA/MMA (con proporciones de polímeros que oscilan desde el 1-100% para cada copolímero). Según una realización preferida, estas matrices particuladas adicionales se modifican para incluir factores de unión o péptidos de adhesión, como se mencionaron y describieron anteriormente. Los factores de unión a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, gelatina, colágeno, fibronectina, gel de fibrina, y ligandos de adhesión celular unidos covalentemente (incluyendo RGD) que utilizan la química de la carbodiimida acuosa convencional. Los ligandos de adhesión celular adicionales incluyen péptidos que tienen secuencias de reconocimiento de adhesión celular, incluyendo, pero sin limitarse a: RGDY, REDYY, GRGDF, GDPSGR, GRGDY y REDV.

Según otra realización, la matriz particulada implantable se modifica físicamente para mejorar la unión celular. Según una realización, la matriz particulada implantable se reticula para potenciar sus propiedades mecánicas y para mejorar sus propiedades de crecimiento y adhesión celular. Según una realización preferida, en primer lugar se reticula una partícula de alginato usando sulfato de calcio seguido de una segunda etapa de reticulación usando cloruro de calcio y protocolos rutinarios. Según otra realización, una fuente de heparina o heparán sulfato, por ejemplo heparina-Sepharose, se incorpora a la matriz antes del cultivo celular.

Se contempla que la composición fluida implantable que comprende una matriz particulada biocompatible pueda suministrarse usando, preferiblemente, una aguja con diámetro interno de calibre 22 a calibre 26. Por consiguiente, las partículas que forman una matriz de este tipo tienen preferiblemente un diámetro que puede pasar a través de la abertura de una aguja adecuada, como se define en el presente documento. Según una realización preferida, las partículas de una matriz de este tipo tienen un diámetro de aproximadamente 20 \mum a aproximadamente 1000 \mum, con un diámetro preferido de aproximadamente 100 \mum a aproximadamente 500 \mum, lo más preferiblemente un diámetro de aproximadamente 200 \mum.

Cada partícula de una matriz particulada preferida debe tener al menos una célula adherida a su superficie, preferiblemente más de una célula. Por consiguiente, cada partícula debe tener un diámetro mayor que el diámetro extendido del tipo de célula escogido. Por ejemplo, las células endoteliales tiene un diámetro extendido de aproximadamente 18 \mum; para estimular la unión de más de una célula endotelial a una partícula, debiendo tener cada partícula un diámetro de al menos 20 \mum.

Tubos de cultivo preferidos: En ciertas realizaciones contempladas en el presente documento, se colocan aproximadamente 50-60 mg de partículas de Gelfoam en tubos individuales de 50 ml (Evergreen, Los Ángeles, CA) con tapas con filtro de 0,2 \mum. Con el fin de reducir el número de partículas perdidas durante los cambios de medios, pueden modificarse los tubos de cultivo, por ejemplo, añadiendo un filtro a la zona de la tapa o a una parte interior del tubo de cultivo para evitar la aspiración u otra eliminación involuntaria de partículas durante la expulsión del medio, añadiendo una división al tubo de cultivo para crear partes separadas para los medios y partículas con un medio de comunicación fluida entre las partes que puede pasar el medio pero no las partículas, o añadiendo un tubo de descarga en la parte inferior del tubo de cultivo que pueda abrirse y eliminar los medios mediante vertido sin afectar a las partículas.

Siembra de células de material implantable: Antes de sembrar las células, se preparan las partículas mediante la adición de etanol al 70% seguido de varios aclarados en PBS o HEPES. Entonces se rehidratan las partículas en EGM-2 sin antibióticos a aproximadamente 37ºC y un 5% de CO_{2}/95% de aire durante de 12 a 24 horas. Entonces, se retiran alícuotas de aproximadamente 50-60 mg de partículas de sus recipientes de rehidratación y se colocan en placas de cultivo tisular individuales. La alícuota de partículas se siembra a una densidad preferida de 2 x 10^{3} a 2 x 10^{4} células por mg de partículas. La mezcla células-matriz se pipetea de arriba a abajo varias veces para formar una suspensión uniforme. Entonces se incuban los tubos a 37ºC, un 5% de CO_{2}, humedad del 90% con agitación periódica durante de 3 a 4 horas para facilitar la unión celular. Luego se añaden por tubo 9 ml adicionales de EGM-2 (volumen medio final = 10 ml), dando como resultado un volumen de partículas final de aproximadamente 5 mg de partículas/ml de medio.

Los medios se cambian cada dos a tres días, después de esto, hasta que las células alcancen la confluencia. Las células en una realización preferida son preferiblemente del pase 6, pero pueden usarse células de menos o más pases.

Curva de crecimiento celular y confluencia: Una muestra de composición fluida implantable se elimina en o aproximadamente en los días 3 ó 4, 6 ó 7, 9 ó 10, y 12 ó 13, se cuentan las células y se evalúan para determinar su viabilidad, y se construye y evalúa una curva de crecimiento con el fin de evaluar las características de crecimiento y determinar si se ha logrado la casi confluencia, confluencia o posconfluencia. En la figura 1 se presenta una curva de crecimiento representativa de una preparación de una composición fluida implantable, que comprende lotes implantados de células endoteliales aórticas porcinas. En este ejemplo, el material implantable es una forma particulada. Generalmente, un experto habitual apreciará los indicios de crecimiento celular aceptable en momentos tempranos, medios y tardíos, tal como una observación de un aumento en el número de células en momentos tempranos (cuando se refiere a la figura 1, aproximadamente entre los días 3 y 10), seguido de una fase casi confluente (cuando se refiere a la figura 1, aproximadamente entre los días 10 y 13), seguido de una meseta en el número de las células una vez que las células han alcanzado la confluencia (cuando se refiere a la figura 1, aproximadamente entre los días 13 y 15) y el mantenimiento del número de células cuando las células son posconfluentes (cuando se refiere a la figura 1, aproximadamente entre los días 15 y 17). Para los fines de la presente invención, se prefieren poblaciones celulares que están en una meseta durante al menos 72 horas.

Los recuentos de células se logran mediante la digestión completa de la alícuota de composición fluida implantable con una disolución de colagenasa 0,8 mg/ml en una tripsina-EDTA para las partículas de Gelfoam o una disolución de dextranasa y tripsina-EDTA para las partículas de Cytodex-3. Después de medir el volumen de la composición fluida implantable digerida, se diluye un volumen conocido de la suspensión celular con azul trípano al 0,4% (4:1 de células con respecto a azul trípano) y se evalúa la viabilidad mediante la exclusión de azul trípano. Se enumeran las células viables, no viables y totales usando un hemocitómetro. Se construyen las curvas de crecimiento representando el número de células viables frente al número de días en cultivo. Se envían e implantan las células después de alcanzar la confluencia.

Para los fines de la presente invención, la confluencia se define como la presencia de al menos aproximadamente 8 x 10^{3} células/mg de partículas biocompatibles, preferiblemente de aproximadamente 7 x 10^{5} a aproximadamente 1 x 10^{6} células totales por alícuota de 50-70 mg de partículas con una viabilidad de preferiblemente al menos aproximadamente el 90% pero no menos de aproximadamente el 80%. La viabilidad celular es de al menos aproximadamente el 90% preferiblemente, pero no menos de aproximadamente el 80%. Si las células no son confluentes en el día 12 ó 13, se cambian los medios y se continúa con la incubación durante un día más. Se continúa con este proceso hasta que se consigue la confluencia o hasta aproximadamente 14 días después de la siembra. Si se determina que las células son confluentes después de realizar los controles en el proceso, se realiza un cambio de medios final. Este cambio de medios final se realiza usando EGM-2 sin rojo de fenol y sin antibióticos. Inmediatamente después del cambio de medios, se ajustan los tubos con tapas de cierre hermético estériles para su envío.

Evaluación de la funcionalidad: Para los fines de la invención descrita en el presente documento, la composición fluida implantable se somete a prueba adicionalmente para determinar indicios de funcionalidad antes de su implante. Por ejemplo, se recogen los medios acondicionados durante el periodo de cultivo para determinar los niveles de heparán sulfato, factor de crecimiento transformante-\beta_{1} (TGF-\beta_{1}), factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF) y óxido nítrico que se producen por las células endoteliales cultivadas. En ciertas realizaciones preferidas, la composición fluida implantable puede usarse para los fines descritos en el presente documento, cuando el número de células totales es de al menos 2, preferiblemente 8 x 10^{3} células/cm^{3}; el porcentaje de células viables es de al menos el 80-90%, preferiblemente \geq 90%, lo más preferiblemente al menos el 90%. El heparán sulfato en medios acondicionados es al menos 0,5-1,0, preferiblemente al menos 1,0 microgramos/10^{6} células/día. El TGF-\beta_{1} en medios acondicionados es al menos 200-300, preferiblemente al menos 300 picogramos/ml/día; el b-FGF en medios acondicionados es menor de aproximadamente 200 picogramos/ml, preferiblemente no más de aproximadamente 400 picogramos/ml.

Los niveles de heparán sulfato pueden cuantificarse usando un ensayo espectrofotométrico de digestión de azul de dimetilmetileno-condroitinasa ABC rutinario. Los niveles de glicosaminoglicano (GAG) sulfatado total se determinan usando un ensayo de unión del colorante azul de dimetilmetileno (DMB), en el que las muestras no conocidas se comparan con una curva patrón generada usando cantidades conocidas de condroitina purificada, sulfatada, diluida en los medios de colección. Las muestras adicionales de medio acondicionado se mezclan con condroitinasa ABC para digerir la condroitina y los dermatán sulfatos antes de la adición del reactivo de color DMB. Se determinan todas las absorbancias a la absorbancia de longitud de onda máxima del colorante DMB mezclado con el patrón de GAG, generalmente alrededor de 515-525 nm. Se calcula la concentración de heparán sulfato por 10^{6} células por día restando la concentración de condroitina y dermatán sulfato de la concentración de glicosaminoglicano sulfatado total en muestras de medio acondicionado. La actividad de la condroitinasa ABC se confirma digiriendo una muestra de condroitina sulfato purificada. Las muestras de medio acondicionado se corrigen apropiadamente si se digiere menos del 100% de la condroitina sulfato purificada. También pueden cuantificarse los niveles de heparán sulfato usando un ensayo ELISA que emplea anticuerpos monoclonales.

