ES2335096T3 - Un metodo para la produccion de plantas con fotorrespiracion suprimida y fijacion de co2 mejorada. - Google Patents
Un metodo para la produccion de plantas con fotorrespiracion suprimida y fijacion de co2 mejorada. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para la producción de plantas con la fotorrespiración suprimida y la fijación de CO2 mejorada que comprende introducir en una célula vegetal, un tejido vegetal o una planta uno o más ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii) la semialdehído tartrónico reductasa, donde la introducción de uno o varios ácidos nucleicos da como resultado la expresión de novo de polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii) la semialdehído tartrónico reductasa y donde dichos polipéptidos se localizan en los cloroplastos de la planta producida.
Description
Un método para la producción de plantas con
fotorrespiración suprimida y fijación de CO_{2} mejorada.
La invención se refiere a un método para la
producción de plantas con la fotorrespiración suprimida y con una
fijación de CO_{2} mejorada.
Recientemente se han realizado muchos esfuerzos
para mejorar el crecimiento y la resistencia de las plantas de
cultivo. Algunas de las plantas de cultivo más importantes p. ej.,
arroz, trigo, cebada, patata, pertenecen a las plantas denominadas
C_{3}. Solamente unas pocas plantas de cultivo importantes, como
el maíz y la caña de azúcar, son plantas C_{4}. La fijación de
CO_{2} en las plantas C_{3} es catalizada principalmente por
la enzima ribulosa-1,5-bisfosfato
carboxilasa (RUBISCO) que está localizada en el interior de los
cloroplastos. La enzima RUBISCO cataliza dos reacciones: la
carboxilación y la oxigenación de la
ribulosa-1,5-bisfosfato. El
producto de la primera reacción son dos moléculas de
3-fosfoglicerato que entran en el ciclo de Calvin
para formar almidón y
ribulosa-1,5-bisfosfato. Los
productos de la reacción de la oxigenasa son una molécula de
3-fosfoglicerato y una de fosfoglicolato (Goodwin y
Mercer, 1983). La última se convierte en
3-fosfoglicerato en una ruta biosintética
denominada fotorrespiración (véase la Figura 1). En el transcurso de
esta secuencia compleja de reacciones se libera una molécula de
CO_{2} y se pierde de la planta. Esta pérdida de CO_{2} reduce
la formación de azúcares y polisacáridos en la planta y de este modo
reduce su productividad. Además, se libera NH_{3} que debe ser
fijado de nuevo. Estos efectos se exacerban adicionalmente cuando
las plantas se desarrollan con un suministro de agua subóptimo.
Aquí, los estomas de la hoja se cierran y las concentraciones de
oxígeno intercelular aumentan debido al oxígeno molecular liberado
de las reacciones lumínicas de la fotosíntesis. Se producen
elevadas cantidades de fosfoglicolato que entran en el ciclo
fotorrespiratorio. Se ha estimado que las plantas pierden
aproximadamente 25% del carbono ya fijado debido a la
fotorrespiración. No obstante, este ciclo es absolutamente
intrínseco para todas las plantas C_{3} debido a la actividad
oxigenasa de la RUBISCO (Leegood et al., 1995; Tolbert,
1997).
La importancia de la fotorrespiración para el
crecimiento y rendimiento de la planta ha sido demostrada mediante
numerosos experimentos en los que se ha aumentando artificialmente
la concentración de CO_{2} atmosférico en experimentos en
invernadero. Ya se han observado incrementos drásticos en el
comportamiento de numerosas especies de cultivo cuando se dobla la
concentración de CO_{2} (Kimball, 1983; Arp et al., 1998).
Sin embargo, este enfoque no es aplicable a las enormes áreas
utilizadas para la producción agrícola.
Las plantas C_{4} han desarrollado un
mecanismo para evitar estas pérdidas. Han empleado enzimas ya
presentes en sus antepasados C_{3}, pero cambiando el grado de
expresión así como la localización a nivel subcelular y específico
del tipo de célula. Al separar la fijación de carbono primaria y
secundaria en dos tejidos diferentes, incrementan drásticamente la
concentración local de CO_{2} en el sitio de actividad de RUBISCO.
