ES2330690T3 - Prueba para la deteccion de priones patologicos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección de proteínas priónicas patológicas in vitro en una muestra, en el que: a) se fijan sobre una fase sólida anticuerpos de captura, que reconocen tanto la forma patológica (PrP Sc ) como la no patológica (PrP C ) de la proteína priónica; b) se incuba la muestra con los anticuerpos fijados de la etapa a), uniéndose la forma patológica y la no patológica de la proteína priónica a los anticuerpos fijados formando complejos; c) se separa la muestra de los complejos generados; d) se incuban los complejos con plasmina, escindiéndose la forma no patológica de la proteína priónica; e) se separan de los complejos los fragmentos de escisión obtenidos mediante la incubación con plasmina; y f) se detecta la proteína priónica no escindida, contenida en los complejos con anticuerpos de detección, que presentan la capacidad de unirse de manera específica a PrP Sc .
Description
Prueba para la detección de priones
patológicos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de proteínas priónicas patológicas
in vitro en una muestra y a un kit de diagnóstico para la
realización de este procedimiento.
Las encefalopatías espongiformes de transmisión
(encefalopatías espongiformes transmisibles, EET) o enfermedades
priónicas son enfermedades cerebrales degenerativas, que van
acompañadas de alteraciones histológicas esponjosas características
del cerebro y siempre acaban siendo mortales. Según la teoría de
Prusiner (Science 1982, 216: 136-144) el agente de
estas enfermedades es una proteína infecciosa sin ácidos nucleicos
detectables, el prión ("agente infeccioso proteináceo",
"proteinaceous infectious agent"). A este respecto, se
trata de una forma de plegamiento erróneo (PrP^{Sc}, Sc:
"Scrapie") de una proteína que se produce de manera
natural, de la proteína priónica celular (PrP^{C}). La
proliferación del agente patógeno tiene lugar mediante la
transformación de la estructura normal de la proteína priónica en la
forma de plegamiento erróneo, cuya aparición está asociada con la
infección o con la enfermedad. Acorde con esta hipótesis cepas de
ratón, a las que les falta la proteína priónica, no pueden
infectarse experimentalmente. Por consiguiente, los agentes
patógenos de EET se denominan también con frecuencia priones y el
grupo en conjunto de estos cuadros clínicos se resume como
enfermedades priónicas. Las encefalopatías espongiformes aparecen en
muchos mamíferos incluido el ser humano. En el caso del ser humano
se trata de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
(ECJ), el síndrome de
Gerstmann-Sträussler-Scheinker
(GSS), el insomnio letal familiar (ILF), kuru y la variante de la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vECJ). La
tembladera (scrapie) se conoció por primera vez en las
ovejas. Desde 1984 está documentada la encefalopatía espongiforme
bovina (EEB) y desde 1996 la variante de la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob. Desde entonces, en Gran Bretaña
y otros países de la UE han enfermado y muerto más de 180.000 reses
de encefalopatía espongiforme bovina (EEB). En Alemania se ha
detectado EEB en más de 290 reses.
En 1993 enfermaron por primera vez 2 jóvenes
granjeros británicos de una forma poco común de la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (ECJ), que se describió en 1996
como la nueva variante de la ECJ (vECJ). Hasta la fecha más de 100
seres humanos han sido víctimas de esta enfermedad en Gran Bretaña.
Hoy en día puede asegurarse que se trata, a este respecto, de EEB
en seres humanos.
A la vista del transcurso mortal, la capacidad
de transmisión a los seres humanos, los largos tiempos de incubación
y la falta de tratamientos, el diagnóstico de las encefalopatías
espongiformes transmisibles es de vital importancia.
Hasta el momento, tres pruebas de diagnóstico
rápido de la EEB han obtenido la autorización de la UE
(EUROPEAN COMMISSION (1999) DIRECTORATE-GENERAL XXIV CONSUMER POLICY AND CONSUMER HEALTH PROTECTION Directorate B - Scientific Health Opinions The Evaluation of Tests for the Diagnosis of transmissible spongioform encephalopathy in bovines www.eu-komission.de):
(EUROPEAN COMMISSION (1999) DIRECTORATE-GENERAL XXIV CONSUMER POLICY AND CONSUMER HEALTH PROTECTION Directorate B - Scientific Health Opinions The Evaluation of Tests for the Diagnosis of transmissible spongioform encephalopathy in bovines www.eu-komission.de):
- \bullet
- Prionics Check, desarrollado originalmente por la empresa Prionics AG (Zúrich, Suiza), se comercializa a nivel mundial desde el 1 de febrero de 2001 por Roche Diagnostics. La prueba se basa en la inmunotransferencia de tipo Western, la duración de la prueba asciende a de siete a ocho horas.
- \bullet
- Prueba de EEB Platelia® se distribuye por la empresa Bio-Rad Laboratories (EE.UU.) y se desarrolló junto con la Commission de L'Energie Atomique (Francia). Se basa en un ELISA; la duración de la prueba asciende a de cuatro a siete horas.
- \bullet
- Enfer TSE de la empresa Enfer Technology (Irlanda) se basa en el principio de ELISA; la duración de la prueba asciende a cuatro horas.
Las tres pruebas usan anticuerpos específicos de
priones frente al fragmento PrP^{27-30}. Si se
tratan PrP^{C} y PrP^{Sc} con la enzima proteolítica proteinasa
K, se digiere completamente PrP^{C}, mientras que PrP^{Sc},
debido a su diferencia estructural, se digiere sólo parcialmente.
Queda el fragmento resistente a proteinasa K
PrP^{27-30}, que se detecta a continuación. La
digestión mediante proteinasa K requiere etapas de trabajo
adicionales en estas pruebas y un control exacto de la concentración
y del tiempo de acción de la enzima, de modo que tras un
tratamiento prolongado pueden digerirse también los priones
patológicos casi completamente. Dado que la digestión tiene lugar
primero en la muestra y después se detectan de manera específica los
priones, este método pierde sensibilidad. Una característica común
adicional: las pruebas pueden realizarse sólo post mortem y
necesitan menos de un gramo de tejido del tronco encefálico, en el
que se acumulan especialmente muchas moléculas de PrP^{Sc}. Una
desventaja de las tres pruebas es la sensibilidad insuficiente. La
enfermedad debe encontrarse en un estadio avanzado con la
correspondiente gran acumulación de priones de EEB, para obtener
resultados claros. Por ello, los institutos y autoridades oficiales,
en casos sospechosos o para asegurar un diagnóstico, emplean otros
métodos tales como histopatología e inmunohistoquímica. Se
investigan nuevas técnicas tales como inmuno-PCR,
adsorción de ligandos específicos y espectroscopía de correlación de
fluorescencia (FCS), para mejorar la sensibilidad de las
pruebas.
Un método adicional, el ensayo dependiente de la
conformación (conformation dependent
immunoassay-CDI; Safar J. et al., Nature
Medicine 1998, 4: 10, 1157-1165), se basa en la
conformación específica de la molécula de PrP^{Sc}, y
concretamente en los sitios de unión parcialmente cubiertos para el
anticuerpo monoclonal 3F4. Para la detección de la forma patológica
se usa la relación de la señal entre la muestra nativa y la
desnaturalizada (molécula de PrP desplegada). Este método requiere
también un tratamiento previo adicional de la muestra y requiere
relativamente mucho tiempo.
Otra serie de métodos de detección usa técnicas
para enriquecer la muestra con priones patológicos. Un método de
esta serie es el método PMCA (amplificación cíclica de proteínas mal
plegadas, (protein misfolding cyclic amplification)) de Soto
(empresa Serono; Castilla J. et al. Nature Medicine Online
Publication 28.08.2005). Para ello se incuba PrP^{Sc} en exceso
de PrP^{C}, para aumentar los agregados de PrP^{Sc}, que se
destruyen con el tratamiento con ultrasonidos posterior, de modo
que se forman nuevos agregados más pequeños. Estos últimos sirven
como "matriz" para la formación de nuevos agregados de
PrP^{Sc}.
Estos ciclos se repiten varias veces (hasta 150
veces). En el caso del método PMCA transcurren al menos 75 horas
hasta que se consigue la sensibilidad notificada. Además se añade
como "matriz" tejido cerebral de hámster y no está claro en
qué estadio de la infección se encontraban los animales
examinados.
La serinproteasa plasmina (sitio de escisión
preferido Lys-Xaa>Arg-Xaa) es una
enzima sintetizada a partir de plasminógeno, un precursor de
zimógeno ubicuo, que desempeña un papel importante en la conversión
de la fibrina en productos solubles (fibrinólisis) y en la
degradación proteolítica de la matriz extracelular (proteólisis
inducida por plasmina). Últimamente se notificó que la plasmina
puede escindir PrP^{C} in vitro, y que PrP^{C} y la
región NH_{2} de la molécula de PrP pueden estimular la formación
de plasmina mediada por el t-PA (activador del
plasminógeno de tipo tisular (tissue-type
plasminogen activator)). Además se encontró que el sitio de
escisión primario de la plasmina en la molécula de PrP se encuentra
en la región de los restos de aminoácido 108-112.
