ES2333434T3 - Uso de poli-alfa-1,4-glucanos lineales como almidon resistente. - Google Patents
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Abstract
Uso de poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua como almidón resistente (RS), caracterizado porque los poli-alfa-1,4-D-glucanos no están retrogradados, y presentan un contenido en RS determinado por el método de Englyst y col. superior al 70% en peso, en el que los poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua se pueden obtener haciendo reaccionar de una disolución acuosa de sacarosa con un extracto de proteína en bruto de la cepa KV832 de la bacteria E. coli que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea.
Description
Uso de
poli-alfa-1,4-glucanos
lineales como almidón resistente.
La presente invención se refiere al uso de
alfa-1,4-glucanos lineales como
almidón resistente (RS), así como a un procedimiento para la
preparación de almidón resistente.
Las estructuras de almidón fundamentalmente
resistentes a la alfa-amilasa se conocen como
"almidón resistente" (RS). Los RSs no son degradados por las
alfa-amilasas. Debido a su susceptibilidad
metabólica reducida los almidones resistentes representan un
componente de producción en bruto con baja energía en el sentido de
ser un lastre en productos alimenticios o en composiciones de
productos alimenticios.
El uso de almidón resistente (RS) se está
volviendo cada vez más importante en la industria de productos
alimenticios. El cuerpo obtiene energía, sólo en una pequeña parte,
de la degradación de los productos que contienen RS. Este
suministro de energía afecta solamente a la degradación oxidativa de
los ácidos grasos de cadena corta reabsorbidos en el colon. Estos
ácidos grasos de cadena corta son los productos finales del
metabolismo de los carbohidratos de la microflora intestinal. Con
el consumo de productos alimenticios que contienen RS, están
disponibles los sustratos para el metabolismo energético de la
microflora intestinal y de las células epiteliales del colon. Estas
últimas dependen del suministro luminal de ácidos grasos de cadena
corta, especialmente butirato, para el mantenimiento de su
estructura y su función.
Niveles de butirato luminal elevados en el colon
representan un factor protector frente a enfermedades
colorrectales.
El almidón resistente se divide en los
siguientes tipos:
- RS tipo 1
- Almidón no accesible físicamente por digestión, por ejemplo, células de planta parcialmente molidas (por ejemplo, en el muesli).
- RS tipo 2
- Almidón granular no digerible (granos de almidón), por ejemplo, de patatas crudas, bananas verdes, etc.
- RS tipo 3
- Almidón retrogradado no digerible que se obtiene, por ejemplo, por tratamiento térmico y/o enzimático y a continuación se retrograda.
- RS tipo 4
- Almidón no digerible químicamente modificado que se forma, por ejemplo, por entrecruzamiento o esterificación (acetilación, etc.).
La característica del RS tipo 3 es la de que es
un almidón resistente que se forma por retrogradación. Durante la
retrogradación (también: recristalización) de almidones
gelatinizados se forman estructuras microcristalinas que no son
susceptibles a la hidrólisis enzimática por las
alfa-amilasas.
Se sabe por el documento de EE.UU. 3.729.380 que
la fracción de amilopectina muy ramificada se puede reducir por
tratamiento enzimático con enzimas de desramificación y ese almidón
desramificado posee una mayor tendencia a la retrogradación que el
almidón nativo.
El documento
EP-A1-0 564 893 describe un
procedimiento para la preparación de un producto que contienen RS
en el que está gelatinizada una suspensión acuosa al 15% de un
almidón que consta de un mínimo del 40% de amilosa, tratado con una
enzima desramificante, y el compuesto intermedio resultante
producido a continuación se retrograda. El producto contiene al
menos el 15% de RS. Si en este procedimiento se usa un almidón con
una fracción en amilosa del 100%, el producto contiene el 50% de RS
aproximadamente.
El documento
EP-A1-0 688 872 describe un
procedimiento para la preparación de un producto que contienen RS
del 25 al 50% a partir de una suspensión acuosa al 20%
aproximadamente de un almidón gelatinizado denominado
"parcialmente degradado" o maltodextrina que está
enzimáticamente desramificada o retrogradada. En el procedimiento
se usa como material de partida un almidón con una fracción de
amilosa inferior al 40%.
En el documento
EP-A1-0 688 872 un almidón definido
como "parcialmente degradado" es un almidón en el que se ha
reducido su peso molecular mediante un tratamiento físico o químico
adecuado, por el que el acortamiento de la longitud de la cadena
afecta tanto a la amilosa como a la amilopectina. El acortamiento la
longitud de la cadena se puede llevar a cabo tanto por
procedimientos hidrolíticos (ácidos o enzimáticamente catalizados),
como por extrusión, oxidación o pirólisis. El producto obtenido
mediante retrogradación del producto degradado se seca mediante
secado por pulverización. El producto pulverizado contiene una
fracción de RS superior al 50% de RS.
En el documento
EP-A-0846704 se describe un almidón
retrogradado que tiene un contenido en RS superior al 55% y una
temperatura de fusión por DSC inferior a 115ºC.
