ES2338173T3 - Nuevas alcohol-deshidrogenasas. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que tiene la actividad biológica de una alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP, y que comprende las secuencias siguientes: una secuencia que es idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 34.
Description
Nuevas
alcohol-deshidrogenasas.
La invención se refiere a nuevos polipéptidos
que tienen la actividad biológica de una
alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP.
La invención se refiere adicionalmente a ácidos nucleicos que
codifican dichos polipéptidos, a hospedadores o células
hospedadoras no humanos(as) y a sistemas de reacción que
pueden utilizarse para preparar productos deseados. Los
polipéptidos de la invención se utilizan preferiblemente en la
preparación, a partir de aldehídos o cetonas, de alcoholes
primarios y alcoholes secundarios enantioméricamente puros que
pueden servir como compuestos intermedios para medicamentos.
Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden emplearse
también en la reacción inversa, es decir, la oxidación de alcoholes
con la formación de aldehídos o cetonas.
La descripción hace referencia a diversos
documentos. El contenido de la descripción de estos documentos se
incorpora por la presente por la referencia.
Los alcoholes enantioméricamente puros se
encuentran entre los bloques de construcción quirales más
importantes de la química industrial especial y fina. Estos
productos actúan, entre otras cosas, como compuestos intermedios
clave esenciales en la preparación de medicamentos. Durante largo
tiempo, la ruta industrial para estas moléculas diana ha
transcurrido preferiblemente por la vía de procesos puramente
químicos, por ejemplo por resolución del racemato. Esto implica, a
partir de una cetona, preparar primeramente el alcohol en su forma
racémica y aislar luego el enantiómero deseado en una resolución
del racemato con ayuda de al menos cantidades estequiométricas de
una sustancia adyuvante quiral. Desventajas de estos métodos
incluyen no sólo el rendimiento de 50% como máximo de la resolución
del racemato, sino que deben considerarse también en el uso de
numerosos compuestos de partida ecológicamente problemáticos para
la preparación del racemato. Otras desventajas son el paso adicional
de reciclado del enantiómero no deseado así como la necesidad de
reactivos adyuvantes quirales (además, cantidades estequiométricas
de los mismos) para la resolución del racemato. El concepto de la
resolución del racemato se resume en la ecuación (1a) en la vista
de conjunto de la Figura 1. Un primer progreso sustancial hacia un
proceso más sostenible se consiguió utilizando la resolución
biocatalítica del racemato, dispensando con ello la necesidad de
emplear cantidades estequiométricas de reactivos adyuvantes
quirales. Lamentablemente, sin embargo, todas las restantes
desventajas arriba enumeradas siguen siendo relevantes, a pesar de
dicha ruta biocatalítica.
Una posible vía de evitar las desventajas arriba
descritas de la resolución del racemato o de síntesis
diastereoselectivas es la conversión directa de cetonas en los
alcoholes ópticamente activos deseados en un solo paso. Tales
"procesos asimétricos directos" pueden llevarse a cabo
utilizando primeramente quimio-catalizadores que
contienen metales, siendo los quimiocatalizadores empleados
complejos que contienen metales pesados que incluyen un ligando
quiral. Además del uso de metales pesados ecológicamente
problemáticos como componente sustancial del catalizador, es
también desventajosa la necesidad de ligandos costosos y muy
sensibles en parte, por ejemplo ligandos fosfano.
Otra alternativa consiste en la reducción
asimétrica directa utilizando biocatalizadores adecuados para
conversión cuantitativa de sustratos proquirales en el producto
enantioméricamente puro deseado. También, en este caso, el número
de pasos de reacción se reduce al mínimo teóricamente posible de un
solo paso, llevándose a cabo la conversión biocatalítica en
condiciones ecológicamente excelentes (entre otras, agua como
disolvente), y el proceso como tal procede con alta economía
atómica. El concepto de un proceso biocatalítico y sostenible de
esta clase se expone en la ecuación (1b) de la vista de conjunto de
la Figura 1.
Una desventaja de la variante biocatalítica, sin
embargo, es la carencia de alcohol-deshidrogenasas
disponibles en escala industrial como biocatalizadores adecuados
para la reacción diana y la expresión de los mismos. El objeto en
el que está basada la presente invención fue por tanto obtener
nuevas alcohol-deshidrogenasas eficientes e
industrialmente utilizables. Este objeto se consigue por las
realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Así pues, la presente invención se refiere a un
polipéptido que tiene la actividad biológica de una
alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP y
que comprende la secuencia siguiente: una secuencia que es idéntica
a la secuencia de SEQ ID No: 34.
La secuencia de aminoácidos mencionada y
caracterizada por SEQ ID está codificada preferiblemente por las
secuencias de DNA a que se hace referencia como SEQ ID Número 68. Se
concede adicionalmente preferencia a polipéptidos que corresponden
a las enzimas existentes naturalmente en toda su longitud. En otra
realización preferida, los polipéptidos de la invención comprenden
adicionalmente al menos una sección de aminoácidos heteróloga que
caracteriza dichos polipéptidos como proteínas de fusión. Posibles
ejemplos de componentes heterólogos de la proteína de fusión de la
invención son marcadores (v.g. el marcador His o el marcador Flag)
que pueden utilizarse para purificación de las proteínas de fusión
de la invención. En otras realizaciones, los componentes
heterólogos pueden tener su propia actividad enzimática. En tal
caso, los dos componentes enzimáticos están enlazados
preferiblemente por un enlazador tal como un enlazador flexible
glicina o glicina-serina de 6-10
aminoácidos de longitud, a fin de asegurar la funcionalidad de
dichos componentes. El término "heterólogo", como se utiliza
en esta memoria, puede significar, en primer lugar, que los
componentes de la proteína de fusión no se presenten naturalmente
enlazados de modo covalente uno a otro y, en segundo lugar, que los
componentes procedan de especies diferentes. Proteínas de fusión
se preparan usualmente utilizando tecnología de DNA recombinante
(véase Sambrook et al., loc. cit.).