No obstante, sobre la actividad de plasmina frente a la forma
patológica (PrP^{Sc}) de la proteína priónica no existen todavía
más conocimientos.
Por consiguiente, hasta el momento no hay ningún
procedimiento de prueba que pueda utilizarse de manera rutinaria,
con el que pueda proporcionarse un diagnóstico temprano inequívoco
en animales vivos o en seres humanos durante el tiempo de
incubación, es decir, antes de la aparición de síntomas que puedan
comprobarse clínicamente.
Por tanto, existe la necesidad de una prueba de
diagnóstico rápido para la detección de priones patológicos, que
venza las desventajas mencionadas anteriormente del estado de la
técnica.
Por tanto, la presente invención se basaba en el
objetivo de proporcionar una prueba para la detección de priones
patológicos, que presente una alta sensibilidad, que pueda
realizarse dado el caso de manera automatizada con un gasto de
tiempo reducido y costes reducidos en comparación, que pueda
detectar priones patológicos en un estadio temprano de enfermedad,
y en la que se pueda prescindir de un tratamiento con proteinasa
K.
Estos y otros objetivos sin más evidentes para
el experto se solucionan mediante la invención descrita a
continuación.
Se encontró sorprendentemente que la forma
patológica de la proteína priónica puede detectarse con alta
selectividad y un gasto relativamente reducido in vitro en
una muestra, cuando:
- a)
- se fijan sobre una fase sólida anticuerpos de captura, que reconocen tanto la forma patológica (PrP^{Sc}) como la no patológica (PrP^{C}) de la proteína priónica;
- b)
- se incuba la muestra con los anticuerpos fijados de la etapa a), uniéndose la forma patológica y la no patológica de la proteína priónica a los anticuerpos fijados formando complejos;
- c)
- se separa la muestra de los complejos generados;
- d)
- se incuban los complejos con plasmina, escindiéndose la forma no patológica de la proteína priónica;
- e)
- se separan de los complejos los fragmentos de escisión obtenidos mediante la incubación con plasmina; y
- f)
- se detecta la proteína priónica no escindida, contenida en los complejos con anticuerpos de detección.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el tratamiento con plasmina se escinde
sorprendentemente la forma no patológica de la proteína priónica,
mientras que la forma patológica de la proteína priónica permanece
sin digerir. La forma patológica tiene la misma secuencia de
aminoácidos que la forma fisiológica de la proteína priónica, pero
una estructura espacial distinta de la misma. Se encontró que el
sitio de escisión primario para plasmina en todas las especies
examinadas se encuentra en la región de los restos de aminoácido
106 a 126 de la proteína priónica. El sitio de escisión primario de
la forma patológica se encuentra parcialmente cubierto, camuflado
("núcleo enterrado", "buried core") y por
consiguiente es difícilmente accesible para la actividad enzimática
de la plasmina. La buena capacidad de escisión de la forma
fisiológica en comparación con la mala capacidad de escisión de la
forma patológica es el principio del método desarrollado en el
presente documento para diferenciar entre ambas formas
priónicas.
Según la invención, con este procedimiento se
detectan proteínas priónicas patológicas.
En el presente documento significan:
- PrP:
- la proteína priónica en general, por ejemplo cuando se remite a características estructurales de la proteína priónica;
- PrP^{C}:
- la forma celular de la proteína priónica, es decir su forma no patológica, que se encuentra en células sanas; y
- PrP^{Sc}:
- la forma patológica de la proteína priónica.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra tomada para el procedimiento puede
proceder a este respecto en principio de cualquier sujeto humano o
animal que esté bajo sospecha de presentar la forma patológica de la
proteína priónica. La muestra puede ser por ejemplo de origen
humano, o proceder de ganado vacuno o de un hámster. La muestra
puede tomarse de un sujeto vivo o muerto. En principio puede servir
como material de partida para la muestra cualquier material líquido
o sólido procedente del cuerpo del sujeto, que pudiera contener la
forma patológica de la proteína priónica. Materiales de partida a
modo de ejemplo para las muestras pueden ser muestras de sangre,
muestras de tejido o fluidos corporales tales como orina, leche,
líquido cefalorraquídeo o saliva. Sobre todo, en el caso de
muestras sólidas puede ser necesario descomponer en primer lugar el
material de partida, de modo que la forma patológica de la proteína
priónica para el procedimiento según la invención se encuentre en la
forma adecuada. El experto conoce bien desde hace tiempo estos
procedimientos de descomposición.
En el caso del procedimiento según la invención,
en primer lugar se fija sobre una fase sólida un anticuerpo de
captura.
El anticuerpo de captura presenta la propiedad
de reconocer y unirse a tanto la forma patológica (PrP^{Sc}) como
la no patológica de la proteína priónica (PrP^{C}). Los
anticuerpos de captura pueden ser por ejemplo monoclonales o
policlonales. Anticuerpos de captura adecuados pueden producirse
según los propios métodos convencionales u obtenerse
comercialmente. Anticuerpos de captura a modo de ejemplo son los
anticuerpos anti-PrP SAF32 y SAF61 (empresa
Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia).
Como fase sólida pueden servir en principio
todos los materiales sólidos que posibiliten la fijación del
anticuerpo de captura, y que no obstaculicen la detección de la
forma patológica de la proteína priónica. Preferiblemente, como
fases sólidas se usan placas de microtitulación o perlas magnéticas
o no magnéticas. Se prefiere especialmente el uso de una placa de
microtitulación como fase sólida.
La fijación del anticuerpo de captura a la fase
sólida puede tener lugar de cualquier manera conocida por el
experto. A este respecto, el anticuerpo de captura puede unirse
directamente a la fase sólida. Por ejemplo, el anticuerpo de
captura puede acoplarse covalentemente a la fase sólida. Por otro
lado, el anticuerpo de captura puede adsorberse también a la
superficie de la fase sólida. Para ello se pipetea por ejemplo sobre
el fondo de una cavidad de una placa de microtitulación y se incuba
durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo al menos 16
horas) a una temperatura adecuada (por ejemplo 4ºC). También es
posible, acoplar el anticuerpo de captura con la fase sólida a
través del sistema de biotina/avidina o estreptavidina conocido por
el experto. Alternativamente, la fijación del anticuerpo de captura
puede tener lugar también a través de un anticuerpo de puente, que
media la unión del anticuerpo de captura a la fase sólida. No
obstante, se prefiere que el anticuerpo de captura se fije
directamente a la fase sólida.
Tras la fijación pueden saturarse sitios de
unión libres de la fase sólida con un tampón de bloqueo adecuado,
cuyos componentes individuales conoce el experto. Un tampón de
bloqueo adecuado puede consistir por ejemplo en un sistema tampón
adecuado y un reactivo de bloqueo, tal como por ejemplo albúmina de
suero bovino (BSA).
Tras la fijación de los anticuerpos de captura a
la fase sólida tiene lugar la incubación con la muestra. A este
respecto se produce la unión de la forma patológica (PrP^{Sc}) y
de la no patológica (PrP^{C}) de la proteína priónica a los
anticuerpos de captura fijados. La incubación tiene lugar durante un
periodo de tiempo que es suficiente para que ambas formas de la
proteína priónica se unan de la manera más cuantitativa posible por
los anticuerpos de captura. Preferiblemente, el tiempo de incubación
no asciende a más de 2 horas.
Tras la incubación se separa la muestra restante
de los complejos generados a partir de fase sólida, anticuerpos de
capturan y proteínas priónicas. Si se usa una placa de
microtitulación como fase sólida, entonces, la retirada de la
muestra puede tener lugar, por ejemplo, mediante succión. Si se usan
perlas como fase sólida, entonces pueden sedimentarse los complejos
que contienen las perlas mediante centrifugación o, en el caso de
perlas magnéticas, bajo la influencia de una fuerza magnética, y
reducirse la muestra que se encuentra en exceso.
Después se mezclan los complejos de fase sólida,
anticuerpos de captura y ambas formas de la proteína priónica con
plasmina. Esta etapa se basa en el principio decisivo y sorprendente
de que la plasmina escinde de manera específica la forma no
patológica contenida en los complejos de la proteína priónica
(PrP^{C}), no sin embargo la forma patológica contenida
igualmente en los complejos de la proteína priónica (PrP^{Sc}).