La solicitud de patente internacional WO
00/02926-A1 describe un procedimiento para la
preparación de polisacáridos resistentes a
alfa-amilasas en los que
poli-alfa-1,4-glucanos
insolubles en agua se suspenden o se dispersan en agua, la
suspensión o dispersión obtenida se calienta, la pasta así obtenida
se enfría y la pasta se retrograda a una temperatura que es
inferior a la temperatura de la pasta calentada. De esta forma se
obtienen productos de RS con un contenido en RS superior al
65%.
Schmiedl y col. (Carbohydrate Polymers 43,
(2000), 183-193) describen en profundidad la acción
butirogénica de almidones resistentes de tipo 3 (denominados
"almidón resistente de tipo III" en la publicación de Schmiedl
y col.) que se preparan a partir de
alfa-1,4-glucanos.
La descripción de la solicitud de patente
internacional WO 00/38537-A1 se cimenta sobre el
documento WO 00/02926-A1. El documento WO
00/38537-A1 describe composiciones que contienen,
entre otros, un almidón resistente que se produce como se describe
en la descripción del documento WO 00/02926-A1. El
documento WO 00/38537-A1 describe que la formación
del almidón resistente usado en las composiciones se lleva a cabo
por retrogradación de los
alfa-1,4-D-glucanos
lineales "no resistentes" insolubles en agua y que los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales "no resistentes" insolubles en agua producen
almidones resistentes únicamente después en la retrogradación.
En resumen, se puede ver que el estado de la
técnica para la preparación de almidones resistentes no granulares
no modificados químicamente enseña que las estructuras de almidón
resistente se forman cuando los polisacáridos se someten a un
proceso de retrogradación adicional que normalmente requiere mucho
tiempo y es muy costoso.
Los documentos US 2003094172 (A1) y WO 01/42309
se refieren a un procedimiento para incrementar el contenido en
almidón (contenido en RS) resistente a la
alfa-amilasa de un polisacárido en el que el
polisacárido usado se incuba, en déficit de agua, a continuación se
enfría, y si es apropiado se seca y se obtiene un polisacárido que
tiene un contenido en RS incrementado comparado con el polisacárido
usado. El contenido en almidón resistente del material de partida
no retrogradado es del 57,3-65%.
El objetivo de la presente invención es hacer
disponible de formas rentables polisacáridos que se puedan usar
como almidones resistentes.
El objetivo se resuelve con la provisión de las
formas de realización descritas en las reivindicaciones de la
patente.
Así, la presente invención se refiere al uso de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales como almidón resistente (RS), caracterizados porque
los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
no están retrogradados, y presentan un contenido en RS determinado
por el método de Englyst y col. superior al 70% en peso,
en los que los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua se pueden obtener con la reacción de una
disolución acuosa de sacarosa con un extracto de proteína en bruto
de la cepa KV832 de la bacteria E. coli que expresa una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una amilosacarasa de
Neisseria polysaccharea.
Sorprendentemente se encontró que
alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua como los caracterizados anteriormente
también se pueden usar como almidones resistentes sin una o más
etapas de retrogradación adicionales.
La solicitud de patente internacional
WO-00/38537-A1 enseña que un almidón
resistente que se puede obtener a partir de un
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua únicamente se puede obtener mediante la
retrogradación de los
alfa-1,4-D-glucanos
lineales "no resistentes" insolubles en agua.
La presente invención hace disponibles de una
manera rentable almidones resistentes cuya preparación no requiere
mucho tiempo ni una etapa de retrogradación costosa. La omisión de
la etapa de retrogradación representa una ventaja significativa
opuesta al procedimiento para la preparación de almidones
resistentes descritos en el documento WO
00/02926-A1 en el que, debido a su insolubilidad en
agua, los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
primero se deben solubilizar a altas temperaturas y/o presiones
elevadas antes de que se puedan someter a la retrogradación
posterior. El uso de temperaturas y/o presiones elevadas es un
proceso muy energético, y así muy costoso.
En relación con la presente invención, el
término "almidón resistente" o "RS" se entiende que es un
polisacárido que consta de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua y que no es susceptible a la degradación
por alfa-amilasas. El "almidón resistente" a
usar de acuerdo con la invención no es un almidón granular (RS de
tipo 2), ni un almidón retrogradado (RS de tipo 3) ni un almidón
químicamente modificado (RS de tipo 4), y así representa un nuevo
tipo de almidón resistente que, en consecuencia, en lo sucesivo se
denominará RS de tipo 5.
En una forma de realización adicional del uso
según la invención los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua se preparan enzimáticamente.
En relación con la presente invención, el
término "insoluble en agua" se entiende que son
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales que, según la definición del Deutsches Arzneimittelbuch
(Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart,
Gori-Verlag GmbH, Frankfurt, 9. Edition (1987))
entran dentro de la categoría de "menos solubles", "poco
solubles", "muy poco solubles" y "prácticamente
insolubles", con respecto a las clases 4-7.
La insolubilidad en agua de los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
usado según la invención preferentemente es tal que al menos el
98%, en particular al menos el 99,5% de los polisacáridos usados son
insolubles en agua en condiciones normales (temperatura = 25ºC
\pm 20%; presión = 101.325 Pascal \pm 20%) (que corresponde al
menos las clases 4 y 5 de la definición del Deutsches
Arzneimittelbuch).
Los procedimientos para la determinación de la
solubilidad de los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
son conocidos por la persona experta en la materia.
