ES2330187T3 - Matrices proteicas modificadas por factor de crecimiento para ingenieria de tejidos. - Google Patents
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Abstract
Una matriz reticulada adecuada para crecimiento o crecimiento invasivo celular, en la que al menos un injerto de proteína o polisacárido modificado por ingeniería se une covalentemente o iónicamente a la matriz, en la que el injerto de proteína o polisacárido modificado por ingeniería comprende un primer dominio que comprende un factor bioactivo o un polisacárido, un segundo dominio, en el que el injerto de proteína o polisacárido modificado por ingeniería está unido a la matriz por el segundo dominio y un sitio de degradación enzimática o hidrolítica entre el primer domino y el segundo dominio.
Description
Matrices proteicas modificadas por factor de
crecimiento para ingeniería de tejidos.
La invención se refiere al uso de matrices que
contienen moléculas farmacéuticamente activas, que incluyen
proteínas de fusión de moléculas farmacéuticamente activas,
particularmente factores de crecimiento, mediante el uso de
interacciones de unión por afinidad, para el uso en la reparación o
regeneración tisular y/o la liberación controlada de las moléculas
farmacéuticamente activas.
Para la reparación o regeneración tisular, las
células tienen que migrar a un lecho de herida, proliferar,
expresar componentes de matriz o formar matriz extracelular y formar
una conformación final de tejido. Con frecuencia tienen que
participar múltiples poblaciones celulares en esta respuesta
morfogénica, que incluye frecuentemente células vasculares y
nerviosas. Se ha demostrado que las matrices mejoran en gran medida
y, en algunos casos, se ha observado que son esenciales para que
esto tenga lugar. Las matrices de crecimiento invasivo de células
naturales están sometidas a remodelación por influencias celulares,
todas basadas en proteólisis, por ejemplo, por plasmina (que
degrada fibrina) y metaloproteinasas de matriz (que degradan
colágeno, elastina, etc.). Tal degradación está altamente
localizada y tiene lugar solamente después del contacto directo con
la célula en migración. Además, el suministro de proteínas de
señalización celular específicas tales como factores de crecimiento
está regulado firmemente. En el modelo natural, no se usan matrices
macroporosas de crecimiento invasivo de células, sino más bien
matrices microporosas que las células pueden degradar, localmente y
a demanda, cuando las células migran al interior de la matriz.
Previamente se han diseñado dispositivos de
suministro controlado para factores de crecimiento basándose en el
uso de heparina inmovilizada para secuestrar el factor de
crecimiento de alguna forma. Por ejemplo, Edelman et al. han
usado perlas de SEPHAROSE^{TM} conjugadas con heparina dentro de
alginato. Las perlas sirven como depósitos que liberan factor de
crecimiento de fibroblastos básico ("bFGF") lentamente
basándose en la unión y disociación de bFGF con heparina.
Se ha demostrado que los péptidos
bi-dominio, que contienen una secuencia de sustrato
de factor XIIIa y una secuencia de péptido bioactivo, se pueden
reticular en geles de fibrina y que este péptido bioactivo conserva
su actividad celular in vitro (Schense, J.C., et al.
(1999) Bioconj. Chem. 10: 75-81). Aunque los
péptidos pueden imitar parcialmente la bioactividad de la proteína
completa de la que se obtienen, esta bioactividad habitualmente es
menor que la bioactividad de la proteína completa y, en ocasiones,
es imposible imitar ciertas proteínas con solamente un péptido
corto. Por lo tanto, sería deseable ser capaz de incorporar en la
matriz la proteína entera, tal como un factor de crecimiento u otra
molécula farmacéuticamente activa. El documento WO 98/43686
describe proteínas de fusión que contienen un dominio de sustrato de
transglutaminasa tal como factor XIII, un dominio de sustrato y un
factor bioactivo. Estos péptidos están unidos covalentemente a un
sustrato de fibrina que tiene una estructura tridimensional capaz de
soportar el crecimiento celular y los materiales resultantes son
útiles en la promoción de crecimiento celular, cicatrización y
regeneración tisular.
Aunque existen y se conocen sistemas de
suministro para proteínas y factores de crecimiento, sigue habiendo
una necesidad de una matriz para el uso en reparación tisular que
promueva la migración celular y el crecimiento invasivo de tejido
al interior de la matriz mediante el control de la presentación y
liberación del factor de crecimiento a las células en migración y
el control de los sitios de adhesión celular. La necesidad es
particularmente grande para tales matrices de crecimiento invasivo
que podrían presentar localmente factores de crecimiento y
conservar su influencia y actividad localmente, a través de
interacciones de afinidad con la matriz, como tiene lugar en la
naturaleza.
Por lo tanto, es un objeto de la presente
invención proporcionar matrices naturales, biodegradables para la
reparación, regeneración y remodelación tisular que tengan
incorporadas en las mismas factores de crecimiento que conservan la
actividad de las moléculas de factor de crecimiento intactas.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar matrices naturales, biodegradables para la liberación
controlada y/o sostenida de factores de crecimiento.
El asunto de la presente invención es una matriz
reticulada adecuada para crecimiento celular o crecimiento invasivo
de acuerdo con la reivindicación 1, un método para preparar una
matriz de acuerdo con la reivindicación 16, un injerto de proteína
o polisacárido modificado por ingeniería de acuerdo con la
reivindicación 25 y la matriz de la presente invención para la
reparación, regeneración o remodelación de tejidos y/o liberación
de factores bioactivos.
Las realizaciones de la presente invención se
reivindican en las respectivas reivindicaciones dependientes.
Las proteínas se incorporan en matrices
poliméricas de proteína o polisacárido o geles para uso en
reparación, regeneración y/o remodelación tisular y/o suministro de
fármacos. Generalmente, las proteínas se pueden incorporar de tal
forma que se liberan por degradación de la matriz, por acción
enzimática y/o difusión. La presente invención se refiere a la
liberación por degradación enzimática o hidrolítica. Como se
demuestra por los ejemplos, un método es unir heparina a la matriz
por métodos covalentes o no covalentes, para formar una
heparina-matriz. La heparina une entonces de manera
no covalente factores de crecimiento que se unen a heparina a la
matriz de proteína. Si la proteína a unir no contiene una secuencia
de unión a heparina nativa, se puede construir una proteína de
fusión que contenga la secuencia de proteína nativa y un dominio de
unión a heparina sintético. De acuerdo con la invención se
construye una proteína de fusión que contiene una región o regiones
reticulables y la secuencia de proteína nativa y esta proteína de
fusión se puede secuestrar por reticulación de la misma para formar
una matriz. El dominio de proteína o péptido de fusión contiene un
enlace degradable que contiene sitios de escisión hidrolítica o
enzimática. Esto permite variar la velocidad de suministro en
diferentes localizaciones dentro de la matriz dependiendo de la
actividad celular en esa localización y/o dentro de la matriz. Esta
estrategia puede ser particularmente útil cuando se desee suministro
de fármaco a largo plazo, por ejemplo, en el caso de regeneración
de nervios, donde es deseable variar la velocidad de liberación de
fármaco espacialmente como una función de regeneración, por ejemplo,
rápidamente cerca de la interfaz de tejido vivo y más lentamente
más hacia el interior de la zona de lesión. Los beneficios
adicionales incluyen la menor dosis de fármaco total dentro del
sistema de suministro y la regulación espacial de la liberación que
permite que se libere un mayor porcentaje del fármaco en el momento
de la mayor actividad celular. Los ejemplos demuestran proporciones
o niveles optimizados de factor de crecimiento, dominio de unión a
heparina y heparina o péptido de unión a heparina secuestrados
dentro de la matriz que induce óptimamente el crecimiento invasivo
del células y regeneración tisular.
La Figura 1 es un cromatograma de detección de
fluorescencia de geles de fibrina que contienen péptido degradado
por plasmina y sin péptido. Se muestra la cromatografía por
exclusión de tamaño de un gel de fibrina degradado con el péptido
\alpha_{2}PI_{1-7}-ATIII_{121-134}
incorporado, añadiéndose el mismo péptido libre al gel de fibrina
degradado que contiene péptido incorporado y péptido libre solo. El
resto de leucina N-terminal está dansilado
(abreviado dL). El péptido libre eluyó en tiempos más prolongados,
que se corresponden a un peso molecular menor, de lo que lo hizo el
péptido incorporado en el gel de fibrina durante la coagulación,
demostrando la unión covalente a fibrina degradada y, por tanto,
incorporación covalente por la acción de la actividad del factor
XIIIa.
La Figura 2 es un gráfico del efecto del bFGF
unido a matriz sobre la extensión de neurita de DRG a las 48 h. Se
muestran los valores medios y la desviación típica de la media. (*
indica p<0,05 en comparación con fibrina no modificada).
La Figura 3 es un gráfico del efecto de
proteínas de fusión de \beta-NGF inmovilizadas
sobre la extensión de neurita de DRG dentro de matrices de fibrina.
Se muestran los valores medios y el error típico de la media.
\blacksquare indica NGF nativo. \blacklozenge indica
TG-P-NGF. \bullet indica
TG-P_{i}-NGF. * indica p<0,0001
frente a fibrina no modificada con NGF en el medio de cultivo. Este
resultado demuestra que el \beta-NGF unido a
matriz mejora la extensión de neurita mediante matrices de fibrina
frente a la misma concentración de NGF en el medio.
La Figura 4 es un gráfico de la cantidad de
incorporación de proteína de fusión de \beta-NGF
con sustrato de factor XIIIa exógeno en matrices de fibrina,
cuantificada por ELISA directo, mediante el uso de
\beta-NGF marcado con biotina. La eficacia de
incorporación de la proteína de fusión de
\beta-NGF era relativamente constante a lo largo
del intervalo de concentraciones ensayado.
La Figura 5 es un gráfico de la incorporación de
dLNQEQVSPLRGD (SEC ID Nº: 1) en geles de fibrina con Factor XIII
exógeno añadido. Cuando se añadió 1 U/ml, el nivel de incorporación
aumentó de tal forma que se pudo conseguir más de 25 mol de
péptido/mol de fibrinógeno.
La Figura 6 es un gráfico de la incorporación
del péptido bi-dominio, dLNQEQVSPLRGD (SEC ID Nº: 1)
en adhesivo de fibrina no diluido. Se ensayaron tres kits separados
y en cada caso se pudo observar un alto nivel de incorporación, que
alcanzaba 25 mol de péptido/mol de fibrinógeno. La concentración de
péptido exógeno requerida para la incorporación máxima fue al menos
5 mM, posiblemente debido a limitaciones de difusión dentro de la
matriz de fibrina altamente densa que se crea. El nivel de
incorporación fue muy uniforme, proporcionando cada kit un perfil
de incorporación similar.
Como se describe en ese documento, se ha
desarrollado un método para mejorar la reparación, regeneración o
remodelación tisular, mediante el uso de matrices naturales que
tienen factores de crecimiento incorporados en la misma de forma
que se pueden liberar. Existen varias ventajas con respecto a las
matrices de la técnica anterior: las matrices naturales son
biocompatibles y biodegradables y se pueden formar in vitro o
in vivo (no se reivindica la formación in vivo), en
el momento del implante; se pueden incorporar proteínas de factor
de crecimiento de longitud completa y pueden conservar la
bioactividad completa; los factores de crecimiento se pueden
incorporar de forma que se pueden liberar, mediante el uso de
técnicas que proporcionan control sobre cómo y cuándo y hasta qué
grado se liberan los factores de crecimiento, de tal forma que se
puede usar la matriz para la reparación tisular directamente o
indirectamente, mediante el uso de la matriz como un vehículo de
liberación controlada.