Los niveles de TGF-\beta_{1} y b-FGF pueden cuantificarse usando un ensayo ELISA que emplea anticuerpos monoclonales o policlonales, preferiblemente policlonales. Los medios de colección control también pueden cuantificarse usando un ensayo ELISA y las muestras corregidas apropiadamente para determinar los niveles de TGF-\beta_{1} y b-FGF presentes en los medios control.

Los niveles de óxido nítrico (NO) pueden cuantificarse usando un ensayo de reacción de Griess convencional. La naturaleza transitoria y volátil del óxido nítrico lo hace inadecuado para la mayoría de los métodos de detección. Sin embargo, dos productos de degradación estables del óxido nítrico, nitrato (NO_{3}) y nitrito (NO_{2}), pueden detectarse usando métodos fotométricos rutinarios. El ensayo de reacción de Griess convierte enzimáticamente el nitrato en nitrito en presencia de nitrato reductasa. El nitrito se detecta colorimétricamente como un producto de colorante azoico coloreado, que absorbe luz visible en el intervalo de aproximadamente 540 nm. El nivel de óxido nítrico presente en el sistema se determina convirtiendo todo el nitrato en nitrito, determinando la concentración total de nitrito en las muestras no conocidas y comparando luego la concentración resultante de nitrito con una curva patrón generada usando cantidades conocidas de nitrato convertido en nitrito.

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El fenotipo inhibidor preferido descrito anteriormente se evalúa usando ensayos cuantitativos de heparán sulfato, TGF-\beta_{1}, NO y/o b-FGF descritos anteriormente, así como los ensayos in vitro cuantitativos de crecimiento de células del músculo liso e inhibición de trombosis como sigue. Para los fines de la presente invención, la composición fluida implantable está lista para el implante cuando uno o más de estos ensayos in vitro alternativos confirma que la composición fluida implantable presenta el fenotipo inhibidor preferido.

Para evaluar la inhibición del crecimiento de células del músculo liso in vitro, se determina la magnitud de la inhibición asociada con las células endoteliales cultivadas. Las células del músculo liso aórtico porcino o humano se siembran escasamente en placas de cultivo tisular de 24 pocillos en medio de crecimiento de células del músculo liso (SmGM-2, Cambrex Bioscience). Se deja que las células se unan durante 24 horas. Luego se reemplaza el medio por medios basales de células del músculo liso (SmBM) que contienen FBS al 2% durante 48-72 horas hasta que se detiene el crecimiento de las células. Los medios acondicionados se preparan a partir de cultivos de células endoteliales posconfluentes, se diluyen 1:1 con 2X medios de crecimiento SMC y se añaden a los cultivos. En cada ensayo se incluye un control positivo para la inhibición del crecimiento de células del músculo liso, por ejemplo, heparina. Después de tres a cuatro días, se enumera el número de células en cada muestra usando un contador Coulter. El efecto de los medios acondicionados sobre la proliferación de células del músculo liso se determina comparando el número de células del músculo liso por pocillo inmediatamente antes de la adición del medio acondicionado con aquél después de tres a cuatro días de exposición a medio acondicionado, y a medios control (medios de crecimiento convencionales con y sin la adición de factores de crecimiento). La magnitud de la inhibición asociada con las muestras de medios acondicionados se compara con la magnitud de inhibición asociada con el control positivo. Según una realización preferida, la composición fluida implantable se considera inhibidora si los medios acondicionados inhiben aproximadamente el 20% de lo que puede inhibir el control de heparina.

Para evaluar la inhibición de la trombosis in vitro, se determina el nivel de heparán sulfato asociado con las células endoteliales cultivadas. El heparán sulfato tiene propiedades tanto antiproliferativas como antitrombóticas. Al usar o bien el ensayo espectrofotométrico de azul de dimetilmetileno-condroitinasa ABC rutinario o bien un ensayo ELISA, ambos ensayos se describen en detalle anteriormente, se calcula la concentración de heparán sulfato por 10^{6} células. La composición fluida implantable puede usarse para los fines descritos en el presente documento cuando el heparán sulfato en los medios acondicionados es al menos 0,5-1,0 preferiblemente 1,0 microgramos/10^{6}
células/día.

Otro método para evaluar la inhibición de la trombosis implica determinar la magnitud de inhibición de la agregación plaquetaria in vitro asociada con el plasma rico en plaquetas. El plasma porcino se obtiene mediante la adición de citrato de sodio a las muestras de sangre porcina a temperatura ambiente. Se centrifuga el plasma citrado a una velocidad suave, para extraer los glóbulos rojos y blancos en un sedimento, dejando las plaquetas suspendidas en el plasma. Los medios acondicionados se preparan a partir de cultivos de células endoteliales posconfluentes y se añaden a alícuotas del plasma rico en plaquetas. Como control, se añade al plasma un agente de agregación plaquetaria (agonista). Los agonistas de plaquetas incluyen comúnmente araquidonato, ADP, colágeno, epinefrina y ristocetina (disponible de Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). A una alícuota adicional de plasma no se le añade ningún agonista de plaquetas o medios acondicionados, para evaluar la agregación plaquetaria espontánea inicial. También se incluye en cada ensayo un control positivo para la inhibición de la agregación plaquetaria. Los controles positivos a modo de ejemplo incluyen aspirina, heparina, abciximab (ReoPro®, Eli Lilly, Indianápolis, IN), tirofibano (Aggrastat®, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ) o eptifibatida (Integrilin®, Milennium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA). Entonces se mide la agregación plaquetaria resultante de todas las condiciones de prueba usando un agregómetro. El agregómetro mide la agregación plaquetaria monitorizando la densidad óptica. A medida que las plaquetas se agregan puede pasar más luz a través de la muestra. El agregómetro notifica resultados en "unidades de agregación plaquetaria", una función de la tasa a la que se agregan las plaquetas. La agregación se evalúa como la agregación máxima a los 6 minutos después de la adición del agonista. El efecto de los medios acondicionados sobre la agregación plaquetaria se determinar comparando la agregación plaquetaria inicial antes de la adición del medio acondicionado con aquélla después de la exposición del plasma rico en plaquetas al medio acondicionado, y al control positivo. Los resultados se expresan como un porcentaje del nivel inicial. La magnitud de inhibición asociada con las muestras de medios acondicionados se compara con la magnitud de inhibición asociada con el control positivo. Según una realización preferida, la composición fluida implantable se considera inhibidora si los medios acondicionados inhiben aproximadamente el 20% de lo que puede inhibir el control positivo.

Recipiente de transporte: Inmediatamente después del cambio de medios, la composición fluida implantable se empaqueta para su envío. Según una realización, los mismos tubos de cultivo usadas para cultivar las células en el material implantable se equipan con tapas de cierre hermético estériles para su envío. Para reducir el riesgo de decantación de partículas y/o células durante el aclarado final, puede modificarse el recipiente de envío para incluir, por ejemplo, un filtro u otro dispositivo de atrapamiento con un tamaño de poro que deje pasar los medios y la disolución de aclarado, pero que no pueda decantar partículas y/o células.

Si la composición fluida implantable se envía en medios que contienen suero, justo antes del implante, la composición fluida implantable se aclara, preferiblemente dentro del tubo de cultivo. Luego, se elimina el filtro u otro medio de atrapamiento del recipiente de transporte y se extraen las partículas injertadas en células en una jeringa para su suministro. Se expulsa la disolución de aclarado en exceso de la jeringa y se acopla una aguja, catéter u otro dispositivo de suministro a la jeringa para su suministro al sitio de tratamiento. Luego se suministra la composición fluida al paciente, por ejemplo, según uno de los métodos de administración a modo de ejemplo discutidos a continuación. Si se transporta la composición fluida implantable en medios libres de suero, no es necesario realizar el procedimiento de aclarado final en el sitio clínico.

Según una realización alternativa, se extrae la composición fluida implantable del tubo de cultivo hacia una jeringa, junto con aproximadamente de 1 a 20 ml de los medios, o un volumen suficiente de los medios para el transporte y almacenamiento, la jeringa se tapa y el material se envía en la jeringa sellada. En el sitio de implante, los medios en exceso se expulsan de la jeringa. Entonces se acopla a la jeringa una aguja, un catéter u otro dispositivo de suministro para el suministro al sitio de tratamiento. Según esta realización, la composición fluida se suministra al paciente directamente desde la jeringa de transporte.

La composición implantable de la presente invención puede suministrarse en recipientes de producto final, incluyendo, por ejemplo, recipientes de cultivo tisular sellados de 50 ml o 60 ml modificados con tapas con filtros o jeringas precargadas, conteniendo cada uno de manera preferible aproximadamente 50-60 mg de material particulado injertado con de aproximadamente 7 x 10^{5} a aproximadamente 1 x 10^{6} células endoteliales totales en aproximadamente 45-60 ml, de manera preferible aproximadamente 50 ml de medio de crecimiento endotelial por alícuota. La carga de células total por paciente será preferiblemente de aproximadamente 0,6-12 x 10^{4} células por kg de peso corporal, pero no menos de 2 x 10^{3} y no más de 2 x 10^{5} células por kg de peso corporal.

Como se contempla en el presente documento, el material de la presente invención comprende células, preferiblemente células endoteliales vasculares, que son preferiblemente viables en aproximadamente un 90% a una densidad de, de manera preferible, aproximadamente 1,4-2,1 x 10^{4} células/mg de partículas en una realización preferida, y cuando son confluentes o casi confluentes, producen medios acondicionados que contienen heparán sulfato al menos aproximadamente 0,5-1,0, preferiblemente al menos aproximadamente 1,0 microgramos/10^{6} células/día. El TGF-\beta_{1} en medios acondicionados es al menos aproximadamente 200-300, preferiblemente al menos aproximadamente 300 picogramos/ml/día; el b-FGF en medios acondicionados está por debajo de aproximadamente 200 picogramos/ml, preferiblemente no más de aproximadamente 400 picogramos/ml.

