ES2395582B1 - Procedimiento de acilación para la obtención de compuestos de interés alimenticio y/o farmacéutico utilizando esterol esterasas fúngicas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de acilación para la obtención de compuestos de interés alimenticio y/o farmacéutico utilizando esterol esterasas fúngicas.#Procedimiento de acilación de fitosteroles libres o de derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una enzima esterol esterasa, caracterizado porque comprende una reacción de acilación en presencia de una esterol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, preferentemente de la especie O. piceae. Ésteres de fitoesteroles o de los derivados saturados de éstos obtenidos por el procedimiento descrito. Un producto enriquecido con los ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos de la invención, elegido entre un alimento, un preparado alimenticio, un suplemento dietético y un medicamento. Así como el uso de cualquiera de estos productos para reducir los niveles de colesterol en plasma sanguíneo.

Description

Procedimiento de adlación para la obtención de compuestos de interés alimenticio vIo

farmacéutico utilizando esterol esterasas fúngicas

SECTOR DE lA TÉCNICA

5 l a invención va dirigida principalmente al sector de la industria alimentaria, aunque también al sector de la industria nutracéutica, recientemente denominado "nutracéutica médica". Utilizando la invención descrita es posible: i) sintetizar ésteres de esteroles vegetales (fitosteroles) o de los derivados saturados de éstos (fitostanoles) mediante reacciones de acilación de fitosteroles o fitostanoles respectivamente con ácidos grasos, ¡j) mejorar las

10 propiedades de productos previamente e)(istentes (como los fitosteroles o los fitostanoles libres) al aci larlos para incorporarlos a alimentos, ¡¡j) contribuir a la prevención de la aterosclerosis gracias al papel regulador de la absorción del colesterol de los ésteres de fitosteroles y los ésteres de fitostanoles, y iv) introducir un proceso biotecnológico y más concretamente un biocatalizador (enzima) para la síntesis de estos compuestos.

15 ESTADO DE LA TÉCNICA

El ritmo de vida actual con tendencia al sedentarismo y el aumento en el consumo de grasas saturadas ha provocado que una gran parte de la población presente niveles de colesterol en suero elevados, facilitando el desarrollo de aterosclerosis, y aumentando, por ello, las probabilidades de sufrir isquemias. A esto hay que unirle aquéllas personas que presentan 20 deficiencias a nivel del metabolismo del colesterol y padecen hipercolesterolemia. Según la Fundación Española del Corazón, desde el l de enero hasta el 2 de marzo de 2011 se habrían producido en el mundo 2.839.348 muertes por fallo cardiovascular. Aunque no especifican cuántas habrían sido por accidentes cerebrovasculares o ataques agudos de miocardio es fácil suponer que, en un alto porcentaje de los casos, los fallecimientos habrían sido causados por

25 niveles altos de colesterol. Es por todo esto que el exceso de colesterol se puede considerar como una auténtica pandemia que ya en el año 2.002 causó unos 4,4 millones de muertes según la OMS.

Los esteroles vegetales o fitosteroles, y por extensión sus derivados saturados los fitostanoles, tienen una estructura química común a la del colesterol, derivando del núcleo de 30 cielopentanoperhidrofenantreno. Sin embargo, estudios realizados en la última década han

puesto de manifiesto su capacidad para disminuir los niveles de colesterol sérico de tipo LDl (lipoproteína de baja densidad) disminuyendo la probabilidad de desarrollar placas de ateroma. Aunque no se conoce en su totalidad su mecanismo de acción, algunos estudios ponen de manifiesto que podrían reducir la absorción de colesterol en el intestino, al desplazarlo de las micelas digestivas.

Por tanto, el consumo de fitosteroles y fitostanoles podría amortiguar y ayudar a prevenir los niveles altos de colesterol en la población pero al no ser sintetizados por el organismo, han de ser incorporados en la dieta, mediante la ingestión de frutas y vegetales o de productos enriquecidos en ellos (Chen et al. Cholesterol-Iowering nutraceuticals and functional foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56: 8761-8773. 2008). De hecho, existen patentes como la US 7.147.859 B2 (Bruno and Falci, 2006) en la que se describen diferentes formulaciones con ¡3-sitosterol, uno de los fitosteroles más abundantes, entre sus componentes. Sin embargo, uno de los principales problemas para su incorporación en diferentes alimentos (principalmente derivados lácteos o de aceites vegetales) ha sido su alto punto de fusión y baja solubilidad. Una solución es esterificar los esteroles y estanoles libres con ácidos grasos de interés para aumentar su solubilidad (Thompson y Grundy. History and development of plant sterol and stanol esters for cholesterol-Iowering purposes. The American Journal of Cardiology 96: 3-9. 2005; Villeneuve et al. lipase-catalyzed synthesis of canola phytosterols oleate esters as cholesterol lowering agents. Enzyme and Microbial Technology 37: 150-155. 2005). Ha sido demostrada mayor eficacia en reducir la absorción de colesterol a nivel intestinal con una dieta suplementada con fitosteroles esterificados que con fitosteroles libres (Weber et al. Cholesterol-Iowering food additives: lipase-catalysed preparation of phytosterol and phytostanol esters. Food Research International 35: 177-181. 2002).

Uno de los primeros productos enriquecidos que comenzó a comercializarse en el año 1995 bajo la marca Benecole es una margarina que incorpora un éster de estanol y cuyo lanzamiento al mercado fue consecuencia de la patente creada por la compañía finla ndesa Raisio. Esta patente fue el punto de partida para el desarrollo de nuevos productos, así, en la patente US 6.087.353 (Stewart et al., 2000) se describe la posibilidad de hidrogenar los ésteres de fitosteroles con el fin de mejorar aún más su solubilidad y estabilidad para poder incorporarlos a diversos tipos de productos (bebidas, alimentos, nutracéuticos,etc).

Cabe destacar que de los extensos estudios realizados para la evaluación de seguridad de esteroles y esta no les vegetales, con varios modelos animales e incluso celulares, a lo largo de los últimos años, ninguno ha revelado efecto adverso alguno para la salud. Por esta razón, se les considera como sustancia GRA5 (Generally Regarded As So/e) tanto por los organismos regulatorios estadounidenses (FDAI como por los europeos (Thompson et al., supra).

La reacción de síntesis de estos compuestos es el punto clave para su obtención pudiendo ser ésta química o enzimática. Sin embargo, el gran gasto de energía que suponen los procesos de síntesis química, que suelen desarrollarse a altas temperaturas, junto con la formación de productos aterogénicos y citotóxicos hace que se sigan buscando catalizadores alternativos y entre ellos los biocatalizadores enzimáticos pueden tener un importante papel (Villeneuve et al., supra).

Las lipasas (EC 3.1.1.3), sobre todo aquéllas producidas por microorganismos, son sin duda las que se han empleado con mayor frecuencia con fines biotecnológicos en reacciones de síntesis.

Existen otras enzimas llamadas esterol esterasas (EC 3.1.1.13) que también son capaces de mediar reacciones de síntesis en las condiciones adecuadas. Entre las este rol esterasas más estudiadas se encuentra la de origen humano (loomes y Senior. Bile salt activation of human cholesterol esterase does not require protein dimerisation. FEBS Letters

405: 369-372. 1997; Ikeda et al. Cholesterol esterase accelerates intestinal cholesterol absorption. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -General Subjects 1571: 34-44. 2002; Brown et al. Plant sterol and stanol substrate specificity of pancreatic cholesterol esterase. The Journal of Nutritional Biochemistry 21: 736-740. 2010). No existen muchas esterol esterasas microbianas descritas pero unas de las más conocidas son las iso formas lIP2 y LlP3 producidas por la levadura Candida rugasa (Benjamin y Pandey. Candida rugasa lipases: Molecular biology and versatility in biotechnology. Yeast 14: 1069-1087. 1998; Tenkanen et al. Hydrolysis of steryl esters by a lipase (Up 3) from Candida rugasa. Applied Microbiology and Biotechnology 60: 120-127. 2002; Domínguez de María et al. Understanding Candida rugosa lipases: An overview. Biotechnology Advances 24: 180-196. 2003; López et al. Reactivity of pure Candida rugosa lipase isoenzymes (Up1, Lip2, and Up3) in aqueous and organic media. Influence of the isoenzymatic profile on the lipase performance in organic media. Biotechnol Progress 20: 65-73. 2004; Chang et al. Efficient production of active recombinant Candida rugosa lIP3lipase in Pichia pastoris and biochemical characterization of purified enzyme. J. Agric. Food Chem. 54: 5831-5838. 2006; Ferrer et al. Recombinant Candida rugosa LlP2 expression in Pichia postoris under the control of the AOXl prometer. Biochemical Engineering Journal 46: 271-277. 2009; Yen et al. Site-specific saturation mutagenesis en residues 132 and 450 of Candida rugosa lIP2 enhances catalytic efficiency and alters substrate specificity in various chain lengths of triglycerides and esters. Journal of Agricultura1 and Food Chemistry 58: 10899-10905. 2010). De hecho, existen crudos enzimáticos comercializados por Sigma (lipasa tipo VII de C. rugosa) y Amano (lipasa AY, Amano 30) con actividad lIP3 que se han empleado en varias ocasiones para la síntesis de diferentes compuestos (Bezbradica et al. The Candida rugosa lipase catalyzed synthesis of amyl isobutyrate in organic solvent and solvent-free system: a kinetic study. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 38: 11-16. 2006; Kim y Akoh. Modeling and optimization of lipase-catalyzed synthesis of phytosteryl esters of oleic acid by response surface methodology. Food Chemistry 102: 336-342. 2007). También se han empleado otros crudos enzimáticos del hongo Aspergillus, poco caracterizados, para la síntesis de ésteres de fitosteroles (T5ke et al. Production and application of novel sterol esterases from Aspergilfus strains by salid state fermentation. Journal of the American Qi! Chemists' 50ciety 84: 907-915. 2007) aunque la productividad es escasa y se requieren largos tiempos de incubación. Además, se ha descrito una enzima del hongo Trichaderma sp. AS59 capaz de sintetizar ésteres de esteroles aunque poco se menciona sobre ello en el trabajo publicado (Maeda et al. Characterization of novel cholesterol esterase from Trichoderma sp AS59 with high ability to synthesize steryl esters. Journal of Bioscience and Bioengineering 105: 341-349. 2008).