Tras la escisión de la forma no patológica de la proteína priónica,
los complejos contienen la fase sólida, los anticuerpos de captura
y la forma patológica intacta, sin digerir de la proteína priónica
(PrP^{Sc}) o el fragmento de escisión unido por los anticuerpos
de captura de la forma no patológica de la proteína priónica.
Aquellos fragmentos de escisión de la forma no patológica de la
proteína priónica, que no se unen por los anticuerpos de captura,
se eliminan en esta etapa por los complejos.
La plasmina usada para la escisión de PrP^{C}
no está limitada adicionalmente, con la excepción de que debe poder
escindir de manera específica la forma no patológica, pero no la
forma patológica de la proteína priónica. Por tanto, puede ser por
ejemplo plasmina recombinante o nativa. Puede producirse de manera
conocida por el experto, por ejemplo mediante activación de
plasminógeno en un activador (por ejemplo urocinasa o
estreptocinasa), que por ejemplo puede estar unido a la matriz.
Puede ser plasmina humana o plasmina de otras especies. Para el
experto está claro que es posible introducir también mutaciones o
deleciones en la secuencia de aminoácidos de la plasmina, sin que
se perjudique con ello la actividad según la invención de la
plasmina. La presente invención también comprende plasmina
modificada de este tipo.
Para la escisión de la forma no patológica de la
proteína priónica, la plasmina se encuentra preferiblemente en una
disolución que contiene un tampón fisiológico, tal como por ejemplo
PBS. La concentración de plasmina se selecciona de modo que sea
suficiente para la escisión de la forma no patológica de la proteína
priónica contenida en los complejos durante el intervalo de tiempo
previsto para la escisión. La concentración de plasmina asciende
preferiblemente a de 10 nM a 2 \muM, aún más preferiblemente de 25
nM a 1 \muM, y todavía más preferiblemente de 40 nM a 60 nM. El
tiempo de incubación de los complejos con plasmina no está
especialmente limitado. No obstante, este tiempo de incubación
asciende preferiblemente a no más de 30 minutos.
En una forma de realización preferida, la
escisión de la forma no patológica de la proteína priónica se
detiene mediante la adición de un reactivo adecuado que inhibe la
actividad de la plasmina. Para ello se usa preferiblemente
aprotinina. El reactivo que inhibe la actividad de plasmina se añade
en forma sólida o preferiblemente líquida y en una concentración
suficiente para la inhibición de la actividad de la plasmina. En el
caso de aprotinina, la concentración preferida asciende a de 4 a 6
\muM.
A continuación se separan los fragmentos de
escisión obtenidos mediante la incubación con plasmina de la forma
no patológica de la proteína priónica, que no se unen por el
anticuerpo de captura, de los complejos de la fase sólida,
anticuerpos de captura y la forma patológica de la proteína priónica
(PrP^{Sc}) o del fragmento de escisión generado mediante la
escisión con plasmina y unido por los anticuerpos de captura de la
forma no patológica de la proteína priónica (PrP^{C}). El tipo y
la manera de separación se adaptan a este respecto al sistema de
detección usado, sobre todo a la fase sólida usada. En muchos casos
es preferible retirar los fragmentos de escisión de PrP^{C} no
unidos sencillamente mediante succión.
Tras la separación de los fragmentos de escisión
de PrP^{C} no unidos de los complejos, se detecta con anticuerpos
de detección la proteína priónica no escindida contenida en los
complejos. En el caso de la proteína priónica no escindida se trata
esencialmente de manera exclusiva de la forma patológica de la
proteína priónica (PrP^{Sc}). Los anticuerpos de detección que
han de utilizarse para su detección presentan la capacidad de unirse
de manera específica a PrP^{Sc}. Dado que la forma no patológica
de la proteína priónica se retiró esencialmente por completo de los
complejos, como anticuerpo de detección puede usarse también un
anticuerpo que reconozca tanto PrP^{Sc} como PrP^{C}.
La detección del anticuerpo de detección tiene
lugar de cualquier manera conocida por el experto. Para ello se
conoce a partir del estado de la técnica un gran número de
procedimientos de detección adecuados. Como una selección no
exhaustiva de estas técnicas se mencionan ELISA (ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas,
(enzyme-linked immunosorbent assay)), EIA
(inmunoensayo ligado a enzimas, (enzyme-linked
immunoassay)), tecnología de nanoperlas (por ejemplo nanoperlas
marcadas con europio), métodos de fluorescencia (por ejemplo,
fluorescencia de resolución temporal) y métodos de
luminiscencia.
La detección tiene lugar preferiblemente a
través de las técnicas de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas) conocidas por el experto. Por ejemplo, el anticuerpo de
detección puede estar conjugado con biotina y su detección puede
tener lugar a través de un conjugado de
estreptavidina-poliperoxidasa, que se mezcla
inmediatamente antes de la medición con activadores tales como por
ejemplo luminol o TMB
(3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). La detección tiene
lugar preferiblemente a través del sistema de biotina/estreptavidina
o avidina cuando todavía no se ha fijado el anticuerpo de captura
con este sistema a la fase sólida. Ejemplos de anticuerpos de
detección según la invención son los anticuerpos
anti-PrP biotinilados SAF32 y SAF61 (empresa,
Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia).
Por tanto, está claro para el experto que los
anticuerpos de detección pueden estar conjugados con una molécula
de detección, un grupo adecuado para la detección o también con
estructuras sólidas (por ejemplo microperlas o nanoperlas, tales
como por ejemplo nanoperlas con europio), para posibilitar la
detección con uno de los procedimientos de detección mencionados
anteriormente u otros conocidos a partir del estado de la técnica.
Por tanto, puede ser preferible, por ejemplo, utilizar anticuerpos
de detección que estén conjugados con biotina o marcadores de
fluorescencia (tales como por ejemplo isotiocianato de fluoresceína
o rodamina). Los anticuerpos de detección pueden ser por ejemplo
policlonales o preferiblemente monoclonales. Anticuerpos de
detección adecuados pueden producirse según los propios métodos
convencionales u obtenerse comercialmente.
En una forma de realización preferida, el
anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección se seleccionan
de modo que el anticuerpo de captura está dirigido frente a un
epítopo de la proteína priónica, que se encuentra de manera
aminoterminal con respecto al sitio de escisión primario de la
plasmina, cuando el anticuerpo de detección reconoce un epítopo de
la proteína priónica, que está dispuesto de manera carboxiloterminal
con respecto al sitio de escisión primario de la plasmina. De
manera correspondiente, también es preferible que el anticuerpo de
captura esté dirigido frente a un epítopo de la proteína priónica,
que se encuentra de manera carboxiloterminal con respecto al sitio
de escisión primario de la plasmina, cuando el anticuerpo de
detección reconoce un epítopo de la proteína priónica, que está
dispuesto de manera aminoterminal con respecto al sitio de escisión
primario de la plasmina.
Por consiguiente, en una forma de realización
preferida el anticuerpo de detección y el anticuerpo de captura se
seleccionan de modo que el anticuerpo de captura está dirigido
frente a un epítopo de la proteína priónica, que se encuentra en la
región de los restos de aminoácido 1-110, cuando el
anticuerpo de detección está dirigido frente a un epítopo, que se
encuentra fuera de esta región, o el anticuerpo de detección está
dirigido frente a un epítopo, que se encuentra en la región de los
restos de aminoácido 1-110, cuando el anticuerpo de
captura está dirigido frente a un epítopo, que se encuentra fuera
de esta región.
En una forma de realización preferida adicional,
la detección de la proteína priónica no escindida contenida en los
complejos tiene lugar de manera cuantitativa. Esto es posible por
ejemplo cuando para la detección de la proteína priónica se utiliza
un ensayo ELISA, en el que la intensidad de señal medida es
proporcional a la cantidad de la proteína priónica detectada en la
muestra. Si se emplea el procedimiento según la invención por
ejemplo en duplicados de muestras, y se incuba una muestra con una
cantidad de plasmina suficiente para la escisión completa de la
forma no patológica de la proteína priónica durante un tiempo
suficiente para ello (por ejemplo durante 30 minutos con plasmina
50 nM) y se deja la otra muestra sin tratar, entonces se puede
comprobar mediante la relación de la intensidad de señal de la
muestra tratada con respecto a la intensidad de señal de la muestra
no tratada, en qué medida tiene lugar la escisión de la población
total de la proteína priónica.
Para el procedimiento según la invención puede
ser ventajoso además, cuando entre una o varias etapas individuales
del procedimiento se realizan una o varias etapas de lavado, para
las que se utilizan tampones de lavado adecuados, conocidos para el
experto. Para ello se utilizan preferiblemente disoluciones tampón
fisiológicas, tales como PBS o TBS, que pueden estar complementadas
con detergentes tales como Tween 20.
Según la invención, para la realización del
procedimiento según la invención para la detección de proteínas
priónicas patológicas pueden utilizarse también kits.
