ES2336180B2 - Procedimiento para producir plantas de tomate con caracteristicas de larga vida. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para producir plantas de tomate con características de larga vida.
La presente invención se refiere al uso de un SNP en el gen nor del tomate como marcador para identificar plantas de tomate, para producir plantas de tomate, y para producir semillas que se regeneran en plantas de tomate con características de larga vida. También se refiere a un procedimiento para identificar dichas plantas de tomate, así como a un procedimiento para producirlas que comprende proporcionar una planta de Solanum lycopersicum que contiene alelos que están caracterizados por dicha mutación en el gen nor, cruzar dicha planta con material de cultivo de S. lycopersicum, recolectar las semillas resultantes de dicho cruce, regenerar las semillas en plantas, e identificar y seleccionar las plantas que contienen la mencionada característica de larga vida empleando para ello dicho SNP. Finalmente también se refiere a un procedimiento para producir semillas que se regeneran en plantas de tomate que presentan características de larga vida.

Description

Procedimiento para producir plantas de tomate con características de larga vida.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir plantas de tomate que presenta características de larga vida.
Estado de la técnica anterior
El tomate (Solanum lycopersicum L. o Lycopersicon esculentum) es una planta de la familia de las solanáceas (Solanaceae) originaria de América y cultivada en todo el mundo por su fruto comestible.
Dicho fruto es una baya muy coloreada, típicamente de tonos que van del amarillento al rojo, debido a la presencia de los pigmentos licopeno y caroteno. Posee un sabor ligeramente ácido, mide de 1 a 2 cm de diámetro en las especies silvestres, y es mucho más grande en las variedades cultivadas. Se produce y consume en todo el mundo tanto fresco como procesado de diferentes modos, ya sea como salsa, puré, jugo, deshidratado o enlatado.
El tomate es un alimento con una baja cantidad de calorías. De hecho, 100 gramos de tomate aportan solamente 18 kcal. La mayor parte de su peso es agua y el segundo constituyente en importancia son los hidratos de carbono. Contiene azúcares simples que le confieren un ligero sabor dulce y algunos ácidos orgánicos que le otorgan el sabor ácido característico. El tomate es una fuente importante de ciertos minerales como el potasio y el magnesio. De su contenido en vitaminas destacan la B1, B2, B5 y la vitamina C.
En el año 2005 la producción mundial de tomate ascendió a 125 millones de toneladas, siendo China el principal productor seguido de EE.UU. y Turquía.
La maduración de frutos carnosos como el tomate representa el estadio final del desarrollo del fruto, mediante el cual el fruto alcanza un aspecto y una palatabilidad que lo hacen apetecible para aquellos organismos que se van a encargar de la diseminación de las semillas.
Entre los cambios que se producen durante el proceso de maduración se pueden destacar: las modificaciones en la textura y en la ultraestructura de la pared celular, la conversión de almidón a azúcares, un incremento de la susceptibilidad al ataque por agentes patógenos después de la cosecha, alteraciones en la biosíntesis y acumulación de pigmentos, y niveles elevados de aromas y componentes volátiles.
El tomate alcanza sus mejores propiedades organolépticas cuando puede madurar en la planta con una buena insolación y una temperatura alta. No obstante, cuando el tomate está maduro, su consistencia se reduce. Esto se traduce generalmente en inconvenientes para su distribución en el mercado en buenas condiciones.
Los tomates modificados genéticamente para retrasar su maduración, tienden a durar más tiempo, pero tienen poco sabor y una textura más almidonosa y menos atractiva.
Para superar estos inconvenientes, un considerable número de esfuerzos investigadores se han dirigido hacia el estudio de las bases bioquímicas del proceso de maduración del tomate, y cuyos resultados se han publicado en numerosos trabajos científicos. Una muestra de ello es la extensa lista de referencias que figura en la patente norteamericana US6762347.
Entre las anterioridades relacionadas con la maduración del tomate se pueden mencionar las siguientes:
-
En el artículo Lincoln et al., Regulation of gene expression by ethylene during Lycopersicon esculentum (tomato) fruit development, PNAS USA, 1987, 84, 2793-2797, se describe el papel que juega el etileno a nivel molecular en la maduración del tomate, ya que el tomate pertenece a un grupo de plantas que presentan una tasa de formación de etileno elevada durante su maduración, así como una actividad respiratoria elevada.