Dentro de las reacciones enzimáticas que se emplean para la síntesis de ésteres de esteroles vegetales éstas pueden transcurrir mediante:

i) Transesterificación tal y como se describe en la patente US 2004/0105931 Al (Basheer and Plat, 2004), donde se emplean I¡pasas comerciales, en presencia de estabilizantes y/o inmovilizadas, y a altas temperaturas de reacción (60 oC). En este caso las reacciones transcurren in situ por lo que los alimentos enriquecidos en este tipo de compuestos estarían limitados a aquéllos que entre sus constituyentes contuvieran de forma natural triglicéridos como moléculas "donadoras" del grupo acilo; es decir, del ácido graso. En concreto, serían susceptibles de enriquecimiento derivados lácteos como la mantequilla, los yogures y los quesos o aceites de diverso origen (oliva, girasol, colza, etc). Esto supone un problema en el caso de aquellas personas alérgicas a la leche y sus derivados o para vegetarianos estrictos (vega nos) que no podrían beneficiarse de este tipo de productos.

ii) Por contraste, en otros trabajos y patentes se describe la obtención de estos compuestos mediante esterificación directa de fitosteroles con ácidos grasos, en diferentes condiciones experimentales empleando como biocatalizador preparados enzimáticos comerciales de C. rugosa. Concretamente, en lo referente al empleo de esta enzima para la síntesis de esta clase de compuestos, las reacciones se desarrollan a temperaturas de entre 30 y 60 ·C, con tiempos de reacción de entre 24 y 72 horas obteniendo rendimientos que oscilan entre el 40 y el 90%, aunque estos resultados dependen del donador de grupos acilo, del tipo de solvente empleado, y de la presencia o no de agua en el medio de reacción (Norinobu et al., 2003; Vu et al. lipase-catalyzed production of phytosteryl esters and their crystallization behavior in corn oil. Food Research International 37: 175-180. 2004; Villeneuve et al., supra; Teixeira et al. Production of steryl esters from vegetable oil deodorizer distillates by enzymatic esterification. Industrial & Engineering Chemistry Research 50: 2865-2875. 2011)_

Considerando los resultados expuestos en los trabajos y patentes mencionados, las principales características diferenciado ras de nuestra invención serían la capacidad de la este rol esterasa del hongo Ophiostomo piceoe (nativa y recombinante) de catalizar con alto rendimiento (90%) reacciones directas de acilación de fitosteroles y de los derivados saturados de éstos con ácido láurico, en presencia de diferentes solventes orgánicos, en presencia y/o ausencia de agua, a una temperatura de entre 24 y 35 oC, preferiblemente a 28 oC, en tiempos cortos de reacción de 4-24 horas, y empleando cantidades del orden de miligramos de crudos liofilizados sin ningún tipo de proceso previo de estabilización y/o inmovilización en los que la enzima objeto de la invención es la única con actividad esterol esterasa, a diferencia de lo que ocurre en las preparaciones comerciales de C. rugosa, que contienen una mezcla de diferentes isoenzimas con diferentes especificidades (unas más de tipo esterol esterasa y otras más lipasas). Precisamente, debido a la dificultad existente para separar mediante técnicas cromatográficas estas isoenzimas de C. rugosa, sería aconsejable obtener las diferentes variantes recombinantes para su aplicación industrial. Sin embargo, a diferencia de O. piceoe, C. rugosa hace un uso no universal del código genético y esto dificulta la expresión de enzimas de esta levadura en sistemas de expresión heteróloga (Bracea et al. Design, total synthesis, and fuctional overexpression of the Candida rugosa JipI gene coding for a major industriallipase. Protein Sci. 7: 1415-1422. 1998).

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Un primer objeto de la presente invención es un procedimiento de acilación de

fitosteroles libres o de los derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una

enzima esterol esterasa, caracterizado porque comprende una reacción de acilación en presencia de un biocatalizador. Preferentemente el biocatalizador es una esterol esterasa producida por hongos del género Ophio50toma.

En una realización preferente de la invención, la reacción de acilación comprendida en el procedimiento de la presente invención es una reacción directa de acilación.

En la presente invención, el término "enzima esterol esteras a" se refiere a una secuencia aminoacídica de la enzima esterol esterasa codificada por el gen esterol este rasa. Dicha enzima es extracelular y puede ser nativa cuando se expresa en el organismo original (aunque al ser extracelular haya perdido el péptido señal y se hable de proteína madura) o recombinante si la secuencia completa de la proteína o la secuencia de la proteína madura se expresa en otro organismo.

En una realización preferente de la invención, dicho gen esterol esterasa se puede obtener de hongos de la especie o. piceae.

En otra realización de la presente invención, dicho gen esterol esterasa se puede obtener a partir de un clon de una genoteca en la que el gen esterol esterasa se puede encontrar en un fago, cósmido, fásmido, o cromosoma artificial (BAC o YAC) empleado para generar dicha genoteca.

En otra realización de la presente invención, dicho gen esterol esterasa se puede obtener a partir de un vector génico en el que la secuencia del gen esterol esterasa hubiera sido previamente clonada y, asimismo, cualquier fragmento de ONA o cONA (ya que el gen carece de intrones) procedente de un proceso de evolución dirigida y/o mutagénesis dirigida del gen esterol esterasa de o. piceoe independientemente del hospedador empleado.

En una realización preferente de la presente invención, la enzima esterol esterasa se caracteriza por presentar alta identidad de secuencia (como mínimo 40-95%, Ó 60-95%) con la secuencia del gen esterol esterasa de O. piceae. En una realización más particular de la invención, dicha homología es mayor en la zona de unión al sustrato de la enzima, como ocurre preferentemente en las enzimas de Candida rugosa lIP2 y LlP3.

En una realización preferente de la presente invención, la enzima este rol esterasa se obtiene de Candida rugosa con actividad esterol esterasa, es decir las isoenzimas lIP2 V/o LlP

3. las enzimas de Candida rugosa con actividad este rol esterasa se pueden obtener de preparados comerciales, como se ha mencionado anteriormente, comercializados por Sigma y Amano.

En la presente invención, el término "gen esterol esterasa" se refiere a una secuencia nucleotídica, ONA, que codifica para la enzima esterol esterasa de O. piceae e identificada por la SEO ID No: 1

La forma nativa de la enzima esterol esterasa es la secuencia aminoacídica completa de la proteína codificada por el gen esterol esterasa de o. piceae, incluyendo el péptido señal (SEO ID No: 2). la forma madura de la enzima esterol esterasa es la secuencia aminoacídica codificada por el gen esterol esterasa, sin incluir el péptido señal (SEO ID No: 3), y se identifica con la SEO ID No: 4. En adelante se hablará de enzima nativa como la forma madura, sin péptido señal, para diferenciarla de las formas recombinantes.

En una realización particular, la secuencia aminoacídica madura codificada por el gen estero1 esterasa se expresa en la levadura P. pastoris empleando como péptido señal el prepropéptido del factor a de Saccharomyces cerevisiae. El proceso de clonación realizado en el vector de expresión pPIC9; así como, el procesamiento post-traduccional de dicho péptido señal dan como resultado una proteína recombinante madura con un extremo N-terminal modificado respecto al de la proteína nativa madura, tal y como se comentará más adelante.

En una realización más particular de la presente invención, la enzima esterol esterasa recombinante presenta modificaciones en su secuencia aminoacidica como consecuencia de

i) su expresión heteróloga en organismos usados habitualmente para la producción industrial de enzimas, como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, P. pastoris, Hansenula polymorpha, YO((Qwia fipolytica, Aspergilfus nidufans y Trichoderma reesei V/o ii) de un proceso de mutagénesis dirigida y diseño racional, o evolución dirigida del gen esterol esterasa (en ambos casos seguido de su expresión en los hospedadores adecuados, como f. coN, S. cerevisiae o P. postoris).

En la presente invención las expresiones "expresión heteróloga" y" gen heterólogo" se refieren a la introducción de un gen extraño (heterólogo) en un organismo con el fin de modificar su material genético y los productos de expresión. En la presente invención se protege un método para la expresión heteróloga del gen este rol esterasa. Dicho método incluye i) la amplificación por PCR de la secuencia que codifica la enzima esterol esterasa, ii) la introducción del gen esterol esterasa en un vector de clonación y/o de expresión; y iii) su expresión heteróloga en cualquiera de los organismos usados para la producción industrial de enzimas citados anteriormente.

En una realización particular de la presente invención, dicho organismo es una levadura metilotrófica, preferentemente P. pastoris. En una realización áun más particular de la presente invención, la forma recombinante de la enzima esterol esterasa obtenida mediante la expresión heteróloga del gen esterol esterasa, preferentemente de O. piceoe, presenta como modificación entre 6-8 aminoácidos nuevos en el extremo N-terminal, añadidos sobre la secuencia aminoacídica de la proteína nativa madura, debido a i) el proceso de clonación en el plásmido integrativo (pPIC9) utilizado para transformar P. postoris que añade 4 aminoácidos (YVEF) al extremo de la proteína que forman parte de la secuencia del sitio de clonaje múltiple del plásmido, concretamente las dianas de restricción SnoBI (TACGTA) y EcoRI (GAATTC), empleada para la clonación en dicho plásmido del extremo 5' del gen. La enzima Notl (GCGGCCGC) fue la empleada para la clonación por el extremo 3', y ii) el mal procesamiento post-traduccional de la proteína recombinante para eliminar el péptido señal (pre-propéptido del factor a de Socchoromyces cerevisioe), que es responsable de la incorporación a la secuencia de dos o cuatro aminoácidos de más (EA o EAEA). Por tanto, se pueden tener dos formas de proteína recombinante, una con 6 y otra con 8 aminoácidos de más, identificadas con las SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6, respectivamente.

En otras realizaciones particulares de la presente invención las dianas de restricción podrían ser cualquiera de las que formen parte del sitio de clonaje múltiple del vector que se emplee, y esto dependerá a su vez del organismo productor. En cualquier caso, las dianas escogidas no formarán parte de la secuencia del gen de la este rol esterasa y se procurará que las modificaciones surgidas en el extremo N-terminal de la proteína, como consecuencia del proceso de clonación, sean las mínimas posibles, suponiendo siempre un correcto procesamiento del péptido señal que se emplee.

