ES2330658T3

ES2330658T3 - Polipeptido inmunogeno compuesto por peptidos cripticos optimizados derivados de antigenos tumorales, y sus usos.

Info

Publication number: ES2330658T3
Application number: ES05850393T
Authority: ES
Inventors: Konstantinos Kosmatopoulos; Sebastien Cornet
Original assignee: Vaxon Biotech SA
Current assignee: Vaxon Biotech SA
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2009-12-14
Anticipated expiration: 2025-12-23
Also published as: CN101370513A; EP1962889A1; WO2007073768A1; US20090130133A1; ATE435660T1; DK1962889T3; JP4929290B2; DE602005015368D1; PL1962889T3; CN101370513B; US7973128B2; CA2634480C; CA2634480A1; PT1962889E; EP1962889B1; JP2009520472A

Abstract

Un polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia YLQVNSLQTVX 1X 2X 3YLEYRQVPVX 1X 2X 3 YLEEITGYL (SEC ID N.º: 1), en el que los epítopos TERT988Y (SEC ID N.º: 8), MAGE-A248V9 (SEC ID N.º: 9), y HER-2/neu402Y (SEC ID N.º: 10) están separados mediante espaciadores X1X2X3, en los que X1, X2 y X3 son cualquier aminoácido o ninguno.

Description

Polipéptido inmunógeno compuesto por péptidos crípticos optimizados derivados de antígenos tumorales, y sus usos.

La presente invención está relacionada con el campo de las vacunas contra el cáncer. De forma más particular, la invención se refiere a un polipéptido optimizado para usar en una vacuna contra el cáncer, que comprende tres péptidos tumorales crípticos con capacidad inmunógena mejorada.

La reciente identificación de antígenos asociados a tumores que son atacados por los linfocitos T citotóxicos (CTL) antitumorales ha abierto el camino para estrategias de vacunas contra el cáncer dirigidas a estimular el repertorio de CTL específicos de tumor.

Las vacunas antitumorales experimentales tienen muchas formas, que incluyen péptidos libres, células dendríticas cargadas con péptidos o lisados tumorales y ADN. Aunque las vacunas con base peptídica son muy atractivas comparadas con otras formas en cuanto a la viabilidad, se encontró que, en muchos estudios, los péptidos tumorales dominantes solo provocaban respuestas inmunológicas y clínicas débiles, con una gran variabilidad entre pacientes (Rosenberg et al., 2004). Varios factores podrían explicar estos resultados relativamente decepcionantes. Primeramente, la mayoría de los antígenos tumorales son proteínas autólogas no mutadas que también son expresadas por los tejidos normales, incluido el timo. Esto suscita problemas de tolerancia por parte del repertorio de CTL específicos de tumores (Restifo, 2001; Van Pel et al., 1995), que emplea péptidos dominantes en lugar de crípticos (Cibotti et al., 1992; Nanda y Sercarz, 1995; Restifo, 2001). De hecho, recientemente se demostró que los péptidos crípticos inducían inmunidad antitumoral más eficientemente que los péptidos dominantes (Gross et al., 2004).

Segundo, las estrategias basadas en epítopos únicos inducen una respuesta de CTL con HLA restringidos solo contra un antígeno que, debido a la inestabilidad genética de los tumores, puede no estar expresado en todas las células tumorales (Brasseur et al., 1995; Lehmann et al., 1995). Las estrategias que provocan respuestas de CTL contra antígenos múltiples tendrían varias ventajas potenciales. En particular, la expresión de al menos un antígeno diana debería ser suficiente para desencadenar citotoxicidad, y es improbable que las células tumorales pierdan todos los antígenos diana de forma simultánea, especialmente cuando los antígenos en cuestión son esenciales para la supervivencia celular y el crecimiento del tumor. Esta estrategia puede provocar respuestas inmunitarias potentes (Oukka et al., 1996).

Finalmente, la inmunoterapia contra el cáncer de amplio espectro debería dirigirse contra antígenos tumorales universales, como por ejemplo TERT, HER-2/neu, MUC-1 y MAGE-A, que están hiperexpresados en una amplia variedad de tumores (Minev et al., 2000; Ofuji et al., 1998; Ogata et al., 1992; Reese y Slamon, 1997; Slamon et al., 1987; Van den Eynde y van der Bruggen, 1997; Vonderheide et al., 1999). La mayoría de estos antígenos están implicados en la supervivencia de las células tumorales y en la capacidad tumorogénica y su regulación por disminución para evadir la respuesta inmunitaria por lo tanto podría tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral.