Según otra realización, se añaden una o más sustancias adicionales a la composición fluida antes de la administración. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, agentes antiinflamatorios, glicosaminoglicanos, prostaglandinas, prostanoides, citocinas incluyendo, pero sin limitarse a, TGF y VEGF, angiotensina y compuestos relacionados, inhibidores de tirosina cinasa, inmunosupresores, vitaminas, glucocorticoides, antioxidantes, eliminadores de radicales libres, hormonas peptídicas, factores angiogénicos e inhibidores angiogénicos.

Portadores: Opcionalmente, según una realización, la composición fluida implantable incluye un fluido portador. Un fluido portador preferido son medios de crecimiento celular para facilitar la administración. Las administraciones simuladas en laboratorio de la composición fluida implantable indican que no es necesario un portador para conservar la integridad celular cuando se manipulan las composiciones fluidas. No se espera que las formulaciones de células tales como aquéllas descritas en el presente documento puedan estar libres de portadores u otros agentes que se emplean normalmente para conservar la integridad celular; o agentes que se emplean normalmente para mejorar el manejo y reducir la alteración inducida por la fuerza de cizallamiento de formulaciones no sólidas o fluidas.

Sin embargo, un portador puede servir para mejorar la confluencia y la viabilidad de las células dentro de la composición fluida, por ejemplo, durante el cultivo celular, incluyendo durante la expulsión de los medios acondicionados y la introducción de nuevos medios, durante la manipulación de la composición fluida implantable antes del transporte, mientras se extrae el material a la jeringa de suministro, y/o durante la expulsión del material desde la jeringa y el suministro del material al espacio perivascular u otro sitio objetivo.

El portador puede introducirse en el material implantable en una variedad de puntos durante el procedimiento de cultivo celular. Por ejemplo, el portador puede añadirse a la matriz particulada en el momento de hidratación de las partículas (antes de la siembra de células), justo antes de o en el momento de la siembra de células, y/o se añaden de manera creciente durante los cambios de medios programados en el procedimiento de cultivo celular. Al introducir previamente portador en el cultivo celular, aquellas células que posiblemente se ven afectadas negativamente pueden eliminarse y las células restantes pueden proliferar para mantener una población celular suficiente.

Alternativamente, el portador puede introducirse durante el último cambio de medios, cuando las células son confluentes o casi confluentes, y justo antes del implante. Sin embargo, se ha observado que la adición de un portador de glicerol no diluido justo antes de la administración puede dar como resultado un choque para las células tal vez, ahogando las células suficientemente hasta reducir la viabilidad celular deseada y la eficacia por debajo de niveles aceptables. Basándose en estas observaciones, es posible que añadir un fluido portador sumamente viscoso, tal como glicerol, a la composición fluida todo de una vez, pueda afectar negativamente a las células y debe evitarse.

Con el fin de evaluar la eficacia de otros fluidos portadores candidatos, se realizarán ensayos iniciales usando una alta razón de partícula con respecto a portador para determinar la cantidad mínima de portador necesaria para lograr los beneficios deseados. Los beneficios deseados que van a evaluarse incluyen, por ejemplo, la manipulación mejorada y la fluidez mejorada de la composición mientras se mantiene la viabilidad y eficacia celulares. Adicionalmente, se realizarán estudios para someter a prueba la capacidad para transformar una forma plana de la composición fluida implantable en una composición fluida particulada implantable, sin afectar a la viabilidad o función celular. Por ejemplo, las disoluciones de prueba iniciales incluirán sólo aproximadamente una disolución al 0,1-1% de un portador de 50 mg de partículas. Esta concentración aumentará por incrementos hasta un máximo de aproximadamente una disolución al 10% de un portador de 50 mg de partículas.

Se realizarán ensayos posteriores en los que se añade un fluido portador de manera creciente durante todo el transcurso del cultivo, comenzando en el momento de hidratación de las partículas o siembra de células, de modo que en el momento en el que las células en la composición fluida implantable hayan llegado a la confluencia y estén listas para ser enviadas y/o administradas a un paciente, la concentración del fluido portador en el material implantable haya aumentado desde una menor razón tolerable para la unión celular temprana hasta una mayor razón óptima de fluido portador con respecto a partículas. Por ejemplo, según un protocolo a modo de ejemplo, una disolución de portador al 0,1% se añadirá al material particulado en el momento de la hidratación inicial y en cada cambio de medios posterior, hasta una disolución final de portador al 1%. Se espera que algunas células se pierdan en cada introducción del fluido portador, pero que la mayoría de las células se incorporen por sí mismas a la composición fluida implantable acondicionada con un portador y puedan crecer hasta confluencia o casi confluencia dentro de este entorno.

Los portadores incluyen, sin limitación, glicerol diluido, alginato (preferiblemente disolución de alginato aproximadamente al 1%), azúcares de dextrano o dextrosa (preferiblemente disolución de dextrosa o dextrano aproximadamente al 1-10%), otros azúcares incluyendo, por ejemplo, glucosa, sacarosa y fructosa, almidones (preferiblemente disolución de hidroxietilalmidón aproximadamente al 6%), gelatina (preferiblemente disolución de gelatina aproximadamente al 1-2%), medios de crecimiento endotelial, medios basales endoteliales, otros medios de crecimiento celular o soluciones salinas tamponadas neutras. Se contemplan intervalos de disolución en porcentaje adicionales pero no se definen expresamente en el presente documento. Se esperan variaciones dependiendo, en parte, del tipo de matriz biocompatible usada, el tipo de célula injerta en la misma y el modo de administración elegido para el suministro. Por ejemplo, los medios de cultivo celular usados para la hidratación inicial y los cambios de medios posteriores pueden incluir de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 10% en volumen de fluido portador, dependiendo del portador elegido. En general, el portador seleccionado debe ser no citotóxico a la dosificación y concentración empleadas y suficientemente permeable para permitir que el aire y los nutrientes fluyan hacia su interior (para soportar el crecimiento celular) y hacia fuera (para eliminar los productos de desecho celular) de la composición implantable.

Efecto del portador de glicerol sin diluir sobre la viabilidad celular: Se sembraron células endoteliales aórticas porcinas en 100 mg de partículas de Gelfoam y se les permitió proliferar hasta confluencia. Se recogió la composición fluida implantable, se colocó en tubos de 50 ml y se mezcló con alícuotas de 3 ml de glicerol sin diluir antes de colocarse en jeringas acopladas a agujas de calibre 24, 26 ó 27. Los contenidos de todas las jeringas se expulsaron lentamente a través de agujas acopladas y se recogieron en tubos de 50 ml. Sólo el 0-5% de todas las células visibles después de la expulsión eran viables (el 95-100% de las células estaban muertas) en comparación con el 86-93% de viabilidad para las células en el mismo ensayo sin la adición de glicerol, ilustrando drásticamente el efecto nocivo sobre la viabilidad celular de este líquido portador cuando se añade sin diluir como una única dosis a las células confluentes. No se determinó si el uso de este portador era beneficioso para mantener la confluencia de las monocapas celulares.

Extrusión y modificación de material plano: Según otra realización se modifica una composición sólida, semisólida o de gran diámetro para formar partículas que puedan suministrarse a través de un dispositivo de suministro inyectable, después de que las células se hayan injertado suficientemente en la composición implantable y hayan alcanzado la confluencia. Según una realización, las células se cultivan en presencia de un fluido portador, como se describió en mayor detalle anteriormente, para mantener la confluencia e integridad celulares durante la modificación del material.

Según una realización, una vez que las células han alcanzado la confluencia en una forma plana de la composición implantable, se transfiere la composición a una jeringa. Con el fin de alojar la forma plana, la jeringa puede no tener aguja o puede tener una aguja de gran calibre. La jeringa succiona la forma plana flexible y entonces, a presión, la composición de células injertadas se extruye a través de la abertura de la jeringa para formar una composición fluida no plana. Con el fin de obtener un tamaño de partícula preferido, pueden ser necesarios varios pasos a través de la jeringa. Por ejemplo, puede hacerse pasar el material a través de la jeringa en primer lugar sin aguja, seguido del paso a través de la aguja de gran calibre y luego el paso a través de agujas de menores calibres hasta que el material haya alcanzado el tamaño de partícula y la fluidez deseados. Los múltiples pasos y modificaciones por incremento del tamaño de partícula son deseables para reducir la cantidad de daño a las células y para mantener la confluencia celular durante una modificación de material de este tipo.

Selladores quirúrgicos: En algunas otras realizaciones, la composición fluida de la presente invención puede servir adicionalmente como sellador anastomótico específicamente o sellador quirúrgico en general. En una realización de doble fin de este tipo, la composición también es eficaz para sellar la unión de dos o más estructuras tubulares o para sellar un hueco en una estructura tubular cuando se pone en contacto con una superficie exterior de la(s) estructura(s), o se aplica en una superficie en arco o exterior, o se aplica de modo circunferencial. Un sellador de este tipo puede eliminar un requisito de suturas que además pueden dañar el tejido vascular, por ejemplo, y contribuir al traumatismo endotelial luminal. Un sellador de este tipo también puede proporcionar una estabilidad adicional en la proximidad de una anastomosis, reforzando de ese modo cualquier reparación de la sutura. Todo lo que se requiere es que las funciones o propiedades de tipo sellador de esta composición de doble fin no interfieran con o alteren la expresión coincidente del fenotipo deseado de las células y la funcionalidad a base de células de la composición.