-
En el artículo J. J. Giovannoni, Curr. Op. Plant Biol., 2007, 10, 1-7, se describen las buenas perspectivas que ofrecen los tomates mutantes para la comprensión del control de la maduración.
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En el artículo Saladié et al., Proc. 5th Int. Postharvest Symp, Eds. F. Mencarelli and P. Tonutti, Acta Hort. 682, ISHS, 2005, se describe que la cutícula del fruto del tomate juega un papel importante en la firmeza del fruto y en los atributos post-cosecha, ya que experimenta una modificación estructural durante la maduración, y que podría ser un importante factor del ablandamiento del fruto.
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En el artículo Saladié et al., Plant Physiology, 2007, 144, 1012-1028, se describe la contribución del metabolismo de la piel del tomate sobre la firmeza del fruto a partir de un tomate denominado DFD (del inglés Delayed Fruit Deterioration), cuyos frutos experimentan una maduración normal, pero permanecen firmes y no presentan pérdida de integridad durante períodos de tiempo considerables una vez alcanzado el grado de madurez.
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En el artículo Gionannoni et al., Mol. Gen. Genet., 1995, 248, 195-206, se describe la caracterización de dos zonas del genoma del tomate que son responsables de una inhibición significativa del proceso de maduración: el gen inhibido de la maduración, denominado rin (del inglés ripening inhibitor) y el gen de la no-maduración denominado nor (del inglés non ripening).
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En el artículo Vicente et al., J. Sci. Food Agric., 2007, 87, 1435-1448, se describe la relación entre el metabolismo de la pared celular y el ablandamiento del fruto.
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En el artículo Mendes et al., Scientia agrícola, 2003, 60(2), 269-275, se describe que el gen alc (alcobaça) ha demostrado ser altamente eficiente para incrementar la vida de tomates comerciales.
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En la solicitud de patente PCT WO-A-01/14561 se describe la secuencia del gen nor, así como la creación de plantas transgénicas con el gen nor. Se describe también que las nuevas plantas presentarían alteraciones en las características del fruto y/o en su respuesta frente al etileno, y tendrían una o más características beneficiosas.
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A pesar de los recursos destinados a estudiar el proceso de maduración del tomate desde un punto de vista molecular, quedan todavía incógnitas por resolver.
Otra aproximación para obtener nuevas variedades vegetales son los procesos de cruce y selección que la humanidad ha llevado a cabo durante siglos para mejorar las plantas silvestres y obtener plantas con mejores características organolépticas, con mejor rendimiento y con una menor susceptibilidad a ser atacadas por agentes patógenos.
Dichos procesos de cruce y selección son generalmente largos y laboriosos y requieren una gran experiencia por parte del horticultor para seleccionar los ejemplares que presentan el fenotipo requerido, dada la variabilidad que ocurre en los procesos naturales.
Subsiste pues la necesidad de disponer de nuevos procedimientos para el desarrollo nuevas variedades de tomates que sean rápidos, menos laboriosos y menos dependientes de la experiencia del horticultor, y que en particular permitan la obtención de tomates que tengan unas características de larga vida.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es el uso de la mutación presente en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate como marcador para identificar plantas de tomate que presenta características de larga vida, para producir plantas de tomate con dichas características, y para producir semillas que se regeneran en plantas de tomate con características de larga vida.
También forma parte del objeto de la invención un procedimiento para identificar plantas de tomate que presenta unas características de larga vida.
También forma parte del objeto de la invención un procedimiento para la producción de plantas de tomate que presenta unas características de larga vida.
Forma parte también del objeto de la invención un procedimiento para la producción de semillas que tienen por resultado plantas de tomate que presenta unas características de larga vida.
Figuras
Figura 1. El gen nor presenta 3 exones. El exón 1 consta de 190 pares de bases y está localizado entre las posiciones 166 y 355 de la secuencia nucleotídica genómica (número de registro AY573803 en la base de datos GenBank del National Center Biotechnology Information. El exón 2 consta de 311 pares de bases, y se encuentra entre las posiciones 983 y 1293 de la secuencia nucleotídica genómica. El exón 3 consta de 567 pares de bases y se encuentra entre las posiciones 2163 y 2729 de la secuencia nucleotídica genómica. Al inicio de la secuencia nucleotídica del gen nor se encuentra el 5'UTR de 165 pares de bases entre las posiciones 1 y 165. Entre los exones 1 y 2 se encuentra un intrón de 627 pares de bases situado entre las posiciones 356 y 982. Entre los exones 2 y 3 se encuentra un intrón de 869 pares de bases situado entre las posiciones 1294 y 2162. Al final de la secuencia nucleotídica se encuentra el 3'UTR de 156 pares de bases situado entre las posiciones 2730 y 2885.
