ES2334801T3 - Concentrado liquido de bacterias adaptadas y viables para una utilizacion alimentaria. - Google Patents
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Abstract
Concentrado líquido de bacterias lácticas, en particular bacterias del género Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. y Lactococcus spp., en el que las bacterias están adaptadas, son viables, y a una concentración comprendida entre 5,1010 y 5,1011 ufc/ml, siendo dichas bacterias adaptadas más resistentes a diferentes estreses, en particular vinculados a diferentes estreses fisicoquímicos, siendo dicho concentrado susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento que comprende las etapas sucesivas de propagación de las bacterias en un medio de cultivo, de adaptación de las bacterias, de lavado del medio de cultivo que contiene las bacterias adaptadas por milcrofiltración tangencial, y de concentración en bacterias del medio lavado por microfiltración tangencial.
Description
Concentrado líquido de bacterias adaptadas y
viables para una utilización alimentaria.
La presente invención se refiere a un
concentrado líquido de bacterias adaptadas y viables para una
utilización alimentaria. Las bacterias producidas son unas
bacterias lácticas.
La ingestión de ciertas cepas de bacterias, en
particular las que pertenecen a los géneros Lactobacillus y
Bifidobacterium es particularmente benéfica a nivel de la
salud, en particular favoreciendo un buen funcionamiento de la
flora intestinal. En efecto, estas bacterias producen bacteriocinas
y ácido láctico que aumentan la digestibilidad de los alimentos,
favorecen el peristaltismo intestinal, y aceleran la evacuación de
las deposiciones. Además, estas bacterias producen ciertas vitaminas
del complejo B, y favorecen en general la absorción de vitaminas y
minerales, disminuyen el colesterol sanguíneo, refuerzan el sistema
inmunitario y tapizan las mucosas intestinales con el fin de
protegerlas contra la invasión y las actividades de los
microorganismos nocivos.
Debido a este hecho, desde hace varios años, las
industrias agroalimenticias intentan incorporar bacterias de este
tipo en sus productos finales, generalmente yogures.
En la actualidad, estas bacterias se utilizan en
forma congelada o liofilizada. Sin embargo, estos procesos de
producción son traumatizantes para las bacterias que pierden una
parte de su actividad y a veces su viabilidad. Esto es perjudicial
para los productores industriales y para los consumidores de estos
productos puesto que las bacterias deben satisfacer las exigencias
de calidad y las prestaciones tecnológicas, si es posible durante
varios meses. Sería por lo tanto deseable utilizar unas bacterias
producidas mediante un procedimiento que les asegure una viabilidad
y una actividad máximas. Para alcanzar dichos objetivos, un método
consiste en producir las bacterias en una forma líquida. Sin
embargo se ha demostrado que este método genera también una
mortalidad importante de las bacterias, después de la introducción
de las bacterias en el producto final.
Además, para disminuir los costes de almacenaje
de las bacterias y facilitar la adición de las bacterias al
producto final, sería deseable concentrar las bacterias en forma
líquida. Para ello, el experto en la materia utiliza de forma
habitual una etapa de centrifugación o de filtración. Sin embargo,
la centrifugación es un proceso traumatizante para las bacterias
que puede provocar una fuerte mortalidad celular en particular
debida a un fuerte cizallamiento y además, este procedimiento no
está bien adaptado para la centrifugación de volúmenes pequeños del
tipo de los requeridos en la producción de las bacterias destinadas
a ser añadidas como probiótico a los productos alimenticios. En lo
que se refiere a una etapa de filtración clásica, ésta produce
también problemas de mortalidad de las bacterias y de colmatado por
parte de las bacterias de los filtros.
Sería por lo tanto deseable producir un volumen
deseado de concentrado líquido de bacterias que presenten una
actividad y una viabilidad máximas después de la etapa de
concentración y después la introducción en el producto final.
Los inventores han mostrado que una etapa de
adaptación de las bacterias permitía aumentar de forma significativa
la actividad y la viabilidad de las bacterias después de la
introducción en el producto final.
