ES2334313B1

ES2334313B1 - Procedimiento supercritico y enzimatico para obtener nuevos esteres de esteroles.

Info

Publication number: ES2334313B1
Application number: ES200801435A
Authority: ES
Inventors: Carlos Fernando Torres Olivares; Paloma De San Roman Pais; Luis Vazquez De Frutos; Francisco J. Señorans Rodriguez; Guzman Torrelo Villa; Guillermo REGLERO RADA; Francisco Ramon Marin Martin; Cristina Soler Rivas
Original assignee: Universidad Autonoma de Madrid; VEGENAT SA
Current assignee: Universidad Autonoma de Madrid; VEGENAT SA
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2008-05-16
Publication date: 2011-01-24
Anticipated expiration: 2028-05-16
Also published as: ES2334313A1

Abstract

Procedimiento supercrítico y enzimático para obtener nuevos ésteres de esteroles.

La presente invención describe nuevos ésteres de esteroles que presenta un esterol esterificado con un ácido carboxílico seleccionado de entre el grupo formado por un ácido graso omega-3, un ácido graso procedente de grasa, láctea, un ácido fenólico, un diterpeno fenólico, el ácido linoleico conjugado o una mezcla de sus isómeros, y sus mezclas distintos de los ácidos carboxílicos presentes en los ésteres de esteroles naturales. La invención describe asimismo un procedimiento de obtención de éstos ésteres de esterol que comprende: (i) una esterificación entre un esterol y un ácido carboxílico en presencia de una lipasa; y (ii) una extracción supercrítica. Asimismo se describe su empleo y composiciones que los contienen.

Description

Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del campo de los ésteres de esteroles, y en particular se refiere a los ésteres de esteroles en los cuales el grupo hidroxilo de un esterol se encuentra esterificado con un ácido carboxílico diferente de los ácidos de los ésteres de esteroles vegetales naturales. La invención se refiere asimismo a un procedimiento para la obtención de esteres de esteroles, en general, y de los nuevos ésteres de esteroles en particular que comprende las etapas de (i) esterificación entre un esterol y determinados ácidos grasos y/o ácidos fenólicos en presencia de una lipasa, y (ii) extracción o fraccionamiento supercrítico, así como al empleo de estos compuestos.

Antecedentes de la invención

Los esteroles vegetales han demostrado ser eficaces en la reducción de los niveles sanguíneos de colesterol mediante la inhibición de la absorción de colesterol en el intestino delgado [Jones et al. (1999) Cholesterol-lowering efficacy of a sitostanol-containing phytosterol mixture with a prudent diet in hyperlipidemic men. American Journal of Clinical Nutrition 69, 1144-1150; Sierksma et al. (1999) Spreads enriched with plant sterols, either esterified 4,4-dimethylsterols or free 4-desmethylsterols, and plasma total- and LDL-cholesterol concentrations. British Journal of Nutrition 82, 273-282.; Weststrate et al. (1999) Safety evaluation of phytosterol esters. Part. 4. Faecal concentrations of bile acids and neutral sterols in healthy normolipidaemic volunteers consuming a controlled diet with or without a phytosterol ester enriched margarine. Food and Chemical Toxicology 37, 1063-1071; Heinemann et al. (1986) Effect of low-dose sitostanol on serum cholesterol in patients with hypercholesterolemia. Atherosclerosis 61, 219-23; Becker et al. (1993) Treatment of severe familia) cholesterolemia in childhood with sitosterol and sitostanol. 3 Pediatr 122, 292-6.; Heinemann et al. (1991) Mechanisms of action of plant sterols on inhibition of cholesterol absorption. Comparison of sitosterol and sitostanol. Eur. J. Clin. Pharmacol. 40, 59-63.; Gylling et al. (1995) Sitostanol ester margarine in dietary treatment of children with familial hypercholesterolemia. J. Lipid Res. 36, 1807-1812; Jones et al. (1999) Cholesterol-lowering efficacy of a sitostanol-containing phytosterol mixture with a prudent diet in hyperlipidemic men, Am 3 Clin Nutr 69, 1140-1150; Quilez et al. (2003) Potential uses and benefits of phytosterols in diet: present situation and future directions Clin. Nutr. 22, 343-351].