Figura 2. Fotografía correspondiente a las electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación por PCR de los exones 1, 2 y 3 del gen nor del tomate obtenidos en el Ejemplo 1. El producto de amplificación que incluye el exón 1 tiene 524 pares de bases, el del exón 2 tiene 777 pares de bases, y el del exón 3 tiene 715 pares de bases.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la invención han descubierto una mutación en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate que permite identificar plantas de tomate que presenta unas características de larga vida, así como producir plantas de tomate que presenta dichas características y producir semillas que se regeneran en plantas de tomate que presenta dichas características de larga vida.
Plantas de tomate ESL
En el contexto de la invención, las plantas de tomate que presenta características de larga vida son aquellas que producen tomates que se conservan durante un período de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración, preferiblemente durante un período de al menos 6 meses.
Además los frutos de dichas plantas pueden mantener sus características organolépticas de jugosidad y aroma durante todo el período de post-cosecha.
En esta descripción las plantas que producen tomates que presentan características de larga vida se denominan plantas ESL, del inglés Extended Shelf Life.
Uso de la mutación como marcador
El objeto de la presente invención es el uso de la mutación presente en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate (SEQ_ID_NO:1) como marcador para identificar plantas de tomate que se conserva durante un período de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración, para producir plantas de tomate con dichas características, y para producir semillas que se regeneran en plantas de tomate con características de larga vida.
En el curso de trabajos de investigación para desarrollar plantas de tomate con características de larga vida, los autores de la invención han identificado un tipo de tomate autóctono con muchas variedades que presenta dichas características de larga vida.
Los trabajos de aislamiento del ADN genómico y secuenciación del gen nor de diferentes variedades de tomate permitieron determinar que los tomates del tipo ESL presentaban una mutación en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate. Los tomates del tipo ESL contenían una base adenina (A) en dicha posición, mientras que otras variedades del tomate del tipo Cherry, del tipo Pintón, o plantas de tomate que incorporan el gen rin, contenían una base timina (T).
Dicha mutación responde a un polimorfismo de un único nucleótido, que se conoce habitualmente como SNP (del inglés Single Nucleotide Polymorphism).
Un SNP es una variación en la secuencia de ADN que ocurre cuando un único nucleótido (A, T, C, o G) en el genoma difiere entre miembros de una misma especie.
Se ha observado que para que se manifieste el fenotipo ESL, los dos alelos de la planta diploide deben contener en la posición 1109 del gen nor una base adenina (A).
El ADN genómico del gen nor del tomate (SEQ_ID_NO: 1) está registrado en la base de datos GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information) con el número de registro AY573803 y contiene 2885 pares de bases. El mRNA del gen nor del tomate (SEQ_ID_NO: 2) está registrado en dicha base de datos del GenBank con el número de registro AY573802 y contiene 1423 pares de bases.
La comparación de las dos secuencias permite concluir que el gen nor presenta tres exones tal como se muestra en la Figura 1. El exón 1 consta de 190 pares de bases y está localizado entre las posiciones 166 y 355 de la secuencia nucleotídica. El exón 2 consta de 311 pares de bases, y se encuentra entre las posiciones 983 y 1293 de la secuencia nucleotídica. El exón 3 consta de 567 pares de bases y se encuentra entre las posiciones 2163 y 2729 de la secuencia nucleotídica. Al inicio de la secuencia nucleotídica del gen nor se encuentra el 5'UTR de 165 pares de bases entre las posiciones 1 y 165. Entre los exones 1 y 2 se encuentra un intrón de 627 pares de bases situado entre las posiciones 356 y 982. Entre los exones 2 y 3 se encuentra un intrón de 869 pares de bases situado entre las posiciones 1294 y 2162. Al final de la secuencia nucleotídica se encuentra el 3'UTR de 156 pares de bases situado entre las posiciones 2730 y 2885.