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Para los fines de ciertas realizaciones de sellador, la composición fluida comprende un sustrato biocompatible que en sí mismo comprende un componente que tiene propiedades de sellado, tal como, pero sin limitarse a, una red de fibrina, mientras que tiene también la propiedades requeridas para soportar las poblaciones de células endoteliales o de tipo endotelial. Además, el sustrato biocompatible per se puede tener tanto propiedades de sellado así como aquéllas requeridas para soportar una población de células. En el caso de otras realizaciones, puede contribuirse en la funcionalidad del sellador, al menos en parte, mediante las células. Por ejemplo, se contempla que las células asociadas con la composición produzcan una sustancia que puede modificar un sustrato, de modo que el sustrato adquiera propiedades de sellado, mientras que también presenta/mantiene su funcionalidad celular requerida. Ciertas células pueden producir esta sustancia de manera natural mientras que otras células pueden modificarse mediante ingeniería para ello.

Vida de almacenamiento de la composición fluida implantable: La composición fluida implantable que comprende una población de células confluente, casi confluente o posconfluente puede mantenerse a temperatura ambiente en un estado estable y viable durante al menos dos semanas. Preferiblemente, esta composición fluida implantable se mantiene en aproximadamente 45-60 ml, de manera más preferible aproximadamente 50 ml, de medios de transporte con o sin FBS adicional. Los medios de transporte comprenden medios EGM-2 sin rojo de fenol. Puede añadirse FBS al volumen de los medios de transporte hasta aproximadamente FBS al 10%, o una concentración total de aproximadamente FBS al 12%. Sin embargo, dado que debe eliminarse el FBS de la composición fluida implantable antes del implante, se prefiere limitar la cantidad de FBS usada en los medios de transporte para reducir la duración del aclarado requerido antes del implante.

Crioconservación de la composición fluida implantable: La composición fluida implantable que comprende una población de células confluente, casi confluente o posconfluente puede crioconservarse para su almacenamiento y/o transporte a la clínica sin reducir su potencia clínica o integridad tras el descongelamiento eventual. Preferiblemente, se crioconserva la composición fluida implantable en un criovial de 15 ml (Nalgene®, Nalgene Nunc Int'l, Rochester, NY) en una disolución de aproximadamente 5 ml de disolución CS-10 CryoStor (BioLife Solutions, Oswego, NY) que contiene DMSO aproximadamente al 10%, dextrano aproximadamente al 2-8% y FBS aproximadamente al 50-75%. Los crioviales se colocan en un baño de isopropanol-agua frío, se transfieren a un congelador de -80ºC durante 4 horas, y posteriormente se transfiere a nitrógeno líquido (de -150 a -165ºC).

Las alícuotas crioconservadas de la composición fluida implantable se descongelan entonces lentamente a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos, seguido de aproximadamente 15 minutos adicionales en un baño de agua a temperatura ambiente. Luego se lava el material aproximadamente 3 veces en aproximadamente 15 ml de medios de lavado. Los medios de lavado comprenden EBM sin rojo de fenol y con o sin gentamicina 50 \mug/ml. Los primeros dos procedimientos de aclarado se llevan a cabo durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. El procedimiento de aclarado final se lleva a cabo durante aproximadamente 30 minutos a 37ºC en un 5% de CO_{2}.

Después de los procedimientos de descongelamiento y aclarado, el material crioconservado se deja reposar durante aproximadamente 48 horas en aproximadamente 10 ml de disolución de recuperación. Para las células endoteliales porcinas, la disolución de recuperación es EBM-2 complementado con FBS al 5% y gentamicina 50 \mug/ml a 37ºC en un 5% de CO_{2}. Para las células endoteliales humanas, la disolución de recuperación es EGM-2 sin antibióticos. Puede llevarse a cabo un acondicionamiento adicional tras la descongelación durante al menos otras 24 horas antes de su uso y/o empaquetado para su almacenamiento o transporte.

Carga y captación en un dispositivo de suministro: Las alícuotas de la composición fluida se empaquetan y transportan en tubos de cultivo o jeringas, como se describió en mayor detalle anteriormente, en aproximadamente 45-60 ml, de manera preferible aproximadamente 50 ml, de medios de transporte, con o sin suero, para soportar la células hasta 14 días sin cambio de medios. Antes del implante, se decantan los medios en exceso y, si había suero presente en los medios de transporte, se aclara varias veces la composición fluida implantable para eliminar cualquier suero restante. Puesto que ciertas preparaciones de formas particuladas de la composición fluida implantable son propensas a la separación y, por tanto, la pérdida de la confluencia de las células, la composición debe permanecer dentro del recipiente de transporte durante el procedimiento de aclarado final. Adicionalmente, se prefieren modificaciones al recipiente de transporte, incluyendo, pero sin limitarse a, filtros y/o compartimentos de medios separados, para mantener la integridad de la composición fluida implantable durante las manipulaciones.

Después de varios aclarados de la composición fluida implantable, aproximadamente 1-3 ml de disolución de aclarado permanece sobre la composición fluida implantable para facilitar la captación del material en el dispositivo de suministro, por ejemplo, una jeringa. Entonces se manipula el dispositivo de suministro para extraer la composición fluida implantable al dispositivo de suministro, teniéndose cuidado de minimizar la alteración de la capa de células confluentes. Según otra realización, un dispositivo de carga de material, tal como una interfase con forma de embudo entre la abertura del recipiente de transporte y la jeringa de suministro, se usa para transferir el material al dispositivo de suministro con alteración celular reducida. Después de la transferencia del material al dispositivo de suministro, algunos de los líquidos restantes, aproximadamente 1 ml, se expulsan fuera del dispositivo de suministro para preparar el dispositivo de suministro y para llenar el volumen hueco. Aproximadamente 0-2 ml de la disolución de aclarado permanecen en la composición fluida implantable suministrada al paciente. La composición fluida implantable está ahora lista para su suministro al sitio de tratamiento.

Paso de la aguja: Para demostrar la utilidad de la presente invención, una composición fluida implantable particulada preferida (HAE injertada en partículas de Gelfoam) se hizo pasar a través de la abertura de una aguja de calibre 22 (diámetro interno = 0,016 pulgadas). Alternativamente, otra composición preferida (PAE injertado en partículas de Gelfoam) se hizo pasar a través de la abertura de una aguja en el intervalo de aproximadamente un aguja de calibre 21 (diámetro interno = 0,019 pulgadas) a una aguja de calibre 28 (diámetro interno = 0,007 pulgadas).

Como se demuestra posteriormente en la tabla 1, el paso de una realización de la presente invención a través de la aguja con un diámetro interno dentro de estos intervalos no afecta negativamente el número, la viabilidad y funcionalidad celular de las células que se hacen pasar a través de la aguja. No se espera que una preparación celular pueda captarse y descargarse desde las aberturas que oscilan desde calibre 21 (diámetro interno = 0,019 pulgadas) a calibre 30 (diámetro interno = 0,006 pulgadas), preferiblemente calibre 24 (diámetro interno = 0,012 pulgadas), sin consecuencia o compromiso en la confluencia o funcionalidad. Tampoco se esperaba, que las células funcionaran tan bien después del paso a través de las agujas con sólo medios de crecimiento celular como fluido portador.

Como se describe posteriormente, las células se mezclaron con la matriz particulada y se dejaron proliferar hasta confluencia. Tres días después de la confluencia, se hizo pasar la composición fluida resultante a través de una aguja estéril con un diámetro interno en el intervalo de aproximadamente 0,007 pulgadas a aproximadamente 0,018 pulgadas, se recogieron y se permitió que se recuperaran durante un periodo de 48 horas en Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). Después del periodo de recuperación, los medios se acondicionaron durante 24 horas. Entonces, se evaluaron los medios acondicionados de las células posteriores al paso. Se evaluaron los medios acondicionados después del paso para determinar niveles aceptables de producción de factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF), heparán sulfato (HS) y factor de crecimiento transformante (TGF-\beta_{1}). Adicionalmente, se realizó un ensayo de células del músculo liso para mostrar la inhibición de la proliferación de células del músculo liso por los medios. Los resultados de los ensayos de la composición que se hizo pasar a través de la aguja se compararon con las muestras que no se habían hecho pasar a través de la aguja.

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TABLA 1 Paso a través de la aguja de calibre 22

1

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Paso a través de la aguja de calibre 24

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Paso del catéter: En otra demostración de las inesperadas propiedades de las composiciones fluidas de la presente invención, se cargó en y se administró una formulación preferida a través de una inyección y/o medio de penetración, por ejemplo, un catéter de aguja (tabla 2). En un estudio, el catéter de aguja era un catéter francés 6 que incorporaba una aguja de Nitinol de pared delgada (diámetro externo = calibre 24; diámetro interno = calibre 22) (Trans Vascular Corp., Palo Alto, CA).

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El paso de la composición fluida a través de un catéter de aguja con un diámetro interno dentro de este intervalo no afectó negativamente el número de células, viabilidad y rendimiento biológico de las células después del paso. Según una realización preferida, se sembraron las células sobre la matriz particulada y se permitió que proliferaran hasta confluencia. Tres días después de la confluencia, se hizo pasar la composición fluida a través de un catéter de aguja estéril con un diámetro interno en el intervalo de aproximadamente 0,007 pulgadas a aproximadamente 0,018 pulgadas, se recogió y se permitió que se recuperara durante un periodo de 24 horas en Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). Después del periodo de recuperación, los medios se acondicionaron durante 24 horas. Entonces se evaluaron los medios acondicionados de las células que se hicieron pasar a través de la aguja. Se evaluaron los medios acondicionados después del paso para determinar niveles aceptables de producción de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), heparán sulfato (HS) y factor de crecimiento transformante-\beta_{1} (TGF-\beta_{1}). Adicionalmente, se realizó un ensayo de células del músculo liso para mostrar la inhibición de la proliferación de células del músculo liso por los medios. Se compararon los resultados de los ensayos de las células que se hicieron pasar a través de la aguja con los resultados de las muestras de material particulado injertado con células que no se habían hecho pasar a través de un catéter de aguja (véase la tabla 2).