De un modo similar se ha descrito en la literatura que algunos ácidos grasos reducen el colesterol total, el colesterol unido a LDL y la lipemia en estudios con animales [Lee et al. (1994) Conjugated linoleic acids and atherosclerosis in rabbits. Atherosclerosis 108, 19-25; Nicolosi et al. (1997) Dietary conjugated linoleic acid reduces plasma lipoproteins and early aortic atherosclerosis in hypercholesterolemic hamsters. Artery 22, 266-277]. Una mayor excreción de esteroles se observó tras la administración de ácido linoleico conjugado en hámsteres con respecto al grupo control [Yeung et al. (2000) Dietary conjugated linoleic acid mixture affects the activity of intestinal acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase in hamsters. Br 3 Nutr 84, 935-41; Bissonauth et al. (2006) The effects of t10,c12 CLA isomer compared with c9,t11 CLA isomer on lipid metabolism and body composition in hamsters. Journal of Nutritional Biochemistry 17, 597-603].

Otros compuestos que han demostrado tener capacidad para reducir los niveles plasmáticos de colesterol son el ácido ferúlico y el orizanol. Este último consiste principalmente en ésteres de ácido ferúlico con sitosterol. Además del efecto de los esteroles vegetales sobre los niveles de colesterol, éstos han mostrado asimismo actividad anticancerígena, antiaterogénica, anti-inflamatoria y antioxidante (Berger et al., 2004, Plant sterols: factors affecting their efficacy and safety as functional food ingredients. Lipids in Health and Disease 3, 5).

Se conocen en el estado de la técnica diversos procesos de esterificación de esteroles tanto en agua como en hexano [Vu et al. (2004) Lipase-catalyzed production of phytosteryl esters and their crystallization behavior in corn oil. Food Research International 37, 175-180]. Sin embargo, estos procedimientos presentan en general el inconveniente de que en todos se hace necesario el empleo de un exceso molar del ácido graso con respecto al esterol con la desventaja adicional del coste adicional que ello implica y la pérdida de producto de partida.

Por ello existe la necesidad en el estado de la técnica de proporcionar un procedimiento alternativo de obtención de ésteres de esteroles que supere al menos en parte las desventajas de los procedimientos actuales.

La presente invención proporciona por tanto un nuevo procedimiento para la obtención de esteres de esteroles, que se basa la esterificación de un esterol con determinados ácidos grasos y/o ácidos fenólicos en presencia de una lipasa, seguida de una extracción supercrítica. El procedimiento se basa asimismo, entre otros aspectos, en la adición del esterol a la mezcla de reacción de esterificación de forma controlada en etapas sucesivas.

El procedimiento propuesto en la invención permite la obtención de ésteres de esteroles en general, sin necesidad de que ninguno de los dos reactivos este presente en exceso. Además, el procedimiento permite de una forma sencilla y limpia, la preparación de nuevos ésteres de esteroles los cuales constituyen un objeto adicional de la presente invención.

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Las dos principales ventajas de los nuevos ésteres de esteroles son, por una parte, que se trata de derivados de esteroles vegetales, más solubles, con hidrodispersabilidad mejorada con respecto al esterol de partida, y por otra que por tanto pueden ser administrados a dosis inferiores con respecto al esterol de partida, manteniendo sin embargo una elevada biodisponibilidad. Además los nuevos ésteres de esteroles combinan en una única molécula los efectos beneficiosos tanto de los esteroles como del ácido graso y/o ácido fenólico correspondiente.

Descripción de la invención

En un aspecto la invención proporciona nuevos ésteres de esteroles que comprenden un esterol y un ácido carboxílico diferente de los ácidos carboxílicos presentes en los ésteres de esteroles presentes en la naturaleza.

Los nuevos ésteres de esteroles, en adelante ésteres de esterol de la presente invención, resultan de la esterificación de un esterol con un ácido carboxílico. Los esteroles de los ésteres de esteroles de la invención pueden ser de origen vegetal, animal, esteroles derivados de algas o de otros microorganismos, como por ejemplo hongos, así como mezclas de los anteriores. En una realización particular los esteroles son fitoesteroles o mezclas de fitoesteroles de origen vegetal, como por ejemplo, el sitosterol, y más particularmente el beta-sitoesterol o campesterol o estigmasterol así como mezclas. En otra realización particular el esterol es fucosterol o ergosterol o mezclas de ambos.

Los ácidos carboxílicos que esterifican los esteroles mencionados, se seleccionan del grupo formado por:

a) un ácido grasos omega-3 mayor de 18 átomos de carbono, tal como ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico y ácido docosapentaenoico;

b) un ácido graso procedente de grasa láctea de cadena larga, corta o media, preferentemente de cadena corta o media, tal como el ácido butírico, ácido valeriánico, el ácido caproico, el ácido hexanoico, el ácido octanoico, ácido ruménico;

c) un ácido fenólico tal como el ácido cafeico, ácido cumárico y el ácido cinámico,

d) un diterpeno fenólico, tal como el ácido carnósico o el ácido rosmarínico;

e) un ácido linoleico conjugado y sus isómeros,

y mezclas de los anteriores.