Para dar respuesta al menos a parte de las cuestiones mencionadas anteriormente, los inventores han combinado tres péptidos crípticos optimizados derivados de antígenos tumorales universales (TERT_{988Y}, HER-2/neu_{402Y} y MAGE-A_{248V9}) en varios polipéptidos de 28 aminoácido, y han evaluado la capacidad de los polipéptidos obtenidos de inducir una respuesta inmunitaria contra los tres péptidos de forma simultánea, tanto in vivo en ratones transgénicos con HLA-A*0201 (HHD) como in vitro en donantes humanos sanos. Previamente se había demostrado que cada uno de los tres péptidos provocaba una respuesta antitumoral in vivo e in vitro (Gross et al., 2004; Scardino et al., 2002). De forma interesante, los CTL provocados por MAGE-A_{248V9} se dirigían contra todos los antígenos MAGE-A (-A1, -A2, - A3, -A4, -A6, -A10, -A12) (Graff-Dubois et al., 2002).

Como describe más adelante, los inventores demostraron que a) un polipéptido formado por TERT_{988Y,} HER-2/neu_{402Y} y MAGE-A_{248V9} provoca una respuesta de CTL poliespecíficos, al contrario que la simple mezcla de los tres péptidos; b) la capacidad del polipéptido de inducir una respuesta de CTL poliespecíficos depende de su organización interna: de las seis variantes que corresponden a todas las disposiciones posibles de los tres péptidos, solo una produjo una respuesta de CTL triespecíficos en casi todos los experimentos con ratones y células humanas.

Un primer aspecto de la invención es por lo tanto un polipéptido que comprende la secuencia YLQVNSLQTVX_{1}X_{2}
X_{3}YLEYRQVPVX_{1}X_{2}X_{3}YLEEITGYL (SEC ID N.º: 1). En esta secuencia, los epítopos TERT_{988Y}, MAGE-A_{248V9} y HER-2/neu_{402Y} están separados mediante espaciadores X_{1}X_{2}X_{3}, en los que X_{1}, X_{2} y X_{3} son cualquier aminoácido o ninguno. El polipéptido, por lo tanto, tiene una longitud de al menos 28 aminoácidos; su longitud puede aumentarse mediante la adición de espaciadores entre los epítopos, y/o por la adición de señales, en sus extremos N y/o C, que favorezcan su procesamiento. En particular, el polipéptido de acuerdo con la invención además puede comprender una secuencia de señalización de translocación al retículo endoplasmático en su extremo N. Se han descrito varias secuencias de señalización de translocación al retículo endoplasmático en la bibliografía científica y pueden usarse en el contexto de la invención. Por ejemplo, puede añadirse la secuencia de señalización de la cadena kappa de Ig (Ishioka et al., 1999), y la secuencia de señalización de la proteína E3/19-kD (Anderson et al., 1991) en el extremo N de los péptidos de acuerdo con la invención. De forma alternativa o además, el polipéptido de acuerdo con la invención puede com-
prender además ubicuitina en su extremo C, dado que la ubicuitinación de las proteínas provoca una mayor proteólisis.

En una realización preferida del polipéptido de acuerdo con la invención, X_{1} = X_{2} = X_{3} = ninguno. Esto quiere decir que los tres epítopos están unidos directamente entre sí. En ausencia de ubicuitina y de señal de translocación al RE, el polipéptido es por lo tanto el polipéptido Poli-6 que se ilustra en los ejemplos más adelante, cuya secuencia es YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL (SEC ID N.º: 2). De acuerdo con otra realización, los espaciadores entre los epítopos son AAY, lo que quiere decir que X_{1}=X_{2}=A y X_{3}=Y.

En los polipéptidos de acuerdo con la invención, los aminoácidos pueden ser o bien aminoácidos L o D. Un polipéptido de acuerdo con la invención preferiblemente muestra una o ambas de las siguientes propiedades, que indican la buena capacidad inmunógena:

- induce una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+ contra TERT_{988Y}, MAGE-A_{248V9}, y HER-2/neu_{402Y}, en una mayoría de ratones HHD vacunados con dicho polipéptido;

- induce una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+ contra TERT_{988Y}, MAGE-A_{248V9}, y HER-2/neu_{402Y} en un ensayo in vitro con PBMC humanos de donantes sanos con HLA-A*0201; esta respuesta triespecífica preferiblemente se obtiene con PBMC de una mayoría, más preferiblemente al menos 70%, de donantes sanos con HLA-A*0201.

Estas propiedades pueden ser analizadas fácilmente por el experto en la técnica, usando los protocolos y ensayos que se describen en la parte experimental más adelante.

Otro objetivo de la presente invención es una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se describe anteriormente. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico es un vector de expresión. Por "vector de expresión" se quiere decir una molécula que, cuando se introduce en una célula de mamífero, permite expresar dicho polipéptido codificado. Con ese objetivo, el experto en la técnica puede elegir un promotor de la transcripción apropiado (por ejemplo, el promotor del CMV), una secuencia codificante con codones optimizados para la expresión en células humanas, una secuencia de terminación de la traducción apropiada, opcionalmente una secuencia de consenso de Kozak, etc. La molécula de ácido nucleico es preferiblemente una molécula de ADN.