En la presente invención, el término "cebador" o primer se refiere a secuencias nucleotídicas cortas que pueden comprender: i) la secuencia del péptido señal de la este rol esterasa madura de O. piceae o la secuencia N-terminal de la proteína madura identificada con SEQ ID No: 7 y ¡j) las basadas en el extremo 3' del gen de la enzima nativa identificada con SEQ ID No: 8; así como iii) aquéllos derivados de éstos si se emplean como molde ONAs modificados resultantes de obtener variantes de la proteína tras un proceso de evolución dirigida y/o mutagénesis dirigida. También se refiere a cualquier tipo de cebadores que incluyan las características anteriores junto con cualquier otra modificación introducida en la secuencia de la proteína, como colas de histidina N o e terminales, etc.

En la presente invención se entiende por "vector de clonación" aquellas moléculas de ONA originadas en un virus, bacterias, o en las células de un organismo superior en el que se puede integrar otro fragmento de DNA, sin que pierda la capacidad de autorreplicación. l os «vectores» introducen DNA extraño en una célula huésped, donde puede reproducirse en grandes cantidades. Ejemplos: plásmidos, cósmidos y los cromosomas artificiales de levadura.

En la presente invención se entiende por "vector de expresión" aquellos plásmidos pequeños que contienen un sitio de clonaje múltiple flanqueado por una o dos secuencias promotoras. Estos promotores se requieren para expresar los fragmentos de DNA insertados en el lugar de clonaje múltiple.

Preferentemente, el procedimiento de acilación de fitosteroles libres o de los derivados saturados de éstos de la presente invención puede ser catalizado por la citada enzima esterol esterasa en su forma nativa codificada por el gen esterol esterasa de un hongo del género Ophiostoma, más preferentemente de la especie o. piceae.

De acuerdo con otro modo de realización preferente, el procedimiento de acilación de fitosteroles libres o de los derivados saturados de éstos de la presente invención puede ser catalizado por una enzima recombinante producida en origen por un hongo del género Ophiostoma, más preferentemente de la especie o. piceae.

De forma aún más preferente, la enzima recombinante utilizada en el procedimiento de la presente invención puede expresarse en P. postoris, más preferentemente la enzima recombinante tiene un extremo N-terminal modificado cuyas secuencias son SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6.

La actividad de las enzimas utilizadas en el procedimiento de la presente invención se comparan con la enzima de Condida rugosa comercializada por Sigma (lipasa tipo VII).

Es importante resaltar que algunas enzimas de tipo lipasa, aunque pueden realizar reacciones directas de esterificación, realizan la síntesis de ésteres de fitosteroles preferiblemente mediante reacciones de transesterificación de los sustratos debido a que muchas de ellas presentan impedimentos estéricos que dificultan el desarrollo de reacciones de esterificación directa (Kirk y Christensen. lipases from Condida ontarctico: unique biocatalysts from a unique origino Organic Process Research & Development 6: 446-45l. 2002). Esto se puede comprobar en la patente US 2004/0105931 Al (Basheer and Plat, 2004), citada anteriormente en la que se estudian diferentes lipasas comercializadas procedentes de diferentes orígenes (bacteriano, fúngico e incluso vegetal). No obstante, a diferencia de lo expuesto en esta y otras patentes, la enzima de o. piceoe (nativa o recombinante) presenta la ventaja de que puede ser utilizada partiendo de crudos liofilizados, sin ningún tipo de proceso previo de estabilización con aditivos y/o proceso de inmovilización, ya que es muy estable y funcional en un rango de temperatura muy amplio (entre 4-35 oC, al menos durante 24 h) y en diferentes solventes orgánicos. Además, la enzima de o. piceoe (nativa o recombinante) sí puede catalizar reacciones de acilación directa entre (itosteroles y un ácido graso. Esto lo hace, al igual que se ha descrito con la enzima comercial de C. rugosa (Norinobu et 01.,2003; VU et al., supra; Villeneuve et al., supra; Teixeira et 01., supra), mediante esteri(icación directa del alcohol, entendiendo por alcohol cualquier esterol presente en la mezcla de fitosteroles. Cabe destacar que los rendimientos obtenidos con preparados enzimáticos de C. rugosa en la producción de estos compuestos mediante reacciones de acilación directa son más altos que en reacciones. de transesterificación (Villeneuve et al., sup ra).

Como se ha indicado, en la presente solicitud de patente las reacciones de

5 esterificación directa se han realizado tanto con la este rol esterasa de o. piceae, nativa o recombinante, como con la enzima comercializada de C. rugosa que contiene actividad esterol esterasa (tiene LlP3). Los resultados obtenidos indican que a pesar de que el porcentaje de esterificación conseguido con las enzimas de o. piceae y C. rugosa es semejante, se requieren dosis menores de enzima y tiempos de reacción más cortos con la

10 enzima de O. piceae. Estas reacciones de esterificación directa probablemente podrían también tener lugar utilizando otras esterol esterasas microbianas que presenten alta identidad de secuencia (40-60%) con la de O. piceae, particularmente en la zona de unión a sustrato, entre las que se encuentran la LlP2 y la LlP3 de C. rugosa. En la tabla 1 se compara los niveles de síntesis alcanzados por diversas enzimas en reacciones de esterificación directa

15 en condiciones similares y las enzimas objeto de la presente invención, así como con el preparado comercial de C. rugosa empleado en idénticas condiciones que las de O. piceoe.

Tabla 1. Porcentajes de acilación de esteroles con ácidos grasos alcanzados por diversas enzimas en condiciones similares.

Crudo

Crudo

Crudo

Enzima

Crudo inmovilizado- Referencia

estabilizado!

inmovilizado!

estabilizado!

lipasa de Candida antarctica'

12 67

lipasa de Candida cylindracea

(e. rugoso)"

2 O

lipasa de Chromobocterium viscosum"

1 63

lipoproteína Bde Pseudomonas sp ."

23 71

Novozym 868"

7 32

lipasa tipo VII de e. rugosob

33

Esterol esteras¡¡ n¡¡tiv¡¡ de C. piceaeb

58

Esterol esterasa recombinante de Q.

piceae b

39

14 11 11 2.

24 48 67 77 Patente US 2004/01059 31 Al

P¡¡tente propuesta

• % de a<:ilación eKpresado como el porcentaje (w{w) de conver5ión de colesterol a su éster de ácido graso en rea<:cione5 con n· heKano empleando una relación molar 1:1,4 colesterol:ácido e5teárico y de5affolladas a 40·C, 16h.

b% de acilación e)(presado como el porcentaje (mM) de conversión de fitosteroles a su forma esterificada en reacciones con isooctano empleando una relación molar 1:1 fitosteroles:ácido láurico y desarrolladas a 28· C, 15h. 1Las enlimas estabilizadas fueron preparadas añadiendo a los crudos en!imáticos sorbitan mono-estearalo u otros esteres de

3lúcares, según la patente W099/1S689. las emimas inmovililadas. estabilizadas o no. se prepararon con arreglo a la misma patente.

Los porcentajes de acilación alcanzados con las estero) esterasas nativa V/o recombinante de o. piceae en tiempos razonables de reacción superan los citados en otras patentes e incluso superan o igualan los obtenidos en las mismas condiciones con una enzima comercial, entiéndase preparado enzimático de C. rugosa (tabla 1).

Tal y como se describe en la solicitud de patente PCT/CA95/00555 y que recoge la patente US 6.087.353 (Stewart et al., 2000), los fitosteroles o los derivados saturados de éstos utilizados en el procedimiento de la presente invención pueden obtenerse prácticamente de cualquier fuente vegetal, por ejemplo, soja, maíz, girasol, colza, legumbres, frutos secos, frutas y verduras; así como de residuos agrícolas. Con respecto a esto último, y teniendo en cuenta el concepto industrial de biorrefinería, se podrían emplear los materiales lignocelulósicos que actualmente se contemplan para la producción de etanol de segunda generación, como, por ejemplo, paja de cereales, residuos de poda, etc., así como los residuos generados tras la producción del bioetanol y la fabricación de cerveza, que contendrían este tipo de compuestos en la fracción liposoluble. Incluso, se podrían emplear aguas de proceso de la industria papelera pues estos compuestos también se encuentran en los extraíbles de madera de frondosas como el eucalipto (Gutiérrez et al. The biotechnological control of pitch in paper pulp manufacturing. Trends Biotechnol 19: 340348.2001). Preferentemente, en el procedimiento de la invención, los fitosteroles utilizados como producto de partida proceden de la soja.

Adicionalmente, los fitosteroles utilizados en el procedimiento de la presente invención pueden ser cualquier fitosterol o derivado de fitosterol conocido, así como sus mezclas. Preferentemente, el procedimiento de la presente invención comprende la acilación de fitosteroles elegidos entre ~-sitosterol, estigmasterol, campesterol, brasicasterol y cualquier derivado o mezcla de éstos. De forma más preferente, los fitosteroles utilizados en el procedimiento de la presente invención son una mezcla que comprende, respecto al peso total de la mezcla, 55% de ¡3-sitosterol, 10% de estigmasterol, 29% de campesterol y 6% de brasicasterol.

También es una realización preferente de la presente invención que los fitosteroles utilizados como producto de partida comprendan, respecto al total del peso de la mezcla, un 70% por peso de S-sitosterol, al menos un 10% por peso de campesterol y al menos un 10% por peso de estigmasterol, ya que esta composición ha resultado ser altamente efectiva disminuyendo los niveles de colesterol plasmático debido a algún tipo de efecto sinérgico entre los distintos fitosteroles presentes tal y como se describe en la solicitud de patente PCT/CA95/00555 y que se recoge en la patente US 6.087.353 ($tewart et al., 2000).

En cualquiera de los casos, el procedimiento de la presente invención permite realizar la síntesis de ésteres de ácidos grasos de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos, donde el ácido graso puede ser saturado, monoinsaturado o poliinsaturado, y de longitud de cadena variable, preferentemente de entre 6 y 18 atómos de carbono, más concretamente ácidos saturados de longitud de cadena media (MCFA), tales como caproico (C6), caprílico (C8), cáprico (CID) y láurico {C12), siendo especialmente preferentemente que el ácido graso utilizado en el procedimiento descrito en la presente solicitud de patente sea ácido dodecanoico (ácido láurico).