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TABLA 2 Paso a través del catéter de aguja

4

Administración endovascular: La composición fluida puede administrarse por vía intraluminal, es decir por vía endovascular. Por ejemplo, la composición puede suministrarse mediante cualquier dispositivo que pueda insertarse dentro del vaso sanguíneo que va a tratarse. Puede usarse sistemas de orientación endoscópica para ubicar el dispositivo de suministro en el sitio de administración, incluyendo, por ejemplo, ecografía intravascular (IVUS), ecografía Doppler a color, ecografía dúplex, otra ecografía rutinaria, angiografía, angiografía de resonancia magnética (MRA), obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), exploración mediante TAC, fluoroscopía para identificar la ubicación de una endoprótesis y/u otros sistemas de orientación endoscópica conocidos en el campo. Adicionalmente, el sitio de la administración puede ubicarse usando palpación táctil. El suministro endovascular de la formulación al sitio de administración puede producirse solo o en combinación y antes de, en el momento de, o después de otro procedimiento endovascular, tal como angioplastia con balón o implante de una endoprótesis u otro dispositivo.

En un caso, se equipa el dispositivo de suministro intraluminal con un dispositivo de paso a través o penetración que penetra en la pared luminal de un vaso sanguíneo para alcanzar una superficie no luminal de un vaso sanguíneo. Entonces, se deposita la composición fluida en una superficie no luminal de un vaso sanguíneo en, adyacente a o en la proximidad de un sitio objetivo lesionado o enfermo.

Se contempla en el presente documento que una superficie no luminal, también denominada extraluminal, pueda incluir una superficie exterior o perivascular de un vaso, o pueda estar dentro de la adventicia, media o íntima de un vaso sanguíneo, por ejemplo. Para los fines de esta invención, no luminal o extraluminal es cualquier superficie excepto una superficie interior de la luz.

Los dispositivos de penetración contemplados en el presente documento pueden permitir, por ejemplo, un solo punto de suministro o una pluralidad de puntos de suministro dispuestos en una configuración geométrica deseada para llevar a cabo el suministro de la composición fluida a una superficie no luminal de un vaso sanguíneo sin alterar un sitio objetivo lesionado o enfermo. Una pluralidad de puntos de suministro pueden disponerse, por ejemplo, en una disposición en círculo, ojo de buey o serie lineal para nombrar unos pocos. También el dispositivo de penetración puede estar en forma de un perforador de endoprótesis, tal como pero sin limitarse a, una endoprótesis con balón que incluye una pluralidad de puntos de suministro.

Administración percutánea: Para los fines de la presente invención en general, la administración de la composición fluida se ubica en un sitio en, adyacente a o en la proximidad de un sitio que necesita tratamiento. El sitio de deposición de la composición fluida implantable es extraluminal. Como se contempla en el presente documento, la deposición extraluminal ubicada puede llevarse a cabo por vía percutánea como sigue.

La composición fluida puede suministrarse por vía percutánea usando una aguja, catéter u otro dispositivo de suministro adecuado. La composición fluida puede administrarse por vía percutánea coincidiendo con el uso de un método de orientación para facilitar el suministro al sitio que necesita tratamiento. La etapa de orientación es opcional. Los sistemas de orientación endoscópica pueden usarse para ubicar el sitio de administración extraluminal, incluyendo, por ejemplo, ecografía intravascular (IVUS), ecografía Doppler a color, ecografía dúplex, otra ecografía rutinaria, angiografía, angiografía de resonancia magnética (MRA), obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), exploración mediante TAC, fluoroscopía para identificar la ubicación de una endoprótesis y/u otros sistemas de orientación endoscópica conocidos en el campo. Adicionalmente, el sitio de administración puede ubicarse usando palpación táctil. Tras la entrada en el espacio perivascular, el médico deposita la composición fluida en un sitio extraluminal en, adyacente a o en la proximidad del sitio que necesita tratamiento. La etapa de orientación o identificación se realiza opcionalmente y no requiere poner en práctica los métodos de la presente invención.

La composición fluida implantable puede suministrarse localmente a un sitio extraluminal expuesto quirúrgicamente en, adyacente a o en la proximidad de un sitio que necesita tratamiento. En este caso, se orienta y dirige el suministro mediante la observación directa del sitio que necesita tratamiento. También en este caso, puede ayudarse al suministro mediante el uso coincidente de una etapa de identificación como se describió anteriormente. De nuevo, la etapa de identificación es opcional.

Sitio de administración: Un dispositivo de penetración puede insertarse a través de la superficie luminal interior de un vaso sanguíneo usando un dispositivo de suministro endovascular o través del tejido circundante en un suministro percutáneo. La administración puede dirigirse a una ubicación proximal con respecto a, distal con respecto a o en un sitio objetivo lesionado o enfermo. En algunos sujetos clínicos, la inserción del dispositivo de penetración en un sitio objetivo lesionado o enfermo puede alterar el sitio objetivo lesionado o enfermo. Por consiguiente, en tales sujetos, debe tenerse cuidado de insertar el dispositivo de penetración en una ubicación a una distancia desde un sitio lesionado o enfermo, preferiblemente una distancia determinada por el médico, regido por las circunstancias específicas en cuestión.

Preferiblemente, la composición fluida se deposita sobre una superficie perivascular de un vaso sanguíneo, ya sea en, adyacente a o en la proximidad de un sitio objetivo lesionado o enfermo que va a tratarse. La composición puede depositarse en una variedad de ubicaciones en relación con un sitio objetivo lesionado o enfermo, por ejemplo, en un sitio objetivo lesionado o enfermo, adyacente a un sitio objetivo lesionado o enfermo, por ejemplo, aguas arriba de un sitio objetivo lesionado o enfermo, sobre una superficie del vaso exterior opuesta de un sitio objetivo lesionado o enfermo. Un sitio adyacente puede estar dentro de 2 mm a 20 mm del sitio de un sitio objetivo lesionado o enfermo. El sitio de deposición puede estar dentro de 21 mm a 40 mm; en aún otra realización preferida, un sitio de depósito está dentro de 41 mm a 60 mm. En otra realización preferida, un sitio de depósito está dentro de 61 mm a 100 mm. Alternativamente, un sitio adyacente es cualquier otra ubicación adyacente determinada por el médico en la que la composición depositada puede presentar un efecto deseado.

Una zona de administración plana opcional puede crearse dentro de un sitio objetivo extraluminal antes de la administración de la composición fluida implantable. Una zona de administración plana es un área preparada para aceptar un volumen de la composición fluida implantable y puede crearse usando, por ejemplo, disección roma, disección con balón, disección fluida u otra técnica de disección conocida en el campo. La zona de administración puede crearse usando un dispositivo de disección endovascular o perivascular. El implante de la composición fluida en un sitio objetivo se facilita mediante la creación de una zona de administración. No se requiere un área de administración para poner en práctica la presente invención.

Se contempla que la composición fluida implantable pueda administrarse en una variedad de configuraciones en el sitio de administración. Por ejemplo, la composición fluida implantable puede administrarse en una aplicación lineal, paralela a la dirección del flujo sanguíneo; en una aplicación de circunferencial, perpendicular a la dirección del flujo sanguíneo; o en una masa en el sitio de administración. También se contempla que la etapa de disección anterior y el suministro de la composición fluida puedan tener lugar simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, la composición fluida implantable puede usarse en sí misma para llevar a cabo la disección fluida si se suministra a presión. Sin embargo, este método de disección supone un riego de traumatismo del tejido creado por el suministro a presión de la composición fluida y puede alterar la confluencia de las células mediante el paso a presión de la composición fluida implantable a través del espacio perivascular. Alternativamente, puede insertarse un dispositivo de suministro en el espacio extraluminal para llevar a cabo la disección roma y administrarse la composición fluida implantable a medida que se retira el dispositivo de suministro de la zona de administración plana recién creada.

Visualización del vaso: El sitio de administración puede ubicarse con la asistencia de un sistema de orientación, por ejemplo un sistema de orientación endoscópica, por ejemplo, ecografía intravascular (IVUS). La ecografía intravascular proporciona una imagen de corte transversal en 360º de una luz del vaso sanguíneo, incluyendo los vasos y las estructuras circundantes.

El sistema de orientación endoscópica puede ser angiografía. Un agente de contraste puede añadirse a la suspensión de células particuladas para permitir la obtención de imágenes del dispositivo de penetración y la determinación de la posición del dispositivo de penetración y la colocación de la suspensión de células particuladas dentro del cuerpo de un paciente usando, por ejemplo, angiografía de contraste.

Los sistemas de orientación endoscópica adicionales para ubicar el sitio de administración extraluminal, incluyen, pero no se limitan a, ecografía Doppler a color, ecografía dúplex, otra ecografía rutinaria, angiografía de resonancia magnética (MRA), obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), exploración mediante TAC, fluoroscopía para identificar la ubicación de una endoprótesis y/u otros sistemas de orientación endoscópica conocidos en el campo. Adicionalmente, el sitio de administración puede ubicarse usando palpación táctil.

La composición fluida implantable puede visualizarse dentro del espacio extraluminal tras la administración usando, por ejemplo, angiografía o IVUS. Según una realización, se realiza la visualización tras la administración para garantizar que la composición fluida implantable se ha suministrado al espacio extraluminal en lugar de al espacio luminal.

Dosificación: Cada administración que puede suministrarse de la composición fluida puede contener aproximadamente 1 x 10^{6} células en un volumen de aproximadamente 50-60 mg de partículas implantables. Se contempla que puedan suministrarse o bien una única administración o bien múltiples administraciones a un solo sitio de tratamiento. También se contempla que puedan suministrarse múltiples administraciones de la composición fluida a un paciente. Las variaciones en la administración múltiple incluyen administrar múltiples administraciones a un solo sitio de tratamiento, administrar una única o múltiples administraciones a una variedad de sitios de tratamiento y/o proporcionar administraciones durante un acontecimiento de un solo tratamiento o a lo largo de un curso de tratamiento prolongado.

Cada administración de la composición fluida contendrá un volumen hueco, una parte del volumen de administración asignado que permanece en el dispositivo de suministro tras la administración. El volumen hueco puede oscilar desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 50% del volumen de la composición fluida cargada en el dispositivo de suministro. Al tener en cuenta el volumen hueco, se cargan un mayor número de células y partículas en un dispositivo de suministro de lo que estaba previsto para la administración real a un paciente. Por supuesto, el volumen hueco y el ajuste auxiliar en el volumen de la composición fluida cargada en el dispositivo de suministro dependerán del dispositivo de suministro escogido.