De acuerdo con la invención, el término
"polipéptido que tiene la actividad biológica de una
alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o
NADP" hace referencia a un grupo de enzimas que catalizan la
conversión de alcoholes en aldehídos o cetonas o la reacción
inversa correspondiente, es decir la conversión de aldehídos en
alcoholes primarios o cetonas en alcoholes secundarios. La primera
reacción mencionada corresponde en esta conexión a un proceso de
oxidación, siendo el segundo tipo de reacción mencionado un proceso
de reducción. El número EC de las
alcohol-deshidrogenasas (ADHs) es EC1.1.1.1. El
alcance de protección de la invención comprende, además de las
enzimas existentes naturalmente aisladas en el curso de la presente
invención, también aquellos polipéptidos que tienen los valores de
identidad arriba mencionados al nivel de aminoácidos comparados con
los polipéptidos aislados de fuentes naturales y que pueden
originarse análogamente de fuentes naturales. Por otra parte, los
mismos pueden modificarse por tecnología de DNA recombinante de tal
modo que la actividad enzimática se retiene en su totalidad o
esencialmente, como será previsto por el técnico experto (véase, por
ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory
Handbook", 2ª edición 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor,
Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular
Biology", John Wiley & Sons, NY, 2001). Así pues, es posible
que aminoácidos que no están localizados en el sitio activo y cuyo
reemplazamiento con un aminoácido "de la misma clase" no es de
esperar a primera vista que dé como resultado una estructura
tridimensional sustancialmente alterada se reemplacen con un
aminoácido "de la misma clase". Por ejemplo, aminoácidos
particulares con cadenas laterales no polares (aminoácidos de la
misma clase), puede esperarse que sean susceptibles de sustitución,
por ejemplo valina en lugar de alanina, sin que esto tenga una
influencia (sustancial) en la función biológica de la enzima, sobre
la actividad enzimática de acuerdo con la invención. Basándose en su
conocimiento especializado, el técnico experto puede deducir
también conclusiones correspondientes en cuanto a la sustitución de
otros tipos de aminoácidos (por ejemplo la sustitución de
aminoácidos básicos con otros aminoácidos básicos o de aminoácidos
con cadenas laterales polares sin carga con otros aminoácidos de
este grupo).
El porcentaje de identidad de las secuencias de
aminoácidos de los polipéptidos aislados de fuentes naturales, que
se describen en esta descripción por números SEQ ID, puede ser
determinado fácilmente por el técnico experto utilizando procesos
conocidos en la técnica anterior. Un programa adecuado que puede
utilizarse de acuerdo con la invención es BLASTP (Altschul et
al., 1997. Gapped to BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.
25(17): 3389-3402).
La invención se refiere también a una molécula
de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención.
La molécula de ácido nucleico de la invención
puede ser una molécula de DNA o una molécula de RNA. Se prefiere
que la molécula de ácido nucleico sea una molécula de cDNA o una
molécula de mRNA. De acuerdo con la invención, dicha molécula de
DNA puede ser adicionalmente una molécula de DNA genómico. La
invención comprende también realizaciones en las cuales dicha
molécula de DNA es una molécula de PNA u otro derivado de una
molécula de DNA. De acuerdo con la invención, se da preferencia a
secuencias de DNA que comprenden las secuencias de DNA de acuerdo
con SEQ ID números 67 a 68.
A fin de conseguir el objeto en el que está
basada la invención, se siguió el método siguiente. En primer
lugar, basándose en una extensa colección de cepas patentadas, se
cultivaron en placas cepas prioritarias y, después de llevar a cabo
controles de viabilidad y pureza, asimismo en cultivo líquido. El
DNA genómico de estos organismos se aisló de los sedimentos de
células cosechados. Basándose en el DNA genómico preparado, se
cribaron genéticamente materiales aislados seleccionados respecto a
genes de alcohol-deshidrogenasas mediante
tipificación PCR por medio de iniciadores de la invención. En este
contexto, incluso la semejanza de secuencias de aminoácidos debida
a la homología de alcohol-deshidrogenasas ya
conocidas no permitió fácilmente derivar iniciadores
oligonucleotídicos con ayuda de los cuales puedan amplificarse
fácilmente con éxito genes de alcohol-deshidrogenasa
no identificados previamente. Inicialmente, este enfoque estaba
basado en la hipótesis de motivos de secuencia particulares
conservados en los genes de alcohol-deshidrogenasa
previamente conocidos que estuvieran también presentes en los
nuevos genes de alcohol-deshidrogenasa deseados. No
obstante, los motivos de secuencia conservados en los genes de
alcohol-deshidrogenasa conocidos previamente son
inadecuados para deducir iniciadores degenerados por procesos
conocidos por el técnico experto (Kwok et al. 1995. Design
and use of mismatched and degenerate primers. En: PCR Primer, A
laboratory Manual, Dieffenbach CW & Dveksler GS (compiladores),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp 143-155;
Compton T. 1990. Degenerate Primers for DNA Amplification. En: PCR
Protocols, A Guide to Methods and Applications. Innis et al.
(compiladores) Academic Press, San Diego, pp 39-34).
Las alcohol-deshidrogenasas dependientes de NAD o
NADP se clasifican como ADHs de cadena larga, de cadena media y de
cadena corta. Los mismas se dividen en estos tres grupos basándose
especialmente en su dependencia de metales y en el tamaño de las
subunidades. Las ADHs de cadena corta no requieren ion metálico
alguno y sus subunidades están constituidas aproximadamente por 250
aminoácidos. En contraste, las ADHs de cadena media y cadena larga
son dependientes de iones metálicos. Las de cadena media, cuyas
subunidades típicas están constituidas por aproximadamente 350
aminoácidos, requieren iones cinc. Las ADH de cadena larga, cuyas
subunidades están compuestas de aproximadamente 385 aminoácidos,
requieren iones hierro (Hummel, W. 1997. New alcohol dehydrogenases
for the synthesis of chiral compounds. 58:145-84).
La heterogeneidad de secuencia, no sólo dentro de todas las ADHs
dependientes de NAD o NADP previamente conocidas, sino también
dentro de los tres grupos de ADH descritos brevemente arriba, es
extremadamente alta. Por esta razón, no era fácil construir
iniciadores con ayuda de los cuales sea posible en primer lugar
amplificar específicamente secuencias de ADH y en segundo lugar
capturar además una diversidad de nuevas ADHs necesarias a fin de
alcanzar el objetivo. Así, a pesar de las homologías de secuencia
esperadas sobre la base de las utilizadas, no se aislaron ADHs de
cadena larga de ningún tipo en las bacterias estudiadas. En este
contexto, se intentó testar la calidad de los iniciadores
construidos primeramente con DNA genómico de organismos modelo
cuyos genes de alcohol-deshidrogenasa son conocidos
o con agrupaciones de DNA constituidas por DNA de diversos
microorganismos. Esto implicaba clonación, secuenciación y análisis
subsiguiente de los productos PCR. Después de esta fase de
establecimiento, se sometieron materiales aislados seleccionados a
tipificación PCR sobre la base del DNA genómico preparado de los
organismos a cribar, como se ha descrito arriba. Los resultados
obtenidos a partir de los experimentos (con respecto a identidad de
secuencia y actividad específica) se incorporaron en priorización de
los organismos Hit potenciales cuyos nuevos genes de
alcohol-deshidrogenasa están siendo aislados. A
pesar de los resultados inesperados, decepcionantes y desmotivantes
en el curso del aislamiento intentado de los ácidos nucleicos que se
suponía codificaban ADHs de cadena larga, se aislaron cierto número
de ácidos nucleicos que codificaban enzimas de cadena corta y
cadenas enzimáticas de cadena media de acuerdo con la invención.
