ES2336772T3 - Conjugados de poliamina con retinoides acidos y preparacion de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Conjugados de poliaminas con retinoides ácidos en los que dichos conjugados son amidas de poliaminas en las que el grupo R del grupo acilo RCO es uno de los residuos de retinoide R1-R6 indicados en los siguientes retinoides ácidos y análogos del ácido all-trans-retinoico de cadena corta del polieno farmacéuticamente importantes: **(Ver fórmula)** y dichas poliaminas son: a) tri-, tetra- y hexa-aminas lineales, cuyos conjugados tienen las fórmulas generales siguientes: **(Ver fórmula)** en la que n es 1 a 9 b) poliaminas conformacionalmente restringidas, cuyos conjugados tienen la fórmula general siguiente: **(Ver fórmula)** c) poliaminas cíclicas, cuyos conjugados tienen las fórmulas generales siguientes: **(Ver fórmula)** d) poliaminas ramificadas (diméricas), cuyos conjugados tienen la fórmula general siguiente: **(Ver fórmula)** en la que R'' es COR ó (CH2)3NHCOR y R'''' es COR ó (CH2)3NHCOR y n es uno de los números 1, 2 y 7.
Description
Conjugados de poliamina con retinoides ácidos y
preparación de los mismos.
La presente invención se refiere a la
preparación de una serie de conjugados de poliamina nuevos con
derivados de vitamina A que inhiben la ribozima RNasa P y la
producción de IL-2 e IFN-\gamma a
través de células mononucleares de sangre periférica in
vitro y que tienen aplicaciones terapéuticas potenciales en
trastornos neoplásticos, de la queratinización e inflamatorios. En
particular, la invención se refiere a conjugados, obtenidos de la
condensación de poliaminas lineales, conformacionalmente
restringidas, cíclicas y ramificadas con retinoides ácidos, tales
como el ácido
all-trans-retinoico.
Las poliaminas lineales, como la espermina (SPM,
1) y espermidina (SPD, 2), y sus compuestos con otros productos
naturales, colectivamente denominados conjugados de poliamina, se
distribuyen ampliamente en organismos vivos y presentan propiedades
biológicas interesantes.
Con el fin de determinar las relaciones de la
actividad biológica de la estructura y posiblemente identificar los
compuestos guía para el desarrollo de productos farmacéuticos
basados en poliamina, se han sintetizado una diversidad de
conjugados y análogos de poliamina lineales, ramificados,
conformacionalmente limitados y cíclicos (Blagbrough y col., PHARM.
SCI., 3, 223 (1997); Schulz y col., ANGEW. CHEM. INT. END. ENGL.,
36, 314 (1997); Papaioannou y col., EUR. J. ORG. CHEM., 1841 (2000)
y Kong Thoo Lin y col., SYNTHESIS, 1189 (2000)). Debido a su
naturaleza policatiónica, las poliaminas interactúan fuertemente con
ácidos nucleicos y desempeñan una función importante en su
biosíntesis y metabolismo. Estabilizan la conformación de ADN y
pueden inducir cambios en la conformación a pesar de la formación
de puentes intra o intermoleculares. Las poliaminas producen
modificaciones específicas de moléculas de ARN especializadas,
estabilizan ribonucleasas y estimulan la acción de ribonucleasas y
ribozimas. Ejercen efectos pleiotrópicos en la síntesis de
proteínas, son esenciales para el crecimiento normal y están
implicadas en los procesos de diferenciación de células mamíferas.
Las concentraciones de poliaminas y las enzimas responsables de su
biosíntesis son notablemente superiores en la proliferación rápida
de células mamíferas; por lo general, estas concentraciones aumentan
en todas las células tras la inducción de la diferenciación. Las
poliaminas son directamente responsables del aumento en la velocidad
de la síntesis macromolecular que tiene lugar durante el desarrollo
y crecimiento de tumores. La inhibición de enzimas biosintéticas
que producen poliaminas y del sistema de recaptación de poliaminas
responsable de alimentar la célula con poliaminas exógenas ha
resultado ser un objetivo muy atractivo para la quimioterapia del
cáncer. Recientemente, las poliaminas selectivamente
N-alquiladas que imitan parcialmente el
comportamiento natural de las poliaminas, inhiben el crecimiento
celular y son metabólicamente estables, se han desarrollado como
agentes anticancerígenos nuevos (para referencias principales véase
la revisión de Papaioannou y col., EUR. J. ORG. CHEM., 1841
(2000)).
Los retinoides constituyen una gran familia de
compuestos orgánicos relacionados estructuralmente con la Vitamina
A de origen natural (retinol, 3) y análogos, tales como retinal (4)
y ácido all-trans-retinoico (5) y una
diversidad de otros análogos sintéticos, tales como acitretina (6),
ácido 13-cis-retinoico (7) y ácido 9-cis-retinoico
(8). Los análogos 9 y 10 del ácido
all-trans-retinoico de cadena corta del
polieno también se pueden considerar miembros de esta familia.
Los retinoides pueden producir respuestas
biológicas específicas después de unirse a y activar receptores o
grupos de receptores especiales. Los retinoides naturales o
sintéticos desempeñan una función importante en la visión,
crecimiento celular, reproducción, proliferación y diferenciación de
diversos tejidos epiteliales o no epiteliales. Aunque ya se usan
ampliamente en el tratamiento sistémico y tópico de diversos
trastornos, los retinoides revelan una serie considerable de
efectos secundarios incluso cuando se usan en dosis terapéuticas.
Así pues, numerosos análogos de retinoides nuevos se han sintetizado
para intentar mejorar el índice terapéutico, perfil biológico y
selectividad de estos compuestos para la aplicación clínica en
dermatología, oncología, reumatología e inmunología (para
monografías generales véase Sporn, Roberts and Goodman (Eds.), The
Retinoids, vol. 1 y 2, Academic Press, Orlando, 1984; Sporn and
Roberts, CIBA FOUND. SYMP., 113, 1 (1985); Sporn, Roberts and
Goodman (Eds.), The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2ª
ed., Raven Press, New York, 1994; Dawson and Okimura (Eds.),
Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids, CRC Press, Boca Ratón,
1990; Packer (Ed.), Methods in Enzymology, Academic Press, vol.
189, parí A, 1990 y vol. 190, part B, 1991)). La aplicación clínica
de retinoides sintéticos en la gestión de trastornos recalcitrantes
y anteriormente neoplásticos incurables, inflamatorios y de
queratinización ha presentado una revolución real en dermatología y
otros campos médicos (Tsambaos, DERMATOSEN, 44, 182 (1996), Muindi,
CANCER TREAT. RES., 87, 305 (1996)). Regulando la expresión
genética, los retinoides son capaces de regular la diferenciación y
crecimiento de células transformadas o de inhibir la transformación
maligna de una diversidad de células que revierten su diferenciación
(DeLuca, FASEB J., 5, 2924 (1991), Lotan y Glifford, BIOMED.
PARMACOTHER., 45, 145 (1991)). En los mecanismos de regulación de la
expresión genética por parte de retinoides, están implicados
ciertos miembros de la gran familia de receptores de hormonas de
glándulas tiroideas y esteroideas, es decir proteínas nucleares a
las que se unen específicamente retinoides (DeLuca, FASEB J., 5,
2924 (1991), Leid y col., TRENOS BIOCHEM. SCI., 17, 427 (1992)).