Además, los inventores han mostrado que una
etapa de filtración tangencial, bajo ciertas condiciones
particulares (presión, concentración, porosidad de membrana etc),
permitía concentrar grandes volúmenes de cultivos de bacterias
preservando su viabilidad y sin colmatar los filtros.
La filtración tangencial permite producir dos
corrientes en función de la naturaleza y de la estructura de la
membrana: el permeado (el medio de cultivo sustancialmente exento de
bacterias y el retentado (que contiene las bacterias, también
denominado concentrado). En una filtración tangencial, el fluido no
circula perpendicularmente sino paralelamente a la superficie de la
membrana y asegura así por su velocidad de corriente un auto
limpiado que previene la acumulación de depósitos que obturan la
superficie de filtración (denominado comúnmente colmatado de los
filtros).
En Shah (Journal of dairy Science,
2000, 83:894-907), se pasa revista a diversos
enfoques para mejorar la viabilidad de los probióticos en los
yogures, entre otros la adaptación al estrés.
Margolles et al. (International
Journal of Food Microbiology, 2003, 82:
191-198) han seleccionado unas cepas de
Bifidobacterium que se han vuelto resistentes a las sales de
la bilis y al colato de sodio por adaptación.
Kim et al. (Current
Microbiology, 2001, 43: 346-350) han
estudiado diferentes aspectos de la respuesta al estrés en los
Lactobacillus acidophilus.
Crespo et al. (Chemical
Engineering Science, 1992, 47: 205-214)
han analizado unos sistemas de reciclado de células por filtración
tangencial interesándose más particularmente en unas bacterias
acidogénicas.
Caridis et al. (Bioprocess
Engineering 1997, 16: 199-208) han
evaluado un sistema de microfiltración tangencial con ayuda de unas
membranas tubulares de cerámica, sobre unas suspensiones de
Mycobacterium.
Tanny et al (Applied and
Environmental Microbiology, 1980,
40:269-273) han evaluado un cartucho plegado de
filtración tangencial para concentrar y recoger unas bacterias
patógenas o no que pertenecen a las especies Escherichia
coli y Salmonella typhimurium.
Reid et al (Journal of Applied
Bacteriology, 1976, 41:321-324) describen
la utilización de un sistema de filtración por flujo tangencial
para recuperar, concentrar y lavar unas suspensiones de
Corynebacterium parvum en unas condiciones asépticas.
Un objeto de la presente invención es por lo
tanto un concentrado de bacterias lácticas caracterizado porque el
concentrado es líquido, porque las bacterias están adaptadas, son
viables y se encuentran en una concentración comprendida entre
5.10^{10} y 5.10^{11} ufc/ml, y porque es susceptible de ser
obtenido mediante un procedimiento que comprende las etapas
sucesivas de propagación de las bacterias en un medio de cultivo, de
adaptación de las bacterias, de lavado del medio de cultivo que
contiene las bacterias adaptadas por microfiltración tangencial, y
de concentración en bacterias del medio lavado por microfiltración
tangencial.
Por bacterias lácticas, se designan
preferentemente según la presente invención unas bacterias del
género Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus
spp, Lactococcus spp, y en particular Lactobacillus casei,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium animalis,
Bifidobacterium breve, Streptococcus thermophilus, Lactococcus
lactis.
Por bacterias adaptadas, se designan, según la
presente invención, unas bacterias más resistentes a diferentes
estreses, en particular asociadas a diferentes estreses
fisicoquímicos.
Por bacterias adaptadas y viables, se designan,
según la presente invención, unas bacterias cuya proporción de
supervivencia después de 28 días en un producto alimenticio, en
particular un producto lácteo o una bebida, es superior al 60% y
ventajosamente superior al 80%.
La viabilidad de las bacterias se mide mediante
unas técnicas de numeración que son conocidas por el experto en la
materia como por ejemplo la numeración en masa, la numeración en
superficie, las células de Malassez, el recuento directo, la
turbidez, la nefelometría, el recuento electrónico, la citometría en
flujo, la fluorescencia, la impedimetría, el análisis de
imágenes.
