ES2335392T3 - Plantas caracterizadas por crecimiento mejorado y metodo y construcciones de acido nucleico utiles para generar las mismas. - Google Patents
Plantas caracterizadas por crecimiento mejorado y metodo y construcciones de acido nucleico utiles para generar las mismas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2335392T3 ES2335392T3 ES02720425T ES02720425T ES2335392T3 ES 2335392 T3 ES2335392 T3 ES 2335392T3 ES 02720425 T ES02720425 T ES 02720425T ES 02720425 T ES02720425 T ES 02720425T ES 2335392 T3 ES2335392 T3 ES 2335392T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- plant
- growth
- promoter
- baselineskip
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Un método de crecimiento mejorado y/o producción comercial de una planta, el método comprende expresar dentro de la planta un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácido por lo menos 60% homóloga a aquella establecida en SEQ ID NOs: 5, 6 o 7.
Description
Plantas caracterizadas por crecimiento mejorado
y métodos y construcciones de ácido nucleico útiles para generar las
mismas.
La presente invención se relaciona con plantas
caracterizadas por crecimiento mejorado y con métodos y
construcciones de ácido nucleico útiles para generar las mismas.
El crecimiento y productividad de las plantas de
cultivo son los parámetros principales que se relacionan con un
crecimiento comercial. Tales parámetros se afectan mediante
numerosos factores que incluyen la naturaleza de la planta
específica y asignación de fuentes dentro de este, la disponibilidad
de fuentes en el ambiente de crecimiento e interacciones con otros
organismos que incluye patógenos.
El crecimiento y productividad de la mayoría de
las plantas de cultivo se limitan mediante la disponibilidad de
CO_{2} en el 1,5-bifosfato carboxilasaoxigenasa
ribulosa de enzima carboxilante (Rubisco). Tal disponibilidad se
determina mediante la concentración de ambiente de CO_{2} y
conductancia estomática, y la velocidad de fijación de CO_{2} por
Rubisco como se determina por el Km(CO_{2}) y V_{max} de
esta enzima [31-33].
En plantas C3, la concentración de CO_{2} en
el sitio de Rubisco es inferior al Km(CO_{2}) de la enzima,
particularmente bajo condiciones de carga de agua. Como tal, estas
plantas de cultivo exhiben una reducción sustancial en el
crecimiento y productividad cuando se expone a condiciones bajas de
CO_{2} inducidas por, por ejemplo, cerramiento estomático que se
puede originar mediante carga de agua.
Muchos microorganismos fotosintéticos son
capaces de concentrar CO_{2} en el sitio de Rubisco por lo tanto
superar la limitación impuesta mediante la baja afinidad de Rubisco
para CO_{2} [34].
Las plantas mayores del C4 y los grupos
fisiológicos CAM también pueden elevar la concentración de CO_{2}
en el sitio de Rubisco por medio de carboxilaciones duales que se
separan espacialmente (en C4) o en el tiempo (en CAM).
Ya que el crecimiento y productividad de la
planta especialmente en plantas C3 de cultivo son altamente
dependientes en disponibilidad de CO_{2} a Rubisco y velocidades
de fijación, se han hecho numerosos intentos para modificar
genéticamente las plantas con el fin de mejorar las concentraciones
o fijación de CO_{2} allí en espera de tal manera que la
modificación conduciría a un incremento en el crecimiento o
producción.
Como tal, numerosos estudios intentan introducir
los mecanismos de concentración de CO_{2} de bacterias
fotosintéticas o plantas C4 en plantas C3, con poco o ningún
suceso.
Por ejemplo, los estudios intentan modificar
genéticamente Rubisco con el fin de elevar su afinidad para CO_{2}
[35] y se ha descrito la transformación de una planta C3 (arroz)
con varios genes responsables para el metabolismo de C4
[36-40].
Aunque teóricamente tales métodos pueden
conducir a mejorar la fijación de CO_{2} en Plantas C3, los
resultados obtenidos de tales estudios han sido decepcionantes.
Existe así una amplia necesidad reconocida para,
y esto sería altamente ventajoso al tener, un método para generar
plantas que exhiben crecimiento mejorado y/o producciones
comerciales incrementadas.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención se proporciona el método de crecimiento mejorado y/o
producción comercial de una planta, el método comprende expresar
dentro de la planta un polipéptido que incluye una secuencia de
aminoácido por lo menos 60% homóloga a aquella establecida en SEQ ID
NOs:3, 5, 6 o 7 como se caracteriza en las reivindicaciones
adjuntas.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención se proporciona una planta transformada que expresa un
polipéptido que incluye una secuencia de aminoácido por lo menos 60%
homóloga a aquella establecida en SEQ ID NOs:5, 6 o 7 la planta
transformada caracterizada por un crecimiento mejorado cuando se
compara con crecimiento de planta no transformada similar bajo
condiciones de crecimiento similares.
De acuerdo con características adicionales en
realizaciones preferidas de la invención descritas adelante, la
planta se hace crecer en un ambiente caracterizado por humedad más
baja del 40%.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la planta se
hace crecer en un ambiente caracterizado por una concentración de
CO_{2} similar a o inferior que en el aire, (aproximadamente
0.035% CO_{2} en aire, y 10 micromolar CO_{2} en la
solución).
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas que expresan
el polipéptido dentro de la planta se efectúa al transformar por lo
menos una porción de las células de la planta con una construcción
de ácido nucleico que incluye una región de polinucleótido que
codifica el polipéptido.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas transformantes
se efectúa mediante un método seleccionado del grupo que consiste
de transformación mediada por agrobacterium, infección vírica,
electroporación y bombardeo de partícula.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la secuencia
de aminoácido es como se establece por SEQ ID NOs: 3, 5, 6, 7.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas que describen la
construcción de ácido nucleico incluye adicionalmente una segunda
región de polinucleótido que codifica un péptido transitorio.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas que describen la
construcción de ácido nucleico incluye adicionalmente una secuencia
promotora para dirigir la transcripción de la primera región de
polinucleótido.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas que describen la
construcción de ácido nucleico incluye adicionalmente una secuencia
promotora para dirigir la transcripción de la primera y segunda
regiones de polinucleótido.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas el promotor es
funcional en células eucarióticas.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas el promotor se
selecciona del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un
promotor inducible, un promotor desarrolladamente regulado y un
promotor específico de tejido.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la planta es
una planta C3.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la planta C3
se selecciona del grupo que consiste de tomate, soya, papa, pepino,
algodón, trigo, arroz, cebada, girasol, banana, tabaco, lechuga,
repollo, petunia, vara de oro y álamo. De acuerdo con todavía
características adicionales en las realizaciones preferidas
descritas la planta es una planta C4.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la planta C4
se selecciona del grupo que consiste de maíz, caña de azúcar y
sorgo.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la planta que
expresa el polipéptido se caracteriza por una velocidad de
crecimiento que es por lo menos 10% mayor que aquella de una planta
similar que no expresa el polipéptido cuando ambas se hacen crecer
bajo condiciones de crecimiento similares en donde el CO_{2} llega
al límite.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la velocidad
de crecimiento se determina mediante por lo menos un parámetro de
crecimiento seleccionado del grupo que consiste de peso fresco
incrementado, peso seco incrementado, crecimiento de raíz
incrementado, crecimiento de vástago incrementado y desarrollo de
flores durante el tiempo.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la planta
transformada se caracteriza adicionalmente por una producción
comercial incrementada cuando se compara con crecimiento de planta
no transformada similar bajo condiciones que limitan el CO_{2}
similares.
De acuerdo con aún otro aspecto de la presente
invención se proporciona una construcción de expresión de ácido
nucleico que comprende: (a) una primera región de polinucleótido que
codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos
por lo menos 60% homóloga a aquella establecida mediante SEQ ID Nos
:5, 6 o 7; y (b) una segunda región de polinucleótido funcional
como un promotor y que es para dirigir la transcripción de la
primera región de polinucleótido en células eucarióticas.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas el promotor se
selecciona del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un
promotor inducible y un promotor específico de tejido.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas el promotor es
un promotor de planta.
De acuerdo con todavía características
adicionales en las realizaciones preferidas descritas la primera
región de polinucleótido codifica adicionalmente un péptido
transitorio que se fusiona transduccionalmente al polipéptido.
La presente invención conduce exitosamente los
resultados de las configuraciones actualmente conocidas al
proporcionar plantas caracterizadas por crecimiento mejorado y por
métodos y construcciones de ácido nucleico útiles para generar los
mismos.
La invención se describe aquí, solo por vía de
ejemplo, con referencia a los dibujos que acompañan. La amplia
referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que
lo particular mostrado es por vía de ejemplo y solo para propósitos
de discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la
presente invención, y están presentes en la causa de proporciones
lo que se considera es más útil y la descripción fácilmente
entendida de los principios y aspectos conceptuales de la invención.
A este respecto, no se hace intento para mostrar detalles
estructurales de la invención en más detalle de los que son
necesarios para un entendimiento fundamental de la invención, la
descripción tomada con los dibujos hace evidente para aquellos
expertos en la técnica como las varias formas de la invención se
pueden realizar en la práctica.
En los dibujos:
Fig. 1 es una representación esquemática de una
región genómica en Synechococcus sp. PCC 7942 en donde una
inserción (indicada por una estrella) de un fragmento de colección
de inactivación conduce a la formación de IL-2
mutante. La secuencia de ADN está disponible en el GenBank, Número
de acceso U62616. Los sitios de restricción se marcan como:
A-ApaI, B-BamHI, Ei-EcoRI, E-EcoRV,
H-HincII, Hi-HindIII, K-KpnI, M-MfeI,
N-NheI, T-TaqI. Las letras destacadas representan la
posición terminada de los fragmentos de ADN que se utilizan como
sondas. Los fragmentos relevantes aislados de una colección EMBL3 se
marcan E1, E2 y E3. P1 y P2 son fragmentos obtenidos por PCR. Los
triángulos indican sitios donde se inserta un cartucho que codifica
Kanr. Los marcos de lectura abierta se marcan mediante una flecha y
se notan sus similitudes en otras proteínas. El Sll y slr (seguido
por cuatro dígitos) son los genes homólogos en Synechocystis
sp. PCC 6803 [23]; YZ02- myctu, No. de Acceso Q10536; ICC, No. de
Acceso P36650; Y128-SYNP6, No. de Acceso P05677;
YGGH, No. de Acceso P44648; factor A homólogo de unión de ribosoma a
s110754 y a P45141; O-acetilhomoserina sulfhidrilasa
homóloga a s110077 y NifS. ORF280 partiendo de la dirección 5' de la
representación esquemática presentada aquí.