La secuenciación del gen nor se ha llevado a cabo siguiendo procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo usando el BigDye Terminator® Kit de la compañía Applied Biosystems.
Dicho procedimiento incluye las siguientes etapas: extracción del ADN genómico de plantas de tomate de diferentes variedades, amplificación del amplicón correspondiente al gen nor, y secuenciación del mismo.
La extracción del ADN genómico se puede efectuar por ejemplo de acuerdo con el procedimiento descrito en el artículo de Doyle et al., Focus, 1990, 12, 13-15.
La amplificación del ADN genómico se puede llevar a cabo mediante el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa, que es conocida habitualmente como PCR.
Para amplificar el gen nor presente en el ADN genómico extraído los autores de la invención diseñaron cebadores específicos para amplificar las secuencias nucleotídicas correspondientes a los exones 1, 2 y 3.
En el Ejemplo 1 de esta descripción se incluyen las secuencias nucleotídicas de los cebadores que se emplearon para dicha amplificación.
En el caso del exón 2, y debido a la longitud del mismo, se emplearon dos cebadores externos y dos cebadores internos en dos amplificaciones consecutivas para conseguir la amplificación apropiada de la zona deseada.
La secuenciación del ADN genómico amplificado se puede efectuar por ejemplo empleando el kit BigDye Termi-
nator® v 1.1 de la compañía Applied Biosystems.
Las secuencias amplificadas de los exones 1, 2 y 3 de diferentes variedades de tomate se alinearon para identificar eventuales polimorfismos. Se comprobó que en los exones 1 y 3 no existía polimorfismo entre los tomates del tipo ESL y las otras variedades de tomate del tipo Cherry y del tipo Pintón.
Sin embargo, como ya se ha mencionado anteriormente, se comprobó que en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor, que se encuentra en la zona correspondiente al exón 2, los tomates del tipo ESL presentaban una mutación en dicha posición. Los tomates del tipo ESL contenían una base adenina (A) en dicha posición, mientras que otras variedades del tomate del tipo Cherry, del tipo Pintón, o las que incorporan el gen rin, contenían una base timina (T).
Al efectuar la traducción de la secuencia nucleotídica a proteína, se observó que dicha mutación causaba un cambio de aminoácido en la posición 106 de la proteína correspondiente. El genotipo T codifica por un aminoácido valina (no polar), y el genotipo A por un aminoácido ácido aspártico (polar).
Procedimiento para identificar plantas de tomate ESL
Otro aspecto del objeto de la presente invención es un procedimiento para identificar plantas de tomate que presenta características de larga vida caracterizado porque comprende la etapa de identificar la presencia en ambos alelos de la base adenina (A) en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate (SEQ_ID_NO: 1).
En el procedimiento de la invención, la identificación de las plantas de tomate se lleva a cabo mediante técnicas bien conocidas por el experto en la materia como por ejemplo el kit de detección SNaPshot®, PCR a tiempo real empleando sondas del tipo Taqman® de la compañía Applied Biosystems, o bien del tipo Hyprobes® de la compañía Roche®, o cualquier otra tecnología de detección de polimorfismos SNP.
En dicho procedimiento se emplean unos cebadores específicos que se describen en el Ejemplo 2 y que permiten identificar las plantas de tomate que contienen el SNP en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate.
Procedimiento para producir plantas de tomate ESL
También forma parte del objeto de la invención un procedimiento para producir plantas de tomate que presenta unas características de larga vida que comprende:
a)
proporcionar una planta Solanum lycopersicum con alelos que contienen una base adenina en la posición 1109 del gen nor del tomate (SEQ_ID_NO: 1),
b)
cruzar la planta proporcionada en la etapa a) con material de cultivo de Solanum lycopersicum, que presenta un genotipo AA o AT en la posición 1109 del gen nor del tomate,
c)
recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa b),
d)
regenerar las semillas en plantas, e
e)
identificar y seleccionar las plantas empleando el marcador de la etapa a) que contienen en ambos alelos el genotipo A.
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En una realización del procedimiento de la invención se cruzó una planta de tomate ESL (planta autóctona que presentaba características de larga vida), que contenía alelos que contenían una base adenina en la posición 1109 del gen nor del tomate, y que consecuentemente presentaba un genotipo AA, con una planta de tomate de otra variedad, por ejemplo del tipo Cherry o Pintón, que presentaba un genotipo TT en lo que se refiere a dicha posición.