Según la presente invención, el concentrado se
caracteriza porque las bacterias adaptadas presentan por lo menos
una de las características siguientes cuando son añadidas a un
producto alimenticio:
- i)
- una tasa de supervivencia superior al 80% después de 14 días en un producto alimenticio a una temperatura comprendida entre 4ºC y 45ºC, teniendo dicho producto alimenticio un pH comprendido entre 3 y 7, ó
- ii)
- una tasa de supervivencia superior al 60% y ventajosamente superior al 80% después de 28 días en un producto alimenticio a una temperatura comprendida entre 4ºC y 45ºC, teniendo dicho producto un pH comprendido entre 3 y 7.
Según la presente invención, el concentrado se
caracteriza porque las bacterias presentan las dos características
i) y ii).
Según la presente invención, el concentrado se
caracteriza porque el producto alimenticio es un producto lácteo
y/o una bebida.
Según la presente invención, las bacterias del
concentrado son viables durante un periodo comprendido entre 4 y 6
semanas.
Según la presente invención, el medio de cultivo
de la etapa de propagación es un medio sintético.
Por medio sintético, se designa según la
presente invención un medio en el que son introducidos unos
componentes sometidos a un control cuantitativo y cualitativo
riguroso.
Según la presente invención, la solución
utilizada en la etapa de lavado está adaptada para la utilización
alimenticia del concentrado de bacterias y presenta una presión
climática compatible con la viabilidad de las bacterias.
Los inventores han mostrado que la etapa de
adaptación de las bacterias permite reducir su mortalidad, provocada
por el cambio del medio de las bacterias entre su medio de cultivo
y el producto alimenticio final a aditivar.
Según la presente invención se demuestra la
adaptación de las bacterias mediante la medición de los parámetros
del medio de cultivo de las bacterias y/o de los parámetros de las
bacterias. Según la presente invención, los parámetros del medio de
cultivo son preferentemente el pH, la presión osmótica y/o la
temperatura.
Para demostrar la adaptación de las bacterias
son posibles otros parámetros del medio de cultivo de las bacterias,
como por ejemplo la concentración en azúcar del medio
bacteriano.
Preferentemente se realiza, en el caso en que el
parámetro del medio de cultivo es el pH, la etapa de adaptación
mediante la disminución del pH por acidificación natural.
Con el fin de realizar la etapa de adaptación de
las bacterias al pH mediante acidificación natural, se puede medir
por ejemplo la concentración en azúcar del medio de fermentación y
más allá de una concentración umbral para cada especie de
bacterias, se sabe que el pH ya no está regulado y resulta muy fácil
la adaptación al medio.
Así, por ejemplo si la concentración en azúcar
del medio de fermentación de Lactobacillus casei es de 9
g/l, el pH ya no está regulado y es aproximadamente igual a 5. Es
entonces más fácil para la cepa adaptada ser añadida a un nuevo
medio y esto permite una viabilidad más importante de las bacterias
en el medio final.
Además, según la presente invención, se puede
utilizar la filtración tangencial para la etapa de adaptación de
las bacterias.
Según la presente invención, la o las membranas
de filtración tangencial tienen una porosidad comprendida entre
0,01 y 0,5 \mum y de manera preferente, entre 0,1 y 0,3
\mum.
Estas membranas son utilizadas para las etapas
de lavado y de concentración del procedimiento y eventualmente la
etapa de adaptación de las bacterias.
Las membranas de filtración se caracterizan
por:
- -
- la porosidad y el espesor de la capa filtrante de los que depende el caudal del permeado,
- -
- el diámetro de los poros y su reparto de los que depende la eficacia de la separación,
- -
- el material empleado del que depende la resistencia mecánica, química, térmica y la facilidad de limpiado.
Por membrana de filtración, se designan unas
membranas orgánicas o minerales.
Las membranas orgánicas pueden estar compuestas
entre otros componentes por acetato de celulosa, poliamidas
aromáticas, polisulfona, ésteres de celulosa, celulosa, nitrato de
celulosa, PVC, o Polipropileno.
Las membranas minerales pueden estar compuestas
entre otros componentes por cerámica sinterizada, metal sinterizado,
carbono o vidrio.