Algunas de estas enzimas y cadenas enzimáticas tenían identidades
de secuencia sorprendentemente bajas (<50%) respecto a las
enzimas conocidas de esta clase.
La invención se refiere adicionalmente a una
molécula de ácido nucleico que es complementaria de la molécula de
ácido nucleico de la invención.
De acuerdo con la invención, el término
"complementario" significa una complementariedad que se
extiende a lo largo de la región entera de la molécula de ácido
nucleico de la invención sin lagunas. Dicho de otro modo, se da
preferencia de acuerdo con la invención a que dicha
complementariedad se extienda 100% a través de la región completa
de la secuencia de la invención, es decir desde el extremo 5' que se
muestra al extremo 3' mostrado. En realizaciones adicionalmente
preferidas, dicha complementariedad se extiende a lo largo de una
región de al menos 19, preferiblemente al menos 21, nucleótidos
contiguos que preferiblemente no codifican el sitio activo de
actividad enzimática.
Adicionalmente, la invención se refiere a un
vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la
invención.
Los vectores de la invención contienen
preferiblemente los ácidos nucleicos de la invención enlazados
operativamente a una secuencia de control de la expresión de tal
modo que dichos ácidos nucleicos sean capaces de ser transcritos y,
en caso apropiado, traducidos en una célula hospedadora adecuada.
Las secuencias de control de la expresión comprenden usualmente un
promotor, y en caso apropiado, secuencias reguladoras adicionales
tales como operadores o intensificadores. Adicionalmente, pueden
estar presentes también las secuencias de iniciación de la
traducción. Secuencias de control de la expresión adecuadas para
células hospedadoras procariotas o eucariotas son conocidas por el
técnico experto (véase, por ejemplo, Sambrook et al., loc.
cit.). Adicionalmente, el vector recombinante de la invención puede
contener también elementos usuales tales como un origen de
replicación y un gen marcador de selección. Ejemplos de vectores
recombinantes adecuados son plásmidos, cósmidos, fagos o virus
(véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra).
Materiales de partida para la preparación de los vectores
recombinantes de la invención están disponibles comercialmente (por
ejemplo de Stratagene, InvitroGen o Promega).
Cualesquiera plásmidos o vectores que estén al
alcance del técnico experto para este propósito son adecuados en
principio. Plásmidos y vectores de esta clase pueden encontrarse,
por ejemplo, en Studier y colaboradores (Studier, W. F.; Rosenberg
A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA
polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol.
185, 61-89) o en los folletos de Novagen, Promega,
New England Biolabs, Clontech o Gibco BRL. Otros plásmidos y
vectores preferidos pueden encontrarse en: Glover, D. M. (1985),
DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL
Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. y Denhardt, D. T (compiladores)
(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their
uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D.
V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods
Enzymol. 185, Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Nueva York. Plásmidos que pueden utilizarse
para clonación del constructo génico que tiene el ácido nucleico de
la invención en el organismo hospedador de una manera muy preferida
son derivados de pUC18 y pUC19 (Roche Biochemicals),
pKK-177-3H (Roche Biochemicals),
pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham
Pharmacia Biotech),
pKK-233-3-(Stratagene) o pET
(Novagen). Otros plásmidos preferidos son pBR322 (DSM3879),
pACYC184 (DSM4439) y pSC101 (DSM6202), que se pueden obtener de la
Colección Alemana DSMZ-Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Brunswick, Alemania. Ejemplos
de promotores preferidos son: T7, lac, tac, trp, rha y ara.
La invención se refiere también a un hospedador
no humano que comprende el polipéptido de la invención o la
molécula de ácido nucleico de la invención o el vector de la
invención.
El hospedador no humano puede ser una célula o
un organismo multi- a policelular. Organismos policelulares
adecuados incluyen sistemas modelo habituales en biología molecular,
tales como Drosophila melanogaster, pez cebra o C.
elegans.
En una realización preferida, el hospedador es
una célula.
En esta realización preferida, el hospedador de
la invención es una célula recombinante que ha sido transformada o
transfectada con un ácido nucleico de la invención o un vector de la
invención (de acuerdo con la presente invención, los términos
"transformación" y "transfección" se utilizan de manera
sinónima. La transformación o transfección puede llevarse a cabo
por métodos conocidos, por ejemplo coprecipitación con fosfato de
calcio, lipofección, electroporación, bombardeo con partículas o
infección viral. La célula de la invención puede contener el ácido
nucleico recombinante en una forma extracromosómica o integrada
cromosómicamente. Dicho de otro modo, la
transfección/transformación puede ser estable o transitoria.
La célula recombinante es preferiblemente de
origen procariota. Células hospedadoras adecuadas incluyen células
de microorganismos unicelulares, tales como células bacterianas. Un
sistema hospedador bacteriano particularmente adecuado es E.
coli. El citoplasma de E. coli contiene los cofactores
requeridos para la actividad enzimática del polipéptido de la
invención. Éstos son, en particular, NADH, NADPH, NAD^{+} y
NADP^{+}. Se da preferencia muy particular a: E. coli XL1
Blue, W3110, DSM14459 (PCT/US00/08159), NM 522, JM101, JM109, JM105,
RR1, DH15, TOP 10- o HB101. Es asimismo posible utilizar para
expresión de los ácidos nucleicos de la invención bacterias de los
géneros/especies Lactobacillus, Bacillus, Rhodococcus,
Campylobacter, Caulobacter, Mycobacterium, Streptomyces, Neisseria,
Ralstonia, Pseudomonas, y Agrobacterium. Cepas apropiadas están
disponibles en la técnica anterior y pueden obtenerse, al menos
parcialmente, de los sitios de depósito internacionales tales como
ATCC o DMSZ. Protocolos de transfección y protocolos de
transformación son conocidos por el técnico experto. (Chan and
Cohen. 1979. High Frequency Transformation of Bacillus subtilis
Protoplasts by Plasmid DNA. Mol Gen Genet.
168(1)111-5; Kieser et al.
2000. Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation
Norwich.; Sambrook et al.. 1589. Molecular Cloning. A
Laboratory Manual. En: segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY.; Iraní y Rowe. 1997.