La matriz se forma reticulando iónicamente,
covalentemente o por combinaciones de los mismos uno o más
materiales poliméricos para formar una matriz polimérica que tenga
suficiente separación inter-polimérica para permitir
el crecimiento invasivo o la migración al interior de la matriz de
las células.
En la realización preferida, la matriz está
formada por proteínas, más preferiblemente proteínas presentes de
forma natural en el paciente en el que se va a implantar la matriz.
La proteína más preferida es fibrina, aunque también se pueden usar
otras proteínas tales como colágeno y gelatina. También se pueden
usar polisacáridos y glucoproteínas. En algunas realizaciones,
también es posible usar polímeros sintéticos que se pueden reticular
por unión iónica o covalente.
El material de matriz preferiblemente es
biodegradable por enzimas presentes de forma natural. La velocidad
de degradación se puede manipular por el grado de reticulación y la
inclusión de inhibidores de proteasa en la matriz.
Las proteínas que forman la matriz se pueden
modificar mediante inclusión de enlaces degradables. Típicamente,
estos serán sitios de escisión enzimática, tales como el sitio para
escisión por trombina. Además, las proteínas de fusión o quimeras
peptídicas, que se reticulan hasta geles de fibrina, se modifican
adicionalmente para contener un sitio degradable entre el sitio de
unión (es decir, un sustrato de factor XIIIa o domino de unión a
heparina) y la proteína bioactiva (es decir, factor de crecimiento o
enzima). Estos sitios pueden ser degradables por hidrólisis no
específica (es decir, un enlace éster) o pueden ser sustratos para
degradación enzimática específica (degradación proteolítica o de
polisacáridos). Estos sitios degradables permiten la modificación
por ingeniería de más liberación específica de factor bioactivo de
geles de fibrina. Por ejemplo, la degradación basada en actividad
enzimática permite controlar la liberación de factores bioactivos
por un proceso celular en lugar de por difusión del factor a través
del gel.
Los sitios de degradación permiten que se libere
el factor bioactivo con poca o ninguna modificación en la secuencia
de proteína primaria, lo que puede dar como resultado mayor
actividad del factor. Además, permite controlar la liberación del
factor por procesos específicos celulares, tales como proteólisis
localizada, en lugar de difusión de algunos materiales porosos.
Esto permite liberar factores a diferentes velocidades dentro del
mismo material dependiendo de la localización de células dentro del
material. La actividad proteolítica específica celular es vital en
aplicaciones tales como regeneración de nervios, que tiene lugar a
lo largo de largos periodos de tiempo. Esto también reduce la
cantidad de factor de crecimiento total necesario, ya que su
liberación está controlada por procesos celulares. La conservación
de factor de crecimiento y su biodisponibilidad son distintas
ventajas de aprovechar la actividad proteolítica específica celular
con respecto al uso de dispositivos de liberación controlada de
difusión que dan como resultado característicamente la pérdida de
una cantidad significativa de factor bioactivo en una liberación
explosiva inicial.
Las enzimas que se podrían usar para degradación
proteolítica son numerosas. Los sitios degradables proteolíticamente
podrían incluir sustratos para colagenasa, plasmina, elastasa,
estromelisina o activadores de plasminógeno. Los sustratos
ilustrativos se enumeran a continuación. P1-P5
indican las posiciones de aminoácidos 1-5 hacia el
extremo amino de la proteína desde el sitio en el que tiene lugar la
proteólisis. P1'-P4' indican las posiciones de
aminoácidos 1-4 hacia el extremo carboxi de la
proteína desde el sitio en el que tiene lugar la proteólisis.
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(Tabla pasa a página
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Sustratos de Polisacárido: La degradación
enzimática puede tener lugar con sustratos de polisacáridos para
enzimas tales como heparinasa, heparitinasa y condrotitinasa ABC.
Cada una de estas enzimas tiene sustratos de polisacáridos. Debido
a la presencia de heparina en todos los sistemas de unión a
heparina, el sustrato para heparinasa ya está incorporado en estos
sistemas.
Sustratos proteolíticos: Se podría añadir
sustrato proteolítico durante la síntesis peptídica de la quimera
peptídica o la quimera de heparina-péptido. La
quimera de péptido de unión a heparina se podría modificar para
contener una secuencia de degradación proteolítica insertando un
sustrato de proteasa, tal como uno de los de plasmina que se han
descrito anteriormente, entre el sustrato de factor XIIIa y el
dominio de unión a heparina. La quimera de
heparina-péptido se podría modificar para contener
una secuencia de degradación proteolítica insertando un sustrato de
proteasa, tal como uno de los de plasmina que se han descrito
anteriormente, entre el sustrato de factor XIIIa y el domino de
heparina. Se podría usar un sustrato con una alta K_{m} y una
baja k_{cat} para ralentizar la escisión mientras que se ocupan
sitios activos de la proteasa. Los sustratos de escisión diferentes
a los de plasmina también se podrían usar para permitir que la
liberación de los factores bioactivos sea independiente de la
degradación de matriz.
Oligo-ésteres: Asimismo se podría
insertar un domino de oligo-éster entre el sustrato de factor XIIIa
y el domino de unión a heparina o el dominio de heparina de la
quimera durante el paso de síntesis peptídica. Esto se podría
conseguir mediante el uso de un oligo-éster tales como oligómeros de
ácido láctico.
El sustrato de degradación no enzimática puede
consistir en cualquier enlace que se someta a hidrólisis por un
mecanismo catalizado por ácido o base. Estos sustratos pueden
incluir oligo-ésteres tales como oligómeros de ácido láctico o
glicólico. La velocidad de degradación de estos materiales se puede
controlar mediante la elección de oligómero.
La matriz se puede modificar mediante la
inclusión de heparina y/o fragmentos de unión a heparina, que se
unen directamente o indirectamente a proteínas que se unen a
heparina. En el último caso, el péptido se puede unir a heparina,
que después está disponible para unirse a factores que incluyen un
sitio de unión a heparina, o el propio péptido puede contener una
porción de heparina que está unida por ciertos factores de
crecimiento de unión a heparina. Los mismos se pueden unir al
material de matriz mediante el uso de técnicas convencionales, como
se analiza con más detalle a continuación.
En una realización preferida, la heparina se une
a geles de fibrina no covalentemente usando un sistema de dos
partes que consiste en una quimera peptídica y la propia heparina.
La quimera peptídica consiste en dos dominios, un sustrato de
factor XIIIa y un domino de unión a polisacárido. Una vez que la
quimera peptídica se ha reticulado en el gel de fibrina, se une a
la heparina (u otros polisacáridos) por interacciones no
covalentes.
Se ha observado que numerosas proteínas tienen
afinidad de unión a heparina. Algunas de estas proteínas y las
secuencias de sus dominios de unión a heparina se enumeran más
adelante en la Tabla 2. Éstas también se analizan en la sección
relacionada con factores bioactivos que se pueden suministrar por la
matriz polimérica.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Muchos factores de crecimiento que están
implicados en la morfogénesis, tanto en el organismo en desarrollo
como en el adulto, se unen a moléculas de matriz extracelular. Esta
afinidad proporciona un modo de acción local del morfógeno,
evitando influencias dístales incontroladas. La principal
interacción de afinidad de matriz que está implicada en esta
localización de influencia es para heparina y proteoglucanos de
sulfato de heparina. Los factores de crecimiento que se unen a
heparina incluyen la superfamilia del factor de crecimiento
transformante ("TGF")-beta (que incluye las
proteínas morfogénicas óseas, "BMP"), la familia del factor de
crecimiento de fibroblastos ("FGF") y el factor de crecimiento
epitelial vascular ("VEGF"), entre otros. En general, un
factor de crecimiento que se considera que se une a heparina eluirá
de una columna de afinidad de heparina a concentraciones de NaCl
por encima de niveles fisiológicos (superiores o iguales a 140 mM).
Los factores de crecimiento de "unión a heparina" adicionales
incluyen interleucina-8,
neurotrofina-6, factor de crecimiento epidérmico de
unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de
crecimiento de tejido conectivo, midquina y molécula asociada a
crecimiento de unión a heparina. Se ha demostrado que estos
factores de crecimiento regulan la reparación tisular.
Los dominios de unión a heparina tienen lugar de
forma natural en muchas familias diferentes de factores de
crecimiento. Una de estas familias con uno o más miembros que se
unen a heparina son los factores de crecimiento de fibroblastos
(Presta, M., et al., (1992). Biochemical and Biophysical
Research Communications. 185: 1098-1107). Los
factores de crecimiento adicionales que se unen a heparina incluyen
el factor de crecimiento transformante, factor morfogénico óseo,
interleucina-8, neurotrofina-6,
factor de crecimiento de células endoteliales vasculares, factor de
crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de
hepatocitos, factor de crecimiento de tejido conectivo, midquina y
molécula asociada a crecimiento de unión a heparina (Götz, R., et
al, (1994). Nature. 372: 266-269; Kaneda, N.,
et al, (1996) J. Biochem. 119: 1150-1156;
Kiguchi, K., et al, (1998) Mol. Carcinogensis. 22:
73-83; Kinosaki, M., et al, (1998). Biochim.
Biophys. Acta. 1384: 93-102; McCaffrey, T., et
al, (1992) J. Cell. Physiol. 152: 430-440; Nolo,
R., et al, (1996) Eur. J. Neurosci. 8:
1658-1665; Spillmann, D., et al, (1998).
Journal of Biological Chemistry. 273: 15487-15493;
Steffen, C., et al, (1998); Growth Factors.
15:199-213.
Tessler, S., et al, (1994) J. Biol. Chem.
269: 12456-12461). Estos factores han mostrado el
potencial de mejorar la cicatrización en muchos tipos diferentes de
tejido que incluyen vasculatura, piel, nervios e hígado. Por lo
tanto, estos materiales se pueden usar para mejorar la cicatrización
en muchas partes diferentes del cuerpo seleccionando el factor de
crecimiento apropiado.
En la realización preferida para la
incorporación de un factor de crecimiento u otra proteína bioactiva
dentro de la matriz, la matriz está formada por fibrina y las
moléculas exógenas incluyen un sustrato que se incorporará dentro
de la fibrina durante la coagulación. Los péptidos exógenos de
acuerdo con la invención están diseñados para incluir dos dominios,
un dominio que es un sustrato para una enzima de reticulación tal
como XIIIa. El factor XIIIa es una transglutaminasa que es activa
durante la coagulación. Esta enzima, formada de manera natural a
partir del factor XIII mediante escisión por trombina, funciona
uniendo cadenas de fibrina entre sí por enlaces amida, formados
entre cadenas laterales de glutamina y cadenas laterales de lisina.