Cada administración que puede suministrarse de la composición fluida puede empaquetarse como una única administración. Cuando se requieren múltiples dosis para la administración a un solo sitio de tratamiento, la cantidad de dosificación deseada puede cargarse en un único dispositivo de suministro y se administra durante una sola administración. Sin embargo, cuando se requieren múltiples dosis para la administración a múltiples sitios de tratamiento dentro de un único paciente, es preferible usar múltiples alícuotas de una cantidad fija del producto que puede suministrarse a lo largo de múltiples administraciones divididas de una dosificación mayor. Las ventajas de las alícuotas de administración fija incluyen reducir las imprecisiones de dosificación introducidas separando una dosificación mayor en múltiples dosificaciones más pequeñas, reducir las imprecisiones de dosificación introducidas mediante las limitaciones de la medición inherentes en el dispositivo de suministro y reducir la variabilidad de dosificación introducida mediante el volumen en exceso de los medios de transporte requeridos para una mayor alícuota de la composición. Adicionalmente, la división de una dosificación mayor en alícuotas más pequeñas requiere la manipulación innecesaria de la composición, incluyendo romper las partículas adyacentes, romper las monocapas de células confluentes y provocar otras lesiones a las células.

Las múltiples administraciones de la composición fluida implantable pueden proporcionarse a lo largo de un curso de tratamiento prolongado. Una dosis inicial de la composición fluida implantable puede administrarse en el momento del tratamiento primario o intervención vascular, seguido de posteriores administraciones mínimamente invasivas una vez cada 1-3 meses, o según sea necesario tal como lo determine un médico.

Flujo de retorno: Se realizó un estudio preclínico usando un solo sujeto de prueba porcino que se sometió a una administración endovascular de partículas de Gelfoam. Una suspensión de partículas de Gelfoam hidratadas, mezcladas con un agente de contraste, se cargó en un mecanismo de suministro a base de catéter y se insertó el catéter en la vasculatura del sujeto de prueba. Se dirigió el catéter al sitio de tratamiento, se insertó la aguja a través de la pared sanguínea, en el espacio perivascular, y se inyectó la suspensión en el espacio perivascular. El procedimiento de inyección y el seguimiento se visualizaron con angiografía de contraste.

No fue evidente ningún flujo de retorno de la suspensión a la luz del vaso a partir de la angiografía de contraste, tanto en el momento de la inyección como tras la administración y la eliminación de la aguja. Además, la posterior evaluación histológica de las secciones de tejido tratado, teñidas mediante tinción con elastina de Verhoeff, no mostró ninguna evidencia de que la suspensión se escapara de la adventicia a o bien la luz del vaso o bien a los tejidos circundantes.

Se contempla que puede inyectarse una cantidad terapéutica de la composición fluida implantable, de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 2 ml, en el espacio perivascular en un único sitio de inyección antes que la presión desde el espacio perivascular sea suficiente para dar como resultado el flujo de retorno de la composición fluida implantable a la luz del vaso.

Ejemplo 1 Estudio de intervención vascular animal

Este ejemplo proporciona protocolos experimentales para someter a prueba y usar una realización preferida de la presente invención para reducir la incidencia de las secuelas clínicas asociadas con la intervención vascular en sujetos de prueba animales. Al usar procedimientos quirúrgicos convencionales, se induce una lesión a la superficie de la luz interior mediante angioplastia percutánea con balón y la colocación de una endoprótesis realizada en las arterias femorales. Entonces se dispone la composición fluida implantable de la presente invención en el espacio perivascular adyacente al sitio de la angioplastia y el vaso tratado con endoprótesis; los detalles de un procedimiento a modo de ejemplo se exponen a continuación. Como se describió anteriormente, pueden variarse la colocación y formulación de la composición fluida implantable.

Específicamente, el estudio incluye 26 sujetos de prueba porcinos que se someten a angioplastia percutánea con balón e implante de endoprótesis. Los procedimientos de angioplastia percutánea con balón convencional e implante de endoprótesis se realizarán según técnicas operatorias convencionales. La composición fluida implantable se aplicará al sitio del inflado del balón y la colocación de la endoprótesis y alrededores como se describe a continuación después de completar la angioplastia y la colocación de endoprótesis y establecer un flujo a través del vaso tratado.

Procedimiento quirúrgico: Para cada sujeto de prueba que se somete a angioplastia percutánea con balón e implante de endoprótesis, el sujeto se intubará y conectará a un dispositivo de seguimiento cardiaco en la posición supina. El acceso a la arteria carótida derecha con una envoltura francesa 7 se obtendrá mediante incisión, y un balón para angioplastia de 5,0 mm de diámetro (Guidant Corp., Indianápolis, IN) se hará avanzar hacia la arteria femoral bajo la orientación fluoroscópica. Se realizará y se registrará la angiografía mediante cinerradiografía. Se lesionarán las arterias femorales derecha e izquierda mediante inflados de balón de 30 segundos entre 8 a 10 atmósferas (3 inflados por lado, en los segmentos solapantes). Las endoprótesis billares megaligadas (Guidant, 6,0-8,0 m x 18 mm) se harán avanzar hacia las arterias femorales bajo la orientación fluoroscópica y se colocarán en el sitio de la angioplastia.

Después de la angioplastia y la colocación de la endoprótesis, la composición fluida que comprende células endoteliales y la matriz particulada, la matriz particulada sola, o nada se suministrarán al aspecto perivascular de las arterias femorales izquierda u derecha mediante un catéter de inyección con aguja. Se orientará el catéter de inyección con aguja al sitio de administración usando, por ejemplo, angiografía o ecografía intravascular para identificar la ubicación de la endoprótesis. La composición fluida implantable se administrará en una ubicación proximal con respecto a la endoprótesis, por ejemplo, una ubicación aproximadamente 1-20 mm proximal con respecto al extremo proximal de la endoprótesis, en una ubicación distal con respecto a la endoprótesis, por ejemplo, una ubicación aproximadamente 1-20 mm distal con respecto al extremo distal de la endoprótesis, y en un sitio a lo largo de la longitud de la endoprótesis. Cada ubicación de inyección recibirá aproximadamente 0,1-1,0 ml de la composición fluida implantable que contiene aproximadamente 40-70 mg de partículas a una densidad de aproximadamente 0,8-2,5 x 10^{4} células/mg. Todos los sujetos de prueba recibirán heparina en la operación y se les administrará diariamente aspirina después de la cirugía.

Diez sujetos de prueba recibirán la composición fluida implantable en el día de la cirugía. Diez sujetos de prueba recibirán la matriz particulada control sola en día de la cirugía. 6 sujetos de prueba adicionales recibirán una endoprótesis, pero no recibirán ningún tipo de implante. Estos 6 sujetos de prueba se usarán para la comparación con el patrón de cuidado. La carga celular total en base al peso corporal será de aproximadamente 1-8 x 10^{4} células por kg.

Después de la finalización del procedimiento de angioplastia, la colocación de la endoprótesis y la inyección de la composición fluida implantable en el espacio perivascular adyacente, un fluoroscopio de brazo en C se colocará sobre el cuello del sujeto de modo que se visualizará el vaso tratado. Bajo fluoroscopía continua, se inyectarán 10-15 cc del contraste yodado (Renograffin, concentración completa). Se registrará y almacenará la cineangiografía para su comparación con el angiograma antes del sacrificio. Se realizará la angiografía final para evaluar la permeabilidad del vaso y la condición de los sitios de inyección del material particulado implantable.

Se administrará heparina antes de la angioplastia como inyección en bolo 100 U/kg más infusión continua 35 U/kg/h y se mantendrá hasta el final de la cirugía. Se administrarán dosis en bolos adicionales (100 U/kg), según sea necesario para mantener ACT \geq 200 segundos.

Permeabilidad del vaso: Se confirmará la permeabilidad del vaso tratado mediante mediciones de flujo de acceso usando ecografía Doppler de flujo a color inmediatamente después de la cirugía, 3-7 días tras la cirugía y una vez por semana después de eso. Se monitorizarán atentamente los vasos tratados para determinar el flujo sanguíneo. El flujo a través del vaso debe detectarse hasta e incluyendo el día 7 tras la cirugía para los sujetos de prueba que se colocan en el estudio. Si no se detecta el flujo a través de un vaso antes de o en el día 7, el sujeto de prueba se retirará del estudio y se hará cada intento para reemplazar al sujeto de prueba, de modo que se mantenga el número original de sujetos/grupo.

Procedimientos de patología: La mitad de los sujetos de prueba animales (5 tratados; 5 control; 3 sujetos sin implante) serán sacrificados 3-5 días después de la cirugía. El resto de los sujetos de prueba animales (5 tratados; 5 control; 3 sujetos sin implante) serán sacrificados un mes después de la cirugía.

Los sujetos de prueba animales se anestesiarán usando pentobarbital sódico (65 mg/kg, i.v.). Se expondrá el vaso tratado y se realizará una fotografía digital del vaso tratado y el tejidos y la vasculatura circundantes. Entonces se colocará un fluoroscopio de brazo en C sobre el cuello del animal de modo que pueda visualizarse el vaso tratado. Bajo fluoroscopia continua, se inyectarán 10-15 cc de contraste yodado (Renograffin, concentración completa). Se registrará la cineangiografía a ángulos de 0º y 90º al vaso tratado. Se determinará la permeabilidad del vaso y el grado de estenosis mediante la lectura ciega de los angiogramas de la necropsia en comparación apareada con los angiogramas después de la colocación. Los angiogramas se clasificarán en una escala de 0-5 dependiendo del grado de estenosis observado en el angiograma. El esquema de clasificación empleado fue como sigue: 0 = 0% de estenosis, 1 = 20% de estenosis, 2 = 40% de estenosis, 3 = 60% de estenosis, 4 = 80% de estenosis y 5 = 100% de estenosis. Se prevé que los vasos tratados con la composición fluida implantable de la presente invención mostrarán una disminución de la estenosis en comparación con los sujetos control tras el examen de los angiogramas.