El ácido láurico es un acido graso de cadena media que se encuentra de forma natural en aceites tropicales como el aceite de coco y el aceite de semillas de palma, así como en la leche de vaca y cabra. Es perfectamente metabolizable por el organismo y su consumo en cantidades adecuadas no representa riesgo de toxicidad según estudios realizados en ratas (Fitzhugh et al. Oral toxicities of lauric acid and certain lauric acid derivatives. Toxicology and Applied Pharmacology 2: 59-67. 1960). Considerando la relación colesterol total/colesterol HDL como marcador del riesgo de padecer una enfermedad cardiovascular, parece ser que, a diferencia de otros ácidos grasos estudiados, el ácido láurico disminuiría más tal relación como consecuencia del aumento del colesterol de tipo HDL o "colesterol bueno" (Mensink et al. Effects of dietary fatty acids and carbohydrates on the ratio of serum total to HDL cholesterol and on serum lipids and apolipoproteins: a meta-analysis of 60 controlled trials. The American Journal of Clinical Nutrition 77: 1146-1155. 2003). Además, estudios realizados, tanto con la forma libre como esterificada (concretamente mono laurina), demuestran su actividad antimicrobiana cuando es añadido a la leche humana o a formulaciones infantiles a concentraciones de entre S y 45 mM según se añada, libre o esterificado" y según el patógeno (15aacs et al. Antimicrobial activity of lipids added to human milk, ¡ntant formula, and bovine milk. The Journal of Nutritional Biochemistry 6: 362-366. 1995). Incluso existen formulaciones comerciales de monolaurina (l auricidin" ) en las que se explota este potencial antimicrobiano, además de su uso como biocida en "films" preparados para el empaquetado de alimentos (Hoffman et al. Antimicrobial effects of corn zein films impregnated with nisin, laurie acid, and EDTA. Journal of Food Protection 64: 885-889. 2001; Dawson et al. Effect of lauric acid and nisin-impregnated soy-based films on the growth of Usteria monocytogenes on Turkey Bologna. Poult Sci 81: 721-726. 2002). A todas estas propiedades se suma su efecto antioxidante y la ventaja adicional de su baj o coste y larga vida media que facilita su empleo a nivel industrial.

En el procedimiento de acilación de fitosteroles libres con ácidos grasos que comprende una reacción de acilación en presencia de una esterol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, en particular por la especie o. piceae nativa o recombinante, tal como se describe en la presente solicitud de patente, la proporción molar de fitosterol:ácido graso puede comprender, preferentemente, valores entre 1:1 y 1:6.

De acuerdo con otro modo de realización preferente de la presente invención, la enzima este rol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, preferentemente de la especie o. piceae, más preferentemente una de sus variantes natural o recombinante, puede utilizarse en el procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos descrito en la presente solicitud de patente en forma de crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo.

De acuerdo con otro modo de realización preferente de la presente invención, la enzima este rol esterasa producida por hongos del género Ophiostomo, preferentemente de la especie O. piceae, más preferentemente una de sus variantes nativa o recombinante, puede utilizarse en el procedimiento de acitación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos descrito en la presente solicitud de patente después de haber sido purificada mediante un método cromatográfico, preferentemente por cromatografía de interacción hidrofóbica, concretamente Hi-Trap Octyl FF (GE Healthcare).

Preferentemente, la enzima esterol esterasa utilizada en el procedimiento de

adlación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos de la presente invención,

utilizada tanto como crudo enzimático como purificada, se puede utilizar en una dosis que comprende entre 1,5 y 12 UjmL de reacción, más preferentemente entre 3 y 6 U/mL

El procedimiento de acilación descrito en la presente solicitud de patente proporciona el empleo de biocatalizadores, esterol esterasas, como crudos liofilizados sin ningún tipo de proceso previo de estabilización V/o inmovilización perfectamente funcionales y estables, y en los que la enzima de interés es mayoritaria y única en su actividad a diferencia de lo que ocurre con la preparación comercial. El empleo de dosis "altas" de biocatalizador se corresponde con miligramos de crudo liofilizado y es suficiente para la obtención de altos porcentajes de acilación (90%).

De acuerdo con otro modo de realización preferente, el procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una enzima este rol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, preferentemente de la especie O. piceae nativa o recombinante, tal como se describe en la presente solicitud de patente, puede transcurrir en un sistema monofásico orgánico o bifásico que comprende una mezcla de solvente orgánico yagua. Preferentemente, cuando el sistema es bifásico comprende un 10% de agua.

De acuerdo con una realización aún más preferente, el solvente orgánico comprendido en dicho sistema monofásico o bifásico, en particular con un 10% de agua, se puede elegir entre el grupo que consiste en isooctano, n-hexano y tolueno.

El empleo de isooctano o n-hexano resulta óptimo desde el punto de vista catalítico y ambiental comparado con el uso de tolueno. Además, el uso de sistemas bifásicos, en presencia de agua, resulta en altos porcentajes de acilación con isooctano y n-hexano, y son preferibles a los monofásicos en lo que se refiere a perspectivas de futuro. Además, este tipo de sistemas resultan atractivos desde un punto de vista industrial pues hacen que los procesos de separación y recuperación sean mucho más eficientes V demanden menos energía.

De acuerdo con otra realización preferente de la presente invención, el procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una enzima este rol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, preferentemente de la especie o. piceae nativa o recombinante, tal como se describe en la presente solicitud de patente puede tener lugar entre 24 y 35 .(, más preferentemente entre 27 y 29 0(, siendo especialmente preferente que la reacción de acilación tenga lugar a 28 oc.

Así, el procedimiento de la presente invención proporciona un procedimiento de acilación catalítica que se desarrolla a bajas temperaturas, preferentemente a 28 oC, con el consiguiente ahorro de energía. Por otro lado, el procedimiento de la presente invención permite la obtención de altos porcentajes de acilación en tiempos cortos de reacción, preferentemente entre 4-24 horas, con 4 horas los rendimientos obtenidos están ya en torno al 50% dependiendo de la enzima y el solvente empleado.

De acuerdo con otra realización preferente de la presente invención, el procedimiento de acilación de fitosteroles libres con ácidos grasos catalizado por una enzima este rol esterasa que comprende una reacción de acilación en presencia de una este rol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, y en particular por la especie o. piceae nativa o recombinante, tal como se describe en la presente solicitud de patente puede comprender:

al los fitosteroles vegetales utilizados se eligen entre el grupo que consiste en ~-sitosterol, estigmasterol, campesterol, brasicasterol y cualquier derivado o mezcla de estos; bl el ácido graso es un ácido graso saturado o insaturado de entre 6 y 18 átomos de carbono; cl la este rol esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo; dl la reacción transcurre en un sistema monofásico orgánico o bifásico que comprende una mezcla de solvente orgánico yagua; y e) la reacción de acilación transcurre entre 24 y 35 oc.

De acuerdo con otra realización preferente, el procedimiento de acilación de fitosteroles libres con ácidos grasos catalizado por una enzima esterol esterasa que comprende una reacción de acilación en presencia de una estero1 esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, y en particular por la especie O. piceae nativa o recombinante, tal como se describe en la presente solicitud de patente puede comprender:

al los fitosteroles empleados son una mezcla que comprende 55% de ~-sitosterol, 10% de estigmasterol, 29% de campesterol, y 6% de brasicasterol, expresado en peso respeto al total de la mezcla; b) el ácido graso es ácido láurico; el la proporción de (itasterol :ácido graso comprende valores entre 1:1 y 1:6; d) la estero1 esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo; el se utiliza una dosis de enzima que comprende entre 1,5 y 12 U/mL de reacción; f) la reacción transcurre en un sistema monofásico orgánico, con isooctano, n-hexano o tolueno como solventes, o bifásico que comprende una mezcla de cualquiera de estos solventes orgánicos con un 10% de agua; y g) la reacción de acilación transcurre a 28 Gc.

De acuerdo con otro modo de realización preferente de la presente invención, en el procedimiento de la invención los sustratos se encuentran en proporciones molares fitosteroles:ácido graso o derivados saturados de fitosteroles:ácido graso comprendidas entre

1:1 y 1:6, y las esterol esterasas se aplican a la reacción de síntesis una vez disueltos éstos en el medio orgánico de elección. Para esto, según el solvente, se calienta previamente los medios de reacción en agua a 100 oC durante 5-10 minutos, preferiblemente 10 minutos. Una vez a temperatura ambiente, se añadirá, en el caso de los sistemas bifásicos, agua en un porcentaje preferente del 10% respecto del volumen de solvente orgánico. l as reacciones se desarrollarán preferentemente entre 24-35 0(, más preferentemente a una temperatura de 28 oC, con agitación magnética a 1.200 rpm, para eliminar barreras de transferencia de masa para los sustratos (Klibanov . Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature

409: 241-246_ 2001), por un tiempo preferente entre 4-96 horas, más preferentemente entre 4 Y 24 horas. La concentración de las esterol esterasas utilizadas preferentemente estará comprendida entre 1,5-12 U/mL de volumen total de reacción, más preferentemente entre 36 U/mL de volumen total de reacción consiguiéndose un porcentaje de síntesis alrededor del 90% en el mejor de los casos. Una vez obtenidos los productos de interés el biocatal izador podrá ser separado de la mezcla de reacción, por ejemplo mediante procesos de centrifugación, para su reutilización.

De acuerdo con un modo de realización preferente de la presente invención, el procedimiento de acilación de fitosteroles libres o de los derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una enzima esterol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, y en particular por la especie o. piceae, nativa o recombinante, tal como se describe en la presente solicitud de patente puede comprender una etapa adicional de aislamiento en forma de polvo sólido del éster de (itesterol o de los derivados saturados de

éstos.

Preferentemente, el procedimiento de acilación de fitosteroles de la presente invención puede comprender: al los fitosteroles vegetales utilizados se eligen entre el grupo que consiste en ~-sitosterol, estigmasterol, campesterol, brasicasterol y cualquier derivado o mezcla de estos; bl el ácido graso es un ácido graso saturado o insaturado de entre 6 y 18 átomos de carbono; cl la este rol esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo; dI la reacción transcurre en un sistema monofásico orgánico o bifásico que comprende una mezcta de solvente orgánico yagua; el la reacción de acilación transcurre entre 24 y 35 oC; y fl aislamiento en forma de polvo sólido del éster de fitosterol.

