ES2443292T3 - Procedimiento para producir plantas de tomate con características de durabilidad prolongada - Google Patents
Procedimiento para producir plantas de tomate con características de durabilidad prolongada Download PDFInfo
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Abstract
Uso de la mutación que consiste en la presencia de adenina, A, en lugar de timina, T, presente a. en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate SEQ ID NO: 1 o 5 b. en la posición correspondiente con respecto a la posición 1109 de SEQ ID NO: 1, de secuencias que tienen una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO: 1, como marcador para identificar plantas de tomate que tienen el genotipo AA, cuyos frutos, que presentan características de durabilidad prolongada, se conservan durante un periodo de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración.
Description
Procedimiento para producir plantas de tomate con características de durabilidad prolongada
La presente invención se refiere al uso de una mutación como marcador para identificar plantas de tomate cuyos frutos presentan características de durabilidad prolongada.
El tomate (Solanum lycopersicum L. o Lycopersicon esculentum) es una planta de la familia de las solanáceas (Solanaceae) originaria de América y cultivada en todo el mundo por su fruto comestible.
Dicho fruto es una baya muy coloreada, típicamente de tonos que van del amarillento al rojo, debido a la presencia de los pigmentos licopeno y caroteno. Posee un sabor ligeramente ácido, mide de 1 a 2 cm de diámetro en las especies silvestres, y es mucho más grande en las variedades cultivadas. Se produce y consume en todo el mundo tanto fresco como procesado de diferentes modos, ya sea como salsa, puré, jugo, deshidratado o enlatado.
El tomate es un alimento con una baja cantidad de calorías. De hecho, 100 gramos de tomate aportan solamente 18 kcal. La mayor parte de su peso es agua y el segundo constituyente en importancia son los hidratos de carbono. Contiene azúcares simples que le confieren un ligero sabor dulce y algunos ácidos orgánicos que le otorgan el sabor ácido característico. El tomate es una fuente importante de ciertos minerales como el potasio y el magnesio. De su contenido en vitaminas destacan la B1, B2, B5 y la vitamina C.
En el año 2005 la producción mundial de tomate ascendió a 125 millones de toneladas, siendo China el principal productor seguido de EE.UU. y Turquía.
La maduración de frutos carnosos como el tomate representa el estadio final del desarrollo del fruto, mediante el cual el fruto alcanza un aspecto y una palatabilidad que lo hacen apetecible para aquellos organismos que se van a encargar de la diseminación de las semillas.
Entre los cambios que se producen durante el proceso de maduración se pueden destacar: las modificaciones en la textura y en la ultraestructura de la pared celular, la conversión de almidón a azúcares, un incremento de la susceptibilidad al ataque por agentes patógenos después de la cosecha, alteraciones en la biosíntesis y acumulación de pigmentos, y niveles elevados de aromas y componentes volátiles.
El tomate alcanza sus mejores propiedades organolépticas cuando puede madurar en la planta con una buena insolación y una temperatura alta. No obstante, cuando el tomate está maduro, su consistencia se reduce. Esto se traduce generalmente en inconvenientes para su distribución en el mercado en buenas condiciones.
Los tomates modificados genéticamente para retrasar su maduración, tienden a durar más tiempo, pero tienen poco sabor y una textura más almidonosa y menos atractiva.
Para superar estos inconvenientes, un considerable número de esfuerzos investigadores se han dirigido hacia el estudio de las bases bioquímicas del proceso de maduración del tomate, y cuyos resultados se han publicado en numerosos trabajos científicos. Una muestra de ello es la extensa lista de referencias que figura en la patente norteamericana US6762347.
Entre los documentos previos en la técnica relacionados con la maduración del tomate se pueden mencionar los siguientes:
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- En el artículo de Lincoln et al., Regulation of gene expression by ethylene during Lycopersicon esculentum (tomato) fruit development, PNAS USA, 1987, 84, 2793-2797, se describe el papel que juega el etileno a nivel molecular en la maduración del tomate, ya que el tomate pertenece a un grupo de plantas que presentan una tasa de formación de etileno elevada durante su maduración, así como una actividad respiratoria elevada.
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- En el artículo de J. J. Giovannoni, Curr. Op. Plant Biol., 2007, 10, 1-7, se describen las buenas perspectivas que ofrecen los tomates portadores de mutaciones para la comprensión del control de la maduración.
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- En el artículo de Saladié et al., Proc. 5th Int. Postharvest Symp, Eds. F. Mencarelli and P. Tonutti, Acta Hort. 682, ISHS, 2005, se describe que la cutícula del fruto del tomate juega un papel importante en la firmeza del fruto y en los atributos post-cosecha, ya que experimenta una modificación estructural durante la maduración, y que podría ser un importante factor del ablandamiento del fruto.
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- En el artículo de Saladié et al., Plant Physiology, 2007, 144, 1012-1028, se describe la contribución del metabolismo de la piel del tomate sobre la firmeza del fruto a partir de un tomate denominado DFD (del inglés Delayed Fruit Deterioration), cuyos frutos experimentan una maduración normal, pero permanecen firmes y no presentan pérdida de integridad durante períodos de tiempo considerables una vez alcanzado el grado de madurez.
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- En el artículo de Giovannoni et al., Mol. Gen. Genet., 1995, 248, 195-206, se describe la caracterización de dos zonas del genoma del tomate que son responsables de una inhibición significativa del proceso de maduración: el gen inhibidor de la maduración, denominado rin (del inglés ripening inhibitor) y el gen de la no-maduración denominado nor (del inglés non ripening).
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- En el artículo de Vicente et al., J. Sci. Food Agric., 2007, 87, 1435-1448, se describe la relación entre el metabolismo de la pared celular y el ablandamiento del fruto.
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- En el artículo de Mendes et al., Scientia agricola, 2003, 60(2), 269-275, se describe que el gen alc (alcobaça) ha demostrado ser altamente eficiente para incrementar la durabilidad de tomates comerciales.
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- En la solicitud de patente PCT WO-A-01/14561 se describe la secuencia del gen nor, así como la creación de plantas transgénicas con el gen nor. Se describe también como las nuevas plantas presentarían alteraciones en las características del fruto y/o en su respuesta frente al etileno, y tendrían una o más características beneficiosas.
A pesar de los recursos destinados a estudiar el proceso de maduración del tomate desde un punto de vista molecular, quedan todavía incógnitas por resolver.
Otra aproximación para obtener nuevas variedades vegetales son los procesos de cruce y selección que la humanidad ha llevado a cabo durante siglos para mejorar las plantas silvestres y obtener plantas con mejores características organolépticas, con mejor rendimiento y con una menor susceptibilidad a ser atacadas por agentes patógenos.
