JP2003535055A - 組織を操作するための増殖因子改変タンパク質マトリクス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 タンパク質は、組織修復、再生、および／またはリモデリング、ならびに／もしくは薬物送達における使用のためにタンパク質または多糖マトリクスに組込まれる。このタンパク質は、マトリクスの分解、酵素作用、および／または拡散により放出されるように組込まれ得る。実施例に示されるように、１つの方法は、共有結合または非共有結合方法のいずれかにより、ヘパリンをマトリクスに結合させ、ヘパリン−マトリクスを形成することである。次いで、ヘパリンは、このタンパク質マトリクスに対するヘパリン結合増殖因子に非共有結合する。あるいは、架橋領域（例えば、第ＸＩＩＩａ因子基質）およびネイティブのタンパク質配列を含む融合タンパク質が、構築され得る。マトリクスと生理活性因子との間の分解可能な連結の組込みは、特に、長期の薬物送達が所望される場合（例えば、神経再生の場合）に有用であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、組織の修復または再生、および／あるいは薬学的に活性な分子の制
御された放出における使用のための、親和性結合相互作用を使用した、薬学的に
活性な分子（薬学的に活性な分子（特に増殖因子）の融合タンパク質を含む）を
含むマトリクスの使用に関する。

【０００２】 （発明の背景） 組織の修復または再生のために、細胞は創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）に移動
し、増殖し、マトリクス成分を発現するかまたは細胞外マトリクスを形成し、そ
して最終的な組織の形状を形成しなければならない。複数の細胞集団が、しばし
ばこの形態形成応答（これは頻繁に脈管細胞および神経細胞を含む）において関
与するに違いない。マトリクスは、非常に増強されることが実証され、そしてい
くつかの場合、これを生じるために必須であることが見出された。天然の細胞は
、細胞内部増殖マトリクスの影響による再構築に供され、これは全てタンパク質
分解（例えば、プラスミン（フィブリンを分解する）およびマトリクスメタロプ
ロテイナーゼ（コラーゲン、エラスチンなどを分解する）による）に基づく。こ
のような分解は、高度に局在化され、そして移動細胞と直接的に接触する際にの
み生じる。さらに、特定の細胞シグナル伝達タンパク質（例えば、増殖因子）の
送達は、きつく調節されている。天然のモデルにおいて、マクロ孔質（ｍａｃｒ
ｏｐｏｒｏｕｓ）細胞内部増殖マトリクスは使用されず、むしろ、局所的に、お
よび要求される場合は細胞がマトリクス中に移動したときに、細胞が分解し得る
微孔質マトリクスが使用される。

【０００３】 増殖因子についての制御された送達デバイスは、いくつかの形態の増殖因子を
隔離するために固定化されたヘパリンの使用に基づいて以前に設計された。例え
ば、Ｅｄｅｌｍａｎらは、アルギネート中のヘパリン結合ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^{Ｔ Ｍ} ビーズを使用した。このビーズは、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」
）のヘパリンとの結合および解離に基づいて、ｂＦＧＦをゆっくり放出する貯蔵
庫として役立つ。

【０００４】 二ドメインペプチド（これは第ＸＩＩＩａ因子基質配列および生理活性ペプチ
ド配列を含む）が、フィブリンゲルに架橋され得ること、およびこの生理活性ペ
プチドがインビトロでその細胞活性を保持していることが実証された（Ｓｃｈｅ
ｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：７５〜８１
）。ペプチドは、そのペプチドが由来するタンパク質全体の生理活性を部分的に
模倣し得るがこの生理活性は通常はタンパク質全体の生理活性よりも低く、とき
どき、ほんの短いペプチドで特定のタンパク質を模倣することは不可能である。
従って、タンパク質全体（例えば、増殖因子または他の薬学的に活性な分子）を
マトリクス中に組み込み得ることが所望される。

【０００５】 タンパク質および増殖因子についての送達系が存在し、公知であるが、組織の
移動細胞への増殖因子の提示および放出の制御ならびに細胞接着部位の制御を介
したマトリクス中への細胞移動および組織内部増殖を促進する、修復において使
用するためのマトリクスについての必要性が残る。この必要性は、天然において
起こるように、マトリクスとの親和性相互作用を介して増殖因子を局所的に提示
し得、そしてその影響および活性を局所的に保持し得るような内部増殖のマトリ
クスについて特に大きい。

【０００６】 従って、インタクトな増殖因子分子の活性を保持する増殖因子がその中に組み
込まれた組織の修復、再生および再構築のための、天然の生分解性マトリクスを
提供することが本発明の目的である。