Los receptores de retinoides ya se han aislado y estudiado
(Redfern, PATHOBIOL. 60, 254 (1992), Giguere y col., NATURE, 330,
624 (1987), Petkovich y col., NATURE, 330, 444 (1987)). Actúan como
factores de trascripción seguido de la activación por medio de
ligandos adecuados. En la actualidad, el desarrollo de nuevos
fármacos basados en retinoides está basado en la síntesis de nuevos
ligandos para los receptores de ácidos retinoicos
RAR\alpha,\beta,\gamma y RXR\alpha,\beta,\gamma y los
receptores huérfanos (Lippman y Lotan, J. NUTR. 130 (2S Suppl), 479S
(2000)).
Recientemente se ha reseñado que los retinoides
naturales, como ácido retinoico y retinol, así como análogos
sintéticos de ácido retinoico, por ejemplo, isotretinoin (ácido
13-cis-retinoico, acitretina y los arotinoides Ro
13-7410, Ro 15-0778, Ro
15-1570 y Ro 13-6298 pero también
otros compuestos, por ejemplo, calcipotriol, antralin y su
combinación, conocidos por su actividad antisoriática, inhiben la
enzima ribonucleasa P (RNasa P) (Papadimou y col., J. BIOL. CHEM.
273, 24375 (1998), Papadimou y col., SKIN PHARMACOL APPL SKfN
PHYSIOL. 13, 345 (2000), Papadimou y col., EUR. J. BIOCHEM. 267,
1173 (2000), Drainas y col, SKIN PHARMACOL. APPL SKIN PHYSIOL.13,
128 (2000), Papadimou y col., BIOCHEM. PHARMACOL. 60, 91 (2000)),
que se ha aislado y caracterizado a partir del molde de limo
Dictyostelium discoideum (Stathopoulos y col.; EUR.J.
BIOCHEM. 228, 976 (1995)) y de queratinocitos epidérmicos humanos
normales. (Drainas y col, resultados no publicados). Estos
resultados abogan por la hipótesis de que los retinoides, además de
regular la trascripción de ADN, también pueden regular la actividad
de enzimas desempeñando papeles clave en biosíntesis macromolecular,
por su implicación en procesos
post-trascripcionales, en los que no está implicada
la unión a receptores del ácido retinoico. La RNasa P es
responsable de hacer madurar los extremos 5' de las moléculas del
precursor tRNA. La actividad de la RNasa P se ha encontrado en
todos los organismos pro- y eucarióticos estudiados hasta el momento
(Frank y Pace ANNU. REV. BIOCHEM. 67, 153 (1998)). Las enzimas de
RNase P son complejos de ARN con proteínas y si actividad se
atribuye principalmente a su subunidad de ARN. Varios
descubrimientos indican que la estructura de la subunidad de ARN es
de tamaño similar en los organismos pro y eucarióticos y que las
estructuras de RNasa P de diferentes organismos eucarióticos son
similares. Por estas razones, parece que la RNasa P de D.
discoideum y queranocitos epidérmicos humanos son modelos
buenos para la identificación y desarrollo de inhibidores
nuevos.
Unir una poliamina a otra molécula bioorgánica
da como resultado la formación de un conjugado de poliamina.
Dependiendo de la estructura del resto sin poliamina, estos
conjugados están diseñados para presentar actividad biológica
mejorada en dianas celulares particulares o combinar las actividades
de las moléculas constituyentes. Los compuestos (conjugados) de la
presente invención se sintetizaron para intentar combinar los
perfiles biológicos de poliaminas y retinoides. Todos se obtuvieron
usando como etapa clave el acoplamiento de análogos de poliamina
tabulados en la Figura 1 con los retinoides descritos en la Figura
2. Se anticipó que la afinidad de la poliamina con los ácidos
nucleicos, por ejemplo la parte de ARN de la RNasa P, reforzaría la
unión de retinoides de origen natural y sintético en la misma
molécula. Recientemente, se sintetizó
N^{1},N^{3}-diretinoil-1,3-diaminopropano,
a partir de 1,3-diaminopropano y cloruro de
retinoilo, en forma de agente antitumoral potencia! pero mostró
poca actividad citostática (Manfredini y col., J. MED. CHEM., 40,
3851 (1997)), mientras que las composiciones cosméticas y/o
dermatológicas estaban constituidas por retinol o ésteres de retinol
y se prepararon polímeros de poliamina y mostraron que los
polímeros de poliamina proporcionan una estabilización superior al
retinol en composiciones para el cuidado de la piel en comparación
con productos conocidos con propiedades antioxidanes o
estabilizantes de retinol (Nguyen y col., Patente de Estados Unidos
Nº. 6.344.206 B1).
El documento WO 9834646 describe antioxidantes,
por ejemplo sustancias similares a caroteno como ácido retinoico
unido a restos de fijación como diana tales como poliaminas, como
espermina y espermidina para el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos.
De hecho, los conjugados descritos en la
presente invención revelan efectos inhibitorios más fuertes en RNasa
P aislada de D. discoideum y queratinocitos epidérmicos
humanos que los retinoides parentales o una combinación de
poliaminas libres y los retinoides correspondientes (Tabla 1). A
partir de los mismos estudios, parece que cuantas más funciones
amino libres estén disponibles en los conjugados para interactuar,
más fuerte es la inhibición de la RNasa P (por ejemplo el conjugado
de espermina con ácido all-trans-retinoico es
un inhibidor más fuerte que el conjugado de espermidina
correspondiente). Por otra parte, los conjugados con dos residuos
retinoides son más activos que aquellos que tienen un residuo (por
ejemplo, la espermina que lleva dos residuos del ácido
all-trans-retinoico es un inhibidor más
fuerte que la espermina que sólo lleva uno). Además estos
compuestos muestran un efecto inhibitorio en la producción de
IL-2 e IFN-\gamma por medio de
células mononucleares de sangre periférica de sujetos humanos
saludables in vitro. En marcado contraste, los retinoides
actualmente disponibles muestran un efecto estimulador en la
producción de estas citoquinas. Estos resultados indican que los
compuestos descritos en la presente memoria descriptiva tienen un
potencial significativo para la aplicación clínica en el tratamiento
de trastornos neoplásticos, inflamatorios y de queratinización.
Figura 1: Estructuras de poliaminas usadas para
preparar los conjugados descritos en la presente invención.
Figura 2: Estructuras de retinoides usadas para
preparar los conjugados descritos en la presente invención.
Figura 3: Procedimiento general para la
preparación de esteres de succinimidilo aislables de retinoides
ácidos.
Figura 4: Esquemas sintéticos para la
preparación de N^{\alpha}-mono- y
N^{\alpha},N^{\omega}-bisamidas de poliaminas
lineales con retinoides ácidos.
Figura 5: Esquemas sintéticos para la
preparación de N^{4},N ^{9}-bisamida de
espermina y de las tres N-monoamidas de espermidina
con retinoides ácidos.
Figura 6: Esquemas sintéticos para la
preparación de N^{\alpha},M^{\omega}-bisamidas
de tetra- y hexamidas conformacionalmente restringidas con
retinoides ácidos.
Figura 7: Esquemas sintéticos para la
preparación de dímeros simétricos y asimétricos de poliamidas de
espermina y espermidina de hexaminas y octaminas cíclicas y con
retinoides ácidos.
Figura 8: Gráfica doble recíproca (1/v frente a
1/[pre-ARNt]) para la reacción de RNasa P en
presencia de
N^{1}N^{12}-RA_{2}-espermina.
La reacción se llevó a cabo en las concentraciones indicadas en
presencia o ausencia de inhibidor. Todas las reacciones se llevaron
a cabo a 37ºC en 20 \mul de tampón D en presencia de DMSO al 10%.
