ES2332169A1 - Empleo de microparticulas que comprenden celulas modificadas geneticamente en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se relaciona con métodos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas mediante el empleo de micropartículas que comprenden células modificadas genéticamente que expresan factores neurotróficos y/o angiogénicos y en donde dichas micropartículas se administran mediante implantación a nivel del córtex cerebral.
Description
Empleo de micropartículas que comprenden células
modificadas genéticamente en el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas.
La presente invención se relaciona con el empleo
de micropartículas que comprenden células modificadas genéticamente
que expresan al menos un factor neurotrófico, al menos un factor
angiogénico o una combinación de ambos para el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas.
Las enfermedades neurodegenerativas, entre las
que se incluyen la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de
Parkinson (EP) entre otras, constituyen un grave problema desde el
punto de vista médico, asistencial, social y económico al que deben
enfrentarse los países desarrollados.
En la actualidad existen varios medicamentos que
proporcionan un tratamiento sintomático de estas enfermedades, pero
ninguno que haya demostrado utilidad con relevancia clínica para
frenar la progresión del proceso degenerativo.
Los factores angiogénicos son factores de
crecimiento que no solo estimulan la neovascularización y la
angiogénesis (iniciada con la activación de las células
endoteliales de los vasos sanguíneos parentales) in vivo,
sino que también son mitogénicos para las células endoteliales
in vitro. Ejemplos de factores angiogénicos son, por
ejemplo, HGF, VEGF, FGF y HIF. El VEGF (factor de crecimiento del
endotelio vascular) es el prototipo de los factores angiogénicos,
cuyo papel a nivel de Sistema Nervioso Central (SNC) no esta
únicamente relacionado con el crecimiento de los vasos sanguíneos,
como regulador fisiológico de la angiogénesis cerebral y de la
integridad de la barrera hematoencefálica, sino que posee además un
efecto directo sobre distintos tipos de células neuronales,
incluyendo incluso a las células madre neuronales (NSCs). Por otro
lado, estudios realizados ponen de manifiesto que en enfermedades
como EA o Huntington se producen deficiencias cerebrovasculares que
preceden a la aparición de los síntomas clínicos, lo cual sugiere
que dichas alteraciones podrían contribuir a la patogénesis de
estas enfermedades.
Los factores neurotróficos son proteínas
naturales que desempeñan un papel importante a nivel de SNC. Dichos
factores son esenciales para asegurar la supervivencia y la
diferenciación de las neuronas durante el desarrollo y para mantener
en el adulto la normalidad de la función neuronal. Debido a estas
funciones fisiológicas los factores neurotróficos son útiles para
el tratamiento de las patologías del SNC en las cuales la
supervivencia y/o la propia función neuronal se encuentran
comprometidas. Dentro de los factores neurotróficos se encuentra el
GDNF (Factor neurotrófico derivado de la glía) que fue aislado por
Lin y cols en 1930 y desde entonces se ha ensayado su utilización
en diferentes enfermedades que afectan al SNC.
Un problema importante a resolver es el sistema
y el lugar de administración de estos factores angiogénicos y
neurotróficos, ya que es necesario que el factor atraviese la
barrera hemato-encefálica para que pueda ejercer su
acción y además el tratamiento de estas enfermedades puede
conllevar una administración crónica durante largos periodos de
tiempo.
En base a los conocimientos previos se dispone
de una gran cantidad de productos terapéuticos, como son, por
ejemplo, los factores neurotróficos y angiogénicos citados
anteriormente, para el tratamiento de enfermedades del SNC. No
obstante la liberación de dichos productos a nivel cerebral está
limitada por la dificultad que supone el acceso al lugar de
administración. En la práctica clínica la liberación controlada de
estos productos terapéuticos se realiza mediante bombas de infusión
o cánulas a nivel intraventricular. Estas vías de administración
requieren inyecciones continuadas o bien recargas de la bomba de
infusión para mantener los niveles del fármaco y evitar la
degradación de la sustancia terapéutica. Además, debido a la
tecnología que presentan las bombas de infusión actuales es difícil
administrar dosis bajas de fármacos durante prolongados periodos de
tiempos.
Una de las estrategias terapéuticas que más
importancia está adquiriendo en el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas y del SNC es la terapia celular. La utilización
de células como medicamento es una alternativa terapéutica de
interés creciente en la comunidad científica, con la que se
pretende desarrollar sistemas farmacéuticos que liberen el fármaco
secretado por las células durante largos periodos de tiempo y de
forma segura y fisiológica, siendo especialmente adecuados para el
tratamiento de enfermedades crónicas. No obstante, una de las
principales limitaciones que presenta este tipo de terapia es el
rechazo por parte de la respuesta inmunitaria del huésped a las
células implantadas, siempre y cuando el injerto objeto del
trasplante no proceda del propio huésped. De ahí que la
administración de células alo y xenogénicas secretoras de productos
terapéuticos, ofrezca resultados poco satisfactorios a
medio-largo plazo como consecuencia de la acción de
los mecanismos defensivos del paciente. Debido a este inconveniente
se han diseñado sistemas que permiten la administración de células
y que evitan el rechazo provocado por la respuesta inmune, entre
dichos sistemas destacan las fibras huecas y las microcápsulas.
La utilización fibras huecas que contienen
células modificadas genéticamente para producir CNTF (Factor
neurotrófico ciliar) es un sistema de administración que se ha
utilizado en el tratamiento de pacientes con ALS. Asimismo, también
se han descrito procedimientos que comprenden la encapsulación de
células productoras de GDNF o VEGF en fibras huecas e implantadas a
nivel del estriado (Yasuhara, T. y Date, I. 2007. Cell
transplantation, vol. 16:1-8; Lindvall, O. y
Wahlberg, L.U. 2008, Experimental Neurology, vol.
209:82-88). La solicitud de patente europea
EP0388428 describe métodos en los que fragmentos de mesencéfalo
ventral encapsulados en tubos formados por membranas semipermeables
se implantan en la región parietal del córtex cerebral tras
craneotomía. No obstante, este tipo de tecnología presenta la
desventaja de ser un sistema de un tamaño elevado (del orden de
milímetros), lo cual puede condicionar la viabilidad y
funcionalidad de las células encapsuladas.