Dichos procesos de cruce y selección son generalmente largos y laboriosos y requieren una gran experiencia por parte del horticultor para seleccionar los ejemplares que presentan el fenotipo requerido, dada la variabilidad que ocurre en los procesos naturales.
Subsiste pues la necesidad de disponer de nuevos procedimientos para el desarrollo de nuevas variedades de tomate que sean rápidos, menos laboriosos y menos dependientes de la experiencia del horticultor y que en particular permitan la obtención de tomates que tengan unas características de durabilidad prolongada.
El objeto de la presente invención es el uso de la mutación presente en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate como marcador para identificar plantas de tomate cuyos frutos presentan características de durabilidad prolongada, para producir plantas de tomate con dichas características, y para producir semillas que se regeneran en plantas de tomate con características de durabilidad prolongada.
También forma parte del objeto de la invención un procedimiento para identificar plantas de tomate cuyos frutos presentan características de durabilidad prolongada.
En la presente invención se describe un procedimiento para la producción de plantas de tomate cuyos frutos presentan unas características de durabilidad prolongada.
También se describe en la invención un procedimiento para la producción de semillas que tienen por resultado plantas de tomate cuyos frutos presentan unas características de durabilidad prolongada.
Figura 1. El gen nor presenta 3 exones. El exón 1 consiste en 190 pares de bases y está localizado entre las posiciones 166 y 355 de la secuencia nucleotídica genómica (número de registro AY573803 en la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology Information). El exón 2 consiste en 311 pares de bases, y se encuentra localizado entre las posiciones 983 y 1293 de la secuencia nucleotídica genómica. El exón 3 consiste en 567 pares de bases y se encuentra entre las posiciones 2163 y 2729 de la secuencia nucleotídica genómica. Al inicio de la secuencia nucleotídica del gen nor se encuentra la 5’UTR de 165 pares de bases entre las posiciones 1 y
165. Entre los exones 1 y 2 se encuentra un intrón de 627 pares de bases situado entre las posiciones 356 y 982. Entre los exones 2 y 3 se encuentra un intrón de 869 pares de bases situado entre las posiciones 1294 y 2162. Al final de la secuencia nucleotídica se encuentra la 3’UTR de 156 pares de bases situada entre las posiciones 2730 y 2885.
Figura 2. Fotografía correspondiente a las electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación por PCR de los exones 1, 2 y 3 del gen nor del tomate obtenidos en el Ejemplo 1. El producto de amplificación que incluye el exón 1 tiene 524 pares de bases, el del exón 2 tiene 777 pares de bases y el del exón 3 tiene 715 pares de bases.
Los autores de la invención han descubierto una mutación en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate que permite identificar plantas de tomate con frutos que presentan unas características de durabilidad prolongada, así como producir plantas de tomate con frutos que presentan dichas características y producir semillas que se regeneran en plantas de tomate cuyos frutos presentan dichas características de durabilidad prolongada.
Plantas de tomate ESL
En el contexto de la invención, las plantas de tomate cuyos frutos presentan características de durabilidad prolongada son aquellas cuyos frutos se conservan durante un período de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración, preferiblemente durante un período de al menos 6 meses.
Además los frutos de dichas plantas pueden mantener sus características organolépticas de jugosidad y aroma durante todo el período de post-cosecha.
En esta descripción las plantas de tomate cuyos frutos presentan características de durabilidad prolongada se denominan plantas ESL, del inglés Extended Shelf Life.
Uso de la mutación como marcador
El objeto de la presente invención es el uso de la mutación que consiste en la presencia de adenina (A) en lugar de timina (T) presente en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate (SEQ ID NO: 1) como marcador para identificar plantas de tomate cuyos frutos se conservan durante un período de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración, para producir plantas de tomate con frutos que tengan dichas características, y para producir semillas que se regeneran en plantas de tomate cuyos frutos tengan características de durabilidad prolongada.
En el curso de trabajos de investigación para desarrollar plantas de tomate con características de durabilidad prolongada, los autores de la invención han identificado un tipo de tomate autóctono con muchas variedades que presenta dichas características de durabilidad prolongada.
Los trabajos de aislamiento del ADN genómico y secuenciación del gen nor de diferentes variedades de tomate permitieron determinar que los tomates del tipo ESL presentaban una mutación en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate. Los tomates del tipo ESL contenían una base adenina (A) en dicha posición, mientras que otras variedades de tomate del tipo Cherry, del tipo Pintón o plantas de tomate que incorporan el gen rin, contenían una base timina (T).
Dicha mutación responde a un polimorfismo de un único nucleótido, que se conoce habitualmente como SNP (del inglés Single Nucleotide Polymorphism).
Un SNP es una variación en la secuencia de ADN que ocurre cuando un único nucleótido (A, T, C, o G) en el genoma difiere entre miembros de una misma especie.
Se ha observado que para que se manifieste el fenotipo ESL, los dos alelos de la planta diploide deben contener en la posición 1109 del gen nor una base adenina (A).
El ADN genómico del gen nor del tomate (SEQ ID NO: 1) está registrado en la base de datos GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information) con el número de registro AY573803 y contiene 2885 pares de bases. El ARNm del gen nor del tomate (SEQ ID NO: 22) está registrado en dicha base de datos del GenBank con el número de registro AY573802 y contiene 1423 pares de bases.
La comparación de las dos secuencias permite concluir que el gen nor presenta tres exones tal como se muestra en la Figura 1. El exón 1 consta de 190 pares de bases y está localizado entre las posiciones 166 y 355 de la secuencia nucleotídica. El exón 2 consta de 311 pares de bases, y se encuentra entre las posiciones 983 y 1293 de la secuencia nucleotídica. El exón 3 consta de 567 pares de bases y se encuentra entre las posiciones 2163 y 2729 de la secuencia nucleotídica. Al inicio de la secuencia nucleotídica del gen nor se encuentra la 5’UTR de 165 pares de bases entre las posiciones 1 y 165. Entre los exones 1 y 2 se encuentra un intrón de 627 pares de bases situado entre las posiciones 356 y 982. Entre los exones 2 y 3 se encuentra un intrón de 869 pares de bases situado entre
las posiciones 1294 y 2162. Al final de la secuencia nucleotídica se encuentra la 3’UTR de 156 pares de bases
situada entre las posiciones 2730 y 2885.
La secuenciación del gen nor se ha llevado a cabo siguiendo procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo usando el kit BigDye Terminator® de la compañía Applied Biosystems.