La enzima también funciona uniendo otras proteínas a fibrina
durante la coagulación, por ejemplo, el inhibidor de la proteína
alfa 2 plasmina. Se ha demostrado que el dominio
N-terminal de esta proteína, específicamente la
secuencia NQEQVSP (SEC ID Nº: 20) funciona como un sustrato eficaz
para el factor XIIIa. Después, se puede seleccionar un dominio
adicional de este péptido para que sea un factor bioactivo, tal como
un péptido, o una proteína o un polisacárido
(Sakiyama-Elbert, et al, (2000) J. Controlled
Release 65: 389-402) y en este documento. Como tal,
se pueden incorporar factores bioactivos exógenos dentro de la
fibrina durante la coagulación por un sustrato de factor XIIIa.
Un modo sencillo de incorporar muchas proteínas
bioactivas de interés en la cicatrización y regeneración en fibrina
es unir la heparina por uno de los métodos descritos en este
documento a los geles de fibrina y usar la heparina para secuestras
proteínas de unión a heparina, tales como factores de crecimiento de
unión a heparina. Esto se puede conseguir por uno de dos modos,
indirectamente reticulando un péptido de unión a heparina en el gel
de fibrina y uniendo la heparina a este péptido no covalentemente
(usando un péptido bi-funcional que contiene un
domino de unión a heparina y un sustrato de factor XIIIa) o
acoplando directamente una quimera de
heparina-péptido (donde la heparina se une
químicamente a un péptido que contiene un sustrato de factor
XIIIa). Sin tener en cuenta el método de incorporación, la heparina
incorporada puede secuestrar después proteínas, tales como factores
de crecimiento con afinidad de unión por heparina, en el gel de
fibrina de una manera similar al modo en el que se secuestran en la
matriz extracelular en la naturaleza. La heparina también puede
proteger esos factores contra degradación proteolítica y prolongar
su actividad hasta que se liberen de la matriz.
La unión de heparina, covalentemente o no
covalentemente a geles de fibrina, añade una funcionalidad novedosa
a estos materiales. La unión de heparina permite que la matriz de
fibrina se una a proteínas de unión a heparina, que incluyen
factores de crecimiento de una manera que no perjudique a la
proteína y evite la difusión libre de la proteína desde el gel.
Esto permite la liberación controlada de las proteínas de unión a
heparina por uno de dos mecanismos, degradación del gel o unión de
la proteína a alguna otra proteína de alta afinidad, tales como un
receptor de superficie celular.
La heparina se puede unir a geles de fibrina no
covalentemente usando un sistema de dos partes que consiste en una
quimera peptídica y la propia heparina. La quimera peptídica
consiste en dos dominios, un sustrato de factor XIIIa y un domino
de unión a polisacárido. Una vez que la quimera peptídica está
reticulada en el gel de fibrina, se une a la heparina (u otros
polisacáridos) mediante interacciones no covalentes.
Para secuestrar factores de crecimiento que no
se unen espontáneamente a heparina, es necesario modificar la
proteína mediante la adición de una funcionalidad capaz de unirse a
fibrina. Esto se puede conseguir de varios modos. A modo de
ejemplo, esto se puede conseguir mediante la adición de un sustrato
de factor XIIIa o añadiendo un dominio de unión a heparina a la
proteína de fusión resultante.
La adición de un sustrato de factor XIIIa
sintético se puede conseguir expresando una proteína de fusión que
contiene la secuencia de factor de crecimiento nativo y un sustrato
de factor XIIIa en el extremo amino o carboxilo de la proteína de
fusión. Esta modificación se realiza a nivel de ADN. Las proteínas
completas presentan dificultad ya que se sintetizan por síntesis
química en fase sólida. La secuencia de ADN que codifica el factor
de crecimiento está adaptada al uso óptimo de codón para expresión
bacteriana. Después, la secuencia de ADN se determina para el
sustrato de factor XIIIa deseado, mediante el uso de codones que
tienen lugar frecuentemente en el ADN bacteriano.
Una serie de fragmentos génicos se diseña antes
de la síntesis de ADN. Debido a la frecuencia de error de la
mayoría de la síntesis de ADN, que contiene un error aproximadamente
cada 50 pb, los genes se construyen para tener aproximadamente 100
pb de longitud. Esto reduce el número de colonias que se tiene que
explorar para encontrar una que contenga la secuencia de ADN
apropiada. La localización en la que un gen termina y comienza el
siguiente se selecciona basándose en la existencia natural de sitios
de corte por enzima de restricción únicos dentro del gen, dando
como resultado fragmentos (u oligonucleótidos) de longitud variable.
El proceso está fomentado enormemente por el uso de software que
identifica la localización y frecuencia de sitios de enzimas de
restricción dentro de una secuencia dada de ADN.
Una vez que se han diseñado exitosamente los
fragmentos génicos, se incluyen sitios de enzimas de restricción
comunes en los extremos de cada fragmento para permitir la ligación
de cada fragmento en un plásmido de clonación. Por ejemplo, la
adición de sitios EcoRI y HindIII a cada fragmento génico permite
que se inserte en la región de clonación de polienlazador de pUC
19. Las cadenas sencillas 3' y 5' de cada fragmento génico se
sintetizan después usando síntesis en fase sólida convencional con
los extremos cohesivos apropiados para la inserción en el vector de
clonación. Después de la escisión y desalación, los fragmentos
monocatenarios se purifican por PAGE y se hibridan. Después de la
fosforilación, los fragmentos hibridados se ligan en un vector de
clonación, tal como pUC 19.
Después de la ligación, los plásmidos se
introducen por transformación en células competentes de
DH5-F' y se siembran en placas de
Isopropil-D-Tiogalactopiranósido
(IPTG)/5-Bromo-4-cloro-3-indolil-D-Galactopiranósido
(X-gal) para explorar para inserción de los
fragmentos génicos. Las colonias resultantes que contienen el
fragmento génico después se exploran para la inserción de la
longitud apropiada. Esto se consigue purificando el plásmido de
colonias de células transformadas por un protocolo de
minipreparación de lisis alcalina y digiriendo el plásmido con los
sitios de enzima de restricción presentes en cada extremo del
fragmento génico. Después de la detección de los fragmentos de la
longitud apropiada por electroforesis en gel de agarosa, los
plásmidos se secuencian.
Cuando se identifica un plásmido que contiene un
fragmento génico con la secuencia apropiada, después el fragmento
se recorta y se usa para ensamblar el gen completo. Cada vez se
corta un plásmido con las enzimas en los puntos de inserción y se
purifica de un gel de agarosa después de desfosforilación del
plásmido. Entretanto, también se corta un segundo plásmido que
contiene el fragmento a insertar y el fragmento a insertar se
purifica de un gel de agarosa. Después, el ADN de inserto se liga
en el plásmido desfosforilado. Este proceso se continúa hasta que
esté ensamblado el gen completo. Después, el gen se mueve al
interior de un vector de expresión, tal como pET 14b y se introduce
por transformación en bacterias para la expresión. Después de esta
ligación final, el gen completo se secuencia para confirmar que es
correcto.
La expresión de la proteína de fusión se
consigue cultivando las bacterias hasta que alcancen el crecimiento
de fase semi-logarítmica e induciendo después la
expresión de la proteína de fusión. La expresión se continúa
durante aproximadamente 3 horas y después se recogen las células.
Después de obtener un sedimento celular bacteriano, las células se
lisan. Las membranas y restos celulares se eliminan por lavado del
sedimento de lisado celular con Triton X100, dejando los cuerpos de
inclusión en forma relativamente pura. La proteína de fusión se
solubiliza usando altas concentraciones de urea y se purifica por
cromatografía de afinidad de histidina. La proteína resultante
después se renaturaliza gradualmente mediante diálisis frente a una
cantidad lentamente decreciente de urea y se liofiliza.
Se pueden incorporar injertos de polisacárido
(quimera de heparina-péptido de sustrato de factor
XIIIa) dentro de la fibrina durante la coagulación para
proporcionar sitios de heparina inmovilizados para unirse a factores
de crecimiento y ralentizar su liberación. La heparina (u otros
polisacáridos tales como sulfato de heparano o sulfato de
condroitina) se puede unir a fibrina directamente mediante el uso
del factor XIIIa construyendo una quimera de
heparina-péptido. Esta quimera contiene dos
dominios, un domino peptídico que consiste en un sustrato de factor
XIIIa y el dominio de polisacárido tal como heparina. Estas quimeras
se preparan usando heparina modificada (u otro polisacárido), por
ejemplo, que contiene un grupo reactivo único en un extremo para
controlar el sitio en el que tiene lugar el acoplamiento del péptido
en la molécula de heparina. Mediante el uso de un grupo funcional
único en el péptido, tal como una cadena lateral presente solamente
en el extremo del péptido donde se desea el acoplamiento, también
se puede controlar la localización del acoplamiento en el péptido.
También es posible incorporar el péptido de sustrato de factor XIIIa
a lo largo de la cadena de heparina, en lugar de en el extremo, e
incluso incorporar más de uno de tales péptidos por cadena de
heparina, pero la estrategia preferida es incorporar un único
péptido de sustrato de factor XIIIa en un extremo de la heparina.
Después, estas quimeras se pueden reticular covalentemente en geles
de fibrina durante la coagulación por la actividad enzimática del
factor XIIIa, permitiendo la unión directa de heparina al gel de
fibrina.
La determinación de las proporciones óptimas de
factor de crecimiento: quimera de heparina-péptido o
la proporción óptima de factor de crecimiento: heparina: péptido de
unión a heparina así como la densidad óptima de la quimera de
heparina-péptido o el péptido de unión a heparina
incorporado en la fibrina es importante. A pesar de su afinidad
relativamente fuerte por heparina, los factores de crecimiento de
unión a heparina se disocian de la matriz en una escala de tiempo
corta. Por lo tanto, un gran exceso de sitios de unión garantiza que
el factor de crecimiento no difunda mucho antes de la unión de
nuevo a la matriz. Este equilibro también permite la unión de
factor de crecimiento libre a receptores de superficie celular que
están en proximidad cercana al sitio de disociación. Este método de
liberación controlada proporciona tanto una unión relativamente a
largo plazo de factores de crecimiento como la rápida liberación de
factores de crecimiento a células locales. Sin embargo, como se
describe en este documento, no siempre es el caso que una alta
proporción y, por tanto, una velocidad de liberación lenta,
proporciona la respuesta biológica más deseable. Puede haber casos
en los que sean deseables velocidades de liberación más rápidas,
especialmente con algunos factores de crecimiento.
Se ha intentado predecir matemáticamente qué
proporción de sitio de unión a factor de crecimiento es óptima para
aplicaciones de crecimiento celular como se determina por liberación
de factor de crecimiento muy lenta. Se demostró que la velocidad de
liberación pasiva de factor de crecimiento desde la matriz se podría
modular mediante la proporción de péptido y heparina al factor de
crecimiento de unión a heparina, conduciendo mayores excesos de
heparina y péptido de unión a heparina con respecto al factor de
crecimiento de unión a heparina a liberación pasiva más lenta. Sin
embargo, no siempre es posible usar tales métodos para predecir las
características de liberación óptima. Por ejemplo, los ejemplos
demuestran que BMP-2 se puede liberar ventajosamente
de manera más rápida de un material con una proporción de heparina
y péptido de unión a heparina a BMP-2 que es más
próxima a equimolar. En algunos casos se obtienen mejores resultados
con menores proporciones de heparina a factor de crecimiento.
La capacidad del sistema de suministro que
contiene heparina de suministrar factores de crecimiento en una
forma activa se ensayó en un modelo ectópico de formación ósea, en
el que se implantaron matrices de fibrina que contenían el sistema
de suministro y BPM-2 por vía subcutánea en ratas.