Según la presente invención, el parámetro de las
bacterias es el tamaño de las bacterias.
Preferentemente, en el caso en que la adaptación
se demuestra por el tamaño de las bacterias, la distribución de las
longitudes de cada bacteria de dicho concentrado se sitúa
mayoritariamente entre 0,1 y 10 micrómetros, ventajosamente entre
0,5 y 5 micrómetros.
La medición del tamaño de las bacterias se
realiza mediante un medio adaptado.
Un medio adaptado puede ser por ejemplo un
muestreo regular de bacterias seguido de una medición del tamaño de
las bacterias por citometría de flujo.
Según la presente invención, el pH del
concentrado está comprendido entre 3 y 6.
Según la presente invención, la temperatura de
utilización del concentrado está comprendida entre 25 y 45ºC y
preferentemente entre 35 y 39ºC.
Por temperatura de utilización, se designa según
la presente invención la temperatura del concentrado cuando es
añadido a un producto alimenticio.
Según la presente invención, el concentrado es
acondicionado en unas bolsas flexibles, herméticas y estériles.
Por bolsas flexibles y herméticas, se designan,
según la presente invención y de forma preferente, unas bolsas de
plástico alimentario.
Según la presente invención, el concentrado,
acondicionado en bolsas flexibles herméticas, puede ser conservado
a una temperatura comprendida entre -50ºC y 4ºC después de su
acondicionado.
De manera opcional, es posible añadir de nuevo
al concentrado líquido de bacterias adaptadas y viables
acondicionado en bolsas flexibles y herméticas, y conservado a
bajas temperatura, unas moléculas crioprotectoras tales como por
ejemplo la sacarosa.
\newpage
Según la presente invención, el concentrado,
acondicionado en bolsas flexibles y herméticas, conservado a una
temperatura comprendida entre -50ºC y 4ºC, es recalentado hasta una
temperatura comprendida entre 25ºC y 45ºC, ventajosamente entre 35
y 39ºC mediante un medio adaptado y antes de ser utilizado.
Por medio adaptado, se designa según la presente
invención por ejemplo la utilización de un baño maría a una
temperatura no letal para las bacterias, por ejemplo 37ºC.
Un objeto de la presente invención es asimismo
la utilización del concentrado líquido de bacterias adaptadas y
viables según la presente invención como aditivo alimenticio.
Por aditivo alimenticio se designa, según la
presente invención cualquier sustancia química añadida a los
alimentos durante su preparación o con vistas a su almacenamiento
para obtener un efecto técnico deseado. Además, según la presente
invención, el concentrado líquido de bacterias posee una numeración
estable, siendo las bacterias viables y no realizándose ninguna
fermentación en el producto final aditivado.
Un objeto de la presente invención es asimismo
un producto alimenticio aditivado, caracterizado porque el aditivo
alimenticio utilizado es el concentrado líquido de bacterias
adaptadas y viables según la presente invención.
Según la presente invención, el producto
alimenticio es un producto lácteo y/o una bebida.
Por producto lácteo se designa según la presente
invención, además de la leche, los productos derivados de la leche,
tales como la nata, el helado, la mantequilla, el queso, el yogur;
los productos secundarios, como el lactosuero, la caseína así como
diversos alimentos preparados que contienen como ingrediente
principal leche o unos constituyentes de la leche.
Por bebida se designa según la presente
invención unas bebidas como por ejemplo los zumos de frutas, las
mezclas de leche y zumos de frutas, los zumos vegetales tales como
el zumo de soja, el zumo de avena o el zumo de arroz, las bebidas
alcoholizadas como por ejemplo el kéfir, las sodas, y las aguas de
fuente o minerales aditivadas o no con azúcar o por ejemplo
aromas.
Un objeto de la presente invención es asimismo
un procedimiento de fabricación de un producto alimenticio
aditivado según la presente invención, caracterizado porque el
concentrado líquido de las bacterias adaptadas y viables es añadido
al producto alimenticio al final de la línea de producción y
preferentemente antes del acondicionado del producto
alimenticio.