Dicho procedimiento incluye las siguientes etapas: extracción del ADN genómico de plantas de tomate de diferentes variedades, amplificación del amplicón correspondiente al gen nor y secuenciación del mismo.
La extracción del ADN genómico se puede efectuar por ejemplo de acuerdo con el procedimiento descrito en el artículo de Doyle et al., Focus, 1990, 12, 13-15.
La amplificación del ADN genómico se puede llevar a cabo mediante el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa, que es conocida habitualmente como PCR.
Para amplificar el gen nor presente en el ADN genómico extraído los autores de la invención diseñaron cebadores específicos para amplificar las secuencias nucleotídicas correspondientes a los exones 1, 2 y 3.
En el Ejemplo 1 de esta descripción se incluyen las secuencias nucleotídicas de los cebadores que se emplearon para dicha amplificación.
En el caso del exón 2, y debido a la longitud del mismo, se emplearon dos cebadores externos y dos cebadores internos en dos amplificaciones consecutivas para conseguir la amplificación apropiada de la zona deseada.
La secuenciación del ADN genómico amplificado se puede efectuar por ejemplo empleando el kit BigDye Terminator® v 1.1 de la compañía Applied Biosystems.
Las secuencias amplificadas de los exones 1, 2 y 3 de diferentes variedades de tomate se alinearon para identificar eventuales polimorfismos. Se comprobó que en los exones 1 y 3 no existía polimorfismo entre los tomates del tipo ESL y las otras variedades de tomate del tipo Cherry y del tipo Pintón.
Sin embargo, como ya se ha mencionado anteriormente, se comprobó que en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor, que se encuentra en la zona correspondiente al exón 2, los tomates del tipo ESL presentaban una mutación en dicha posición. Los tomates del tipo ESL contenían una base adenina (A) en dicha posición, mientras que otras variedades de tomate del tipo Cherry, del tipo Pintón, o las que incorporan el gen rin, contenían una base timina (T).
Al efectuar la traducción de la secuencia nucleotídica a proteína, se observó que dicha mutación causaba un cambio de aminoácido en la posición 106 de la proteína correspondiente. El genotipo T codifica para un aminoácido valina (no polar) y el genotipo A para un aminoácido ácido aspártico (polar).
Procedimiento para identificar plantas de tomate ESL
El otro aspecto del objeto de la presente invención es un procedimiento para identificar plantas de tomate cuyos frutos presentan características de durabilidad prolongada caracterizado porque comprende la etapa de identificar la presencia en ambos alelos de la base adenina (A) en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate (SEQ ID NO: 1).
En el procedimiento de la invención, la identificación de las plantas de tomate se lleva a cabo mediante técnicas bien conocidas por el experto en la materia como por ejemplo el kit de detección SNaPshot®, PCR a tiempo real empleando sondas del tipo Taqman® de la compañía Applied Biosystems, o bien del tipo Hyprobes® de la compañía Roche®, o cualquier otra tecnología de detección de polimorfismos SNP.
En dicho procedimiento se emplean unos cebadores específicos que se describen en el Ejemplo 2 y que permiten identificar las plantas de tomate que contienen el SNP en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate.
Procedimiento para producir plantas de tomate ESL
También se describe en la invención un procedimiento para producir plantas de tomate cuyos frutos presentan unas características de durabilidad prolongada que comprende:
a) proporcionar una planta de Solanum lycopersicum con alelos que contienen una base adenina en la posición 1109 del gen nor del tomate (SEQ ID NO: 1),
b) cruzar la planta proporcionada en la etapa a) con material de cultivo de Solanum lycopersicum, que presenta un genotipo AA o AT en la posición 1109 del gen nor del tomate,
c) recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa b),
d) regenerar las semillas en plantas, e
e) identificar y seleccionar las plantas que contienen en ambos alelos el genotipo A empleando el marcador de la etapa a).
En una realización del procedimiento de la invención se cruzó una planta de tomate ESL (planta autóctona cuyos frutos presentaban características de durabilidad prolongada), que contenía alelos que contenían una base adenina en la posición 1109 del gen nor del tomate, y que consecuentemente presentaba un genotipo AA, con una planta de tomate de otra variedad, por ejemplo del tipo Cherry o Pintón, que presentaba un genotipo TT en lo que se refiere a dicha posición.
De dicho cruce se obtuvieron semillas F1 que se regeneraron en una planta de tomate. Se procedió a la extracción del ADN genómico de una planta F1 y se procedió a la identificación de la base que se encontraba en la posición 1109 del gen nor de dicha planta tal como se describe en el Ejemplo 2. Se observó que dicha planta F1 era un híbrido que presentaba un genotipo AT.
En una etapa ulterior, se pueden recoger semillas F2 de las plantas obtenidas por autofecundación, y proceder a la extracción del ADN genómico de varias plantas F2 e identificar la base que se encuentra en la posición 1109 del gen nor de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.
Con el uso del SNP o marcador identificado por los autores de la presente invención se pueden producir plantas de tomate cuyos frutos combinan las características de durabilidad prolongada con otras características fenotípicas interesantes desde el punto de vista comercial, como por ejemplo el tamaño, la forma, el color o la textura del fruto.
Así, por ejemplo, se pueden producir tomates con características de durabilidad prolongada (ESL) que presentan características del tomate del tipo Cherry empleando el procedimiento de la invención. Para ello se puede cruzar una línea parental de tomate ESL que presenta el genotipo AA en la posición 1109 del gen nor, con una línea parental de tipo Cherry que presenta el genotipo TT en dicha posición. De esta forma se obtiene una F1 que presenta un genotipo AT. Al cruzar el híbrido F1 con una línea parental ESL se obtiene una F2 y se pueden seleccionar las plantas que presentan el genotipo AA empleando el marcador de la invención. Empleando el procedimiento de retrocruce o retrocruzamiento, bien conocido por el experto en la materia, y el marcador de la invención para seleccionar las plantas con genotipo AA, se pueden obtener líneas parentales con características de durabilidad prolongada (ESL) y otras características interesantes comercialmente como las del tomate Cherry.
Procedimiento para producir semillas de plantas de tomate ESL
También se describe un procedimiento para producir semillas que tienen por resultado plantas de tomate cuyos frutos presentan unas características de durabilidad prolongada que comprende las etapas:
a) proporcionar una planta Solanum lycopersicum con alelos que contienen una base adenina en la posición 1109 del gen nor del tomate SEQ ID NO: 1,
b) cruzar la planta proporcionada en la etapa a) con material de cultivo de Solanum lycopersicum, que presenta un genotipo AA o AT en la posición 1109 del gen nor del tomate,
c) recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa b), e
d) identificar y seleccionar las semillas empleando el marcador de la etapa a) que contienen en ambos alelos el genotipo A.