Fig. 2 muestra alineación de la secuencia de
ácido nucleico entre ORF467 (ICTB, SEQ ID NO:2) y sIr1515 (SLR, SEQ
ID NO:4). Las líneas verticales indican identidad de nucleótido. Los
intervalos se indican por guiones. Se desarrolla alineación
utilizando el software Blast donde la falta de intervalo igual a 10
para existencia y 10 para extensión, emparejamiento promedio igual a
10 y error de emparejamiento promedio igual a -5. Los nucleótidos
idénticos iguales a 56%.
Fig. 3 muestra la alineación de la secuencia de
aminoácido entre la proteína IctB (ICTB, SEQ ID NO:3) y la proteína
codificada por sIr1515 (SLR, SEQ ID NO:5). Los aminoácidos idénticos
se marcan por su código de una letra entre las secuencias alineadas,
los aminoácidos similares se indican por un signo más. Se desarrolla
alineación utilizando el software Blast donde la falta abierta de
intervalo igual a 11, faltas de extensión de intervalo igual a 1 y
la matriz es blosum62. Los aminoácidos idénticos iguales a 47%,
aminoácidos similares iguales a 16%, homología total igual a
63%.
Figs. 4a-b son gráficas que
muestran las velocidades de CO_{2} y de captación HCO_{3} por
Synechococcus PCC 7942 (4a) y IL-2 mutante (4b) como
una función de la concentración Ci externa. LC y HC son células que
crecen bajo (aire) bajo o CO_{2} alto (5% de CO_{2} en aire),
respectivamente. Las velocidades se evalúan a partir de las
mediciones durante fotosíntesis de situación de equilibrio
utilizando un espectrómetro de masa de entrada de membrana (MIMS)
[6, 7, 22].
Fig. 5 presenta la comparación de homología de
secuencia de ADN de una región de ictB encontrada en Synechococcus
PCC 7942 y en IL-2 mutante. Esta región se duplica
en el mutante debido a un único evento de reticulación. Comparado
con el tipo intacto, un nucleótido adicional y una eliminación de
seis nucleótidos se encuentran en el lado BamHI, y 4 nucleótidos se
eliminan en el lado ApaI (ver Figura 1). Estos cambios resultan en
codones de parada en IctB después de 168 o 80 aminoácidos en los
lados BamHI y ApoI, respectivamente. La secuencia mostrada por esta
Figura inicia del aminoácido 69 de ictB.
Fig. 6 ilustra la construcción ictB utilizada
para generar plantas transgénicas de la presente invención, que
incluye un promotor 35S, el péptido transitorio (TP) de la subunidad
pequeña de guisante Rubisco (coordinados de nucleótido
329-498 de Número de acceso GeneBank x04334 donde
reemplazamos la G en la posición 498 con una T, la región
codificante ictB, la terminación NOS y resistencia a la canamicina
(KnR) dentro del vector binario pBI121 de
Clontech.
Clontech.
Fig. 7 es un análisis Northern de plantas
Arabidopsis y de tabaco tipo intacto y transgénicas (w) utilizando
ictB y 18S rADN como sondas.
Fig. 8 ilustra la velocidad de fotosíntesis como
se afecta por la concentración intercelular de CO_{2} en plantas
tipo intacto y las plantas de tabaco transgénicas de la presente
invención; las plantas 1 y 11 son transgénicas.
Fig. 9 ilustra los experimentos de crecimiento
conducidos en plantas Arabidopsis transgénicas (A, B y C) y tipo
intacto (WT). Cada mancha de crecimiento incluye una planta tipo
intacto y tres plantas transgénicas. Se proporcionan datos como el
peso seco promedio de las plantas +/- D.E. Las condiciones de
crecimiento se describen en la sección de Ejemplos.
La presente invención es de un método para
generar plantas caracterizadas por crecimiento mejorado y/o
producción de fruta y/o velocidad de florecimiento, de plantas
generadas por lo que, y de construcciones de ácido nucleico
utilizadas por tal un método. Específicamente, la presente invención
se puede incrementar sustancialmente la velocidad el crecimiento
y/o frutos, producción de plantas C3 especialmente cuando se hace
crecer bajo condiciones caracterizadas por baja humedad y/o una baja
concentración de CO_{2}.
Los principios y operación de la presente
invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y
descripciones que acompañan.
La invención es capaz de otras realizaciones o
de ser practicadas o llevadas a cabo en varias formas. También, se
entiende que la fraseología y terminología empleada aquí es para el
propósito de la descripción y no debe estar como limitante.
El incremento en la velocidad/tamaño de
crecimiento y/o producción comercial de las plantas de cultivo es de
primordial importancia especialmente en regiones en las que el
crecimiento/las condiciones de cultivo son subóptimas debido a una
carencia de, por ejemplo, agua.
Aunque reducir la presente invención para la
práctica los inventores han descubierto qué plantas expresan
polinucleótidos exógenos que codifican un transportador de carbono
inorgánico putativo se caracterizan por crecimiento mejorado,
especialmente cuando se hace crecer bajo condiciones caracterizadas
por baja humedad o bajas concentraciones de CO_{2}.
Así, de acuerdo con la presente invención se
proporciona una planta transformada que expresa un polipéptido que
incluye una secuencia de aminoácido que es por lo menos 60% homóloga
a aquella establecida en SEQ ID NO: 5, 6 o 7.
La planta transformada de la presente invención
se caracteriza por crecimiento mejorado cuando se compara con
crecimiento de planta no transformada similar bajo condiciones de
crecimiento similares.
Como se utiliza aquí, la frase "crecimiento
mejorado" se refiere a una velocidad de crecimiento mejorado, o
a un tamaño/peso de crecimiento incrementado de la planta completa o
preferiblemente la porción comercial de la planta (producción
incrementada) como se determina por peso fresco, peso seco o tamaño
de la planta o porción comercial del mismo.
Como es el detalle adicional en la sección de
Ejemplos que sigue, la planta transformada de la presente invención
exhibe, por ejemplo, una velocidad de crecimiento que es por lo
menos 10% mayor que aquella de una planta transformada no similar
cuando ambas plantas se hacen crecer bajo condiciones de crecimiento
similares.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, el polipéptido es por lo menos 60%,
preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos
70%, todavía más preferiblemente por lo menos 75%, aún más
preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos
85%, más preferiblemente por lo menos 90%, aún más preferiblemente
por lo menos 95%, idealmente 95-100% homóloga
(idéntico + similar) a la SEQ ID NO: 3, 5, 6 o 7 o una porción del
mismo como se determina utilizando el software Blast donde la falta
abierta de el intervalo es igual a 11, extensión gap, falta igual a
1 y la matriz es blosum62.
De acuerdo con las realizaciones preferidas de
la presente invención, las condiciones de crecimiento se
caracterizan por humedad de por lo menos 40% y/o concentración de
CO_{2} que es inferior en aire.
La planta transformada de la presente invención
puede ser cualquier planta que incluye, pero no se limita a, planta
C3 tal como, por ejemplo, tomate, soya, papa, pepino, algodón,
trigo, arroz, cebada o Planta C4, tal como, por ejemplo, maíz, caña
de azúcar, sorgo y otros.
La planta transformada de la presente invención
se genera al introducir una molécula de ácido nucleico o
polinucleótido que codifica el polipéptido descrito anteriormente en
las células de la planta.
Tal una molécula de ácido nucleico o
polinucleótido puede tener una secuencia que corresponde a por lo
menos una porción de SEQ ID NO:2, 4, 8 o 9 la porción que codifica
un polipéptido que contribuye al rasgo de crecimiento
incrementado.
Alternativamente o adicionalmente la molécula de
ácido nucleico puede tener una secuencia que es por lo menos 60%,
preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos
70%, todavía más preferiblemente por lo menos 75%, aún más
preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos
85%, más preferiblemente por lo menos 90%, aún más preferiblemente
por lo menos 95%, idealmente 95-100% idéntica a
aquella porción, como se determina utilizando el software Blast
donde las faltas el intervalo son iguales 10 para existencia y 10
para extensión, emparejamiento promedio igual a 10 y error de
emparejamiento promedio igual a -5. Se apreciará a este respecto
que la SEQ ID NO:2, 4, 8 o 9 se puede utilizar fácilmente para
aislar las secuencias homólogas que se pueden probar como se
describe en la sección de Ejemplos que sigue para su actividad de
transporte de bicarbonato. Métodos para aislar tales secuencias
homólogas se describen extensivamente en, por ejemplo, Sambrook
et al. [9] y pueden incluir hibridación y amplificación de
PCR.
Todavía alternativamente o adicionalmente la
molécula de ácido nucleico puede tener una secuencia capaz de
hibridar con la porción de la SEQ ID NO:2, 4, 8 o 9. La hibridación
para ácidos nucleicos grandes (por ejemplo, por encima de 200 bp en
longitud) se efectúa de acuerdo con las realizaciones preferidas de
la presente invención mediante hibridación exigente o moderada, en
donde la hibridación exigente se efectúa mediante una solución de
hibridación que contiene 10% de sulfato de dextrano, 1 M NaCl, I%
SDS y 5x106 cpm 32p de sonda marcada, a 65ºC, con una solución de
lavado final de 0.2 x SSC y 0.1% SDS y lavado final a 65ºC; aunque
la hibridación moderada se efectúa mediante una solución de
hibridación que contiene 10% sulfato de dextrano, 1 M NaCl, 1% SDS
y 5 x 106 cpm 32p de sonda marcada, a 65ºC, con una solución de
lavado final de 1 x SSC y 0.1% SDS y lavado final a 50ºC.
Preferiblemente, el polipéptido codificado por
la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluye un
péptido transitorio de terminal N fusionado a este que sirve para
dirigir el polipéptido a una membrana específica. Tal una membrana
puede ser, por ejemplo, la membrana celular, en donde el polipéptido
servirá para transportar el bicarbonato del apoplasto en el
citoplasma, o, tal una membrana puede ser externa y preferiblemente
la membrana de cloroplasto interna. Los péptidos transitorios como
se describe aquí son bien conocidos en la técnica. La descripción
adicional de tales péptidos transitorios se encuentra en, por
ejemplo, Johnson et al. Plant Cell (1990)
2:525-532; Sauer et al. EMBO J. (1990)
9:3045-3050; Mueckler et al. Science (1985)
229:941-945; Von Heijne, Eur. J. Biochem. (1983)
133:17-21; Yon Heijne, J. Mol. Biol. (1986) 189:
239-242; Iturriaga et al. Plant Cell (1989)
1:381-390; McKnight et al., Nucl. Acid Res.
(1990) 18:4939-4943; Matsuoka y Nakamura, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:834-838. A recent
text book entitled "Recombinant proteins from plants", Eds. C.