Según la presente invención, el procedimiento de
fabricación de un producto alimenticio aditivado se caracteriza
porque el concentrado líquido de bacterias adaptadas y viables es
añadido al producto alimenticio en línea por bombeo.
La presente invención se pondrá más claramente
de manifiesto a partir de la descripción siguiente, que se refiere
a unos ejemplos de medición de la viabilidad y adaptación de las
bacterias del concentrado líquido según la presente invención.
Sin embargo, resulta evidente que estos ejemplos
se proporcionan únicamente a título de ilustración del objeto de la
invención, no constituyendo de ninguna manera una limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Seguimiento de la viabilidad de las
cepas de Lactobacillus casei adaptadas y no adaptadas en un
producto alimenticio del tipo yogur a lo largo de un periodo de 28
días.
Figura 2a: Histograma de distribución del tamaño
de las cepas de Lactobacillus casei adaptadas y no adaptadas
antes de ser sometidas a un estrés ácido.
Figura 2b: Histograma de distribución del tamaño
de las cepas de Lactobacillus casei adaptadas y no adaptadas
después de ser sometidas a un estrés ácido.
Figura 3: Curvas que muestran la adaptación del
Lactobacillus casei con respecto a la temperatura del medio
del cultivo (37ºC y 39ºC). La permisividad relativa
\varepsilon_{R} (cantidad adimensional igual a permisividad
\varepsilon, expresada en pF/cm, dividida por la permisividad del
vacío \varepsilon_{0}) se expresa en función de la edad de las
bacterias (en horas).
Figura 4: Curvas que muestran la adaptación del
Lactobacillus casei en función de la presión osmótica
(concentración en glucosa de 20, 40 y 80 g/l, respectivamente en
gris claro, gris oscuro y negro). La permisividad \varepsilon,
expresada en PF/cm, se expresa en función de la densidad óptica
(DO).
\newpage
Ejemplo
1
Se desea evaluar las consecuencias de una etapa
de adaptación de cepas de Lactobacillus casei a nivel de su
viabilidad.
Para ello, se prepara un lote de bacterias
testigo de Lactobacillus casei que son inseminadas en un
medio MRS (medio especial que perite el crecimiento de los
lactobacilos, puesto a punto por Man, de Roghosa y Sharpe).
En paralelo a este lote testigo, se prepara un
lote de bacterias Lactobacillus casei, que después de su
inseminación en un medio MRS son adaptadas mediante una etapa de
acidificación natural.
Para llevar a cabo dicho proceso, después de 17
horas de cultivo, se realiza una disminución del pH por
acidificación natural a lo largo de una hora para pasar el pH de
6,5 a un pH de 5.
A continuación, los dos lotes de bacterias son
lavados y concentrados en bacterias por microfiltración
tangencial.
Estos dos concentrados de bacterias son
introducidos separadamente en una masa de yogur a un pH de 5,5 y a
una temperatura de 10ºC.
Se mide la cantidad de bacterias vivas el D+1 en
los dos lotes de yogures.
A continuación se extrae todos los días una
muestra de los dos lotes de yogur aditivados respectivamente con el
concentrado bacteriano testigo y con el concentrado de bacterias
adaptadas, y se cuantifica el número de cepas supervivientes con
respecto al número de cepas vivas el D+1. Para esto se realiza una
numeración en masa.
Para cada una de las mediciones de viabilidad
durante el periodo de conservación del producto acabado, este
último es homogeneizado correctamente antes de la toma de muestras.
Se extrae una muestra estéril de 1ml de producto. Se realiza una
dilución en serie de 10 en 10. Las diferentes diluciones del
producto son colocadas en una placa de Petri y se vierte un medio
gelificado líquido (calentado previamente a 50ºC) sobre estas
fracciones de producto. Se escogerá el medio a verter en función de
la naturaleza de las bacterias que se desean contar. El medio
gelificado se endurece. Las placas de Petri son entonces colocadas
en una incubadora durante algunos días (2-5d) a
37ºC. Los resultados se presentan en la figura 1.
Se observa que al cabo de 7 días, el número de
bacterias supervivientes en el lote de las bacterias testigo es del
80% y en el lote de las bacterias adaptadas es del 105% (se ha
producido un ligero crecimiento bacteriano).