De dicho cruce se obtuvieron semillas F1 que se regeneraron en una planta de tomate. Se procedió a la extracción del ADN genómico de una planta F1 y se procedió a la identificación de la base que se encontraba en la posición 1109 del gen nor de dicha planta tal como se describe en el Ejemplo 2. Se observó que dicha planta F1 era un híbrido que presentaba un genotipo AT.
En una etapa ulterior, se pueden recoger semillas F2 de las plantas obtenidas por autofecundación, y proceder a la extracción del ADN genómico de varias plantas F2 e identificar la base que se encuentra en la posición 1109 del gen nor de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.
Con el uso del SNP o marcador identificado por los autores de la presente invención se pueden producir plantas de tomate que combina las características de larga vida con otras características fenotípicas interesantes desde el punto de vista comercial, como por ejemplo el tamaño, la forma, el color, o la textura del fruto.
Así, por ejemplo, se pueden producir tomates con características de larga vida (ESL) que presentan características del tomate del tipo Cherry empleando el procedimiento de la invención. Para ello se puede cruzar una línea parental de tomate ESL que presenta el genotipo AA en la posición 1109 del gen nor, con una línea parental de tipo Cherry que presenta el genotipo TT en dicha posición. De esta forma se obtiene una F1 que presenta un genotipo AT. Al cruzar el híbrido F1 con una línea parental ESL se obtiene una F2 y se pueden seleccionar las plantas que presentan el genotipo AA empleando el marcador de la invención. Empleando el procedimiento de retrocruce o retrocruzamiento, bien conocido por el experto en la materia, y el marcador de la invención para seleccionar las plantas con genotipo AA, se pueden obtener líneas parentales con características de larga vida (ESL) y otras características interesantes comercialmente como las del tomate Cherry.
Procedimiento para producir semillas de plantas de tomate ESL
Forma parte también del objeto de la invención un procedimiento para producir semillas que tienen por resultado plantas de tomate que presenta unas características de larga vida que comprende las etapas:
a)
proporcionar una planta Solanum lycopersicum con alelos que contienen una base adenina en la posición 1109 del gen nor del tomate SEQ_ID_NO: 1,
b)
cruzar la planta proporcionada en la etapa a) con material de cultivo de Solanum lycopersicum, que presenta un genotipo AA o AT en la posición 1109 del gen nor del tomate,
c)
recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa b), e
d)
identificar y seleccionar las semillas empleando el marcador de la etapa a) que contienen en ambos alelos el genotipo A.
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Sorprendentemente, se ha encontrado que los frutos de las plantas de tomate que contienen en ambos alelos una base adenina (A) en la posición 1109 del gen nor presentan unas características de larga vida, de modo que se pueden conservar durante un período de al menos 3 meses, y generalmente de al menos 6 meses sin necesidad de refrigeración, con lo que disminuyen los costes de almacenamiento y de transporte, y asimismo el fruto mantiene sus características organolépticas de jugosidad y aroma durante todo el período de post-cosecha.
Los ejemplos que siguen a continuación se exponen a efectos de proporcionar al experto en la materia una explicación detallada de realizaciones concretas dentro de la invención.
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Ejemplo preparativo
Extracción del ADN genómico de las plantas de tomate
El procedimiento empleado para extraer el ADN genómico de las plantas de tomate coincide sustancialmente con el procedimiento descrito en Doyle et al., Focus, 1990, 12, 13-15.
Se llevó a cabo la extracción de ADN genómico de plantas de tomate del tipo ESL, del tipo Cherry, del tipo Pintón, y de plantas de tomate que incorporaban el gen rin en su genoma.
Se colocó una hoja joven en un tubo eppendorf de 1,9 ml, y se sumergió en nitrógeno líquido. A continuación se trituraron las hojas, se añadieron 500 \mul de la solución tampón de extracción Doyle calentada previamente a 65ºC, y se agitó suavemente.
La muestra se mantuvo en un baño maría a 65ºC durante 30 minutos.
Pasado este período de tiempo se añadió rápidamente una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico en una proporción 24:1 en volumen/volumen.