Una alternativa a las fibras huecas, es el
empleo de microcápsulas que pueden comprender células o fragmentos
del plexo coroideo, o células modificadas genéticamente para
expresar proteínas de interés terapéutico.
Skinner, S.M.J. et al.
(Xenotransplantation, 2006 vol.13: 284-288)
describen la utilización de células de plexos coroideos
microencapsulados en modelos animales de distintas enfermedades del
SNC.
Borlongan et al. (Neurochemistry Int.
2004 vol. 24: 495-503) describen un método para el
tratamiento de la isquemia cerebral mediante la implantación
subdural de microcápsulas que comprenden células del plexo
coroideo.
La solicitud de patente estadounidense
US2004213768 describe métodos para la administración de factores
neurotróficos al sistema nervioso central basados en la
implantación de microcápsulas (preferiblemente de alginato) que
comprenden células aisladas del plexo coroideo, en donde la
implantación se efectúa de forma subdural o subaracnoidea.
Sin embargo, el empleo de células de plexo
coroideo no permite controlar de forma exacta la naturaleza de los
factores angiogénicos/neurotróficos producidos por la célula.
Por otro lado, respecto al empleo de
microcápsulas que pueden comprender células modificadas
genéticamente, Meysinger, D. et al. (Neurochem. Int. 1994
vol. 24(5): 495-503) describen microcápsulas
de alginato-polilisina-alginato que
comprenden fibroblastos modificados genéticamente para producir
factor de crecimiento nervioso (NGF). En un trabajo publicado por
Grandoso, L. et al. (Internal Journal of Pharmaceutics, 2007
vol. 343:69-78) se estudia la utilización de
microcápsulas de
alginato-poli-L-lisina
en las que se inmovilizan fibroblastos productores de GDNF para el
tratamiento de la EP en un modelo de rata parkinsonizada. Las
microcápsulas se administraron a nivel del estriado mediante
esterotaxia y se observó una mejora en el comportamiento rotacional
de los animales.
Sin embargo, ambos trabajos emplean técnicas
demasiado invasivas que pueden conducir a efectos secundarios no
deseados en el paciente.
Por tanto, existe una necesidad en el estado de
la técnica de encontrar sistemas que permitan controlar el producto
terapéutico y/o los factores angiogénicos y neurotróficos
administrados y que sean menos invasivos, mejorando de este modo el
tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, entre las que
se incluyen la EA y la EP.
En un aspecto, la invención se relaciona con una
micropartícula que comprende células modificadas genéticamente que
expresan al menos un factor neurotrófico, al menos un factor
angiogénico o una combinación de ambos para el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, en donde la administración de la
microparticula se realiza a nivel del córtex cerebral.
La Figura 1 muestra tres fotografías de las
micropartículas que contienen fibroblastos modificados
genéticamente para producir VEGF. A y B: imágenes de microscopía
óptica. C: imagen de microscopía de fluorescencia.
La Figura 2 es una gráfica que muestra la
proliferación de células BMVEC en presencia de VEGF secretado por
las micropartículas (33 ng/mL) y de la solución stock de VEGF (500
ng/mL) a los días 7 y 20.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la
densidad de vasos sanguíneos estimulada por la producción de VEGF a
partir de las micropartículas implantadas en ratones C57BL/6
normales.
La Figura 4 es una fotografía que muestra la
doble tinción BrdUrd-lectina de los nuevos vasos
sanguíneos inducidos por la producción de VEGF a partir de las
micropartículas implantadas en ratones C57BL/6 normales.
La Figura 5 es una gráfica que representa los
resultados obtenidos en el ensayo T-maze en ratones
APP/PS1.
La Figura 6 es una gráfica que muestra los
resultados del test de reconocimiento de objetos en ratones
APP/PS1.
La Figura 7 es una gráfica que representa los
niveles de BDNF medidos en diferentes tejidos de ratas viejas
(18-24 meses) control (tratadas micropartículas
vacías) y ratas tratadas con micropartículas que contenían células
productoras de BDNF.
La Figura 8 es una gráfica que representa los
resultados de la determinación de caspasa 3, caspasa 9 y PMAPK en
cortex de ratas viejas control (tratadas con micropartículas
vacías) y con las micropartículas que liberan BDNF.
Los inventores han descubierto que la
administración a nivel del córtex cerebral de micropartículas que
comprenden células modificadas genéticamente para expresar factores
neurotróficos o angiogénicos permite, sorprendentemente, el
tratamiento no sólo de lesiones localizadas en el córtex cerebral,
sino también lesiones localizadas en otras áreas del cerebro
gracias a la difusión de los factores neurotróficos o angiogénicos
administrados.
Así, en un aspecto, la invención se relaciona
con una micropartícula que comprende células modificadas
genéticamente que expresan al menos un factor neurotrófico, al
menos un factor angiogénico o una combinación de ambos, para el
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en donde la
administración de la micropartícula se realiza a nivel del córtex
cerebral.
La micropartícula de la invención es una
partícula esférica o no, dentro de la que se incluyen (i)
microcápsulas, que se definen como sistemas vesiculares en los que
las células modificadas genéticamente están confinadas en una
cavidad rodeada de una única membrana (habitualmente polimérica); y
(ii) microesferas, que son sistemas matriciales en los que las
células están dispersas por toda la partícula.
En la presente invención, se entiende por
"micropartícula" a aquella partícula que comprende un diámetro
inferior a 1 mm, preferentemente, entre 1 y 0,9, entre 0,9 y 0,8,
entre 0,8 y 0,7, entre 0,7 y 0,6, entre 0,6 y 0,5, entre 0,5 y 0,4,
entre 0,4 y 0,3, entre 0,3 y 0,2, entre 0,2 y 0,1 o menos de 0,1 mm
de diámetro. En una realización particular, la micropartícula de la
invención posee un diámetro entre 0,380 y 0,404 mm, preferentemente,
0.392 mm. Asimismo, en el contexto de la presente invención y
debido a la capacidad de la micropartícula de producir de forma
continua productos terapéuticos, dicha micropartícula se denomina
micro-biosistema farmacéutico.
No obstante, como entiende el experto en la
materia, el tamaño medio de la micropartícula de la invención se ve
influenciado por diferentes factores tecnológicos del procedimiento
de producción de dicha micropartícula, tales como la concentración
de los distintos componentes de la micropartícula, velocidad de
agitación, etc.