Un tercer aspecto de la invención es un una célula dendrítica aislada cargada con un polipéptido como se ha descrito anteriormente, o transducida con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido así. En el presente contexto "aislada" quiere decir que dicha célula dendrítica está fuera del cuerpo del paciente. La célula preferiblemente se carga o se transduce ex vivo. Por ejemplo, la célula dendrítica puede cargarse con el polipéptido mediante la técnica que describen Vonderheide et al. (Vonderheide et al., 2004), o transducirse con un vector de expresión usando el protocolo que describen Firat et al. (Firat et al., 2002).

La invención también se refiere a un complejo que comprende un vector de transporte de péptidos y un polipéptido como se describe anteriormente. Los ejemplos de vectores de transporte de péptidos que pueden usarse de acuerdo con la invención son péptidos que penetran en las células, toxinas bacterianas como por ejemplo la adenilato ciclasa de B. pertussis (Fayolle et al., 1999), la toxina de la difteria (Fayolle et al., 1999), la toxina del ántrax (Doling et al., 1999), la subunidad B de la toxina Shiga (Haicheur et al., 2000) y otros vectores como por ejemplo el PLA2 del veneno de abeja (Babon et al., 2005), liposomas, virosomas (Bungener et al., 2002) y similares.

Otra clase de complejo de acuerdo con la invención comprende un vector de transporte de genes y una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente. Hasta la fecha se ha descrito una enorme variedad de vectores de transporte de genes entre los que puede elegir el experto en la técnica dependiendo de la forma de administración que se contemple (ex vivo, intratumoral, sistémica, ...), el tipo de células diana, etc. Los ejemplos no limitantes de vectores de transporte de genes que pueden usarse de acuerdo con la invención son vectores no víricos como por ejemplo liposomas, péptidos que penetran en las células, nanopartículas (como partículas de oro para la administración con una pistola de genes), bacterias (Vassaux et al., 2005) y vectores víricos como por ejemplo MVA (Meseda et al., 2005), adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, lentivirus y similares, que se han descrito abundantemente en la bibliografía científica.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido y/o una molécula de ácido nucleico y/o un complejo y/o células dendríticas genomanipuladas como se describe anteriormente. En particular, los polipéptidos, las moléculas de ácido nucleico, los complejos y células dendríticas de acuerdo con la invención pueden usarse para la preparación de una composición inmunógena para la inmunoterapia contra el cáncer. Estas composiciones son particularmente útiles para la inmunoterapia de tumores que expresan al menos un antígeno que se selecciona a partir del grupo formado por la familia MAGE-A, la familia HER y TERT, especialmente para tratar individuos con HLA-A*0201.

La vacunación o los procedimientos de tratamiento contra el cáncer, que comprenden una etapa de administrar un polipéptido y/o una molécula de ácido nucleico y/o un complejo de acuerdo con la invención, o bien in vivo a un paciente que lo necesite, o ex vivo a células provenientes de dicho paciente, también son parte de la invención, así como la vacunación o procedimientos de tratamiento que comprenden una etapa de administrar células dendríticas genomanipuladas como se describe anteriormente a un individuo.

La invención se ilustra además mediante la siguiente figura y ejemplos.

Leyenda de la figura

Figura 1: Reconocimiento de péptidos nativos cognados mediante CTL murinos inducidos por péptidos crípticos optimizados.

Se derivaron líneas de CTL de esplenocitos de ratones HHD inmunizados contra péptidos crípticos optimizados, como se describe en Materiales y Métodos. Las líneas de CTL se analizaron para determinar la citotoxicidad contra dianas de RMAS/HHD cargadas con un péptido irrelevante (HIVgag76) o con el péptido nativo cognado, a una proporción entre linfocitos y células diana de 10/1.

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Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y Métodos 1.1. Animales

Ratones HHD transgénicos para HLA-A*0201 que han sido descritos en otras fuentes (Pascolo et al., 1997).

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1.2. Células

Células RMAS/HHD que han sido descritos en otras fuentes (Pascolo et al., 1997). Las células T2 tumorales que expresan HLA-A*0201 carecen de TAP1/2. Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 o DMEM suplementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS).

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1.3. Péptidos

Los péptidos fueron sintetizados por Epytop (Nîmes, Francia).

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1.4. Medición de la afinidad relativa y la estabilidad del péptido/HLA-A*0201

El protocolo que se usó para medir la afinidad relativa (RA) se describe en detalle en otros documentos (Tourdot et al., 2000). En resumen, se incubaron células T2 con diversas concentraciones de péptido (0,1-100 \muM) durante 16 h y después se marcaron con mAb BB7,2 para cuantificar la expresión de HLA-A*0201. A cada concentración de péptido, se calculó el marcaje específico de HLA-A*0201 en términos de porcentaje del marcado obtenido con el péptido de referencia HIVpol_{589} (IVGAETFYV) que se usó a 100 \muM. La afinidad relativa se calculó en términos de la concentración de péptido de prueba dividida entre la concentración del péptido de referencia que indujo el 20% de la expresión de HLA-A*0201. Para medir la estabilidad del complejo de péptido y HLA-A*0201, se incubaron células T2 toda la noche con cada péptido a 100 \muM y 37ºC. Después las células se trataron con Brefeldin A durante 1 h, se lavaron, se incubaron a 37ºC durante 0, 2, 4 y 6 horas, y se marcaron con mAb BB7.2. La CD_{50} se definió como el tiempo necesario para una pérdida del 50% de HLA-A*0201, como se ha descrito anteriormente (Tourdot et al., 2000).