En este modelo, las condiciones favorables para la formación ósea
eran a proporciones bajas de heparina a factor de crecimiento de
1:1. La adición de mayores proporciones, tales como 5:1 o superior,
era inhibidora para la formación ósea. Estos resultados eran
inesperados basándose en estudios publicados previos y sugieren que
proporciones bajas de heparina a factor de crecimiento tienen un
uso imprevisto en el suministro de BMP-2. (Véase el
ejemplo 5).
La adición de factor XIII exógeno a
preparaciones de fibrinógeno se puede usar para aumentar el número
de péptidos de unión a heparina incorporados dentro de matrices de
fibrina, permitiendo que el péptido de unión a heparina sirva como
un sitio de inmovilización para heparina y como un sitio de adhesión
celular. Este aumento de la concentración peptídica puede mejorar
la capacidad de tales materiales de promover la extensión de
neuritas y otras formas de migración celular, mediante el uso de
dominios de unión a heparina como sitios de adhesión celular. Se ha
demostrado que los péptidos de unión a heparina actúan como péptidos
de adhesión y, como tales, pueden mejorar la velocidad de migración
celular dentro de fibrina (Sakiyama, S. E., et al., (1999)
FASEB J. 13: 2214-2224). Sin embargo, esta
respuesta requería aproximadamente 8 moles de péptido incorporado
por mol de fibrinógeno en el coágulo. Como tal, el uso de un gran
número de estos péptidos de unión a heparina para unirse a heparina
para el uso como un sitio de afinidad en la liberación sostenida de
factores de crecimiento de unión a heparina puede eliminar el
efecto de adhesión beneficioso del péptido de unión a heparina. Esta
limitación se puede superar por incorporación de mayores niveles
del péptido de unión a heparina exógeno, que se puede conseguir
mediante la adición de mayores niveles de factor XIIIa a la
preparación de fibrinógeno, permitiendo de este modo que el péptido
tenga ambos efectos simultáneamente. La incorporación de péptido
adicional a una proporción superior a 8 moles de péptido por mol de
fibrinógeno (es decir, 25 moles de péptido por mol de fibrinógeno),
por tanto, puede ser útil para permitir que los péptidos de unión a
heparina sirvan como sitios de adhesión celular y como sitios de
inmovilización de heparina para suministro de fármaco. Por ejemplo,
el 5% de los sitios de unión a heparina se puede usar para
inmovilizar la heparina para el suministro de fármaco y el otro 95%
permanecería desocupado y libre para servir como dominios de
adhesión celular, permitiendo de este modo que los péptidos de
unión a heparina se usen como dominios de adhesión celular y como
sitios de inmovilización de factor de crecimiento dentro del mismo
material. Este uso dual de péptidos de unión a heparina se
aprovecha del uso del factor XIIIa exógeno debido a que se ha
demostrado que se tiene que incorporar un número relativamente alto
de sitios de unión a heparina en la fibrina (8 moles de péptido por
mol de fibrinógeno) para mejorar la adhesión celular y la migración
dentro de matrices de fibrina.
Existen muchas posibles combinaciones de
quimeras de péptido-péptido, con un sustrato de
factor XIIIa en un dominio y un péptido de unión a heparina en el
otro dominio. Estas diferentes combinaciones tendrán diferentes
ventajas y desventajas. Por ejemplo, algunos sustratos de factor
XIIIa se incorporan de manera más eficaz que otros. Adicionalmente,
diferente péptidos de unión a heparina tienen diferente afinidad por
la heparina. Una consideración adicional es la posible
inmunogenicidad de los péptidos. Incluso aunque es posible utilizar
secuencias peptídicas basadas en las secuencias de las proteínas
humanas, la fusión entre estas dos secuencias humanas es nueva y
nunca se ha observado por el sistema inmune de un paciente. Como
tal, existe cierto riesgo de que una fusión de este tipo fuese
inmunógena e indujera formación de anticuerpos contra una o la otra
proteína o frente al propio sitio de fusión. En general, las
secuencias peptídicas más cortas tendrán una menor tendencia de
inducir respuestas antigénicas que las más largas. Como tal, la
quimera con el sustrato de factor XIIIa de inhibidor de alfa 2
plasmina y el dominio de unión a heparina de antitrombina III
induciría más probablemente una respuesta antigénica que el péptido
bi-dominio correspondiente con un dominio de unión a
heparina del factor plaquetario 4, por ejemplo.
Una estrategia adicional para reducir la
probabilidad de que una quimera bi-dominio usada
para inmovilizar heparina dentro de la red de fibrina sea
inmunógena es formar directamente una quimera de
péptido-heparina, con un sustrato de factor XIIIa,
por ejemplo, del inhibidor de proteína alfa 2 plasmina, en un
dominio, y una cadena de heparina como el otro dominio, con un
enlace covalente entre ambos. De este modo, no existe ninguna
secuencia peptídica natural en el sitio de fusión, de tal forma que
el potencial de interacciones inmunológicas es muy bajo.
También se puede considerar el uso de proteínas
de fusión en la liberación de proteínas mediante la afinidad por
heparina, ya que una fusión de una proteína bioactiva que no se une
a heparina se puede construir con un dominio de unión a heparina,
para preparar una proteína de fusión resultante que se una a
heparina. Además, como una alternativa a la incorporación de
proteínas bioactivas dentro de fibrina por su afinidad por heparina,
las proteínas se pueden incorporar directamente mediante el uso del
factor XIIIa. Esto es posible si poseen un dominio de sustrato para
factor XIIIa, de forma natural o por incorporación con una proteína
recombinante para formar una proteína de fusión con la proteína
bioactiva y un dominio de sustrato de factor XIIIa.
La síntesis de cualquiera de las proteínas de
fusión que se han descrito anteriormente se puede conseguir
mediante el uso de técnicas de biología molecular. Para hacer esto,
se puede crear una proteína de fusión que contenga toda la
secuencia proteica de interés con una secuencia de reticulación o
unión fusionada en el extremo amino o carboxilo o potencialmente en
cualquier otro lugar dentro de la cadena de proteína. Esto se
realiza a nivel de ADN, ya que las secuencias que codifican un
sustrato de reticulación de factor XIIIa o un dominio de unión a
heparina se pueden insertar en el comienzo o el final de los codones
para la proteína original, por ejemplo. Cuando se expresan estas
proteínas modificadas, contendrán el dominio adicional de interés
en el extremo amino o carboxi o en cualquier otro lugar dentro del
dominio de proteína principal. Mediante el uso de la maquinaria
natural diseñada para síntesis proteica, se posibilita sintetizar y
purificar grandes proteínas con alta fidelidad.
Usando técnicas de biología molecular
convencionales, se pueden preparar proteínas de fusión de cualquier
factor de crecimiento para el que se conoce la secuencia de proteína
o de ADN, permitiendo la adición de dominios novedosos tales como
dominios de unión a heparina o sustratos enzimáticos. Estas
proteínas de fusión se pueden construir a fin de añadir un dominio
novedoso en el extremo N o C de la proteína, por ejemplo, o dentro
de la cadena proteica. Las modificaciones se realizan a nivel de
ADN construyendo un gen que contiene tanto la secuencia de ADN que
codifica el factor de crecimiento como la secuencia de ADN que
codifica la secuencia de reticulación o de unión, por ejemplo, un
dominio de unión a heparina. Después, este ADN se liga en un
plásmido de expresión y se introduce por transformación en
bacterias. Después de la inducción de la expresión, las bacterias
producirán grandes cantidades de esta proteína de fusión. Después de
la expresión, la proteína se tiene que purificar del lisado celular
y replegar. La purificación con frecuencia se simplifica debido a la
tendencia de proteínas de mamífero expresadas a alto nivel de
formar cuerpos de inclusión en bacterias.
Se puede incorporar una proteína de fusión
recombinante en los geles de fibrina mediante el uso de varios
esquemas diferentes. En el primer diseño, un sustrato de factor
XIIIa se ha incorporado directamente en la proteína. Cuando esta
proteína modificada está presente durante la polimerización de la
fibrina, se incorpora directamente en la matriz de fibrina de un
modo similar a los péptidos bi-dominio. Un método
separado implica proteínas de fusión que se han sintetizado para
incorporar un dominio de unión a heparina. En este ejemplo, un
péptido bi-dominio, heparina y la proteína de fusión
de unión a heparina se incluyen en la mezcla de polimerización de
fibrina. Durante la polimerización, el péptido
bi-dominio se reticula en el gel de fibrina. Este
péptido bi-dominio contendría una secuencia de
sustrato de factor XIIIa además de una secuencia de unión a
heparina. La heparina se une al péptido bi-dominio
que se ha incorporado en el gel de fibrina y está atrapada en la
matriz de fibrina. Esta heparina atrapada sirve para secuestrar la
proteína de fusión de unión a heparina dentro del gel de fibrina
por unión a los dominios de unión a heparina modificados por
ingeniería. Se ha demostrado que esta incorporación es lo
suficientemente estable para secuestrar el factor de crecimiento
hasta que se elimine el péptido reticulado del gel por proteólisis
controlada por células.
De acuerdo con la invención, esta técnica se
modifica incorporando un sitio de degradación enzimática entre la
secuencia de sustrato de factor XIIIa y la proteína de interés. Por
selección cuidadosa de K_{m} y k_{cat} de este sitio de
degradación enzimática, la degradación se podría controlar para que
tuviera lugar antes o después de la matriz de proteína y/o
utilizando enzimas similares o diferentes para degradar la matriz,
ajustándose la colocación del sitio de degradación para cada tipo
de proteína y aplicación. Esta nueva proteína se podría reticular
directamente en la matriz de fibrina como se ha descrito
anteriormente. Sin embargo, la incorporación de un sitio de
degradación enzimática altera la liberación de la proteína durante
la proteólisis. Cuando las proteasas obtenidas de células alcanzan
la proteína secuestrada, pueden escindir la proteína modificada por
ingeniería en el sitio de degradación recién formado. Los productos
de degradación resultantes incluirían la proteína liberada, que
ahora estaría prácticamente libre de cualquier secuencia de fusión
modificada por ingeniería, así como cualquier fibrina degradada.
Por lo tanto, la proteína libre ahora sería prácticamente idéntica
en la secuencia primaria al factor de crecimiento nativo y
potencialmente más bioactiva. Se usa un método similar con las
proteínas de fusión de unión a heparina. Estas nuevas proteínas
contendrían entonces el sitio de degradación de proteasa, así como
el nuevo dominio de unión a heparina. Las proteínas de fusión de
unión a heparina se secuestrarán en la matriz por la incorporación
de heparina en la fibrina por la inmovilización covalente de
péptidos de unión a heparina. De nuevo, con el nuevo sitio de
degradación de proteasa añadido, la proteína liberada sería
idéntica en la secuencia primaria a la proteína natural.
Los polímeros descritos en este documento se
pueden reticular para formar matrices para reparación, regeneración
o remodelación de tejidos y/o liberación de factores bioactivos,
antes de o en el momento del implante. En algunos casos será
deseable inducir la reticulación en el sitio de administración (no
reivindicado) para conformar la matriz al tejido en el sitio de
implante. En otros casos será conveniente preparar la matriz antes
del implante y, en el caso en el que la matriz incorpora heparina o
péptidos de unión a heparina que se usan para unirse a otras
moléculas bioactivas tales como factores de crecimiento, estos
factores se pueden añadir a la matriz antes de o en el momento del
implante. En algunos casos asimismo puede ser conveniente
"rellenar" la matriz con estos factores bioactivos, cuando los
factores cargados originalmente se han liberado.