(\blacklozenge) sin inhibidor, con
N^{1},N^{12}-RA_{2}-espermina
a (\ding{110}) 3 \muM, (\ding{115}) 4 \muM, (\medbullet) 5
\muM. Panel superior. Gráfica de las pendientes de las
líneas dobles recíprocas frente a las concentraciones del inhibidor
(I).
Figura 9: Efecto de
N^{1},N^{12}-RA_{2}-SPM sobre
el porcentaje de células mononucleares de sangre periférica
CD4+/IL-2+ y CD8+/IL-2+.
Figura 10: Efecto de
N^{1},N^{12}-RA_{2}-SPM sobre
la intensidad media de fluorescencia (MFI) de células mononucleares
de sangre periférica CD4+/IL-2+ y
CD8+/IL-2+.
Figura 11: Efecto de
N^{1},N^{12}-RA_{2}-SPM sobre
el porcentaje de células mononucleares de sangre periférica
CD8+/IFN-\gamma+.
CD8+/IFN-\gamma+.
Figura 12: Efecto de
N^{1},N^{12}-RA_{2}-SPM o
sobre la intensidad media de fluorescencia (MFI) de células
mononucleares de sangre periférica
CD8+/IFN-\gamma+.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la presente invención son
conjugados de poliamina con retinoides ácidos, que se preparan a
través de la condensación de poliaminas libres o de poliaminas
selectivamente protegidas, a partir de las descritas en la Figura
1, directamente con los retinoides o con los esteres de
succinimidilo correspondientes de los retinoides ácidos tabulados
en la Figura 2. Los conjugados de la presente invención son
inhibidores de la enzima RNasa P, aislada del molde de limo D.
discoideum y queratinocitos epidérmicos humanos. El inhibidor
más potente entre estos conjugados también ha mostrado efectos
inhibitorios excelentes en la producción de IL-2 e
INF-\gamma por medio de células mononucleares de
sangre periférica. Así pues, es razonable asumir que estos
compuestos pueden ser útiles en la gestión de trastornos
inflamatorios.
La evaluación biológica de los conjugados de la
presente invención a través del examen de su actividad inhibitoria
sobre la RNasa P a partir del molde de limo D. discoideum y
queratinocitos epidérmicos humanos constituye una prueba rápida y
segura de la evaluación de su potencial para modular la
diferenciación y proliferación epitelial y revertir la
transformación maligna de las células epiteliales. Así pues, las
pruebas laboriosas alternativas para la evaluación del retinoide
basadas en la activación trascripcional mediada por el receptor del
ácido retinoico (RAR) (Astrom, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., 173,
339 (1990)), o la supresión de la expresión de una enzima (Michel,
ANAL. BIOCHEM., 192, 232 (1991)), o la inducción de un ARN de
proteína (Eider, J. INVEST. DERMATOL. 106, 517 (1996)) se vuelven
innecesarias.
Una subfamilia de los compuestos de la presente
invención está representada por las siguientes fórmulas generales
3DI-3DIX, que representan conjugados de poliaminas
lineales, de números variables de átomos de carbono y nitrógeno en
la cadena, con retinoides ácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La suscripción n en la fórmula 3DVIII varía de 2
a 9 y en la fórmula 3DIX de 1-9. El sustituyente R
es uno de los siguientes sustituyentes
R^{1}-R^{6}, preferiblemente R^{1}.
\vskip1.000000\baselineskip
La otra subfamilia de los compuestos de la
presente invención con las fórmulas generales
3DX-3DXVII, incluye conjugados de poliaminas
conformacionalmente restringidas, cíclicas y ramificadas (diméricas)
con retinoides ácidos. La restricción de la conformación en el
resto de poliamina está impuesta por medio de, por ejemplo, anillos
aromáticos incorporados en la cadena (conjugados 3DX y 3DXI) o
anillos heterocíclicos (conjugados 3DXII) mientras que las
poliaminas cíclicas usadas son de diversos tamaños de anillo y
contienen diferentes números de átomos de carbono, nitrógeno y
oxígeno en el anillo (conjugados 3DXIII-3DXVI). En
esta subfamilia, el resto de poliamina también está constituido por
dímeros (espermina y espermidina) de poliamina simétrica o
asimétrica (conjugados 3DXVII). En esta categoría de compuestos, el
sustituyente R es uno de los anteriormente mencionados
R^{1}-R^{6}, preferiblemente R^{1}, mientras
que n es uno de los números 1, 2 y 7. En los compuestos 3DXVIIA, R'
es idéntico a R'' e igual a COR. En los compuestos 3DXVIIB, R' es
también idéntico a R'' pero igual a (CH_{2})_{3}NHCOR.
Por último, en los compuestos 3DXVIIC, R' es igual a COR y R'' es
igual a (CH_{2})_{3}NHCOR.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción clave en la síntesis de las amidas
de poliamina descritas en la presente invención es el acoplamiento
de un retinoide ácido o derivados activados de un retinoide ácido
con una poliamina libre (procedimiento directo) o un derivado
adecuadamente protegido de una poliamina (procedimiento indirecto).
Los retinoides ácidos usados en este trabajo estaban disponibles en
el mercado, por ejemplo ácido
all-trans-retinoico (ALDRICH), ácido 9- y
13-cis-retinoico (SIGMA) y acitretina (ROCHE) o se
sintetizaron usando reacciones convencionales, por ejemplo los
análogos 9 y 10 del ácido
all-trans-retinoico de cadena corta
del polieno descritos en la Figura 2. En particular, el ácido
\beta-ionilidenacético (9) se obtuvo de acuerdo
con un protocolo publicado (Tietze und Eicher, "Reactionen und
Synthesen im organisch-chemischen Praktikum",
Thieme, New York, 1981, pág. 445), mientras que el ácido
\beta-ioniliden-trans-crotónico
(10) se sintetizó a partir de
\beta-ionilidenetanol (referencia anterior, pág.
446) a través de un protocolo de tres etapas que implica la
oxidación del aldehído correspondiente con ácido
o-yodoxibenzoico (IBX) en DMSO (Frigerio y col., J.
ORG. CHEM., 60, 7272 (1995)), reacción de Wittig con dietil
(etoxicarbonil)metilfosfonato y por último saponificación.
Teniendo en cuenta la sensibilidad de los retinoides hacia los
reactivos fuertemente ácidos, se elige la activación de los
retinoides en forma de sus esteres "activos" correspondientes
con N-hidroxisuccinímida (HOSu) que son
hidrolíticamente relativamente estables y se pueden purificar
fácilmente, en caso necesario, con cromatografía en columna
ultrarrápida (FCC). Además, los ésteres de succinimidilo de ácidos
carboxílicos \alpha,\beta-insaturados reaccionan
solamente con el grupo amino primario de poliaminas (Papaioannou y
col., TETRAHEDRON LETT., 43, 2593 (2002)). Los ésteres de
succinimidilo de retinoides ácidos (21) se obtienen simplemente
(Figura 3) por medio del tratamiento del retinoide ácido con HOSu
en presencia del agente de acoplamiento
N,N'-diciciohexilcarbodiimida (DCC) (véase el
Ejemplo 1). Los ésteres de succinimidilo 21 así obtenidos son de
pureza suficiente para usarse en la siguiente etapa. Sin embargo,
las muestras puras se pueden obtener fácilmente a través de
purificación con FCC. Los ésteres 21 se usan después para acilar
los grupos amino primarios de las poliaminas libres (procedimiento
directo) o poliaminas protegidas en sus funciones amino secundarias
con grupos de protección, tales como
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o
trifluoroacetilo (Tfa), que se pueden eliminar posteriormente en
condiciones básicas (procedimiento indirecto). Los ejemplos de
ambas metodologías en la preparación de tetra-aminas
N^{\alpha}-mono(3DII)- y
N^{\alpha},N^{\omega}-diacetiladas lineales (3DI
y 3DVIII) y triaminas
N^{\alpha},N^{\omega}-diacetiladas (3DIV) y
hexa-aminas (3DIX) se presentan en la Figura 4 y se
detallan en los Ejemplos 2 y 3. Los precursores útiles para la
metodología indirecta son poliaminas que soportan el grupo protector
trifenilmetilo (tritilo, Trt) en sus funciones amino terminales,
como 22, 26 y 27, cuya preparación se ha descrito por parte de uno
de los inventores usando el enfoque amida para el ensamblaje de la
cadena de poliaminas (Papaioannou y col., TETRAHEDRON LETT, 36,
5187 (1995); 39, 5117 (1998); 42, 1579 (2001); 43, 2593 y 2597
(2002) y Papaioannou y col., en "Drug Discovery and Design:
Medical Aspects", J. Matsoulkas y T. Mavromoustakos (Eds.), IOS
Press, Amsterdam, 2002, en prensa). Estos precursores se protegen
después rutinariamente en sus funciones amino secundarias con, por
ejemplo, el grupo Fmoc y por último se detritilan por medio de una
solución de ácido trifluoroacético (TFA) en diclorometano (DCM).