Enhancement of transformation in Pseudomonas aeruginosa
PA01 by Mg^{2+} and heat. Biotechniques 22:
54-56). Ejemplos adicionales de organismos
hospedadores que pueden utilizarse son asimismo levaduras tales
como Hansenula polymorpha, Pichia sp. y Saccharomyces
cerevisiae.
Como alternativa a esto, la célula puede ser de
origen eucariota. Células eucariotas adecuadas incluyen células
CHO, células HeLa y otras. Muchas de estas células pueden obtenerse
de sitios de depósito tales como ATCC o DMSZ. En una realización
preferida adicional, el hospedador es un animal transgénico no
humano.
Animales transgénicos no humanos pueden
producirse por procesos conocidos en la técnica anterior.
El animal transgénico no humano de la invención
puede tener preferiblemente diversas constituciones genéticas. El
mismo puede (1) sobre-expresar de manera
constitutiva o inducible el gen de un ácido nucleico de la
invención, (ii) contener el gen endógeno de un ácido nucleico de la
invención en una forma inactiva, (iii) contener el gen endógeno de
un ácido nucleico de la invención reemplazado total o parcialmente
con un gen mutado de un ácido nucleico de la invención, (iv) tener
sobreexpresión o infraexpresión condicional y específica del tejido
del gen de un ácido nucleico de la invención o (v) tener una
silenciación condicional y específica del tejido del gen de un
ácido nucleico de la invención.
Preferiblemente, el animal transgénico contiene
además un gen exógeno de un ácido nucleico de la invención bajo el
control de un promotor que permite
sobre-expresión.
Alternativamente, el gen endógeno de un ácido
nucleico de la invención puede sobre-expresarse por
activación y/o reemplazamiento del promotor intrínseco.
Preferiblemente, el promotor endógeno del gen de un ácido nucleico
de la invención tiene una modificación genética que da como
resultado la expresión incrementada del gen. Dicha modificación
genética del promotor endógeno comprende en este caso a la vez una
mutación de bases individuales y mutaciones de deleción e
inserción.
En una realización particularmente preferida del
hospedador de la invención, el último es un roedor transgénico,
preferiblemente un ratón transgénico, un conejo transgénico, una
rata transgénica, o es una oveja transgénica, una vaca transgénica,
una cabra transgénica o un cerdo transgénico.
Los ratones presentan numerosas ventajas sobre
otros animales. Los mismos pueden mantenerse fácilmente y su
fisiología está considerada como un sistema modelo del humano. La
producción de tales animales manipulados genéticamente es lo
bastante conocida por el técnico experto y se lleva a cabo
utilizando procesos comunes (véase por ejemplo Hogan, B.,
Beddington, R., Costantini, F. y Lacy, E. (1994), Manipulating the
Mouse-Embryo; A Laboratory Manual, 2º edición, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; WO91/08216).
Alternativa o adicionalmente, es también posible
emplear sistemas de cultivo de células, en particular sistemas de
cultivo de células humanas, para las aplicaciones descritas para el
animal transgénico no humano de la invención.
Ejemplos de cofactores de
alcohol-deshidrogenasas, que se utilizan -como ya se
ha mencionado, dependiendo de la
alcohol-deshidrogenasa particular- son NADH y NADPH
y sus formas oxidadas, NAD^{+} y NADP^{+}, respectivamente.
Los cofactores pueden generarse, en principio,
sea de una manera acoplada a enzima utilizando una segunda enzima,
por ejemplo una formiato-deshidrogenasa o
glucosa-deshidrogenasa, o de una manera acoplada a
un sustrato utilizando cualquiera de los alcoholes aceptados como
sustrato por la alcohol-deshidrogenasa empleada, por
ejemplo -iso-propanol- si está aceptado como sustrato. El
diagrama siguiente indica a modo de ejemplo el concepto de la
reducción catalizada por alcohol-deshidrogenasa de
una cetona con regeneración del cofactor acoplado a enzima
utilizando una formiato-deshidrogenasa:
Las alcohol-deshidrogenasas se
utilizan, por ejemplo, para preparación de alcoholes secundarios
enantioméricamente enriquecidos, con preferencia enantioméricamente
puros, partiendo de cetonas proquirales. En este contexto, se
conocen tanto alcohol-deshidrogenasas
(R)-específicas como (S)-específicas
que, de acuerdo con ello, dan como resultado la formación de las
formas enantioméricas particulares (R) y, respectivamente, (S) de
alcoholes.
Correspondientemente, se da también preferencia
de acuerdo con la invención a un hospedador que tiene una
deshidrogenasa adicional adecuada para regeneración de cofactores o
una molécula de ácido nucleico que codifica dicha
deshidrogenasa.
En este contexto, el hospedador puede contener
naturalmente dicha deshidrogenasa adicional o puede haber sido
transfectado con un ácido nucleico recombinante que codifica dicha
deshidrogenasa y con el cual es posible expresar dicha
deshidrogenasa en dicho hospedador. Esta realización requiere
también que el hospedador tenga los cofactores necesarios para la
función de dicha deshidrogenasa adicional o que dichos cofactores
sean suministrados a dicho hospedador de una manera adecuada.
Se da preferencia particular en este contexto a
un hospedador en el cual la deshidrogenasa adecuada para la
regeneración del cofactor es una
formiato-deshidrogenasa o una
glucosa-deshidrogenasa. Se da preferencia particular
a una formiato-deshidrogenasa de Candida
boidinii. Se da también preferencia particular a que la
deshidrogenasa de regeneración del cofactor sea una
glucosa-deshidrogenasa de Bacillus subtilis.
Mutantes genéticamente modificados de dichas deshidrogenasas de
regeneración de cofactores, que retienen dicha función enzimática,
se prefieren asimismo de acuerdo con la invención.