En una realización particular el éster de esterol está constituido por un fitoesterol o una mezcla de fitoesteroles, y un ácido graso omega-3. En otra realización particular el éster de esterol está constituido por un fitoesterol o una mezcla de fitoesteroles, y ácido graso procedente de grasa láctea. En otra realización particular el éster de esterol está formado por un fitoesterol o mezcla de fitoesteroles, preferentemente un sitosterol, y más preferentemente beta-sitosterol y el ácido esterificado es ácido linoleico conjugado.

Los inventores consiguen con los ésteres de esterol de la invención, combinar, modular y/o potenciar los efectos beneficiosos de los esteroles con los efectos saludables que han demostrado tener determinados ácidos grasos y ácidos fenólicos, consiguiéndose en algunos casos un efecto sinérgico, y en otros la suma de los efectos beneficiosos del esterol y de la segunda sustancia bioactiva seleccionada de entre los ácidos carboxílicos arriba descritos y sus mezclas. Además la segunda sustancia bioactiva combinada con el esterol actúa como vehículo lipídico. Asimismo los nuevos ésteres de esteroles de la invención, presentan una mejor hidrodispersabilidad y/o una mejorada biodisponibilidad con respecto a los esteroles de partida.

Los nuevos ésteres de esteroles presentan una capacidad de inhibición de la incorporación del colesterol a las micelas digestivas mayor que otros ésteres de ácidos grasos con esteroles (ver Ejemplo 2). Además poseen otros efectos saludables sobre los niveles plasmáticos de colesterol, y otras propiedades tales como su capacidad anticancerígena, antiaterogénica y/o antioxidante. Por ello como se describe más abajo estos nuevos ésteres de esterol son útiles en la preparación de composiciones farmacéuticas o nutracéuticas, bien solos o en combinación con otros agentes activos, y junto con al menos un excipiente farmacológicamente aceptable, y además son útiles, en la preparación de una composición alimenticia o un alimento, con propiedades beneficiosas para la saludo tales como productos lácteos, mantequilla, margarinas, etc.

Los nuevos ésteres de esteroles de la invención pueden obtenerse mediante un nuevo procedimiento de obtención, útil para sintetizar ésteres de esteroles en general.

Por tanto en otro aspecto la presente invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de ésteres de esteroles, y en particular los nuevos ésteres de esteroles, que comprende las siguientes etapas:

(i): una síntesis enzimática que comprende la esterificación de un esterol y un ácido carboxílico diferente de los ácidos carboxílicos presentes en los ésteres de esteroles presentes en la naturaleza en presencia de una lipasa; y

(ii): una extracción o fraccionamiento supercrítico.

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La reacción de esterificación de esteroles con ácidos carboxílicos, se realiza en un reactor tipo tanque agitado en presencia de una lipasa, y dicha esterificación y a continuación se lleva a cabo la purificación mediante extracción o fraccionamiento con fluidos supercríticos. La reacción de esterificación puede transcurrir en una sola etapa cuando se usa el ácido carboxílico en exceso o en más de una etapa cuando los esteroles y ácidos carboxílicos se encuentran en cantidades estequiométricas. De acuerdo con una realización preferente del procedimiento, la esterificación se realiza en al menos dos etapas. En este último caso, los esteroles son añadidos en etapas sucesivas, y una o más, de las etapas totales del procedimiento de la invención, se llevan a cabo a presión reducida generalmente comprendida entre 100 y 10 milibar.

La reacción de esterificación se lleva a cabo en presencia de una lipasa que puede estar tanto libre como inmovilizada. La purificación posterior con fluidos supercríticos, se lleva a cabo preferentemente mediante fraccionamiento o extracción en columna y en contracorriente. Las condiciones de extracción y fraccionamiento utilizadas varían en función de la composición de ésteres de esterol que se obtiene y puede ser fácilmente determinadas por un experto en la materia. Típicamente se lleva a acabo a una presión comprendida entre 100 y 250 bares, una temperatura de entre 30 y 70ºC y con una relación entre los caudales (en kg/hora) de CO_{2} y de la muestra de entre 5 a 50.