La micropartícula de la invención puede estar
formada por cualquier material polimérico biocompatible que permita
la secreción continua de los productos terapéuticos y que actúe
como soporte de las células modificadas genéticamente. Así, dicho
material polimérico biocompatible puede ser, por ejemplo, los
polímeros termoplásticos o los polímeros hidrogeles.
Entre los polímeros termoplásticos se encuentran
ácido acrílico, acrilamida, 2-aminoetil
metacrilato,
poli(tetrafluoroetileno-cohexafluorpropileno),
ácido metacrílico-(7-cumaroxi) etil éster,
N-isopropil acrilamida, ácido poliacrílico,
poliacrilamida, poliamidoamia,
poli(amino)-p-xilileno,
poli(cloroetilvonileter), policaprolactona,
poli(caprolactona-co-trimethylene
carboanto), poli(carbonato urea) uretano,
poli(carbonato) uretano, polietileno, coplímero de
polietileno y acrilamida, polietilenglicol, polietilenglicol
metacrilato, poli(etilene tereftalato),
poli(4-hidroxibutil acrilato),
poli(hidroxietil metacrilato),
poli(N-2-hidroxipropil
metacrilato), poli(ácido láctico-ácido glicólico), poli(ácido L
láctico), poli(gamma-metil,
L-glutamato), poli(metilmetacrilato),
poli(propileno fumarato), poli(propileno óxido),
polipirrol, poliestirene, poli(tetrafuoro etileno),
poliuretano, polivinil alcohol, polietileno de peso molecular
ultraalto, 6-(p-vinilbenzamido)-ácido hexanóico y
N-p-vinilbenzil-D-maltonamida
y copolímeros que contienen más de uno de dichos polímeros.
Entre los polímeros del tipo hidrogel se
encuentran materiales naturales del tipo alginato, agarosa,
colágeno, almidón, ácido hialurónico, albúmina de suero bovina,
celulosa y sus derivados, pectina, condroitin sulfato, fibrina y
fibroina, así como hidrogeles sintéticos como sefarosa y
sefadex.
En una realización particular, el polímero que
forma parte de la micropartícula de la invención se encuentra
ligado a, o funcionalizado con, un ligando específico para un
receptor de superficie celular. En la presente invención, se
entiende por "ligando específico para un receptor de superficie
celular" a la molécula o péptido que es capaz de reconocer un
receptor de la superficie celular y unirse a él de forma específica.
De este modo, dicho ligando permite la interacción específica entre
el polímero de la micropartícula y las células modificadas
genéticamente contenidas dentro de la misma.
En principio, cualquier molécula o péptido que
posea sitios de unión específicos que puedan ser reconocidos por
receptores de superficie de las células puede ser usado en la
presente invención como un ligando específico para un receptor de
superficie celular. Así, el ligando específico para un receptor de
superficie celular puede proceder de moléculas de adhesión celular
que interaccionan con la matriz extracelular como la fibronectina,
los distintos miembros de la fa-
milias de las selectinas, las caderinas, las lectinas, las integrinas, las inmunoglobulinas, las colectinas y las galectinas.
milias de las selectinas, las caderinas, las lectinas, las integrinas, las inmunoglobulinas, las colectinas y las galectinas.
Así, el ligando específico para un receptor de
superficie celular empleado en la presente invención puede ser un
péptido derivado de una región seleccionada de las regiones de la
fibronectina que intervienen en la unión con las integrinas que se
encuentran en la membrana celular. Por ejemplo, y sin limitar la
invención, dichos péptidos derivan de la región de la décima
repetición tipo III de fibronectina que contiene el péptido RGD, de
la región de la decimocuarta repetición tipo III de la fibronectina
que contiene el péptido IDAPS (SEQ ID NO: 1), de la región CSI de
fibronectina que contiene el péptido LDV y la región CS5 de la
fibronectina que contiene el péptido REDV (SEQ ID NO: 2). Estos
péptidos pueden consistir en fragmentos de las regiones
correspondientes que conservan su capacidad adhesiva, como, por
ejemplo, el péptido QAGDV (SEQ ID NO: 3) del fibrinógeno, el
péptido LDV de la fibronectina y el péptido IDSP (SEQ ID NO: 4) de
VCAM-I.
La presente invención también contempla el uso
de péptidos de unión a integrinas como un ligando específico para
un receptor de superficie celular, que derivan de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina que comprende la
secuencia RGD, como, por ejemplo, un péptido seleccionado del grupo
de RGD, RGDS (SEQ ID NO: 5), GRGD (SEQ ID NO: 6), RGDV (SEQ ID NO:
7), RGDT (SEQ ID NO: 8), GRGDG (SEQ ID NO: 9), GRGDS (SEQ ID NO:
10), GRGDY (SEQ ID NO: 11), GRGDF (SEQ ID NO: 12), YRGDS (SEQ ID
NO: 13), YRGDDG (SEQ ID NO: 14), GRGDSP (SEQ ID NO: 15), GRGDSG
(SEQ ID NO: 16), GRGDSY (SEQ ID NO: 17), GRGDVY (SEQ ID NO: 18),
GRGDSPK (SEQ ID NO: 19), CGRGDSPK (SEQ ID NO: 20), CGRGDSPK (SEQ ID
NO: 21), CGRGDSY (SEQ ID NO: 22), ciclo(RGDfK) (SEQ ID NO:
23), YAVTGRGD (SEQ ID NO: 24), AcCGGNGEPRGDYRAY-NH2
(SEQ ID NO: 25), AcGCGYGRGDSPG (SEQ ID NO: 26) y RGDPASSKP (SEQ ID
NO: 27), variantes cíclicas de dichos péptidos, variantes
multivalentes tanto lineales como ramificadas (ver por ejemplo
Dettin et al. 2002, J. Biomed. Mater. Res.
60:466-471; Monaghan et al. 2001, Arkivoc, 2:
U42-49; Thumshirn et al. 2003, Chemistry 9:
2717-2725; Scott et al, 2001, J. Gene Med. 3:
125-134) así como combinaciones de dos o más de
dichos péptidos.
Por tanto, en otra realización particular, el
ligando específico para un receptor de superficie celular es un
péptido que comprende la secuencia RGD.