Sorprendentemente, se ha encontrado que los frutos de las plantas de tomate que contienen en ambos alelos una base adenina (A) en la posición 1109 del gen nor presentan unas características de durabilidad prolongada, de modo que se pueden conservar durante un período de al menos 3 meses, y generalmente de al menos 6 meses sin necesidad de refrigeración, con lo que disminuyen los costes de almacenamiento y de transporte, y asimismo el fruto mantiene sus características organolépticas de jugosidad y aroma durante todo el período de post-cosecha.
Procedimiento para producir plantas de durabilidad prolongada (ESL) mediante transgénesis.
Aunque la planta con la mutación en homocigosis presenta las características más interesantes, como las descritas en los ejemplos de la presente invención, una planta puede contener una mutación que tenga la base adenina (A) en la posición 1109 del gen nor en homocigosis, heterocigosis o hemicigosis.
Como se mencionó antes, la planta puede obtenerse mediante cruzamiento, es decir, empleado el polen de la planta homocigótica para el polimorfismo que presenta una base adenina en la posición 1109 del gen nor para polinizar cualquier otra planta que no contiene dicha mutación en las secuencias del gen nor, mediante polinización del gineceo de las plantas que contienen la secuencia mutada de la invención con otros pólenes de plantas que no contienen esta secuencia, o pueden obtenerse mediante transformación genética mediante biobalística, infección con Agrobacterium o cualquier otra técnica conocida por el experto en la materia que permita la integración de cualquiera de las secuencias de la invención en el ADN de la planta, ya sea nuclear, cloroplástico o mitocondrial.
También se describe el uso de:
a) La SEQ ID NO: 1 que presenta una base adenina (A) en la posición 1109, en lugar de una base timina (T),
b) una secuencia homóloga a la secuencia nucleotídica de (a) que presenta una base adenina (A) en la posición homóloga a la 1109, o
c) una construcción genética (denominada a partir de ahora construcción genética de la invención) que incluye la secuencia nucleotídica de acuerdo con a), b), o cualquiera de sus combinaciones,
para producir plantas de durabilidad prolongada (ESL).
Puede esperarse que el grado de identidad/similitud de las secuencias homólogas a la recopilada en la secuencia SEQ ID NO: 1 es, en diferentes especies del género Solanum y dentro de las diferentes variedades y subespecies de Solanum lycopersicum L, al menos del 80% o superior y, más preferiblemente, al menos del 85%, 90, 95 o 99%. La correspondencia entre las secuencias de nucleótidos de las secuencias adoptivas y la secuencia recogida en SEQ ID NO: 1 puede determinarse mediante procedimientos conocidos en la materia. Los procedimientos para comparar las secuencias son bien conocidos en el estado de la técnica e incluyen, entre otros, el programa BLASTP
o BLASTN y el programa FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1999). Preferiblemente las diferencias (mutaciones) presentadas por la secuencia nucleotídica homóloga a la SEQ ID NO: 1 se presentan en regiones no codificantes, sin afectar al producto de la expresión de dicha secuencia.
El término «homología», como se usa en esta descripción, se refiere por tanto a la semejanza entre dos estructuras debido a un ascendente evolutivo común y, más específicamente, a la semejanza entre dos o más secuencias nucleotídicas o aminoacídicas. Puede considerarse que las secuencias homólogas, con una identidad de al menos el 80% con la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1, la cual presenta una base adenina (A) en la posición homóloga a 1109, tendrían la misma función.
La construcción genética de la etapa c) de la invención, no se corresponde con un sistema de expresión génica o un vector que comprende la SEQ ID NO: 1, que presenta la base adenina (A) en la posición 1109 del gen nor en lugar de timina (T), o la secuencia homóloga a SEQ ID NO: 1 que presenta una base adenina (A) en la posición homóloga a 1109, unida de forma operativa a al menos un promotor que dirige la transcripción de dichas secuencias nucleotídicas y con secuencias necesarias o apropiadas adicionales para la transcripción y su regulación adecuada con respecto al tiempo y localización, por ejemplo, señales de inicio y parada, sitios de corte de la señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores de la transcripción (potenciadores), silenciadores de la transcripción (silenciadores), etc.
Se puede obtener un gran número de estas construcciones, sistemas o vectores de expresión mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia y son parte de la presente invención.
Un «vector» es un replicón, o un vector integrado, al que se une otro segmento polinucleotídico para llevar a cabo la replicación y/o expresión del segmento unido.
Un «replicón» es todo elemento genético que actúa como una unidad autónoma de replicación polinucleotídica dentro de una célula, la cual es capaz de replicarse por sí misma.
Un vector de integración es todo elemento genético que se integra en el genoma de una célula y se mantiene estable.
«Secuencia de control» se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para llevar a cabo la expresión de las secuencias a las que están unidas. Según se usa en este documento, el término «promotor» se refiere a una región anterior en la secuencia de ADN con respecto al punto inicial de la transcripción y, en particular, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal, independientemente de si el origen del promotor es vegetal o no.
Unido de forma «operativa» se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos de esta forma tienen una relación que les permite trabajar de una forma intencionada. Una secuencia control «unida de forma operativa» a una secuencia que se transcribe en secuencia nucleotídica de la invención se une de forma que la expresión de la secuencia codificante se alcanza en condiciones compatibles con las secuencias control.
Una «secuencia codificante» es una secuencia polinucleotídica que se transcribe en ARNm y/o se traduce en un polipéptido cuando está bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.
En la invención además se describe un proceso para producir plantas de tomate cuyos frutos presentan algunas características de durabilidad prolongada que comprende:
a) transfección de la SEQ ID NO: 1 que presenta una base adenina (A) en la posición 1109, en lugar de una base timina (T), una secuencia homóloga a la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, que presenta una base adenina (A) en la posición homóloga a 1109, o una construcción genética que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 que presenta una base adenina (A) en la posición 1109 (o una secuencia homóloga a la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, que presenta una base adenina (A) en la posición homóloga a 1109) en una célula o cultivo de células huésped vegetales,
b) crecimiento de la célula o el cultivo de células huésped vegetales en medios adecuados hasta la regeneración de una planta completa.
En esta descripción «transfección» o «transgénesis» se entiende como un procedimiento para transferir ADN no propio a un organismo que, de este modo, se empieza a denominar «transgénico».