De acuerdo con otro modo de realización preferente, el procedimiento de acilación de fitosteroles de la presente invención puede comprender: al los fitosteroles empleados son una mezcla que comprende 55% de ~-sitosterol, 10% de estigmasterol, 29% de campesterol, y 6% de brasicasterol, expresado en peso respeto al total de la mezcla; bl el ácido graso es ácido láurico; c) la proporción de fitosterol :ácido graso comprende valores entre 1:1 y 1:6; dI la este rol esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo; el se utiliza una dosis de enzima que comprende entre 1,5 y 12 U/mL de reacción; f) la reacción transcurre en un sistema monofásico orgánico, con isooctano, n-hexano o tolueno como solventes, o bifásico que comprende una mezcla de cualquiera de estos solventes orgánicos con un 10% de agua; g) la reacción de acilación transcurre a 28 oC; y h) aislamiento en forma de polvo sólido del éster de fitasterol.

Los ésteres de fitosteroles o o de los derivados saturados de éstos sintetizados pueden separarse del exceso de ácido graso utilizado diferentes procedimientos, como por ejemplo: i) mediante destilación molecular (Hirota et al. Purification of steryl esters from soybean oi1 deodorizer distillate. Journal of the American O¡I Chemists' Society 80: 341-346. 2003) Y ¡j) mediante desacidificación facilitando la formación de sales del ácido graso (Weber et al. Fatty acid steryl, stanyl, and steroid esters by esterification and transesterification in vacuo using Candida rugosa lipase as catalyst. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49: 67~71. 2001). Incluso sin eliminar el exceso de ácidos grasos en la reacción, el solvente podría eliminarse evaporando en rotavapor o utilizando un liofilizador. En cualquiera de los casos, el procedimiento de la presente invención preferentemente comprende una etapa adicional de obtención de un producto en forma de polvo sólido con características organolépticas apropiadas para su incorporación directa en alimentos, bebidas, fármacos y nutracéuticos, de modo que la cantidad de solvente residual o impurezas orgánicas volátiles se encuentren dentro los límites aceptables propuestos por la guía GPC (Guía de la Buena Práctica Clínica) del Comité Internacional de Armonización (ICH) o de farmacopeas (Grodowska y Parczewski. Organic solvents in the pharmaceutical industry. Acta Poloniae pharmaceutica-drug Research

67: 3-12. 2010). Hay que considerar que hasta un 50% del gasto energético necesario para un proceso químico proviene de la purificación de los productos y del reciclado de los solventes empleados (Clark y Tavener. Alternative solvents: shades of green. Organic Process Research & Development 11: 149-155.2007).

Adicionalmente, la presente invención también tiene por objeto los ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos obtenidos por el procedimiento de acilación definido en la presente solicitud de patente.

De acuerdo con otro aspecto adicional, la presente invención también se refiere a productos enriquecidos con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos obtenidos por el procedimiento de acilación definido en la presente solicitud de patente. Preferentemente estos productos pueden ser un alimento, un preparado alimenticio, un suplemento dietético o un medicamento.

De forma más preferente, cuando el producto enriquecido es un producto alimenticio, éste puede ser: i) un alimento perteneciente al grupo de los derivados lácteos, ii) un alimento o producto que no pertenece al grupo de los derivados lácteos, siendo apto para alérgicos a la leche como por ejemplo un producto derivado de la soja. En este sentido destacar que se ha demostrado que la administración de ésteres de estero les junto con proteína de soja ayuda a disminuir más los niveles de colesterol (Un et al. Soy protein enhances the cholesterol-Iowering effect of plant sterol esters in cholesterol-fed hamsters. The Journal of Nutrition 134: 143-148. 2004), o iii) un producto que proviene de cereales o mezclas de cereales como masas y masas de repostería o pastas.

De forma más preferente, cuando el producto enriquecido es un suplemento dietético, por ejemplo suplemento alimenticio o vitamínico, o un medicamento, esté es una forma sólida apta para administración oral, como por ejemplo, comprimido, cápsula, grajea, gránulo, etc.

De acuerdo con otro aspecto adicional, la presente invención también se refiere al uso de los ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos obtenidos por el procedimiento de acilación definido en la presente solicitud de patente y de los productos enriquecidos con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos objeto de la presente invención para la obtención de productos de interés alimenticio y/o farmacéutico.

De acuerdo con otro aspecto adicional, la presente invención también se refiere a los ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos obtenidos por el procedimiento de acilación definido en la presente solicitud de patente y a los productos enriquecidos con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos objeto de la presente invención para su uso en medicina, preferentemente para reducir los niveles de colesterol en plasma sanguíneo.

De acuerdo con un modo de realización preferente, el procedimiento de acilación de

fitosteroles libres o de los derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una

enzima esterol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma tal como se describe en la presente solicitud de patente, se caracteriza porque los preparados enzimáticos pueden ser producidos en un medio de cultivo para O. piceae, que incluye un compuesto lipídico como inductor, y para Pichia postoris para la producción de la misma enzima en su variante recombinante. l a esterol esterasa producida en ambos sistemas es una enzima mayoritaria y única en su actividad en los crudos enzimáticos obtenidos. los crudos pueden ser sometidos a un proceso de liofilización y almacenados durante meses conservando su actividad.

La esterol esterasa utilizada en el procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos con ácidos grasos de la presente invención puede ser cualquier enzima recombinante codificada en origen por el gen de O. piceae.

Preferentemente, la enzima recombinante se obtiene por un procedimiento que incluye 3 etapas que se describen a continuación:

i) La amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de la secuencia que codifica la enzima, donde dicha secuencia se corresponde con la secuencia completa (incluyendo el péptido señal) o madura (sin péptido señal) de la proteína. Los moldes para la reacción de PCR podrán ser cualquier fragmento de DNA o cONA que contenga la secuencia en cuestión como el DNA genómico del hongo preferentemente, o bien clones de una genoteca generada a partir de ONA genómico o cONA en la que el fragmento de ácido nucleico responsable de codificar la enzima se encuentra en cualquier fago, cósmido, fásmido, o cromosoma artificial (BAC o YAC) empleado para generar dicha genoteca. De acuerdo con una realización preferente adicional, el molde empleado para la PCR también podría ser cualquier vector en el que la secuencia hubiera sido previamente clonada y, asimismo, cualquier fragmento de DNA o cDNA procedente de un proceso de evolución dirigida y/o muta génesis dirigida independientemente del hospedador empleado. Preferentemente, son iniciadores de la amplificación cebadores que contengan la secuencia del péptido señal SEQ ID No : 3 o N-terminal de la proteína madura SEQ ID No: 9 y cebadores basados en el extremo 3' del gen de la enzima nativa (SEQ ID No: 8); o aquéllos derivados de éstos si se emplean como molde ONA o cONA modificados resultantes de obtener variantes de la proteína como resultado de un proceso de evolución dirigida y/o mutagénesis dirigida.

También cualquier tipo de cebadores que incluyan las características anteriores junto con

cualquier otra modificación introducida en la secuencia de la proteína, como colas de

histidina N o eterminales, etc.

ii) l a introducción del gen o la secuencia madura que codifican la proteína,

S

modificada o no, en cualquier tipo de vector de clonación V/o de expresión; entendiéndose

por vector plásmidos de origen bacteriano modificados o vectores víricos eucariotas.

¡ji) Su expresión heteróloga en cualquiera de los organismos usados para la

producción industrial de enzimas.

10

La presente invención tiene su origen en los estudios previos realizados sobre la

este rol esterasa de O. piceae. Tras un screening entre diferentes hongos se escogió al

ascomiceto O. piceae por producir una enzima capaz de hidrolizar tanto ésteres de esteroles

como triglicéridos y mezclas de éstos procedentes de maderas de frondosas o coníferas

(Calero-Rueda et al. Production, isolation and characterization of a sterol esterase from

15

Ophiostoma piceoe. Biochim. Biophys. Acta 1599 (1-2]: 28-35. 2002; Calero-Rueda et 01.

Hydrolysis of sterol esters by an esterase from Ophiostoma piceae: Application for pitch

control in pulping of fucalyptus globulus wood. Intern. J. Biotechnol. 6: 367-375. 2004). Estos

estudios dieron lugar a la patente internacional WQ 02/075045 A1Rl (Calero-Rueda et al.,

2002) para su aplicación en la reducción de pitch, depósitos que originan problemas durante

20

la fabricación de la pasta de papel.

Debido al interés industrial suscitado con la enzima, se decidió llevar a cabo su

expresión heteróloga en uno de los sistemas eucarióticos más empleados, la levadura

metilotrófica P. pastoris, con el fin de tratar de mejorar sus niveles de producción. Diferentes

25

patentes recogen las mejoras realizadas en este sistema de expresión durante los últimos

años (Bollok et al. Recent patents on the Pichia pastoris expression system: expanding the

toolbox for recombinant protein production. Recent Patents on Biotechnology 3: 192-201.

2009). Esto, junto con la secuenciación reciente del genoma de la levadura (De Schutter et al.

Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris . Nature

30

Biotechnology 27: 561-566. 2009), posibilitará en el futuro la mejora de cepas mediante

estrategias de biología de sistemas.

La producción máxima de la esterol esterasa de O. piceae, en un medio sintético con glucosa y sales minerales suplementado con 0,5% de aceite de oliva (Calero-Rueda et al., supra), se obtuvo entre los 15 y 21 días de cultivo y los niveles de actividad fueron aproximadamente 1,8 U/mL utilizando p -nitrofenilbutirato (pNPB) como sustrato. En el sistema de expresión escogido se pretende incrementar los niveles de actividad, disminuir el tiempo de producción y evitar la inducción con aceite de oliva, lo que tendría un efecto muy positivo en la producción de esta enzima a nivel industrial.

La secuencia madura (sin péptido señal) de la esterol esterasa de O. piceae se ha utilizado para expresarla en la levadura P. postoris. La producción de la enzima recombinante se encuentra fuertemente regulada por el promotor AOXl (alcohol oxidasa 1) de la levadura que responde a la presencia de metanol como inductor. La proteína recombinante producida es dirigida y secretada al medio extracelular gracias a la incorporación en su extremo Nterminal del pre-propéptido del factor a de s. cerevisiae, empleado para la expresión extracelular de muchas otras proteínas (Crepin et 01. Production and characterization of the Talaromyces stipitotus feruloyl esterase FAEC in Pichia pastoris: identification of the nucleophilic serine. Protein Expression and Purification 29: 176-184. 2003; Damaso et 01. Optimized Expression of a Thermostable Xylanase from Thermomyces lonuginosus in Pichio postoris. Appl. Enviran. Microbio!. 69: 6064-6072. 2003; Brunel et 01. High-Ievel expression of Candido paropsifosis lipasejacyltransferase in Pichio postoris. Journal of Biotechnology 111: 41-50. 2004). El hecho de que la producción se encuentre fuertemente regulada por la inducción del promotor AOXl garantiza la obtención de altos niveles de proteína recombinante dado que el gen AOXl sólo se sobreexpresa en presencia de metanol, y su producto es la primera enzima de la ruta catabólica para su utilización en levaduras metilotróficas. Existe también un gen AOX2 cuyo producto no representa más del 15% de la actividad alcohol oxidasa celular, de manera que entre ambas enzimas pueden llegar a constituir casi el 30% del total de la proteína soluble celular en células creciendo en el alcohol (Cregg et 01. Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia postoris. Mol. Cell. Biol. 9: 1316-1323. 1989; Daly y Hearn. Expression of heterologous proteins in Pichio postoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.