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1.5. Generación de CTL en ratones HHD

Se inyectó a ratones HHD por vía subcutánea con 100 \mug de péptidos nonámeros/decámeros, y con 240 \mug de polipéptido emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) más 150 \mug del epítopo de linfocito T cooperador HBVcore_{128} con I-A^{b} restringido. Once días después, se estimularon esplenocitos (5x10^{7} células en 10 ml) de los ratones inmunizados in vitro con péptido (10 \muM) en RPMI 1640 + 10% de FCS durante cinco días. Se establecieron las líneas de CTL mediante reestimulación semanal in vitro con esplenocitos radiados en presencia de concentraciones decrecientes de péptido (1 a 0,1 \muM) y 50 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA).

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1.6. Ensayo de citotoxicidad

Se usaron células péptido murinas como dianas, como se ha descrito en otros documentos (Tourdot et al., 1997). En resumen, se pulsaron 2,5x10^{3} dianas marcadas con ^{51}Cr con péptidos a 37ºC durante 60 min. Después se añadieron células efectoras en 100 \mul de medio y se incubaron a 37ºC durante 4 horas. Después de incubar, se recogieron 100 \mul de sobrenadante y la radioactividad se midió en un contador \gamma. El porcentaje de lisis específica se determinó como: Lisis = (Liberación experimental - Liberación espontánea) / (Liberación máxima - Liberación espontánea) x 100.

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1.7. Análisis de inmunofluorescencia por citometría de flujo

Para el marcado de los tetrámeros, se tiñeron células de los nódulos linfáticos (LN) inguinales y paraaórticos de ratones inmunizados con 15 \mug/ml de tetrámeros HLA-A2/TERT_{988Y}, HLA-A2/MAGE-A_{248V9} y HLA-A2/HER-2/neu_{402Y} acoplados a PE (Proimmune, Oxford, Reino Unido) en presencia de un anticuerpo contra el receptor Fc (clon 2.4 G2) en 20 \mul de PBS, 2% de FCS durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez en PBS, 2% de FCS y después se tiñeron con anticuerpos contra CD44-FITC (clon 1M.178), contra TCR\beta-cicromo (clon H57) y contra CD8\alpha-APC (clon 53.6.7) (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) en 50 \mul de PBS, 2% de FCS durante 30 min a 4ºC. Después las células se lavaron una vez en PBS, 2% de FCS y se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo FACSCalibur® (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE. UU.).

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1.8. Generación de linfocitos CD8 a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

Se recogieron PBMC mediante leucocitaféresis de voluntarios sanos con HLA-A*0201. Las células dendríticas (DC) se produjeron a partir de células adherentes (2x10^{6} células/ml) se cultivaron durante siete días con 500 UI/ml de GM-CSF (Leucomax®, Schering- Plough, Kenilworth, NJ) y 500 UI/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) en medio completo (RPMI 1640 suplementado con 10% de suero AB humano termoinactivado,L-glutamina 2 \muM y antibióticos). El día 7, las DC se pulsaron con péptidos o polipéptidos 10 \muM durante 2 h; los agentes de maduración Poly I:C (Sigma, Oakville, Canadá) a 100 ng/ml, y mAb contra CD40 (clon G28-5, ATCC, Manassas, VA) a 2 \mug/ml se añadieron al cultivo y los DC se incubaron además a 37ºC toda la noche durante hasta 48 horas. Después se radiaron las DC maduras (3500 rad). Los linfocitos CD8+ se purificaron mediante selección positiva con MicroBeads CD8 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los linfocitos CD8^{+} (2x10^{5}) + los linfocitos CD8^{-} (6x10^{4}) se estimularon con 2x10^{4} DC pulsadas con péptido en medio de cultivo completo suplementado con 1000 UI/ml de IL-6 y 5 UI/ml de IL-12 (R&D Systems, Minneapolis, MN) en placas de fondo redondo de 96 pocillos. A partir del día 7, los cultivos se volvieron a estimular semanalmente con DC cargadas con péptido en presencia de 20 UI/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA) y 10 ng/ml de IL-7 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Después de la tercera restimulación, los linfocitos CD8 se analizaron en un ensayo de liberación de IFN-\gamma.