En relación con la presente invención, se
entiende que el término "lineal" es un
poli-alfa-1,4-D-glucano
que no presenta ramificación o cuya ramificación es tan escasa que
no es detectable con procedimientos normales tales como
espectroscopia de RMN ^{13}C.
En relación con la presente invención, se
entiende que una "disolución acuosa de sacarosa" es una
disolución acuosa que puede estar exenta de sales tamponantes, pero
preferentemente contiene sales tamponantes, con una concentración
de sacarosa en el intervalo comprendido entre el 0,5% en peso y el
80% en peso, preferentemente en el intervalo entre el 5% en peso y
el 60% en peso, más preferido en un intervalo entre el 10% en peso y
el 50% en peso, especialmente preferido en un intervalo entre el
20% en peso y el 30% en peso.
En relación con la presente invención, se
entiende que una "enzima con la actividad de una amilosacarasa"
es una enzima que cataliza las siguientes relaciones:
- 1.
- Sacarosa + sacarosa \leftrightarrow oligo-(alfa-1,4-glucano)_{n} + fructosa
- 2.
- Oligo-(alfa-1,4-glucano)_{n} + sacarosa \leftrightarrow poli-(alfa-1,4-glucano)_{n+1} + fructosa
Partiendo de este esquema de reacción los
alfa-1,4-glucanos lineales
oligoméricos o poliméricos pueden servir como aceptores para una
reacción de alargamiento de la cadena que da lugar a
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua a usar según la invención, cuyos
residuos glucosa están conectados mediante enlaces
alfa-1,4-glicosídicos y presentan
un peso molecular medio en el intervalo de 0,75 x 10^{2} g/mol a
10^{7} g/mol, preferentemente entre 1 x 10^{2} g/mol y 10^{5}
g/mol, y más preferentemente entre 1 x 10^{3} g/mol y 3 x 10^{4}
g/mol, lo más preferentemente entre 2 x 10^{3} g/mol y 1,2 x
10^{4} g/mol.
Estos aceptores
alfa-1,4-glucano oligoméricos o
poliméricos se pueden añadir externamente, sin embargo,
preferentemente se producen a partir de sacarosa por la propia
amilosacarasa como se describe en el ejemplo 1.
La ramificación, por ejemplo los enlaces
alfa-1,6-glicosídicos, no es
detectable por RMN ^{13}C (Remaud-Simeon y col.
en "Carbohydrate Bioengineering" (ed. S. B. Petersen y col.),
Elsevier Science B.V. (1995), 313-320) en estos
productos que se obtuvieron mediante la reacción de una disolución
acuosa de sacarosa con una enzima con la actividad enzimática de la
amilosacarasa.
En relación con la presente invención en
principio se puede usar cualquier amilosacarasa opcional. Las
proteínas con la actividad enzimática de una amilosacarasa son
conocidas por la persona experta en la materia. Preferentemente,
las amilosacarasas a usar según la invención se originan a partir de
microorganismos, preferentemente a partir del género
Neisseria, más preferentemente la amilosacarasa de
Neisseria polysaccharea.
La patente de EE.UU. 6265635-B1,
la solicitud de patente internacional WO 00/14249-A1
y Potocki de Montalk y col. (Journal of Bacteriology 181 (2),
(1999), 375-381) describen, por ejemplo, secuencias
de ADN que codifican una proteína amilosacarasa de Neisseria
polysaccharea que es preferida en relación con la presente
invención. Además, se ha descrito la presencia de proteínas con
actividad amilosacarasa para una serie de especies de
Neisseria adicionales, por ejemplo, para Neisseria
perflava (Okada y Hehre, J. Biol. Chem. 249 (1974),
126-135), MacKenzie y col., Can J. Microbiol. 23,
(1977), 1303-1307), Neisseria canis,
Neisseria cinerea, Neisseria denitrificans,
Neisseria sicca, Neisseria subflava (MacKenzie y col.,
Can. J. Microbiol. 24, (1978), 357-362).
Se describe una secuencia de ADN que codifica
para una proteína amilosacarasa de Caulobacter crescentus CB
15 en la Secuencia completa del genoma de Caulobacter
crescentus. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
98:4136-4141, la información del ADN y de la
proteína están disponibles en el banco de datos del EMBL
(http://srs.ebi.ac.uk) con el ID Nº AE005791 y Protein_id
AAK23119.1.
También se conoce una amilosacarasa de la cepa
93246 de Neisseria meningitidis cuyo ADN y la secuencia de
aminoácidos está disponible con la ID AY099334 y Protein_id
AAM51152.1 del banco datos del EMBL.
Además, se conoce una secuencia de ADN de
Deinococcus radiodurans R1 (número de acceso del banco de
genes del NCBI NP_294657, conocida como
alfa-amilasa) que codifica para una proteína con la
actividad enzimática de una amilosacarasa.
Con la ayuda de este ADN y la información de la
secuencia de aminoácidos de las amilosacarasas, preferentemente con
la ayuda de la información de la secuencia descrita en el documento
WO 00/14249-A1 ahora es posible para la persona
experta aislar secuencias homólogas de otros organismos,
preferentemente microorganismos. Esto se puede llevar a cabo, por
ejemplo, con la ayuda de procedimientos convencionales, por ejemplo,
seleccionando bancos genómicos con sondas de hibridación adecuadas.