Cunningham y A.J.R. Porter, 1998 Humana Press Totowa, N.J. describe
métodos para la producción de proteínas recombinantes en plantas y
métodos para objetivar las proteínas a diferentes compartimientos en
la célula de planta. El texto por Cunningham y Porter se incorpora
aquí como referencia. Sin embargo se apreciará por un experto en la
técnica que un gran número de proteínas integradas de membrana
falla en poseer un péptido transitorio removible. Se acepta que en
tales casos una cierta secuencia de aminoácido en dichas proteínas
sirve no solo como una porción estructural de la proteína, pero
también como un péptido transitorio.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico
de la presente invención se incluye dentro de una construcción de
ácido nucleico designada como un vector para células de planta
transformantes por lo que permite la expresión de la molécula de
ácido nucleico dentro de tales células.
La expresión de la planta se puede efectuar al
introducir la molécula de ácido nucleico de la presente invención
(preferiblemente utilizando la construcción de ácido nucleico) en la
dirección 3' de un promotor de planta presente en secuencias de
polinucleótido organelo o genómico endógeno (por ejemplo,
cloroplasto o mitocondria), por lo que permite la expresión del
mismo dentro de las células de la planta.
En tales casos, la construcción de ácido
nucleico incluye adicionalmente secuencias que permiten
"knock-in" la molécula de ácido nucleico en
regiones de polinucleótido específico o aleatorizado de tales
secuencia de polinucleótido genómico u organelo.
Preferiblemente, la construcción de ácido
nucleico de la presente invención incluye adicionalmente un promotor
de planta que sirve para dirigir la expresión de la molécula de
ácido nucleico dentro de células de planta.
Como se utiliza aquí en la especificación y en
la sección de reivindicaciones que permite la frase "promotor de
planta" incluye un promotor que puede dirigir la expresión de gen
en células de planta (que incluye organelos que contienen ADN). Tal
un promotor se puede derivar de una planta, bacteria, origen vírico,
fúngico o animal. Tal un promotor puede ser constitutivo, es decir,
capaz de dirigir alto nivel de la expresión de gen en una
pluralidad de tejidos de planta, específico de tejido, es decir,
capaz de dirigir la expresión de gen en un tejido o tejidos de
planta particular, inducible, es decir, capaces de dirigir la
expresión de gen bajo a estímulo, o quimérico.
Así, el promotor de planta empleado puede ser un
promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, un promotor
inducible o un promotor quimérico.
Ejemplos de promotor constitutivo de plantas
incluyen, sin limitación, promotores CaMV35S y CaMV19S, promotor
FMV34S, promotor badnavirus sugarcane bacilliforme, promotor CsVMV,
promotor Arabidopsis ACT2/ACT8 actina, promotor Arabidopsis
ubiquitina UBQ1, promotor de hoja de cebada tionina BTH6, promotor y
promotor arroz actina.
Ejemplos de promotores específicos de tejido
incluyen, sin estar limitado a, proteína de almacenamiento faseolín
de fríjol, promotor DLEC, promotor PHSb, promotor de proteína de
almacenamiento zeína, promotor conglutina gama de soya, gen AT2S1,
promotor actina ACT11 de Arabidopsis, promotor napa de Brassica
napus y promotor de gen de papa patatina.
El promotor inducible es un promotor inducido
por un estímulo específico tal como condiciones de tensión que
comprende, por ejemplo, luz, temperatura, químicos, sequía, alta
salinidad, choque osmótico, condiciones oxidantes o en el caso de
patogenicidad e incluyen, sin estar limitado a, el promotor
inducible por luz del gen de guisante rbcS, el promotor del gen
alfalfa rbcS, los promotores DRE, MYC y MYB activo en sequía; los
promotores INT, INPS, prxEa, Ha hsp 17.7G4 y RD21 activos en alta
salinidad y tensión osmótica, y los promotores hsr203J y str246C
activo en tensión patogénica.
La construcción de ácido nucleico de la presente
invención preferiblemente incluye adicionalmente regiones de
polinucleótido que proporcionan un origen de replicación
procariótico de amplio rango anfitrión; un marcador seleccionable
procariote; y, para transformaciones de Agrobacterium, la secuencia
T de ADN para transferencia mediada por Agrobacterium a cromosomas
de planta. Donde la secuencia heteróloga no es fácilmente
susceptible a la detección, la construcción preferiblemente también
tendrá un gen de marcador seleccionable adecuado para determinar si
una célula de planta se ha transformado. Una revisión general de
marcadores adecuados para los miembros de la familia de pasto se
encuentra en Wilmink y Dons, Plant Mol. Biol. Reptr. (1993)
11:165-185.
Los marcadores seleccionables de procariota
adecuados incluyen resistencia hacia los antibióticos tal como
ampicilina, canamicina o tetraciclina. Otras secuencias de ADN que
codifican las funciones adicionales también pueden estar presentes
en el vector, como se muestra en la técnica.
También se recomiendan las secuencias adecuadas
para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma
de planta. Esto puede incluir secuencias de transposón así como
también secuencias Ti que permiten la inserción aleatoria de un
casete de expresión heterólogo en un genoma de planta.
La construcción de ácido nucleico de la presente
invención se puede utilizar para establecer o transformar
transitoriamente células de planta. En la transformación estable, la
molécula de ácido nucleico de la presente invención se integra en
el genoma de la planta y como tal este representa un rasgo estable y
hereditario. En la transformación transitoria, la molécula de ácido
nucleico se expresa por la célula transformada pero no se integra en
el genoma y como tal representa un rasgo transitorio.
Existen varios métodos para introducir genes
forasteros en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas (Potrykus,
I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991)
42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989)
338: 274-276).
Los métodos principales para originar
integración estable de ADN exógeno en ADN genómico de planta
incluyen dos investigaciones principales:
- (i)
- Transferencia de gen mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee androgens in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.
- (ii)
- captación ADN directo: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; que incluye métodos para la captación directa de ADN en protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074. captación ADN inducida por breve choque eléctrico de células de planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Inyección de ADN en células de planta o tejidos mediante bombardeo de partícula, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; por el uso de sistemas micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; o mediante la incubación directa de ADN con polen germinado, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. y Mantell, S. H. y Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; y Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema Agrobacterium incluye el uso de
vectores de plásmido que contienen segmentos de ADN definidos que
integran en el ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación
del tejido de la planta varían dependiendo de las especies de
plantas y el sistema de suministro de Agrobacterium. Un amplio
alcance utilizado es el procedimiento de disco de hoja que se puede
desarrollar con cualquier explante de tejido que proporciona una
buena fuente para el inicio de diferenciación de planta completa.
Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer
Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Un
alcance complementario emplear el sistema de suministro
Agrobacterium en combinación con infiltración por vacío. El sistema
Agrobacterium es especialmente viable en la creación de plantas
dicotiledóneas transgénicas.
\newpage
Existen varios métodos de transferencia de ADN
directa en células de planta. En electroporación, los protoplastos
se exponen brevemente a un campo eléctrico fuerte. En
microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente directamente en las
células utilizando micropipetas muy pequeñas. En microbombardeo de
partícula, el ADN se adsorbe en microproyectiles tal como cristales
de sulfato magnesio o partículas de tungsteno, y los
microproyectiles se aceleran físicamente en células o tejidos de
planta.
Se ejecuta propagación de planta luego de la
transformación estable. El método más común de propagación de
planta es mediante semilla. La regeneración mediante propagación de
semilla, sin embargo, tiene la deficiencia que debido a la
heterozigosidad existe una carencia de uniformidad en el cultivo, ya
que se producen semillas por plantas de acuerdo con las varianzas
genéticas gobernadas por las reglas Mendelianas. Básicamente, cada
semilla es genéticamente diferente y cada uno crecerá con sus
propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la planta
transformada a ser producida de tal manera que la planta regenerada
tiene rasgos idénticos y características de la planta transgénica
progenitora. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada
se regenere mediante micropropagación que proporciona una
reproducción consistente rápida de las plantas transformadas.
La micropropagación es un proceso de crecimiento
para nueva generación de plantas de una pieza única de tejido que
se ha cortado de una planta progenitora seleccionada o cultivo. Este
proceso permite la reproducción de masa de plantas que tienen el
tejido preferido que expresa la proteína de fusión. La nueva
generación de plantas que se producen son genéticamente idénticos
a, y tienen todas las características de, la planta original. La
micropropagación permite la producción en masa de calidad de
material de planta en un periodo corto de tiempo y ofrece una
multiplicación rápida de cultivadores seleccionados en la
conservación de las características de la planta transgénica o
transformada original. Las ventajas para clonar plantas son la
velocidad de multiplicación de planta y la calidad y uniformidad de
plantas producidas.
La micropropagación es un procedimiento de
múltiples etapas que requiere alteración de medio de cultivo o las
condiciones de crecimiento entre las etapas. Así, el proceso de
micropropagación involucra cuatro etapas básicas: etapa uno,
cultivar tejido inicial; etapa dos, multiplicación del cultivo de
tejido; etapa tres, diferenciación y formación de planta; y etapa
cuatro, cultivo de invernadero y endurecimiento. Durante la etapa
uno, el cultivo de tejido inicial, el cultivo de tejido se establece
y está libre de contaminante certificado. Durante la etapa dos, el
cultivo de tejido inicial se multiplica hasta que se produce un
número suficiente de muestras de tejido para cumplir las metas de
producción. Durante la etapa tres, las muestras de tejido que
crecen en la etapa dos se dividen y se hacen crecer en plántulas
individuales. En la etapa cuatro, las plántulas transformadas se
transfieren a un invernadero para endurecimiento donde la tolerancia
de las plantas a la luz se incrementa gradualmente ya que se puede
hacer crecer en ambiente natural.
Aunque la transformación estable se prefiere
actualmente, la transformación transitoria de células de hoja,
células meristemáticas o la planta completa también se prevé
mediante la presente invención.
La transformación transitoria se puede efectuar
mediante cualquiera de los métodos de ADN directos descritos
anteriormente o mediante infección vírica utilizando virus de planta
modificados.
Los virus que se han mostrado por ser útiles
para la transformación de anfitriones de planta incluyen CaMV, TMV
y BV. La transformación de plantas utilizando virus de planta se
describe en la Patente Estadounidense No. 4,855,237 (BGV),
EP-A 67,553 (TMV), la Solicitud Publicada Japonesa
No. 63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667
(BV); y Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular
Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,
pp. 172-189 (1988). Las partículas de seudovirus
para uso en la expresión de ADN forastero en muchos anfitriones, que
incluye plantas, se describe en WO 87/06261.