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1.9. Marcado de IFN-\gamma intracelular

Se incubaron linfocitos T (10^{5}) con 2x10^{5} células T2 cargadas con péptido estimulante en presencia de 20 \mug/ml de Brefeldin-A (Sigma, Oakville, Canadá). Seis horas después se lavaron, se tiñeron con anticuerpo contra CD8 conjugado con r-ficoeritrina (Caltag Laboratories, Burlingame, CA) en PBS durante 25 min a 4ºC, se lavaron de nuevo y se fijaron con 4% de PFA. Después las células se permeabilizaron con PBS, 0,5% de BSA, 0,2% de saponina (Sigma, Oakville, Canadá), y se marcaron con un mAb contra IFN\gamma conjugado con aloficocianina (PharMingen, Mississauga, Canadá) durante 25 min a 4ºC antes de analizar con un citómetro de flujo FACSCalibur^{TM} (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

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Ejemplo 2 Capacidad inmunógena de los péptidos usados para generar el polipéptido

Se seleccionaron tres péptidos para incluirlos en el polipéptido. HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} son las variantes optimizadas de los affinity péptidos crípticos con baja afinidad por HLA-A*0201HER-2/neu_{402} y TERT_{988}, que se derivan ellos mismos de los antígenos tumorales ampliamente expresados HER-2/neu y TERT (Scardino et al., 2002). Difieren de los péptidos nativos en la posición 1, donde el resto nativo está sustituido por un Y. Esta sustitución potencia la afinidad de los péptidos crípticos restringidos a HLA-A*0201 (Tourdot et al., 2000). MAGE-A_{248V9} es la variante optimizada de el MAGE-A_{248D9/G9} con baja afinidad por HLA-A*0201 que comparten todas las moléculas MAGE-A. Difiere de los péptidos nativos en la posición 9, donde los aminoácidos D/G son sustituidos por el resto de ancla primaria V. Esta sustitución también potencia la afinidad de HLA-A*0201 (Graff-Dubois et al., 2002).

Los tres péptidos mostraban una elevada afinidad de unión por HLA-A*0201 (RA<5) y formaban complejos estables de HLA/péptido (CD50 > 2 h) (Graff-Dubois et al., 2002; Scardino et al., 2002) (Tabla 1). Como se demostró anteriormente, los tres péptidos eran inmunógenos en ratones ratones HHD transgénicos para HLA-A*0201 (Graff-Dubois et al., 2002; Scardino et al., 2002). Y más importante, las líneas de CTL murinos reconocían específicamente y destruían las dianas RMAS/HHD cargadas con el péptido nativo apropiado (Figura 1).

TABLA 1 Afinidad por HLA-A*0201 de los péptidos MAGE-A_{248V9}, HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y}. ^{1}RA = afinidad relativa; concentración de péptido experimental/concentración de péptido de referencia que indujo 20% de expresión de HLA-A*0201 obtenida con péptido de referencia 100 \muM. Afinidad del péptido de referencia = 1. ^{2}CD_{50}: Disociación del complejo 50: semivida del complejo de HLA/péptido (h)

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Ejemplo 3 Respuestas inmunitarias a la mezcla de péptidos

La forma más simple de estimular una respuesta de CTL poliespecíficos in vivo sería inyectar una mezcla de los péptidos relevantes. Por lo tanto, los inventores examinaron si los ratones HHD vacunados con una mezcla equimolar de péptidos HER-2/neu_{402Y}, TERT_{988Y} y MAGE-A_{248V9} desarrollaban una respuesta poliespecífica in vivo. La respuesta inmunitaria se evaluó midiendo la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos de los péptidos en los nódulos linfáticos que drenaban el sitio de la inyección siete días después de la vacunación, usando tetrámeros específicos. Antes de usar, se validó cada tetrámero con líneas de CTL específicas de péptido como se había descrito anteriormente (Miconnet et al., 2002). Se registró una respuesta positiva cuando el porcentaje de linfocitos CD8 positivos para el tetrámero era superior al porcentaje medio + 3 desviaciones típicas de linfocitos CD8 positivos para el tetrámero en seis ratones sin exposición previa (0,16% para MAGE-A_{248V9}, 0,13% para HER-2/neu_{402Y} y 0,16% para TERT_{988Y}). Se vacunó a ocho ratones con la mezcla de péptidos en dos experimentos independientes (Tabla 2). Ninguno de los ocho ratones respondió de forma simultánea a los tres péptidos. Tres ratones respondieron a un péptido y cinco respondieron a dos péptidos. Las respuestas contra MAGE-A_{248V9} fueron más frecuentes (6/8 ratones) que las respuestas a HER-2/neu_{402Y} (4/8 ratones) o TERT_{988Y} (3/8 ratones).