El péptido que comprende la secuencia RGD puede
estar unido al polímero de la micropartícula a través del extremo
N-terminal o del extremo C-terminal
e, independientemente del punto de anclaje, puede estar unido
directamente al polímero o, alternativamente, puede estar unido a
través de un elemento espaciador. Prácticamente, cualquier péptido
con flexibilidad estructural puede ser utilizado. A modo
ilustrativo, dicho péptido flexible puede contener repeticiones de
restos de aminoácidos, tales como (Gly)_{4} (SEQ ID NO:
28), Gly-Gly-Gly-Ser
(SEQ ID NO: 29), (Gly)_{13} (SEQ ID NO: 30) (Beer, J.H.
et al., 1992, Blood, 79, 117-128),
SGGTSGSTSGTGST (SEQ ID NO: 31), AGSSTGSSTGPGSTT (SEQ ID NO: 32),
GGSGGAP (SEQ ID NO: 33), GGGVEGGG (SEQ ID NO: 34) o cualquier otra
repetición de restos de aminoácidos adecuada, o bien la región
bisagra de un anticuerpo.
Asimismo, el ligando específico para un receptor
de superficie celular puede estar ligado al polímero con distintos
grados de sustitución, de forma que las concentraciones de ambos
componentes pueden variar y de este modo controlar el número de
ligandos específicos para un receptor de superficie celular que
están ligados al polímero de la micropartícula. Así, la invención
contempla polímeros que contienen entre 1 y 100, entre 100 y 200,
entre 200 y 300, entre 300 y 400, entre 400 y 500, entre 500 y 600,
entre 600 y 700, entre 700 y 800, entre 800 y 900 y entre 900 y 1000
moléculas de dicho ligando específico por cada molécula de
polímero.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
micropartícula de la invención puede estar formada por cualquier
material polimérico biocompatible que permita la secreción continua
de los productos terapéuticos y que actúe como soporte de las
células modificadas genéticamente. Así, en una realización
particular, el polímero de la micropartícula de la invención es
alginato. En el Ejemplo 1 de la presente solicitud de patente se
describe uno de los distintos procedimientos que existen en el
estado de la técnica para producir micropartículas que comprenden
alginato como material biopolimérico.
En principio, cualquier tipo de alginato capaz
de formar un hidrogel es adecuado para ser usado en la
micropartícula de la invención. Así, la micropartícula puede
contener alginato formado mayoritariamente por regiones de ácido
manurónico (bloques MM), por regiones de ácido gulurónico (bloques
GG) y por regiones de secuencia mixta (bloques MG). El porcentaje y
distribución de los ácidos urónicos difieren según el origen del
alginato y contribuyen a las propiedades del alginato. El experto en
la materia conoce los porcentajes de cada uno de los distintos
bloques que aparecen en las distintas fuentes biológicas de los
alginatos. Así, la invención contempla el uso de alginatos
procedentes de Laminaria hyperborea, Letonia nigrescens, Lessonia
trabeculata, Durvillaea antarctica, Laminaria digitata, Eclonia
maxima, Macrocystis pyrifera, Ascophyllum nodosum y/o
Laminaria japonica así como mezclas de alginatos de
distintas especies hasta conseguir el contenido deseado en bloques
GG, MM o GM. Los bloques GG contribuyen a la rigidez del hidrogel,
mientras que los monómeros MM mantienen una gran resistencia a la
fractura, de forma que mediante el uso de una combinación adecuada
de polímeros de alginato, se puede obtener una mezcla cuyo módulo
de elasticidad presenta una valor adecuado mientras que la
viscosidad de la solución pre-gel se mantiene a
niveles suficientemente bajos como para permitir una adecuada
manipulación e inmovilización celular. Así, los alginatos que pueden
usarse en la presente invención incluyen alginatos GG, alginatos MM
o combinaciones de ambos en una relación de 90:10, 80:20, 70:30,
60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 o 10:90.
Adicionalmente, la invención también contempla
el uso de alginatos derivados del tratamiento de alginatos
naturales con enzimas que son capaces de modificar los bloques
integrantes para dar lugar a alginatos con propiedades mejoradas.
Así, alginatos resultantes del tratar alginatos con
C5-epimerasas, que convierten bloques M en bloques
G, así como con la enzima A1gE4 de la bacteria Azotobacter
vinelandii que es capaz de convertir los bloques M
relativamente rígidos en bloques MG. Alternativamente, la invención
contempla el uso de alginatos que han sido modificados por distintos
tratamientos físicos, en particular, rayos gamma, irradiación con
ultrasonidos o con luz ultravioleta según ha sido descrito por
Wasikiewicz, J.M. et al. (Radiation Physics and Chemistry,
2005, 73:287-295).
La micropartícula de la invención que comprende
alginato como material polimérico biocompatible puede usarse tal
cual. Sin embargo, como es conocido del estado de la técnica, el
alginato es un polímero poco estable que tiende a perder calcio y
por tanto, a perder su carácter de gel. Además, las partículas de
alginato son relativamente porosas lo que resulta en que los
anticuerpos pueden acceder a su interior y dañar las células. Por
estos motivos, opcionalmente, la micropartícula de la invención
puede estar rodeada de una membrana semipermeable que confiera
estabilidad a las partículas y que forme una barrera impermeable a
los anticuerpos.
Por membrana semipermeable se entiende una
membrana que permite la entrada de todos aquellos solutos
necesarios para la viabilidad celular y que permitan la salida de
las proteínas terapéuticas producidas por las células contenidas
dentro de la micropartícula, pero que es sustancialmente
impermeable a los anticuerpos, de forma que las células quedan
protegidas de la respuesta inmune producida por el organismo que
alberga la micropartícula.