Después se lleva a cabo la mono- y/o bisacilación usando uno o dos
equivalentes de ésteres 21, respectivamente. Por último, tiene
lugar la desprotección del grupo amino secundario usando una
solución al 20% de piperidina (Pip) en DCM, seguido de purificación
rutinaria de los intermedios completamente protegidos por FCC, en
caso necesario.
La preparación de poliaminas aciladas en sus
funciones amino secundarias por medio de derivados de retinoides
ácidos activados se ilustra en la Figura 5 con la preparación de
conjugados de espermina 3DIII y se describen en detalle en el
Ejemplo 4. Así pues, la trifluoroacetilación selectiva de las
funciones amino primarias (O'Sullivan y Dalrympe, TETRAHEDRON
LETT., 36, 3451 (1995); Blackiock y col., TETRAHEDRON LETT,, 36,
7357 (1995); Krakowiak y Bradshaw, SYNTH. COMMUN., 28, 3451 (1998);
Blagbrough y col., TETRAHEDRON, 56, 3439 (2000)) con
CF_{3}CO_{2}Et seguido de la acilación de las restantes
funciones amino con el retinoide ácido en presencia del agente de
acoplamiento potente hexafluorofosfato bromotripirrofidinofosfonio
(PyBrOP) y ^{i}Pr_{2} NEt lleva a los derivados 28 de espermina
completamente protegidos, a partir de los cuales se obtienen los
conjugados proyectados 3DHI a través de hidrólisis alcalina. Usando
la misma metodología descrita en detalle en el Ejemplo 5, se
obtuvieron los conjugados de espermidina
N^{4}-monoacilados 3DVI (Figura 5), mientras que
los otros dos regioisómeros posibles 3DV y 3DVII se volvieron
disponibles a través de las N^{1}(29)- y
N^{8}(30)-tritilespermidinas
correspondientes, de acuerdo con la metodología también descrita en
la Figura 5 y en detalle en el Ejemplo 6. La preparación del
precursor anterior ya se ha descrito (Papaioannou y col.,
TETRAHEDRON LETT., 42, 1579 (2001)), mientras que el último se
obtuvo fácilmente a través del acoplamiento del cloruro
Fmoc-NH(CH_{2})_{2}COCl
(Papaioannou y col., TETRAHEDRON LETT., 36, 5187 (1995)) con
N-tritilputrescina en presencia de
^{i}Pr_{2}NEt, seguido de la eliminación rutinaria del grupo
Fmoc y por último reducción mediada por LiAIH_{4}.
La preparación de las bisamidas de poliamina
3DX-3DXIV que incorporan dos residuos de retinoides
en sus funciones amino primarias se describe en la Figura 6 y es
idéntica a la preparación directa de los conjugados
3DVIII.2SuOH (Figura 4). implica el tratamiento simple de las tetra-aminas 13-15 y 18 y la hexa-amina 16 con dos equivalentes molares de ésteres de succinimidilo 21. En caso de que las bases libres no estén fácilmente disponibles, en su lugar se usan las sales de politrifluoroacetato correspondientes y ^{i}Pr_{2}Net para su neutralización in situ (véase Ejemplo 2, procedimiento directo B). Las síntesis de las poliaminas 13-16 y 18, usadas como materiales de partida en estas preparaciones, ya se han descrito por parte de uno de los inventores (Papaioannou y col., TETRAHEDRON LETT., 43, 2593 (2002) y Papaioannou y col., en "Drug Discovery and Design: Medical Aspects", J. Matsoulkas y T. Mavromoustakos (Eds.), IOS Press, Amsterdam, 2002, en prensa). Por último, la preparación de las tri (3DXV)- y tetra (3DXVI y 3DXVII-C)-amidas de poliaminas que incorporan tres y cuatro residuos de retinoide, respectivamente, en sus funciones amino primarias se describe en la Figura 7. Estas síntesis implican el acoplamiento de las poliaminas correspondientes 19 y 17 y 20 con tres y cuatro equivalentes molares, respectivamente, de ésteres de succinimidilo 21. También se ha descrito recientemente la síntesis de poliaminas 17 (Papaioannou y col., TETRAHEDRON LETT., 43, 2597 (2002)) y 19 y 20 (Papaioannou y col., TETRAHEDRON LETT., 43, 2593 (2002)).
3DVIII.2SuOH (Figura 4). implica el tratamiento simple de las tetra-aminas 13-15 y 18 y la hexa-amina 16 con dos equivalentes molares de ésteres de succinimidilo 21. En caso de que las bases libres no estén fácilmente disponibles, en su lugar se usan las sales de politrifluoroacetato correspondientes y ^{i}Pr_{2}Net para su neutralización in situ (véase Ejemplo 2, procedimiento directo B). Las síntesis de las poliaminas 13-16 y 18, usadas como materiales de partida en estas preparaciones, ya se han descrito por parte de uno de los inventores (Papaioannou y col., TETRAHEDRON LETT., 43, 2593 (2002) y Papaioannou y col., en "Drug Discovery and Design: Medical Aspects", J. Matsoulkas y T. Mavromoustakos (Eds.), IOS Press, Amsterdam, 2002, en prensa). Por último, la preparación de las tri (3DXV)- y tetra (3DXVI y 3DXVII-C)-amidas de poliaminas que incorporan tres y cuatro residuos de retinoide, respectivamente, en sus funciones amino primarias se describe en la Figura 7. Estas síntesis implican el acoplamiento de las poliaminas correspondientes 19 y 17 y 20 con tres y cuatro equivalentes molares, respectivamente, de ésteres de succinimidilo 21. También se ha descrito recientemente la síntesis de poliaminas 17 (Papaioannou y col., TETRAHEDRON LETT., 43, 2597 (2002)) y 19 y 20 (Papaioannou y col., TETRAHEDRON LETT., 43, 2593 (2002)).