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TABLA 2 Respuestas de linfocitos T CD8 contra MAGE-A_{248V9}, HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} en ratones individuales inmunizados con una mezcla equimolar de péptidos. "+": el porcentaje de linfocitos T CD8 positivos para el tetrámero estaba entre una y dos veces el corte, tal como se define en Materiales y Métodos (0,16% para MAGE-A_{248v9}, 0,13% para HER-2/neu_{402Y}, y 0,16% para TERT_{988Y}). "++": el porcentaje de linfocitos T CD8 positivos para el tetrámero era más del doble del corte

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La incapacidad de la mezcla de péptidos de estimular una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8 se confirmó in vitro con células humanas. Se estimularon PBMC de tres donantes con HLA-A*0201 in vitro con una mezcla de MAGE-A_{248V9}, HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} y, después de cuatro ciclos de reestimulación, se analizaron para determinar su capacidad de reconocer y de ser activados por células estimuladoras cargadas con cada péptido. La activación de los PBMC se evaluó midiendo el porcentaje de linfocitos CD8 que producía IFN\gamma mediante de marcado intracelular. Se registró una respuesta positiva cuando el porcentaje de PBMC activados fue al menos dos veces la obtenida con un péptido irrelevante. Ninguno de los tres donantes desarrolló una respuesta específica de linfocitos T CD8 contra los tres péptidos (Tabla 3). El donante n.º D5725 respondió a MAGE-A_{248V9}/HER-2/neu_{402Y}, el donante n.º D7241 respondió a HER-2/neu_{402Y}, y el donante n.º D7225 respondió a MAGE-A_{248V9}/TERT_{988Y}.

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TABLA 3 Linfocitos T CD8 específicos de péptido inducidos por la estimulación de PBMC de donantes sanos con la mezcla de péptidos. Se generaron linfocitos T CD8 específicos de péptido mediante la estimulación in vitro de PBMC de tres donantes sanos con una mezcla equimolar de péptidos MAGE-A_{248V9}, HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y}. La especificidad de los linfocitos T CD8 inducidos se evaluó midiendo el % de linfocitos CD8 que producía IFN\gamma después de la estimulación con las células T2 cargadas con péptido como se ha descrito en Materiales y Métodos. Los valores de más del doble del valor del control negativo, que indican una respuesta positiva, se muestran en negrita

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Estos resultados demostraron que la vacunación una simple mezcla de péptidos inmunógenos no generó una respuesta poliespecífica.

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Ejemplo 4 Capacidad inmunógena de los polipéptidos

Los inventores después examinaron si la vacunación con polipéptidos compuestos por MAGE-A_{248V9},
HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} provocaba una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+. Primero se optimizó el polipéptido tomando en cuenta el procesamiento de cada péptido en su posición del extremo C y la generación de péptidos unidos con afinidad elevada por HLA-A*0201. El procesamiento en la posición del extremo C se evaluó usando dos modelos predictivos online de escisión con proteasomas (Netchop: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/, PAProc: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) (Kesmir et al., 2002; Kuttler et al., 2000; Nussbaum et al., 2001). Se consideró arbitrariamente que un péptido estaba procesado si ambos modelos predecían su escisión. La afinidad de los nuevos péptidos unidos se evaluó usando el modelo predictivo su Bimas (Parker et al., 1994). Seis variantes de polipéptidos, denominadas Poli-1 a Poli-6, englobaba todas las posibles disposiciones de los péptidos (Tabla 4). Ninguna de las seis variantes estaba asociada a la escisión de los tres péptidos en los modelos predictivos (Tabla 5). Además, Poli-1, Poli-3, Poli-4 y Poli-5 generaron péptidos unidos con puntuaciones predictivas elevadas de unión a HLA-A*0201 (Tabla 4). Uno de estos péptidos (YLYLQVNSL; Poli-1 y -3) correspondía a un péptido autólogo derivado de la región de la cadena pesada variable de inmunoglobulina humana.

TABLA 4 Análisis informático de seis posibles variantes de polipéptidos: generación de péptidos unidos con una elevada afinidad por HLA-A*0201 prevista

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TABLA 5 Análisis informático de seis posibles variantes de polipéptidos: predicción de posiciones de escisión por proteasomas en las seis posibles configuraciones de los polipéptidos. a: Para Paproc. (|) simboliza una baja probabilidad de escisión. b: Para Netchopp, el umbral se fijó a 0,5 y la red empleada fue: "Extremo C 1.0. Extremo C 2.0 y 20S". c: Se requirió predicción de la escisión por ambos modelos para considerar que un péptido sería procesado

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Dado que esta estrategia predictiva no consiguió identificar la variante de polipéptido con la mayor eficacia teórica, las variantes se analizaron experimentalmente para determinar su capacidad de generar una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8 in vivo (ratones HHD) e in vitro (donante sano con HLA-A*0201).

Se vacunó a los ratones HHD con cada polipéptido, y se identificaron los linfocitos T CD8 específicos para los péptidos individuales drenando los nódulos linfáticos usando tetrámeros específicos. Las seis variantes de polipéptidos fueron inmunógenas en los ratones HHD (es decir, generaron una respuesta contra al menos un péptido) pero la frecuencia de los ratones que respondía difería entre variantes. Las variantes más inmunógenas fueron Poli-1, Poli-3 y Poli-6, con 100%, 87% y 83% de ratones que respondían, respectivamente (Tabla 6). Poli-2, Poli-4 y Poli-5 indujeron una respuesta respectivamente en 57%, 62% y 62% de los ratones vacunados. La frecuencia de respuestas potentes (% de linfocitos CD8 positivos para el tetrámero de al menos el doble del corte; indicado con ++) fue mayor con Poli-6 (41% de todas las respuestas), Poli-3 (30% de todas las respuestas) y Poli-1 (25% de todas las respuestas). Las respuestas se dirigían contra MAGE-A_{248V9} en 74% de los ratones que respondían, HER-2/neu_{402Y} en 71% y TERT_{988Y} en 55%. El análisis de las respuestas inmunitarias en ratones individuales mostró que Poli-6 indujo una respuesta triespecífica en 67% de los ratones vacunados, seguido de Poli-4 (37,5%), Poli-1 (28,5%), Poli-5 (25%) y Poli-3 (12,5%). Poli-2 no indujo una respuesta triespecífica en ningún ratón.