Histología: La mitad de los sujetos de prueba animales (5 tratados; 5 control; 3 sujetos sin implante) se sacrificarán 3 días después de la cirugía. El resto de los sujetos de prueba animales (5 tratados; 5 control; 3 sujetos sin implante) se sacrificarán un mes después de la cirugía.

Una necropsia limitada, definida como el examen macroscópico del sitio de administración y tejido circundante incluyendo drenar los ganglios linfáticos se realizará en todos los sujetos de prueba. Se recogerá y guardará el tejido de los principales órganos, incluyendo el cerebro, los pulmones, los riñones, el hígado, el corazón y el bazo, para todos los sujetos sacrificados un mes después de la cirugía. Deben analizarse los órganos sólo si surgen hallazgos inusuales del examen macroscópico de la superficie externa del organismos o del examen microscópico de los sitios de administración y el tejido circundante.

Se cortarán todos los vasos tratados y tejidos circundantes, se fijarán en formalina al 10% (o equivalente) y se impregnarán con glicolmetacrilato (o equivalente). Al usar secciones de aproximadamente de 3 \mum de espesor cortadas con un cuchillo de acero inoxidable con perfil de C (o equivalente), se prepararán las secciones a partir de cada uno de los tres segmentos del vaso tratado: proximal con respecto al material inyectable; en el sitio del material inyectable: y distal con respecto al material inyectable. Se montarán estas secciones sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina (o equivalente) y se teñirán con hematoxilina y eosina o tinción con elastina de Verhoeff. Los portaobjetos teñidos se examinarán y puntuarán con respecto a la inflamación perivascular y luminal (aguda y crónica), degeneración vascular, trombos y fibrosis, y para determinar la presencia de células del músculo liso y células endoteliales. Las secciones adicionales de tejido derivado de los sujetos sometidos a 1 mes de prueba se teñirán con elastina de Verhoeff, y se examinarán y puntuarán con respecto al tamaño del vaso, y el grado de lesión del vaso, hiperplasia de la íntima y reestenosis. También pueden teñirse secciones adicionales con marcadores específicos para células endoteliales y del músculo liso, incluyendo, pero sin limitarse a, PECAM-1 y actina \alpha-SMC. También se examinará la luz residual, que refleja el cambio en la geometría del vaso después de la lesión y reparación. También las secciones teñidas con Verhoeff se someterán al análisis morfométrico usando planimetría digital computerizada con un microscopio de video y un software personalizado.

Se determinará la inflamación perivascular y luminal tanto de manera aguda (sujetos de 3-5 días) como crónica (sujetos de 1 mes). La inflamación aguda se caracteriza por granulocitos, principalmente neutrófilos, mientras que la inflamación crónica se caracteriza por macrófagos y linfocitos. Adicionalmente, también pueden teñirse secciones con los siguientes marcadores específicos: anticuerpo anti-CD45 para identificar leucocitos, anticuerpo anti-CD3 para identificar células T, CD79a para identificar células B y MAC387 para identificar monocitos/macrófagos.

Se examinarán y puntuarán los portaobjetos teñidos con respecto a la presencia de células del músculo liso y células endoteliales. Se evaluarán y puntuarán todas las secciones del vaso tratado, incluyendo la íntima/pseudoíntima, la parte interna de la media cerca de la luz, la parte externa (sitio de la adventicia) de la media cerca de la adventicia, y la adventicia. El tamaño de cada compartimento tisular, por ejemplo, la íntima, la media y la adventicia, se medirán en micrómetros. Se evaluará cada sección para determinar la presencia y/o el grado de cada uno de los siguientes criterios. Se evaluarán los indicios de inflamación, incluyendo, pero sin limitarse a, la presencia y el grado de neutrófilos, linfocitos, macrófagos, eosinófilos, células gigantes y células plasmáticas. Se evaluarán las secciones de tejidos para determinar la presencia de fibroblastos, neovascularización, calcificación, hemorragia, congestión, fibrina, fibrosis del injerto e infiltración del injerto. Adicionalmente se evaluarán las secciones de tejido para determinar indicios de degeneración, incluyendo, pero sin limitarse a, la degeneración, pérdida de elastina y/o la ausencia de la parte del tejido, vacuolización de las miofibras del músculo liso y/o calcificación del tejido. También se evaluarán las secciones de tejido para determinar la proliferación de células endoteliales, proliferación de las células de la subíntima, incluyendo, pero sin limitarse a, la neovascularización y la presencia de miofibras del músculo liso, fibroblastos y fibrosis. También se evaluarán cada una de las secciones de tejido medidas para determinar la necrosis del tejido y la presencia de material foráneo. Se asignarán puntuaciones para cada variable en una escala de 0 a 4 (0 = sin cambios significativos; 1 = mínimo; 2 = leve; 3 = moderado; y 4 = grave).

Se montarán secciones adicionales de tejido de los sujetos de prueba animales de 1 mes sólo en portaobjetos de vidrio y se teñirán (elastina de Verhoeff) para el análisis morfométrico. Las mediciones del volumen de la luz, la media, de la íntima y del vaso total se tomarán usando planimetría digital computerizada con un microscopio de video y un software personalizado para cada sección. El porcentaje de estenosis se determinará para cada sección. Un método de cuantificación de la hiperplasia de la íntima es dividiendo el área de la íntima entre el área de la íntima y la luz [(íntima, mm^{2})/ (íntima + luz, mm^{2})].

También se obtendrán secciones adicionales, a la discreción del patólogo, si tras el examen macroscópico del/de los vaso(s) se observa cualquier lesión focal, adelgazamiento de la(s) pared(es) del vaso o dilatación fuera de los sitios descritos anteriormente. Un patólogo veterinario certificado por el comité examinará y puntuará todos los portaobjetos teñidos de una manera ciega.

Resultados esperados para los sujetos sometidos a intervención vascular animales

Se espera que los sujetos tratados con la composición fluida de la presente invención como se describió anteriormente presenten uno o más indicios de la incidencia reducida de las secuelas clínicas asociadas con la intervención vascular, incluyendo, pero sin limitarse a, la disminución de la trombosis oclusiva, aumento de las tasas de permeabilidad, disminución de la estenosis, disminución de la hiperplasia de la íntima, y disminución de la inflamación luminal y/o perivascular aguda y crónica.

Otros indicios de un vaso tratado satisfactoriamente es el diámetro de la luz adecuado. Se espera que el material inyectable de la presente invención permita el mantenimiento de un diámetro de la luz adecuado reduciendo la estenosis del vaso y permitiendo de ese modo el flujo sanguíneo sin impedimentos a velocidades normales o casi normales. El diámetro de la luz y el porcentaje de estenosis se monitorizarán usando la angiografía del vaso tratado en el día del tratamiento y justo antes del sacrificio en el día 30. El estrechamiento de la luz tras la cirugía se correlacionará con tasas de flujo sanguíneo usando los protocolos de ecografía Doppler convencionales. Se espera que la presente invención evite o retrase el estrechamiento que impide el flujo sanguíneo por debajo de una velocidad normal o casi normal.

Un indicio más de un vaso con endoprótesis que funciona es la ausencia de efectos de borde. Se espera que el material inyectable de la presente invención reduzca la incidencia y/o el grado de la trombosis oclusiva o estenosis del vaso tratado en la parte del vaso distal y proximal con respecto a la endoprótesis, a menudo denominados efectos de borde. Los efectos de borde, o efectos de envoltorio de caramelo (candy wrapper), son zonas de estenosis que se desarrollan en las articulaciones y bordes de la endoprótesis tras la colocación de la endoprótesis. Caracterizados por la proliferación temprana del tejido de la neoíntima y la posterior estenosis, los efectos de borde pueden conducir a trombosis oclusiva. Los efectos de borde se monitorizarán usando angiografía del vaso tratado en el día del tratamiento y justo antes del sacrificio en el día 30. Se espera que la presente invención evite o retrase la trombosis y el estrechamiento del vaso asociado con los efectos de borde de los vasos con endoprótesis, como se describe en el presente documento. También se determinará histológicamente la presencia o ausencia de efectos de borde obteniendo secciones muy proximal y muy distal, aproximadamente 2-3 mm aguas arriba o aguas abajo de los bordes de la endoprótesis en cualquier dirección. Para evaluar la presencia de efectos de borde, las secciones muy proximal y muy distal se puntuarán con respecto a la lesión, inflamación, formación de neoíntima y trombo.

Como grupo, se espera que los sujetos tratados muestren al menos diferencias crecientes en al menos uno de estos indicios mencionados anteriormente de funcionalidad en comparación con los controles.

Ejemplo 2 Estudio de intervención vascular humana

Este ejemplo proporciona protocolos experimentales para someter a prueba y usar una composición fluida que comprende células endoteliales vasculares injertadas y una matriz biocompatible en forma particulada para reducir la incidencia de las secuelas clínicas asociadas con la intervención vascular en sujetos de prueba clínica humanos. Al usar procedimientos quirúrgicos convencionales, se realiza una angioplastia percutánea con balón y colocación de endoprótesis ordenadas por el médico para aliviar un estado clínico. Entonces, se dispone la composición fluida implantable en el espacio perivascular en, adyacente a o en la proximidad del sitio de la angioplastia y la colocación de la endoprótesis; los detalles de un procedimiento a modo de ejemplo se exponen a continuación. Como se describió anteriormente, el experto puede variar la colocación y formulación de la composición fluida implantable de una manera rutinaria.

Específicamente, el estudio incluye sujetos de prueba humanos que se someten a la angioplastia percutánea con balón y colocación de endoprótesis en un miembro periférico. Los procedimientos de angioplastia percutánea con balón y colocación de endoprótesis convencionales se realizarán según técnicas operatorias convencionales. La composición fluida implantable de la presente invención se aplicará al sitio del inflado del balón y alrededores como se describió anteriormente, después de haber completado la angioplastia y la colocación de endoprótesis y haber restablecido el flujo a través del vaso tratado. La carga celular total en base al peso corporal será de aproximadamente 1,0 x 10^{4} células por kg a aproximadamente 8,0 x 10^{4} células por kg.