En resumen, tiene lugar la primera fijación de CO_{2} en el
citoplasma de las células del mesófilo y es catalizada por PEPC,
una enzima sin actividad oxigenasa intrínseca y una afinidad
significativamente mayor por su sustrato en comparación con
RUBISCO. El ácido C_{4} resultante se difunde al haz vascular
estanco y aquí se descarboxila para liberar CO_{2}. El ácido
monocarbónico restante sirve para regenerar el aceptor de CO_{2}
primario en el mesófilo. Este mecanismo de concentración de
CO_{2} da como resultado una completa supresión de la
fotorrespiración y una fotosíntesis insensible al oxógeno (Kanai y
Edwards, 1999). Un mecanismo similar con una separación temporal en
lugar de espacial de las actividades enzimáticas se aplica a las
plantas con un metabolismo ácido de crasuláceas (CAM) (Cushman y
Bohnert, 1999).
Además de estos mecanismos dependientes de la
cooperación de dos tipos de células diferentes algunas plantas
acuáticas han desarrollado mecanismos de tipo C_{4} que funcionan
dentro de una célula. Aquí, la fijación de CO_{2} primaria y
secundaria tiene lugar en una célulal,pero en diferentes
compartimentos. Mientras la actividad de PEPC está restringida al
citoplasma, la liberación de CO_{2} y la refijación similar a las
plantas C_{4} tiene lugar en el cloroplasto. Esta ruta de tipo
C_{4} unicelular da como resultado una supresión parcial de la
fotorrespiración con una reducción de la sensibilidad al oxígeno
(Reiskind et al., 1997).
Se han descrito numerosos intentos para
transferir las rutas C_{4} o de tipo C_{4} o componentes de esta
ruta a plantas C_{3}. En su mayor parte, se ha utilizado hasta
ahora la expresión en exceso de PEPC. Tres grupos aplicaron la
expresión del ADNc o el gen de PEPC de maíz bajo el control de
diferentes promotores (Hudspeth et al., 1992; Kogami y
otros, 1994; Ku y otros, 1999; Aunque se detectaron incrementos en
los niveles de actividad de PEPC de hasta 100 veces con el gen de
maíz intacto completo en arroz (Ku et al., 1999), sólo hubo
impactos débiles sobre la fisiología y el comportamiento de
crecimiento de la planta (Matsuoka et al., 2001, véase
también EP-A 0 874 056). Recientemente, se ha
descrito la expresión en exceso de PEPC y malato deshidrogenasa de
Sorghum en patata, pero en este caso los niveles de expresión
fueron bajos y no se pudo observar modificación de los parámetros
fotosintéticos (Beaujean et al., 2001). Gehlen et al.
(1996) han expresado en exceso ADNc de PEPC de una fuente
bacteriana en patata con un impacto algo menor sobre los
parámetros fotosintéticos La combinación de esta enzima con la
expresión en exceso adicional de una enzima
NADP^{+}-malica (ME) de Flaveria pringlei
dirigida al cloroplasto intensificó estos efectos sin ningún
impacto sobre el crecimiento o rendimiento de la planta (Lipka et
al., 1999). Para arroz, se ha descrito recientemente que la
expresión en exceso de una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PCK) de
Urochloa panicoides dirigida a cloroplastos da como
resultado la inducción de PEPC endógena y el establecimiento de un
ciclo semejante a C_{4} en una sola célula. No obstante, no se
observó un aumento de los parámetros de crecimiento (Suzuki et
al., 2000; véase también WO 98/35030).
Por lo tanto, a pesar de los numerosos intentos
para mejorar la fijación de CO_{2} y reducir la fotorrespiración
hasta ahora no se ha proporcionado ningún método que conduzca a una
mejora del crecimiento, productividad, y/o rendimiento para las
plantas de cultivo agrícolas. Todos estos intentos tenían el
objetivo de concentrar CO_{2} en el sitio de fijación para
suprimir la actividad oxigenasa de la RUBISCO, mientras la presente
invención tenían el objetivo de utilizar los productos de la
actividad oxigenasa de la RUBISCO para la supresión de la
fotorrespiración.
Muchas bacterias han desarrollado rutas
bioquímicas para metabolizar glicolato, el producto primario de la
actividad oxigenasa de la RUBISCO. Para Escherichia coli,
esta ruta ha sido descrita con gran detalle (Lord, 1972; Pellicer
et al., 1996). E. coli es capaz de crecer sobre
glicolato como única fuente de carbono. Como se resume en la Figura
4, el glicolato se oxida primero a glioxilato. Esta reacción es
provocada por un complejo multiproteico que es capaz de oxidar el
glicolato de una manera independiente del oxígeno. Las proteínas
necesarias para la oxidación del glicolato en E. coli han
sido analizadas y se ha demostrado que los marcos de lectura
abiertos D, E, y F del operón de la glicolato oxidasa glc están
codificando los componentes de la enzima activa. En la siguiente
etapa de reacción, dos moléculas de glioxilato son ligadas por la
glioxilato carboligasa (GCL) para formar semialdehído tartrónico
(TS) y en esta reacción se libera CO_{2}. El TS es convertido
adicionalmente en glicerato por la TS reductasa (TSR). El glicerato
es integrado en el metabolismo del carbono basal bacteriano.