En una realización adicional, la invención se
refiere a un sistema de reacción que comprende un compuesto
orgánico que es un sustrato de una deshidrogenasa, adicionalmente el
polipéptido de la invención, el vector de la invención o el
hospedador de la invención y, en caso apropiado, un cofactor para el
polipéptido de la invención. (La adición de cofactor se requiere en
aquellos casos en los cuales el cofactor no está ya presente en el
sistema, véase también más adelante en esta memoria). En un caso, el
sistema de reacción de la invención puede ser una célula bacteriana
que corresponde al hospedador de la invención y que tiene el
polipéptido de la invención y también los cofactores necesarios en
el citoplasma. En el caso de que el o los cofactores estén ya
presentes naturalmente en el sistema/hospedador, dichos cofactores
no necesitan ser suministrados ya por separado. Convenientemente,
el hospedador es uno que tiene una deshidrogenasa adicional adecuada
para regeneración de cofactores o una molécula de ácido nucleico
que codifica dicha deshidrogenasa y también los cofactores
requeridos por ella. Si se suministra un sustrato para un producto
deseado a dicho sistema de reacción o si dicho sustrato es
metabolizado en el sistema de reacción propiamente dicho, entonces
el producto deseado puede aislarse fácilmente del sistema de
reacción, si dicho sistema de reacción se mantiene en condiciones
adecuadas. Condiciones adecuadas incluyen realización de la
reacción a temperaturas de 10 a 80ºC, con preferencia de 20 a 60ºC,
y muy preferiblemente de 20 a 40ºC. Se da preferencia también a que
la concentración del sustrato esté comprendida entre 100 y 2000 mM,
con preferencia de 200 a 800 mM. En una forma preferida, la reacción
deseada se lleva a cabo a fin de alcanzar conversiones de >80%,
en particular mayores que 90%, dentro de un tiempo de reacción de
<20 horas, en particular un tiempo de reacción de <10 horas y
muy preferiblemente un tiempo de reacción inferior a 5 horas. En
otra realización, el sistema de reacción puede ser un sistema in
vitro para conversión de un sustrato adecuado a fin de obtener
el producto deseado. Por ejemplo, el polipéptido de la invención
puede ponerse en contacto con los cofactores mencionados y el
sustrato, en caso apropiado (es decir, en caso necesario), con una
deshidrogenasa adicional adecuada para regeneración de cofactores
(y, en caso apropiado, los cofactores requeridos para ella, en
particular NADH y/o NADPH o sus formas oxidadas) en condiciones
adecuadas, como se ha expuesto anteriormente, por ejemplo, y durante
un periodo de tiempo suficiente, a fin de que el producto deseado
pueda regenerarse. En esta variante in vitro con utilización
de enzimas aisladas (en forma purificada o como extracto bruto) y
adición de cofactores, estas adiciones de cofactores deberían,
conforme a un control económico del proceso, ser inferiores a 0,01
equivalentes (basadas en la cantidad de sustrato empleada),
preferiblemente <0,001 equivalentes y muy preferiblemente
<0,0005 equivalentes.
El "sistema de reacción" puede ser también
además un animal transgénico no humano al cual se alimenta o se
administra un sustrato adecuado y, en caso apropiado, cofactores y/o
dicha deshidrogenasa adicional, y que es capaz de convertir dicho
sustrato en tejidos adecuados. En otra realización, el sistema de
reacción puede ser también un sistema de membrana celular en el
cual están anclados la enzima, las enzimas y, en caso apropiado,
los cofactores.
Se da preferencia adicional de acuerdo con la
invención a un sistema de reacción en el cual el compuesto orgánico
que es un sustrato de una deshidrogenasa es un compuesto de
carbonilo.
Se da preferencia particular a un sistema de
reacción en el cual el compuesto de carbono es un aldehído o una
cetona.
Esta realización de la invención permite la
preparación, de modo particularmente preferido de acuerdo con la
invención, de alcoholes de grado técnico que pueden utilizarse, por
ejemplo, como compuestos intermedios para la preparación de
compuestos activos utilizables en medicamentos.
Se da preferencia particular de acuerdo con la
invención a que la cetona sea una cetona sustituida
asimétricamente.
Esta realización de la invención se prefiere
particularmente debido a que los productos generados en una
reducción correspondiente tienen un centro de quiralidad y pueden
obtenerse con enantioselectividad alta. En general, los alcoholes
secundarios quirales deseados se obtienen en una forma
enantioméricamente pura con un exceso enantiomérico de >99%.
En otra realización preferida del sistema de
reacción de la invención, el compuesto orgánico que es un sustrato
de una deshidrogenasa es un alcohol. Esta variante es
preferiblemente adecuada para preparación de compuestos de
carbonilo comercialmente importantes, por ejemplo cetonas
pertinentes en el campo de los productos químicos aromáticos.
Adicionalmente, la oxidación puede utilizarse también para la
formación de alcoholes secundarios enantioméricamente puros
partiendo de un alcohol racémico como sustrato y convirtiendo el
enantiómero deseado en el compuesto cetónico por oxidación
enantioselectiva. El enantiómero deseado restante puede aislarse
luego de acuerdo con lo anterior.
El alcohol es preferiblemente un alcohol
primario o un alcohol secundario quiral. En el primer caso, el
producto generado es un aldehído, mientras que en el segundo caso
se forman las cetonas correspondientes.
Se da también preferencia de acuerdo con la
invención al cofactor en el sistema de reacción de la invención que
es NADH, NADPH, NAD^{+} o NADP^{+}.
La invención se refiere también a un proceso
para preparar el polipéptido de la invención o un polipéptido
codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención,
proceso que comprende cultivar el hospedador de la invención y
aislar dicho polipéptido.
El polipéptido puede purificarse, por ejemplo,
por procesos convencionales, por ejemplo por fragmentación de
células apropiadas, por ejemplo por medio de una "prensa
francesa", por intercambio iónico, cromatografía de exclusión
por tamaño o de afinidad, etc. (Coligan et al., Current
Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc.). Como
alternativa a esto, el polipéptido de la invención, cuando está
enlazado a un péptido conductor, puede ser exportado de las células
y purificado del sobrenadante de cultivo. Esta realización requiere
que el polipéptido de la invención, que no contiene naturalmente un
péptido conductor, esté modificado genéticamente. Esta realización
tiene la ventaja de una purificación más simple del polipéptido de
la invención a partir del sobrenadante de cultivo. Los
procedimientos y péptidos conductores óptimos adecuados pueden ser
determinados fácilmente por el técnico experto.
En una realización preferida adicional del
proceso de la invención, el polipéptido se aísla de un fluido
corporal o una muestra de tejido del animal transgénico no humano.
En esta realización, asimismo, el polipéptido de la invención
contiene preferiblemente un péptido conductor.
En una realización preferida adicional del
proceso de la invención y, en particular, si el animal transgénico
no humano es un mamífero, por ejemplo una vaca, una cabra o una
oveja, el fluido corporal es leche o suero.
En otra realización, la invención se refiere a
un proceso para preparar un compuesto orgánico que es un producto
de una deshidrogenasa, proceso que comprende hacer reaccionar un
compuesto orgánico que es un sustrato de una deshidrogenasa con el
polipéptido de la invención, el hospedador de la invención o por
medio del sistema de reacción de la invención.
Las diversas realizaciones de la invención que
deben utilizarse en el proceso de la invención difieren en
principio en que tienen que añadirse al polipéptido compuestos
adicionales tales como cofactores etc. (véase anteriormente), si el
último se utiliza en un sistema in vitro exento de células.