La reticulación se puede conseguir mediante la
adición de agente de reticulación exógeno o, en el caso en el que
el polímero incluye un sustrato de factor XIIIa, durante
procedimientos quirúrgicos o mediante adición de trombina
localmente en el sitio de implante.
También se pueden añadir células a la matriz
antes de o en el momento del implante o incluso posteriormente al
implante, en o después de la reticulación del polímero para formar
la matriz. Esto puede ser además o en lugar de la reticulación de
la matriz para producir una separación intersticial diseñada para
promover la proliferación o el crecimiento invasivo de células.
Aunque en muchos casos será deseable implantar
la matriz para promover el crecimiento o la proliferación celular,
en algunos casos, los factores bioactivos se usarán para inhibir la
velocidad de proliferación celular. Una aplicación específica es
inhibir la formación de adhesiones después de cirugía.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar realizaciones preferidas de la invención. Aunque las
composiciones y los métodos se han descrito en términos de
realizaciones preferidas, será evidente para los especialistas en
la técnica que se pueden aplicar variaciones a la composición, los
métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método
descrito en este documento sin alejarse del concepto, espíritu y
alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó una quimera peptídica que contenía
tanto un sustrato de factor XIIIa como un domino de unión a
heparina por síntesis en fase sólida convencional. Un péptido de
muestra es uno que contiene la siguiente secuencia
dLNQEQVSPK(A)FAKLAARLYRKA (SEC ID Nº: 21),
donde el extremo N del péptido contiene el sustrato de factor XIIIa
y la secuencia en cursiva contiene un péptido modificado del dominio
de unión a heparina de ATIII (dL indica dansil leucina, que se usa
para permitir la detección del péptido por fluorescencia).
Se usó cromatografía de exclusión por tamaño
para determinar la cantidad de péptido reticulado hasta geles de
fibrina usando el método de incorporación que se ha desarrollado
previamente. Un péptido bi-dominio que contiene el
dominio de unión a heparina de antitrombina III y un marcador
fluorescente se incorporaron en geles de fibrina durante la
polimerización. El péptido libre se lavó de los geles y la red de
fibrina se degradó con plasmina. Los productos de degradación se
analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento
(cromatografía de exclusión por tamaño) para determinar la cantidad
de péptido (por fluorescencia) presente por mol de fibrinógeno (por
absorbancia a UV). La señal de fluorescencia de geles modificados
por péptido aparecía en un momento de elución anterior de lo que lo
hizo la señal del péptido libre solo, indicando que todo el péptido
presente en los geles modificados estaba reticulado hasta fibrina
(FIGURA 1). La cuantificación basada en patrones de concentración
conocida tanto para péptido como para redes de fibrina degradadas
con plasmina mostró incorporación de 8,7 \pm 0,2 moles de péptido
por mol de fibrinógeno (n=10).
Para evaluar esta estrategia para liberar
factores de crecimiento de unión a heparina de matrices de
crecimiento invasivo celular de fibrina que también comprenden un
péptido bi-domino unido covalentemente, un domino
del cual es un sustrato de factor XIIIa y un dominio del cual es un
dominio de unión a heparina basado en antitrombina III, se
cultivaron ganglios de raíz dorsal de manera tridimensional dentro
de geles de fibrina en una diversidad de condiciones, como se
muestra a continuación.
1) Dializar fibrinógeno (8 mg/ml) frente a 4 l
de solución salina tamponada con Tris (Tris 33 mM), pH 7,4 du rante
24 horas.
2) Filtrar a esterilidad fibrinógeno usando un
filtro de jeringa de 0,2 \mum.
3) Preparar las siguientes soluciones
peptídicas:
4) Preparar solución de trombina: 100 unidades
en 5 ml de TBS.
5) Añadir 1,4 ml de fibrinógeno a cada solución
de péptido.
6) Preparar geles: añadir 20 \mul de TBS +
CaCl_{2} 50 mM, 40 \mul de solución de trombina (20 unidades/ml)
y 340 \mul de solución de péptido + fibrinógeno. (las anteriores
soluciones constituyen 6 geles).
7) Incubar a 37ºC durante 1 h.
8) Lavar 5 veces en 24 horas. Usar 1 ml de TBS
las primeras 4 veces y medio neuronal la última vez.
9) Disecar ganglios de raíz dorsal embrionarios
de pollos de 8 días.
10) Poner un ganglio en cada gel y poner a 37ºC
durante 1 h.
11) Añadir 1 ml de medio neuronal a cada
gel.
12) Cambiar medio después de 24 horas.
Los resultados de estos estudios con cultivo de
ganglio de raíz dorsal se muestran en la Figura 2. Estos resultados
muestran que la heparina y el péptido solo no aumentan la extensión
de neuritas. Cuando se añade sin péptido y heparina, el bFGF no
mejora el crecimiento de neuritas, demostrando que el protocolo de
lavado usado es suficiente. La mejora de neuritas aumenta por la
adición tanto de 1 \mug/ml como de 5 \mug/ml de bFGF unido de
un modo dependiente de dosis. La adición de 1,0 \mug/ml de VEGF
unido no aumentó la extensión de neuritas, sugiriendo que el efecto
de bFGF no se debe a su capacidad de promover la angiogénesis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó una quimera de
heparina-péptido acoplando un péptido, que contenía
el sustrato de factor XIIIa en el extremo N y una
poli-lisina en el extremo C, a un oligosacárido de
heparina, con un único grupo aldehído en un extremo, por aminación
reductora. Se sintetiza un péptido con la siguiente secuencia,
dLNQEQVSPLKKKG (SEC ID Nº: 22) por química de péptido en fase
sólida convencional. Los oligosacáridos de heparina se preparan por
degradación con ácido nitroso convencional de heparina, dando como
resultado la formación de un aldehído en el terminal reductor del
oligosacárido escindido. Durante el acoplamiento, el grupo amino de
la cadena lateral de lisina ataca el aldehído en el extremo
reductor del oligosacárido de heparina para formar una base de
Schiff. Después, la base de Schiff se reduce para formar un producto
estable. A continuación se proporciona un protocolo de acoplamiento
de muestra. También se puede acoplar la heparina al sitio de
sustrato de inhibidor de alfa 2 plasmina más sencillo NQEQVSP (SEC
ID Nº: 20). Existe una amina primaria en este péptido solamente en
el extremo N. Cuando se sintetiza el péptido, como habitualmente, en
una resina de fase sólida, el extremo N se expone a quedar colgando
y cuando la alfa amina en el extremo N está desprotegida, está
disponible una amina primaria para la reacción. Se puede formar de
manera sencilla una forma reactiva de heparina por escisión en
ciertos ácidos, como se describe en Grainger, D., et al.,
(1988). J. Biomed Mat. Res. 22: 231-249, para
formar un fragmento de heparina con un grupo aldehído terminal. Este
aldehído reactivo se puede pasar sobre el péptido unido aún unido a
la resina, condensarse sobre el mismo, para formar una quimera de
péptido-heparina que está unida por una base de
Schiff, que se puede reducir de forma sencilla por cianoborohidruro
sódico para formar una amina secundaria, que es una forma más
estable.
Se podrían usar otras estrategias. Por ejemplo,
la heparina de aldehído se puede convertir en heparina amino
primaria por reacción con un exceso de etilenodiamina y reducción de
la base de Schiff de forma análoga a lo que se ha descrito
anteriormente. La purificación de la etilenodiamina residual libre
se puede conseguir por diálisis. Esta amino heparina se puede
condensar en el grupo carboxilo C terminal escindiendo el péptido
de la resina sólida con el grupo carboxilo en el resto E todavía
protegido, seguido de activación del grupo carboxilo en el extremo
C usando reactivos convencionales de síntesis peptídica, y después
seguido de desprotección del grupo carboxilo en el resto E.
- 1)
- Disolver 1,8 mM de péptido y 1,8 mM de heparina degradada por ácido nitroso en tampón borato 50 mM, pH 9. Dejar reaccionar durante 30 minutos.
- 2)
- Añadir NaCNBH_{3} 160 mM y dejar reaccionar durante 12 horas.
- 3)
- Añadir NaCNBH_{3} 240 mM y dejar reaccionar durante 12 horas.
- 4)
- Ajustar pH a 7 con HCl diluido.
- 5)
- Añadir NaCl hasta una concentración final de 1 M.
- 6)
- Dializar frente a 4 l de agua desionizada durante 24 horas.
- 7)
- Liofilizar para obtener producto de reacción.
- 8)
- Analizar rendimiento de reacción por cromatografía de exclusión por tamaño.
- 9)
- La purificación del producto deseado se consigue usando cromatografía de intercambio aniónico.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Dializar fibrinógeno (8 mg/ml) frente a 4 l
de solución salina tamponada con Tris (Tris 33 mM), pH 7,4 durante
24 horas.
2) Filtrar a esterilidad fibrinógeno usando un
filtro de jeringa de 0,2 \mum.
3) Preparar las siguientes soluciones de
quimera:
4) Preparar solución de trombina: 100 unidades
en 5 ml de TBS.
5) Añadir 1,4 ml de fibrinógeno a cada solución
de quimera.
6) Preparar geles: añadir 20 \mul de TBS +
CaCl_{2} 50 mM, 40 \mul de solución de trombina (20 unidades/ml)
y 340 \mul de solución de quimera + fibrinógeno (las anteriores
soluciones constituyen 6 geles).
7) Incubar a 37ºC durante 1 h.
8) Lavar 5 veces en 24 horas. Usar 1 ml de TBS
las primeras 4 veces y medio neuronal la última vez.
9) Disecar ganglios de raíz dorsal embrionarios
de pollos de 8 días.
10) Poner un ganglio en cada gel y poner a 37ºC
durante 1 h.
11) Añadir 1 ml de medio neuronal a cada
gel.
12) Cambiar medio después de 24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteína de fusión de
\beta-NGF se expresaron con un sustrato de
reticulación exógeno que permite que las proteínas de fusión de
\beta-NGF se reticulen enzimáticamente hasta
matrices de fibrina, lo que sirvió como el material de base para el
sistema de suministro de fármaco. Un sustrato de plasmina se puso
entre el sustrato de reticulación y el dominio de
\beta-NGF en la proteína de fusión, que sirvió con
un enlazador degradable y permitió que se liberara
\beta-NGF de la matriz de una forma prácticamente
idéntica a su secuencia nativa por escisión enzimática. Las
proteínas de fusión de \beta-NGF se unieron
covalentemente a la fibrina por la actividad de transglutaminasa
del factor XIIIa y se ensayaron en un modelo in vitro de
regeneración nerviosa para determinar la capacidad del sistema de
suministro para liberar factores de crecimiento activos en
respuesta a actividad enzimática asociada con células.
Se prepararon dos proteínas de fusión de
\beta-NGF por expresión de proteína recombinante.
Cada proteína contenía un sustrato de reticulación en el extremo N
de la proteína que consistía en el sustrato de factor XIIIa de
transglutaminasa (TG) del inhibidor de
\alpha_{2}-plasmina, NQEQVSPL (SEC ID Nº: 23).