Al cabo de 14 días, el número de bacterias
supervivientes en el lote de las bacterias testigo es del 58% y en
el lote de las bacterias adaptadas es del 110% (se ha producido un
ligero crecimiento bacteriano).
Al cabo de 28 días, el número de bacterias
supervivientes en el lote de las bacterias testigo es del 42% y en
el lote de las bacterias adaptadas es del 110% (se ha producido un
ligero crecimiento bacteriano).
En conclusión, la etapa de adaptación de las
bacterias induce una disminución de la mortalidad de las bacterias
del orden de un 60% con respecto a un lote testigo de bacterias no
adaptadas, después de 28 días en un yogur.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se desea seguir la evolución del tamaño de las
bacterias adaptadas y de las bacterias no adaptadas sometidas a un
estrés ácido.
Para ello, se prepara un lote de bacterias
testigo Lactobacillus casei que son inseminadas en un medio
MRS (medio especial que permite el crecimiento de los lactobacilos
puesto a punto por Man, de Rogosa y Sharpe).
En paralelo a este lote testigo, se prepara un
lote de bacterias Lactobacillus casei, que después de su
inseminación en un medio MRS son adaptadas mediante una etapa de
acidificación natural.
Para esto, después de 17 horas de cultivo, se
realiza una disminución del pH por acidificación natural a lo largo
de una hora para pasar el pH de 6,5 a un pH de 5.
A continuación, los dos lotes de bacterias son
lavados y concentrados en bacterias por microfiltración
tangencial.
A continuación se toma una muestra de bacterias
y se mide su tamaño por citometría de flujo. Así se establece un
histograma de distribución de tamaños de las bacterias adaptadas y
no adaptadas (lote testigo) (figura 2a). Se observa que la
distribución del tamaño de las bacterias de los dos lotes es muy
similar.
A continuación, los dos lotes de bacterias son
sometidos a un estrés ácido mediante la adición de las bacterias a
un medio que tiene un pH de 3.
A continuación se toma una muestra de las
bacterias y se mide su tamaño mediante citometría de flujo. Así se
establece un histograma de distribución de tamaños de las bacterias
adaptadas y no adaptadas después de un estrés ácido (figura 2b). Se
observa que la distribución del tamaño de las bacterias de los dos
lotes es muy diferente. En el lote de bacterias adaptadas, el
tamaño de mayor frecuencia es de 3,2 \mum (frecuencia de 0,016).
En el lote de las bacterias no adaptadas, el tamaño de mayor
frecuencia es de 5,45 \mum (frecuencia 0,012).
En conclusión, la etapa de adaptación de las
bacterias induce una disminución en el tamaño de las bacterias del
orden de un 60% cuando éstas son sometidas a un estrés ácido, con
respecto a unas bacterias no adaptadas. Por lo tanto, es posible
demostrar la adaptación de las bacterias midiendo su tamaño.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se desea demostrar la adaptación de las
bacterias midiendo la influencia del parámetro del medio de cultivo
que es la temperatura.
Para ello, se preparan dos lotes de bacterias
testigo Lactobacillus casei a partir de un mismo inóculo.
Estos dos lotes son inseminados en un medio MRS (medio especial que
permite el crecimiento de los lactobacilos puesto a punto por Man,
de Rogosa y Sharpe).
Se utiliza una sonda de biomasa que permite
medir la permisividad relativa \varepsilon_{R}. Las sondas se
pueden utilizar para este fin son conocidas por experto en la
materia (véase en particular el documento FR 2835921). La
permisividad \varepsilon_{R} es una cantidad adimensional igual
a la permisividad \varepsilon (expresada en pF/cm) dividida por
la permisividad del vacío \varepsilon_{0}
(\varepsilon_{0}=8,854187.10^{-2} pF/cm). La evolución de la
permisividad relativa se mide a lo largo del tiempo. La permisividad
relativa será función del número de células vivas y del tamaño de
estas células.
Se cultivan los dos medios de cultivo
rigurosamente idénticos y que comprenden la misma cantidad de
bacterias uno a 37ºC y el otro a 39ºC.