La persona experta sabe que el aislamiento de secuencias homólogas
también se puede llevar a cabo con la ayuda de oligonucleótidos
(degenerados) y con el uso de procedimientos basados en la PCR.
La selección de bancos de datos tales como los
que hay disponibles, por ejemplo, en el EMBL
(http://www.ebi.ac.
uk/Tools/index/htm) o el NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), también puede servir para identificar secuencias homólogas que codifican para una proteína con la actividad enzimática de una amilosacarasa. Aquí, una o más secuencias se preajustan a la denominada secuencia de consulta. A continuación, esta secuencia de consulta se compara con secuencias que están contenidas en los bancos de datos seleccionados por medio de programas estadísticos de ordenador. Esas consultas a los bancos de datos (por ejemplo, búsquedas en blast o fasta) son conocidas por la persona experta y se pueden llevar a cabo con diferentes proveedores. Si esa consulta al banco de datos se lleva a cabo, por ejemplo, en el NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se deben usar los ajustes normales que están preajustados para la respectiva comparación de la secuencia de consulta. Estos son los ajustes para las comparaciones de secuencias de proteínas (blastp): límite de entrada = no activado; filtro = baja complejidad activada; valor esperado = 10; tamaño de la palabra = 3; matriz = BLOSUM62; costes de los huecos: existencia = 11, extensión = 1.
uk/Tools/index/htm) o el NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), también puede servir para identificar secuencias homólogas que codifican para una proteína con la actividad enzimática de una amilosacarasa. Aquí, una o más secuencias se preajustan a la denominada secuencia de consulta. A continuación, esta secuencia de consulta se compara con secuencias que están contenidas en los bancos de datos seleccionados por medio de programas estadísticos de ordenador. Esas consultas a los bancos de datos (por ejemplo, búsquedas en blast o fasta) son conocidas por la persona experta y se pueden llevar a cabo con diferentes proveedores. Si esa consulta al banco de datos se lleva a cabo, por ejemplo, en el NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se deben usar los ajustes normales que están preajustados para la respectiva comparación de la secuencia de consulta. Estos son los ajustes para las comparaciones de secuencias de proteínas (blastp): límite de entrada = no activado; filtro = baja complejidad activada; valor esperado = 10; tamaño de la palabra = 3; matriz = BLOSUM62; costes de los huecos: existencia = 11, extensión = 1.
Los siguientes parámetros son para comparaciones
de secuencias de ácidos nucleicos (blastn): límite de entrada: no
activado; filtro = baja complejidad activada; valor esperado = 10;
tamaño de la palabra = 11.
En esa búsqueda en el banco de datos de la
información del ADN y de la secuencia de aminoácidos de las
amilosacarasas, se puede usar la información de la secuencia
descrita en el documento WO 00/14249-A1, por
ejemplo, como secuencia de consulta para identificar moléculas de
ácidos nucleicos y/o proteínas adicionales que codifican una
proteína con la actividad enzimática de una amilosacarasa.
La actividad enzimática de una proteína con
actividad amilosacarasa se puede detectar muy fácilmente con la
expresión del gen de la amilosacarasa en E. coli y la
posterior tinción de azul de las células de E. coli con yodo
como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 6 de la solicitud de
patente internacional WO 95/31553-A1.
La conversión de la disolución acuosa de
sacarosa se lleva a cabo in vitro.
Las solicitudes internacionales WO
99/67412-A1 (ejemplo 3) (correspondientes a la
solicitud de EE.UU. US 20020052029-A1), WO
00/38537-A1 (ejemplo 1) y de Montalk y col. (FEBS
letters 471, (2000), 219-223) describen, por
ejemplo, procedimientos para la preparación in vitro de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
por medio de amilosacarasa. Aquí se hace referencia explícita a la
descripción de estos documentos. Además, en el ejemplo 1 de la
presente solicitud de patente se describe un procedimiento in
vitro para la preparación de
poli-alfa-1,4-D-glucanos.
En una forma de realización adicional de la
presente invención la preparación in vitro de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
con amilosacarasa tiene lugar en presencia de aceptores de un grupo
glucosilo lineal externo. Dentro del contexto de la presente
invención, se entiende que el término "aceptor de un grupo
glucosilo lineal externo" es un oligo- o polisacárido lineal,
por ejemplo, maltopentosa, maltohexosa, maltoheptosa, que se añade
externamente al sistema in vitro y está en posición de
incrementar la velocidad de conversión inicial de la sacarosa por
parte de la amilosaca-
rasa.
rasa.
En una forma de realización adicional
particularmente preferida de la presente invención, la preparación
in vitro de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
por medio de amilosacarasa tiene lugar en ausencia de aceptores de
un grupo glucosilo ramificado externo. Dentro del contexto de la
presente invención, se entiende que el término "aceptor de un
grupo glucosilo ramificado externo" es una molécula de
carbohidratos ramificada tal como glucógeno o amilopectina que se
añade externamente al sistema in vitro o ya está presente en
la mezcla de reacción, por ejemplo, como componente del extracto
enzimático de amilosacarasa y que está en posición de incrementar
la velocidad de conversión inicial de la sacarosa por parte de la
amilosacarasa.