Materiales adecuados para formar la membrana
semipermeable son materiales insolubles en fluidos biológicos,
preferentemente poliamino ácidos, como por ejemplo
poli-L-lisina,
poli-L-ornitina,
poli-L-arginina,
poli-L-asparagina,
poli-L-aspártico, poli
benzil-L-aspartate,
poli-S-benzil-L-cisteína,
poli-gamma-bencil-L-glutamato,
poli-S-CBZ-L-cisteína,
poli-\varepsilon-CBZ-D-lisina,
poli-\delta-CBZ-DL-ornitina,
poli-O-CBZ-L-serina,
poli-O-CBZ-D-tirosine,
poli(\gamma-etil-L-glutamate),
poli-D-glutámico, poliglicine,
poli-\gamma-N-hexil
L-glutamato,
poli-L-histidina, poli
(\alpha,\beta-[N-(2-hidroxietil)-DL-aspartamida]),
poli-L-hidroxiprolina, poli
(\alpha,\beta-[N-(3-hidroxipropil)-DL-aspartamide]),
poli-L-isoleucina,
poli-L-leucina,
poli-D-lisina,
poli-L-fenilalanina,
poli-L-prolina,
poli-L-serina,
poli-L-threonina,
poli-DL-triptófano,
poli-D-tirosine o una combinación de
los mismos. Preferiblemente, por tanto, en una realización
particular, la micropartícula de la invención comprende, además,
una membrana de poli-L-lisina.
La membrana que recubre la micropartícula es
habitualmente de un material policatiónico, que da lugar a la
formación de un complejo polianión-policatión que
contribuye a la estabilización del alginato y a reducir la porosidad
de la micropartícula y a formar una barrera inmunológica
impermeable a los anticuerpos. Sin embargo, la carga positiva de
dicha membrana favorece la adhesión celular a la superficie de la
micropartícula lo que resulta en una menor biocompatibilidad de la
misma. Por ello, si se desea, la membrana de
poli-L-Lisina que rodea la
micropartícula está rodeada, a su vez, de una segunda membrana
formada mayoritariamente por un material que inhibe la adhesión
celular, preferiblemente, alginato (ver Ejemplo 1 de la presente
solicitud de patente).
Cualquier célula eucariota que haya sido
modificada genéticamente para expresar, al menos, un factor
neurotrófico, al menos, un factor angiogénico o una combinación de
ambos, puede ser utilizada en la presente invención, pero las
células de ratón, rata, primate y humanas son las preferidas. Así
células adecuadas para llevar a cabo la invención son
cardiomiocitos, células endoteliales, células epiteliales,
linfocitos (células B y T), mastocitos, eosinófilos, células de la
intima vascular, cultivos primarios de células aisladas de
distintos órganos, preferentemente de células de aisladas de los
islotes de Langerhans, hepatocitos, leucocitos, incluyendo
leucocitos mononucleares, células madre de origen embrionario,
mesenquimales, de cordón umbilical o adultas (de piel, pulmón,
riñón e hígado), osteoclastos, condrocitos y otras células del
tejido conectivo. También son adecuadas células de líneas
establecidas tales como células T de Jurkat, células
NIH-3T3, CHO, Cos, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293,
3T3, mioblastos C2C12 y células W138.
En principio, el número de células que deben
formar parte de la micropartícula no es esencial para la invención
siempre que exista un número de células suficiente para que se
contribuya a la formación de la retícula. Así, la cantidad de
células por cada mL de solución de polímero es entre 1 y 10 x
10^{6}, preferiblemente entre 2 y 9 x 10^{6}, más
preferiblemente entre 3 y 8 x 10^{6}, todavía más preferiblemente
entre 4 y 7 x 10^{6} y todavía más preferiblemente entre 5 y 6 x
10^{6}. Preferiblemente, el número de células en la mezcla
inicial es de 5; 3,75; 2,5 ó 1,25 x 10^{6} por cada mL de solución
de polímero.
En el contexto de la presente invención, la
célula eucariota contenida dentro de la micropartícula de la
invención puede ser modificada con cualquier factor neurotrófico,
por ejemplo, y sin limitarse a, neurotrofinas (NT), como la
NT-3, NT-4, NT-5 ó
NT-6; factor neurotrófico derivado del cerebro
(BDNF, Brain-derived neurotrophic factor); factor
neurotrófico ciliar (CNTF); factor de crecimiento insulínico tipo 1
(IGF-1); factor de crecimiento insulínico tipo 2
(IGF-2); factor de crecimiento nervioso (NGF, del
inglés Nerve Growth Factor); neurturina (NTN); persefinas;
arteminas, pleiotrofina (PTN), efrinas, netrinas, semaforinas,
slits, reelinas, factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF),
factor neurotrófico conservado de dopamina (CDNF) (conserved
dopamine neurotrophic factor), factor neurotrófico derivado de los
astrocitos mesencefálicos (MANF, mesencephalic
astrocyte-derived neurotrophic factor)
etc.
etc.
Asimismo, en el contexto de la presente
invención, la célula eucariota contenida dentro de la
micropartícula de la invención puede ser modificada con cualquier
factor angiogénico, por ejemplo, y sin limitarse a, angiopoyetinas
(Ang), tales como Ang-1, Ang-2,
Ang-3 o Ang-4; factor básico de
crecimiento de fibroblastos (bFGF/FGF2), como por ejemplo, el
factor de crecimiento de fibroblastos 20 (FGF20); factor de
crecimiento transformador beta (TGF\beta), factor de crecimiento
transformador alfa (TGF\alpha), factor de crecimiento de placenta
(PIGF); factor de crecimiento epidérmico (EGF, epidermal grothw
factor); factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), como
VEGF-A, VEGF-B o
VEGF-C; factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF, Platelet-derived growth factor), como
PDGF-A y PDGF-B; el polipéptido
intestinal vasoactivo (VIP); factor de crecimiento de hepatocitos
(HGF), cardiotrofinas, proteínas morfogenéticas del hueso (BMP,
bone morphogenetic protein), sonic hedgehog (SHH), etc.
Como entiende el experto en la materia, la
modificación genética de las células que van a ser encapsuladas
dentro de la micropartícula de la invención puede ser llevado a cabo
mediante cualquier método de los conocidos en la técnica. Así, el
gen o el vector que contiene el gen pueden ser administrados
mediante electroporación, transfección usando liposomas o proteínas
policatiónicas o usando vectores virales, incluyendo vectores
adenovirales y retrovirales y también vectores no virales.
Asimismo, las secuencias de nucleótidos que
codifican los factores neurotróficos o los factores angiogénicos se
encuentran asociadas a secuencias que regulan la expresión de
dichos factores. Estas secuencias pueden ser secuencias que regulan
la transcripción, como promotores, constitutivos o inducibles,
enhancers, terminadores transcripcionales y secuencias que regulan
la traducción, como secuencias no traducidas localizadas 5' o 3'
con respecto a la secuencia codificante.