El término «transgénico» se usa en el contexto de la presente invención para describir plantas en las que se ha incorporado una secuencia de ADN no propio, en una forma preferiblemente estable y, específicamente, los polinucleótidos o construcciones genéticas de la invención.
Preferiblemente, la célula huésped transfectada puede clasificarse taxonómicamente como miembro del género Solanum. Más preferiblemente, la célula transfectada puede clasificarse taxonómicamente como miembro de la especie Solanum lycopersicum.
Un «huésped», «célula huésped» o «célula hospedadora» según se utiliza en esta descripción se refiere a un organismo, célula o tejido, especialmente una célula vegetal, que se usa como diana o recipiente para los elementos transfectados (por ejemplo, polinucleótidos o construcciones genéticas de la invención):
Con «planta» en esta descripción, se entienden todos los organismos que pueden clasificarse dentro del reino Viridiplantae, incluyendo las algas verdes y las plantas terrestres (Embryophyta). Los organismos del género Solanum pertenecen al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, filo Streptophyta, subclase Asteridae, orden Solanales y familia Solanaceae. Solanum lycopersicum es el nombre científico de la planta del tomate.
Los términos «polinucleótido» y «ácido nucleico» se usan en este documento de forma indistinta en referencia a formas poliméricas nucleotídicas de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (RNA o ARN) como desoxirrobonucleótidos (DNA o ADN).
Los términos «secuencia aminoacídica», «péptido», «oligopéptido», «proteína» y «polipéptido» se usan en este documento de manera indistinta, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede o no estar química o bioquímicamente modificada.
La célula transformada con un vector que incluye la SEQ ID NO: 1, que presenta la base adenina (A) en la posición 1109 del gen nor en lugar de timina (T), puede incorporar la secuencia en uno de los ADN de la célula; nuclear, mitocondrial y/o cloroplástico, o permanecer como parte de un vector que tiene su propia maquinaria para la autorreplicación.
Más preferiblemente, la célula transformada con un vector que incluye la SEQ ID NO: 1, que presenta la base adenina (A) en la posición 1109 en lugar de timina (T), o una secuencia homóloga a la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, que presenta una base adenina (A) en la posición homóloga a la 1109 en lugar de un base timina (T), puede incorporar la secuencia en uno de los ADN de la célula; nuclear, mitocondrial y/o cloroplástico en forma estable. Los procedimientos para la incorporación de un ácido nucleico exógeno en el genoma de una célula vegetal en forma estable son conocidos en el estado de la técnica.
Las células transformadas, si son vegetales, pueden colocarse en un programa de organogénesis somática o embriogénesis mediante el cual, tras la desdiferenciación de las mismas con una adecuada combinación de hormonas vegetales y de otros compuestos, darán lugar a una planta completa que contiene el material genético de la célula original de la que proviene.
Los ejemplos que siguen a continuación se exponen a efectos de proporcionar al experto en la materia una explicación detallada de realizaciones concretas dentro de la invención.
Ejemplo preparativo.-Extracción del ADN genómico de las plantas de tomate
El procedimiento empleado para extraer el ADN genómico de las plantas de tomate coincide sustancialmente con el procedimiento descrito en Doyle et al., Focus, 1990, 12, 13-15.
Se llevó a cabo la extracción de ADN genómico de plantas de tomate del tipo ESL, del tipo Cherry, del tipo Pintón, y de plantas de tomate que incorporaban el gen rin en su genoma.
Se colocó una hoja joven en un tubo eppendorf de 1,9 ml, y se sumergió en nitrógeno líquido. A continuación se trituraron las hojas, se añadieron 500 µl de la solución tampón de extracción Doyle calentada previamente a 65º C, y se agitó suavemente.
La muestra se mantuvo en un baño de agua a 65º C durante 30 minutos.
Pasado este período de tiempo se añadió rápidamente una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico en una
proporción 24:1 volumen/volumen.
Se centrifugó a 11.000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se transfirieron 200 µl de la fase acuosa a
un nuevo tubo eppendorf.
Se añadieron 350 µl de alcohol isopropílico a 4º C a la fase acuosa, y se mezcló suavemente hasta la formación de hilos de ADN.
Se centrifugó a 10.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se eliminó el sobrenadante con una pipeta. En la parte inferior del eppendorf se encontraba un precipitado blanquecino que era el ADN extraído.
A dicho precipitado se añadieron 200 µl de tampón de lavado Doyle, se centrifugó a 10.000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos, y se eliminó el sobrenadante. El pellet obtenido se secó, y se resuspendió en 50 µl de agua tipo HPLC. Se mantuvo toda la noche a 4º C, y posteriormente se guardó a -20º C. Dicha suspensión se empleó para efectuar la secuenciación de los exones del gen nor de cada uno de los tomates ensayados.
El tampón de extracción de Doyle y el tampón de lavado de Doyle se encuentran descritos en el artículo de Doyle et al., ya mencionado.
La secuenciación de los exones del gen nor de diferentes tipos de tomate se llevó a cabo mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los exones de dicho gen, y a continuación se procedió a su secuenciación, previa amplificación y marcado.
Se llevó a cabo la secuenciación de ADN genómico de plantas de tomate del tipo ESL, del tipo Cherry, del tipo Pintón y de plantas de tomate que incorporaban el gen rin en su genoma.
1.- Amplificación de los exones
Para amplificar cada uno de los tres exones del gen nor del tomate se mezclaron 0,5 μl (equivalentes a 20-100 ng) de ADN genómico obtenido en el Ejemplo preparativo, 15 μl de agua destilada, 2,5 μl de tampón de PCR concentrado 10 veces (AmpliTaq 10x PCR buffer II, Applied Biosystems), 2,5 μl de solución MgCl2 25 mM (AmpliTaq MgCl2 Solution, Applied Biosystems), 2 μl de dNTPs 5 mM, 1 μl de una solución del cebador F específico por cada exón a 10 μM, 1 μl de una solución del cebador R específico por cada exón a 10 μM, y 0,5 μl de ADN Polimerasa Taq (Applied Biosystems).
Se ejecutó el programa del termociclador AB9700 de Applied Biosystems de acuerdo con la siguiente secuencia: 1 minuto a 94º C; 35 repeticiones del ciclo de 30 segundos a 94º C, 30 segundos a 60º C, 90 segundos a 72º C, finalizando con un ciclo de 5 minutos a 72º C.
Finalizada la amplificación, ésta se comprobó mediante electroforesis en un gel de agarosa siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la materia.