Cada proteína de fusión de \beta-NGF también
contenía la secuencia nativa de \beta-NGF en el
extremo C de la proteína. Uno de dos sustratos de plasmina (P) se
puso entre el sustrato de reticulación y el dominio de
\beta-NGF de la proteína de fusión, un sustrato
de plasmina funcional (LIK/MKP, donde / indica el sitio de escisión)
o un sustrato de plasmina no funcional (LINMKP) en el que el resto
de lisina en el sitio de escisión en el sustrato de plasmina se
cambió a un resto de asparagina para convertir el sustrato de
plasmina en no funcional. La proteína de fusión que contenía un
sustrato de plasmina funcional se denominó
TG-P-NGF y la proteína de fusión
que contenía un sustrato de plasmina no funcional se denominó
TG-P_{i}-NGF.
La secuencia de proteína a expresar es la
siguiente:
donde la región en cursiva es el
marcador histidina obtenido del vector de expresión y la región
subrayada es el sitio de escisión por trombina. Los restos son la
secuencia de sustrato de reticulación para factor XIIIa y la región
doblemente subrayada indica el sustrato de
plasmina.
\newpage
El plásmido de clonación usado para el
ensamblaje de genes era pUC 18. La secuencia de ADN del gen es la
siguiente de 5' a 3':
Para sintetizar la proteína de fusión de
\beta-NGF por expresión de proteína recombinante,
se clonó el gen que codifica la proteína. Una vez que se hubieron
diseñado los fragmentos génicos, se añadieron sitios Eco RI y Hind
III al extremo de cada fragmento, para permitir la clonación de
estos fragmentos en el polienlazador de clonación de pUC 18 (Gibco,
Basel, Suiza). Los oligonucleótidos monocatenarios 3' y 5' de cada
fragmento génico se sintetizaron por Microsynth (Balgach, Suiza)
con extremos cohesivos para los dos sitios de restricción de
clonación. Los oligonucleótidos monocatenarios se purificaron usando
electrofóresis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (PAGE), la
banda de mayor peso molecular para cada fragmento se extrajo del gel
y se hibridaron los correspondientes fragmentos oligonucleotídicos
3' y 5'. Los fragmentos hibridados se fosforilaron con T4 ADN
cinasa (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Suiza) y se ligaron en pUC18.
Después de la ligación, los plásmidos se introdujeron por
transformación en células competentes de DH5-F' y se
sembraron en placas de
isopropil-D-tiogalactopiranósido
(IPTG)/5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-galactopiranósido
(X-gal)/ampicilina (Amp) para explorar para la
inserción de los fragmentos génicos en el plásmido. Los plásmidos
de colonias que contenían fragmentos génicos insertados se
secuenciaron para identificar colonias que contenían fragmentos
génicos con la secuencia correcta. Después de que se hubiera
obtenido la secuencia correcta para cada fragmento génico, los
fragmentos se ensamblaron para formar el gen completo para la
proteína de fusión. En resumen, los plásmidos que contenían el
fragmento 2 se digirieron con las enzimas Eco RV y Hind III
(Boehringer Mannheim) y los fragmentos se purificaron por PAGE no
desnaturalizante. Los plásmidos que contenían el fragmento 1 se
digirieron con las enzimas Eco RV y Hind III, se desfosforilaron
con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim) y los plásmidos
digeridos se purificaron por electrofóresis en gel de agarosa. El
fragmento 2 se ligó en los plásmidos digeridos que contenían el
fragmento 1 para obtener un plásmido que contenía tanto los
fragmentos 1 como 2. Este plásmido se introdujo por transformación
en células competentes de DH5-F' y se sembró en
placas de Amp. Las colonias resultantes se exploraron para
plásmidos que contenían ambos fragmentos y estos plásmidos se
secuenciaron. Este proceso se repitió hasta que se ensambló el gen
completo para la proteína de fusión de
\beta-NGF.
El gen para la proteína de fusión
TG-P_{i}-NGF se preparó a partir
del gen de TG-P-NGF por mutagénesis
dirigida. Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
para modificar la región del gen de proteína de fusión que codifica
el sustrato de plasmina, usando cebadores que contenían la
modificación deseada del gen. Usando el gen de
TG-P-NGF como un molde, se
realizaron dos reacciones, una con el cebador A y el cebador B y
otra con el cebador C y el cebador D.
- Cebador A
- AACAGCTATG ACCATG (M13 inverso)
- Cebador B
- GTTTCATGTT GATCAGCGGC AGT
- Cebador C
- TGATCAACAT GAAACCCGTG GAA
- Cebador D
- GTAAAACGACG GCCAGT (M13) (SEC ID Nº: 26-29) Los productos de las dos reacciones se purificaron por electrofóresis en gel de agarosa y se usaron como cebadores para la tercera reacción. Los cebadores A y D también se añadieron a la tercera reacción para ampliar el producto deseado. El producto de reacción final se digirió con Eco RI y Hind III y se purificó por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de PCR se clonó en pUC18 y se secuenció para identificar el producto de PCR correcto.
El gen completo para cada una de las proteínas
de fusión de \beta-NGF se digirió de pUC18 y se
ligó en el vector de expresión pET14b (Novagen, Madison,
Wisconsin). El vector de expresión se introdujo por transformación
en el hospedador de expresión, BL21 (DE3) pLysS para permitir la
regulación estrecha de la expresión de proteína de fusión. La
proteína de fusión se expresó cultivando el E. coli hasta que
alcanzó el crecimiento de fase semi-logarítmica
(densidad óptica a 600 nm de 0,4-0,6) e induciendo
después la expresión de proteína por la adición de IPTG 0,4 mM al
medio de cultivo. Las bacterias se recogieron después de 2 h por
centrifugación a 5500 xg. Después de la recogida, las células se
suspendieron en 1/10 del volumen de cultivo de Tris HCl 20 mM, NaCl
250 mM, pH 8,0. Se añadieron lisozima (0,4 mg/ml) y ADNasa (5 ng/ml)
a las células recogidas y la solución se incubó a 37ºC durante 30
minutos. Los cuerpos de inclusión se recogieron del lisado celular
por centrifugación a 10.000 xg durante 15 min. El sedimento que
contenía los cuerpos de inclusión se resuspendió en 40 ml/l de
volumen de cultivo de tampón de unión (imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M,
Tris HCl 20 mM, pH 7,9) que contenía clorhidrato de guanidina
(GuHCl) 6 M a temperatura ambiente durante 90 min. El material
insoluble en la solución se recogió por centrifugación durante 20
min a 20.000 xg y el sobrenadante, que contenía la proteína de
fusión solubilizada, se guardó para purificación
adicional.
adicional.
La proteína de fusión contenía un marcador
histidina escindible por trombina para la purificación en el extremo
N de la proteína, debido a que el gen de la proteína de fusión de
\beta-NGF se insertó en pET14b entre los sitios
Nde I y Bam HI. Se usó la cromatografía de afinidad de níquel para
purificar la proteína de fusión de \beta-NGF. Se
introdujo resina His Bind^{TM} (Novagen) en una columna de
cromatografía (2,5 ml de volumen de lecho por litro de volumen de
cultivo), se cargó con Ni^{++} y se equilibró con tampón de unión
que contenía GuHCl 6 M (de acuerdo con las instrucciones del
fabricante). El sobrenadante, que contenía la proteína de fusión,
se filtró con un filtro de jeringa de 5 \mum y se cargó en la
columna. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón
de unión que contenía urea 8 M y 6 volúmenes de columna de tampón
de lavado (imidazol 20 mM, NaCl 0,5 M, Tris HCl 20 mM, pH 7,9) que
contenía urea 8 M. La proteína de fusión se eluyó con 4 volúmenes
de columna de tampón de elución (imidazol 1 mM, NaCl 0,5 M, Tris HCl
20 mM, pH 7,9) que contenía urea 8 M. La presencia de proteína de
fusión de \beta-NGF en las fracciones de elución
se confirmó por dodecilsulfato sódico
(SDS)-PAGE.
La proteína de fusión de
\beta-NGF se replegó añadiendo un exceso de 5
veces de tampón de replegamiento helado (Tris HCl 20 mM, NaCl 250
mM, glutatión reducido 2 mM y glutatión oxidado 002 mM, pH 8,0) a la
proteína de fusión de \beta-NGF purificada
lentamente, hasta que se consiguió una concentración final de urea
de 1,3 M. La proteína de fusión se replegó durante 48 h a 4ºC con
agitación. La proteína de fusión replegada se dializó frente a un
exceso de 50 veces de tampón de almacenamiento (Tris HCl 20 mM, NaCl
500 mM, pH 8,0) que contenía glicerol al 10% a 4ºC durante una
noche. La proteína de fusión se concentró por centrifugación usando
concentradores Vivaspin^{TM} (límite de PM 5000, Vivascience,
Lincoln, RU) hasta una concentración de aproximadamente
300-400 \mug/ml, como se mide por el ensayo de
Bradford.
Para determinar la eficacia de la incorporación
de proteína de fusión de \beta-NGF en matrices de
fibrina, la proteína de fusión
TG-P_{i}-NGF se marcó con biotina
para permitir la cuantificación de \beta-NGF por
un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) directo. Se
añadió un exceso molar de 20 veces de
Sulfo-N-hidroxisuccinimida
(NHS)-LC Biotina (Pierce, Lausanne, Suiza) a la
proteína de fusión de \beta-NGF en solución salina
tamponada con fosfato (PBS, tampón fosfato 0,01 M, 8 g/l de NaCl,
0,2 g/l de KCl, pH 7,4) a una concentración de 1 mg/ml de una
solución madre de 10 mg/ml de biotina en
N,N-dimetilformamida (disuelta durante 10 min a
37ºC). La reacción se dejó avanzar durante 2 h a temperatura
ambiente. Después, la biotina no reaccionada se eliminó por
cromatografía de nitración en gel usando una columna
PD-10 (Amersham Pharmacia, Dubendorf, Suiza).
Se adsorbió una cantidad conocida de
\beta-NGF marcado en placas de 96 pocillos durante
una noche en tampón de recubrimiento (NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8) a
4ºC. Los pocillos se bloquearon con albúmina sérica bovina al 1%
(BSA) en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Los pocillos se
lavaron 3 veces en PBS con Tween-20 al 0,5% (tampón
PBS). Se diluyó estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano
rusticano (HRP) hasta 1 \mug/ml en PBS y se añadió a cada pocillo
durante 1 h. Los pocillos se lavaron 3 veces con tampón PBST y
después se incubaron en solución de revelado de ABTS (ácido
2,2'-Azino-bis(3-etilbenz-tiazolina-6-sulfónico))
(NaC_{2}H_{3}O_{2} 0,1 M, NaH_{2}PO_{4} 0,05 M, ABTS al
0,1%, H_{2}O_{2} al 0,01%, pH 42). Después de
1-5 minutos, la reacción se detuvo añadiendo un
volumen igual de SDS al 0,6% y se midió la absorbancia de cada
pocillo a 405 nm usando un lector de placa El311SX de
Bio-Tek Instruments (Winooski, Vermont). Se preparó
una curva patrón de la concentración de \beta-NGF
frente a la absorbancia a 405 nm usando estas mediciones del ensayo
de ELISA directo.