También se aplica una ruta similar como ciclo
fotorrespiratorio en algunas algas verdes y cianobacterias (Nelson
y Tolbert, 1970; Ramazanov y Cardenas, 1992). En este caso, la
oxidación del glicolato es catalizada aparentemente por la
glicolato deshidrogenasa localizada en el interior de la
mitocondria. De nuevo, esta enzima no depende de oxígeno y utiliza
aceptores de electrones orgánicos como el Dinucleótido de
Nicotin-Adenosina (NAD^{+}) en su lugar. El
metabolismo adicional del glioxilato parece ser similar a la ruta
descrita para E. coli.
El problema técnico de la presente invención fue
proporcionar métodos alternativos y medios para la supresión de la
fotorrespiración y por medio de esto el incremento de la
productividad y/o el rendimiento en plantas de cultivo.
La solución del problema técnico se logra
proporcionando un método para la producción de plantas con la
fotorrespiración suprimida y una fijación de CO_{2} mejorada que
comprende introducir en una célula vegetal, tejido vegetal o planta
uno o más ácidos nucleicos, donde la introducción de uno o varios
ácidos nucleicos da como resultado la expresión de novo de
polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) una
glicolato oxidasa o glicolato deshidrogenasa, (ii) una glioxilato
carboligasa y (iii) una semialdehído tartrónico reductasa.
En particular, la invención se refiere a la
reutilización del fosfoglicolato producido en la fotorrespiración.
El producto de reacción se convertirá en un componente que puede ser
reintegrado en el metabolismo asimilador de la planta dentro del
cloroplasto. Esto se completará mediante la transferencia de genes
derivados de rutas que utilizan glicolato de bacterias, algas,
plantas y/o animales incluyendo seres humanos en el genoma nuclear
y/o plastidial de la planta. El método de la invención conduce a una
reducción de la fotorrespiración en plantas C_{3} y por esto será
muy beneficioso para la producción de alimento especialmente pero no
exclusivamente en condiciones de crecimiento no favorables.
El método de la presente invención consiste en
instalar una actividad oxidante de glicolato dentro del cloroplasto.
Para esto, se tendrán que transferir al cloroplasto varias enzimas.
Esto puede ser propiciado o bien mediante transformación nuclear de
células vegetales, tejido vegetal o plantas con la secuencia
codificante de la respectiva proteína fusionada a un péptido de
tránsito al cloroplasto o bien mediante transformación directa del
genoma del cloroplasto. Los promotores que controlan la expresión
de los respectivos transgenes pueden ser constitutivos o
controlados por métodos medioambientales o técnicos. Las enzimas
pueden ser transferidas a células vegetales, tejido vegetal o
plantas sobre constructos plasmídicos individuales o
independientemente sobre varios constructos. Los mecanismos
generales para la integración de genes son bien conocidos en la
técnica e incluyen la transferencia mediada por
Agrobacterium, la electroporación, la microinyección, o el
tratamiento químico. El método de la invención se puede aplicar a
cualquier planta, célula vegetal incluyendo células de algas, o
tejido vegetal, preferiblemente a plantas C_{3}. Muy
preferiblemente la invención se aplica a patata y tabaco.
Una ruta que satisface los requerimientos de
esta invención se muestra en la Figura 5:
La primera proteína en la nueva ruta bioquímica
es una enzima que cataliza la oxidación de glicolato de una manera
independiente del oxígeno con cofactores orgánicos. Las oxidasas
útiles para este fin incluyen las glicolato oxidasas bacterianas y
las glicolato deshidrogenasas de algas así como las actividades
reductoras de glioxilato de mamíferos y los homólogos funcionales
derivados de plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína puede estar constituida por uno o
múltiples polipéptidos. En gran media, el uso de enzimas de estas
fuentes evitará la formación de especies con oxígeno reactivo que
son producidas por las glicolato oxidasas de las plantas superiores
localizadas en el interior de los peroxisomas.
Los polipéptidos preferidos que tienen la
actividad enzimática de una glicolato oxidasa son aquellos
codificados por el operón glc de E. coli. Los
más preferidos son los polipéptidos que comprenden las secuencias
de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 (Glc D), 4 (Glc E) y 6
(Glc F). De acuerdo con esto, los ácidos nucleicos que
comprenden una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3 y 5
pueden utilizarse para llevar a cabo la presente invención.