【０００７】 増殖因子の制御および／または維持された放出のための、天然の生分解性マト
リクスを提供することが、本発明のさらなる目的である。

【０００８】 （発明の要旨） 組織の修復、再生および／もしくは再構築ならびに／または薬物送達において
使用するために、タンパク質は、タンパク質または多糖ポリマーのマトリクスま
たはゲル中に組み込まれる。このタンパク質は、このマトリクスの分解によって
、酵素作用および／または拡散によって放出されるように組み込まれ得る。実施
例によって実証されるように、１つの方法は、ヘパリンを共有結合的または非共
有的結合方法のいずれかによってマトリクスに結合させてヘパリン−マトリクス
を形成することである。次いで、このヘパリンは、ヘパリン結合増殖因子をタン
パク質マトリクスに非共有結合させる。結合されるべきタンパク質がネイティブ
なヘパリン結合配列を含まない場合、ネイティブなタンパク質配列および合成ヘ
パリン結合ドメインを含む融合タンパク質が構築され得る。あるいは、架橋領域
およびネイティブなタンパク質配列を含む融合タンパク質が構築され得、そして
この融合タンパク質は架橋によって隔離されて、マトリクスを形成し得る。この
融合タンパク質またはペプチドドメインは、加水分解部位または酵素的切断部位
を含む分解可能な結合を含み得る。これは、マトリクス中の異なる位置で、その
位置および／またはマトリクス中における細胞活性に依存して、送達速度を変更
することを可能にする。このアプローチは、長期の薬物送達が所望される場合、
例えば、神経再生の場合（再生の相関的要素として空間的に薬物放出速度を変更
すること（例えば、生存組織境界の付近では速く、そして損傷域中ではさらによ
りゆっくりと）が所望される場合）、特に有用であり得る。さらなる利点として
は、送達系中のより低い総薬物用量、および、最大細胞活性の時点で放出される
べき薬物のよりも高い割合を可能にする、放出の空間的な制御が挙げられる。実
施例は、細胞内部増殖および組織再生を最適に誘導したマトリクス中へ隔離され
た増殖因子、ヘパリン結合ドメインおよびヘパリンまたはヘパリン結合ペプチド
の、最適化される比またはレベルを実証する。

【０００９】 （発明の詳細な説明） 本明細書中に記載される場合、組織の修復、再生または再構築を、増殖因子が
放出可能に取り込まれた天然のマトリクスを使用して増強するための方法が開発
された。先行技術のマトリクスを越えるいくつかの利点が存在する：天然のマト
リクスは生体適合性および生分解性であり、そして移植時に、インビトロまたは
インビボで形成され得る；全長の増殖因子タンパク質が取り込まれ得、そして全
部の生理活性を保持し得る；この増殖因子は、この増殖因子をどのように、およ
びいつ、およびどの程度放出するかについての制御を提供する技術を使用して放
出可能に組み込まれ得、その結果このマトリクスは、直接的または間接的に組織
修復のために、制御された放出ビヒクルとしてこのマトリクスを使用して、使用
され得る。

【００１０】 （Ｉ．マトリクスおよび増殖因子） （Ａ．マトリクス材料） １つ以上のポリマー材料をマトリクス内での細胞内部増殖または細胞のマトリ
クス中への移動を可能にするのに十分なポリマー間間隙を有するポリマーマトリ
クスを形成する、イオン的、共有結合的、またはその組合わせによって架橋して
マトリクスが形成される。

【００１１】 好ましい実施形態において、このマトリクスはタンパク質で形成され、最も好
ましくは、マトリクスが移植されるべき患者において天然に存在するタンパク質
で形成される。最も好ましいタンパク質はフィブリンであるが、他のタンパク質
（例えば、コラーゲンおよびゼラチン）もまた使用され得る。多糖および糖タン
パク質もまた使用され得る。いくつかの実施形態において、イオン結合または共
有結合によって架橋され得る合成ポリマーを使用することもまた可能である。

【００１２】 このマトリクス材料は、好ましくは、天然に存在する酵素によって生分解可能
である。分解の速度は、架橋の程度およびマトリクス中にプロテアーゼインヒビ
ターを含むことによって操作され得る。