Cuando se utiliza el sistema de reacción de la invención, los
componentes necesarios, con la posible excepción del sustrato, están
ya presentes preferible y ventajosamente en el sistema, y por tanto
no es necesaria en este caso una adición separada.
Se da preferencia de acuerdo con la invención a
un proceso que comprende adicionalmente el paso de aislar el
producto de la reacción. Procesos adecuados para
aislamiento/purificación han sido expuestos anteriormente.
En una realización particularmente preferida del
proceso de la invención, el último comprende adicionalmente
procesar el producto para producir un medicamento. Cierto número de
descripciones de utilización de alcoholes enantioméricamente puros
como compuestos intermedios para preparación de compuestos
farmacéuticos activos se dan en la bibliografía. Una vista de
conjunto a este respecto está contenida, entre otros lugares, en:
A. Kleemann, J. Engels, B. Kutscher, D. Reichert, Pharmaceutical
Substances: Syntheses, Patents, Applications, 4ª edición,
Thieme-Verlag, Stuttgart, 2001.
En otra realización particularmente preferida
del proceso de la invención, el último comprende adicionalmente el
paso de procesar el producto para dar un producto secundario. En
este contexto, la derivatización puede tener lugar tanto por vía de
modificación del grupo alcohol, por ejemplo por esterificación y
reacciones secundarias subsiguientes, como por vía de
modificaciones de los sustituyentes particulares.
Se da aquí preferencia particular al proceso de
la invención que comprende adicionalmente el paso de formular el
producto secundario con un vehículo o excipiente farmacéuticamente
compatible en la preparación de un medicamento.
Ejemplos de vehículos y/o diluyentes
farmacéuticamente compatibles adecuados son conocidos por el técnico
experto y comprenden, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas
con fosfato, agua, emulsiones tales como, por ejemplo, emulsiones
aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes o detergentes,
soluciones estériles, etc. Medicamentos que comprenden tales
vehículos pueden formularse por medio de métodos convencionales
conocidos. Dichos medicamentos pueden administrarse en una dosis
adecuada a un individuo. La administración puede realizarse por
vías oral o parenteral, por ejemplo por vías intravenosa,
intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, local, intranasal,
intrabronquial, oral o intradérmica, o por medio de un catéter en un
sitio de una arteria. Preparaciones para administración parenteral
comprenden soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas
o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales tales como, por ejemplo, aceite
de oliva, y compuestos éster orgánicos tales como, por ejemplo,
oleato de etilo, que son adecuados para inyecciones. Vehículos
acuosos comprenden agua, soluciones, emulsiones y suspensiones
basadas en alcohol/agua, soluciones salinas y medios tamponados.
Vehículos parenterales comprenden soluciones de cloruro de sodio,
dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer y
aceites fijos. Ejemplos de vehículos intravenosos incluyen
suplementos líquidos, nutrientes y electrólitos (tales como, por
ejemplo, los basados en dextrosa de Ringer). El medicamento puede
comprender además conservantes y otros aditivos tales como, por
ejemplo, compuestos antimicrobianos, antioxidantes, agentes
complejantes y gases inertes. Dependiendo del uso específico
propuesto, pueden incluirse también otros compuestos activos tales
como, por ejemplo, interleuquinas, factores de crecimiento,
factores de diferenciación, interferones, proteínas quimiotácticas o
un agente inmunomodulador inespecífico.
El tipo de dosis es determinado por el médico
encargado del tratamiento de acuerdo con los factores clínicos. El
técnico experto sabe que el tipo de dosis depende de diversos
factores tales como, por ejemplo, volumen o peso corporal,
superficie corporal, edad, sexo o estado general de salud del
paciente, o bien del agente a administrar especialmente, la
duración y el tipo de administración, y de otras medicaciones que
puedan ser administradas en paralelo. Una dosis típica puede estar
comprendida, por ejemplo, en un intervalo entre 0,001 y 1000
\mug, siendo admisibles dosis por debajo y por encima de este
intervalo ilustrativo, especialmente cuando se tienen en cuenta los
factores mencionados anteriormente. Si la composición de la
invención se administra de manera regular, la dosis unitaria por
día debería estar comprendida por regla general entre 1 \mug y 10
mg. Los compuestos activos en estas preparaciones están presentes
usualmente a una concentración mayor que 10 \mug/ml de un tampón
fisiológico. Sin embargo, los mismos pueden estar presentes también
en forma sólida a una concentración comprendida entre 0,1 y 99,5%
en peso de la mezcla total. En general, se ha demostrado ventajoso
administrar el o los compuestos activos en cantidades totales que
van desde aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg, preferentemente en
cantidades totales de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg, de peso
corporal en 24 horas, en caso apropiado como una infusión continua
o en forma de una pluralidad de dosis individuales, a fin de
conseguir el resultado deseado. Si la composición se administra por
vía intravenosa, la dosis unitaria por kilogramo de peso corporal
al día debería estar comprendida en un intervalo entre 1 \mug y
10 mg. El medicamento puede administrarse por vías tópica, local o
sistémica.
Finalmente, se da preferencia particular de
acuerdo con la invención a un proceso en el cual el producto es un
alcohol enantioméricamente puro.
La solicitud describe también un ligando que
fija específicamente el polipéptido de la invención, ligando que no
es un sustrato de dicho polipéptido, y ni un cofactor del mismo, ni
un producto convertido por el mismo.
El término "fija específicamente" significa
de acuerdo con la invención que el ligando no reacciona, o no lo
hace esencialmente de manera cruzada, con otros polipéptidos, con
inclusión de aquéllos que tienen una secuencia primaria similar o
una estructura tridimensional similar. La reactividad cruzada puede
determinarse por procesos conocidos en la técnica anterior (véase
Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press,
Cold Spring Harbor, 1988). A este fin, es posible utilizar, por
ejemplo, ensayos competitivos, por ejemplo tests turbidimétricos,
en los cuales el ligando se incuba junto con el polipéptido marcado
de la invención y un polipéptido competitivo con el mismo, siendo
posible que el último se utilice a concentraciones diferentes.
En una realización preferida, el ligando es un
anticuerpo o un fragmento o derivado del mismo, un aptámero, o una
sustancia de peso molecular bajo.
Los fragmentos de anticuerpo comprenden
fragmentos Fv, Fab y F(ab')_{2}. Los derivados incluyen
scFvs (véase Harlow, loc. cit.). Los anticuerpos pueden ser de
origen policlonal o monoclonal.
En una realización particularmente preferida del
receptor, dicho receptor es un anticuerpo monoclonal.