Los cebadores que se emplearon para la amplificación de los tres exones del gen nor del tomate se muestran en la Tabla I:
TABLA I
- Exón
- Referencia Secuencia del cebador SEC ID N.º
- 1
- Cebador F externo TCATTTTCTCTCTTCCCAAAAA 3
- Cebador R externo
- CATGAAGATTAAAAAGGGGAAA 4
- 2
- Cebador F externo TCCACGATAACGTGTAAAAAGTG 5
- Cebador R externo
- TTTTCATCAAAAATTTGAAAGTTGA 6
- Cebador F externo
- TTCGGAGAGCAAGAATGGTT 7
- Cebador R externo
- CAACCAAGTGGCTTGTTATTTG 8
- 3
- Cebador F externo AACTCGAATAAATTCAATGTTTCAT 9
- Cebador R externo
- TCGATTGATTTTACAGGGCTAA 10
5 En el caso del exón 2, que tiene 777 pares de bases, se efectuaron dos amplificaciones: en primer lugar con los dos cebadores externos, y en segundo lugar con los cebadores internos.
En la Figura 2 se observa el resultado de la electroforesis del gel de agarosa para los exones 1, 2 y 3 del gen nor del tomate.
10 Antes de proceder a la amplificación y marcado de las secuencias de los exones para efectuar su secuenciación, eventualmente se puede llevar a cabo una purificación de las mismas mediante el empleo del kit High Pure PCR Product Purification Kit® de Roche Applied Science.
15 2.- Secuenciación de los exones
La secuenciación de los tres exones se llevó a cabo mediante el empleo del kit de secuenciación BigDye Terminator® v1.1 de la compañía Applied Biosystems.
20 Se efectuó la secuenciación de cada uno de los ADN genómicos que se obtuvieron de diferentes tipos de tomate del Ejemplo preparativo después de ser amplificados por PCR con los cebadores descritos en la Tabla I.
Se colocaron 4 μl del producto de PCR de los tres exones como se describe en el apartado 1 del Ejemplo 1, 2 μl del reactivo BigDye Terminator® (Applied Biosystems), 1 μl de una solución del cebador externo específico por cada 25 exón a 3,2 mM, y 3 μl de agua destilada.
Se ejecutó el siguiente programa en el termociclador AB9700: 25 ciclos de 10 segundos a 96º C, 5 segundos a 50º C, y 4 minutos a 60º C.
30 Siguiendo las instrucciones del proveedor del kit, esto se precipitó con una mezcla de etanol, EDTA y acetato sódico.
El precipitado obtenido se resuspendió en tampón de inyección de la compañía Applied Biosystems, y la suspensión se cargó en el secuenciador automático ABI PRISM 3130 de la compañía Applied Biosystems, y se ejecutó el programa de secuenciación.
35 Los datos de secuenciación se analizaron empleando el programa informático GeneMapper® de la compañía Applied Biosystems.
Se observó que el tomate del tipo ESL contenía en la posición 1109 del gen nor, concretamente en el exón 2 de dicho gen, una timina (T), mientras que tomates del tipo Cherry, del tipo Pintón, o aquellos que incorporaban el gen rin en su genoma tenían una adenina (A) en dicha posición.
Al efectuar la traducción de la secuencia nucleotídica a proteína, se observó que dicha mutación causaba un cambio de aminoácido en la posición 106 de la proteína correspondiente. El genotipo T codifica para un aminoácido valina (no polar), y el genotipo A para un aminoácido ácido aspártico (polar).
La identificación de tomates del tipo ESL se llevó a cabo mediante el empleo de la técnica PCR de acuerdo con el procedimiento que se describe a continuación en el que se emplean unos cebadores diseñados para poder identificar rápidamente la base que se encuentra en la posición 1109 del exón 2 del gen nor del tomate.
En primer lugar se extrajo el ADN genómico de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo preparativo. A continuación se mezclaron 0,5 μl de ADN genómico correspondientes a 20-100 ng, 15 μl de agua, 2,5 μl de tampón de PCR concentrado 10 veces (AmpliTaq 10x PCR buffer II, Applied Biosystems), 2,5μl de una solución de MgCl2 25 mM (AmpliTaq MgCl2 Solution, Applied Biosystems), 2 μl de dNTPs 5 mM, 1 μl de una solución del cebador F (SEQ ID NO: 7) 10 μM, 1 μl de una solución del cebador R (SEQ ID NO: 8) 10 μM, y 0,5 μl (2,5 u) de ADN Polimerasa Taq (AmpliTaq® -Applied Biosystems).
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador AB9700, de acuerdo con la siguiente secuencia: 1 ciclo de un minuto a 94º C; 35 ciclos de 30 segundos a 94º C, 30 segundos a 60º C, y 30 segundos a 72º C; para terminar con un ciclo de 5 minutos a 72º C.
Se comprobó que la amplificación era correcta mediante electroforesis en un gel de agarosa siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la materia.
Se transfirieron 2,5 μl del producto amplificado a un nuevo tubo y se añadió 1 μl de ExoSAP-IT de la compañía Applied Biosystems. Se mezcló y se aplicó un golpe de centrífuga.
A continuación, el producto se incubó en un termociclador durante 15 minutos a 37º C, y durante 15 minutos a 80º C.
Para llevar a cabo la reacción SNaPShot se mezclaron 1,5 μl del ADN obtenido, 1,25 μl del reactivo Mix SNaPshot (Applied Biosystems), 0,5μl de una solución del cebador interno (SEQ ID NO: 11) 2 μM, y 1,75μl de agua HPLC (Panreac).
El cebador interno utilizado en esta etapa tenía la secuencia 5’- TACCGGAACCGACAAGCCGG -3’ (SEQ ID NO: 11).
Se ejecutó la PCR con la siguiente programación del termociclador: 25 ciclos de 10 segundos a 96º C, 5 segundos a 50º C, y 30 segundos a 60º C, y finalmente se mantuvo a 4º C.
Se añadieron 1 μl de fosfata de intestino de ternera (1u/μl) (CIP), se agitó y se aplicó un golpe de centrífuga.
Se incubó en un termociclador durante 1 hora a 37º C, 15 minutos a 75º C, y se mantuvo a 4º C.
A continuación 0,5 μl del producto obtenido se cargó en una placa de secuenciación junto con 12 μl de formamida HI-DI, y 0,5 μl del reactivo LIZ 500 size standard.
Se desnaturalizó durante 5 minutos a 95º C, se enfrió la placa con hielo y se aplicó un golpe de centrífuga.
Se cargó el secuenciador automático AB3130 (SNP, matriz E5, módulo FragmentAnalysis36_POP7_1) y se
analizaron los datos con el programa informático GeneMapper® de la compañía Applied Biosystems.