J. Mol. Recognit. 18: 119-138. 2005). Considerando esto, los niveles de actividad que se han obtenido en Erlenmeyer con una cepa Mut+ (Methanol utilizotian plus) de P. pastoris como biofactoría para la producción de la esterol esterasa serían de unas 3 veces los niveles alcanzados con o. piceae cuando se emplea un medio complejo, y de la tercera parte si se emplea un medio mínimo. No obstante la producción puede aumentar más si en el medio de cultivo se añade además del metanol, como inductor y fuente de carbono, una segunda fuente de carbono como el sorbitol, que no interfiere con la inducción (Inan y Meagher. Nonrepressing carban sources ter alcohol oxidase (AOXl) prometer of Pichia postoris. Journal of Bioscience and Bioengineering 92: 585-589. 2001), llegando en este caso a producir niveles de actividad de hasta unas 7 veces superiores cuando se emplea un medio complejo. Además, es importante reseñar que las producciones citadas se lograrían en tan sólo 4 días de cultivo frente a las 2-3 semanas necesarias si se produce la enzima nativa, y que los volúmenes de medio que se manejan en esta escala para la producción de la enzima recombinante son considerablemente inferiores. la producción de la esterol esterasa recombinante puede verse mejorada aún más mediante un escalado a biorreactor en bioprocesos perfectamente controlados, en medios mínimos de composición perfectamente definida, y en tiempos de producción no mayores de 4 días, lo que facilitaría su posible uso industrial, a diferencia de lo que ocurre con las diferentes isoenzimas de C. rugoso de las que sólo se ha descrito el escalado en estas condiciones en la lIP2 recombinante (Ferrer et al., supra).

la enzima recombinante producida es mayoritaria en el crudo y se puede concentrar por ultrafiltración tangencial empleando una membrana de 5 kDa y emplearse para diferentes aplicaciones, como la que describe la presente invención, tras haber sido liofilizada.

la purificación de las enzimas nativa y recombinante se realizó según el método previamente descrito (Calero-Rueda et al., supra) con pequeñas modificaciones: el líquido ultrafiltrado se equilibró con sulfato amónico 0,5 M Y se aplicó a un cartucho de interacción hidrofóbica Hi Trap Octyl Sephorose (GE Healthcare) equilibrado con la misma concentración de sal en Tris-HCI 25 mM, pH 7,0. las proteínas retenidas se eluyeron con un gradiente lineal decreciente de la sal en 50 minutos a un flujo de 1 ml/min. Finalmente, la este rol esterasa se eluyó con una solución de Triton X-lOO reducido al 0,2% (v/v). Mediante este único pasó se consiguió obtener proteínas totalmente purificadas una vez dializadas por ultrafiltración para eliminar el detergente.

La caracterización cinética de la enzima recombinante en cuanto a la hidrólisis de diferentes tipos de ésteres (de p-nitrofenol, glicerol y colesterol) pusieron de manifiesto que la afinidad de la enzima recombinante por la mayor parte de los sustratos es algo mayor que en el caso de la enzima nativa. Lo que llama la atención, y es de destacar, es que con cualquiera de los sustratos ensayados la eficacia catalítica calculada para la enzima recombinante es del orden de 8-10 veces superior a la de la enzima nativa. Según esto, la enzima recombinante es capaz de catalizar la hidrólisis de más moléculas de cada uno de los sustratos por unidad de tiempo. Al igual que ocurre con la enzima nativa, las mayores eficacias corresponden a los ésteres de cadena larga V además éstas aumentan con el número de insaturaciones del sustrato. Hasta el momento no se ha caracterizado desde un punto de vista cinético la capacidad de síntesis de ambas enzimas debido a la complejidad de las reacciones. En este caso, los sistemas en los que se realizan las reacciones (sistemas monofásicos o bifásicos) podrían condicionar estos resultados.

En un principio la mejora catalítica de la enzima recombinante se atribuyó a su mayor grado de N-glicosilación frente al de la enzima nativa (=30% frente al 8%), pero esto no parece ser la causa de la mejora en la enzima recombinante pues apenas existen cambios significativos en su actividad frente a distintos sustratos tras su desglicosilación con endoglicosidasa H. Sin embargo, donde sí se han encontrado diferencias entre ambas enzimas, que podrían explicar esta mejora es en la secuencia de sus extremos N-termi nales. En concreto, la enzima recombinante presenta el extremo N-terminal modificado con entre 6-8 aminoácidos nuevos añadidos sobre la secuencia de la proteína nativa (SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6) como consecuencia de i) el proceso de clonación en el plásmido integrativo utilizado para transformar P. pastoris que añade 4 aminoácidos (VVEF) al extremo de la proteína que forman parte del sitio de clonaje multiple de áquel, y ii) el mal procesamiento post-traduccional de la proteína recombinante para eliminar el péptido señal (pre-propéptido del factor a de 5. cerevisiae), a causa de lo cual se incorporan a la secuencia dos (EA) o cuatro (EAEA) aminoácidos de más_ Por tanto, se tienen dos formas de proteína recombinante, una con 6 y otra con 8 aminoácidos de más. El mal procesamiento de este péptido señal se ha descrito también en otras proteínas expresadas de manera recombinante en P. pastoris sin afectar drásticamente a las propiedades catalíticas de la enzima (Crepin et al., supra; Damaso et al., supra; Brunel et al., supra) y parece debido a que una de las enzimas encargadas de ello, concretamente la enzima STE13, que media la eliminación de las repeticiones EA, no sería capaz de procesar, al ser una enzima minoritaria, un producto (proteína recombinante) que se está sobreexpresando (Brake. Secretion af heterologous proteins directed by the yeast a-factor leader Veast Genetic Engineering. Biotechnology series.pags. 269-280, 1989).

La existencia de la misma enzima con diferencias en su extremo N-terminal así como las diferentes propiedades catalíticas de cada una de las formas se ha descrito en la literatura (Mandrich et al. Role af the N Terminus in Enzyme Activity, 5tability and Specificity in Thermophilic Esterases Belonging to the H$l Family. Journal af Molecular Biology 345: 501

512. 2005; 5ayari et al. N-terminal peptide af Rhizopus oryzae lipase is important tor its catalytic properties. FEBS letters 579: 976-982. 2005; Niu et al. Secretion of pro-and mature Rhizopus orrhizus lipases by Pichio postoris and properties of the proteins. Molecular Biotechnology 32: 73-81. 2006; Yu et al. Rhizopus chinensis lipase: Gene cloning, expression in Pichio postoris and properties. Journal of Molecular Catalysis 8: Enzymatic 57: 304-311. 2009; Peña-Montes et al. Differences in biocatalytic behavior between two variants of Stcl esterase from Aspergiffus nidulans and its potential use in biocatalysis. Journal of Molecular Catalysis

B: Enzymatic 61: 225-234. 2009), e incluso se ha propuesto cómo dicho extremo interactuaría no sólo con el sustrato de naturaleza lipídica sino también con el resto de la molécula de enzima (Frikha et al. Structural homologies, importance for catalysis and lipid binding of the N-terminal peptide of a fungal and a pancreatic lipase. Protein and Peptide letters 17: 254

259. 2010). Por eso, asumimos que en el caso de la esterol esterasa recombinante este cambio podría estar implicado en la mejora de sus constantes cinéticas. Esto se pudo comprobar mediante estudios de velocidad de sedimentación realizados utilizando ultracentrifugación analítica para comparar las enzimas nativa y recombinante (Fig. 1). Estos estudios han puesto de manifiesto que mientras en solución acuosa (fosfato sódico 25 mM, pH 7,0) la enzima nativa se encuentra altamente agregada, la recombinante está en forma monomérica V dimérica. Si las proteínas se encuentran en una solución acuosa en presencia de detergente, en este caso Genapol X-lOO al 1% (v/v), ambas se encuentran mayoritariamente en forma monomérica. Si los estudios se hacen con enzima recombinante desglicosilada, para evitar el posible efecto "solubi lizante" que pudieran tener los carbohidratos unidos a la proteína (ya que el porcentaje de estos es mucho mayor que en la nativa), se observa que la enzima recombinante se encuentra en forma monomérica y dimérica en solución acuosa, siendo la forma compatible con el monómero la que aparece en presencia del detergente. Por tanto, resulta concluyente que la modificación del extremo N

S 10

terminal de la proteína recombinante está influyendo en el estado de agregación de la proteína y esto hace que sus propiedades cinéticas mejo ren. Existen trabajos que ponen de manifiesto la diferente actividad de una proteína, concretamente lipasas, según su estado de agregación. Cuando la proteína se encuentra agregada se forman estructuras pseudo-cuaternarias como consecuencia de la alta hidrofobicidad en aminoácidos expuest os al medio. Aunque existe disparidad en los efectos provocados, parece demostrado que el aumento del estado de agregación va acompañado de una pérdida de actividad que puede llegar a ser total, según el caso, como consecuencia del bloqueo de los sitios de unión al sustrato (Rúa et al. Thermoalkalophilic lipase of Baciffus thermocatenulaWs. Large-scale production, purificatio n and properties: aggregation behaviour and its effect on activity. Journal of Biotechnology 56: 89-102. 1997; Palomo et al. General trend of Ilpase to selfassemble giving bimolecular aggregates greatly modifies the enzyme functio nallty. Biomacromolecules 4: 1-6. 2003; f errer et al., supra).

15

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

20

Fig. 1. Estudio del estado de agregación de las enzimas nativa V recombinante por ultracentrifugación analítica. Se muestran los perfiles obtenidos con la enzima nativa y recombinante en solución acuosa a pH 7,0 en experimentos de velocidades de sedimentación.