Construcción de virus de ARN de planta para la
introducción y expresión de secuencias de ácido nucleico exógeno no
víricos en plantas se demuestra pro las referencias anteriores así
como también por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:
285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987)
6:307-311; French et al. Science (1986)
231:1294-1297; y Takamatsu et al. FEBS
Letters (1990) 269:73-76.
Cuando los virus es un virus de ADN, las
modificaciones adecuadas se pueden hacer por los virus en sí mismos.
Alternativamente, el virus primero se puede clonar en un plásmido
bacteriano para cada construcción del vector vírico deseado con el
ADN forastero. El virus luego se puede cortar del plásmido. Si el
virus es un virus de ADN, un origen bacteriano de replicación se
puede adherir al ADN vírico, que luego se replica por la bacteria.
La transcripción y traducción de este ADN producirá la proteína
recubierta que encapsulará el ADN vírico. Si el virus es un virus
de ARN, el virus se clona generalmente como un cADn y se inserta en
un plásmido. El plásmido luego se utiliza para hacer todas las
construcciones. El virus de ARN luego se produce al transcribir la
secuencia vírica del plásmido y la traducción de los genes víricos
para producir las proteínas de recubrimiento que encapsulan el ARN
vírico.
La construcción de virus de ARN de planta para
la introducción y expresión en plantas de secuencias de ácido
nucleico exógeno no vírico tal como aquellos que se incluyen en la
construcción de la presente invención se demuestra por las
referencias anteriores así como también en la Patente Estadounidense
No. 5,316,931.
En una realización, se proporciona un ácido
nucleico vírico de planta en el que la secuencia codificante de
proteína recubierta nativa se ha eliminado de un ácido nucleico
vírico, una secuencia que codifica la proteína de recubrimiento
vírico de planta no nativa y una no nativa, el promotor
preferiblemente el promotor subgenómico de la secuencia que
codifica la proteína de recubrimiento no nativa, capaz de expresión
en el anfitrión de planta, empaque del ácido nucleico vírico de
planta recombinante, y asegurar una infección sistémica del
anfitrión mediante el ácido nucleico vírico de planta recombinante,
se ha insertado. Alternativamente, el gen de proteína de
recubrimiento se puede inactivar mediante inserción de la secuencia
de ácido nucleico no nativa dentro de este, de tal manera que se
produce una proteína. El ácido nucleico vírico de planta
recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no
nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo es capaz
de transcribir o expresar genes adyacentes o secuencias de ácido
nucleico en el anfitrión de planta e incapaz de recombinación uno
con el otro y con promotores subgenómicos nativos. Se pueden
insertar secuencias de ácido nucleico no nativas (forasteras)
adyacentes al promotor subgenómico vírico de planta nativa o los
promotores subgenómicos víricos de planta nativo y no nativo si se
incluye más de una secuencia de ácido nucleico. Las secuencias de
ácido nucleico no nativas se transcriben o se expresan en la planta
anfitriona bajo control del promotor subgenómico para producir los
productos deseados.
En una segunda realización, un ácido nucleico
vírico de planta recombinante se proporciona como la primera
realización excepto que la secuencia que codifica la proteína
recubierta nativa se coloca adyacente uno de los promotores
subgenómicos de proteína recubierta no nativa en lugar de una
secuencia que codifica la proteína de recubrimiento no nativa.
En una tercera realización, se proporciona un
ácido nucleico vírico de planta recombinante en el que el gen de
proteína recubierta nativo es adyacente de su promotor subgenómico y
uno o más promotores subgenómicos no nativos se han insertado en el
ácido nucleico vírico. Los promotores subgenómicos no nativos
insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes
en un anfitrión de planta y son capaces de recombinación con cada
uno y con promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de ácido
nucleico no nativos se puede insertar adyacentes a los promotores
víricos de planta subgenómica no nativos de tal manera que dichas
secuencias se transcriben o se expresan en la planta anfitriona
bajo control de los promotores subgenómicos para producir el
producto deseado.
En una cuarta realización, se proporciona un
ácido nucleico vírico de planta recombinante como en la tercera
realización excepto que la secuencia que codifica la proteína de
recubrimiento nativa se reemplaza por una secuencia que codifica la
proteína de recubrimiento no nativa.
Los vectores víricos se encapsulan mediante
proteínas de recubrimiento codificadas por el ácido nucleico vírico
de planta recombinante para producir un virus de planta
recombinante. El ácido nucleico vírico de planta recombinante o
virus de planta recombinante se utiliza para infectar plantas
anfitrionas adecuadas. El ácido nucleico vírico de planta
recombinante es capaz de replicación en el anfitrión, rociado
sistémico en el anfitrión, y la transcripción o expresión de genes
forasteros (ácido nucleico aislado) en el anfitrión para producir la
proteína deseada.
En adición a lo anterior, la molécula de ácido
nucleico de la presente invención también se puede introducir en un
genoma cloroplasto por el que se permite la expresión de
cloroplasto.
Se conoce una técnica para introducir secuencias
de ácido nucleico exógenas para el genoma de los cloroplastos. Esta
técnica involucra los siguientes procedimientos. Primero, las
células de planta se tratan químicamente para reducir el número de
cloroplastos por célula a aproximadamente uno. Luego, el ácido
nucleico exógeno se introduce por vía de bombardeo de partícula en
las células con la ayuda de introducir por lo menos una molécula de
ácido nucleico exógena en los cloroplastos. El ácido nucleico
exógeno se selecciona de tal manera que este es integrable en el
genoma de cloroplasto por vía de recombinación homóloga que se
efectúa fácilmente por enzimas inherentes al cloroplasto. Para este
fin, el ácido nucleico exógeno incluye, en adición a un gen de
interés, por lo menos una resistencia de ácido nucleico que se
deriva del genoma de cloroplasto. Adicionalmente, el ácido nucleico
exógeno incluye un marcador seleccionable, que sirve mediante
procedimientos de selección secuencial para asegurar que todas o
sustancialmente todas las copias de los genomas de cloroplasto luego
de tal sección incluirá el ácido nucleico exógeno. Se encuentran
detalles adicionales relacionados con esta técnica en la Patente
Estadounidense Nos. 4,945,050; y 5,693,507 que se incorporan aquí
como referencia. Un polipéptido así se puede producir por el
sistema de expresión de proteína del cloroplasto y se llega a
integrar en la membrana interna de cloroplasto.
Así, la presente invención proporciona métodos,
construcciones de ácido nucleico y plantas transformadas generadas
utilizando tales métodos y construcciones, cuyas plantas
transformadas se caracterizan por una velocidad de crecimiento
mejorada y/o producción comercial incrementada.
Lo objetos adicionales, ventajas, y
características novedosas de la presente invención serán evidentes
para un experto en la técnica luego del examen de los siguientes
ejemplos; que no están destinados a ser limitantes. Adicionalmente,
cada una de las varias realizaciones y aspectos de la presente
invención como se destacó aquí anteriormente y como se reivindica
en la sección de reivindicaciones adelante encuentra soporte
experimental en los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ahora se hace referencia a los siguientes
ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la
invención.
Generalmente, la nomenclatura utilizada aquí y
los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente
invención incluyen las técnicas molecular, bioquímica,
microbiológica y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican
vigorosamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular
Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989);
"Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes
I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et
al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley y
Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to
Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988);
Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American
Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A
Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como
se establece en la Patente Estadounidense Nos. 4,666,828;
4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A
Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.
E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic
Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y.
(1994), Tercera Edición; "Current Protocols in Immunology"
Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites
et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th
Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y
Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H.
Freeman y Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se
describen extensivamente en la patente y literatura científica, ver,
por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 3,791,932; 3,839,153;
3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654;
3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219;
5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.
J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y
Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation"
Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell
Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and
Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular
Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol.
1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To
Methods and Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990);
Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and
Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996);
todas las cuales se incorporan como referencia como se establece
completamente aquí. Otras referencias generales se proporcionan a
través de este documento. Los procedimientos allí se consideran por
ser conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia
del escritor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos de la cepa Synechococcus sp.
PCC 7942 y IL.-2 mutante del mismo se hacen crecer a 30ºC en medio
BG11 complementado con 20 mM de Hepes-NaOH pH 7.8 y
25 \mug mL-1 canamicina (en el caso del mutante).
El medio se airea con 5% v/v CO_{2} en aire (CO_{2} alto) o
0.0175% v/v CO_{2} en aire (CO_{2} bajo) que se prepara al
mezclar aire con aire libre de CO_{2} en una relación 1:1. Se
hacen crecer Escherichia coli (cepa DH5o) en un medio LB [9]
complementado con canamicina (50 \mug/mL) o ampicilina (50
\mug/mL) cuando se requiera.
\vskip1.000000\baselineskip
Las velocidades de evolución de O_{2}
dependiente de carbono inorgánico (Ci) se miden por un electrodo de
O_{2} como se describe en otro lugar [10] y mediante un
espectrómetro de masa de entrada de membrana (MIMS, [6, 11]). El
MIMS también se utiliza para evaluaciones de captación de CO_{2} y
HCO_{3} durante fotosíntesis en situación de equilibrio [6]. El
"Fluke" de Ci luego del suministro de CO_{2} o HCO_{3} se
determinan mediante la técnica de centrifugación de filtrado [10].