Alternativamente, se puede utilizar glioxilato
reductasa humana que tiene actividad glicolato deshidrogenasa. Una
glioxilato reductasa humana preferida comprende la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 8. Por lo tanto, también se puede
utilizar un ácido nucleico que comprende la secuencia de
polinucleótidos del SEQ ID NO: 7 para llevar a cabo la presente
invención.
En lugar de los polipéptidos de E. coli
mencionados antes codificados por el operón glc se pueden
utilizar los homólogos derivados de Arabidopsis thaliana o de
otras fuentes de plantas superiores. Un homólogo de Arabidopsis
thaliana preferido, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 10 y está codificado por un ácido nucleico que comprende la
secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 9.
La segunda proteína es una enzima que cataliza
la formación de semiladehído tartrónico a partir de dos moléculas
de glioxilato bajo la liberación de CO_{2} inorgánico. La
glioxilato carboligasa de origen bacteriano o de algas así como los
homólogos funcionales de otros orígenes son adecuados para este
fin.
Un polipéptido preferido que tiene actividad de
una glioxilato carboligasa comprende la secuencia de aminoácidos
del SEQ ID NO: 12. De acuerdo con esto, los ácidos nucleicos que
comprenden una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 11 pueden
utilizarse para llevar a cabo la presente invención.
La tercera proteína es una enzima que cataliza
la formación de glicerato a partir de semialdehído tartrónico. Las
enzimas adecuadas para este fin incluyen la semialdehído tartrónico
reductasa de origen bacteriano o de algas así como los homólogos
funcionales de otros orígenes.
Un polipéptido preferido que tiene actividad de
una semialdehído tartrónico reductasa comprende la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 14. De acuerdo con esto, un ácido
nucleico que comprende la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID
NO: 13 puede utilizarse para llevar a cabo la presente
invención.
Con el propósito de expresar los ácidos
nucleicos que codifican los polipéptidos que tienen actividades
enzimáticas requeridas por la presente invención en células
vegetales, se puede utilizar cualquier secuencia reguladora
conveniente. Las secuencias reguladoras proporcionarán el inicio de
la transcripción y de la traducción así como regiones de
terminación, en las que el inicio de la transcripción puede ser
constitutivo o inducible. La región codificante está unida de
manera operativa a dichas secuencias reguladoras. Las secuencias
reguladoras adecuadas están representadas por el promotor
constitutivo 35S que puede ser empleado para plantas dicotiledóneas.
Para plantas monocotiledóneas se puede utilizar el promotor
constitutivo de la ubiquitina, en particular el promotor de
ubiquitina de maíz (GenBank: gi19700915). Los ejemplos de los
promotores inducibles representan los promotores inducibles por la
luz de la subunidad pequeña de RUBISCO, en particular el promotor
rbcS de tomate (GenBank: gi22624), y los promotores de la
"proteína de unión al complejo luz cosecha (lhcb)", en
particular el promotor lhcb de tabaco (GenBank:
gi1890636).
gi1890636).
Los polipéptidos que tienen las actividades
enzimáticas requeridas para la presente invención pueden comprender
una secuencia de aminoácidos que los dirige al cloroplasto, la
membrana del cloroplasto y/o el citoplasma. Las secuencias de
direccionamiento adecuadas son conocidas por los expertos en la
técnica. Preferiblemente, el péptido de tránsito al cloroplasto
derivado del gen de la
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa
de Solanum tuberosum (GenBank: G68077, aminoácidos
1-58) se utiliza para dirigir los polipéptidos de
acuerdo con la presente invención a los cloroplastos.
Alternativamemente, los polipéptidos se dirigen
directamente al cloroplasto utilizando la transformación del genoma
del cloroplasto mediante bombardeo con partículas de secciones de
hoja e integración mediante recombinación homóloga. Los expertos en
la técnica conocen vectores y sistemas de selección adecuados. Las
secuencias codificantes para los polipéptidos pueden transferirse a
vectores individuales a un constructo, en la que los marcos de
lectura abiertos individuales pueden estar fusionados con uno o
varios ARN policistrónicos con sitios de unión a los ribosomas
añadidos delante de cada marco de lectura abierto individual con el
fin de permitir la traducción independiente.
La fofoglicolato fosfatasa y la glicerato
quinasa así como la RUBISCO son enzimas abundantes en el interior
de los cloroplastos de la planta y de este modo no tienen que ser
transferidas a los cloroplastos para permitir el funcionamiento de
la ruta bioquímica novedosa.