Se disolvió fibrinógeno sin plasminógeno en agua
y se dializó frente a solución salina tamponada con Tris (TBS, Tris
33 mM, 8 g/l de NaCl, 0,2 g/l de KCl) a pH 7,4 durante 24 h. La
proteína de fusión de \beta-NGF se incubó con
Ca^{++} 5 mM y 4 unidades NIH/ml de trombina durante 1 h a 37ºC
para eliminar el marcador histidina usado para la purificación. La
solución de proteína de fusión de \beta-NGF se
mezcló en proporción igual con fibrinógeno a una concentración de 8
mg/ml y se polimerizó a 37ºC durante 60 min. Las matrices de
fibrina se lavaron 5 veces a lo largo de 24 h y cada lavado se
registró para determinar la cantidad total de
\beta-NGF eliminado por lavado de la matriz.
Después de 24 h, las matrices de fibrina que contenían
\beta-NGF se degradaron con 0,1 U de plasmina
porcina. La cantidad de \beta-NGF en los lavados y
remanente en la matriz se cuantificó como se ha descrito
anteriormente por ELISA directo y se construyó una curva patrón de
\beta-NGF para cada ELISA realizado.
Se realizó una transferencia de Western para
mostrar directamente que las proteínas de fusión de
\beta-NGF estaban acopladas covalentemente a
matrices de fibrina. Se prepararon y lavaron matrices de fibrina
como se describe en el ensayo de cuantificación de incorporación.
Las matrices se lavaron 5 veces a lo largo de 24 h y después se
degradaron con plasmina, como se ha descrito anteriormente. Los
productos de degradación se separaron por SDS-PAGE
usando un gel desnaturalizante al 13,5%. Las proteínas del gel se
transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF)
de Inmobilion-P^{TM} activada (Millipore,
Volketswil, Suiza) con una corriente de 400 mA durante 1 h. La
membrana se secó durante una noche. Las proteínas se transfirieron
a la membrana, incluyendo el marcador de peso molecular, se
visualizaron por tinción con Ponceau S al 0,2%. La unión de
proteína no específica a la membrana se bloqueó con BSA al 3% en TBS
durante 2 h. La membrana se incubó con anticuerpo de cabra
anti-\beta-NGF humano (R&D
Systems, Minneapolis, Minnesota) a una concentración de 0,2
\mug/ml en BSA al 3% durante 1 h. La membrana se lavó 3 veces con
TBS durante 5 min y se incubó con el anticuerpo secundario,
anti-inmunoglobulinas de cabra de conejo conjugado
con HRP (Dako Diagnostics, Zug, Suiza) a una concentración de 0,5
\mug/ml en BSA al 3% durante 30 min. La membrana se lavó 3 veces
con TBS y después se incubó durante 5 min con un sustrato de HRP
quimioluminiscente mejorado (Pierce, Lausanne, Suiza) diluido 1:5
en PBS. El exceso de líquido se eliminó de la membrana y se cubrió
con plástico y se expuso a película de rayos X durante
5-60 s.
5-60 s.
De hecho, se observó un aumento del peso
molecular para proteínas de fusión de \beta-NGF
que estaban presentes durante la polimerización de matrices de
fibrina), aunque en el caso de \beta-NGF que
carecía de un sustrato de reticulación, no se observó
\beta-NGF en la matriz después del lavado. Este
resultado mostró directamente que la proteína de fusión de
\beta-NGF estaba inmovilizada covalentemente
dentro de matrices de fibrina durante la polimerización por la
actividad transglutaminasa del factor XIIIa.
Para determinar la capacidad de proteína de
fusión de \beta-NGF inmovilizada covalentemente de
suministrase de un modo controlado, se incorporaron proteínas de
fusión de \beta-NGF en matrices de fibrina durante
la polimerización y se ensayó la capacidad de estas matrices de
mejorar la extensión de neuritas in vitro usando DRG de
pollo. Se observó que TG-P-NGF
mejora la extensión de neuritas en más del 350% frente a la fibrina
no modificada sin NGF presente en el medio de cultivo y hasta el 50%
con respecto a la fibrina no modificada con 10 ng/ml de NGF nativo
en el medio (Figura 3).
TG-P_{i}-NGF, que contenía un
sustrato de plasmina no funcional, no se pudo escindir de la matriz
de fibrina por plasmina en una forma nativa y no mejoró
significativamente la extensión de neuritas frente al NGF nativo en
el medio de cultivo, cuando se inmovilizó covalentemente dentro de
matrices de fibrina a cualquiera de las concentraciones ensayadas.
Sin embargo, TG-P-NGF, que contenía
un sustrato de plasmina funcional, se pudo escindir de la matriz por
plasmina de un modo muy similar al NGF nativo y se observó que
mejoraba la extensión de neuritas, incluso en comparación con dosis
similares de NGF nativo presente en el medio de cultivo. Se observó
un efecto de dosis-respuesta para la proteína de
fusión de TG-P-NGF, consiguiéndose
una dosis óptima cuando estaba presente 1-5
\mug/ml de proteína de fusión de \beta-NGF en
la mezcla de polimerización. Estos resultados demostraron que la
proteína de fusión de TG-P-NGF era
bioactiva cuando estaba inmovilizada dentro de matrices de fibrina,
sugiriendo que se podría liberar en una forma activa por
degradación de matriz asociada con células. A pesar de la menor
actividad de las proteínas de fusión de \beta-NGF
en el ensayo de actividad de células PC12, cuando la proteína de
fusión de \beta-NGF degradable por plasmina se
acoplaba covalentemente a fibrina, promovió mayores niveles de
extensión de neuritas que la misma dosis de NGF nativo en el medio
de cultivo. Estos resultados también sugirieron que para que las
proteínas de fusión de \beta-NGF sean
completamente activas, se tienen que liberar de la matriz de fibrina
de una forma similar a la de su estructura nativa.
Para determinar la eficacia de la incorporación
de proteína de fusión de \beta-NGF en matrices de
fibrina, la proteína se marcó con biotina y se realizó un ELISA
directo en matrices de fibrina que contenían proteína de fusión de
\beta-NGF marcada con biotina en la mezcla de
polimerización. Se incorporaron proteínas de fusión de
\beta-NGF marcadas con biotina en matrices de
fibrina durante la polimerización. Después del lavado para eliminar
cualquier proteína de fusión de \beta-NGF no
unida, las matrices se degradaron con plasmina y se cuantificó la
cantidad de \beta-NGF en las matrices degradadas y
en los lavados. El porcentaje de la proteína de fusión de
\beta-NGF incorporada en la matriz de fibrina se
muestra en la Figura 4 como una función de la concentración de
\beta-NGF en la mezcla de polimerización. A lo
largo del intervalo de concentraciones de proteína de fusión de
\beta-NGF ensayado, se incorporó el
50-60% de la proteína de fusión durante la
polimerización de la matriz de fibrina. Este resultado demostró que
se incorporaron proteínas de fusión de \beta-NGF
en matrices de fibrina de manera eficaz mediante la acción del
factor XIIIa.
El NGF se puede expresar como proteína de fusión
en E. coli, que contiene un dominio de unión a heparina en
el extremo N, un sustrato de plasmina en el centro y la secuencia de
NGF en el extremo C de la proteína. Esto se consigue construyendo
un gen sintético que contiene el ADN que codifica la proteína de
fusión deseada. La secuencia de proteína a expresar es la
siguiente:
donde la región en cursiva es el
marcador Histidina obtenido del vector de expresión y la región
subrayada es el sitio de escisión por trombina. El subrayado
discontinuo indica la secuencia de unión a heparina y el subrayado
doble indica el sustrato de
plasmina.
El plásmido de clonación usado para el
ensamblaje de genes era pUC 18. La secuencia de ADN del gen es la
siguiente de 5' a 3':
Este gen se inserta entre los sitios EcoRI y
HindIII en la región de clonación de polienlazador de pUC 18, como
se muestra en el mapa.
Después del ensamblaje, este gen se inserta en
el vector de expresión. Después se realizan la expresión y
purificación como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El NGF se puede expresar como una proteína de
fusión en E. coli, que contiene un sustrato de factor XIIIa
en el extremo N y la secuencia de \beta-NGF humano
en el extremo C de la proteína. Esto se consigue construyendo un
gen sintético que contiene el ADN que codifica la proteína de fusión
deseada. La secuencia de proteína a expresar es la siguiente:
donde la región en cursiva es el
marcador Histidina obtenido del vector de expresión y la región
subrayada es el sitio de escisión por trombina. Los restos son la
secuencia de sustrato de reticulación para el factor
XIIIa.
El plásmido de clonación usado para el
ensamblaje de genes era pUC 18, que es el mismo que pUC 19 excepto
porque se invierte la secuencia de la región de clonación de
polienlazador. A continuación hay un mapa de pUC 19, que se obtuvo
de New England Biolabs. La secuencia de ADN del gen es la siguiente
de 5' a 3':
Este gen se inserta entre los sitios EcoRI y
HindIII en la región de clonación de polienlazador de pUC 18, como
se muestra en el mapa. Después del ensamblaje de genes, este gen se
inserta en el vector de expresión pET 14b entre los sitios NdeI y
BamHI. A continuación hay un mapa del vector pET 14b, que se obtuvo
de Novagen. Después de la inserción del gen en el vector de
expresión, el plásmido se introduce por transformación en células
competentes de BL21(DE3)pLysS. Las células se cultivan
hasta que alcanzan una DO de aproximadamente 0,6, después se
inducen para expresar la proteína de fusión con IPTG (concentración
final en solución 0,4 mM). La expresión se continúa durante
2-3 horas. Las células se ponen en hielo durante 5
minutos y después se recogen por centrifugación a 5000 x g durante
5 min a 4ºC. Se resuspenden en 0,25 de volumen de cultivo de
Tris-HCl 50 mM frío pH 8,0 a 25ºC. Las células se
centrifugan como anteriormente y el sedimento se congela. Las
células se lisan después de la descon-
gelación.
gelación.
El lisado celular se centrifuga y el
sobrenadante se desecha. El sedimento se resuspende en Triton X100.
La solución después se centrifuga y se desecha el sobrenadante. El
sedimento se resuspende en urea 6 M y la proteína de fusión se
purifica por cromatografía de afinidad de histidina. El marcador
histidina se puede escindir por trombina durante la polimerización
y lavar de los geles durante el procedimiento de lavado
convencional.
El NGF se puede expresar como una proteína de
fusión en E. coli, que contiene un dominio de unión a
heparina en el extremo N y la secuencia de NGF en el extremo C de
la proteína. Esto se consigue construyendo un gen sintético que
contiene el ADN que codifica la proteína de fusión deseada. La
secuencia de proteína a expresar es la si-
guiente:
guiente:
donde la región en cursiva es el
marcador Histidina obtenido del vector de expresión y la región
subrayada es el sitio de escisión por trombina. La región subrayada
con un subrayado discontinuo es la secuencia de unión a
heparina.
El plásmido de clonación usado para el
ensamblaje de genes era pUC 18. La secuencia de ADN del gen es la
siguiente de 5' a 3':
Este gen se inserta entre los sitios EcoRI y
HindIII en la región de clonación de polienlazador de pUC 18, como
se muestra en el mapa. Después del ensamblaje, este gen se inserta
en el vector de expresión. Después se realizan la expresión y
purificación como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado que el factor morfogénico óseo
unido a la matriz de fibrina es capaz de controlar la liberación de
este factor y cuando esta matriz se implanta por vía subcutánea se
forma hueso ectópico. Aunque este procedimiento es diferente de la
formulación ósea dentro de un defecto óseo, proporciona un método
adecuado para ensayar la capacidad de controlar la liberación de un
factor de crecimiento bioactivo in vivo.