De acuerdo con la invención, "sustancias de
peso molecular bajo" son moléculas existentes naturalmente o
producidas artificialmente que tienen un peso molecular de
aproximadamente 250 a 1000 Da, preferiblemente 300 a 750 Da, y de
modo particularmente preferible 400 a 600 Da, o son moléculas
modificadas de dicho peso molecular, que se ha derivado de
sustancias naturales.
La solicitud describe adicionalmente un
iniciador que tiene una secuencia representada en la Tabla 1.
Adicionalmente, la solicitud describe un par de
iniciadores que tienen las secuencias representadas en la Tabla 1,
sirviendo el primer iniciador de dicho par de iniciadores como
iniciador directo y sirviendo el segundo iniciador de dicho par de
iniciadores como iniciador inverso para amplificar una secuencia de
DNA.
El iniciador (en combinación con un iniciador
adicional adecuado, preferiblemente un iniciador adicional adecuado
enumerado en la Tabla 1) y el par de iniciadores pueden utilizarse
para amplificación de las secuencias de la invención,
preferiblemente por medio de PCR o LCR. Los iniciadores y pares de
iniciadores, respectivamente, se han seleccionado con gran cuidado
a partir de una multiplicidad de iniciadores potencialmente
posibles. Además de la amplificación de las secuencias de ácido
nucleico de la invención, los mismos permiten también la
amplificación de secuencias que codifican enzimas de la técnica
anterior, y son por tanto versátiles.
La solicitud describe adicionalmente un kit que
comprende
el polipéptido de la invención;
la molécula de ácido nucleico de la
invención;
el vector de la invención;
el hospedador de la invención;
el ligando;
el sistema de reacción de la invención;
al menos un iniciador; y/o
al menos un par de iniciadores.
Los componentes del kit pueden empaquetarse
individualmente o parcialmente juntos en recipientes adecuados. Los
componentes pueden estar presentes en el kit, por ejemplo, en forma
liofilizada o, por ejemplo, en solución, incluyendo disolventes
adecuados en particular disolventes acuosos tales como soluciones
tamponadas, por ejemplo soluciones tamponadas con fosfato.
Los kits pueden utilizarse de muchas maneras
diferentes. Por ejemplo, los mismos pueden servir para identificar
alcohol-deshidrogenasas adicionales o ácidos
nucleicos que codifican éstas, dándose preferencia a la utilización
de los iniciadores de la invención. En estas realizaciones, los kits
pueden utilizarse para producción industrial de la enzima de la
invención o de los productos convertidos por dicha enzima. En estas
realizaciones, debería darse preferencia a la utilización del
hospedador de la invención o el sistema de reacción de la
invención.
En las figuras:
Fig. 1: representa la técnica anterior por la
vía de la resolución del racemato: al menos 4-4
pasos
Fig. 2: representa una vista de conjunto de la
agrupación 2 (= grupo de iniciadores 2), basada en 33 secuencias
Fig. 3: representa la tipificación PCR con el
grupo de iniciadores 2, utilizando diversas agrupaciones.
Los ejemplos ilustran la invención.
Se dio prioridad a cepas procedentes de una
colección extensa de cepas patentadas y se dejaron crecer en cultivo
líquido después de llevar a cabo comprobaciones de viabilidad y
pureza. Los pelets de células cosechadas sirvieron como material de
partida para cribado genético. Se construyeron iniciadores para
cribado genético de genes de alcohol-deshidrogenasa
y se testaron luego sobre la base de DNA genómico preparado de
aislados microbianos seleccionados con ayuda de PCR. Las
alcohol-deshidrogenasas dependientes de NAD o NADP
se clasifican como ADHs de cadena larga, de cadena media y de
cadena corta. Dado que la heterogeneidad de secuencia en estos
grupos es sustancial, dichos grupos se reunieron en agrupaciones
basadas en análisis de la secuencia. Las ADHs de cadena larga se
dividieron en 3 agrupaciones, las ADHs de cadena media en 4
agrupaciones y las ADHs de cadena corta en 3 agrupaciones.
Subsiguientemente, se construyeron en cada caso 4 juegos de
iniciadores degenerados por agrupación, que difieren en la
utilización de codones específicos (uso de codones) pero que están
dirigidos contra los mismos motivos de secuencia de las
agrupaciones.
Las ADHs de cadena larga se dividieron sobre la
base de los análisis de secuencia en 3 agrupaciones, y los
iniciadores se construyeron y testaron con un procedimiento análogo.
Sin embargo, a pesar de las expectativas en contrario, no se
amplificó marcador PCR alguno asignable a este grupo.
Iniciadores dirigidos contra ADHs de cadena
media se diseñaron como sigue: las ADHs de cadena media se
dividieron sobre la base del análisis de secuencia en 4
agrupaciones. Subsiguientemente, se construyeron en cada caso 4
juegos de iniciadores degenerados que difieren por el uso de codones
seleccionado. Esto se ilustrará gráficamente y a modo de ejemplo en
la Figura 2 sobre la base del grupo de organismos para determinación
del grupo de iniciadores 2. Los juegos de iniciadores se
seleccionaron sobre la base de regiones conservadas en 33 secuencias
de alcohol-deshidrogenasa diferentes.
Estos grupos de iniciadores, por ejemplo el
grupo de iniciadores 2, se utilizaron subsiguientemente para
investigar diversas agrupaciones (que contenían DNA genómico de
microorganismos). Utilizando este juego de iniciadores, fue posible
amplificar, clonar y secuenciar una base de secuencias ADH parciales
de cadena media. El resultado correspondiente de esta tipificación
PCR se muestra más adelante en la Figura 3. Como se documenta, entre
otras cosas, por las pistas 1, 2, y 10 de la Figura 3, se
encontraron en este contexto en cada caso secuencias génicas que
indican actividad de una alcohol-deshidrogenasa,
debido a la secuencia de genes correspondiente a los genes
conocidos de las enzimas ADH. Globalmente, se identificaron
secuencias de genes ulteriores con actividad potencial de
alcohol-deshidrogenasa. La identidad de los
marcadores de secuencia encontrados con ADHs ya conocidas estaba
comprendida entre 51-99%.