La instalación de la ruta propuesta en esta
invención permitirá la reintegración directa del CO_{2} liberado
durante la ruta de reacción a las reacciones fotosintéticas y no se
perderá carbono inorgánico en la mitocondria como se ha descrito
para las reacciones fotorrespiratorias. Por esto, los productos de
la fotorrespiración suprimirán la fotorrespiración aumentando la
concentración de CO_{2} en el sitio de fijación.
Los métodos para confirmar que la ruta novedosa
es funcional en el interior de los cloroplastos de la planta
incluyen:
- \bullet
- Estudiar si los genes son expresados y las proteínas son acumuladas en el interior del cloroplasto.
- \bullet
- Estudiar si los intermedios metabólicos de la ruta se acumulan en la célula vegetal.
- \bullet
- Estudiar cualquier cambio en las propiedades fotosintéticas del transformante mediante medición de la propiedad fotosintética. Esto incluye preferiblemente la determinación del punto de compensación de CO_{2} mediante mediciones del intercambio gaseoso.
- \bullet
- Estudiar el crecimiento, la producción de biomasa y el rendimiento de las plantas en diferentes condiciones de crecimiento, preferiblemente en condiciones no favorables para las plantas C_{3}.
El contenido de la presente invención también lo
constituyen las células vegetales, los tejidos vegetales o las
plantas que comprenden uno o más ácidos nucleicos que codifican
polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i)
glicolato oxidasa o glicolato deshidrogenasa, (ii) glioxilato
carboligasa y (iii) semialdehído tartrónico reductasa.
Las realizaciones preferidas de los ácidos
nucleicos introducidos en las células vegetales, tejidos vegetales
o plantas se han mencionado anteriormente.
Debido al aumento del potencial fotosintético,
las plantas de la presente invención obtienen una o más de las
siguientes propiedades: elevado rendimiento por peso seco, mayor
resistencia a la sequía y al calor, aumento de la eficacia de uso
del nitrógeno, o reducción de los requerimientos para la
fertilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Principal ciclo fotorrespiratorio de
la planta. RUBISCO =
Ribulosa-1,5-bis-fosfato
Carboxilasa/Oxigena-
sa; PGP = Fosfoglicolato Fosfatasa; GO = Glicolato oxidasa; GGAT = Glutamato Glioxilato Aminotransferasa; SS = Serina Sintasa; SGAT = Serina Glioxilato Aminotransferasa; HPR = Hidroxipiruvato Reductasa; GK = Glicerato Quinasa
sa; PGP = Fosfoglicolato Fosfatasa; GO = Glicolato oxidasa; GGAT = Glutamato Glioxilato Aminotransferasa; SS = Serina Sintasa; SGAT = Serina Glioxilato Aminotransferasa; HPR = Hidroxipiruvato Reductasa; GK = Glicerato Quinasa
Figura 2: Ruta C_{4} (establecida en maíz). CA
= Anhidrasa Carbónica; PEP = fosfoenolpiruvato; PEPC =
Fosfoenolpiruvato Carboxilasa; OAA = oxaloacetato; MDH = Malato
Deshidrogenasa; ME = Enzima Málica; RuBP =
ribulosa-1,5-bisfosfato; Pyr =
piruvato; PPDK =
piruvato-P_{i}-diquinasa
Figura 3: Ruta unicelular de tipo C_{4}. OAA =
oxaloacetato; PEP = fosfoenolpiruvato; Pyr = piruvato. PEPC =
Fosfoenolpiruvato Carboxilasa; PCK = Fosfoenolpiruvato
Carboxiquinasa; ME = Enzima Málica; PPDK =
piruvato-P_{i}-diquinasa; PPT =
Traslocador de Triosa fosfato
Figura 4: Ruta que utiliza glicolato bacteriano.
GO = Glicolato oxidasa; GCL = Glioxilato Carboligasa; TSR =
Semialdehído Tartrónico Reductasa
Figura 5: Ruta plastidial novedosa descrita en
esta invención.
Las actividades enzimáticas escritas en negrita
tienen que ser instaladas en el cloroplasto de la planta mediante
transformación. PGP = Fosfoglicolato Fosfatasa; GO = Glicolato
oxidasa; GCL = Glioxilato Carboligasa; TSR = Semialdehído Tartrónico
Reductasa; GK = Glicerato Quinasa; RuBP =
ribulosa-1,5-bisfosfato.