Los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua que presentan las propiedades descritas
en el presente documento (insolubles en agua, sin ramificación, con
un peso molecular entre 10^{2} g/mol y 10^{7} g/mol) pero
preparados mediante un procedimiento diferente también pueden ser
materiales de partida del uso según la invención.
Los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan un contenido en RS determinado
según el método de Englyst y col. (European Journal of Clinical
Nutrition 46, (Supp.23), (1992), S33-S50) superior
al 70% en peso. En relación con la presente invención, el método de
Englyst y col. usado preferentemente para determinar el contenido
en RS se describe en el ejemplo 1.
En una forma de realización adicional de la
presente invención, los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua a usar según la invención presentan un
contenido en RS determinado mediante el método de Englyst y col.
superior al 75% en peso, preferentemente superior al 80% en peso,
más preferentemente superior al 85% en
peso.
peso.
\newpage
Los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua a usar según la invención presentan un
alto contenido en RS. Esto es completamente sorprendente para la
persona experta puesto que en base al contenido de la descripción
del documento WO 00/38537-A1 tendría que asumir que
los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
a usar según la invención formarían estructuras "no
resistentes", esto es, estructuras que serían susceptibles a la
degradación por alfa-amilasas.
Ahora sorprendentemente se ha encontrado que, al
contrario de lo que se afirma en la descripción del documento WO
00/38537-A1, los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
a usar según la reivindicación 1 de la invención de presentan un
contenido en RS superior al 70% en peso, preferentemente superior al
80% en peso, más preferentemente superior al 85% en peso sin que
haya que someterlos a una etapa de retrogradación adicional.
En relación con la presente invención
"retrogradación" (también: recristalización) se entiende que
significa un procedimiento que consta de al menos una etapa de
calentamiento y al menos una etapa de enfriamiento de una
suspensión de polisacáridos o una dispersión de polisacáridos.
Durante la etapa de calentamiento, la suspensión de polisacáridos o
la dispersión de polisacáridos gelatiniza, durante la fase de
enfriamiento se forman estructuras microcristalinas que no son
susceptibles a la hidrólisis enzimática por las
alfa-amilasas.
Además, se encontró que los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
a usar según la invención promueven la formación de ácidos grasos
de cadena corta, particularmente butirato, en el colon y así, son
adecuados para su uso como suplementos nutricionales para la
prevención de enfermedades colorrectales.
En una forma de realización adicional del uso
según la invención los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan una temperatura máxima por
DSC de entre 95ºC y 125ºC, preferentemente entre 100ºC y 120ºC, más
preferentemente entre 105ºC y 116ºC.
El procedimiento de "calorimetría de barrido
diferencial" (DSC) también es conocido por la persona experta en
la materia. Los resultados de las mediciones de la DSC se usan para
la caracterización de la estabilidad térmica de los productos de
RS. El procedimiento de DSC usado preferentemente en relación con la
presente invención se describe en el ejemplo 3 de la presente
solicitud de patente.
Los máximos endotérmicos de las mediciones de la
DSC se caracterizan con mayor precisión mediante diversos
parámetros (T_{0}, T_{P}, T_{C} y dH). La temperatura de
inicio T_{0} caracteriza el comienzo de la transformación
térmica. Al valor de la T_{P} (T_{P} = temperatura máxima de la
DSC) se lee la temperatura a la cual tiene lugar la máxima
transformación térmica del material cristalino, mientras que T_{C}
representa la temperatura a la cual concluye el proceso de
transformación (temperatura final).
La energía de transformación dH (entalpía de
transformación) se determina calculando el área del pico. Representa
la energía total que es necesaria para la transformación.
En una forma de realización adicional del uso
según la invención, los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan una energía por DSC de
transformación de fase dH de 10 J/g - 30 J/g, preferentemente de 11
J/g - 25 J/g y más preferentemente de 20 J/g - 24 J/g.
En una forma de realización preferida adicional
del uso según la invención los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua no están modificados.
En relación con la presente invención, el
término "no modificado" significa que los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
a usar según la invención se producen enzimáticamente,
preferentemente por conversión de una disolución acuosa de sacarosa
por una amilosacarasa, y después de la preparación enzimática y el
aislamiento de los
poli-alfa-1,4-D-glucanos,
posteriormente no se modifican química y/o físicamente.
Este procedimiento ofrece la ventaja de que se
omiten las etapas de retrogradación intensivas en costes y el
tiempo, a diferencia de los procedimientos para la preparación de
almidones resistentes, en particular, RS de tipo 3, descrito en el
estado de la técnica.
En una forma de realización adicional la
invención se refiere al uso de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
insolubles en agua ligeramente ramificados como almidón
resistente.
En relación con la presente invención, se
entiende que el término "ligeramente ramificados" es un grado
de ramificación inferior al 1%, preferentemente inferior al 0,5% y
más preferentemente inferior al 0,25%.
La determinación del grado de ramificación se
lleva a cabo por medio de espectroscopia de RMN ^{13}C.
La ramificación se puede producir en las
posiciones 2 y 3, preferentemente en la posición 6. Puede aparecer
por modificación química, por ejemplo, por formación de éter o
esterificación o por modificación enzimática, por ejemplo, con una
enzima ramificante.
Los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
insolubles en agua ligeramente ramificados preferentemente no están
modificados.