【００１３】 （Ｂ．分解可能な結合） マトリクスを形成するタンパク質は、分解可能な結合を含むことを介して改変
され得る。代表的に、これらは酵素切断部位（例えば、トロンビンによる切断の
ための部位）である。さらに、融合タンパク質またはペプチドキメラ（これはフ
ィブリンゲルに架橋される）は、接着部位（すなわち、第ＸＩＩＩａ因子基質ま
たはヘパリン結合ドメイン）と生理活性タンパク質（すなわち、増殖因子または
酵素）との間に切断可能な部位を含むようにさらに改変され得る。これらの部位
は、非特異的な加水分解（すなわち、エステル結合）によって切断され得るか、
または特異的な酵素的分解（タンパク質分解性分解または多糖分解のいずれか）
のための基質であり得るかのいずれかである。これらの分解可能な部位は、フィ
ブリンゲルから生理活性因子のより特異的な放出の操作を可能にする。例えば、
酵素活性に基づく分解は、ゲルを介したこの因子の拡散によるよりもむしろ、細
胞プロセスによって制御されるべき生理活性因子の放出を可能にする。

【００１４】 この分解部位は、一次タンパク質配列に対してわずかな改変を伴うかまたは改
変を伴わずに生理活性因子の放出を可能にし、これはこの因子のより高い活性を
生じ得る。さらに、この分解部位は、は、因子の放出がいくつかの多孔性材料か
ら拡散されるよりもむしろ、細胞特異的なプロセス（例えば、局在化したタンパ
ク質分解）によって制御されることを可能にする。これは、材料中の細胞の位置
に依存して因子が同じ材料中で異なる速度で放出されることを可能にする。細胞
特異的タンパク質分解活性は、長期間にわたって生じる神経の再生などの適用に
きわめて重要である。これはまた、必要な総増殖因子の量を減少させる。なぜな
ら、この増殖因子の放出は、細胞プロセスによって制御されるからである。増殖
因子の保存およびその生理活性は、初期バースト放出における生理活性因子の有
意な量の欠失を特徴的に生じる拡散制御放出デバイスの使用に対する、細胞特異
的タンパク質分解活性の開発の明らかな利点である。

【００１５】 タンパク質分解性分解のために使用され得る酵素は、多数である。タンパク質
分解的分解部位は、コラゲナーゼ、プラスチン、エラスターゼ、ストロメライシ
ン、またはプラスミノーゲンアクチベーターのための基質を含み得る。例示的な
基質を、以下に列挙する。Ｐ１〜Ｐ５は、タンパク質分解が生じる部位から、こ
のタンパク質のアミノ末端に向かってアミノ酸の１〜５位を示す。Ｐ１’〜Ｐ４
’は、タンパク質分解が生じる部位から、このタンパク質のカルボキシ末端に向
かってアミノ酸の１〜４位を示す。

【００１６】 （表１：プロテアーゼのサンプル基質配列）

【００１７】

【表１】 （多糖基質） 酵素分解は、酵素（例えば、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、およびコンドロ
イチン分解酵素ＡＢＣ）についての多糖基質を伴って生じ得る。これらのそれぞ
れの酵素は、多糖基質を有する。全てのヘパリン結合系におけるヘパリンの存在
によって、ヘパリナーゼについての基質は、すでにこれらの系の中に構築されて
いる。

【００１８】 （タンパク質分解基質） タンパク質分解基質は、ペプチドキメラまたはヘパリンペプチドキメラのいず
れかのペプチド合成の間に添加され得る。このヘパリン結合ペプチドキメラは、
プロテアーゼ基質（例えば、上記のプラスミンについての基質のうちの１つ）を
第ＸＩＩＩａ因子基質とヘパリン結合ドメインとの間に挿入することによってタ
ンパク質分解性分解配列を含むように改変され得る。このヘパリン−ペプチドキ
メラは、プロテアーゼ基質（例えば、上記のプラスミンについての基質のうちの
１つ）を第ＸＩＩＩａ因子基質とヘパリンドメインとの間に挿入することによっ
てタンパク質分解性分解配列を含むように改変され得る。高いＫ_ｍおよび低いＫ_ｃａｔ を有する基質を使用して、プロテアーゼの活性部位を占有しながらも切断
をゆっくりにし得る。プラスミンについての基質以外の切断基質を使用して、マ
トリクス分解と独立した生理活性因子の放出を可能にし得る。

【００１９】 （オリゴエステル） オリゴエステルドメインは、キメラの第ＸＩＩＩａ因子基質と、ヘパリン結合
ドメインまたはヘパリンドメインのいずれかとの間に、ペプチド合成工程の間同
様に挿入され得る。これは、乳酸のオリゴマーのようなオリゴエステルを使用し
て達成され得る。

【００２０】 非酵素的分解基質は、酸または塩基触媒機構によって加水分解を受ける任意の
結合で構成され得る。これらの基質は、オリゴエステル（例えば、乳酸のオリゴ
マーまたはグリコール酸のオリゴマー）を含み得る。これらの材料の分解速度は
、オリゴマーの選択を介して制御され得る。