Los kits según la invención contienen
anticuerpos de captura, que están dirigidos frente a tanto la forma
patológica (PrP^{Sc}) como la no patológica (PrP^{C}) de la
proteína priónica, plasmina y anticuerpos de detección.
Las características esenciales de la invención
de estos componentes del kit se describieron ya detalladamente.
Así, puede ser ventajoso por ejemplo, cuando los
anticuerpos de captura se encuentran ya fijados sobre una fase
sólida. Como fase sólida sirven en este caso preferiblemente placas
de microtitulación o perlas magnéticas o no magnéticas.
En una forma de realización, los anticuerpos de
detección contenidos en el kit reconocen tanto la forma patológica
como la no patológica de la proteína priónica.
En una forma de realización preferida, el
anticuerpo de captura contenido en el kit está dirigido frente a un
epítopo de la proteína priónica, que se encuentra de manera
aminoterminal con respecto al sitio de escisión primario de la
plasmina, cuando el anticuerpo de detección reconoce un epítopo de
la proteína priónica, que está dispuesto de manera
carboxiloterminal con respecto al sitio de escisión primario de la
plasmina. Alternativamente puede ser preferible también que el
anticuerpo de captura esté dirigido frente a un epítopo de la
proteína priónica, que se encuentra de manera carboxiloterminal con
respecto al sitio de escisión primario de la plasmina, cuando el
anticuerpo de detección reconoce un epítopo de la proteína priónica,
que está dispuesto de manera aminoterminal con respecto al sitio de
escisión primario de la plasmina.
En una forma de realización preferida adicional,
el anticuerpo de captura contenido en el kit está dirigido frente a
un epítopo de la proteína priónica, que se encuentra en la región de
los restos de aminoácido 1-110, cuando el
anticuerpo de detección está dirigido frente a un epítopo, que se
encuentra fuera de esta región. Por otro lado, el anticuerpo de
detección contenido en el kit puede estar dirigido también frente a
un epítopo, que se encuentra en la región de los restos de
aminoácido 1-110, cuando el anticuerpo de captura
está dirigido frente a un epítopo, que se encuentra fuera de esta
región.
En una forma de realización preferida aún
adicional, el kit contiene además un tampón de bloqueo para la
saturación de sitios de unión libres de la fase sólida, un tampón
de lavado y/o aprotinina.
En una forma de realización aún adicional, la
plasmina se encuentra en el kit o bien disuelta en una disolución
tampón o bien liofilizada como sólido.
En caso de que esté contenida aprotinina en el
kit, ésta puede encontrarse igualmente disuelta en una disolución
tampón o liofilizada como sólido. Igualmente, en el kit pueden estar
contenidos posibles aditivos para las disoluciones contenidas en el
kit (por ejemplo detergentes, reactivos de bloqueo).
El procedimiento según la invención permite
detectar proteínas priónicas patológicas en un estadio temprano de
enfermedad con un gasto de tiempo y coste reducido con una alta
especificidad y sensibilidad dado el caso en el contexto de una
prueba automatizada. A este respecto, se logra la detección de
PrP^{Sc} en distintas especies, tales como el ser humano, hámster
o ganado vacuno con una sensibilidad extraordinariamente alta.
Mediante la determinación de la dosis DI_{50}
(la dosis infecciosa, que provoca una enfermedad en al menos el 50%
de los animales expuestos; Prusiner S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1998, 10, 95, 13363-13383) puede calcularse la
sensibilidad de pruebas para la detección de priones patológicos
(cuanto más bajo es el valor de DI_{50}/ml, más alta es la
sensibilidad de la prueba). Con el procedimiento según la invención
pueden conseguirse valores inferiores a 1.000 DI_{50}/ml. Para
fines de comparación se indican los valores de DI_{50}/ml de las
pruebas que pueden adquirirse comercialmente Prionics Check
(DI_{50}/ml: 1.000.000-100.000; homogeneizado de
EEB como muestra; límite de detección, dilución de
10^{0}-10^{-1}), prueba de EEB Platelia®
(DI_{50}/ml: 3.000; homogeneizado de EEB como muestra; límite de
detección, dilución de 10^{-2,5}) y Enfer TSA (DI_{50}/ml:
30.000; homogeneizado de EEB como muestra; límite de detección,
dilución de 10^{-1,5}.
El procedimiento según la invención se basa en
la buena capacidad de escisión de la forma de PrP fisiológica
mediante plasmina en comparación con la mala capacidad de escisión
de la forma patológica. El plegamiento específico de la molécula de
PrP^{Sc}, que cubre el sitio de escisión primario para la
plasmina, y la mayor selectividad enzimática de la plasmina
permiten una diferenciación entre ambas formas tras la
inmovilización de los priones. El uso de plasmina tiene la ventaja
con respecto a la proteinasa K, de que sólo se escinde PrP^{C} y
no se digiere completamente, permaneciendo intactos los anticuerpos
usados.
El procedimiento dura en total aproximadamente
3,5 horas y no requiere ningún tratamiento previo especial de la
muestra, tal como por ejemplo la prueba de EEB Platelia®. A
diferencia de la prueba Enfer, en la que la adsorción de los
priones tiene lugar de manera no específica sobre la superficie de
la placa de microtitulación, la unión de los priones es específica
desde el principio. El gasto de tiempo en el caso del procedimiento
según la invención es claramente más reducido que en el caso de
Prionics-Check, en el que la detección tiene lugar
según una inmunotransferencia de tipo Western.
El procedimiento según la invención reduce la
dependencia de un tipo de anticuerpo específico y, por consiguiente,
es extraordinariamente flexible: dado que PrP^{C} se escinde en
principio en dos fragmentos mediante plasmina, pueden usarse
distintos anticuerpos, de modo que puede detectarse o bien la región
aminoterminal o bien la región carboxiloterminal de la molécula de
PrP.
Además, el procedimiento según la invención, al
contrario que todos los demás procedimientos conocidos hasta ahora,
permite la medición de la velocidad inicial de la escisión de
PrP^{C}. El procedimiento según la invención puede realizarse
fácilmente de manera automatizada, lo que favorece la utilización en
la práctica. Además, el procedimiento podría utilizarse también
para aumentar la sensibilidad de otros métodos inmunológicos para
la detección de priones (digestión "suave", con ello una mejor
relación señal-ruido).
La presente invención se ilustra a continuación
mediante ejemplos, no debiendo entenderse éstos, sin embargo, como
limitativos.
La figura 1 muestra los epítopos de los
anticuerpos anti-PrP utilizados para los ensayos a
modo de ejemplo.
La figura 2 muestra la escisión in vitro
de proteínas priónicas no inmovilizadas mediante plasmina humana
dependiendo de diferentes concentraciones de plasmina. En la
leyenda, significan, rhuPrP: PrP humana recombinante, huPrP^{C}:
PrP^{C} humana (suero), hamPrP^{c}: PrP^{C} de hámster
(homogeneizado de cerebro). Se representan los valores medios y las
desviaciones estándar de tres ensayos independientes. Se muestra la
relación porcentual de la intensidad de una muestra tras el tiempo
de incubación indicado con plasmina con respecto a la intensidad de
la muestra sin incubación con plasmina. Todos los valores indicados
llevan corrección del fondo.
La figura 3 muestra la escisión de PrP^{C}
nativa de ser humano mediante plasmina humana tras la inmovilización
sobre la placa de microtitulación. Como anticuerpo de captura se
utilizó SAF32 (reconoce el epítopo entre los restos de aminoácido
58 y 89 de la molécula de PrP) y como anticuerpo de detección 3F4
biotinilado (reconoce el epítopo entre los restos de aminoácido 108
y 111 de la molécula de PrP). Se trataron diferentes diluciones de
muestra directamente sobre la placa con plasmina con distinta
duración de incubación a 37ºC. Se muestra la relación porcentual de
la intensidad de una muestra tras el tiempo de incubación indicado
con plasmina con respecto a la intensidad de la muestra sin
incubación con plasmina. Todos los valores indicados llevan
corrección del fondo.
La figura 4 muestra la escisión de PrP^{C}
nativa de hámster mediante plasmina humana tras la inmovilización
sobre la placa de microtitulación. Como anticuerpo de captura se
utilizó SAF32 (reconoce el epítopo entre los restos de aminoácido
58 y 89 de la molécula de PrP) y como anticuerpo de detección 3F4
biotinilado (reconoce el epítopo entre los restos de aminoácido 108
y 111 de la molécula de PrP). Se trataron diferentes diluciones de
muestra directamente sobre la placa con plasmina con distinta
duración de incubación y a 37ºC. Se muestra la relación porcentual
de la intensidad de una muestra tras el tiempo de incubación
indicado con plasmina con respecto a la intensidad de la muestra
sin incubación con plasmina.