Figura 6: Representación esquemática de los
constructos de ADN-T utilizados para la
transformación de la planta. LB, RB = borde izquierdo y borde
derecho, Pnos = Promotor de la Nopalina Sintasa, nptII = Neomicina
Fosfotransferasa, pAnos = Señal de Poliadenilación de Nopalina
Sintasa, SAR = Región de Anclaje al Armazón, P35SS/pA35S = Promotor
y Señal de Poliadenilación del gen 35S intensificados
transcripcionalmente del virus del mosaico de la coliflor, TL =
región no traducida 5' del virus del grabado del tabaco, cTP =
Péptido de Tránsito al Cloroplasto de la
Ribulosa-1,5-bisfosfato Carboxilasa
de patata.
Figura 7: Representación esquemática de los
constructos del vector utilizados para la transformación de la
planta. LB, RB = borde izquierdo y derecho, Pnos = Promotor de la
Nopalina Sintasa, nptII = Neomicina Fosfotransferasa, pAnos = Señal
de Poliadenilación de la Nopalina Sintasa, SAR = Región de Anclaje
al Armazón, P35SS/pA35S = Promotor y Señal de Poliadenilación
intensificados transcripcionalmente del gen 35S del virus del
mosaico de la coliflor, TL = región no traducida 5' del virus del
grabado del tabaco, cTP = Péptido de Tránsito al Cloroplasto de la
Ribulosa-1,5-bisfosfato Carboxilasa
de patata, GCL = Glioxilato Carboligasa de Escherichia coli,
TSR = Semialdehído tartrónico Reductasa de Escherichia coli,
ori ColE1 = Origen de Replicación para la propagación en
Escherichia coli, ori RK2 = Origen de Replicación para la
propagación en Agrobacterium tumefaciens, bla =
\beta-Lactamasa
Figura 8: Un constructo para la expresión
plastídica policistrónica de los componentes de la ruta. GO =
Glicolato oxidasa; glcD = subunidad glcD de GO de E.
coli; glcE = subunidad glcE de GO de E. coli; glcF =
subunidad glcF de GO de E. coli; TSR = Semialdehído
Tartrónico Reductasa; GCL = Glioxilato Carboligasa.
Figura 9: Actividad Glicolato deshidrogenasa de
un homólogo de Arabidopsis thaliana para el operón glc de
E. coli. Se muestra la producción de glioxilato en un
análisis de glicolato deshidrogenasa como se ha descrito antes
(Lord, 1972). Las proteínas fueron expresadas en exceso como
versiones etiquetadas con His en E. coli. AtglcD = Homólogo
de Arabidopsis thaliana para el operón glc de E.
coli. no rel. = proteína no relacionada que fue expresada en
paralelo; - co-factor = análisis de ausencia de
co-factores orgánicos
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se amplificaron los genes que codificaban la
semialdehído tartrónico reductasa, la glioxilato carboligasa, y los
marcos de lectura abiertos que codifican los polipéptidos D, E, y F
del operón de la glicolato oxidasa del genoma de E. coli
utilizando el método de la PCR. Las secuencias fueron obtenidas de
bases de datos públicas. Los oligonucleótidos fueron
complementarios al inicio y al final de las regiones codificantes,
respectivamente, proporcionadas en la lista de secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se amplificó ADNc que codificaba glioxilato
reductasa a partir de ARNm de hígado humano utilizando el método
"Transcriptasa Inversa-PCR". Las secuencias se
obtuvieron de publicaciones científicas (Rumsby y Cregeen, 1999).
El ARNm fue sometido a transcripción inversa utilizando
oligonucleótidos oligo-dT como comienzo y la PCR se
llevó a cabo con oligonucleótidos complementarios al inicio y el
final de las regiones codificantes, respectivamente, proporcionadas
en la lista de secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se identificó un marco de lectura abierto con
homología a nivel de proteínas al marco de lectura abierto de
glcD del operón glc de E. coli como una
secuencia genómica de Arabidopsis thaliana en una base de
datos pública. Se aisló ARN de tejido foliar joven y se amplificó la
secuencia codificante utilizando el método de la "Transcriptasa
Inversa-PCR". El ARNm fue sometido a
transcripción inversa utilizando oligonucleótidos
oligo-dT como comienzo y la PCR se llevó a cabo con
oligonucleótidos complementarios al inicio y el final de las
regiones codificantes, respectivamente, proporcionadas en la lista
de secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las secuencias codificantes de los genes
descritos en los Ejemplos 1-3 fueron clonadas en el
vector pET22b(+) [Novagen, Darmstadt, Alemania] como fusión
traduccional N-terminal a seis resos histidina. Las
proteínas fueron expresadas en exceso en E. coli cepa ER2566
[NEB, Beverly, MA, EEUU] y purificadas en parte sobre una matriz de
afinidad Ni^{2+}-quelato [Qiagen, Hilden,
Alemania] siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las actividades de la semialdehído tartrónico
reductasa y la glioxilato carboligasa se midieron en extractos
brutos derivados de cepas que las expresaban en exceso y no las
expresaban en exceso mediante las técnicas descritas antes (Kohn,
1968; Chang et al., 1993). Los resultados indican que las
proteínas mantienen su función enzimática en la fusión traduccional
con seis restos histidina y que las secuencias amplificadas
codifican sus respectivas actividades enzimáticas.