En una forma de realización adicional de la
presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación
de un almidón resistente que engloba las siguientes etapas del
proceso:
- a)
- preparación de una disolución acuosa de sacarosa;
- b)
- conversión de la disolución acuosa de sacarosa con un extracto de proteína en bruto de la cepa KV832 de la bacteria E. coli que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea en poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua; y opcionalmente
- c)
- el aislamiento de los poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua.
La preparación de una disolución acuosa de
sacarosa es conocida por la persona experta en la materia. Ya se
han descrito disoluciones acuosas de sacarosa adecuadas en relación
con el uso según la invención. La conversión según la etapa b) del
procedimiento también se ha descrito anteriormente en relación con
el uso según la invención. Los procedimientos también son conocidos
por la persona experta, y cómo puede aislar los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua que son almidones resistentes RS de
tipo 5. Las propiedades de los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua a usar
\hbox{según la invención ya
se han descrito anteriormente en relación con el uso según la
invención.}
En una forma de realización adicional de la
presente invención los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua se pueden secar después del
aislamiento. Por ejemplo, se pueden criodesecar, secar al aire o
secar por pulverización.
En una forma de realización adicional, la
presente invención se refiere al uso del procedimiento de la
invención para la preparación de un almidón resistente.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención con mayor precisión sin que esté limitada a los
ejemplos.
1. Preparación de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua. La preparación de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua se describe, por ejemplo, en los
documentos WO 00 44492, WO 00 02926, WO 00 38537, WO 99 67412 o WO
01 42309.
2. Purificación de amilosacarasa. Se describe un
protocolo para la purificación de una proteína con la actividad
enzimática de una amilosacarasa en el documento WO 99 67412.
3. Expresión de una proteína con la actividad
enzimática de una amilosacarasa. La expresión de una proteína con
la actividad enzimática de una amilosacarasa en células bacterianas
se describe, entre otros, por Potocki de Montalk y col. (2000, FEMS
Microbiology Letters 186, 103-10) y Potocki de
Montalk y col. (1999, J. of Bacteriology 181,
375-381).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El contenido en RS de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua, preparados con la conversión de
sacarosa por una proteína con la actividad enzimática de una
amilosacarasa, se basó en el método de Englyst (European Journal of
Clinical Nutrition (1992) 46 (suppl.2), p.33-50)
para la determinación de almidones resistentes de tipo III. Al
mismo tiempo, el método de Englyst se modificó en relación con la
información sobre la determinación del contenido en RS en el
documento WO 00 02926.
Tampón de digestión de
pancreatina/amiloglucosidasa usado:
- \quad
- Acetato Na 0,1 M, pH 5,2
- \quad
- CaCl_{2} 4 mM
Se agitaron 12 g de pancreatina (Merck, Nº de
Producto 1.07130.1000) en 80 ml de agua desmineralizada
(conductividad 18 M ohm aproximadamente) durante 10 min a 37ºC y a
continuación se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm.
54 ml del sobrenadante obtenido después de la
centrifugación se trataron con 9,86 ml de agua desmineralizada y
0,14 ml de amiloglucosidasa (6000 u/ml, Sigma, Nº de Producto
A-3042).
5 ensayos de la digestión con
pancreatina/amiloglucosidasa (AGS) se prepararon cada vez para cada
lote de
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua a medir. Posteriormente no se añadió
disolución enzimática a 2 de estos 5 ensayos. Los ensayos a los que
no se les añadió disolución enzimática se designan como referencia
y se usan para la determinación de la velocidad de recuperación. Los
3 ensayos restantes se designan como muestras, posteriormente se
tratan con disolución enzimática y se usan para la determinación del
contenido en RS de los respectivos
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua. Una serie de matraces de reacción que
no contienen
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua se procesaron en paralelo (muestras de
blanco). Estas muestras de blanco que no contienen
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua se usan para la determinación de la
cantidad de material coprecipitado (proteína, sales).
Se determinó el peso neto de 50 ml de matraces
de reacción (tubos Falcon) y a continuación en cada caso se
añadieron 200 mg aproximadamente de
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua.
Se añadieron 15 ml de tampón de acetato sódico a
cada una de las muestras de
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua y las muestras de blanco, y 200 ml de
tampón de acetato sódico a cada una de las referencias (véase más
arriba). Estas muestras se precalentaron a 37ºC.
La reacción se inició con la adición de 5 ml de
disolución enzimática a cada uno de los matraces de reacción
individuales de las muestras y de las muestras de blanco que a
continuación, se agitaron durante 2 horas a 37ºC (200 rpm).
La reacción se inactivó con la adición de 5 ml
de ácido acético glacial (equilibrado a pH 3,0) y 80 ml de etanol
técnico a las muestras, a las muestras de blanco y a las
referencias.
La precipitación del
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua a partir de la mezcla de reacción se
consiguió con la incubación del ensayo de reacción inactivado a
temperatura ambiente durante 1 hora.
Después de la sedimentación (centrifugación
durante 10 minutos a 2500 x g), el sedimento de los ensayos
individuales obtenidos se lavó dos veces con etanol al 80% para
eliminar los glucanos de cadena corta y a continuación se
criodesecó después de enfriar a -70ºC.