La figura 5 muestra la escisión de PrP^{C}
nativa (de homogeneizado de cerebro de hámster) mediante plasmina
humana tras la inmovilización sobre una placa de microtitulación.
Como anticuerpo de captura se utilizó PRI3O8 (reconoce el epítopo
entre los restos de aminoácido 106-126 de la
molécula de PrP) y como anticuerpo de detección SAF32 biotinilado
(reconoce el epítopo entre los restos de aminoácido
58-89 de la molécula de PrP). El
PRI3O8-epítopo incluye el sitio de escisión de la
plasmina, suprimiéndose la escisión de PrP^{C}.
La figura 6 muestra la escisión de PrP
recombinante de ser humano con restos lisina intercambiados en la
agrupación de lisina 2 (dLC2) mediante plasmina humana tras la
inmovilización sobre una placa de microtitulación. La agrupación de
lisina 2 comprende los restos de aminoácido 101 a 110 de la PrP. Los
restos lisina contenidos en los mismos en la posición 101, 104, 106
y 110 estaban intercambiados por alanina. Se examinaron distintas
concentraciones de muestra. Como anticuerpo de captura se utilizó
SAF61 (reconoce el epítopo entre los restos de aminoácido
142-160 de la molécula de PrP) y como anticuerpo de
detección SAF32 biotinilado (reconoce el epítopo entre los restos
de aminoácido 58-89 de la molécula de PrP). Se
muestra la relación porcentual de la intensidad de una muestra tras
el tiempo de incubación indicado con plasmina con respecto a la
intensidad de la muestra sin incubación con plasmina. Todos los
valores indicados llevan corrección del fondo.
La figura 7 muestra la escisión de PrP
recombinante de ser humano con restos lisina intercambiados en la
agrupación de lisina 2 (dLC2) mediante plasmina humana tras la
inmovilización sobre una placa de microtitulación en exceso de bPrP
(PrP bovina de homogeneizado de cerebro de vacuno). Como anticuerpo
de captura se utilizó SAF61 (reconoce el epítopo entre los restos
de aminoácido 142-160 de la molécula de PrP) y como
anticuerpo de detección SAF32 biotinilado (reconoce el epítopo
entre los restos de aminoácido 58-89 de la molécula
de PrP). Se muestra la relación porcentual de la intensidad de una
muestra tras el tiempo de incubación indicado con plasmina con
respecto a la intensidad de la muestra sin incubación con plasmina.
Todos los valores indicados llevan corrección del fondo.
La figura 8 muestra la escisión de PrP^{Sc} de
homogeneizado de cerebro de hámster mediante plasmina humana tras
la inmovilización sobre una placa de microtitulación. Como
anticuerpo de captura se utilizó SAF61 (reconoce el epítopo entre
los restos de aminoácido 142-160 de la molécula de
PrP) y como anticuerpo de detección SAF32-biotina
(reconoce el epítopo entre restos de aminoácido
58-89 de la molécula de PrP). Se representan
diferentes diluciones de homogeneizados de cerebro de animales
infectados con scrapie. Se muestra la relación porcentual de
la intensidad de una muestra tras el tiempo de incubación indicado
con plasmina con respecto a la intensidad de la muestra sin
incubación con plasmina. Todos los valores indicados llevan
corrección del fondo. Se representan los valores medios y las
desviaciones estándar de tres ensayos independientes.
Figura 9: escisión de PrP^{Sc} (de
homogeneizado de cerebro de hámster) en exceso de PrP^{C} nativa
mediante plasmina humana tras la inmovilización sobre una placa de
microtitulación. Como anticuerpo de captura se utilizó SAF61
(reconoce el epítopo entre los restos de aminoácido
142-160 de la molécula de PrP) y como anticuerpo de
detección SAF32 biotinilado (reconoce el epítopo entre los restos de
aminoácido 58-89 de la molécula de PrP).
Significan, PrP^{C} la forma celular normal de PrP y PrP^{Sc} la
forma patológica de PrP. El homogeneizado de cerebro de hámster con
scrapie se diluyó en homogeneizado de cerebro de hámsteres
sanos. Se representan los valores medios y las desviaciones
estándar de tres ensayos independientes. Se muestra la relación
porcentual de la intensidad de una muestra tras el tiempo de
incubación indicado con plasmina con respecto a la intensidad de la
muestra sin incubación con plasmina. Todos los valores indicados
llevan corrección del fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
En una serie de ensayos se escindió tanto la PrP
humana recombinante (rhuPrP), como la PrP^{C} nativa (suero
humano, homogeneizado de cerebro de hámster) in vitro con
plasmina, teniendo lugar no obstante la digestión con plasmina en
un tubo de muestra, y no estando inmovilizadas las proteínas
priónicas en el momento de la digestión.
Se incubaron PrP humana recombinante (rhuPrP),
PrP^{C} humana (suero; huPrP^{C}) y PrP^{C} de hámster
(homogeneizado de cerebro; hamPrP^{C}) en concentraciones de
partida de desde 553 hasta 575 pg/ml (calibración frente a PrP
humana recombinante; empresa Roboscreen) durante 30 minutos a 37ºC
con distintas concentraciones de plasmina humana en un tubo de
muestra. A continuación se detuvo la reacción mediante la adición de
aprotinina y se detectó PrP mediante un ensayo ELISA. Como
anticuerpo de captura se utilizó SAF32 (reconoce el epítopo entre
los restos de aminoácido 58 y 89 de la molécula de PrP) y como
anticuerpo de detección 3F4 acoplado con biotina (reconoce el
epítopo entre los restos de aminoácido 108 y 111 de la molécula de
PrP). Para el ensayo ELISA se mezcló la muestra con un conjugado de
estreptavidina-poliperoxidasa (SApolyHRP, empresa
Pierce, Rockford, EE.UU.), que estaba diluido 1:5000 en tampón de
reacción (1 parte de tampón de bloqueo + 4 partes de PBS), y se
incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación se
añadió TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) como
sustrato a la muestra y se incubó durante 30 minutos. Tras la
adición de la disolución de parada (H_{2}SO_{4} al 0,25% en
agua destilada) se midió la extinción de la muestra a 405 nm con un
lector de ELISA (Tecan Genios; Tecan, Suiza).
El epítopo del anticuerpo de detección se
encuentra justo en el sitio de escisión primario de la proteína
priónica, por lo que únicamente pueden detectarse proteínas
priónicas no escindidas en la muestra mediante ELISA (figura 1).
Se muestra que la escisión de PrP^{C} nativa
in vitro mediante la presencia de inhibidores de plasmina
presentes en la muestra sólo puede controlarse con dificultad cuando
se realiza la digestión en un tubo de muestra sin inmovilización
previa de las proteínas priónicas. Para una escisión significativa
de PrP humana recombinante en el tubo de ensayo es por tanto
necesaria una concentración de plasmina de aproximadamente 200 nM,
mientras que la misma medida de escisión para PrP^{C} de ser
humano y PrP^{C} de hámster sólo se consigue a una concentración
de plasmina de más de
1 \muM (figura 2).
1 \muM (figura 2).
Por este motivo se desarrolló una prueba en la
que en primer lugar se inmovilizan priones contenidos en una
muestra por medio de un anticuerpo monoclonal, entonces se tratan
con plasmina humana y a continuación se detectan los priones no
escindidos restantes con otro anticuerpo marcado. Dado que la
muestra antes de la digestión con plasmina se separa de los
complejos de anticuerpos fijados y proteínas priónicas, los
sustratos de plasmina o inhibidores de plasmina contenidos en la
muestra no pueden influir o inhibir la actividad de plasmina en la
digestión.
En ensayos adicionales se examinó la escisión de
PrP mediante plasmina tras la inmovilización por medio de
anticuerpos fijados sobre placas de microtitulación (figura 3 y
figura 4). Para ello se usaron tanto anticuerpos que están
dirigidos frente a distintos epítopos de la molécula de PrP (figura
1; figura 5), como rhuPrP, estando intercambiados los restos lisina
en la región de escisión de la plasmina por alanina (figura 6 y
figura 7).