En la Tabla II se presentan los resultados obtenidos al aplicar el procedimiento de la invención a diferentes líneas de
tomate:
TABLA II
- Línea de tomate
- Genotipo Fenotipo Período de durabilidad Color del fruto
- 1
- TT Cherry 10 días Rojo
- 2
- AA ESL > 6 meses Naranja
- 3
- TT Pintón 10 días Rojo
- 4
- TT Pintón 10 días Rojo
- 5
- TT Pintón 10 días Rojo
- 6
- AT Híbrido 30 días Rojo
- 7
- TT rin 60 días Amarillo
- 8
- TT rin 60 días Amarillo
- 9
- TT rin 60 días Amarillo
- 10
- TT rin 60 días Amarillo
- 11
- AA ESL > 6 meses Naranja
- 12
- AA ESL > 6 meses Naranja
- 13
- AA ESL > 6 meses Naranja
- 14
- AA ESL > 6 meses Naranja
- 15
- AA ESL > 6 meses Naranja
- 16
- AA ESL > 6 meses Naranja
- 17
- AA Híbrido F1 > 6 meses Naranja
- 18
- AA Híbrido F1 > 6 meses Naranja
- 19
- AA Híbrido F1 > 6 meses Naranja
Se puede observar que los tomates del tipo ESL, que tienen un genotipo AA en la posición 1109 del gen nor, presentan un período de durabilidad superior a los 6 meses, mientras que los tomates que presentan un genotipo TT 5 no presentan dicha característica.
Tampoco presentan las características de durabilidad prolongada los híbridos AT obtenidos a partir de una línea parental ESL con un genotipo AA y una línea parental con un genotipo TT.
10 Las líneas híbridas 17 a 19 se han obtenido a partir de dos líneas parentales que presentan el genotipo AA.
Se tomó una planta de tomate del tipo ESL que tenía el genotipo AA en la posición 1109 del gen nor, y se cruzó con 15 una planta de tomate del tipo Cherry que tenía el genotipo TT en dicha posición.
Se obtuvo una primera generación F1 que se sometió al ensayo de identificación descrito en el Ejemplo 2, y se observó que presentaban un genotipo híbrido AT.
20 El cruce de una planta de tomate del tipo ESL con el híbrido AT conduce a la obtención de plantas, y mediante el empleo del marcador de la invención se seleccionan aquellas que presentan características de durabilidad prolongada (ESL) con el genotipo AA en la posición 1109 del gen nor.
Mediante el empleo de la técnica de retrocruce o retrocruzamiento, bien conocida por el experto en la materia, se 25 pueden obtener líneas parentales ESL que presentan características de otros tipos de tomate por ejemplo Cherry.
<110> Semillas Fitó, S.A.
<120> Procedimiento para producir plantas de tomate con características de durabilidad prolongada
<130> EP2096.3
<140> EP2255006
<141> 06/09/2010
<150> PCT/EP2009/052912
<151> 12/03/2009
<160> 11
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 2885
<212> ADN
<213> Solanum lycopersicum
<400> 1 ctaaattcct tcttgtttat cattttctct cttcccaaaa aaaaatccca aaatttaatc 60 ataatacaat tcgaatttat caacctcgta ctacgtacat atttttgttg gtacgtaaaa 120 tactgaattc aggtcaactc aaacatcgta aattgtgatt tctttatgga aagtacggat 180 tcatcaaccg ggacacgtca tcagcctcaa ctcccaccgg ggtttcgatt ccacccgacg 240 gacgaagaac tcatcgtcca ctacctcaaa aaacgagtcg ccggcgctcc gattccggtg 300 gatattattg gtgaaattga tctttataag tttgatccat gggaactccc tgctactatt 360 ttcaccacta tactatattt tcttgcccta taacttatat ataggggaaa aagatcggag 420 tcagcgatga acaattattg tgtctaaatt aaattttaaa tatgcaatag attggtgacg 480 aatttcgttg ctaattaatt ttttagtgat aaattaatat ttttcccctt tttaatcttc 540 atgtttttta tcacaaagtt ttctatgacc aacttataaa gatttgaact cgatcaattt 600 tttttttaga atgaatgaac ttatgttata tatagtgata ttttaaatgc ttttttatat 660 tttcaaaaga tatccacgat aacgtgtaaa aagtgaattt gcaaaaaaaa aatgtagtac 720 cttttattta attttattgt agataattta gattttaatt ttgaatttgt tata 780 ttctgaatcg tataatattt atttaatttc tattttttga gttttttttt ggagggtgct 840 taaaaagtag tattcacaaa tataaagtag tggacaaaca taaagtagtg gacccataat
900 ttattttttt aaaaattata ttaaaactat ttgttaagtt taaattctga attatcttct
960 tatcatgtgt ttaacgcagc taaggcaata ttcggagagc aagaatggtt cttttttagt
1020 ccaagagata gaaaatatcc taacggggcg aggccaaatc gggctgcaac atcgggttat
1080 tggaaggcta ccggaaccga caagccggtt tttacttccg gtggaacaca aaaggttggg
1140 gtaaaaaagg cgctcgtttt ttacggcggt aaaccaccaa aaggggtaaa aactaattgg
1200 atcatgcatg aatacagagt tgtagaaaat aaaacaaata acaagccact tggttgtgat 1260 aatattgttg ccaacaaaaa aggatctttg agggtaagtc ctaaattttg catcgaaact 1320 aatttctcta tcgtatcaga tagggataag atatacgtat actctaatct ccttgaacca 1380 cacaagtact atactagata tgttgttgtt gtagatgact tgattcaact ttcaaatttt 1440 tgatgaaaat gtttaagtta tatataccat atatatatag gcgtagctaa aaatttcgat 1500 aagggggttt aaatctgaaa aaatggatat acgaaatagc cgaaagaggt tcgacataga 1560 ttattttaac catataaaaa taatacaatt ttcatatata tatacgccgt ggttaatatg 1620 aggaatattt tatactatta atgtacttta accaggggcg gctctagagt tgatgaaccc 1680 tctcagcgaa aatttacgtt gtatatttaa ggtacctttt aataattttt gtatttatat 1740 attaattttg aacctcttga atataagatt agacgttgac ttagtggttt caggggttca 1800 aatcactatt ctttttttcc taaccccctt aatgaaaatc ctgaatcggc cactaacttt 1860 aactggttat agaaggttaa tcttactaga aaaaagcatg aaattctaac cgacaaagat 1920 gtagtcgccc agttagataa gacgtttaaa ttgggcggat agagttactt tatttttcac 1980 tgtcatatgt tactatatat tgacacttca cttaaagagt tatcatatcg atatttttac 2040 tattagtgta cataacacaa