Se transfieren células que crecen en CO_{2} alto en la fase log
del crecimiento a CO_{2} bajo o alto 12 horas antes de conducir
los experimentos. Luego se cosechar, las células se resuspenden en
25 mM Hepes-NaOH pH 8.0 y se airean con aire
(concentración Ci es aproximadamente 0.4 mM) bajo flujo de luz de
100 Pmol fotón quanta m-2 s-1. Las
alícuotas se retiran, colocadas inmediatamente en tubos de
microfuga y se mantienen bajo condiciones de temperatura y luz
similares. Las cantidades pequeñas de 14C-CO_{2}
o 14C-HCO_{3} - que no afectan la concentración
final de Ci, se inyectan, y la captación Ci termina después de 5
segundos mediante centrifugación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aísla ADN genómico como se describe en otro
lugar [12]. Se utilizan técnicas de ADN recombinante estándar para
clonación y análisis Southern [12-13] utilizando el
Equipo de Marca de ADN Sensible Aleatorizada o el sistema DIG
(Boehringer, Mannheim). Se desarrolla análisis de secuencia
utilizando el equipo de secuenciamiento de ciclo terminador de
Tinte, ABI Prism (377 secuenciamiento de ADN Perkin Elmer). La
colección genómica utilizada aquí se construye utilizando un equipo
de vector Lambda EMBL3/BamHI disponible de Stratagene (La Jolla,
CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Una modificación del método desarrollado por
Dolganov y Grossman [14] se utiliza para elevar y aislar nuevos
mutantes que requieren CO_{2} alto [4, 5]. En resumen, se digiere
ADN genómico con TaqI y se liga en el sitio AccI del
poliaglutinante de un plásmido Bluescript SK modificado. El gen de
transmisión bluescript para conferir resistencia a la ampicilina se
inactiva mediante la inserción de un cartucho que codifica
resistencia a la canamicina (Kanr, [8]) (dentro del sitio ScaI). La
cepa Synechococcus sp. de células PCC 7942 se transfectan
con la colección [12]. Los eventos cruzados únicos que confieren
Kanr conducen a la inactivación de varios genes. Las células Kanr
se exponen a condiciones bajas de CO_{2} durante 8 horas para
adaptación, seguido por un tratamiento con ampicilina (400
\mug/mL) durante 12 horas. Las células que son capaces de adaptar
al CO_{2} bajo y así capaces de crecer bajo estas condiciones se
eliminan mediante este tratamiento. El mutante que requiere
CO_{2} alto, IL-2, incapaz de dividir bajo
condiciones bajas de CO_{2}, sobrevive, y se rescata luego de la
remoción de ampicilina y el crecimiento en la presencia de
concentración alta de CO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN aislado del mutante se digiere con ApaI
ubicado en un lado del sitio AccI en el poliaglutinante; con BamHI
o EcoRI, ubicado en el otro lado del sitio AccI; o con MfeI que no
divide el vector o el cartucho Kanr. Estas enzimas también dividen
el ADN genómico. El ADN digerido se autoliga luego de la
transfección de células competentes E. coli (cepa DH5a). Las
colonias Kanr que llevan las secuencias de vector que llevan el
origen de replicación, el cartucho Kanr y parte del gen inactivado
luego se aíslan. Este procedimiento se utiliza para clonar las
regiones de flanqueo en ambos lados del vector insertado en el
mutante. Los fragmentos 1.3 Kbp ApaI y 0.8 Kbp BamHI aislados de
los plásmidos (un sitio ApaI y sitio BamHI originado del
polireticulador del vector) se utilizan como sondas para
identificar los clones relevantes en una colección genómica EMBL3
del genoma tipo intacto, y por análisis Southern. La ubicación de
estos fragmentos en el genoma tipo intacto (SEQ ID NO:1) se muestra
esquemáticamente en la Figura 1. El fragmento ApaI están entre las
posiciones 1600 a 2899 (de SEQ ID NO:1), marcado como T y A en la
Figura 1; el fragmento de BamHI está entre las posiciones 4125 a
4957 (de SEQ ID NO:1) marcado como B y T en la Figura 1. El
fragmento 0.8 Kbp BamHI hibridado con el fragmento 1.6 Kbp HincII
(marcado E3 en la Figura 1). El fragmento 1.3 Kbp ApaI hibridado con
un fragmento EcoRI de aproximadamente 6 Kbp. De forma interesante,
este fragmento no se puede clonar de la colección genómica en E.
coli. Por lo tanto, el sitio BamHI se utiliza (posición 2348,
SEQ ID NO:1, Figura 1) para dividir el clon EMBL3 en dos fragmentos
clonables de 4.0 y 1.8 Kbp (E1 y E2, respectivamente, el E1 inicia
de un sitio Sau3A en la dirección 5' del sitio HindIII posicionado
al inicio de la Figura 1). La conformación que estos tres
fragmentos de hecho se ubican como se muestra en la Figura 1 se
obtiene mediante PCR utilizando ADN tipo intacto como plantilla,
que conduce a la síntesis de los fragmentos P1 y P2 (Figura 1). El
análisis de secuencia posibilita la comparación de la región
relevante en IL-2 con la secuencia correspondiente
en el tipo intacto.
\vskip1.000000\baselineskip
El IL-2 mutante crece tanto como
las células tipo intacto en la presencia de alta concentración de
CO_{2} pero es incapaz de crecer bajo CO_{2} bajo. El análisis
de la velocidad fotosintética como una función de la concentración
externa Ci revela que la afinidad fotosintética evidente del
IL-2 mutante es 20 mM Ci, que es aproximadamente
100 veces mayor que la concentración de Ci en las condiciones bajas
de CO_{2}. Las curvas relacionadas con la velocidad fotosintética
como una función de la concentración de Ci, en IL-2,
son similares a aquellas obtenidas con otros mutantes que requieren
CO_{2} alto de Synechococcus PCC 7942 [16, 17]. Estos datos
sugieren que la incapacidad de IL-2 para crecer bajo
CO_{2} bajo es debido al desarrollo fotosintético pobre de este
mutante.
Los mutantes que requieren CO_{2} alto
muestran que las características se reconocen entre los mutantes
que llevan carboxisomas aberrantes [9, 10, 12, 18, 19] o defectuosos
en energización de captación Ci [20, 21]. Todos los mutantes
defectuosos carboxisoma caracterizados por los datos son capaces de
acumular Ci dentro de las células de forma similar a las células
tipo intacto. Sin embargo, ellos son incapaces de utilizar este
eficientemente en la fotosíntesis debido a que el estado de baja
activación de rubisco en células mutantes se expone a CO_{2} bajo
[10]. Este no es el caso para IL-2 mutante que posee
carboxisomas normales pero exhibe captación HCO_{3} deteriorada
(Tabla 1, Figuras 4a-b). Las mediciones de
acumulación de 14Ci indican que la captación HCO_{3} y CO_{2}
son similares en el tipo intacto y mutante de crecimiento de
CO_{2} alto (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La velocidad del CO_{2} y de la captación
HCO_{3} en Synechococcus sp. El PCC 7942 y
IL-2 mutante como se afecta por la concentración de
CO_{2} en el medio de crecimiento. La captación de CO_{2} o
HCO_{3} unidireccional de células que crecen bajo condiciones
altas en CO_{2} o se expone a CO_{2} bajo durante 12 horas se
presenta en P mole Ci acumulado dentro de las células mg^{-1} Chl
h^{-1}. Los resultados presentados son el promedio de tres
experimentos diferentes, con cuatro replicas en cada experimento, el
rango de los datos está dentro de \pm10% del promedio. WT - tipo
intacto.
\newpage
La captación HCO_{3} mediante células tipo
intacto incrementada mediante aproximadamente 6 veces luego de
exposición a condiciones bajas de CO_{2} durante 12 horas. Por
otra parte, el mismo tratamiento resulta en solo hasta un
incremento de 2 veces en la captación HCO_{3} para el IL- 2
mutante. La captación de CO_{2} se incrementa en aproximadamente
50% para el IL-2 mutante y el tipo intacto luego de
transferir de condiciones bajas a altas de CO_{2}. Estos datos
indican que el transporte de HCO_{3} y no la captación de CO_{2}
se deteriora en IL-2 mutante.
El V_{max} de la captación HCO_{3}, estimado
por MIMS [7, 22] en fotosíntesis en situación de equilibrio (Figura
4a), es 220 y 290 Pmol HCO_{3} - mg^{-1} Chl h^{-1} para
crecimiento tipo intacto de CO_{2} alto y bajo, respectivamente, y
la tabla K_{1/2} correspondiente (HCO_{3}) son 0.3 y 0.04 mM
HCO_{3}, respectivamente. Estos estimados están en acuerdo
cercano con aquellos reportados antes [7]. En IL-2
mutante que crece en CO_{2} alto, por otra parte, el sistema de
transporte HCO_{3} es evidentemente inactivo. La curva
relacionada a la velocidad de transporte HCO_{3} como una función
de su concentración no se parece a las cinéticas saturables
esperadas (observado para el tipo intacto), pero es cercano a una
dependencia lineal como se espera en un proceso que media la
difusión (Figura 4b). Es esencial elevar la concentración de
HCO_{3} - en el medio a valores tal altos como 25 mM con el fin
de alcanzar velocidades de captación HCO_{3} similares al
V_{max} descrito por el tipo intacto.
El V_{max} estimado de captación de CO_{2}
mediante IL-2 y tipo intacto que crece en CO_{2}
alto es similar para cerca de 130-150 \mumol
CO_{2} mg^{-1} Chl h^{-1} y los valores K_{1/2} (CO_{2})
están alrededor de 5 \muM (Figuras 4a-b), que
indican que la captación de CO_{2} es menos afectado por la
mutación de IL-2. Las células mutantes que se
exponen a CO_{2} bajo durante 12 horas muestra cinéticas
saturables para la captación HCO_{3} que sugiere el
involucramiento de un portador. Sin embargo, el K_{1/2}
(HCO_{3}-) es 4.5 mM HCO_{3} - (es decir, 15- y 100 veces
inferior a tipo intacto que crece en CO_{2} bajo y alto,
respectivamente) y el V_{max} es aproximadamente 200 Pmol
HCO_{3}- mg^{-1} Chl h^{-1}. Estos datos indican que la
presencia de un transportador HCO_{3} de baja afinidad que se
activa o utiliza luego de la inactivación de la captación HCO_{3}
de alta afinidad en el mutante. La actividad del transportador de
baja afinidad resulta en las cinéticas de transporte saturable
observadas en el mutante expuesto a CO_{2}. Estos datos
demuestran adicionalmente que el mutante es capaz de responder a la
señal de CO_{2} baja.
La razón para la discrepancia entre los datos
obtenidos mediante los dos métodos utilizados, con respecto a la
captación HCO_{3} en captación células mutantes y tipo intacto que
crecen bajo condiciones altas en CO_{2}, no se entiende
completamente. Esto se puede relacionar con el hecho que en el
método MIMS de la captación HCO_{3} se evalúa como la diferencia
entre fotosíntesis neta y captación de CO_{2} [6, 7, 22]. Por lo
tanto, en concentraciones de Ci por debajo de 3 mM, donde el mutante
no exhibe fotosíntesis neta, la captación HCO_{3} se calcula como
cero (Figuras 4a-b). Por otra parte, la técnica de
centrifugación filtrante, como se utiliza aquí, mide el transporte
HCO_{3} unidireccional cercano a la situación de equilibrio por
vía de intercambio de isótopo, que puede explicar algunas de las
variaciones en los resultados. No obstante, los datos obtenidos
mediante ambos métodos indican claramente severa inhibición de
captación HCO_{3} en células mutantes se expone a CO_{2} bajo.