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Tabla 6: Respuesta de linfocitos T CD8 contra MAGE-A_{248V9}, HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} en ratones individuales inmunizado con los diferentes polipéptidos. La respuesta inmunitaria se evaluó midiendo el % de los linfocitos T CD8 positivos para el tetrámero de los nódulos linfáticos de drenaje en los ratones vacunados. "-": porcentaje de linfocitos T CD8 positivos para el tetrámero inferior al corte, como se define en Materiales y Métodos (0,16% para MAGE-A_{248V9}, 0,13 para HER-2/neu_{402Y} y 0,16% para TERT_{988Y}). "+": porcentaje una a dos veces superior al corte. "++": porcentaje más de dos veces el corte. Las líneas sombreadas corresponden a los ratones que respondieron a los tres péptidos.

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Estos resultados se confirmaron con células humanas in vitro. Cada polipéptido (excepto Poli-2, que era muy poco inmunógeno en los ratones HHD) se analizó con células de dos a cinco donantes sanos. Las respuestas inmunitarias in vitro se evaluaron midiendo el porcentaje de linfocitos CD8 que producían IFN\gamma \beta después de la activación específica con péptidos. Los cinco polipéptidos estimularon los linfocitos T para que respondieran a al menos un péptido en 80% a 100% de los donantes. Sin embargo, sólo Poli-6 y Poli-1 indujeron respuestas triespecíficas en los CTL. Poli-6 indujo respuestas contra los tres péptidos en 80% de donantes, comparado con solo el 25% de donantes con Poli-1 (Tabla 7). Poli-6 también provocó las respuestas más potentes (contra MAGE-A_{248V9} en los donantes n.º D7017 y n.º D7225; y contra HER-2/neu_{402Y} en el donante n.º D7744).

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Tabla 7: Linfocitos T CD8 específicos de péptido inducidos por la estimulación con polipéptido de PBMC de donante humano sano. Se generaron linfocitos T CD8 específicos de péptido mediante la estimulación in vitro de PBMC de donantes sanos con los diferentes polipéptidos. Se evaluó la especificidad de los linfocitos CD8 inducidos midiendo el % de linfocitos CD8 que producía IFN\gamma tras la estimulación con células T2 cargadas con péptido como se ha descrito en Materiales y Métodos. "-": % de células positivas para IFN\gamma menos de 2 veces superior al control negativo (péptido irrelevante). "+": % de células positivas para IFN\gamma 2 veces superior al control negativo. "++": % de células positivas para IFN\gamma 2 a 10 veces superior al control negativo. "+++": % de células positivas para IFN\gamma m\alphas diez veces el control negativo. Las líneas sombreadas corresponden a las células de donante que respondían a los tres péptidos.

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Juntos estos resultados mostraron que Poli-6 indujo unas respuestas triespecíficas de linfocitos T CD8 frecuentes y potentes tanto in vivo (ratones HHD) como in vitro (PBMC humanos).

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Descripción

Este estudio de polipéptidos compuestos por tres péptidos crípticos optimizados restringidos a HLA-A*0201 derivados de los antígenos tumorales universales hTERT, HER-2/neu y MAGE-A identificó un polipéptido, denominado Poli-6 (SEC ID N.º: 2), que indujo una respuesta de CTL contra los tres péptidos componentes tanto en ratones HHD transgénicos que expresaban en HLA-A*0201 como en células de donante humano sano.

Existe un amplio consenso sobre la influencia de la organización de los polipéptidos (estructuración del péptido, adición de espaciadores), que de forma ideal debería permitir la escisión apropiada de todos los péptidos componentes y evitar la creación de nuevos péptidos unidos con gran afinidad por la molécula de HLA relevante. Varios estudios han demostrado que la presencia de espaciadores entre los péptidos aumenta la eficacia de la vacuna al promover la escisión de los péptidos individuales (Livingston et al., 2002; Velders et al., 2001; Wang et al., 2004). Es más, Ishioka et al. encontraron que la posición de un péptido dentro de un polipéptido puede afectar a su capacidad inmunógena. Esto subraya la importancia de la configuración global del poliepítopo (Ishioka et al., 1999). Los presentes resultados apoyan estos hallazgos, ya que uno de las seis estructuras polipeptídicas que se analizaron era muy inmunógena, mientras que otra era mínimamente eficaz. Esta es la primera demostración directa de que la organización del polipéptido debe optimizarse para obtener una capacidad inmunógena máxima. Estos resultados también muestran que esta organización óptima no puede preverse usando los actuales modelos predictivos de escisión de proteasomas. De hecho, no se predijo que ninguno de los seis polipéptidos candidatos fuera escindido de una forma más eficiente que los otros. Además, Poli-2, que no pudo provocar una respuesta poliespecífica, no generó péptidos unidos que se predijera que tenían una afinidad elevada por HLA-A*0201 en el sistema de modelo de Bimas.