La cantidad de cepas aumenta a lo largo del
tiempo, lo que es normal.
Los inventores han podido verificar que el
número de células total no era diferente en los dos medios de
cultivo. Se puede utilizar una técnica clásica de medición de la
densidad óptica (del tipo espectrómetro de absorción) con este fin
o bien una sonda óptica Wedgewood (sistema que mide en el infrarrojo
cercano la densidad óptica de las suspensiones microbianas). La
absorbancia del medio medida mediante un espectrómetro será función
de la cantidad de células totales en el medio. También se pueden
utilizar unas técnicas de numeración sobre placa.
Gracias a la sonda de biomasa utilizada, se
puede demostrar que las bacterias cambiaban de forma y tamaño, por
lo tanto se adaptaban en función de la temperatura del medio de
cultivo. La figura 3 ilustra esta observación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se desea demostrar la adaptación de las
bacterias midiendo la influencia de dos parámetros del medio de
cultivo considerados conjuntamente, que son la temperatura y el
pH.
Para ello, se preparan tres lotes de bacterias
testigo Lactobacillus casei a partir de un mismo inóculo.
Se cultivarán los tres medios de cultivo a tres
temperaturas diferentes (35, 37 y 39ºC) sometiendo cada vez las
bacterias a un estrés ácido bajando el pH del medio a un pH de
3.
El cambio de tamaño de las células traducirá su
adaptación a las condiciones del medio. Este tamaño será medido por
microscopía.
\newpage
En la Tabla 1, los resultados obtenidos muestran
bien que las bacterias se adaptan en función de los parámetros del
medio que son la temperatura y el pH puesto que las bacterias
cambian de tamaño.
Ejemplo
5
Se desea demostrar la adaptación de las
bacterias midiendo la influencia del parámetro del medio de cultivo,
que es la presión osmótica.
Para ello, se preparan tres lotes de bacterias
testigo Lactobacillus casei a partir de un mismo inóculo.
Estos lotes son inseminados en un medio MRS (medio especial que
permite el crecimiento de los Lactobacilles puesto a punto
por Man, de Rogosa y Sharpe).
Los tres medios de cultivo que comprenden la
misma cantidad de bacterias contendrán respectivamente unas
cantidades de 20, 40 y 80 g de glucosa por litro de medio de
cultivo. Cuanto mayor sea la concentración de glucosa del medio,
mayor será la presión osmótica de este medio.
Se ha utilizado una sonda que permite medir la
permisividad relativa. Las sondas se pueden utilizar para este fin
son conocidas por el experto en la materia (FR 2835921). Se ha
medido la evolución de esta permisividad relativa a lo largo del
tiempo. La permisividad \varepsilon (expresada en pF/cm) se
calcula multiplicando la permisividad relativa \varepsilon_{R}
por la permisividad del vacío \varepsilon_{0}
(\varepsilon_{0}=8,854187.10^{-2} pF/cm).
Una técnica clásica de medición de la densidad
óptica (del tipo espectrómetro de absorbancia), o bien una sonda
óptica Wedgewood (sistema que mide en el infrarrojo cercano la
densidad óptica de las suspensiones microbianas) se utiliza para
medir la evolución de la densidad óptica del medio a lo largo del
tiempo. El valor de Densidad Óptica (DO) obtenido será función del
número de células total en el medio.
Expresando la permisividad en función de la DO,
la curva resultante (Figura 4) permite demostrar la evolución de la
viabilidad (expresada por la medición de la permisividad) y del
tamaño de las células en función de la presión osmótica del medio.
Los resultados muestran que las bacterias cambian de tamaño. En
efecto, en el caso en que no se produjera un cambio de tamaño de
las células, los resultados observados en la Figura 4 serían dos
rectas rectilíneas. En este caso, se pueden observar dos curvas
(correlación no lineal).
Por lo tanto, las bacterias se adaptan en
función de la presión osmótica del medio de cultivo.