Promotores adecuados para la expresión de los
factores neurotróficos o factores angiogénicos incluyen, sin estar
necesariamente limitados a, promotores constitutivos tales como los
derivados de los genomas de virus eucariotas tales como el virus del
polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de
la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneina, el
promotor del gen de la timidina kinasa del virus del herpes
simplex, regiones LTR de los retrovirus, el promotor del gen de la
inmunoglobuina, el promotor del gen de la actina, el promotor del
gen EF-1alfa así como promotores inducibles en los
que la expresión de la proteína depende de la adición de una
molécula o de una señal exógena exógena, tales como el sistema
tetraciclina, el sistema NFkappaB/luz UV, el sistema Cre/Lox y el
promotor de los genes de choque térmico.
Por otro lado, los factores neurotróficos o
factores angiogénicos expresados por las células que forman parte
de la micropartícula de la invención pueden ser expresados de forma
transitoria o de forma estable. En caso de que la micropartícula
permanezca un tiempo prolongado en el paciente, es preferible usar
células que expresen dichos factores de forma estable. La expresión
estable requiere la transformación del polinucleótido que codifica
los factores neurotróficos o factores angiogénicos se realice
conjuntamente con un polinucleótido que codifica una proteína que
permite seleccionar células transformadas. Sistemas de selección
adecuados son, sin limitación, la timidina quinasa del virus del
herpes, la fosforribosiltransferase hipoxantina guanina, adenina
fosforibosiltransferasa, genes que codifican para proteínas que
confieren resistencia a un antimetabolito como la dihidrofolato
reductase, la piruvato transaminasa, el gen de resistencia a la
neomicina y a la higromicina.
Tal como se ha indicado al comienzo de la
presente descripción, la invención se relaciona con una
micropartícula que comprende células modificadas genéticamente que
expresan al menos un factor neurotrófico, al menos un factor
angiogénico o una combinación de ambos, para el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, en donde la administración de la
micropartícula se realiza a nivel del córtex cerebral.
Como entiende el experto en la materia,
cualquier enfermedad neurodegenerativa que pueda ser tratada con
factores neurotróficos, factores angiogénicos o una combinación de
ambos, puede ser tratada igualmente con la micropartícula de la
invención.
En la presente invención, se entiende por
"enfermedad neurodegenerativa" a aquella enfermedad que se
distingue por ser el resultado de una muerte progresiva de neuronas
en el sistema nervioso, fundamentalmente en el cerebro, dando lugar
al empeoramiento de las actividades corporales, como el equilibrio,
el movimiento, el habla, la respiración, la función cardiaca, etc.
Ejemplos de enfermedades neurodegenerativas son, sin limitarse a,
la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, la
ataxia de Friedreich, la enfermedad de Huntington, demencia con
cuerpos de Lewy, la enfermedad de Parkinson, atrofia muscular
espinal, etc.
En una realización particular, la enfermedad
neurodegenerativa se selecciona entre la enfermedad de Alzheimer,
la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la
enfermedad de Huntington.
En el contexto de la presente invención, la
administración de la micropartícula se realiza a nivel del córtex
cerebral, permitiendo la difusión de los factores neurotróficos o
angiogénicos a otras áreas del cerebro. Por administración "a
nivel del córtex cerebral" se entiende, en el contexto de la
presente invención, un método en el que la administración se lleva
mediante perforación del cráneo y una o varias meninges pero sin
dañar el cortex cerebral.
En el contexto de la presente invención, el
método de administración preferido es mediante una craneotomía.
En la presente invención, se entiende por
"craneotomía" a la cirugía del cerebro que consiste en la
abertura del cráneo para exponer las meninges, permitiendo la
administración de las micropartículas de forma subdural o
subaracnoidea.
En una realización particular de la invención,
la administración de la micropartícula a nivel del córtex cerebral
se lleva a cabo de forma subdural o subaracnoidea. El procedimiento
para administrar las micropartículas está descrito en el Ejemplo 2
que acompaña a la presente descripción.
En la presente invención se entiende por
"córtex cerebral" o "corteza cerebral" al manto de tejido
nervioso que cubre la superficie de los hemisferios cerebrales.
En una realización particular, la administración
de la micropartícula a nivel del córtex cerebral se lleva a cabo
mediante craneotomía bilateral.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas
mediante la administración de micropartículas que comprenden
células modificadas genéticamente que expresan al menos un factor
neurotrófico, al menos un factor angiogénico o una combinación de
los anteriores, en donde la administración de las micropartículas
se realiza a nivel del córtex cerebral.
Los siguientes Ejemplos son ilustrativos de la
invención y no pretenden ser limitativos de la misma.
Las células BHK (fibroblastos procedentes de
riñón de hamster) modificadas genéticamente para producir VEGF se
hicieron crecer en medio DMEM con un 2% de
L-glutamina, 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de
antibiótico/antimicótico. Se realizaron pases de las células cada 2
o 3 días, manteniéndose en el incubador a 37ºC en una atmósfera de
CO_{2} al 5%. Todos los componentes de los medios de cultivo
utilizados fueron de la casa Gibco BRL (Invitrogen S.A.,
España).
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de encapsulación comprende
varias etapas. En primer lugar se suspenden las células,
modificadas genéticamente para que secreten el producto
terapéutico, en una solución de alginato. Posteriormente se hace
pasar la suspensión celular a través de la punta del goteador
electrostático mediante una bomba de flujo, cayendo las gotículas
formadas en la solución gelificante de cloruro cálcico. Además
mediante la aplicación de una diferencia de potencial electrostático
entre la punta del goteador y la solución de cloruro cálcico, se
consigue la formación y gelificación de pequeñas gotículas a partir
de la suspensión celular. Una vez formados los núcleos sólidos de
alginato se recubren, aplicándose un primer recubrimiento con una
solución de poli-L-lisina al 0,05%
durante 5 minutos y un segundo recubrimiento con una solución de
alginato al 0,1% durante 5 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El tamaño y las características superficiales de
las micropartículas se determinó utilizando un microscopio óptico
invertido (NikonTSM) equipado con una cámara (Sony
CCD-Iris). Las micropartículas obtenidas son de
forma esférica y superficie lisa y uniforme cuyo tamaño medio fue
de 392 \pm 12 \mum (Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Para caracterizar la viabilidad y funcionalidad
de los fibroblastos en el interior las micropartículas, se estudió
in vitro la actividad metabólica celular y la liberación de
VEGF durante un periodo de tres semanas. La viabilidad celular fue
determinada utilizando en ensayo del MTT. La determinación de la
producción de VEGF se realizó mediante una técnica de ELISA
(Amersham Biosciences, USA). Tras 21 días en cultivo, la secreción
de VEGF a partir de las micropartículas cargadas con 10^{6}
células por mililitro de alginato fue de aproximadamente 174 ng de
VEGF/24 horas. Estos resultados sugieren que las células se
adaptaron satisfactoriamente al nuevo microambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular BMVEC son células que derivan
de células endoteliales cerebrales. Son mantenidas en medio DMEM
(Sigma), FBS 10% (Gibco) y antibiótico antimicótico 1% (Gibco).