Debido a las propiedades interesantes de la
(S)-alcohol-deshidrogenasa conocida
de Rhodococcus eryhtropolis
(S-Re-ADH; esta enzima se
caracteriza por conversión estereoselectiva de un amplio espectro de
cetonas y cetoésteres en los compuestos hidroxilados
correspondientes) que pertenece asimismo a las
alcohol-deshidrogenasas de cadena media, y también
de otras alcohol-deshidrogenasas obtenidas de cepas
de Rhodococcus, se investigó la cuestión de si sería posible
identificar nuevas secuencias de ADH que exhiban una semejanza
relativamente alta con esta secuencia, con ayuda de cribado
genético. La fuerza impulsora es en este caso la suposición de que
nuevas ADHs cuyas secuencias comparten una identidad alta con la
secuencia de S-Re-ADH podrían poseer
análogamente propiedades interesantes. Por ejemplo, tales ADHs
nuevas podrían poseer por una parte las propiedades demostradas de
S-Re-ADH pero, por otra parte, por
ejemplo, podían tener un espectro de sustratos modificado o
eficiencia de expresión incrementada. Con objeto de responder a la
interrogante anterior, se llevaron a cabo primeramente análisis
comparativos de secuencias con la secuencia de aminoácidos de estas
S-Re-ADH. Estos análisis revelaron
que S-Re-ADH es un representante de
la agrupación 1 de las ADHs de cadena media. Adicionalmente, se
encontró dentro de esta agrupación un grupo constituido por 5
secuencias de proteína, que incluye
S-Re-ADH. Partiendo de estas 5
secuencias, se construyeron y ensayaron iniciadores degenerados,
teniendo en cuenta el uso de codones, de acuerdo con el
procedimiento arriba descrito.
Con objeto de reducir el número de PCRs a
efectuar, se establecieron agrupaciones constituidas por 24 aislados
bacterianos y se aisló el DNA. Este DNA se utilizó como molde. Se
amplificaron y secuenciaron numerosos marcadores de secuencia. El
análisis de los marcadores de secuencia traducidos en secuencias de
aminoácidos revelaba identidades respecto a la secuencia
S-Re-ADH de aproximadamente 84 a
99%. Se aislaron 2 genes de longitud total que están representados
por una secuencia tag y que exhiben 98% de identidad con
S-Re-ADH al nivel de secuencia de
aminoácidos. Las nuevas ADHs se derivan del organismo
Arthrobacter paraffineus ATCC 21327). La homología al nivel
del DNA es 94%. Dichos genes de longitud total se aislaron con ayuda
de un enfoque de homología de secuencias.
Además, se ensayaron finalmente 12 juegos de
iniciadores para las ADHs de cadena corta, que están dirigidas
contra las 3 agrupaciones de este grupo. El molde utilizado fue DNA
que se había aislado a partir de 5 materiales aislados que, debido
a su actividad de ADH, habían reducido
4-cloroacetofenona o 2-heptanona en
el cribado de actividad. La identidad de los marcadores de
secuencia de aminoácidos con secuencias de ADH de cadena corta
conocidas está comprendida entre 47% y 84%, exhibiendo la gran
mayoría de estas secuencias una identidad inferior a 67% con las
secuencias publicadas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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<110> Degussa GmbH
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<120> Nuevas
alcohol-deshidrogenasas
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<130>
DG-IPM-PAT/Dr. Re
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<160> 4
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 33
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<211> 348
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
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<221> Fuente
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<223> ZF0050310 = Arthrobacter
paraffineus
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<400> 33
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<210> 34
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<212> PRT
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<221> Fuente
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<223> ZF0050310 = Arthrobacter
paraffineus
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paraffineus
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<212> DNA
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<223> ZF0050310 = Arthrobacter
paraffineus
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<400> 68
Claims (24)
1. Un polipéptido que tiene la actividad
biológica de una alcohol-deshidrogenasa dependiente
de NAD o NADP, y que comprende las secuencias siguientes: una
secuencia que es idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 34.
2. Una molécula de ácido nucleico, que
codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Una molécula de ácido nucleico, que es
complementaria a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 2.
4. Un vector, que comprende la molécula de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3.
5. Un hospedador no humano, que comprende el
vector de acuerdo con la reivindicación 4.
6. El hospedador de acuerdo con la
reivindicación 5, que es una célula.
7. El hospedador de acuerdo con la
reivindicación 5, que es un animal transgénico no humano.
8. El hospedador de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 5 a 7, que tiene una deshidrogenasa adicional
adecuada para regeneración de cofactores o una molécula de ácido
nucleico que codifica dicha deshidrogenasa.
9. El hospedador de acuerdo con la
reivindicación 8, en el cual la deshidrogenasa adecuada para
regeneración de cofactores es una
formiato-deshidrogenasa o una
glucosa-deshidrogenasa.
10. Un sistema de reacción, que comprende un
compuesto orgánico que es un sustrato de una deshidrogenasa, el
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, el vector de acuerdo
con la reivindicación 4 o el hospedador de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 5 a 9, y, en caso apropiado, un cofactor
para el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
11. El sistema de reacción de acuerdo con la
reivindicación 10, en el cual el compuesto orgánico que es un
sustrato de una deshidrogenasa es un compuesto de carbonilo.
12. El sistema de reacción de acuerdo con la
reivindicación 11, en el cual el compuesto de carbonilo es un
aldehído o una cetona.
13. El sistema de reacción de acuerdo con la
reivindicación 12, en el cual la cetona es una cetona sustituida
asimétricamente.
14. El sistema de reacción de acuerdo con la
reivindicación 10, en el cual el compuesto orgánico que es un
sustrato de una deshidrogenasa es un alcohol.
15. El sistema de reacción de acuerdo con la
reivindicación 14, en el cual el alcohol es un alcohol primario o
un alcohol secundario quiral.
16. El sistema de reacción de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el cual el cofactor
es NADH, NADPH, NAD^{+} o NADP^{+}.
17. Un proceso para preparar el polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 1 o un polipéptido codificado por la
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2,
proceso que comprende cultivar el hospedador de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 y aislar dicho
polipéptido.
18. Un proceso para preparar el polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 1 o un polipéptido codificado por la
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2,
proceso que comprende aislar dicho polipéptido de una muestra de
fluido corporal o de tejido del hospedador de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 9.
19. Un proceso para un compuesto orgánico que es
un producto de una deshidrogenasa, proceso que comprende hacer
reaccionar un compuesto orgánico que es un sustrato de una
deshidrogenasa con el polipéptido de acuerdo con la reivindicación
1, el hospedador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5
a 9 o por medio del sistema de reacción de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 16.
20. El proceso de acuerdo con la reivindicación
19, que comprende adicionalmente el paso de aislar el producto de
la reacción.
21. El proceso de acuerdo con la reivindicación
20, que comprende adicionalmente procesar el producto para dar un
medicamento.
\newpage
22. El proceso de acuerdo con la reivindicación
20, que comprende adicionalmente el paso de procesar el producto
para dar un producto secundario.
23. El proceso de acuerdo con la reivindicación
22, que comprende adicionalmente el paso de formular el producto
secundario en la preparación de un medicamento.
24. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 23, en el cual el producto es un alcohol
enantioméricamente puro.
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