Se centrifugó a 11.000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se tranfirieron 200 \mul de la fase acuosa a un nuevo tubo eppendorf.
Se añadieron 350 \mul de alcohol isopropílico a 4ºC a la fase acuosa, y se mezcló suavemente hasta la formación de hilos de ADN.
Se centrifugó a 10.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se eliminó el sobrenadante con una pipeta. En la parte inferior del eppendorf se encontraba un precipitado blanquecino que era el ADN extraído.
A dicho precipitado se añadieron 200 \mul de tampón de lavado Doyle, se centrifugó a 10.000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos, y se eliminó el sobrenadante. El pellet obtenido se secó, y se resuspendió en 50 \mul de agua tipo HPLC. Se mantuvo toda la noche a 4ºC, y posteriormente se guardó a -20ºC. Dicha suspensión se empleó para efectuar la secuenciación de los exones del gen nor de cada uno de los tomates ensayados.
El tampón de extracción Doyle y el tampón de lavado de Doyle se encuentran descritos en el artículo de Doyle et al., ya mencionado.
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Ejemplo 1 Secuenciación de los exones del gen nor del tomate
La secuenciación de los exones del gen nor de diferentes tipos de tomate se llevó a cabo mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los exones de dicho gen, y a continuación se procedió a su secuenciación, previa amplificación y marcado.
Se llevó a cabo la secuenciación de ADN genómico de plantas de tomate del tipo ESL, del tipo Cherry, del tipo Pintón y de plantas de tomate que incorporaban el gen rin en su genoma.
1.- Amplificación de los exones
Para amplificar cada uno de los tres exones del gen nor del tomate se mezclaron 0,5 \mul (equivalentes a 20-100 ng) de ADN genómico obtenido en el Ejemplo preparativo, 15 \mul de agua destilada, 2,5 \mul de tampón de PCR x10 conc (AmpliTaq 10x PCR buffer II, Applied Biosystems), 2,5 \mul de solución MgCl_{2} 25 mM (AmpliTaq MgCl_{2} Solution, Applied Biosystems), 2 \mul de dNTPs 5 mM, 1 \mul de una solución del cebador F específico para cada exón 10 \muM, 1 \mul de una solución del cebador R específico para cada exón 10 \muM, y 0,5 \mul de Taq DNA Polimerasa (Applied Biosystems).
Se ejecutó el programa del termociclador AB9700 de Applied Biosystems de acuerdo con la siguiente secuencia: 1 minuto a 94ºC; 35 repeticiones del ciclo 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, 90 segundos a 72ºC, finalizando con un ciclo de 5 minutos a 72ºC.
Finalizada la amplificación se comprobó mediante electroforesis en un gel de agarosa siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la materia.
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(Tabla pasa a página siguiente)
\newpage
Los cebadores que se emplearon para la amplificación de los tres exones del gen nor del tomate se muestran en la Tabla I:
TABLA I
1 
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En el caso del exón 2, que tiene 777 pares de bases, se efectuaron dos amplificaciones: en primer lugar con los dos cebadores externos, y en segundo lugar con los cebadores internos.
En la Figura 2 se observa el resultado de la electroforesis del gel de agarosa para los exones 1, 2 y 3 del gen nor del tomate.
Antes de proceder a la amplificación y marcado de las secuencias de los exones para efectuar su secuenciación, eventualmente se puede llevar a cabo una purificación de las mismas mediante el empleo del kit High Puré PCR Product Purification Kit® de Roche Applied Science.
2.- Secuenciación de los exones
La secuenciación de los tres exones se llevó a cabo mediante el empleo del kit de secuenciación BigDye Termina-
tor® v1.1 de la compañía Applied Biosystems.
Se efectuó la secuenciación de cada uno de los ADN genómicos que se obtuvieron de diferentes tipos de tomate del Ejemplo preparativo después de ser amplificados por PCR con los cebadores descritos en la Tabla I.
\newpage
Se colocaron 4 \mul del producto de PCR de los tres exones descrito en el apartado 1 del Ejemplo 1, 2 \mul del reactivo BigDye Terminator® (Applied Biosystems), 1 \mul de una solución del cebador externo específico para cada exón 3,2 mM, y 3 \mul de agua destilada.
Se ejecutó el siguiente programa en el termociclador AB9700: 25 ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 50ºC, y 4 minutos a 60ºC.