Las células endoteliales cerebrales BMVEC fueron
cultivadas en presencia de diferentes concentraciones de VEGF
preparado a partir del producto puro, solución stock (500 ng/mL) y
secretado a partir de las micropartículas, VEGF funcional (33
ng/mL). La proliferación celular fue determinada mediante el Kit
Proliferation XTT (Roche) a los 7 y 20 días (Figura 2). Este ensayo
permite determinar la funcionalidad del VEGF liberado a partir de
las micropartículas. La concentración de 33 ng/mL es similar a la
producida por unas 200 micropartículas y se comparó su efecto con
una concentración alta de VEGF como es 500 ng/mL. Los resultados
obtenidos ponen de manifiesto que a los 7 días tanto el tratamiento
con la solución stock como con el VEGF funcional estimulan la
proliferación celular y que esta es significativamente superior a la
producida por los controles. Sorprendentemente a los 20 días se
observa que concentraciones bajas de VEGF inducen una proliferación
celular superior que las concentraciones altas, lo cual pone de
manifiesto que la dosis de VEGF secretada por las micropartículas
podría ser suficiente para inducir la respuesta proliferativa
sin que existan riesgos de aparición de edema producido por una concentración excesivamente alta de VEGF.
sin que existan riesgos de aparición de edema producido por una concentración excesivamente alta de VEGF.
Los animales se dividieron en dos grupos de 6
ratones cada uno: control (recibió micropartículas vacías) y
tratado con VEGF (n=6) a los que se le implantaron, a nivel del
córtex cerebral, las micropartículas que contenían las células
productoras de VEGF. A los ratones anestesiados mediante
isofluorano inhalado se les realizó una craneotomía bilateral en
las coordenadas posterior 0,6 mm y lateral 1,1 mm al punto bregma
(Paxinos & Watson, 1986. "The rat brain in stereotaxic
coordinates", 2nd edition, New York: Academia. Una vez realizada
la craneotomía se les administraron en la superficie del cerebro
las micropartículas productoras de VEGF y a los ratones control se
les administraron micropartículas vacías. A cada ratón se le
administró entre 20-30 micropartículas por
orificio. Una vez terminada la intervención quirúrgica se cerraron
los orificios con membranas de nitrocelulosa impregnadas en una
solución de Yodo diluida (Betadine), lo cual impide la salida de
las cápsulas de los orificios y aísla el cerebro de una posible
infección.
Los animales fueron sacrificados a las 2
semanas, 1 mes y 3 meses y se realizaron estudios de
inmunohistoquímica. Se determinó la formación de vasos utilizando
lectina de tomate biotinilada y el factor VIII.
Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto
que la densidad de los vasos sanguíneos en los cerebros de los
animales tratados con las micropartículas que contenían las células
productoras de VEGF era claramente superior a la que presentaban
los animales del grupo control a las dos semanas, y que el efecto se
mantenía al mes y a los dos meses, lo cual indica una liberación
sostenida de la molécula a partir de las micropartículas (Figura
3).
Además se realizó una doble tinción con BrdUrd y
lectina con el objetivo de distinguir los nuevos vasos formados
tras la liberación de VEGF de los vasos
pre-existentes, observándose un incremento de
dichos vasos a medida que transcurre el tiempo desde la
administración (Figura 4).
Los ratones doble transgénicos: Amyloid
precursor protein/presenilin-1 (APP/Ps1) resultante
del cruce entre el ratón Tg2576 (sobreexpresa la proteína APP695
humana) y el ratón mutante (ratón M146L) para la
presenilina-1 (Ps1). Estos ratones son un modelo de
amiloidosis para la enfermedad de Alzheimer.
A los ratones anestesiados mediante isofluorano
inhalado se les realizó una craneotomía bilateral en las
coordenadas posterior 0,6 mm y lateral 1,1 mm al punto bregma
(Paxinos y Watson, 1982). Una vez realizada la craneotomía se les
administraron en la superficie del cerebro a nivel subdural, a un
grupo de ratones, micropartículas productoras de VEGF y a otro
grupo de ratones, micropartículas con fibroblastos no transfectados
(a este grupo de ratones se les denominó "sham"). Además se
incluyó un grupo de ratones littermate controles. A cada ratón (6
por grupo) se le administró entre 20-30
micropartículas por orificio. Una vez terminada la intervención
quirúrgica se cerraron los orificios con membranas de nitrocelulosa
impregnadas en una solución de Yodo diluida (Betadine), lo cual
impide la salida de las micropartículas de los orificios y aísla el
cerebro de una posible infección.
Los ratones fueron mantenidos durante 3 meses en
el animalario hasta que se les realizaron las pruebas de
comportamiento: T-Maze (laberinto en T) y el
reconocimiento de objetos. Al acabar las pruebas de comportamiento
los ratones fueron perfundidos transcardiacamente con solución
salina 0,9%. La mitad del cerebro se fijó con paraformaldehído 4%
en solución salina 0,1 M pH 7,4, y la otra mitad se congeló a -80ºC
para posteriores pruebas bioquímicas.
En el T-maze, que mide actividad
exploratoria, hay una recuperación en la latencia o tiempo de
decisión (Figura 5). La tasa de alternación espontánea también se
recupera: 63% en el grupo control, 50% en los ratones tratados con
las micropartículas con fibroblastos no transfectados
("sham"), y 61% en el grupo de ratones tratados con
micropartículas con fibroblastos productores de VEGF.