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Actividad inhibitoria en RNasa P. Se ha
desarrollado un procedimiento por el cual se puede calcular
rápidamente la actividad biológica de los conjugados
poliamina-retinoide. Este procedimiento está basado
en el efecto de los conjugados poliamina-retinoide
en la actividad de RNasa P y se describe en detalle en el Ejemplo
7. Todos los conjugados sintetizados se evaluaron para detectar su
efecto en la actividad de RNasa P por medio de la construcción de
curvas de respuesta de la dosis. A partir de las curvas de respuesta
de la dosis se calcula el valor CI_{50} (la concentración de
conjugado a la que la formación de producto se reduce al 50%)
(Papadimou y col., J. BIOL. CHEM. 273, 24375 (1998)), que es una
primera medida y bastante fiable para la potencia de análogos de
retinoide. La estimación precisa de la potencia inhibitoria en la
RNasa P de los conjugados poliamina-retinoide más
fuertes se elucidaron por medio de análisis cinéticos detallados de
su efecto en la actividad de la RNasa P de D. discoideum o
queratinocitos epidérmicos humanos. Con el fin de llevar a cabo
tales análisis, se determinó la velocidad inicial en presencia o
ausencia del conjugado a partir de las pendientes iniciales de las
gráficas de tiempo. Los datos representados en gráficas dobles
recíprocas (1/v frente a 1/[S]) con concentraciones en aumento de
conjugados poliamina-retinoide y los valores K_{i}
(la constante de disociación del inhibidor (I), en la que I es un
conjugado poliamina-retinoide, con la enzima) se
determinaron a partir de las gráficas de las pendientes de las
gráficas dobles recíprocas frente a la concentración del inhibidor
(Papadimou y col., J. BIOL. CHEM. 273, 24375 (1998), Papadimou y
col., SKIN PHARMACOL. APPL. SKIN PHYSIOL 13, 345 (2000)). Estas
gráficas llevan a la determinación gráfica de valores K_{i} a
partir de la intersección negativa de la línea con el
eje-l. La figura 8 muestra la gráfica doble
recíproca y la gráfica de la pendiente para
N^{1},N^{12}-bisretinoilespermina. Se
construyeron gráficas similares para todos los conjugados. El valor
K_{i} es una medida muy buena para determinar la potencia precisa
de los conjugados poliamina-retinoide. Los valores
K_{i} del efecto de los conjugados
poliamina-retinoide más potentes en la actividad de
RNasa P de D. discoideum se presentan en la Tabla 1, a
continuación, en comparación con los retinoides y arotinoides
sintéticos y naturales. Se obtuvieron valores K_{i} similares con
RNasa P de queranocitos epidérmicos humanos normales.
Actividad
anti-inflamatoria. Se realizaron experimentos
preliminares para determinar las condiciones óptimas para detectar
intracelularmente IL-2 e
IFN-\gamma (los datos no se muestran), que
principalmente implicaban la determinación de concentraciones de
brefeídina, ionomicina y PMA y la duración del periodo de incubación
y de la presencia de la brefeídina. Se determinó que la adición al
principio del periodo de incubación de 5 ng/ml de PMA en
combinación con 250 ng/ml de ionomicina, así como la adición durante
las últimas 2 h de periodo, de incubación de 4 h de 5 \mug/ml de
brefeídina, estaba acompañada de una liberación máxima de ambas
citoquinas en el espacio intracelular.
La incubación de PBMC en presencia de
PMA/ionomicina estaba acompañada en todos los experimentos por una
regulación hacia arriba significativa de la expresión de
IL-2 e IFN-\gamma en comparación
con los cultivos no estimulados. Esto se manifestó tanto en
linfocitos CD4+ como CD8+ y se manifestó tanto como una regulación
hacia arriba del porcentaje de linfocitos, así como una regulación
hacia arriba de la intensidad de fluorescencia. Además, se observó
que los linfocitos CD4+ eran los productores principales de
IL-2, mientras que los linfocitos CD8+ producían en
su mayor parte IFN-\gamma.
La adición de un conjugado
poliamina-retinoide, por ejemplo,
N^{1},N^{12}-RA_{2}-SPM, al
comienzo del cultivo, en las concentraciones 10^{-4}, 10^{-5} y
10^{-6} M, tuvo un efecto variable sobre los niveles de
IL-2 inducidos por PMA/ionomicina (véase el Ejemplo
8). La concentración más elevada del conjugado (10^{-4} M)
produjo un descenso en el porcentaje de células CD4+/IL- 2+ y
CD8+/1L-2+, así como en la intensidad de
fluorescencia, mientras que las otras dos concentraciones tenían un
efecto mínimo o ninguno. En una concentración de 10^{-4} M, el
conjugado poliamina-retinoide indujo un descenso en
la intensidad de fluorescencia de células
CD4+/IFN-\gamma+ y porcentaje de células
CD8+/IFN-\gamma+, mientras que las otras dos
concentraciones inferiores revelaron un efecto mínimo o ninguno
(Figuras 9-12).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron puntos de fusión capilares en un
aparato Büchi SMP-20 y no se corrigen. Se
registraron espectros de IR en forma de sedimentos de KBr o con
muestras oleosas puras en un espectrofotómetro
Perlkin-Elmer 16PC FT-IR. Se
obtuvieron espectros de ^{1}H RMN a 400,13 MHz, en un
espectrómetro Bruker Avance 400 DPX. Se obtuvieron espectros de
masas con ionización por electronebulización (ESI) en un
espectómetro Micromass-Platforn LC para soluciones
de los compuestos medidos en MeOH. Se realizaron microanálisis en un
Analizador Elemental Cario Erba EA 1108. Todos los compuestos
nuevos proporcionaron datos microanalíticos satisfactorios dentro
de \pm 0,3 de los valores calculados. Se realizó una cromatografía
en columna ultrarrápida (FCC) sobre gel de sílice Merck 60 (malla
230-400) y Cromatografía en capa fina (TLC) sobre
películas F_{254} de gel de sílice Merck (0,2 mm) precubiertas de
hoja de aluminio. El disolvente o sistemas de disolvente usados
fueron: (A) PhMe/EtOAc (95:5), (B) PhMe/EtOAc (9:1), (C) PhMe/EtOAc
(7:3), (D) PhMe/EtOAc (1:1), (E) CH_{2}Cl_{2}/MeOH (9:1), (F)
CHCl_{3}/MeOH (9:1), (G) CHCl_{3}/MeOH/conc. NH_{3}
(7:3:0.3), (I) CHCl_{3}/MeOH/conc. NH_{3} (6:4:0.4), (J)
CHCl_{3}/MeOH/conc. NH_{3} (5:5:0.5). Se visualizaron manchas
con luz UV a 254 nm y ninhidrina. Todos los disolventes usados se
secaron de acuerdo con procedimientos convencionales antes de usar.
Los experimentos que implican retinoides se dirigieron
rutinariamente bajo una atmósfera de Ar y con protección de luz. Se
efectuó el secado de soluciones con Na_{2}SO_{4} anhidro,
mientras que la evaporación de los disolventes se llevó a cabo a
presión, reducida en un evaporador rotatorio a una temperatura de
baño que no superaba los 40ºC.