Una ventaja importante del procedimiento de la invención reside en que éste tiene lugar en ausencia de disolvente orgánico lo cual supone una ventaja en cuanto al ahorro en costes, tanto por el hecho de no utilizarlos como por el hecho de evitar el almacenamiento de los mismos, y su tratamiento en la industria, para minimizar sus efectos contaminantes del medioambiente. La etapa de purificación del proceso permite obtener un producto totalmente exento de disolventes orgánicos, de elevada pureza que presenta cualidades aptas para su consumo o administración a animales, incluido el hombre.

En otro aspecto, tal y como se mencionó arriba, la invención se relaciona con el empleo de los nuevos ésteres de esteroles obtenibles mediante el procedimiento de la invención en el tratamiento y/o prevención de diversas enfermedades y/o condiciones tales como, el exceso de colesterol o lipemia, cáncer, y dolencias relacionadas con la aterogenesis o la inflamación como las enfermedades cardiovasculares.

Por lo tanto en otro aspecto la invención se refiere a una composición farmacéutica, alimenticia o nutracéutica que comprende al menos un éster de esterol según la invención y al menos un excipiente farmacológicamente aceptable o un componente alimenticio o alimento. Dicha composición puede incluir además uno o más ingredientes activos adicionales tales como vitaminas, minerales etc.

A continuación se presentan ejemplos ilustrativos de la invención que se exponen para una mejor comprensión de la invención y en ningún caso deben considerarse una limitación del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Procedimiento de obtención de nuevos ésteres de esteroles

Los esteroles vegetales procedentes de desodorizados de aceite de soja (mayoritariamente, beta-sitosterol) se mezclaron con los ácidos grasos procedentes de grasa láctea en condiciones estequiométricas y en dos etapas consecutivas. En una primera etapa un tercio del total de los esteroles se mezcló con los ácidos grasos fundidos previamente a 50ºC, en un agitador orbital. A continuación se añadió un 10% en peso de lipasa de Candida rugosa (Sigma (St. Louis, MO, USA). Trascurridas 4 horas a 40ºC se añadieron los 2/3 restantes de esteroles y la reacción se dejó progresar hasta que el total de los esteroles y ácidos grasos se consumió. Esta segunda etapa se realizó a vacío para eliminar el agua producida en la esterificación (100 mbar). Los disolventes empleados para recuperar la lipasa fueron de grado HPLC (Lab-Scan (Dublin, Ireland)). La posterior extracción supercrítica con CO_{2} (Air Liquide, España) se realizó con 180 y 200 bares de presión y a 40 grados centígrados con una relación entre el CO_{2} y la muestra de 20, empleando una columna de extracción en contracorriente de acero inoxidable 316 SS dividida en cuatro tramos, con sistema de calefacción independiente para cada tramo. La longitud total de la columna fue 300 cm de altura: 120 cm de altura en el tramo inferior y 60 cm de altura en cada uno de los otros tramos, y un diámetro interno de 17,6 mm. Las extracciones se hicieron con una columna de extracción rellena con anillos Fenske. En estas condiciones se obtuvieron ésteres de esteroles con los ácidos grasos procedentes de la grasa láctea (tales como butirato de esterilo, hexanoato de esterilo, octanoato de esterilo, etc.) de pureza superior al 95% en peso.

Ejemplo 2 Efecto de los esteroles vegetales de la invención esterificados con ácido linoleico conjugado (CLA) sobre el desplazamiento del colesterol de las micelas digestivas y comparación con los mismos esteroles esterificados con ácido oleico

Se compararon, por ejemplo, linoleato conjugado de beta-sitosterilo y linoleato conjugado de otros esteroles vegetales procedentes de aceite de soja, frente a oleato de beta-sitosterilo, y oleato de otros esteroles vegetales procedentes de aceite de soja. Los métodos de estimación de la biodisponibilidad mediante digestión in vitro, se desarrollaron a partir del método de Miller (Miller et al, Am. J. Clin. Nutr., 1981). Este método, sin embargo, fue diseñado específicamente para estimar la biodisponibilidad de hierro mediante diálisis en un medio acuoso. Basándose en la simulación de las condiciones fisiológicas, del método de Miller, se han desarrollado otros en los que se pretende simular la digestión de lípidos. Como aspecto fundamental, y diferenciador con respecto al método inicial se suprimió la fase de masticación, se redujo la digestión gástrica al tener poco impacto en los procesos lipolíticos, y se favoreció la formación de micelas, en donde debían encontrarse los compuestos hidrofóbicos.