Claims (20)
1. Concentrado líquido de bacterias lácticas, en
particular bacterias del género Lactobacillus spp.,
Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. y Lactococcus
spp., en el que las bacterias están adaptadas, son viables, y a
una concentración comprendida entre 5,10^{10} y 5,10^{11}
ufc/ml, siendo dichas bacterias adaptadas más resistentes a
diferentes estreses, en particular vinculados a diferentes estreses
fisicoquímicos, siendo dicho concentrado susceptible de ser
obtenido mediante un procedimiento que comprende las etapas
sucesivas de propagación de las bacterias en un medio de cultivo,
de adaptación de las bacterias, de lavado del medio de cultivo que
contiene las bacterias adaptadas por milcrofiltración tangencial, y
de concentración en bacterias del medio lavado por microfiltración
tangencial.
2. Concentrado según la reivindicación 1,
caracterizado porque las bacterias adaptadas presentan por lo
menos una de las características siguientes cuando son añadidas a
un producto alimenticio:
- i)
- una tasa de supervivencia superior al 80% después de 14 días en un producto alimenticio a una temperatura comprendida entre 4ºC y 45ºC, teniendo dicho producto alimenticio un pH comprendido entre 3 y 7, o
- ii)
- una tasa de supervivencia superior al 60% y ventajosamente superior al 80% después de 28 días en un producto alimenticio a una temperatura comprendida entre 4ºC y 45ºC, teniendo dicho producto alimenticio un pH comprendido entre 3 y 7.
3. Concentrado según la reivindicación 2,
caracterizado porque las bacterias presentan las dos
características i) y ii).
4. Concentrado según cualquiera de las
reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el producto
alimenticio es un producto lácteo y/o una bebida.
5. Concentrado según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
bacterias son viables durante un periodo comprendido entre 4 y 6
semanas.
6. Concentrado según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
adaptación de las bacterias es demostrada mediante la medición de
parámetros del medio de cultivo de las bacterias y/ó de parámetros
de las bacterias.
7. Concentrado según la reivindicación 6,
caracterizado porque los parámetros del medio de cultivo son
el pH, la presión osmótica, y/o la temperatura.
8. Concentrado según la reivindicación 7,
caracterizado porque el parámetro del medio de cultivo es el
pH y porque la etapa de adaptación se realiza por disminución del
pH por acidificación natural.
9. Concentrado según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque el parámetro de
las bacterias es el tamaño de las bacterias.
10. Concentrado según la reivindicación 9,
caracterizado porque la distribución de las longitudes de
cada bacteria de dicho concentrado se sitúa mayormente entre 0,1 y
10 micrómetros, ventajosamente entre 0,5 y 5 micrómetros.
11. Concentrado según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque su pH está
comprendido entre 3 y 6.
12. Concentrado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se conserva a
una temperatura comprendida entre -50ºC a +4ºC después del
acondicionamiento.
13. Concentrado según la reivindicación 12,
caracterizado porque se recalienta hasta una temperatura
comprendida entre 25 y 45ºC, ventajosamente entre 35 y 39ºC
mediante un medio adaptado antes de ser utilizado.
14. Utilización del concentrado según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 como aditivo alimenticio.
15. Utilización del concentrado según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13, a una temperatura comprendida entre
25 y 45ºC, ventajosamente entre 35 y 39ºC.
16. Recipiente en forma de bolsas flexibles,
herméticas y estériles que comprende el concentrado según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13.
17. Producto alimenticio aditivado,
caracterizado porque el aditivo alimenticio utilizado es un
concentrado líquido de bacterias adaptadas y viables según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
18. Producto alimenticio aditivado según la
reivindicación 17, caracterizado porque se trata de un
producto lácteo y/o una bebida.
19. Procedimiento de fabricación de un producto
alimenticio aditivado según cualquiera de las reivindicaciones 17 y
18, caracterizado porque el concentrado líquido de bacterias
adaptadas y viables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13
es añadido al producto alimenticio al final de la línea de
producción y ventajosamente antes del acondicionamiento del
producto alimenticio.
20. Procedimiento de fabricación de un producto
alimenticio aditivado según la reivindicación 19,
caracterizado porque el concentrado líquido de bacterias
adaptadas y viables es añadido al producto alimenticio en línea por
bombeo.
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