Los inventores también encontraron que la vacunación con una mezcla de los tres péptidos era mucho menos eficaz que la vacunación con polipéptidos para provocar una respuesta poliespecífica. De forma interesante, las células de donante humano D7225 respondió a los tres péptidos después de la estimulación con Poli-6 ex vivo, pero solo a HER-2/neu_{402Y} después de la estimulación con la mezcla de péptidos. El uso de péptidos exógenos tiene el inconveniente de que el número de complejos de péptido y MHC I decae con la misma cinética que la concentración de péptido exógeno (Wang et al., 2004). La corta semivida de estos complejos provocaría una notable pérdida en la eficacia de la sensibilización (Gett et al., 2003). Por el contrario, la presentación cruzada de péptidos largos mediante APC podría asegurar una fuente endógena de péptidos con cinética más lenta y más mantenida. Se ha demostrado que esta estrategia
de péptidos largos es más inmunógena que el uso de los péptidos cortos correspondientes (Zwaveling et al., 2002).

Como se ha demostrado anteriormente, el polipéptido Poli-6 de la SEC ID N.º: 2, que está compuesto por tres péptidos tumorales crípticos optimizados derivados de antígenos tumorales universales (HER-2/neu_{402Y}, TERT_{988Y} y MAGE-1A_{248V9}), induce una respuesta poliespecífica en los ratones HHD que expresan HLA-A*0201y en células humanas ex vivo. Este polipéptido tiene potencial de vacunación antitumoral de amplio espectro para los pacientes de cáncer.

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<110> VAXON BIOTECH

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<120> POLIPÉPTIDO INMUNÓGENO COMPUESTO POR PÉPTIDOS CRÍPTICOS OPTIMIZADOS DERIVADOS DE ANTÍGENOS TUMORALES

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Y SUS USOS

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<130> VMA/bv1788-2

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<170> PatentIn version 3.3

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<223> Poli-6 con espaciadores

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

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<223> Poli-4

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<211> 28

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Poli-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TERT988Y

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MAGE-A248V9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HER-2/neu402Y

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HER-2/neu402Y

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> epítopo de unión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> epítopo de unión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> epítopo de unión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> epítopo de unión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

26

Claims

1. Un polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia YLQVNSLQTVX_{1}X_{2}X_{3}YLEYRQVPVX_{1}X_{2}X_{3}
YLEEITGYL (SEC ID N.º: 1), en el que los epítopos TERT_{988Y} (SEC ID N.º: 8), MAGE-A_{248V9} (SEC ID N.º: 9), y HER-2/neu_{402Y} (SEC ID N.º: 10) están separados mediante espaciadores X_{1}X_{2}X_{3}, en los que X_{1}, X_{2} y X_{3} son cualquier aminoácido o ninguno.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende una secuencia de señalización de translocación al retículo endoplasmático en su extremo N.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende ubicuitina en su extremo C.

4. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que X_{1} = X_{2} = X_{3} = ninguno.

5. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que X_{1} = X_{2} = A y X_{3} = Y.

6. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque induce una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+ contra TERT_{988Y}, MAGE-A_{248V9}, y HER-2/neu_{402Y} en la mayoría de los ratones HHD vacunados con dicho polipéptido.

7. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque induce una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+ contra TERT_{988Y}, MAGE-A_{248V9}, y HER-2/neu_{402Y} en un ensayo in vitro con PBMC humanos de donantes sanos con HLAA* 0201.

8. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+ se obtiene con PBMC de la mayoría, preferiblemente al menos 70% de los donantes sanos con HLA-A*0201.

9. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, que es un vector de expresión.

11. Una célula dendrítica aislada cargada con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o transducida con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10.

12. Un complejo que comprende un vector de transporte de péptidos y un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Un complejo que comprende un vector de transporte de genes y una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9.

14. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y/o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, y/o una célula dendrítica de acuerdo con la reivindicación 11, y/o un complejo de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13.

15. Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y/o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, y/o una célula dendrítica de acuerdo con la reivindicación 11, y/o un complejo de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, para la preparación de una composición inmunógena para la inmunoterapia contra el cáncer.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha composición está destinada para la inmunoterapia de tumores que expresan al menos un antígeno que se selecciona a partir del grupo formado por la familia MAGE-A, la familia HER y TERT.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que dicha composición está destinada a tratar individuos con HLA-A*0201.