Siguiendo las instrucciones del proveedor del kit, se precipitó con una mezcla de etanol, EDTA y acetato sódico.
El precipitado obtenido se resuspendió en tampón de inyección de la compañía Applied Biosystems, y la suspensión se cargó en el secuenciador automático ABI PRISM 3130 de la compañía Applied Biosystems, y se ejecutó el programa de secuenciación.
Los datos de secuenciación se analizaron empleando el programa informático GeneMapper® de la compañía Applied Biosystems.
Se observó que el tomate del tipo ESL contenía en la posición 1109 del gen nor, concretamente en el exón 2 de dicho gen, una timina (T), mientras que tomates del tipo Cherry, del tipo Pintón, o tomates que incorporaban el gen rin en su genoma tenían una adenina (A) en dicha posición.
Al efectuar la traducción de la secuencia nucleotídica a proteína, se observó que dicha mutación causaba un cambio de aminoácido en la posición 106 de la proteína correspondiente. El genotipo T codifica por un aminoácido valina (no polar), y el genotipo A por un aminoácido ácido aspártico (polar).
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Ejemplo 2 Identificación de tomates del tipo ESL
La identificación de tomates del tipo ESL se llevó a cabo mediante el empleo de la técnica PCR de acuerdo con el procedimiento que se describe a continuación en el que se emplean unos cebadores diseñados para poder identificar rápidamente la base que se encuentra en la posición 1109 del exón 2 del gen nor del tomate.
En primer lugar se extrajo el ADN genómico de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo preparativo.
A continuación se mezclaron 0,5 \mul de ADN genómico correspondientes a 20-100 ng, 15 \mul de agua, 2,5 \mul de tampón de PCR x10 conc (AmpliTaq 10x PCR buffer II, Applied Biosystems), 2,5 \mul de una solución de MgCl_{2} 25 mM (AmpliTaq MgCl_{2} Solution, Applied Biosystems), 2 \mul de dNTPs 5 mM, 1 \mul de una solución del cebador F (SEQ_ID_NO: 7) 10 \muM, 1 \mul de una solución del cebador R (SEQ_ID_NO: 8) 10 \muM, y 0,5 \mul (2,5 u) de Taq DNA Polimerasa (AmpliTaq®-Applied Biosystems).
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador AB9700, de acuerdo con la siguiente secuencia: 1 ciclo de un minuto a 94ºC; 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, y 30 segundos a 72ºC; para terminar con un ciclo de 5 minutos a 72ºC.
Se comprobó que la amplificación era correcta mediante electroforesis en un gel de agarosa siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la materia.
Se transfirieron 2,5 \mul del producto amplificado a un nuevo tubo y se añadió 1 \mul de ExoSAP-IT de la compañía Applied Biosystems. Se mezcló y se aplicó un golpe de centrífuga.
A continuación se incubó en un termociclador durante 15 minutos a 37ºC, y durante 15 minutos a 80ºC.
Para llevar a cabo la reacción SNaPShot se mezclaron 1,5 \mul del ADN obtenido, 1,25 \mul del reactivo Mix SNaPshot (Applied Biosystems), 0,5 \mul de una solución del cebador interno (SEQ_ID_NO: 11) 2 \muM, y 1,75 \mul de agua HPLC (Panreac).
El cebador interno utilizado en esta etapa tenía la secuencia 5'-TACCGGAACCGACAAGCCGG -3' (SEQ_ID_
NO: 11).
Se ejecutó la PCR con la siguiente programación del termociclador: 25 ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 50ºC, y 30 segundos a 60ºC, y finalmente se mantuvo a 4ºC.
Se añadieron 1 \mul de CIP (1 u/\mul) (calf intestinal phosphatase), se agitó y se aplicó un golpe de centrífuga.
Se incubó en un termociclador durante 1 hora a 37ºC, 15 minutos a 75ºC, y se mantuvo a 4ºC.
\newpage
A continuación 0,5 \mul del producto obtenido se cargó en una placa de secuenciación junto con 12 \mul de formamida HI-DI, y 0,5 \mul del reactivo LIZ 500 size standard.
Se desnaturalizó durante 5 minutos a 95ºC, se enfrió la placa con hielo y se aplicó un golpe de centrífuga.