Ejemplo
2.1
Para la escisión de PrP^{C} inmovilizada a
partir de plasma humano se recubrieron tres placas de
microtitulación transparentes (Lumi-Nunc
Maxi-Sorp F96; empresa Nunc, Wiesbaden) con 100
\mul/cavidad de anticuerpo monoclonal (anticuerpo
anti-PrP: SAF32, empresa Spi-Bio,
Montigny le Bretonneux, Francia; concentración: 1 \mug/ml en
tampón carbonato/bicarbonato pH 9,0, empresa Perbio, Bonn) durante
16-18 horas a 4ºC. Se succionó el líquido residual
y se saturaron los sitios de unión libres mediante la adición de 100
\mul de tampón de bloqueo (Superblock, empresa Perbio, Bonn) en
cada cavidad durante 1 hora. Se succionó el tampón de bloqueo de las
placas y se pipetearon las muestras (plasma citrato humano reunido,
diluido de manera correspondiente en tampón de reacción: 1 parte de
tampón de bloqueo + 4 partes de PBS) sobre las placas. Tras una
incubación de dos horas a temperatura ambiente se lavaron las
placas tres veces con tampón de lavado (TBS (Burph TBS, empresa
Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5%
(Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)). A
continuación se pipetearon en las cavidades 100 \mul de plasmina
humana 50 nM (empresa Chromogenix, Estocolmo, Suecia) en PBS
(empresa Perbio, Bonn). Se incubaron las placas durante 0, 10, 20 y
30 minutos a 37ºC en un agitador térmico (THERMOSTAR, empresa BMG,
Offenburg) a 500 revoluciones por minuto. Después se pipetearon en
cada cavidad 25 \mul de aprotinina 5 \muM (empresa Merck
Biosciences, Schwalbach) en PBS. Tras 5 minutos de incubación a
temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con el tampón
de lavado. Para la detección de la PrP sin digerir se pipetearon
100 \mul de anticuerpo de detección biotinilado (3F4, empresa
Signet, Dedham, EE.UU.; 125 ng/ml) en tampón de reacción en cada
cavidad.
Para el ensayo ELISA se incubó con el anticuerpo
de detección durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación
suave en la oscuridad. Tras lavar en cada caso seis veces con 300
\mul de tampón de lavado (TBS (Burph TBS, empresa Pierce,
Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5%
(Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)) se
diluyó 1:5000 un conjugado de
estreptavidina-poliperoxidasa (SApolyHRP, empresa
Pierce, Rockford, EE.UU.) en tampón de reacción (1 parte de tampón
de bloqueo + 4 partes de PBS) y se pipeteó hasta 100 \mul por
cavidad sobre las placas de microtitulación. Tras 20 minutos de
incubación a temperatura ambiente con agitación suave en la
oscuridad se lavó en cada caso de nuevo seis veces en cada caso con
300 \mul de tampón de lavado. A continuación se pipetearon en
cada caso 100 \mul sobre TMB llevado a temperatura ambiente
(3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) como sustrato en
cada cavidad y se incubaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente con agitación moderada en la oscuridad. Tras la adición de
50 \mul de disolución de parada (H_{2}SO_{4} al 0,25% en agua
destilada) por cavidad se midió la extinción de la muestra a 405 nm
con un lector de ELISA (Tecan Genios; Tecan, Suiza).
Los resultados de la escisión de PrP^{C}
inmovilizada a partir de plasma humano se representan en la figura
3. De manera análoga a esto se realizó también la escisión de
PrP^{C} inmovilizada a partir de homogeneizado de cerebro de
hámster, con la única excepción de que para la muestra no se usó
plasma citrato humano reunido, sino homogeneizado de cerebro de
hámster de animales sanos. Los resultados de la escisión de
PrP^{C} inmovilizada a partir de homogeneizado de cerebro de
hámster se muestran en la figura 4.
La intensidad porcentual que disminuye
exponencialmente, que puede verse en las figuras 3 y 4, aclara que
el 3F4 biotinilado usado como anticuerpo de detección, que reconoce
un epítopo entre los restos de aminoácido 108 y 111 de la molécula
de PrP, con una duración de incubación progresiva detecta cada vez
menos epítopos. Esto muestra que el epítopo de este
PrP-anticuerpo se encuentra sobre el fragmento
PrP^{C}, que se degradó mediante la escisión con plasmina y se
eliminó por lavado antes de la detección con el anticuerpo de
detección.
Se muestra además que ya tras veinte minutos de
incubación con plasmina la cantidad total de la PrP^{C}
inmovilizada a partir de plasma humano de dilución 1:200 estaba
escindida mediante plasmina. En el caso de la dilución 1:50 y
1:100, tras 30 minutos de incubación con plasmina ya no estaba
presente prácticamente nada de PrP^{C} de ser humano sin escindir
(figura 3).
En el caso del homogeneizado de hámster
(dilución 1:400), tras 20 minutos de incubación con plasmina estaba
escindida mediante plasmina la cantidad total de la PrP^{C}
inmovilizada. En el caso de la dilución 1:100 y 1:200, tras 30
minutos de incubación con plasmina ya no era detectable
prácticamente nada de PrP^{C} de hámster no escindida
(figura 4).
(figura 4).
Ejemplo
2.2
Para la supresión de la escisión de PrP mediante
plasmina se recubrieron dos placas de microtitulación transparentes
(Lumi-Nunc Maxi-Sorp F96; empresa
Nunc, Wiesbaden) con 100 \mul/cavidad de anticuerpo monoclonal
(anticuerpo anti-PrP: PRI308, empresa
Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia;
concentración: 1 \mug/ml en tampón carbonato/bicarbonato pH 9,0
(empresa Perbio, Bonn) durante 16-18 horas a 4ºC. Se
succionó el líquido residual y se saturaron los sitios de unión
libres mediante la adición de 100 \mul de tampón de bloqueo
(Superblock, empresa Perbio, Bonn) en cada cavidad durante 1 hora.
Se succionó el tampón de bloqueo de las placas y se pipetearon las
muestras (extracto de homogeneizado de cerebro de hámster de
animales sanos, diluido de manera correspondiente en tampón de
reacción: 1 parte de tampón de bloqueo + 4 partes de PBS) sobre las
placas. Tras una incubación de dos horas a temperatura ambiente se
lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (TBS (Burph TBS,
empresa Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5%
(Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)). A
continuación se pipetearon sobre una placa de microtitulación 100
\mul de plasmina humana 50 nM (empresa Chromogenix, Estocolmo,
Suecia) en PBS (empresa Perbio, Bonn), mientras que se pipetearon
100 \mul de PBS sobre la segunda placa de microtitulación. Se
incubaron las placas durante 30 minutos a 37ºC en un agitador
térmico (THERMOSTAR, empresa BMG, Offenburg) a 500 revoluciones por
minuto. Después se pipetearon sobre ambas placas 25 \mul/cavidad
de aprotinina 5 \muM (empresa Merck Biosciences, Schwalbach) en
PBS. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se lavaron
las placas tres veces con el tampón de lavado. Para la detección de
la PrP sin digerir se pipetearon 100 \mul de anticuerpo de
detección biotinilado (SAF32, empresa Spi-Bio,
Montigny le Bretonneux, Francia; 125 ng/ml) en tampón de reacción
en cada cavidad. A continuación se realizó el ensayo ELISA según las
especificaciones anteriores.
Tal como se deduce a partir de la figura 5, tras
la inmovilización de PrP^{C} nativa por medio de un anticuerpo de
captura (PRI3O8), que reconoce como epítopo los restos de aminoácido
106-126 de la molécula de PrP, no es posible
ninguna escisión con plasmina. Esto muestra que mediante la unión de
PrP^{C} mediante el anticuerpo de captura está enmascarado el
sitio de escisión primario de PrP^{C} para la plasmina, y éste
debe encontrarse entre los restos de aminoácido
106-126 de la molécula de PrP.
Ejemplo
2.3
Para la escisión de PrP^{C} recombinante se
recubrieron cuatro placas de microtitulación transparentes
(Lumi-Nunc Maxi-Sorp F96; empresa
Nunc, Wiesbaden) con 100 \mul/cavidad de anticuerpo monoclonal
(anticuerpo anti-PrP: SAF61, empresa
Spi-Bio, Montigny Le Bretonneux, Francia;
concentración 1 \mug/ml en tampón carbonato/bicarbonato pH 9,0,
empresa Perbio, Bonn) durante 16-18 horas a 4ºC. Se
succionó el líquido residual y se saturaron los sitios de unión
libres mediante la adición de 100 \mul de tampón de bloqueo
(Superblock, empresa Perbio, Bonn) en cada cavidad durante 1 hora.