25

Fig. 2A. Acilación de fitosteroles de soja con ácido láurico. Cromatograma de gases ilustrativo de la reacción control con una relación fitosteroles:ácido graso 1:1 en isooctano tras 48 horas. Hg. 2B. Acilación de fitosteroles de soja con ácido láurico. Cromatograma de gases ilustrativo del proceso de síntesis en reacciones con relación 1:1 tras 48 h con cualquiera de las enzimas empleadas en la presente invención.

30

Fig. 3. Efecto de diferentes relaciones fitosteroles:ácido láurico en la acilación de fitosteroles de soja con el ácido en sistemas bifásicos isooctano/agua tras 48 h de reacción.

Fig. 4. Efecto de la dosis de enzima en la acilación de fitosteroles de soja con ácido láurico

en sistemas bifásicos isooctano/agua empleando exceso de ácido tras 48 h de reacción. los

valores de act ividad se refieren a la actividad obtenida empleando como sustrato butirato de p-nitrofenilo a una concentración final de 1,5 mM.

Fig. 5. Efecto del solvente orgánico utilizado en la acilación de fitosteroles de 50ja con ácido

láurico en sistemas bifásicos empleando exceso de ácido tras 48 h de reacción.

EJEMPLOS 10

Ejemplo 1

Acilación de fitosteroles con ácido láurico en sistemas bifásicos isooctanojagua. Efecto de

la relación fitosteroles:ácido láurico.

15 Según datos bibliográficos, las moléculas de fitosterol, debido a fuertes

impedimentos estéricos, resultan sustratos díficiles de acilar para una gran mayoría de lipasas

o esterol esterasas mediante reacciones directas de esterificación {Kirk et al., supra~, y se suele recurrir por este motivo al desarrollo de reacciones de transesterificación. Sin embargo, en este y los sucesivos ejemplos se opta por reacciones de esterificación directa.

20 Crudos (preparados de enzima sin purificar) de la este rol esterasa nativa y recombinante fueron concentrados por ultrafiltración tangencial a través de una membrana de 5 kDa, congelados a -80 oC y sometidos a un proceso de liofilización durante 48 horas. l a actividad enzimática frente a pNPB antes y después del proceso de liofilización no cambió

25 significativamente, conservando una actividad media cercana al 80% para la enzima nativa, y del 70-100% para la enzima recombinante dependiendo del lote y medio de producción. los liófilos se mantuvieron a 4 oC durante más de 6 meses mostrando una gran estabilidad con el tiempo sin apenas perder actividad. Una preparación comercial (Sigma) con actividad este rol esterasa procedente de C. rugosa se empleó también para las comparaciones.

30 Para la acilación de fitosteroles con ácido láurico se empleó una mezcla comercial de éstos (Sigma), procedente de soja, conteniendo 55% de ~-sitosterol, 10% de estigmasterol,

29% de campesterol y 6% de brasicasterol según se pudo comprobar por cromatografía de

gases acoplada a espectrometría de masas.

Diferentes relaciones molares fitosterol:ácido láurico fueron ensayadas, concretamente relaciones desde 1:1 a 1:6. Específicamente se asignó como reacción base aquella en la que la concentración de fitosteroles era de 10 mM (estimada como media de los pesos moleculares de las especies presentes) y en la que la concentración de ácido láurico era también de 10 mM. Las reacciones tuvieron lugar en un sistema bifásico solvente orgánico/agua, concretamente isooctano/agua, donde la cantidad de agua correspondía al 10% de la cantidad de solvente empleada. Las reacciones se desarrollaron en tubos de vidrio con tapón de rosca y junta de teflón conteniendo imanes para la homogenización de la mezcla durante la reacción. Directamente sobre los tubos se añadieron las cantidades necesarias de cada uno de los sustratos y el solvente orgánico, y se agitaron en vórtex. Tras calentar los tubos a 100 Ge durante 5-10 minutos, preferiblemente 10 minutos, para favorecer la disolución de los componentes, y dejarlos enfriar a temperatura ambiente, se añadió la cantidad apropiada de agua mimQ. Inmediatamente después se añadieron las diferentes enzimas a una concentración de 6 U/mL de reacción (actividad medida frente a butirato de p-nitrofenilo a una concentración final de 1,5 mM). Se estableció un control sin enzima y las reacciones de síntesis se desarrollaron a 28 Ge y una agitación de 1.200 rpm durante un máximo de 96 horas. Se obtuvieron muestras de las reacciones a diferentes tiempos de incubación. Éstas fueron diluidas 10 veces con isooctano, centrifugadas a 7.500 rpm a temperatura ambiente durante 10-15 minutos, tras lo cual se tomaron 200 ¡..tL del sobrenadante que se diluyeron a la mitad con oleato de colesterilo 0,5 mM en isooctano (patrón interno).

Las muestras fueron analizadas mediante cromatografía de gases empleando un equipo GC 7890A (Agilent Technofogies), dotado de sistemas split y bockjfush con restrictor, con una columna Supelco SPB-l (5m x 250¡..tm x O,25¡..tm) y detector de ionización de llama (FID). El volumen de muestra a inyectar fue de 1 ¡..tL. Las temperaturas del inyector y el detector fueron fijadas a 350 oc. La temperatura de la columna se mantuvo a 115 oC durante 1 minuto, después se aumentó hasta 170 Ge a razón de 10 ·e/min, y por último se programó una rampa de 20 °e/min hasta 350 oC, manteniendo a esta temperatura 1 minuto. El tiempo de carrera fue de unos 17 minutos. Como gas portador se empleó helio a una presión de 20 psi. El análisis de datos se realizó con el software GC-Chem5tation Rev.B.04.02 (96) de Agitent Technofogies (2001-2009). la cuantificación de los sustratos y productos de la reacción se realizó a partir de sus factores de respuesta respecto al oleato de colesterilo empleado como patrón interno. las rectas de calibrado presentaron coeficientes de correlación de 0,99.

La figura 2 muestra, a modo de ejemplo, el seguimiento por cromatografía de gases de una reacción control (sin enzima) y otra en la que se emplea enzima tras 48 horas de incubación a 28 oc. En ambas reacciones la relación fitosteroles:ácido láurico fue 1:1 y, en su caso, la cantidad de enzima de 6 U/mL El pico a 1,55 minutos corresponde al ácido láurico, los picos a 10,75; 11,00; 11,15; Y 11,35 minutos corresponden a los fitosteroles brasicasterol, campesterol, estigmasterol y ~-sitosterol respectivamente, los picos con tiempos de retención de 14,40; 14,55; 14,65; Y 14,80 minutos corresponden a los ésteres de fitosteroles del ácido láurico, a saber, laurato de brasicasterilo, la urato de campesterilo, laurato de estigmasterilo y laurato de ~-sitosterilo; finalmente, el pico a 15,6 min corresponde al oleato de colesterilo (patrón interno).

Como puede deducirse del análisis de las muestras por cromatografía de gases, las esterol esterasas nativa (O PE nativa) y recombinante (OPE recombinante), así como la comercializada de C. rugoso (CRL), son capaces de realizar la acilación del ácido graso con cualquiera de los fitosteroles de la mezcla. La cuantificación con respecto al porcentaje de síntesis alcanzado, calculado con arreglo a la cantidad inicial de fitosteroles, pone de manifiesto que con las tres enzimas se alcanzan altos porcentajes de acilación en tiempos cortos de reacción. Este porcentaje es mayor a medida que aumenta el exceso de ácido láurico en la reacción (Fig. 3). Sin embargo, entre las enzimas empleadas existen diferencias mostrando mejores niveles de acilación las enzimas nativa y recombinante de o. piceae que la comercial a bajos excesos del ácido.

Utilizar excesos de uno de los sustratos es una estrategia recurrente en las reacciones de síntesis o de acilación para optimizar los rendimientos de obtención de ésteres. A pesar de que reacciones en las que los sustratos aparezcan en una relación 1:1 puedan parecer ideales desde un punto de vista económico e incluso para la posterior purificación de los productos, en determinadas ocasiones, como la que nos ocupa, resulta ventajoso emplear tal exceso (Villeneuve et al., supra) pues reduce el tiempo de reacción necesario para obtener altos porcentajes de acilación. En principio, los ésteres de fitosteroles sintetizados pueden separarse del exceso de ácido graso mediante destilación molecular (Hi rota et al., supra), o mediante desacidificación facilitando la formación de sales del ácido graso (Weber et al., supra). la mezcla de reacción puede también ser directamente tratada en un rotavapor o en un liofilizador para eliminar el solvente orgánico y obtener un producto con propiedades organolépticas aceptables en presencia del ácido graso libre.

Ejemplo 2 Acilación de fitosteroles con ácido láurico en sistemas bifásicos isooctanofagua. Efecto de la dosis de enzima.

Con el fin de comprobar el efecto de la dosis de las diferentes enzimas en la eficacia de síntesis de ésteres de fitosteroles del ácido láurico se realizaron reacciones de acilación en sistemas bifásicos isooctano/agua, empleando un exceso de ácido láurico.

Las reacciones fueron preparadas según se indica en el ejemplo 1. Dosis de cada una de las enzimas comprendidas entre 1,5 y 12 U/mL (actividad frente a pNPB) fueron añadidas a los tubos de reacción y se incubaron entre 4-48 horas a 28 oC con agitación magnética a

1.200 rpm. A diferentes intervalos de tiempo se obtuvieron muestras que fueron procesadas y analizadas tal y como se menciona en el ejemplo 1.

Las cuantificaciones obtenidas tras los análisis realizados por cromatografía de gases (Fig. 4) ponen de manifiesto que a dosis bajas de enzima (1,5 U/ml) el porcentaje de acilación alcanzado con la preparación enzimática de C. rugosa (CRl) es inferior al obtenido con las enzimas de Ophiostoma (OPE nativa y OPE recombinante). Resulta importante destacar que cuando se emplean dosis altas de enzima se obtienen los mismos resultados con las tres preparaciones enzimáticas ensayadas.

Las dosis de enzima que se han empleado corresponden a cantidades de sólido del orden de miligramos. Además sería posible su recuperación tras el térmi no de la reacción por filtración o centrifugación. No obstante, para la realización del siguiente ejemplo se optó por seguir empleando dosis de 6 U/mL de reacción total de cada una de las enzimas, pues este

valor se encuentra dentro del rango en el que se alcanzan los mejores porcentajes de adlación y permite cierto ahorro en biocatalizador.