Las muestras se volvieron a pesar y las
diferencias de peso se usaron para el cálculo del contenido en RS
"gravimétrico".
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el siguiente procedimiento para la
determinación del contenido en RS de lotes individuales de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua:
- a)
- Determinación del contenido en agua de lotes de muestra individuales de poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales (peso de H_{2}O).
- b)
- Determinación del peso neto de los matraces de reacción individuales para las respectivas muestras (peso de RGP), referencias (peso de RGR) y las muestras de blanco (peso de RGB).
- c)
- Pesaje de 200 mg aproximadamente de poli-alfa-1,4-D-glucano lineal insoluble en agua en los matraces de reacción individuales para las muestras (peso de P) y las referencias (peso de R).
- d)
- Cálculo de la fracción seca de los pesos para las muestras (peso de P_{tr} = peso de P - peso de H_{2}O) y las referencias (peso de R_{tr} = peso de P - peso de H_{2}O).
- e)
- Digestión enzimática de las respectivas muestras y muestras de blanco. Las referencias se trataron de la misma manera pero sin la adición de la disolución enzimática.
- f)
- Precipitación, sedimentación, lavado y criodesecado de las sustancias que permanecen en los matraces de reacción de las muestras, referencias y muestras de blanco después del tratamiento descrito en e).
- g)
- Pesaje de las sustancias que permanecen en los matraces de reacción de las muestras (peso de PRG), referencias (peso de RRG) y las muestras de blanco (peso de BRG), incluyendo el matraz de reacción después del tratamiento descrito en f).
- h)
- Cálculo del peso de las sustancias que permanecen en los matraces de reacción de
- \quad
- las muestras (peso de Pnv = peso de PRG - peso de RGP),
- \quad
- referencias (peso de Rnv = peso de RRG - peso de RGR)
- \quad
- las muestras de blanco (peso de Bnv = peso de BRG - peso de RGB)
- \quad
- después del tratamiento descrito en f).
- i)
- Determinación del contenido en agua de las sustancias que permanecen en los matraces de reacción de las
- \quad
- muestras (peso de H_{2}OPnv),
- \quad
- referencias (peso de H_{2}ORnv)
- \quad
- las muestras de blanco (peso de H_{2}OBnv)
- j)
- Cálculo de la fracción seca de las sustancias que permanecen en los matraces de reacción de las
- \quad
- muestras (peso de Pnv_{tr} = peso de Pnv - peso de H_{2}OPnv)
- \quad
- referencias (peso de Rnv_{tr} = peso de Rnv - peso de H_{2}ORnv)
- \quad
- y las muestras de blanco (peso de Bnv_{tr} = peso de Bnv - H_{2}OBnv)
- \quad
- después del tratamiento descrito en f).
- k)
- Determinación de los pesos corregidos de las muestras (peso de Pnv_{korr} = peso de Pnv_{tr} - peso de Bnv_{tr})
- \quad
- y las referencias (peso de Rnv_{korr} = peso de Rnv_{tr} - peso de Bnv_{tr})
- l)
- Cálculo del porcentaje de la fracción de los pesos corregidos de los poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua que permanecen después de la digestión enzimática en relación al peso seco de la cantidad de partida de las
- \quad
- muestras (RSaP = peso de Pnv_{korr}/peso de P_{tr} 100)
- \quad
- y cálculo del porcentaje de la fracción de los pesos corregidos de los poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua restantes de las referencias en relación al peso seco de las cantidades de partida de las referencias (RSaR = peso de Rnv_{korr}/peso de R_{tr} x 100).
- m)
- Determinación del valor medio del porcentaje de las fracciones de los poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua restantes después de la digestión enzimática de las muestras (RSaPMW = n x RSaP/n)
- \quad
- y determinación de los valores medios del porcentaje de las fracciones de los poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua restantes de las referencias: (velocidad de recuperación; RSaRMW = n x RSaR/n)
- \quad
- en las que n es el número de muestra y los ensayos de referencia llevados a cabo para los respectivos lotes de poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua.
- n)
- Determinación del contenido en RS en porcentaje de los lotes individuales de poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua por corrección de los valores medios de las fracciones en porcentaje de los poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua restantes después de la digestión enzimática con la velocidad de recuperación (RS = RSaPMW/RSaRMW x 100).
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el contenido en RS de los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua, preparados con la conversión de
sacarosa por una proteína con la actividad enzimática de una
amilosacarasa según el procedimiento descrito en el ejemplo 2b). Si
se usa un extracto de proteína en bruto procedente de la cepa
DH5\alpha de la bacteria E. coli que expresa una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica una amilosacarasa de Neisseria
polysaccharea (Potocki de Montalk y col., 1999, J. of
Bacteriology 181, 375 -381) para la preparación del
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua, el contenido en RS del
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua es del 75% \pm 2%.
Si se usa un extracto de proteína en bruto de la
cepa KV832 de la bacteria E. coli (Kiel y col., 1987, Mol.
Gen. Genet. 207: 294-301) que expresa una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica una amilosacarasa de Neisseria
polysaccharea (Potocki de Montalk y col., 1999, J. of
Bacteriology 181, 375 -381) para la preparación del
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua, el contenido en RS del
poli-alfa-1,4-D-glucano
lineal insoluble en agua es del 91% \pm 2%
\newpage
Ejemplo
2
Se determinó el peso molecular de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua con la conversión de sacarosa por una
proteína con la actividad enzimática de una amilosacarasa mediante
cromatografía de exclusión molecular (GPC).