Se succionó el tampón de bloqueo de las placas y se pipetearon sobre
las placas las muestras (PrP humana recombinante con restos lisina
intercambiados por alanina en la agrupación de lisina 2 (dLC2), del
Institut für Labormedizin, Charité, Campus Virchow Klinikum; diluida
de manera correspondiente en tampón de reacción: 1 parte de tampón
de bloqueo + 4 partes de PBS). Tras una incubación de dos horas a
temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con tampón de
lavado (TBS (Burph TBS, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween
20 al 0,5% (Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford,
EE.UU.)). A continuación se pipetearon en las placas de
microtitulación 100 \mul de plasmina humana 50 nM (empresa
Chromogenix, Estocolmo, Suecia) en PBS (empresa Perbio, Bonn). Se
incubaron las placas durante 0, 5, 15 y 30 minutos a 37ºC en un
agitador térmico (THERMOSTAR, empresa BMG, Offenburg) a 500
revoluciones por minuto. Después se pipetearon sobre todas las
placas 25 \mul/cavidad de aprotinina 5 \muM (empresa Merck
Biosciences, Schwalbach) en PBS. Tras 5 minutos de incubación a
temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con el tampón
de lavado. Para la detección de la PrP^{C} sin digerir se
pipetearon 100 \mul de anticuerpo de detección biotinilado
(SAF32, empresa Spi-Bio, Montigny le Bretonneux,
Francia; 125 ng/ml) en tampón de reacción en cada cavidad. A
continuación se realizó el ensayo ELISA según las especificaciones
anteriores.
Los resultados (figura 6) muestran que el
intercambio de restos lisina en la agrupación de lisina 2 (dLC2) de
PrP humana por alanina conduce a una influencia significativa en la
escisión de PrP mediante plasmina. Así, en la muestra que contenía
la PrP^{C} mutada en una concentración de 25,7 ng/ml, tras 30
minutos aún quedaba sin digerir más del 70% de la PrP^{C} mutada.
También a concentraciones menores de la PrP^{C} mutada se ve
inhibida fuertemente la escisión con plasmina.
Ejemplo
2.4
Para la escisión de PrP^{C} nativa e
inmovilizada recombinante en una mezcla se recubrieron siete placas
de microtitulación transparentes (Lumi-Nunc
Maxi-Sorp F96; empresa Nunc, Wiesbaden) con 100
\mul/cavidad de anticuerpo monoclonal (anticuerpo
anti-PrP: SAF61, empresa Spi-Bio,
Montigny le Bretonneux, Francia; concentración 1 \mug/ml en
tampón carbonato/bicarbonato pH 9,0, empresa Perbio, Bonn) durante
16-18 horas a 4ºC. Se succionó el líquido residual
y se saturaron los sitios de unión libres mediante la adición de 100
\mul de tampón de bloqueo (Superblock, empresa Perbio, Bonn) en
cada cavidad durante 1 hora. Se succionó el tampón de bloqueo de
las placas y se pipetearon sobre las placas las muestras (PrP humana
recombinante con restos lisina intercambiados por alanina en la
agrupación de lisina 2 (dLC2), del Institut für Labormedizin,
Charité, Campus Virchow Klinikum; diluida hasta 25,7; 14,1 y
7,1 ng/ml en homogeneizado de cerebro de vacuno, diluida 1:100 en tampón de reacción; tampón de reacción: 1 parte de tampón de bloqueo + 4 partes de PBS). Tras una incubación de dos horas a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (TBS (Burph TBS, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5% (Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)). A continuación se pipetearon en las placas de microtitulación 100 \mul de plasmina humana 50 nM (empresa Chromogenix, Estocolmo, Suecia) en PBS (empresa Perbio, Bonn). Se incubaron las placas durante 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos a 37ºC en un agitador térmico (THERMOSTAR, empresa BMG, Offenburg) a 500 revoluciones por minuto. Después se pipetearon sobre todas las placas 25 \mul/cavidad de aprotinina 5 \muM (empresa Merck Biosciences, Schwalbach) en PBS. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con el tampón de lavado. Para la detección de la PrP^{C} sin digerir se pipetearon 100 \mul de anticuerpo de detección biotinilado (SAF32, empresa Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia;
125 ng/ml) en tampón de reacción en cada cavidad. A continuación se realizó el ensayo ELISA según las especificaciones anteriores.
7,1 ng/ml en homogeneizado de cerebro de vacuno, diluida 1:100 en tampón de reacción; tampón de reacción: 1 parte de tampón de bloqueo + 4 partes de PBS). Tras una incubación de dos horas a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (TBS (Burph TBS, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5% (Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)). A continuación se pipetearon en las placas de microtitulación 100 \mul de plasmina humana 50 nM (empresa Chromogenix, Estocolmo, Suecia) en PBS (empresa Perbio, Bonn). Se incubaron las placas durante 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos a 37ºC en un agitador térmico (THERMOSTAR, empresa BMG, Offenburg) a 500 revoluciones por minuto. Después se pipetearon sobre todas las placas 25 \mul/cavidad de aprotinina 5 \muM (empresa Merck Biosciences, Schwalbach) en PBS. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con el tampón de lavado. Para la detección de la PrP^{C} sin digerir se pipetearon 100 \mul de anticuerpo de detección biotinilado (SAF32, empresa Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia;
125 ng/ml) en tampón de reacción en cada cavidad. A continuación se realizó el ensayo ELISA según las especificaciones anteriores.
A partir de la figura 7 puede deducirse que
también puede escindirse PrP^{C} nativa de vacuno a partir de una
mezcla con distinta concentración de PrP mutada, recombinante de ser
humano, cuya escisión mediante plasmina se suprime fuertemente
debido a la mutación (véase el ejemplo anterior).
En una serie adicional de ensayos se examinaron
con plasmina muestras con scrapie (cepa 263K de hámster). Se
examinó homogeneizado de cerebro de animales infectados en estadio
terminal en diferentes concentraciones para determinar la presencia
de PrP^{Sc} (figura 8). Además se añadieron diferentes cantidades
de homogeneizado de cerebro de animales infectados al homogeneizado
de cerebro de animales sanos, para comprobar la detección de la
forma patológica en presencia de mayores concentraciones de la forma
normal (figura 9).
Ejemplo
3.1
Para la preparación de las muestras se mezclaron
40 \mul de homogeneizado de cerebro de hámster de animales
infectados con scrapie con 40 \mul de sarcosilo al 2%
(empresa Sigma, Seelze), se trataron durante 60 segundos a nivel 3
con ultrasonidos (aparato de ultrasonidos UP100H, empresa Dr.
Hielscher, Teltow) y se incubaron durante 2 horas a temperatura
ambiente en un Rotor (neoLab-Rotor, empresa Roth,
Karlsruhe). Después se preparó una serie de diluciones en tampón de
reacción.
Se recubrieron cuatro placas de microtitulación
transparentes (Lumi-Nunc Maxi-Sorp
F96; empresa Nunc, Wiesbaden) con 100 \mul/cavidad de anticuerpo
monoclonal (anticuerpo anti-PrP: SAF61, empresa
Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia;
concentración 1 \mug/ml en tampón carbonato/bicarbonato pH 9,0,
empresa Perbio, Bonn) durante 16-18 horas a 4ºC. Se
succionó el líquido residual y se saturaron los sitios de unión
libres mediante la adición de 100 \mul
de tampón de bloqueo (Superblock, empresa Perbio, Bonn) en cada cavidad durante 1 hora. Se succionó el tampón de bloqueo de las placas y se pipetearon las muestras preparadas sobre las placas. Tras una incubación de dos horas a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (TBS (Burph TBS, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5% (Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)). A continuación se pipetearon en las placas de microtitulación 100 \mul de plasmina humana 50 nM (empresa Chromogenix, Estocolmo, Suecia) en PBS (empresa Perbio, Bonn). Se incubaron las placas durante 5, 15 y 30 minutos a 37ºC en un agitador térmico (THERMOSTAR, empresa BMG, Offenburg) a 500 revoluciones por minuto. Después se pipetearon sobre todas las placas 25 \mul/cavidad de aprotinina 5 \muM (empresa Merck Biosciences, Schwalbach) en PBS. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con el tampón de lavado. Para la detección de moléculas de PrP sin digerir se pipetearon 100 \mul de anticuerpo de detección biotinilado (SAF32, empresa Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia; 125 ng/ml) en tampón de reacción en cada cavidad. A continuación se realizó el ensayo ELISA según las especificaciones anteriores.
de tampón de bloqueo (Superblock, empresa Perbio, Bonn) en cada cavidad durante 1 hora. Se succionó el tampón de bloqueo de las placas y se pipetearon las muestras preparadas sobre las placas. Tras una incubación de dos horas a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (TBS (Burph TBS, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5% (Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)). A continuación se pipetearon en las placas de microtitulación 100 \mul de plasmina humana 50 nM (empresa Chromogenix, Estocolmo, Suecia) en PBS (empresa Perbio, Bonn). Se incubaron las placas durante 5, 15 y 30 minutos a 37ºC en un agitador térmico (THERMOSTAR, empresa BMG, Offenburg) a 500 revoluciones por minuto. Después se pipetearon sobre todas las placas 25 \mul/cavidad de aprotinina 5 \muM (empresa Merck Biosciences, Schwalbach) en PBS. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con el tampón de lavado. Para la detección de moléculas de PrP sin digerir se pipetearon 100 \mul de anticuerpo de detección biotinilado (SAF32, empresa Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia; 125 ng/ml) en tampón de reacción en cada cavidad. A continuación se realizó el ensayo ELISA según las especificaciones anteriores.