actcgaataa attcaatgtt tcattagcta gttaattagt 2100 ctaacttttt taaaaaaaaa tatttttctt actccacact attttatttt atttttttgc 2160 agctagatga ttgggtttta tgtcgaattt acaagaagaa taacacacaa aggtccatag 2220 atgatttgca tgatatgttg ggatcgatac cacaaaatgt accaaattca atattacaag 2280 gaataaagcc ttcaaactat ggtacaatat tgctcgaaaa tgaatcgaat atgtacgatg 2340 gaattatgaa taacacgaac gatattatca acaataataa tagatccatt ccacaaatat 2400 cgtcaaagag aacgatgcat ggaggtttgt attggaataa cgacgaagca acaacaacaa 2460 caacaactat tgataggaac cattctccaa atacaaaaag gttccttgtt gagaacaacg 2520 aggacgatgg acttaacatg aataatattt cgcgaattac aaatcatgaa caaagtagct 2580 ccattgccaa tttcctgagc cagtttcctc aaaatccttc gattcaacaa caacaacaac 2640 aacaagaaga agtattggga tctcttaatg atggggtcgt ctttcgacaa ccttataatc 2700 aagttactgg catgaattgg tactcttaaa gatataaaaa ggcaaaaaat agttagccct 2760 gtaaaatcaa tcgatcaatc aatcatagat atattatata tggatttcgt tatattttac 2820 ttttagttag aattaatata tagaatatct tctatctcac attaacaaat aagaacattt 2880 ataac 2885
<210> 2
<211> 1423
<212> ADN
<213> Solanum lycopersicum
<400> 2 ctaaattcct tcttgtttat cattttctct cttcccaaaa aaaaaatccc aaaatttaat 60 cataatacaa ttcgaattta tcaacctcgt actacgtaca tatttttgtt ggtacgtaaa 120 atactgaatt caggtcaact caaacatcgt aaattgtgat ttctttatgg aaagtacgga 180 ttcatcaacc gggacacgtc atcagcctca actcccaccg gggtttcgat tccacccgac 240 ggacgaagaa ctcatcgtcc actacctcaa aaaacgagtc gccggcgctc cgattccggt 300 ggatattatt ggtgaaattg atctttataa gtttgatcca tgggaactcc ctgctaaggc 360 aatattcgga gagcaagaat ggttcttttt tagtccaaga gatagaaaat atcctaacgg 420 ggcgaggcca aatcgggctg caacatcggg ttattggaag gctaccggaa ccgacaagcc 480 ggtttttact tccggtggaa cacaaaaggt tggggtaaaa aaggcgctcg ttttttacgg 540 cggtaaacca ccaaaagggg taaaaactaa ttggatcatg catgaataca gagttgtaga 600 aaataaaaca aataacaagc cacttggttg tgataatatt gttgccaaca aaaaaggatc 660 tttgaggcta gatgattggg ttttatgtcg aatttacaag aagaataaca cacaaaggtc 720 catagatgat ttgcatgata tgttgggatc gataccacaa aatgtaccaa attcaatatt 780 acaaggaata aagccttcaa actatggtac aatattgctc gaaaatgaat cgaatatgta 840 cgatggaatt atgaataaca cgaacgatat tatcaacaat aataatagat ccattccaca 900 aatatcgtca aagagaacga tgcatggagg tttgtattgg aataacgacg aagcaacaac 960 aacaacaaca actattgata ggaaccattc tccaaataca aaaaggttcc ttgttgagaa 1020 caacgaggac gatggactta acatgaataa tatttcgcga attacaaatc atgaacaaag 1080 tagctccatt gccaatttcc tgagccagtt tcctcaaaat ccttcgattc aacaacaaca 1140 acaacaacaa gaagaagtat tgggatctct taatgatggg gtcgtctttc gacaacctta 1200 taatcaagtt actggcatga attggtactc ttaaagatat aaaaaggcaa aaaatagtta 1260 gccctgtaaa atcaatcgat caatcaatca tagatatatt atatatggat ttcgttatat 1320 tttactttta gttagaatta atatatagaa tatcttctat ctcacattaa caaataagaa 1380 catttataac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1423
<210> 3
<211> 22
<212> ADN
<213> Solanum lycopersicum
<400> 3 tcattttctc tcttcccaaa aa 22
<210> 4
<211> 22
<212> ADN
<213> Solanum lycopersicum
<400> 4 catgaagatt aaaaagggga aa 22
- <210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Solanum lycopersicum
- <400> 5 tccacgataa cgtgtaaaaa gtg
- 23
- <210> 6 <211> 25 <212> ADN <213> Solanum lycopersicum
- <400> 6 ttttcatcaa aaatttgaaa gttga
- 25
- <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Solanum lycopersicum
- <400> 7 ttcggagagc aagaatggtt
- 20
- <210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Solanum lycopersicum
- <400> 8 caaccaagtg gcttgttatt tg
- 22
- <210> 9 <211> 25 <212> ADN <213> Solanum lycopersicum
- <400> 9 aactcgaata aattcaatgt ttcat
- 25
- <210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Solanum lycopersicum
- <400> 10 tcgattgatt ttacagggct aa
- 22
- <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Solanum lycopersicum
- <400> 11 taccggaacc gacaagccgg
- 20
- 1
Claims (4)
- REIVINDICACIONES1.-Uso de la mutación que consiste en la presencia de adenina, A, en lugar de timina, T, presente5 a. en la posición 1109 de la secuencia nucleotídica del gen nor del tomate SEQ ID NO: 1 ob. en la posición correspondiente con respecto a la posición 1109 de SEQ ID NO: 1, de secuencias que tienen una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO: 1,10 como marcador para identificar plantas de tomate que tienen el genotipo AA, cuyos frutos, que presentan características de durabilidad prolongada, se conservan durante un periodo de al menos 3 meses sin necesidad de refrigeración.
- 2.-El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que adicionalmente se selecciona la planta de tomate 15 identificada que presenta el genotipo AA en la posición 1109 como se describe en la reivindicación 1a o 1b.
- 3.-El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que adicionalmente se selecciona al menos una semilla de la planta de tomate identificada que presenta el genotipo AA en la posición 1109 como se describe en la reivindicación 1a o 1b.
- 4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la planta de tomate se clasifica taxonómicamente dentro de la especie Solanum lycopersicum.
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