Se midió la actividad del homólogo de
Arabidopsis para el operón glc de E. coli (SEQ
ID NO: 10) en extractos brutos de cepas bacterianas que la
expresaban en exceso y no la expresaban en exceso como se ha
descrito antes (Lord, 1972). Los resultados indican que el homólogo
de Arabidopsis es una auténtica glicolato deshidrogenasa
capaz de oxidar el glicolato en presencia de cofactores orgánicos.
En la Figura 9 se muestra un diagrama que muestra las actividades
relativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para la transformación de la planta, se
insertaron los constructos del gen en el vector de expresión vegetal
binario pTRAKc, un derivado de pPAM (GenBank: AY027531). La casete
de expresión estaba flanqueada por la región de anclaje al armazón
del gen RB7 de tabaco (GenBank: U67919). Se utilizó la casete
nptII de pPCV002 (Koncz y Schell, 1986) para la selección de
las plantas transgénicas. La expresión de los genes está bajo el
control constitutivo del promotor 35S de CaMV intensificado
transcripcionalmente (Reichel et al., 1996). Las proteínas
fueron expresadas como una fusión traduccional a un péptido de
tránsito a cloroplastos derivado del gen de la
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa
de Solanum tuberosum (Gen Bank: G68077, aminoácidos
1-58). En la Figura 6 se da una representación
esquemática del ADN-T. Se clonaron constructos
individuales para la semialdehído tartrónico reductasa (TSR) y la
glioxilato carboligasa (GCL) en los sitios de restricción
MluI y Ecl136II del vector. Se elaboró un constructo que
contenía ambos genes cortando un fragmento de 4629 pb del constructo
que contenía la secuencia codificante de TSR con las enzimas de
restricción AscI y ScaI y ligándolo en el vector que
contenía la secuencia codificante de GCL cortada con las enzimas de
restricción PmeI y ScaI. Antes de la ligación, se
volvieron romos los extremos sobresalientes del sitio de restricción
AscI con la polimerasa de Klenow. En la Figura 7 se
proporciona una representación esquemática del constructo del
vector final. El vector se denomina
pTRAc-rbCS1-cTP-TSR/GCL.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se introdujo el vector
pTRAc-rbCS1-cTP-TSR/GCL
en Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 suministrada por el
Dr. Koncz, Max-Planck-Institute for
Breeding Research, Colonia, Alemania vía electroporación. Se
transformaron secciones de hoja de tabaco siguiendo las técnicas
descritas (Schell et al., 1985). Se seleccionaron los callos
en cuanto a su resistencia a la kanamicina y se regeneraron las
plantas a partir de los callos resistentes. Se seleccionaron líneas
transgénicas potenciales por la presencia de los transgenes
integrados en el genoma utilizando el método de la pCR. Se demostró
la acumulación de los transcritos y las proteínas, respectivamente,
utilizando los análisis RT-PCR o Western con
anticuerpos para la fusión con seis histidinas
C-terminales y se seleccionaron las líneas con una
expresión elevada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se construyó un vector permitiendo la expresión
simultánea de todos los polipéptidos necesarios para el
establecimiento de la ruta propuesta mediante transformación del
genoma del cloroplasto de tabaco. Se amplificó la parte del operón
glc de E. coli que codificaba los polipéptidos
glcD, glcE, y glcF utilizando el método de la
PCR. Se amplificaron las secuencias codificantes para la
semialdehído tartrónico reductasa (TSR) y la glioxilato carboligasa
(GCL) de E. coli y se añadieron secuencias de
shine-dalgarno aguas arriba de la secuencia
codificante utilizando el método de la PCR. Se añadió una fusión
traduccional C-terminal de seis histidinas a la
secuencia codificante de GCL. En cada caso se utilizaron
oligonucleótidos homólogos al principio y al final de las
respectivas secuencias codificantes con prolongaciones para la
adición de los elementos de la secuencia mencionados. El constructo
completo se cortó con NcoI y Bpu1102I y se transfirió
a un vector para la transformación plastídica que se había cortado
con NcoI and XbaI (Bock, 2001). Antes de la ligación,
se volvieron romos los extremos sobresalientes de los sitios de
restricción XbaI y Bpu1102I con la polimerasa de
Klenow. En la Figura 8 se proporciona una representación esquemática
del inserto del vector.