Los siguientes ejemplos se proporcionan de tal
forma que ilustran la práctica de La presente invención. No
pretenden limitar o definir el alcance entero de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución enfriada en hielo de ácido
all-trans-retinoico (5) (3,00 g, 10 mmol) en
THF o DMF seco (30 ml) se añadió secuencialmente HOSu (1,72 g, 15
mmol) y DCC (2,48 g, 12 mmol) y la mezcla resultante se agitó
durante 30 minutos adicionales a 0ºC y durante toda la noche a
temperatura ambiente. El DCU precipitado se filtró y se lavó varias
veces con EtOAc. Los filtrados combinados se lavaron secuencialmente
con una solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% enfriada con hielo,
H_{2}O y dos veces con salmuera. El secado, seguido de la
filtración y evaporación del disolvente, dejó un residuo. La FCC
del residuo usando como eluyente el sistema A del disolvente,
combinando las fracciones que contienen el producto puro,
evaporación y trituración con Et_{2}O proporcionó 3,38 g (85%) de
éster cristalino amarillo 21a seguido de refrigeración durante toda
la noche. R_{f}(A): 0,24, P. f.:
173ºC-76ºC, FT-IR (cm^{-1}) :
1758, 1732, 1626, 1595, 1574, 1558, ^{1}H-RMN 400
MHz (CDCl_{3}) : \delta 7,152 (1H, dd, J 11,6 y 15,2 Hz,
H-6), 6,352 (2H, d, J 15,2 Hz, H-5 y
H-11), 6,176 (1H, d, J 16,0 Hz,
H-10), 6,166 (1H, d, J 10,3 Hz,
H-7), 5,954 (1H, s, H-2), 2,852 (4H,
a, S, H-2' y H-3'), 2,382 (3H, s,
H-4), 2,030 (3H, s, H-9), 2,030 (2H,
m, H-14), 1,722 (3H, s, H-20), 1,613
(2H, m, H-15), 1,472 (2H, m, H-16),
1,035 (6H, s, H-18 y H-19) ppm.
Análisis elemental basado en C_{24}H_{31}NO_{4}((Calculado)
Encontrado): C, (72,52) 72,69; H, (7,86) 7,72; N, (3,52) 3,28.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución enfriada en hielo de espermina
(1) (0,55 g, 2,7 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (25 ml) se añadió
éster 21a (1,99 g, 5 mmol). La solución resultante se agitó durante
una hora adicional a 0ºC y después se colocó en el refrigerador
durante toda la noche. El producto precipitado se filtró, se lavó en
el filtro con CH_{2}Cl_{2} enfriado en hielo y se secó a
presión reducida para proporcionar 2,02 g (80%) de la sal de
bishidroxisuccinimidato de 3DIa en forma de un sólido amarillo.
R_{f}(I) : 0,40 (base libre) y 0,13
(HOSu), P.f.,: 149ºC-52ºC, FT-IR
(cm^{-1}) : 3430, 3317, 1674, 1647, ESI-MS (m/z):
768,74 (MH), 767,75 (M), 485,56 (R^{1} CO-SPM+H),
580,02 (MH-C_{14} H_{20}), 384,72 (MH_{2}/2),
^{1}H-RMN 400 MHz (d_{6}-DMSO):
\delta 8,040 (2H, t no resuelto, NHCO), 6,912 (2H, dd, J 12,1 y
14,2 Hz, H-6), 6,33-6,15 (8H, m,
H-5, H-7, H-10,
H-11), 5,840 (2H, s, H-2), 5,780
(4H, s, H_{2}N^{+}), 3,150 (4H, c no resuelto,
H-1'), 2,529 (16H, m, H-3',
H-4', H-2'', H-3''),
2,290 (6H, s, H-4), 2,024 (4H, t no resuelto,
H-14), 1,976 (6H, s, H-9), 1,704
(6H, s, H-20), 1,598 (8H, m, H-15,
H-2'), 1,474 (8H, m, H-16,
H-5'), 1,032 (12H, s, H-18,
H-19) ppm.
Análisis elemental basado en
C_{58}H_{88}N_{6}O_{8} ((Calculado) Encontrado): C, (69,85)
69,56; H, (8,89) 8,97; N, (8,43) 8,62.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se usó CHCl_{3} en forma del disolvente
de la reacción, se observó una solución completa de reactivos y
productos. La reacción resultó completa (por TLC) en 30 minutos a
0ºC y después se procesó diluyendo la solución resultante con
EtOAc, lavando secuencialmente dos veces con una solución acuosa de
NaHCO_{3} al 5% y dos veces con agua. Después se secó la fase
orgánica y se evaporó para dejar un producto bruto, que se purificó
por FCC usando el sistema I del disolvente en forma de eluyente para
proporcionar 3Dla libre puro, en forma de un polvo amarillo, en
rendimiento al 75%.
Alternativamente y con el fin de facilitar el
procesamiento y purificación por procedimientos de FCC, después de
la diacilación de espermina, tiene lugar la protección in
situ de las funciones amino secundarias libres restantes con el
grupo trifluoroacetilo (Tfa), por medio del tratamiento de la mezcla
de la reacción con anhídrido trifluoroacético (Tfa_{2}O) en
presencia de Et_{3}N durante 5 minutos a 0ºC kat durante 30
minutos a temperatura ambiente. Después, el producto completamente
protegido se somete inicialmente a purificación con FCC y finalmente
a la eliminación de los grupos protectores temporales por medio del
tratamiento con k_{2}CO_{3} a MeOH/H_{2}O mantenido a reflujo
(6:0,5) durante 30 minutos, proporcionando el producto libre 3Dla en
rendimiento total al 68%.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución enfriada en hielo de
N^{1},N^{12}-Trt_{2}-SPM (22a;
n=1) (2 g, 3 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (30 ml) se añadió
secuencialmente ^{i}Pr_{2}NEt (1,4 ml, 8 mmol) y
Fmoc-OSu (2,2 g, 8 mmol). Después de 30 minutos a
temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se diluyó con
CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y se lavó secuencialmente dos veces con
una solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% y dos veces con agua. El
secado y evaporación del disolvente dejaron un residuo que se
sometió a FCC usando en forma de eluyente el disolvente del sistema
B para proporcionar 3,26 g de producto puro
N^{4},N^{9}-Fmoc_{2}-N^{1},N^{12}-Trt_{2}-SPM
en forma de una espuma. Después se trató con una solución (20 ml)
de ácido trifluoroacético (TFA) en CH_{2}Cl_{2} (1:4) durante
30 minutos a 0ºC. La evaporación del disolvente dejó un residuo que
se trituró en Et_{2}O/hexano (1:1) y se refrigeró durante toda la
noche. El líquido sobrenadante se vertió y el residuo se sometió a
FCC usando en forma de eluyente el sistema E del disolvente para
proporcionar 1,8 g (rendimiento al 69% basado en 22a) de la sal de
bistrifluoroacetato de
N^{4},N^{9}-Fmoc_{2}-SPM (23a)
en forma de una espuma.
A una solución enfriada en hielo de 23a (0,88 g,
1 mmol) en DMF/CHCl_{3}(1:1) 2 ml se añadió secuencialmente
^{i}Pr_{2}NEt (0,7 ml, 4 mmol) y éster "activo" 21a (0,79
g, 2 mmol). Después de 1 hora a temperatura ambiente, la mezcla de
la reacción se diluyó con EtOAc 50 ml y se lavó una vez con una
solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% y dos veces con agua. El
secado, evaporación y FCC con el eluyente D proporcionó el
intermedio 24a. Esto se trató después con una solución (10 ml) de
piperidina (Pip) en CH_{2}Cl_{2} (1:4) durante 15 minutos a
temperatura ambiente. La evaporación del disolvente, trituración del
residuo con Et_{2}O, refrigeración y finalmente filtración
proporcionó 0,57 g (74%) de 3DIa.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución enfriada en hielo de 23a (0,88 g,
1 mmol) en DMF/CHCl_{3} (1:1) 2 ml se añadió ^{i}Pr_{2}NEt
(0,4 ml, 2,3 mmol) y después éster "activo" 21a (0,32 g, 0,8
mmol) en porciones pequeñas en una hora. Después de 30 minutos
adicionales a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se
diluyó con EtOAc 50 ml y se lavó una vez con una solución acuosa de
NaHCO_{3} al 5% y dos veces con agua. El secado, evaporación y FCC
del residuo con el eluyente F proporcionó el intermedio 25a R_{f}
(F) 0,15. Esto se trató después con una solución (10 ml) de Pip en
CH_{2}Ch (1:4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La
evaporación del disolvente a presión reducida, trituración del
residuo con Et_{2}O y refrigeración proporcionó un precipitado.