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Preparación de una disolución al 1% del poli-alfa-1,4-D-glucano lineal insoluble en agua en DMSO + NaNO_{3} 90 mM (que corresponde al eluyente usado en el análisis de GPC).
- 2.
- Agitación durante 30 minutos aproximadamente a 60ºC para disolver.
- 3.
- Centrifugación durante 1 minuto a 8000 rpm en una centrífuga de sobremesa.
- 4.
- Dilución 1:10 en el eluyente.
- 5.
- Inyección de 24 \mul de dilución 1:10.
\vskip1.000000\baselineskip
Componentes del sistema GPC usado:
- \quad
- Bomba: Dionex, P580
- \quad
- Muestreador automático: Dionex, AS50
- \quad
- Columnas: PSS (pre-columna: PSS GRAM, 10 \mu; columnas de separación: PSS GRAM 3000, 10 \mu y PSS GRAM 100, 10 \mu
- \quad
- Horno de columna: Dionex, modelo 585
- \quad
- Detección: Shodex R171
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis por GPC se llevó a cabo en las
siguientes condiciones:
Muestreador automático y horno de columna a
60ºC
- \quad
- Eluyente: DMSO + NaNO_{3} 90 mM
- \quad
- Velocidad de flujo del eluyente: 0,7 ml/min
El control se llevó a cabo con el software
Chromeleon (Dionex) y la evaluación de los datos con la ayuda del
software PSS WinGPC compact V.6.20.
\vskip1.000000\baselineskip
Los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentaban un peso molecular de 1500 a
55.000 Dalton. El pico máximo cae a 9000 Dalton.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La estabilidad térmica de los productos de RS se
determinó con la ayuda del Pyris Diamond DSC de Perkin Elmer. Se
pesó cada vez 10 mg de productos de RS en una cápsula de medida
(plato de acero Perkin Elmer Nº de producto 03190029), se trataron
con 30 \mul de agua desionizada (Millipore) y la cápsula de medida
se selló según las instrucciones del fabricante. Todas las muestras
se midieron en las siguientes 12 horas. Una cápsula de medida vacía
sirvió como referencia. La calibración se llevó a cabo con un patrón
de indio. La medición de la DSC se llevó a cabo sobre un intervalo
de temperaturas de 20-150ºC a una velocidad de
calentamiento de 10ºC por minuto. La determinación de la T_{0},
T_{P} y \DeltaH se llevó a cabo con el software Pyrus (vers.
5). Los datos para la \DeltaH se refieren a los pesos en seco de
las muestras que se determinaron con una balanza calefactada. Cada
muestra se midió dos veces con este procedi-
miento.
miento.
Los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua se prepararon con un extracto de
proteína en bruto de la cepa DH5\alpha de la bacteria E.
coli que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea (Potocki de
Montalk y col., 1999, J. Bacteriology 181, 375-381)
o con un extracto de proteína en bruto de la cepa KV832 de la
bacteria E. coli (Kiel y col., 1987 Mol. Gen. Genet. 207:
294-301) que expresa una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica para una amilosacarasa de Neisseria
polysaccharea (Potocki de Montalk y col., 1999, J. Bacteriology
181, 375-381). Los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua obtenidos se criodesecaron o se secaron
al aire.
Claims (9)
1. Uso de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua como almidón resistente (RS),
caracterizado porque los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
no están retrogradados, y presentan un contenido en RS determinado
por el método de Englyst y col. superior al 70% en peso, en el que
los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua se pueden obtener haciendo reaccionar
de una disolución acuosa de sacarosa con un extracto de proteína en
bruto de la cepa KV832 de la bacteria E. coli que expresa una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una amilosacarasa
de Neisseria polysaccharea.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan un contenido en RS
determinado por el método de Englyst y col. superior al 75% en
peso.
3. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan un contenido en RS
determinado por el método de Englyst y col. superior al 80% en
peso.
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3
caracterizado porque los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan una temperatura máxima por
DSC de entre 95ºC y 125ºC.
5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4
caracterizado porque los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan una energía por DSC de
transformación de fase dH de 20 J/g - 24 J/g.
6. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 5
caracterizado porque los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan un peso molecular medio de 1
x 10^{2} g/mol a 10^{5} g/mol.
7. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 5
caracterizado porque los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan un peso molecular medio de 1
x 10^{3} g/mol a 3 x 10^{4} g/mol.
8. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 5
caracterizado porque los
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua presentan un peso molecular medio de 2
x 10^{3} g/mol a 1,2 x 10^{4} g/mol.
9. Procedimiento para la preparación de
poli-alfa-1,4-D-glucanos
lineales insolubles en agua según las reivindicaciones
1-8 que engloba las siguientes etapas:
- a)
- preparación de una disolución acuosa de sacarosa;
- b)
- conversión de la disolución acuosa de sacarosa con un extracto de proteína en bruto de la cepa KV832 de la bacteria E. coli que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea en poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua; y opcionalmente
- c)
- el aislamiento de los poli-alfa-1,4-D-glucanos lineales insolubles en agua.
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