Se transformaron cloroplastos de plantas de
Nicotiana tabacum cv. Petit Havanna utilizando el bombardeo
con partículas. Las líneas transformadas se seleccionaron utilizando
los antibióticos espectinomicina y estreptomicina como se ha
descrito antes (Bock, 2001).
<110> Bayer Cropscience AG
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un método para la producción de
plantas con fotorespiración suprimida y fijación de CO_{2}
mejorada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Le A 36 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1497)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> glc D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 499
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1053
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (1050)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> glc E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1224
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1221)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> glc F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 987
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (984)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glioxilato reductasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1704
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (1701)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Operón homólogo glc de E.
Coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 567
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1782
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (1779)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glioxilato carboligasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 593
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 879
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (876)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Semialdehido tartrónico
reductasa
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 292
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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Claims (28)
1. Un método para la producción de plantas con
la fotorrespiración suprimida y la fijación de CO_{2} mejorada
que comprende introducir en una célula vegetal, un tejido vegetal o
una planta uno o más ácidos nucleicos que codifican polipéptidos
que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o
la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii)
la semialdehído tartrónico reductasa, donde la introducción de uno
o varios ácidos nucleicos da como resultado la expresión de novo de
polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) la
glicolato oxidasa o la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato
carboligasa y (iii) la semialdehído tartrónico reductasa y donde
dichos polipéptidos se localizan en los cloroplastos de la planta
producida.
2. El método de la reivindicación 1, donde
dichos polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos que
dirige dichos polipéptidos al cloroplasto.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2 donde
dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una
glicolato oxidasa se obtienen del operón glc de E. coli.
4. El método de la reivindicación 3, donde
dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de los
SEQ ID NO: 2, 4 y 6.
5. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la
secuencia de polinucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 3 y 5.
6. El método de la reivindicación 1 ó 2 donde
dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una
glicolato deshidrogenasa son glioxilato reductasas humanas.
7. El método de la reivindicación 6, donde
dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 8.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 6 o 7, donde dichos ácidos nucleicos
comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 7.
9. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde dichos polipéptidos que tienen la
actividad enzimática de una glioxilato carboligasa se obtienen de
E. coli.
10. El método de la reivindicación 9, donde
dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 12.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la
secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 11.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, donde dichos polipéptidos que tienen la
actividad enzimática de una semialdehído tartrónico reductasa se
obtienen de E. coli.
13. El método de la reivindicación 12, donde
dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 14.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la
secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 13.
15. Una célula vegetal, tejido vegetal o planta
que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican polipéptidos
que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o
la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii)
la semialdehído tartrónico reductasa, donde dichos polipéptidos se
localizan en los cloroplastos.
16. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de la reivindicación 15, donde dichos polipéptidos comprenden una
secuencia de aminoácidos que dirige dichos polipéptidos al
cloroplasto.
17. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de la reivindicación 15 o 16 donde dichos polipéptidos que tienen
la actividad enzimática de una glicolato oxidasa se obtienen del
operón glc de E. coli.
18. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de la reivindicación 17, donde dichos polipéptidos comprenden la
secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 4 y 6.
19. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde dichos
ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos de los
SEQ ID NO: 1, 3 y 5.
20. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de las reivindicaciones 15 o 16, donde dichos polipéptidos que
tienen la actividad enzimática de una glicolato deshidrogenasa son
glioxilato reductasas humanas.
21. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de la reivindicación 20, donde dichos polipéptidos comprenden la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8.
22. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de una cualquiera de las reivindicaciones 15,16, 20 o 21, donde
dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos
del SEQ ID NO: 7.
23. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, donde dichos
polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una glioxilato
carboligasa se obtienen de E. coli.
24. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de la reivindicación 23, donde dichos polipéptidos comprenden la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12.
25. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, donde dichos
ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ
ID NO: 11.
26. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, donde dichos
polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una semiladehído
tartrónico reductasa se obtienen de E. coli.
27. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de la reivindicación 26, donde dichos polipéptidos comprenden la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14.
28. La célula vegetal, tejido vegetal o planta
de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, donde dichos
ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ
ID NO: 13.
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