Finalmente la filtración y evaporación del filtrado proporcionaron
0,1 g (47%) de 3DIIa en forma de una espuma amarillenta.
ESI-MS (m/z): 485,86 (MH).
Debería apreciarse que en la reacción
anteriormente indicada del compuesto 23a con éster 21a, también se
formaron cantidades considerables de la espermina diacilada
correspondiente, pero este subproducto se separa fácilmente del
derivado de espermina monoacilada 25a, durante la FCC anteriormente
mencionada. La sal de trisclorhidrato de 3DEIa también se obtuvo,
en forma de un polvo amarillento, por medio de la trituración de una
solución de la base libre en MeOH con una solución enfriada en
hielo de solución de HCL gaseoso 1,2 N en MeOH anhidro, seguido de
la precipitación inmediata de la sal así formada con Et_{2}O.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución enfriarla, en hielo de la sal de
bistrifluoroacetato de
N^{1},N^{12}-bistrifluoroacetilespermina (0,32
g, 0,5 mmol) en CH_{2}Cl_{3} (1 ml) anhidro se añadió
^{i}Pr_{2}NEt (0,7 ml, 4 mmol) y una mezcla constituida por
ácido all-trans-retínoico (0,3 g, 1
mmol) y PyBrOP (0,6 g, 1,28 mmol) en pequeñas porciones durante un
periodo de 1 hora. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la
mezcla de la reacción se diluyó con CHCl_{3} y se lavó
secuencialmente con una solución acuosa de NaHCO_{3} al 5%
enfriada en hielo (dos veces) y agua (dos veces). El secado y
evaporación dejó un residuo a partir del cual se obtuvo un
intermedio puro 28a (R=R^{1}) a través de FCC usando el sistema D
del disolvente en forma de eluyente. El intermedio 28a se disolvió
en MeOH 4 ml y se trató con 0,4 ml de una solución acuosa de 4,75 N
NaOH durante 2 horas a temperatura ambiente. Después se eliminó el
MeOH a presión reducida y el residuo se completó en 20 ml de agua y
se extrajo dos veces con CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas
combinadas se lavaron dos veces con salmuera, se secaron y se
evaporaron para dejar 0,16 g (40%) de 3DIIIa puro en forma de un
polvo amarillo. R_{f} (J): 0,26. FT-IR
(cm^{-1}): 3434, 1620. ESI-MS (m/z): 790,30 (Ana),
768,31 (MH). Análisis elemental basado en
C_{58}H_{88}N_{6}O_{8} ((Calculado) Encontrado): C (69,85)
70,08; H (8,89) 8,60; N (8,43) 8.21.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de espermidina (2) (0,73 g, 5
mmol) y trifluoroacetato de etilo (2 ml, 17,5 mmol) en acetonitrilo
(15 ml) que contiene 0,11 ml (6 mmol) de H_{2}O se mantuvo a
reflujo durante toda la noche y después el disolvente se evaporó
para proporcionar 2,1 g (rendimiento al 92%) de la sal de
monotrifluoroacetato de
N^{1},N^{8}-bistrifluoroacetilespermidina en
forma de una espuma, que se usó como tal en la siguiente etapa. Así
pues, a una solución enfriada en hielo de esta sal (0,50 g, 1,1
mmol) en DMF anhidro (1,4 ml) y CHCl_{3} (1 ml) se añadió
^{i}Pr_{2}NEt (0,7 ml, 4 mmol) seguido de acitretinoina (0,34
g, 1,06 mmol) y PyBrOP (0,82 g, 1,76 mmol). La mezcla de la reacción
se agitó a 0ºC durante 30 minutos y a temperatura ambiente durante
toda la noche. Después se diluyó con EtOAc y se lavó una vez con
solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% enfriada en hielo y dos veces
con H_{2}O frío, se secó y se evaporó para proporcionar un
residuo. A partir de este residuo, se obtuvo 0,60 g (86%) de 3DVIb
completamente protegido en forma de un aceite amarillo después de
purificación por FCC usando en forma de eluyente el sistema D del
disolvente. Rf(D) 0,26. El producto tenía
ESI-MS (m/z): 668,23 (MNa), 645,92 (MH). El 3DVIb
completamente protegido (0,60 g, 1 mmol) se disolvió en MeOH (60 ml)
y se añadió H_{2}O (6 ml) y K_{2}CO_{3} (0,52 g, 4 mmol) y la
mezcla resultante se llevó a reflujo durante 90 minutos. El
filtrado se calentó y se concentró hasta que se secó. El residuo se
sometió a FCC,. usando el sistema G del disolvente en forma de
eluyente, y las fracciones con R_{f}(G) 0,12 se combinaron
y se evaporaron para proporcionar el producto puro 3DVIb (0,38 g,
83%) en forma de una espuma amarillenta. El producto tenía
ESI-MS: 454,33 (MH).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución enfriada en hielo de
N^{8}-Trt-SPD (30) (0,5 g, 1,3
mmol) se añadió ^{i}Pr_{2}NEt (0,5 ml, 2,6 mmol) y
Fmoc-OSu (0,5 g, 2,6 mmol). Después de 30 min a 0ºC,
la mezcla de la reacción se diluyó con EtOAc y se lavó una vez con
una solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% enfriada en hielo, después
H_{2}O y finalmente salmuera y se secó. La filtración,
evaporación y FCC del residuo usando el sistema B del disolvente en
forma de eluyente, proporcionó el producto puro que se trató
inmediatamente con 10 ml de una solución de TFA en CH_{2}Cl_{2}
(3:7) durante 30 minutos a 0ºC. La evaporación del disolvente,
trituración del residuo con Et_{2}O y rechazo del líquido
sobrenadante proporcionó 0,41 g (rendimiento al 45%) de la sal de
trifluoroacetato de
N^{1},N^{4}-Fmoc_{2}-SPD.
R_{f}(E) 0,21. ESI-MS (m/z): 704,64
(MH).
A una solución enfriada en hielo de esta sal
(0,34 g, 0,48 mmol) en DMF (2 ml) se añadió ^{i}Pr_{2}NEt (0,2
ml, 1,2 mmol) y el éster "activo" 21b (0,2 g, 0,48 mmol).
Después de 1 hora a 0ºC y 1 hora a temperatura ambiente, la mezcla
de la reacción se diluyó con EtOAc y se lavó dos veces con una
solución acuosa de NaHCO_{3}al 5% enfriada en hielo y dos veces
con H_{2}O, se secó y se evaporó hasta que se secó. El residuo se
sometió a FCC, usando en forma de eluyente en sistema C del
disolvente para proporcionar 0,31 g (rendimiento al 72%) del 3DVIIb
completamente protegido en forma de una espuma amarillenta.
R_{f}(B) 0,27. ESI-MS (m/z) : 899,08 (MH).
Este intermedio (0,3 g, 0,33 mmol) se trató posteriormente con una
solución al 20% de Pip en CH_{2}Cl_{2} durante 2 horas a
temperatura ambiente. Después se evaporó el disolvente y el residuo
se trituró con Et_{2}O. Las aguas madres del sobrenadante se
descartaron y este procedimiento se repitió. Finalmente, el secado
del residuo dejó 0,14 g (93%) de producto puro 3DVIlb en forma de
una espuma amarilla. ESI-MS (m/z): 455,02 (MH).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos de RNasa P se llevaron a cabo a 37ºC
en 20 \mul de tampón D (Tris/HCl 50 mM, pH 7,6, NH_{4}Cl 10 mM,
MgCl_{2}5 mM y ditiotreitol 5 mM) en caso de que se usara RNasa P
aislada de D. discoideum (Stathopoulos y col.; EUR. J.