Es interesante notar que aunque las características de captación
HCO_{3} cambiadas durante aclimatación del mutante para CO_{2}
bajo. El transporte CO_{2} no se afecta (Figuras
4a-b). Así se concluye que el fenotipo que requiere
CO_{2} alto de IL-2 se genera mediante la mutación
de un transportador HCO_{3} que en no aclimatación al CO_{2}
bajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ya que el IL-2 se deteriora en
el transporte de HCO_{3}, se utiliza para identificar y clonar la
región genómica relevante involucrada en la captación HCO_{3} de
alta afinidad. La Figura 1 presenta un mapa esquemático de la
región genómica en Synechococcus sp. El PCC 7942 donde la
inserción del vector inactivante mediante un evento de
recombinación único cruzado (indicado por una estrella) generado con
el IL-2 mutante. El análisis de secuencia (GenBank,
No. de Acceso U62616, SEQ ID NO:1) identifica varios marcos de
lectura abierta (identificados en la leyenda de la Figura 1),
algunos son similares a aquellos identificados en Synechocystis PCC
6803 [23]. La comparación de la secuencia de ADN en el tipo intacto
con aquellos en las dos regiones repetidas (debido un único
cruzamiento) en IL-2 mutante, identifica varias
alteraciones por último. Esto incluye una eliminación de 4
nucleótidos en el lado ApaI y una eliminación de 6 nucleótidos pero
la adición de un bp en el lado BamHI (Figura 5). Las razones para
estas alteraciones no se conoce, pero ellos ocurren durante la
recombinación de cruzamiento único entre el ADN genómico y el
plásmido superhélice que lleva el inserto en la colección de
inactivación. El fenotipo que requiere CO_{2} alto de JR12 mutante
de Synechococcus sp. El PCC 7942 también resulta de
eliminaciones de parte del vector y de una región genómica, durante
un único evento cruzado, que conduce a la deficiencia en biosíntesis
purina bajo CO_{2} bajo [24].
Las alteraciones se describen en la Figura 5
resulta en cambios de marco que conducen a inactivación de ambas
copias de ORF467 (nucleótidos 2670-4073 de la SEQ ID
NO:1, SEQ ID NO:2) en IL-2. La inserción de un
cartucho Kanr dentro de los sitios EcoRV o NheI en ORF467,
posiciones 2919 y 3897 (SEQ ID NO:1), respectivamente (indicado por
los triángulos en la Figura 1), resulta en mutantes capaces de
crecer en la presencia de canamicina bajo condiciones bajas de
CO_{2}, a través de un tipo intacto significativamente inferior
(aproximadamente 50%). El análisis Southern de estos mutantes
indica claramente que ellos son merodiploides, es decir, que
contiene las regiones genómicas mutadas y el tipo intacto.
Las Figuras 2 y 3 muestran alineaciones de
aminoácido y ácido nucleico de ictB y slr1515, la secuencia más
similar al ictB identificado en el banco de gen, respectivamente.
Note que los nucleótidos idénticos se comparten entre estas
secuencias de ácido nucleico (Figura 2) igual 56%, los aminoácidos
idénticos se comparte entre estas secuencias de aminoácido (Figura
3) igual 47%, los aminoácidos similares se comparten entre estas
secuencias de aminoácido (Figura 3) igual a 16%, trae la homología
total entre 63% (Figura 3). Cuando se analiza sin los dominios de
transmembrana, los aminoácidos idénticos se comparten entre estas
secuencias de aminoácido iguales 40%, los aminoácidos similares se
comparten entre estas secuencias de aminoácido iguales a 12%, que
trae homología total entre 52%.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína codificada por ORF467 (SEQ ID NO:3)
contiene 10 regiones de putativas de transmembrana y es una
proteína que integra la membrana. Es algo que la homología en varias
proteínas de reducción-oxidación que incluye el
cotransporte unidireccional de Na+/pantotenato de E. coli
(No. de Acceso P16256). Son esenciales iones Na+ para captación
HCO_{3} en cianobacteria y se ha discutido el involucramiento
posible de un cotransporte unidireccional de Na+/HCO_{3} - [3,
25, 26]. La secuencia del cuarto dominio transmembrana contiene una
región que es similar al motivo de unión DCCD en subunidad C de
sintasa ATP con la excepción de las dos posiciones más externas,
reemplazadas por cambios conservativos en ORF467. El gran número de
proteínas de transporte que son homólogos al producto de gen de
ORF467 también sugieren que también es una proteína de transporte,
posiblemente involucrada en la captación HCO_{3}. El ORF467 se
refiere aquí como ictB (para el transporte de carbono inorgánico B
[27]).
La similitud de secuencia entre cmpA, que
codifica un polipéptido 42-kDun que acumula en la
membrana citoplásmica de Synechococcus PCC 7942 expuesto a CO_{2}
bajo [28], y nrtA involucrado en el transporte de nitrato [29],
elevan la posibilidad que el CmpA puede ser la parte periplásmica de
un transportador tipo ABC comprometido en el transporte HCO_{3}
[21, 42]. El papel del polipéptido 42 kDa, sin embargo, no es claro
ya que la inactivación de cmpA no afecta la capacidad de
Synechococcus PCC7942 [30] y Synechocystis PCC6803 [21] hacer crecer
bajo un nivel de aire normal de CO_{2} pero el crecimiento se
reduce bajo 20 ppm CO_{2} en aire [21]. Es posible que el
Synechococcus sp. PCC 7942 contiene tres portadores
diferentes HCO_{3}: uno codificado por cmpA; IctB; y uno
expresado en células IL-2 mutantes se expone a
CO_{2} bajo cuya identidad es aún para ser elucidado. Estos
transportadores permiten a la célula para mantener carbono
inorgánico que suministra bajo varias condiciones ambientales.
\vskip1.000000\baselineskip
La región que codifica ictB se clona en la
dirección 3' de un promotor fuerte (CaMV 35S) y en la dirección 3',
y en marco con, el péptido transitorio de subunidad de guisante
rubisco pequeña. Este casete de expresión se liga a secuencias de
vector que generan la construcción mostrada en la Figura 6.
Las plantas de Arabidopsis thaliana y
Tabaco se transforman con el casete de expresión descrito
anteriormente utilizando el método Agrobacterium. Las plántulas de
plantas Arabidopsis tipo intacto y transgénicas se germina y se
eleva durante 10 días bajo condiciones de humedad. Las plántulas
luego se transfieren a potes, cada uno contiene y tres plantas
transgénicas o tipo intacto. Los potes se colocan en dos cámaras de
crecimiento (Binder, Alemania) y crecen a 20-21ºC,
200 micromol de fotones m^{-2} seg^{-1} (9 h:15 h,
luz:oscuridad). La humedad relativa se mantiene a
30-35% en una cámara de crecimiento y
70-75% en la otra. En los experimentos de
crecimiento, se cosechan plantas de las cámaras de crecimiento
después 18 días del crecimiento. Las plantas se pesan rápidamente
(peso fresco) y se secan en el horno durante la noche con el fin de
determinar el peso seco.
El análisis Northern de ARN de planta demuestra
que los niveles de ictB mRNA varían entre diferentes plantas
transgénicas, aunque como se espera, el mARN de ictB no se detecta
en las plantas tipo intacto (Figura 7).
Las mediciones de las características
fotosintéticas con respecto a la concentración de CO_{2} muestra
que las velocidad de Tabaco (Figura 8) y Arabidopsis (no mostrado)
de fotosíntesis en nivel de CO_{2} saturado es similar en las
plantas transgénicas y tipo intacto. Por otra parte, los niveles de
aire bajos de CO_{2} o inferiores (tal como se experimenta bajo
carga de agua cuando se cierra de estomas) las plantas transgénicas
exhiben velocidades fotosintéticas significativamente mayores que el
tipo intacto (Figura 8). Note que la pendiente de la curva
relacionada con la fotosíntesis de concentración de CO_{2}
intracelular se empina en las plantas transgénicas lo que sugiere
que la actividad de Rubisco es mayor en las plantas
transgénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
En vista del efecto positivo de la expresión de
ictB en desarrollo sintético, las plantas transgénicas de la
presente invención se prueban adicionalmente para las velocidades de
crecimiento cuando se compara con plantas tipo intacto (Figura 9).
Naturalmente, el crecimiento es más rápido en plantas bien
suministradas con agua, mantenidas bajo la alta humedad relativa
(por encima de 70%). Bajo tales condiciones no existe diferencia
significativa entre las plantas transgénicas y tipo intacto.
Por otra parte, las plantas Arabidopsis
transgénicas crecen significativamente más rápido que las tipo
intacto bajo condiciones de suministro de agua restringido y
humedad baja (inferior a 40%) (Figura 9). Estos datos demuestran el
uso potencial de ictB para elevar la productividad de planta
particularmente bajo condiciones secas donde cerramiento estomática
puede conducir el nivel de CO_{2} intracelular bajo y así el
retardo del crecimiento.
Las razones para el efecto muy largo de la
expresión de ictB en el crecimiento puede ser debido a la
concentración elevada de CO_{2} en el sitio de Rubisco en las
plantas transgénicas, consecuente en la entrada de HCO_{3}
mejorada a los cloroplastos, esperaría el punto de compensación
inferior para CO_{2} y para el delta inferior ^{13}C de la
materia orgánica producida [31]. La Tabla 2 muestra que el punto de
compensación es ligeramente inferior en las plantas transgénicas
pero la diferencia no es estadísticamente significativa. La
pendiente de la curva que relaciona la fotosíntesis en la
concentración de CO_{2} intracelular (Figura 8) se empina en las
plantas transgénicas sugiere (de acuerdo con modelos aceptados de
fotosíntesis [31-33]) que la actividad de Rubisco
es mayor que en el tipo intacto. Los experimentos donde comparamos
la actividad de Rubisco en plantas tipo intacto y transgénicas
sugiere actividad mayor en el formador (no mostrado).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Así, aplicar las técnicas de la presente
invención uno puede transformar plántulas tal como Plantas C3 que
incluye, pero no se limita a, tomate, soya, papa, pepino, algodón,
trigo, arroz, cebada y plantas C4 de cultivo, que incluye, pero no
se limita a, maíz, caña de azúcar, sorgo y otras, para generar por
lo tanto plantas que crecen más rápido, y producen producción de
cultivo alta especialmente bajo condiciones que limitan el agua y/o
que limitan el CO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos secuencias de aminoácido adicionales que
exhiben similitud funcional para ictB se listan en la Tabla 3
adelante. Estas secuencias que codifican los polipéptidos que son
75-80% homólogas a ictB (Tabla 4) se puede utilizar
para transformar plantas con el fin de alcanzar el mejoramiento del
crecimiento o producción resultante descrito aquí anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la base de los resultados obtenidos con las
plantas transgénicas Arabidopsis (ver sección 2, anterior), se
espera que la expresión de ictB en algunas de las plantas de cultivo
más importantes que incluye: trigo, arroz, cebada, papa, algodón,
soya, lechuga y tomate conduciría a un crecimiento y producción
comercial significativa especialmente en regiones en las que el
cultivo comercial de cultivos alimenticios se inhibe sustancialmente
mediante las condiciones de crecimiento, tal como por ejemplo las
condiciones de crecimiento árido que caracterizan varias regiones en
África.