Las muestras digeridas se sometieron a centrifugación bajo diversas condiciones. Se probaron velocidades de 150000 a 3000 g durante diferentes tiempos a 20ºC. Cuando la fase lipídica se separó de la acuosa, se extrajo esta última y se utilizó inmediatamente como fracción micelar. A partir de la fracción acuosa obtenida se obtuvo el número de micelas, mediante una cámara de conteo celular, el residuo graso, mediante extracción, y el contenido en colesterol. Las micelas obtenidas se separaron mediante centrifugación, recuperándose posteriormente con fines analíticos los compuestos lipofílicos mediante una saponificación y posterior extracción líquido-líquido con disolventes orgánicos.

La fracción micelar se utilizó para determinar su composición por cromatografía de gases (determinación del desplazamiento micelar). La detección y cuantificación de los esteroles, no solo de los presentes en las micelas resultantes de la digestión, sino en todos los pasos mencionados (2 microlitros) se llevó a cabo usando un cromatógrafo de gases (Varian) con una columna de metil silicona (007-1) de 30 m. Se empleó un gradiente de temperaturas consistente en iniciar la temperatura a 80ºC aumentar hasta 180 con un gradiente de temperatura de 40 grados por minuto (2.5 min) y hasta 300ºC a 6º/min se mantuvo después 10 min (32.5 min). Después se subió a 350ºC a 7º/min y se mantuvo durante 50 min mas (89.64 min). La temperatura del inyector se mantuvo a 320ºC y la del detector de ionización de llama a 350ºC seleccionando una división de flujo de 1:5.

Como resultado del ensayo in vitro, los esteroles esterificados con CLA desplazaron más de un 36% del colesterol de las micelas en comparación con los esteroles esterificados con ácido oleico en el que el desplazamiento micelar del colesterol fue tan solo del 14%.

Claims

1. Un éster de esterol que presenta un esterol esterificado con un ácido carboxílico seleccionado de entre el grupo formado por un ácido graso omega-3 mayor de 18 átomos de carbono, un ácido graso procedente de grasa láctea, un ácido fenólico, un diterpeno fenólico, el ácido linoleico conjugado o una mezcla de sus isómeros, y sus mezclas.

2. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el ácido graso omega-3 mayor de 18 átomos de carbono se selecciona de entre el ácido eicosapentaenoico, el ácido docosahexaenoico, el ácido docosapentaenoico, y sus mezclas.

3. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el ácido graso procedente de grasa láctea se selecciona de entre ácido butírico, ácido valeriánico, ácido caproico, ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido ruménico y sus mezclas.

4. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el ácido fenólico se selecciona de entre el ácido cafeico, el ácido cinámico y sus mezclas.

5. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el diterpeno fenólico es el ácido carnósico o el ácido rosmarínico.

6. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el ácido es el ácido linoleico conjugado.

7. Ester de esterol según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el esterol se selecciona de entre un fitoesterol, un esterol procedente de un animal, un esterol procedente de un alga, un esterol procedente de un hongo y sus mezclas.

8. Ester de esterol según la reivindicación 7, en el que el esterol es un fitoesterol o una mezcla de fitoesteroles.

9. Ester de esterol según la reivindicación 8, en el que el esterol es beta-sitosterol o campesterol o estigmasterol, y sus mezclas.

10. Ester de esterol según la reivindicación 7, en el que el esterol es el fucosterol o el ergosterol, y sus mezclas.

11. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el esterol es fitoesterol o una mezcla de fitoesteroles, y el ácido graso esterificado es un ácido graso omega-3.

12. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el esterol es un fitoesterol o una mezcla de fitoesteroles, y el ácido graso esterificado es un ácido procedente de grasa láctea.

13. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el esterol es un fitoesterol y el ácido esterificado es ácido linoleico conjugado.

14. Ester de esterol según la reivindicación 1, en el que el esterol es un fitoesterol y el ácido esterificado es un ácido fenólico.

15. Un procedimiento de obtención de un éster de esterol según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende las siguientes etapas: (i) una reacción de esterificación enzimática entre un esterol y un ácido carboxílico distinto a los que se encuentran en los ésteres de esteroles vegetales presentes en la naturaleza y en presencia de al menos una lipasa; y (ii) una extracción supercrítica.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la etapa (i) se lleva a cabo con cantidades equimoleculares de esterol y de ácido carboxílico.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, en el que la presión durante la etapa de extracción supercrítica está comprendida entre 100 y 250 bares, la temperatura entre 30 y 70ºC y la relación entre los caudales (en kg/hora) de CO_{2} y de la muestra de entre 5 a 50.

18. Empleo de los nuevos ésteres de esteroles según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y prevención de la lipemia o de la hipercolesterolemia.

19. Composición farmacéutica, alimenticia o nutracéutica que comprende al menos un éster de esterol según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y al menos un excipiente farmacológicamente aceptable o un componente alimenticio.