\newpage
Se muestra que la PrP^{Sc} incluso en una
dilución 1:6400 del homogeneizado de cerebro de hámster de animales
infectados con scrapie en tampón aún ha de detectarse
claramente. La intensidad medida es proporcional a la concentración
del homogeneizado de cerebro de hámster (y con ello de la
PrP^{Sc}).
Ejemplo
3.2
Para la preparación de las muestras se mezclaron
40 \mul de homogeneizado de cerebro de hámster de animales
infectados con scrapie o de animales sanos con 40 \mul de
sarcosilo al 2% (empresa Sigma, Seelze), se trataron durante 60
segundos a nivel 3 con ultrasonidos (aparato de ultrasonidos UP100H,
empresa Dr. Hielscher, Teltow) y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente en un rotor (neoLab-Rotor
empresa Roth, Karlsruhe). Después se preparó una serie de
diluciones de homogeneizados con scrapie en homogeneizados
normales. Inmediatamente antes de pipetear sobre las placas se
diluyeron las muestras 1:100 en tampón de reacción.
Se recubrieron siete placas de microtitulación
transparentes (Lumi-Nunc Maxi-Sorp
F96; empresa Nunc, Wiesbaden) con 100 \mul/cavidad de anticuerpo
monoclonal (anticuerpo anti-PrP: SAF61, empresa
Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia;
concentración 1 \mug/ml en tampón carbonato/bicarbonato pH 9,0,
empresa Perbio, Bonn) durante 16-18 horas a 4ºC. Se
succionó el líquido residual y se saturaron los sitios de unión
libres mediante la adición de 100 \mul
de tampón de bloqueo (Superblock, empresa Perbio, Bonn) en cada cavidad durante 1 hora. Se aspiró el tampón de bloqueo de las placas y se pipetearon las muestras preparadas sobre las placas. Tras una incubación de dos horas a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (TBS (Burph TBS, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5% (Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)). A continuación se pipetearon en las placas de microtitulación 100 \mul de plasmina humana 50 nM (empresa Chromogenix, Estocolmo, Suecia) en PBS (empresa Perbio, Bonn). Se incubaron las placas durante 5, 15 y 30 minutos a 37ºC en un agitador térmico (THERMOSTAR, empresa BMG, Offenburg) a 500 revoluciones por minuto. Después se pipetearon sobre todas las placas 25 \mul/cavidad de aprotinina 5 \muM (empresa Merck Biosciences, Schwalbach) en PBS. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con el tampón de lavado. Para la detección de moléculas de PrP sin digerir se pipetearon 100 \mul de anticuerpo de detección biotinilado (SAF32, empresa Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia; 125 ng/ml) en tampón de reacción en cada cavidad. A continuación se realizó el ensayo ELISA según las especificaciones anteriores.
de tampón de bloqueo (Superblock, empresa Perbio, Bonn) en cada cavidad durante 1 hora. Se aspiró el tampón de bloqueo de las placas y se pipetearon las muestras preparadas sobre las placas. Tras una incubación de dos horas a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (TBS (Burph TBS, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.) con Tween 20 al 0,5% (Surfact-Amps, empresa Pierce, Rockford, EE.UU.)). A continuación se pipetearon en las placas de microtitulación 100 \mul de plasmina humana 50 nM (empresa Chromogenix, Estocolmo, Suecia) en PBS (empresa Perbio, Bonn). Se incubaron las placas durante 5, 15 y 30 minutos a 37ºC en un agitador térmico (THERMOSTAR, empresa BMG, Offenburg) a 500 revoluciones por minuto. Después se pipetearon sobre todas las placas 25 \mul/cavidad de aprotinina 5 \muM (empresa Merck Biosciences, Schwalbach) en PBS. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se lavaron las placas tres veces con el tampón de lavado. Para la detección de moléculas de PrP sin digerir se pipetearon 100 \mul de anticuerpo de detección biotinilado (SAF32, empresa Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Francia; 125 ng/ml) en tampón de reacción en cada cavidad. A continuación se realizó el ensayo ELISA según las especificaciones anteriores.
A partir de la figura 9 puede deducirse que la
forma patológica de la proteína priónica (PrP^{Sc}) incluso en un
exceso de 6400 veces de la forma no patológica de la proteína
priónica (PrP^{C}) aún puede detectarse claramente. Esto muestra
que la detección de PrP^{Sc} mediante el procedimiento según la
invención no se logra solamente en sujetos que se encuentran en el
estadio terminal de la enfermedad, en el que la concentración de
PrP^{Sc} supera la concentración de PrP^{C}, sino que es posible
ya claramente antes, en un estadio preclínico temprano.
Claims (19)
1. Procedimiento para la detección de proteínas
priónicas patológicas in vitro en una muestra, en el que:
- a)
- se fijan sobre una fase sólida anticuerpos de captura, que reconocen tanto la forma patológica (PrP^{Sc}) como la no patológica (PrP^{C}) de la proteína priónica;
- b)
- se incuba la muestra con los anticuerpos fijados de la etapa a), uniéndose la forma patológica y la no patológica de la proteína priónica a los anticuerpos fijados formando complejos;
- c)
- se separa la muestra de los complejos generados;
- d)
- se incuban los complejos con plasmina, escindiéndose la forma no patológica de la proteína priónica;
- e)
- se separan de los complejos los fragmentos de escisión obtenidos mediante la incubación con plasmina; y
- f)
- se detecta la proteína priónica no escindida, contenida en los complejos con anticuerpos de detección, que presentan la capacidad de unirse de manera específica a PrP^{Sc}.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la detección en la etapa f) tiene lugar de manera
cuantitativa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que los anticuerpos de detección reconocen tanto la forma
patológica como la no patológica de la proteína priónica.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el anticuerpo de captura está dirigido frente a un epítopo
de la proteína priónica, que se encuentra en la región de los restos
de aminoácido 1-110, cuando el anticuerpo de
detección está dirigido frente a un epítopo, que se encuentra fuera
de esta región, o el anticuerpo de detección está dirigido frente a
un epítopo, que se encuentra en la región de los restos de
aminoácido 1-110, cuando el anticuerpo de captura
está dirigido frente a un epítopo, que se encuentra fuera de esta
región.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que tras la etapa a) se saturan
sitios de unión libres de la fase sólida mediante tampón de
bloqueo.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que las fases sólidas son placas
de microtitulación o perlas paramagnéticas o no magnéticas.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo de incubación en la
etapa b) no asciende a más de 2 horas.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo de incubación en la
etapa d) no asciende a más de 30 minutos.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que a la incubación con plasmina
en la etapa d) le sigue la adición de aprotinina.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que entre las etapas individuales
se realizan etapas de lavado.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que los anticuerpos de detección
contienen biotina, marcadores de fluorescencia y/o nanoperlas,
especialmente nanoperlas marcadas con europio.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que la detección en la etapa f)
tiene lugar mediante un ensayo ELISA.
13. Kit de diagnóstico para la detección de
priones patológicos in vitro en una muestra, que
contiene:
- a)
- anticuerpos de captura, que están dirigidos tanto frente a la forma patológica (PrP^{Sc}) como a la no patológica (PrP^{C}) de la proteína priónica,
- b)
- plasmina; y
- c)
- anticuerpos de detección, que presentan la capacidad de unirse de manera específica a PrP^{Sc}.
14. Kit de diagnóstico según la reivindicación
13, en el que los anticuerpos de captura ya están fijados sobre una
fase sólida.
15. Kit de diagnóstico según la reivindicación
14, en el que la fase sólida son placas de microtitulación o
perlas.
16. Kit de diagnóstico según la reivindicación
13, en el que los anticuerpos de detección reconocen tanto la forma
patológica como la no patológica de la proteína priónica.
17. Kit de diagnóstico según la reivindicación
13, que contiene además tampón de bloqueo para la saturación de
sitios de unión libres de la fase sólida, tampón de lavado y/o
aprotinina.
18. Kit de diagnóstico según la reivindicación
13, en el que la plasmina se encuentra disuelta en una disolución
tampón o liofilizada como sólido.
19. Kit de diagnóstico según la reivindicación
13, en el que el anticuerpo de captura está dirigido frente a un
epítopo de la proteína priónica, que se encuentra en la región de
los restos de aminoácido 1-110, cuando el
anticuerpo de detección está dirigido frente a un epítopo, que se
encuentra fuera de esta región, o el anticuerpo de detección está
dirigido frente a un epítopo, que se encuentra en la región de los
restos de aminoácido 1-110, cuando el anticuerpo de
captura está dirigido frente a un epítopo, que se encuentra fuera de
esta región.
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