Se cargó el secuenciador automático AB3130 (SNP, matriz E5, módulo FragmentAnalysis36_POP7_1) y se analizaron los datos con el programa informático GeneMapper® de la compañía Applied Biosystems.
En la Tabla II se presentan los resultados obtenidos al aplicar el procedimiento de la invención a diferentes líneas de tomate:
TABLA II
2
Se puede observar que los tomates tipo ESL, que tienen un genotipo AA en la posición 1109 del gen nor, presentan un período de vida superior a los 6 meses, mientras que los tomates que presentan un genotipo TT no presentan dicha característica.
Tampoco presentan las características de larga vida los híbridos AT obtenidos a partir de una línea parental ESL con un genotipo AA y una línea parental con un genotipo TT.
Las líneas híbridas 17 a 19 se han obtenido a partir de dos líneas parentales que presentan el genotipo AA.
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Ejemplo 3 Producción de tomates del tipo ESL
Se tomó una planta de tomate del tipo ESL que tenía el genotipo AA en la posición 1109 del gen nor, y se cruzó con una planta de tomate del tipo Cherry que tenía el genotipo TT en dicha posición.
Se obtuvo una primera generación F1 que se sometió al ensayo de identificación descrito en el Ejemplo 2, y se observó que presentaban un genotipo híbrido AT.
El cruce de una planta de tomate del tipo ESL con el híbrido AT conduce a la obtención de plantas, y mediante el empleo del marcador de la invención se seleccionan aquellas que producen frutos que presentan características de larga vida (ESL) con el genotipo AA en la posición 1109 del gen nor.
Mediante el empleo de la técnica de retrocruce o retrocruzamiento, bien conocida por el experto en la materia, se pueden obtener líneas parentales ESL que presentan características de otros tipos de tomate por ejemplo Cherry.
<110> Semillas Fitó, S.A.
\hskip1cm
Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA) 
\hskip1cm
Garcia Mas, Jordi 
\hskip1cm
Jahrmann, Torben 
\hskip1cm
Pujol Abajo, Marta 
\hskip1cm
Fitó Castells, Eulalia 
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para producir plantas de tomate larga vida
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> 000
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip1cm
3 
\hskip1cm
4 
\hskip1cm
5 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1423
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<212> DNA
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<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
6 
\hskip1cm
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum lycopersicum 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum lycopersicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
16

Claims (6)

1. Uso de la mutación presente en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate (SEQ_ID_
NO: 1) como marcador para identificar plantas de tomate que se conserva durante un período de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración.
2. Uso de la mutación presente en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate (SEQ_ID_
NO: 1) como marcador para producir plantas de tomate que se conserva durante un período de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración.
3. Uso de la mutación presente en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate (SEQ_ID_
NO: 1) como marcador para producir semillas que se regeneran en plantas de tomate que se conserva durante un período de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración.
4. Procedimiento para identificar plantas de tomate que presenta características de larga vida caracterizado porque comprende la etapa de identificar la presencia en ambos alelos de la base adenina (A) en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate (SEQ_ID_NO:1).
5. Procedimiento para producir plantas de tomate que presenta unas características de larga vida caracterizado porque comprende:
a)
proporcionar una planta Solanum lycopersicum con alelos que contienen una base adenina en la posición 1109 del gen nor del tomate (SEQ_ID_NO: 1),
b)
cruzar la planta proporcionada en la etapa a) con material de cultivo de Solanum lycopersicum, que presenta un genotipo AA o AT en la posición 1109 del gen nor del tomate,
c)
recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa b),
d)
regenerar las semillas en plantas, e
e)
identificar y seleccionar las plantas empleando el marcador de la etapa a) que contienen en ambos alelos el genotipo A.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento para producir semillas que tienen por resultado plantas de tomate que presenta unas características de larga vida caracterizado porque comprende las etapas:
a)
proporcionar una planta Solanum lycopersicum con alelos que contienen una base adenina en la posición 1109 del gen nor del tomate (SEQ_ID_NO: 1),
b)
cruzar la planta proporcionada en la etapa a) con material de cultivo de Solanum lycopersicum, que presenta un genotipo AA o AT en la posición 1109 del gen nor del tomate,
c)
recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa b), e
d)
identificar y seleccionar las semillas empleando el marcador de la etapa a) que contienen en ambos alelos el genotipo A.
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