BIOCHEM. 228, 976 (1995)) o tampón K (Tris/HCl 50 mM, pH 7,5,
NH_{4}Cl 100 mM, MgCl_{2}5 mM y ditiotreitol 5 mM) en caso de
que se usara RNasa P aislada de queratinocitos epidérmicos humanos
(Drainas y col, datos no publicados), conteniendo
2-5 fmol de sustrato
pre-ARNt^{ser} (una transcripción marcada in
vitro del gen Schizosaccharoinyces pombe supSI de ARNt^{ser})
y proteína de 1,3 \mug de la fracción de RNasa P. Las soluciones
madre de retinoides (naturales o sintéticas) se prepararon en
dimetilosulfóxido (DMSO) al 100%. Cuando se usan retinoides, los
ensayos enzimáticos se llevan a cabo en presencia de DMSO al 10%.
Se detuvieron las reacciones por medio de la adición de 5 \mul de
tinte de detención (formamida al 80%, EDTA 50 mM, azul de
bromofenol al 0,1%, xileno cianol al 0,1%). Los productos de la
reacción se resolvieron en un gel desnaturalizante de
poliacrilamida al 10%/urea 8 M y se visualizaron por
autorradiografía sin secado. La actividad se cuantificó por
recuento de Cerenkov de láminas de gel escindidas.
\vskip1.000000\baselineskip
A efectos del estudio, se incubaron células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) de diez voluntarios sanos
(edad 33-52 años) en volumen de 1 ml (RPMI 1640/FCS
al 10%) durante periodos de tiempo variantes a 37ºC en una
incubadora de CO_{2} (5%) en presencia o ausencia de PMA (Sigma,
St Louis, Mo.), ionomicina (Sigma, St Louis, Mo.) y/o el conjugado
poliamina-retinoide (10^{-4}, 10^{-5},
10^{-6} M) así como un inhibidor de la proteína de transporte,
brefeídina (Sigma, St Louis, Mo.) para evitar la secreción de
citoquinas en el espacio extracelular.
Después de esta incubación, las PBMC se tiñeron
con un anticuerpo monoclonar
anti-CD4-FITC o
anti-CD8-FITC (Beckton Dikinson
Helias, Atenas, Grecia) en un tampón PBS que contenía BSA al 0,5% y
NaN_{3}al 0,01%, y posteriormente se fijaron con paraformaldehído
y se incubaron durante toda la noche. En la siguiente etapa, las
PBMC fijadas se lavaron y se volvieron a suspender en tampón PBS que
contenía BSA al 0,5%, saponina al 0,5% (Sigma, St Louis, Mo.) (para
permeabilizar células) y NaN_{3} al 0,01%. Las PBMC fijadas se
tiñeron posteriormente con un anticuerpo monoclonal
anti-IL-2/PE o
anti-IFN-\gamma/PE (Diaclone,
Besancon, Francia) y se analizaron para detectar la expresión
intracelular de IL-2 o IFN-\gamma
y la expresión de la membrana de los antígenos CD4 o CD8 en un
citómetro de flujo FACSCAN. A través de esta etapa, se usó PBS
provisto de saponina, ya que su efecto de permeabilización es
reversible.
El corte de inmunofluorescencia se estableció en
cultivos no estimulados como fondo y los resultados se expresaron
como el porcentaje de células CD4/IL-2+ y
CD8/1L-2-+ (Figura 9) y
CD8/IFN-\gamma^{+} y
CD4/IFN-\gamma^{+} (Figura 11), o
alternativamente como su intensidad media de fluorescencia (Figuras
10 y 12, respectivamente).
Claims (7)
1. Conjugados de poliaminas con retinoides
ácidos en los que dichos conjugados son amidas de poliaminas en las
que el grupo R del grupo acilo RCO es uno de los residuos de
retinoide R^{1}-R^{6} indicados en los
siguientes retinoides ácidos y análogos del ácido
all-trans-retinoico de cadena corta
del polieno farmacéuticamente importantes:
y dichas poliaminas
son:
a) tri-, tetra- y hexa-aminas
lineales, cuyos conjugados tienen las fórmulas generales
siguientes:
en la que n es 1 a
9
b) poliaminas conformacionalmente restringidas,
cuyos conjugados tienen la fórmula general siguiente:
c) poliaminas cíclicas, cuyos
conjugados tienen las fórmulas generales
siguientes:
d) poliaminas ramificadas
(diméricas), cuyos conjugados tienen la fórmula general
siguiente:
en la
que
R' es COR ó (CH_{2})_{3}NHCOR y R''
es COR ó (CH_{2})_{3}NHCOR
y n es uno de los números 1, 2 y 7.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un procedimiento para la preparación de un
compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que implica las dos
siguientes etapas:
a) síntesis de compuestos con la fórmula
general
en la que R es uno de los residuos
de retinoide R^{1}-R^{6} de la reivindicación 1,
que implica la esterificación de retinoides ácidos con HOSu en
presencia del agente de acoplamiento DCC y la purificación con
cromatografía ultrarrápida en
columna
b) acilación selectiva directa de los grupos
amino primarios de poliaminas con los compuestos obtenidos como
anteriormente, o la acilación de los grupos amino secundarios de
poliaminas, protegidos en sus funciones amino primarias con el grupo
trifluoroacetilo o el 9-fluorenilmetoxicarbonilo,
con los retinoides ácidos de la reivindicación 1 en presencia del
agente de acoplamiento PyBrOP, seguido de desprotección.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, cuyo procedimiento implica la acilación selectiva
directa de las funciones amino primarías de poliaminas o sus
correspondientes sales de clorhidrato o trifluoroacetato con los
compuestos de la etapa a) de la reivindicación 2, en el que el
disolvente se selecciona entre diclorometano, cloroformo y
dimetilformamida y la base, en caso necesario, se selecciona entre
trietilamina y diisopropiletilamina o cualquier otra amina terciaria
o en general cualquier otra base no nucleófica.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 caracterizado porque la acilación selectiva
de las funciones amino primarias de poliaminas se efectúa con
cualquier otro derivado del ácido carboxílico activado conocido para
acilar selectivamente funciones amino primarias en presencia de las
secundarias.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2 caracterizado porque la mono- o
bis-acilación selectiva de las funciones amino
primarias de poliaminas tiene lugar indirectamente e implica las
siguientes etapas:
(i) protección de las funciones amino
secundarias de poliaminas, que soportan el grupo tritilo de
protección en sus funciones amino primarias, con él grupo
9-fluorenilmetoxicarbonilo o trifluoroacetilo
(ii) detritilación
(iii) mono- o bis-acilación con
los compuestos de la etapa a) de la reivindicación 2
(iv) desprotección y purificación completa, en
caso necesario, por cromatografía ultrarrápida en columna.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2 caracterizado porque la acilación selectiva
de las funciones amino secundarias de poliaminas implica las
siguientes etapas:
(i) trifluoroacetilación selectiva de las
funciones amino primarias de poliaminas
(ii) acilación de las funciones amino
secundarias con los retinoides ácidos de la reivindicación 1 en
presencia del agente de acoplamiento PyBroP
(iii) eliminación de los grupos
trifluoroacetilo por hidrólisis alcalina.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Preparaciones o productos farmacéuticos que
contienen los compuestos reivindicados en la reivindicación 1 para
aplicaciones terapéuticas en humanos.
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