Aunque la invención se ha descrito en conjunto
con las realizaciones específicas del mismo, es evidente que muchas
alternativas, modificaciones y variaciones será evidente para
aquellos expertos en la técnica. Adicionalmente, la citación o
identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se debe
construir como una admisión de tal manera que la referencia está
disponible como la técnica previa a la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Kaplan, A., Schwarz, R.,
Lieman-Hurwitz, J. y Reinhold, L.
(1991) Plant Physiol. 97, 851-855.
2. Badger, M.R. y Parroz, D.G.
(1994) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45,
369-399.
3. Kaplan, A., Schwarz, R.,
Lieman-Hurwitz, J.,
Ronen-Tarazi, M. y Reinhold, L.
(1994) in: The Molecular Biology of the Cyanobacteria
(Bryant, D. Ed.), pp. 469-485, Kluwer Academic Pub.,
Dordrecht, The Netherlands.
4. Ronen-Tarazi, M.,
Schwarz, R., Bouevitch, A.,
Lieman-Hurwitz, J., Erez, J. y
Kaplan, A. (1995) in: Molecular Ecology of Aquatic
Microbes (Joint, I., Ed.), pp. 323-334.
Springer-Verlag, Berlin.
5. Kaplan, A.,
Ronen-Tarazi, M., Zer, H.,
Schwarz, R., Tchernov, D., Bonfil, D.J.,
Schatz, D., Vardi, A., Hassidim, M. y
Reinhold, L. (1998) Can. J. Bot. 76,
917-924.
6. Sultemeyer, D., Parroz, G.D.,
Bryant, D.A. y Badger, M.R. (1997) Plant
201, 36- 42.
7. Sultemeyer, D., Klughammer, B.,
Badger, M.R. y Parroz, G.D. (1998) Plant
Physiol. 116, 183-192.
8. Ronen-Tarazi, M.,
Shinder, V. y Kaplan, A. (1998) FEMS
Microbiol Lett. 159, 317-324.
9. Sambrook, J., Fritsch, E.F. y
Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York.
10. Kaplan, A., Marcus, Y. y
Reinhold, L. (1988) in: Methods in Enzymology (Packer,
L. y Glazer, A.N., Eds.), pp. 534-539. Academic
Press, New York.
11. Tchernov, D., Hassidim, M.,
Luz, B., Sukenik, A., Reinhold, L. y
Kaplan, A. (1997) Curr. Biol. 7,
723-728.
12. Badger, M.R. y Parroz, G.D.
(1992) Physiol. Plant. 84,606-615.
13. Ronen-Tarazi, M.,
Lieman-Hurwitz, J., Gabay, C.,
Orus, M. y Kaplan, A. (1995) Plant
Physiol. 108, 1461-1469.
14. Dolganov, N. y Grossman, A.
(1993) J. Bacteriol.
175,7644-7651.
15. Ronen-Tarazi, M.,
Bonfil, D.J., Schatz, D. y Kaplan, A.
(1998) Can. J. Bot. 76, 942-948.
16. Marcus, Y., Schwarz, R.,
Friedberg, D. y Kaplan, A. (1986) Plant
Physiol. 82, 610-612.
17. Schwarz, R., Friedberg, D.,
Reinhold, L. y Kaplan, A. (1988) Plant
Physiol. 88, 284-288.
18. Fukuzawa, H., Suzuki, E.,
Komukai, Y. y Miyachi, S. (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89, 4437-4441.
19. Schwarz, R., Reinhold, L. y
Kaplan, A. (1995) Plant Physiol. 108,
183-190.
20. Marco, M., Ohad, N.,
Schwarz, R., Lieman-Hurwitz, J.,
Gabay, C. y Kaplan, A. (1993) Plant
Physiol. 101, 1047-1053.
21. Ohkawa, H., Sonoda, M.,
Katoh, H. y Ogawa, T. (1998) in: Proceedings of
The Third International Symposium on Inorganic Carbon Uptake by
Aquatic Photosynthetic Organisms (Colman, B. Ed.), Can J Bot
76, 1035-1042.
22. Yu, J.W., Parroz, G.D. y
Badger, M.R. (1994) Aust. J. Plant Physiol. 21,
185- 195.
23. Kaneko, T., Sato, S.,
Kotani, H., Tanaka, A., Asamizu, E.,
Nakamura, Y., Miyajima, N., Hirosawa, M.,
Sugiura, M., Sasamoto, S., Kimura, T.,
Hosouchi, T., Matsuno, A., Muraki, A.,
Nakazaki, N., Naruo, K., Okumura, S.,
Shimpo, S., Takeuchi, C., Wada, T.,
Watanabe, A., Yamada, M., Yasuda, M. y
Tabata, S. (1996) DNA Res. 3,
109-136.
24. Lieman-Hurwitz J.,
Schwarz, R., Martinez, F., Maor, Z.,
Reinhold, L., y Kaplan, A. (1990) in:
Proceedings of The Second International Symposium on Inorganic
Carbon Uptake by Aquatic Photosynthetic Organisms (Colman, B. Ed.),
Can J Bot 69: 945-950.
25. Kaplan, A., Schwarz, R.,
Ariel, R., y Reinhold, L. (1990) in: Regulation
of Photosynthetic Processes (Kanay, R., Katoh, R.S. y Miyachi, S.
Eds.), Special Issue of the Botanical Magazine, vol. 2, pp.
53-71, Tokyo.
26. Tyrrell, P. N., Kandasamy, R.
A., Crotty, C. M. y Espie, G. S. (1996)
Plant Physiol. 112, 79-88
27. Ogawa, T. (1991) Plant
Physiol. 96, 280-284.
28. Omata, T. y Ogawa, T.
(1986) Plant Physiol. 80, 525-530.
29. Omata, T. (1992) in: Research
in Photosynthesis (Murata, N. Ed.) vol. III,
807-810, Kluwer Academic Pub., Dodrecht, The
Netherlands.
30. Omata, T., Carlson, T.J.,
Ogawa, T. y Pierce, J. (1990) Plant
Physiol. 93, 305- 311.
31. Woodrow, ES DECIR y Berry,
J.A. (1988) Ann. Rev. Plant Physiol 39,
533-594.
32. Mott, K.A. y Woodrow, ES
DECIR (2000) Journal of Experimental Botany 51,
399-406.
33. Poolman, M.G., Fell, D.A. y
Thomas, S. (2000) Journal of Experimental
Botany 51, 319-328.
34. Kaplan, A. y Reinhold, L.
(1999) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50,
539-570.
35. Spreitzer, R.J. (1999)
Photosynthesis Research 60, 29-42.
36. Horton, P. (2000) Journal
of Experimental Botany 51, 475-485.
37. Matsuoka, M., Nomura, M.,
Agarie, S., Miyao-Tokutomi, M. y
Ku, M.S.B. (1998) Journal of Plant Research
111, 333-337.
38. Nomura, M. et al.
(2000) Plant Mol. Biol. 44,
99-106.
39. Takeuchi, K., Akagi, H.,
Kamasawa, N., Osumi, M. y Honda, H.
(2000) Planta 211, 265-274.
40. Suzuki, S., Murai, N.,
Burnell, J.N. y Arai, M. (2000) Plant
Physiol. 124,163- 172.
41. Bonfil, D.J.,
Ronen-Tarazi, M., Sultemeyer, D.;
Lieman-Hurwitz, J., Schatz, D. y
Kaplan, A. (1998) FEBS Lett. 430,
236-240.
42. Maeda, S-I.,
Parroz, G. D., Badger, M. R., Enomoto, C. y
Omata, T. (2000) J. Biol. Chem. 275,
20551-20555.
<110> Kaplan, Aaron
\hskip1cmLieman-Hurwitz, Judy
\hskip1cmRachmilevitch, Shimon
\hskip1cmSchatz, Daniella
\hskip1cmMittler, Ron
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PLANTAS CARACTERIZADAS POR
CRECIMIENTO MEJORADO Y MÉTODOS Y CONSTRUCCIONES DE ÁCIDO NUCLEICO
ÚTILES PARA GENERAR LAS MISMAS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 00/21536
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4957
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechococcus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechococcus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechococcus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechocystis sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechocystis sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Anabaena PCC7120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 472
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nostoc punctiforme
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Anabaena PCC7120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nostoc punctiforme
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (32)
1. Un método de crecimiento mejorado y/o
producción comercial de una planta, el método comprende expresar
dentro de la planta un polipéptido que incluye una secuencia de
aminoácido por lo menos 60% homóloga a aquella establecida en SEQ ID
NOs: 5, 6 o 7.
2. Un método de crecimiento mejorado y/o
producción comercial de una planta, el método comprende expresar
dentro de la planta un polipéptido que incluye una secuencia de
aminoácido por lo menos 60% homóloga a aquella establecida en SEQ ID
NOs: 3, 5, 6 o 7, en donde la planta se hace crecer en un ambiente
caracterizado porque la humedad es inferior a 40%.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en
donde la planta se hace crecer en un ambiente caracterizado
porque una concentración de CO_{2} intracelular es inferior a 10
micromolar.
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la expresión de dicho polipéptido
dentro de la planta se efectúa al transformar por lo menos una
porción de las células de la planta con una construcción de ácido
nucleico que incluye una región de polinucleótido que codifica dicho
polipéptido.
5. El método de la reivindicación 4, en donde
dicha transformación se efectúa mediante un método seleccionado del
grupo que consiste de transformación mediada por agrobacterium,
infección vírica, electroporación y bombardeo de partícula.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, en donde dicha secuencia de aminoácido es
como se establece por SEQ ID NOs: 3, 5, 6 o 7.
7. El método de la reivindicación 4, en donde
dicha construcción de ácido nucleico incluye adicionalmente una
segunda región de polinucleótido que codifica un péptido
transitorio.
8. El método de la reivindicación 4, en donde
dicha construcción de ácido nucleico incluye adicionalmente una
secuencia promotora para dirigir la transcripción de dicha primera
región de polinucleótido.
9. El método de la reivindicación 4, en donde
dicha construcción de ácido nucleico incluye adicionalmente una
secuencia promotora para dirigir la transcripción de dicha primera y
dicha segunda regiones de polinucleótido.
10. El método de la reivindicación 8, en donde
dicho promotor es funcional en células eucarióticas.
11. El método de la reivindicación 10, en donde
dicho promotor se selecciona del grupo que consiste de un promotor
constitutivo, un promotor inducible, un promotor desarrolladamente
regulado y un promotor específico de tejido.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha planta es una planta C3.
13. El método de la reivindicación 12, en donde
dicha planta C3 se selecciona del grupo que consiste de tomate,
soya, papa, pepino, algodón, trigo, arroz, cebada, lechuga, vara de
oro, banana y álamo.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha planta es una planta C4.