Se sintetizaron geles de fibrina con un péptido
bi-domino diferente con la secuencia
LNQEQVSPK(A)FAKLAARLYRKA (SEC ID Nº: 36). Este
péptido se obtiene de la secuencia de sustrato de Factor XIIIa para
el inhibidor de \alpha_{2}-plasmina en el
primer dominio y un mimético del dominio de unión a heparina de
antitrombina III en el segundo dominio. La BMP-2 es
una proteína de unión a heparina y se unirá a la secuencia
proporcionada anteriormente. Los geles se polimerizaron en
presencia del péptido (a 1 mM), heparina y BMP-2
humana recombinante en proporciones de heparina a
BMP-2 de 1:1 y 40:1.
Se crearon geles de control que tenían
cantidades equivalentes de la proteína morfogénica,
BMP-2, pero que carecían de la heparina y el
péptido bi-dominio. Después, estos geles se
implantaron por vía subcutánea en ratas y se dejaron permanecer
durante dos semanas. Cuando las matrices se extrajeron, se observó
de poco a nada de hueso de los geles que no contenían el sistema de
liberación de péptido-heparina, mientras que los
geles que contenían el sistema mostraron una formación ósea
significativa.
\newpage
Esto se observa del mejor modo en la masa de las
matrices eliminadas que se muestra en la Tabla 3.
El sistema de liberación mejoró la formación de
hueso ectópico dentro de la matriz, demostrando la viabilidad del
sistema de liberación in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
El fibrinógeno purificado como se obtiene por
métodos de precipitación convencionales contiene pequeñas cantidades
de factor XIIIa endógeno que actúa como un reactivo de limitación
en la incorporación del péptido bi-dominio. Esto se
demostró mediante el uso de fibrinógeno purificado, en el que fue
posible incorporar los péptidos bi-domino a
concentraciones de hasta 8,2 mol de péptido/mol de fibrinógeno
basándose en la concentración de factor XIIIa endógeno. Se demostró
que la adición de factor XIIIa exógeno mejora el nivel de la
incorporación de péptido. Esto es particularmente pertinente para
el control de la concentración de péptido bi-dominio
dentro del gel, que, a su vez, afectará a la adhesión celular y
determinará el límite superior para la incorporación de heparina y
factor de crecimiento. En algunos casos puede ser ventajoso aumentar
la adhesión celular, concentraciones de heparina o factor de
crecimiento más allá de las posibles con fibrinógeno purificado
convencional.
Se usó el factor XIII exógeno, purificado de
plasma agrupado, para incorporar el péptido
bi-dominio, dLNQEQVSPLRGD (SEC ID Nº: 1) en los
geles. Se añadió 1 U de factor XIII exógeno por ml de gel de fibrina
y se analizó el nivel de péptido bi-dominio
incorporado covalentemente mediante análisis cromatográfico. Los
resultados se muestran en la Figura 5. Cuando se añadió 1 U/ml de
factor XIII exógeno, el nivel de incorporación alcanzó 25 mol de
péptido/mol de fibrinógeno. Este nivel de incorporación está próximo
al límite teórico basado en el número de posibles sitios de
unión.
También se demostró la capacidad del péptido
bi-dominio, dLNQEQVSPLRGD (SEC ID Nº: 1), de
incorporarse en kits de adhesivo de fibrina disponibles en el
mercado. Se obtuvieron kits Tissucol y después se fraccionaron en
múltiples muestras. Se añadió péptido bi-dominio
exógeno hasta 6 mM y se midió el nivel de incorporación mediante
análisis cromatográfico (Figura 6). El nivel de incorporación de
péptido se ensayó a lo largo de un amplio intervalo de
concentraciones de péptido bi-dominio iniciales para
tres kits separados. Cuando se midió el nivel de incorporación, se
observó que tuvo lugar la máxima incorporación a concentraciones
superiores a péptido exógeno 5 mM. Puede ser que en estas matrices
altamente densas, la difusión comience a desempeñar un papel en el
proceso de incorporación. Sin embargo, se observó un nivel muy
elevado de incorporación alcanzando el nivel al menos 25 mol de
péptido/mol de fibrinógeno. Además, existe una variabilidad
significativa en la composición de kits de adhesivo de fibrina con
un amplio intervalo de concentraciones posibles de proteína
presente. Sin embargo, esto claramente no afectó a la incorporación
del péptido bi-dominio significativamente ya que el
perfil de incorporación era similar para los tres kits
ensayados.
Claims (33)
1. Una matriz reticulada adecuada para
crecimiento o crecimiento invasivo celular, en la que al menos un
injerto de proteína o polisacárido modificado por ingeniería se une
covalentemente o iónicamente a la matriz,
en la que el injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería comprende
- un primer dominio que comprende un factor bioactivo o un polisacárido,
- un segundo dominio, en el que el injerto de proteína o polisacárido modificado por ingeniería está unido a la matriz por el segundo dominio y
- un sitio de degradación enzimática o hidrolítica entre el primer domino y el segundo dominio.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La matriz de la reivindicación 1, en la que
el factor bioactivo es un péptido.
3. La matriz de la reivindicación 2, en la que
el péptido comprende al menos un dominio de unión a heparina.
4. La matriz de la reivindicación 1, en la que
el factor bioactivo es un factor de crecimiento o una proteína.
5. La matriz de la reivindicación 4, en la que
el factor bioactivo es un factor de crecimiento de unión a
heparina.
6. La matriz de la reivindicación 5, en la que
el factor de crecimiento de unión a heparina se selecciona entre el
grupo que consiste en factor de crecimiento transformante beta,
proteínas morfogénicas óseas, factor de crecimiento de
fibroblastos, factor de crecimiento epitelial vascular,
interleucina-8, neurotrofina-6,
factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de
crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de tejido
conectivo, midquina, moléculas asociadas a crecimiento de unión a
heparina y mezclas de los mismos.
7. La matriz de la reivindicación 1, en la que
el factor bioactivo es una enzima.
8. La matriz de la reivindicación 1, en la que
el polisacárido se selecciona entre el grupo que consiste en
heparina, sulfato de heparina y sulfato de condroitina.
9. La matriz de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde la matriz se selecciona entre el grupo
que consiste en proteínas, polisacáridos, glucoproteínas y
materiales sintéticos.
10. La matriz de la reivindicación 9, donde la
matriz comprende fibrina.
11. La matriz de la reivindicación 1, en la que
el sitio de degradación es un sitio de degradación enzimática, que
se escinde por una enzima seleccionada entre el grupo que consiste
en plasmina y metaloproteinasa de matriz.
12. La matriz de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en la que el segundo dominio es un domino
de sustrato para una enzima de reticulación.
13. La matriz de la reivindicación 12, en la que
el segundo dominio comprende un domino de sustrato de
transglutaminasa.
14. La matriz de la reivindicación 13, en la que
el segundo dominio es un dominio de sustrato de factor XIIIa.
15. La matriz de la reivindicación 14, en la que
el segundo dominio comprende la SEC ID Nº: 20.
16. Un método para preparar una matriz que
comprende los pasos de
- a.
- proporcionar al menos una matriz capaz de formar una matriz reticulada,
- donde la matriz se selecciona entre el grupo que consiste en proteínas, polisacáridos, glucoproteínas y materiales sintéticos.
- b.
- añadir un injerto de proteína o polisacárido modificado por ingeniería a la matriz,
- donde el injerto de proteína o polisacárido modificado por ingeniería comprende
- un primer dominio que comprende un factor bioactivo o un polisacárido,
- un segundo dominio y
- un sitio de degradación enzimática o hidrolítica entre el primer domino y el segundo dominio y
- c. reticular la matriz, de tal forma que la matriz se una al segundo dominio del injerto de proteína o polisacárido modificado por ingeniería.
\vskip1.000000\baselineskip
17. El método de la reivindicación 16, en el que
el factor bioactivo se selecciona entre el grupo que consiste en
péptidos, factores de crecimiento y enzimas.
18. El método de la reivindicación 17, en el que
el factor bioactivo es un factor de crecimiento de unión a
heparina.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
el factor de crecimiento de unión a heparina se selecciona entre el
grupo que consiste en factor de crecimiento transformante beta,
proteínas morfogénicas óseas, factor de crecimiento de
fibroblastos, factor de crecimiento epitelial vascular,
interleucina-8, neurotrofina-6,
factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de
crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de tejido
conectivo, midquina, moléculas asociadas a crecimiento de unión a
heparina y mezclas de los mismos.
20. El método de la reivindicación 17, en el que
el factor bioactivo es péptido que comprende al menos un dominio de
unión a heparina.
21. El método de la reivindicación 16, en el que
el polisacárido se selecciona entre el grupo que consiste en
heparina, sulfato de heparano y sulfato de condroitina.
22. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 21, en el que el segundo dominio es un dominio
de sustrato para una enzima de reticulación.
23. El método de la reivindicación 23, en el que
el segundo dominio comprende un dominio de sustrato de
transglutaminasa.
24. El método de la reivindicación 23, en el que
el segundo dominio comprende un dominio de sustrato de Factor
XIIIa.
25. Un injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería, que comprende un primer dominio que
comprende un factor de crecimiento o un polisacárido, un segundo
dominio que comprende una región reticulable que es capaz de
reticular el injerto de proteína o polisacárido modificado por
ingeniería a una matriz y un sitio de degradación enzimática o
hidrolítica entre el primer y el segundo dominio.
26. El injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería de la reivindicación 25, en el que el
factor bio-activo es un factor de crecimiento de
unión a heparina.
27. El injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería de la reivindicación 25, en el que el
factor de crecimiento se selecciona entre el grupo que consiste en
factor de crecimiento transformante beta, proteínas morfogénicas
óseas, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento
epitelial vascular, interleucina-8,
neurotrofina-6, factor de crecimiento epidérmico de
unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de
crecimiento de tejido conectivo, midquina, moléculas asociadas a
crecimiento de unión a heparina y mezclas de los mismos.
28. El injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería de la reivindicación 25, en el que el
polisacárido se selecciona entre el grupo que consiste en heparina,
sulfato de heparano y sulfato de condroitina.
29. El injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería de cualquiera de las reivindicaciones 25
a 28, en el que el sitio de degradación es un sitio de degradación
enzimática, que se escinde por una enzima seleccionada entre el
grupo que consiste en plasmina y metaloproteinasas de matriz.
30. El injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería de cualquiera de las reivindicaciones 25
a 29, en el que el segundo dominio es un dominio de sustrato para
una enzima de reticulación.
31. El injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería de la reivindicación 30, en el que el
segundo dominio comprende un domino de sustrato de
transglutaminasa.
32. El injerto de proteína o polisacárido
modificado por ingeniería de la reivindicación 31, en el que el
segundo dominio comprende un dominio de sustrato de Factor
XIIIa.
33. La matriz de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 para la reparación, regeneración o
remodelación de tejidos y/o liberación de factores bioactivos.
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