Se realizarán seguimientos clínicos a los 5 días, 2 semanas y en los meses 1, 3 y 6. Se requerirán mediciones del flujo sanguíneo usando ecografía Doppler de flujo a color en el día 5 para establecer un nivel inicial, seguido de a las 2 semanas, 1 mes, 3 meses y 6 meses tras la cirugía. Los sujetos de prueba que muestren un flujo absoluto de menos de 350 ml/min, o más del 25% de reducción en el flujo desde la medición anterior, o más del 50% del área de estenosis (medida mediante ecografía Doppler) se derivarán para realizar una angiografía. La intervención médica correctora tal como angioplastia se permitirá para las lesiones estenóticas de más del 50% determinadas mediante angiografía.

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Se realizará una angiografía de contraste de los vasos tratados y el tejido y vasculatura circundantes al nivel inicial y a los 3 meses. Se calculará el diámetro de la luz para cada región y se medirá la velocidad sistólica pico.

Resultados esperados para el estudio de intervención vascular humana

Se espera que los sujetos tratados con la composición fluida implantable de la presente invención como se describió anteriormente, presentarán uno o más indicios de reducción en la incidencia de las secuelas clínicas asociadas con la intervención, incluyendo, pero sin limitarse a, trombosis oclusiva, reestenosis, hiperplasia de la íntima e inflamación aguda y crónica.

Un indicio de un vaso sanguíneo funcional es el diámetro de la luz adecuado. Se espera que la presente invención permita el mantenimiento del diámetro de la luz adecuado, permitiendo de ese modo el flujo sanguíneo sin impedimentos a velocidades suficientes para mantener la circulación periférica normal o casi normal. Se monitorizará el diámetro de la luz usando angiografía del vaso tratado al inicio del valor inicial (aproximadamente 5 días después del tratamiento) y después de eso al menos 3 meses tras la cirugía. El estrechamiento de la luz tras la cirugía se correlacionará con las velocidades de flujo sanguíneo usando protocolos de ecografía Doppler convencionales. Se espera que la composición fluida implantable de la presente invención, cuando se usa como se describe en el presente documento, evite o retrase el estrechamiento que impide el flujo sanguíneo por debajo de una velocidad adecuada para la circulación periférica como se describe en el presente documento. Se espera además que el tratamiento con la composición fluida implantable de la presente invención dé como resultado velocidades de flujo sanguíneo que permitan la circulación clínicamente aceptable, o que se aproximen a las velocidades normales. Será comparable el flujo dentro y fuera de una parte tratada de un vaso sanguíneo. Comparable significa sustancialmente similar para fines clínicos. Por ejemplo, velocidades de flujo sanguíneo de aproximadamente 150-500 ml/min, preferiblemente 300-500 ml/min, y de manera más preferible aproximadamente 350-400 ml/min.

Ejemplo 3 Estudio de readhesión pélvica animal

Este ejemplo proporciona protocolos experimentales para someter a prueba y usar una composición fluida que comprende una matriz particulada biocompatible y células endoteliales o de tipo endotelial injertadas para reducir la incidencia de las adhesiones en la pelvis y sus alrededores en sujetos de prueba animales. Se utilizará un modelo experimental de rata (un modelo de trompa uterina modificada, J. Invest. Surg. 7:409-15 (1994)) para estudiar el tratamiento de las adhesiones posoperatorias después de la cirugía de reconstrucción tubárica usando la composición fluida implantable y los métodos de la presente invención. Se raspará la trompa uterina a ambos lados y se suturarán juntos. Después de 14 días, durante la nueva laparotomía, se cortará la estrecha conexión entre los dos lados de la trompa uterina suturada. Se aplicará la composición fluida implantable de la presenta invención en un lado de la trompa uterina y alrededores como se describió anteriormente. Como un control, el otro lado de la trompa uterina no recibirá la composición fluida implantable. Se monitorizará la presencia o ausencia de adhesiones a lo largo del tiempo. Se espera que las ratas tratadas con la composición fluida implantable de la presente invención presenten una incidencia reducida de las adhesiones en la pelvis y sus alrededores.

Ejemplo 4 Estudio de oclusión de trompas de Falopio animales

Este ejemplo proporciona protocolos experimentales para someter a prueba y usar una matriz biocompatible y células endoteliales o de tipo endotelial injertadas para reducir la incidencia de la oclusión de las trompas de Falopio en sujetos de prueba animales. Se utilizará un modelo experimental de conejo (J. Vasc. Interv. Radiol. 13:399-404 (2002)) para estudiar el tratamiento de la oclusión de las trompas de Falopio usando la composición fluida implantable y los métodos de la presente invención. Bajo orientación fluoroscópica, se realizará el cateterismo transvaginal de las trompas de Falopio derecha e izquierda usando una técnica coaxial. Con un hilo guía de metal que sobresale del catéter con electrodo activo, se realizará la electrocoagulación RF. Se aplicará la composición fluida implantable de la presente invención a una trompa de Falopio y alrededores como se describió anteriormente. Como control, la otra trompa de Falopio no recibirá la composición fluida implantable. Se evaluará la permeabilidad tubárica y los cambios histológicos a lo largo del tiempo. Se espera que los conejos tratados con la composición fluida implantable de la presente invención presenten una incidencia reducida de oclusión, estenosis y necrosis en las trompas de Falopio y sus alrededores.

También puede usarse eficazmente la presente invención para reducir la incidencia de los embarazos ectópicos y/o como un tratamiento intervencionista coincidiendo con o tras un embarazo ectópico.

La invención puede realizarse en otras formas específicas. Por tanto, las presentes realizaciones deben considerarse ilustrativas y no restrictivas, estando indicado el alcance de la invención por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripción anterior.

Claims

1. Composición fluida que comprende una matriz biocompatible y células para su uso en el tratamiento de un sitio lesionado o enfermo en la luz interior de una estructura anatómica tubular en la que dicha composición fluida se suministra mediante inyección percutánea a una superficie extraluminal en o adyacente a o en la proximidad del sitio lesionado o enfermo en una cantidad eficaz para tratar el sitio lesionado o enfermo.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la composición debe suministrarse mediante un procedimiento cerrado mínimamente invasivo.

3. Composición según la reivindicación 1, en la que la composición debe suministrarse atravesando o penetrando en la pared interior de dicha estructura anatómica tubular.

4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la estructura anatómica tubular es un vaso sanguíneo.

5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición fluida comprende además medios de crecimiento celular.

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas células son células endoteliales o células que tienen un fenotipo de tipo endotelial.

7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dichas células son un cocultivo de dos o más células seleccionadas del grupo que consiste en células endoteliales, células epiteliales, células del músculo liso, fibroblastos, células madre, células progenitoras endoteliales y cardiomiocitos.

8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dichas células son una población de células confluente, una población de células casi confluente, una población de células posconfluente o una población de células que tiene uno cualquiera de los fenotipos anteriores.

9. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición fluida mantiene su forma.

10. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la matriz biocompatible comprende partículas o microportadores.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que las partículas o microportadores tienen un diámetro de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 500 micrómetros.

12. Composición según la reivindicación 11, en la que las partículas o microportadores tienen un diámetro de aproximadamente 200 micrómetros.

13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la matriz biocompatible comprende además gelatina, colágeno, fibronectina, fibrina, laminina o un péptido de unión.

14. Composición según la reivindicación 13, en la que la matriz biocompatible comprende además un péptido de unión que comprende un péptido de secuencia arginina-glicina-aspartato (RGD).

15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha cantidad eficaz de la composición fluida reduce la proliferación de las células del músculo liso en el sitio lesionado o enfermo.

16. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha cantidad eficaz de la composición fluida reduce la trombosis oclusiva en el sitio lesionado o enfermo.

17. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha cantidad eficaz de la composición fluida reduce la hiperplasia de la íntima en el sitio lesionado o enfermo.

18. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha cantidad eficaz de la composición fluida reduce la estenosis o reestenosis en el sitio lesionado o enfermo.

19. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 al 14, en la que dicha cantidad eficaz de la composición fluida reduce la inflamación aguda en el sitio lesionado o enfermo.

20. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 al 14, en la que dicha cantidad eficaz de la composición fluida reduce la inflamación crónica en el sitio lesionado o enfermo.

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21. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha cantidad eficaz de la composición fluida reduce la vasodilatación o el vasoespasmo en el sitio lesionado o enfermo.

22. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de identificar un sitio para depositar la composición fluida sobre una superficie exterior de dicha estructura anatómica tubular.

23. Composición según la reivindicación 22, en la que la etapa de identificación: (a) se produce antes de o coincidiendo con la etapa de paso a través, penetración o inyección; o (b) se lleva a cabo mediante la obtención de imágenes; o (c) se lleva a cabo mediante palpación táctil.

24. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la superficie exterior de dicha estructura anatómica tubular: (a) es una superficie no luminal; o (b) ocupa el espacio perivascular; o (c) es un vaso sanguíneo que comprende una endoprótesis, opcionalmente en la que dicho sitio lesionado o enfermo está en la proximidad de la endoprótesis.

25. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la estructura anatómica tubular se selecciona de: los conductos lagrimales, la tráquea, los bronquios, los bronquiolos, las fosas nasales, los senos, las vías respiratorias, las trompas de Eustaquio, el conducto auditivo externo, la cavidad bucal, el esófago, el estómago, el duodeno, el intestino delgado, el intestino grueso, los conductos biliares, el uréter, la vejiga, la uretra, las trompas de Falopio, el útero, la vagina y otros conductos del aparato reproductor femenino y el conducto deferente y otros conductos del aparato reproductor masculino.

26. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la estructura anatómica tubular es una estructura que se produce de manera natural o una anastomosis creada quirúrgicamente.