Ejemplo 3

5 Acilación de fitosteroles con ácido láurico en sistemas bifásicos solvente orgánico/agua y

sistemas monofásicos orgánicos. Efecto del solvente orgánico empleado.

l a eficacia de las esterol esterasas nativa y recombinante de O. piceae, así como de la enzima comercializada de C. rugosa en reacciones de acilación de fitosteroles con ácido láurico en 10 sistemas bifásicos solvente/agua fue probada empleando diferentes solventes orgánicos para comprobar su efecto sobre el resultado de la reacción. En la literatura queda reflejado como el empleo de diferentes solventes puede afectar al rendimiento de la reacción como consecuencia de su diferente polaridad, lo cual determina la actividad "esterificante" de lipasas y este rol esterasas (Hirata et al. Lipase-catalyzed transesterification in organic solvent: 15 effects of water and solvent, thermal stability and some applications. Journal of Biotechnology 14: 157-167. 1990; Grodowska et al., supra). Incluso mediante la llamada "ingeniería de solventes" se pueden producir cambios en la actividad catalítica, estabilidad y selectividad de la enzima sin necesidad de modificarla mediante técnicas de mutagénesis dirigida, evolución dirigida o phoge display (Klibanov., supra). Isooctano, n-hexano y tolueno 20 fueron los solventes escogidos. Todos ellos se han empleado para la síntesis de otros compuestos de interés y continúan hoy en día empleándose en la industria farmacéutica bajo estrictas normas de utilización (Grodowska et al., supra). De hecho, el tolueno, en el año 2005, ocupaba el puesto número 7 dentro del ranking de los 10 solventes más empleados en GlaxoSmithKline Pharmaceuticals (GSK) (Constable et al. Perspective on solvent use in the 25 pharmaceutical industry. Organic Process Research & Oevelopment 11: 133-137. 2007), mientras que el n-hexano es uno de los pocos solventes orgánicos aceptados en la industria alimentaria (Li et al. Lipase-catalyzed synthesis of conjugated linoleyl b-sitosterol and its cholesterol-Iowering properties in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58: 18981902. 2010). Todos ellos presentan una adecuada separabilidad agua/solvente cuando se

30 emplean en sistemas bifásicos (Constable et al., supra).

Las reacciones de acilación se prepararon tal y como se indicó en el ejemplo 1 empleando un exceso de ácido láurico con los diferentes solventes. Las reacciones se desarrollaron en tubos de vidrio con tapón de rosca y junta de teflón siendo el volumen de agua el 10% del volumen empleado de solvente orgánico. Como se indicó en el ejemplo 1, tras añadir los sustratos y los solventes, y agitar en vórtex, las mezclas se calentaron en un baño de agua a 100 oC durante 5-10 minutos, preferiblemente 10 minutos, para favorecer la disolución de aquéllos, aunque en el caso del tolueno no hubiera sido necesario. Una vez fríos se añadió el volumen necesario de agua millio, y se procedió a la adición de las enzimas a una concentración de 6 U/ml. las reacciones se desarrollaron a 28 oC, 1.200 rpm durante 4-48 horas. A diferentes intervalos de tiempo se obtuvieron muestras de las diferentes reacciones que se procesaron y analizaron tal y como se expuso anteriormente en el ejemplo 1.

Los análisis por cromatografía de gases de las muestras obtenidas de las diferentes reacciones ponen de manifiesto la capacidad de las enzimas ensayadas de acilar los fitosteroles en presencia de cualquiera de los solventes orgánicos. Sin embargo, con las tres enzimas, los mejores porcentajes de acilación se alcanzan cuando se emplea isooctano como solvente, después n-hexano, y por último en tolueno. En concreto, los porcentajes de acilación logrados tras 48h de reacción en isooctano fueron del 85, 81 Y 84% para las enzimas

O. piceae nativa (OPE nativa), o. piceae recombinante (OPE recombinante), y C. rugosa comercial (CRL) respectivamente; en n-hexano del 85, 76 Y 78% respectivamente; y finalmente, en tolueno del 6, 4 y 14% respectivamente (Fig. 5).

Del mismo modo, estas reacciones pueden desarrollarse en sistemas monofásicos con cada uno de los tres solventes orgánicos estudiados. los resultados de esterificación con la enzima nativa de o. piceae y la enzima comercial de C. rugoso fueron similares a los obtenidos en los sistemas bifásicos al emplear los solventes con mayor coeficiente de partición (logP). Sin embargo, los rendimientos obtenidos con la esterol esterasa recombinante de o. piceae fueron menores.

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de acilación de fitosteroles libres o de derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una enzima esterol esterasa, caracterizado porque

   5 comprende una reacción de acilación en presencia de una esterol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma .
2. 2. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 1, caracterizado porque la esterol esterasa es producida por hongos de la especie o. piceae.

   10 3. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 2, caracterizado porque la esterol esterasa es una enzima recombinante codificada por el gen de o. piceae.
3. 4. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 3, caracterizado porque la esterol esterasa recombinante se

   15 expresa en un organismo elegido entre f. coli, s. cerevisiae, P. pastaris, H. polymorpha, Y. lipolytica, A. nidulons y T. reesei.
4. 5. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 4, caracterizado porque la esterol esterasa recombinante tiene un extremo N-terminal modificado cuyas secuencias son SEQ ID No: 5 y SEQ ID

   20 No: 6.
5. 6. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los fitosteroles o fitostanoles empleados provienen de cualquier fuente vegetal, residuos lignocelulósicos o residuos de fabricación industrial de etanol, cerveza o papel.

   2S 7. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 6, caracterizado porque los fitosteroles o los derivados saturados de éstos empleados provienen de la soja.
6. 8. Procedimiento de acilación de fitosteroles según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los fitosteroles vegetales utilizados se

   eligen entre el grupo que consiste en a-sitosterol, estigmasterol, campesterol, brasicasterol y cualquier derivado o mezcla de éstos.

7. 9.

   Procedimiento de acilación de fitosteroles según la reivindicación 8, caracterizado porque la mezcla de fitosteroles empleada comprende 55% de ¡3-sitosterol, 10% de estigmasterol, 29% de campesterol y 6% de brasicasterol expresado en peso respecto al total de la mezcla.

8. 10.

   Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el ácido graso es un ácido graso saturado o insaturado, de entre 6 y 18 átomos de carbono.

9. 11.

   Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido graso es ácido laúrico.

10. 12.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 aSó 11, caracterizado porque la proporción molar de fitosterol:ácido graso o derivado saturado de fitosterol:ácido graso comprende valores entre 1:1 y 1:6.

11. 13.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la esterol esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo.

12. 14.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles o de derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la este rol esterasa empleada como catalizador ha sido purificada mediante un método cromatográfico.

13. 15.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 13 ó 14, caracterizado porque se utiliza una dosis de enzima que comprende entre 1,5 y 12 U/ml de reacción, prefere ntemente entre 3 y 6 U/mL

14. 16.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la reacción

    transcurre en un sistema monofásico orgánico o bifásico que comprende una mezcla

    de solvente orgánico yagua.
15. 17. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos

    según la reivindicación 16, caracterizado porque el sistema bifásico comprende un 5 10% de agua.

16. 18.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles o de derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 16 Ó 17, caracterizado porque el solvente orgánico se elige entre el grupo que consiste en isooctano, n-hexano y tolueno.

17. 19.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos

    10 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la reacción de acilación transcurre entre 24 y 35 oC, preferentemente a 28 oc.

18. 20.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles según una cualquiera de las reivindicaciones 1 aS, caracterizado porque: al los fitosteroles vegetales utilizados se eligen entre el grupo que consiste en ~15 sitosterol, estigmasterol, campesterol, brasicasterol y cualquier derivado o mezcla de estos; bl el ácido graso es un ácido graso saturado o insaturado de entre 6 y 18 átomos de carbono; cl la esterol esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido 20 como consecuencia del cultivo del hongo; dI la reacción transcurre en un sistema monofásico orgánico o bifásico que comprende

    una mezcla de solvente orgánico yagua; y el la reacción de acilación transcurre entre 24 y 35 oC.

19. 21.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles según una cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque:

    al los fitosteroles empleados son una mezcla que comprende 55% de ~-sitosterol , 10% de estigmasterol, 29% de campes te rol, y 6% de brasicasterol, expresado en peso respeto al total de la mezcla;

    bl el ácido graso es ácido láurico; 30 cl la proporción de fitosterol:ácido graso comprende valores entre 1:1 y 1:6;

    d) la esterol esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo;

    el se utiliza una dosis de enzima que comprende entre 1,5 y 12 U/mL de reacción;

    f) la reacción transcurre en un sistema monofásico orgánico, con isooctano, n-hexano o tolueno como solventes, o bifásico que comprende una mezcla de cualquiera de estos solventes orgánicos con un 10% de agua; y

    g) la reacción de acilación transcurre a 28 oc.
20. 22. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a S, caracterizado porque adicionalmente comprende una etapa de aislamiento en forma de polvo sólido del éster de fitosterol

    o de un derivado saturado de éste.

21. 23.

    Procedimiento de acilación de fitosteroles según una cualquiera de las reivindicaciones 20 Ó 21, caracterizado porque adicionalmente comprende una etapa de aislamiento en forma de polvo sólido del éster de fitosterol.

22. 24.

    Ésteres de fitosteroles obtenidos mediante un procedimiento tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

23. 25.

    Ésteres de derivados saturados de fitosteroles obtenidos mediante un procedimiento tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 19 ó 22 .

24. 26.

    Producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se definen en la reivindicación 24 y 25, caracterizado porque dicho producto se elige entre el grupo que consiste en un alimento, un preparado alimenticio, un suplemento dietético y un medicamento.

25. 27.

    Producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 26, caracterizado por ser un producto alimenticio elegido entre el grupo que consiste en producto lácteo, producto derivado de la soja, cereal y mezcla de cereales.

26. 28.

    Producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 26, caracterizado por ser un suplemento dietético o medicamento una forma sólida apta para administración oral.

27. 29.

    Uso de los ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se definen en las reivindicaciones 24 y 25 respectivamente, o de un producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se define en las reivindicaciones 26 a 28 para la obtención de productos de interés alimenticio V/o farmacéutico.

28. 30.

    Ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se definen en las reivindicaciones 24 y 25 respectivamente, o de un producto enriquecido con

    ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se define en las

    reivindicaciones 26 a 28 para reducir los niveles de colesterol en plasma sanguíneo.