15. El método de la reivindicación 14, en donde
dicha planta C4 se selecciona del grupo que consiste de maíz, caña
de azúcar, y sorgo.
16. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en donde la planta que expresa dicho
polipéptido se caracteriza porque una velocidad de
crecimiento es por lo menos 10% mayor que aquella de una planta
similar que no expresa dicho polipéptido cuando ambas se hacen
crecer bajo condiciones de crecimiento similares.
17. El método de la reivindicación 16, en donde
dicha velocidad de crecimiento se determina mediante por lo menos un
parámetro de crecimiento seleccionado del grupo que consiste de peso
fresco incrementado, peso seco incrementado, crecimiento de raíz
incrementado, crecimiento de vástago incrementado y desarrollo de
flores incrementado durante el tiempo.
18. Una planta transformada que expresa un
polipéptido que incluye una secuencia de aminoácido por lo menos 60%
homóloga a aquella establecida en SEQ ID NOs: 5, 6 o 7, dicha planta
transformada caracterizada porque un crecimiento mejorado
cuando se compara con crecimiento de planta no transformada es
similar bajo condiciones de crecimiento similares.
19. La planta transformada de la reivindicación
18, en donde dichas condiciones de crecimiento incluyen condiciones
de humedad de por lo menos 40%.
\newpage
20. La planta transformada de la reivindicación
18 o 19, en donde dicha secuencia de aminoácido es como se establece
por SEQ ID NOs: 5, 6 o 7.
21. La planta transformada de una cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 20, en donde dicha planta transformada es
una planta C3.
22. La planta transformada de la reivindicación
21, en donde dicha planta C3 se selecciona del grupo que consiste de
tomate, soya, papa, pepino, algodón, trigo, arroz, cebada, lechuga,
vara de oro, banana, álamo, y cítricos.
23. La planta transformada de una cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 20, en donde dicha planta transformada es
una planta C4.
24. La planta transformada de la reivindicación
23, en donde dicha planta C4 se selecciona del grupo que consiste de
maíz, caña de azúcar, y sorgo.
25. La planta transformada de una cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 24, en donde una velocidad de crecimiento
de dicha planta transformada es por lo menos 10% mayor que aquella
de una planta transformada no similar cuando ambas se hacen crecer
bajo condiciones de crecimiento similares.
26. La planta transformada de la reivindicación
25, en donde dicha velocidad de crecimiento se determina mediante
por lo menos un parámetro de crecimiento seleccionado del grupo que
consiste de peso fresco, peso seco, crecimiento de raíz, crecimiento
de vástago y desarrollo de flores.
27. La planta transformada de una cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 25, en donde dicha planta transformada se
caracteriza adicionalmente por una producción comercial
incrementada cuando se compara con crecimiento de planta no
transformada similar bajo condiciones similares.
28. La planta transformada de una cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 25, en donde dichas condiciones de
crecimiento incluyen carga de agua, baja humedad, carga de sal, y/o
condiciones bajas de CO_{2}.
29. Una construcción de expresión de ácido
nucleico que comprende:
(a) una primera región de polinucleótido que
codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácido por
lo menos 60% homóloga a aquella establecida mediante SEQ ID NOs: 5,
6 o 7; y
(b) una segunda región de polinucleótido
funcional como un promotor y que es para dirigir la transcripción de
dicha primera región de polinucleótido en células eucarióticas.
\vskip1.000000\baselineskip
30. La construcción de la expresión de ácido
nucleico de la reivindicación 29, en donde dicho promotor se
selecciona del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un
promotor inducible, un promotor desarrolladamente regulado y un
promotor específico de tejido.
31. La construcción de la expresión de ácido
nucleico de la reivindicación 29, en donde dicho promotor es un
promotor de planta.
32. La construcción de la expresión de ácido
nucleico de la reivindicación 29, en donde dicha primera región de
polinucleótido codifica adicionalmente un péptido transitorio que se
fusiona transduccionalmente a dicho polipéptido.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US828173 | 2001-04-09 | ||
| US09/828,173 US20030037356A1 (en) | 2001-04-09 | 2001-04-09 | Plants characterized by enhanced growth and methods and nucleic acid constructs useful for generating same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2335392T3 true ES2335392T3 (es) | 2010-03-26 |
Family
ID=25251083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02720425T Expired - Lifetime ES2335392T3 (es) | 2001-04-09 | 2002-03-26 | Plantas caracterizadas por crecimiento mejorado y metodo y construcciones de acido nucleico utiles para generar las mismas. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030037356A1 (es) |
| EP (1) | EP1408736B1 (es) |
| JP (1) | JP2004531252A (es) |
| AT (1) | ATE446005T1 (es) |
| AU (1) | AU2002251447B2 (es) |
| CA (1) | CA2443654A1 (es) |
| DE (1) | DE60234101D1 (es) |
| ES (1) | ES2335392T3 (es) |
| IL (1) | IL158244A0 (es) |
| MX (1) | MXPA03009154A (es) |
| NZ (1) | NZ528709A (es) |
| WO (1) | WO2002081622A2 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100394844C (zh) | 2006-02-22 | 2008-06-18 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种培育转基因杨树的方法 |
| CN102993285B (zh) * | 2011-09-14 | 2014-05-14 | 中国科学院植物研究所 | 一种与二氧化碳浓缩机制相关的集胞藻蛋白的新用途 |
| CN103233029A (zh) * | 2013-05-06 | 2013-08-07 | 深圳华大基因研究院 | 构建体及其用途 |
| AU2014374057B2 (en) | 2013-12-31 | 2020-08-27 | The University Of Massachusetts | Plants with enhanced photosynthesis and methods of manufacture thereof |
| KR20170095284A (ko) * | 2014-12-09 | 2017-08-22 | 훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠 | 종양 항원 펩티드 |
| CN105359856A (zh) * | 2015-11-11 | 2016-03-02 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种批量鉴定小麦耐盐性的方法及装置 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6320101B1 (en) * | 1999-06-14 | 2001-11-20 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Enhancing inorganic carbon fixation by photosynthetic organisms |
-
2001
- 2001-04-09 US US09/828,173 patent/US20030037356A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-03-26 ES ES02720425T patent/ES2335392T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-26 NZ NZ528709A patent/NZ528709A/en unknown
- 2002-03-26 AT AT02720425T patent/ATE446005T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-03-26 IL IL15824402A patent/IL158244A0/xx active IP Right Grant
- 2002-03-26 EP EP02720425A patent/EP1408736B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-26 JP JP2002579986A patent/JP2004531252A/ja active Pending
- 2002-03-26 MX MXPA03009154A patent/MXPA03009154A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-03-26 AU AU2002251447A patent/AU2002251447B2/en not_active Ceased
- 2002-03-26 DE DE60234101T patent/DE60234101D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-26 CA CA002443654A patent/CA2443654A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-26 WO PCT/IL2002/000250 patent/WO2002081622A2/en active Search and Examination
-
2003
- 2003-04-10 US US10/410,432 patent/US20030192076A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL158244A0 (en) | 2004-05-12 |
| US20030192076A1 (en) | 2003-10-09 |
| AU2002251447B2 (en) | 2007-01-04 |
| DE60234101D1 (de) | 2009-12-03 |
| WO2002081622A2 (en) | 2002-10-17 |
| JP2004531252A (ja) | 2004-10-14 |
| EP1408736B1 (en) | 2009-10-21 |
| ATE446005T1 (de) | 2009-11-15 |
| EP1408736A4 (en) | 2004-12-29 |
| EP1408736A2 (en) | 2004-04-21 |
| US20030037356A1 (en) | 2003-02-20 |
| WO2002081622A3 (en) | 2004-02-19 |
| CA2443654A1 (en) | 2002-10-17 |
| NZ528709A (en) | 2005-04-29 |
| MXPA03009154A (es) | 2004-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6320101B1 (en) | Enhancing inorganic carbon fixation by photosynthetic organisms | |
| Stein et al. | Elevation of free proline and proline-rich protein levels by simultaneous manipulations of proline biosynthesis and degradation in plants | |
| ES2502415T3 (es) | Protección de proteínas KRP mutantes negativas dominantes contra la inhibición activa del complejo ciclina-CDK por parte de KRP de tipo salvaje | |
| BR112015015415B1 (pt) | Métodos para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, taxa de crescimento, biomassa, rendimento da semente, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, para produzir de uma cultura, para cultivar uma colheita, e, para selecionar uma planta | |
| US11965182B2 (en) | Plants with enhanced yield and methods of construction | |
| BR112014014268B1 (pt) | Métodos para modular a condutância de estomas e estruturas de expressão de planta para execução da mesma | |
| MX2012009988A (es) | Crecimiento de planta incrementado por modulacion de la expresion omega-amidasa en plantas. | |
| BR112019012622A2 (pt) | métodos de aumento de rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento de sementes, rendimento de fibras, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso de nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, de produção e de crescimento de uma cultura agrícola e de seleção de uma planta, polinucleotídeo isolado, constructo de ácido nucleico, polipeptídeo isolado, célula de planta, e, planta. | |
| US20160326542A1 (en) | Drought and salt tolerant plants | |
| ES2335392T3 (es) | Plantas caracterizadas por crecimiento mejorado y metodo y construcciones de acido nucleico utiles para generar las mismas. | |
| US20200055908A1 (en) | Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein | |
| US20190338302A1 (en) | Transgenic land plants comprising a putative transporter protein of an edible eukaryotic algae | |
| ES2326789T3 (es) | Plantas transgenicas con el gen de la enzima para la segmentacion de neoxantina. | |
| US11834666B2 (en) | Genetically engineered land plants that express a plant CCP1-like mitochondrial transporter protein | |
| US20050108790A1 (en) | Plants characterized by enhanced growth and methods and nucleic acid constructs useful for generating same | |
| US20120004114A1 (en) | Nucleotide sequences encoding gsh1 polypeptides and methods of use | |
| EP3419993B1 (en) | Enhancing photosynthesis | |
| AU2002251447A1 (en) | Plants characterized by enhanced growth and methods and nucleic acid constructs useful for generating same | |
| CN116157526A (zh) | 提高c3植物的生产率 | |
| US20040128720A1 (en) | Plants characterized by enhanced growth and methods and nucleic acid constructs useful for generating same | |
| ES2400807T3 (es) | Transportadores mejorados y sus usos | |
| US12018266B2 (en) | Enhancing photosynthesis | |
| IL158244A (en) | Plants characterized by enhanced growth and methods and nucleic acid constructs useful for generating same | |
| KR20150106528A (ko) | 식물의 비생물학적 스트레스 내성을 증가시키는 고추 유래의 msrb2 유전자 및 이의 용도 |