En el test de reconocimiento de objetos, que
mide memoria a corto plazo, también hay una recuperación
significativa (Figura 6).
Para la realización de este experimento se
utilizaron ratas Wistar de entre 24 y 30 meses llevándose a cabo un
estudio piloto con ratas control y ratas tratadas. Las células
modificadas genéticamente para producir BDNF se encapsularon
utilizando la misma metodología que en el Ejemplo 1. Las
micropartículas fueron implantadas en las ratas mediante
craneotomía bilateral. Las ratas control se trataron de la misma
manera pero se les administraron micropartículas vacías. Las ratas
permanecieron en el estabulario hasta su sacrificio, a los 2 meses,
para realizar los análisis oportunos.
Los resultados que se muestran en la Figura 7
ponen de manifiesto que el BDNF liberado de las micropartículas,
administradas en la superficie del cerebro, se transporta hasta la
sangre, siguiendo la ruta corteza, hipocampo,
plexo-coroideo, líquido cefalorraquídeo y
sangre.
El análisis inmunohistoquímico para detectar
caspasa 3, caspasa 9 y MAPK en distintos tejidos, muestra que las
ratas tratadas con las micropartículas productoras de BDNF
presentan, a nivel de cortex (Figura 8) y a nivel de cerebelo una
disminución en la actividad caspasa 3 y caspasa 9 lo cual indicaría
una menor muerte celular. Además puede observarse como se produce
un incremento de la actividad MAPK lo cual indica la activación de
la señalización por BDNF en esta región. En los plexos coroideos se
observa que no hay variaciones en los niveles de BDNF aunque si hay
un descenso de los niveles de caspasa 3 lo cual podría indicar un
menor deterioro de la barrera hematoencefálica.
<110> Universidad del País Vasco
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Fundación Investigación Biomédica
Hospital Universitario 12 Octubre
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Centro de Investigación Biomédica en
Red de Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Empleo de micropartículas que
comprenden células modificadas genéticamente en el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P3694ES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
decimocuarta repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región CS5 de
la fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento del fibrinógeno con
capacidad adhesiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de la fibronectina con
capacidad adhesiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento del VCAM-I
con capacidad adhesiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido cíclico derivado de la
región de la décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acetilación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acetilación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de la región de la
décima repetición tipo III de fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido utilizado como elemento
espaciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido empleado como elemento
espaciador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido empleado como elemento
espaciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido empleado como elemento
espaciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido empleado como elemento
espaciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido empleado como elemento
espaciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido empleado como elemento
espaciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm42
Claims (10)
1. Una micropartícula que comprende células
modificadas genéticamente que expresan al menos un factor
neurotrófico, al menos un factor angiogénico o una combinación de
ambos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en
donde la administración de la micropartícula se realiza a nivel del
córtex cerebral.
2. Micropartícula según la reivindicación 1, en
donde la micropartícula comprende un polímero unido a un ligando
específico para un receptor de superficie celular.
3. Micropartícula según la reivindicación 2, en
donde el ligando específico para un receptor de superficie celular
es un péptido que comprende la secuencia RGD.
4. Micropartícula según la reivindicación 2 ó 3,
en donde el polímero que forma parte de la micropartícula es
alginato.
5. Micropartícula según la reivindicación 4, en
donde la micropartícula comprende, además, una membrana de
poli-L-Lisina.
6. Micropartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el factor neurotrófico se
selecciona entre neurotrofinas (NT); factor neurotrófico derivado
del cerebro (BDNF); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor de
crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1); factor de
crecimiento insulínico tipo 2 (IGF-2); factor de
crecimiento nervioso (NGF); neurturina (NTN); persefinas;
arteminas, pleiotrofina (PTN), efrinas, netrinas, semaforinas,
slits, reelinas ó factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF),
factor neurotrófico conservado de dopamina (CDNF) (conserved
dopamine neurotrophic factor) y factor neurotrófico derivado de los
astrocitos mesencefálicos (MANF, mesencephalic
astrocyte-derived neurotrophic factor).
7. Micropartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde el factor angiogénico se
selecciona entre angiopoyetinas (Ang); factor básico de crecimiento
de fibroblastos (bFGF/FGF2); factor de crecimiento transformador
beta (TGF\beta, factor de crecimiento transformador alfa
(TGF\alpha), factor de crecimiento de placenta (PIGF); factor de
crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento del endotelio
vascular (VEGF); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF);
el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP); factor de crecimiento
de hepatocitos (HGF), cardiotrofinas, proteínas morfogenéticas del
hueso (BMP, bone morphogenetic protein) o sonic hedgehog (SHH).
8. Micropartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la enfermedad neurodegenerativa se
selecciona entre la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de
Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de
Huntington.
9. Micropartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde la administración de la
micropartícula a nivel del córtex cerebral se lleva a cabo de forma
subdural o subaracnoidea.
10. Micropartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en donde la administración de la
micropartícula a nivel del córtex cerebral se lleva a cabo mediante
craneotomía bilateral.
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| ES200802217A ES2332169B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Empleo de microparticulas que comprenden celulas modificadas geneticamente en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. |
| US13/055,554 US20110212060A1 (en) | 2008-07-24 | 2009-07-23 | Use of microparticles containing genetically modified cells in the treatment of neurodegenerative diseases |
| EP09800099A EP2322147A4 (en) | 2008-07-24 | 2009-07-23 | USE IN THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES OF MICROPARTICLES CONTAINING GENETICALLY MODIFIED CELLS |
| PCT/ES2009/070309 WO2010010223A1 (es) | 2008-07-24 | 2009-07-23 | Empleo de micropartículas que comprenden células modificadas genéticamente en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802217A ES2332169B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Empleo de microparticulas que comprenden celulas modificadas geneticamente en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2332169A1 true ES2332169A1 (es) | 2010-01-27 |
| ES2332169B1 ES2332169B1 (es) | 2010-10-25 |
Family
ID=41508649
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200802217A Expired - Fee Related ES2332169B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Empleo de microparticulas que comprenden celulas modificadas geneticamente en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. |
Country Status (4)
| Country | Link |
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