【００２１】 （Ｃ．ヘパリン；ヘパリン結合ペプチド） マトリクスは、ヘパリンおよび／またはヘパリン結合フラグメントを含むこと
を介して改変され得、これはヘパリンに結合するタンパク質に直接的または間接
的に結合する。後者の場合、このペプチドはヘパリンに結合し得、次いでこれは
ヘパリン結合部位を含む因子に結合するために利用可能であるか、またはこのペ
プチドはそれ自体が特定のヘパリン結合増殖因子によって結合されるヘパリン部
分を含み得る。これらは、以下においてより詳細に議論されるような標準的な技
術を使用して、マトリクス材料に結合され得る。

【００２２】 好ましい実施形態において、ヘパリンは、ペプチドキメラおよびヘパリンそれ
自体からなる２部の系（ｔｗｏ−ｐａｒｔ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、フィブ
リンゲルに非共有結合的に結合される。このペプチドキメラは、２つのドメイン
（第ＸＩＩＩａ因子基質および多糖結合ドメイン）からなる。一旦、このペプチ
ドキメラがフィブリンゲル中に架橋すると、このペプチドキメラは非共有結合的
相互作用によってヘパリン（または他の多糖）に結合する。

【００２３】 多くのタンパク質が、ヘパリン結合親和性を有することが見出されている。こ
れらのタンパク質およびそれらのヘパリン結合ドメインの配列のいくつかを、以
下の表２に列挙する。これらはまた、ポリマーマトリクスによって送達され得る
生理活性因子に関する節で議論される。

【００２４】

【表２】 （Ｄ．生理活性因子） 発育中の生物および成体の両方において形態発生に関与する多くの増殖因子は
、細胞外マトリクス分子に結合する。この親和性は、形態形成物質の作用の局所
モードを提供し、制御できない遠位の影響を妨げる。この影響の局所化に関与す
るこの主なマトリクス親和性相互作用は、へパリンとヘパリン−表面プロテオグ
リカンについてである。ヘパリンに結合する増殖因子としては、なかでも、トラ
ンスフォーミング増殖因子（「ＴＧＦ」）−βスーパーファミリー（骨形成タン
パク質、「ＢＭＰ」を含む）、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）ファミリー、
および血管上皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）が挙げられる。一般的に、ヘパリンを
結合すると考えられる増殖因子は、生理的レベルより高いＮａＣｌ濃度（１４０
ｍＭ以上）でヘパリン親和性カラムから溶出する。さらなる「ヘパリン結合」増
殖因子としては、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結
合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、およびヘ
パリン結合増殖関連分子が挙げられる。これらの増殖因子は、組織修復を調節す
ることが示されている。

【００２５】 ヘパリン結合ドメインは、増殖因子の多くの異なるファミリーに天然に存在す
る。ヘパリンを結合する１つ以上のメンバーを有するこれらのファミリーの１つ
は、線維芽細胞増殖因子である（Ｐｒｅｓｔａ，Ｍ．ら、（１９９２）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．１８５：１０９８〜１１０７）。ヘパリンを結合する
さらなる増殖因子としては、トランスフォーミング増殖因子、骨形成因子、イン
ターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、血管内皮細胞増殖因子、ヘパリン
結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、および
ヘパリン結合増殖関連分子が挙げられる（Ｇｏｅｔｚ，Ｒ．ら、（１９９４）．
Ｎａｔｕｒｅ．３７２：２６６−２６９；Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．ら、（１９９６）
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９：１１５０〜１１５６；Ｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．ら、
（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｓ．２２：７３〜８３；Ｋｉｎ
ｏｓａｋｉ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
．１３８４：９３〜１０２；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，Ｔ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：４３０〜４４０；Ｎｏｌｏ，Ｒ．ら、（１９
９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：１６５８〜１６６５；Ｓｐｉｌｌｍ
ａｎｎ，Ｄ．，ら、（１９９８）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７３：１５４８７−１５４９３；Ｓｔｅｆｆｅｎ，
Ｃ．ら、（１９９８）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ． １５：１９９〜２１３
．Ｔｅｓｓｌｅｒ，Ｓ．ら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１
２４５６〜１２４６１）。これらの因子は、血管系、皮膚、神経および肝臓を含
む多くの異なる型の組織における治癒を促進する可能性を示している。従って、
これらの物質は、使用されて、適切な増殖因子を選択することによって身体の多
くの異なる部分において創傷治癒を促進し得る。

【００２６】 （ＩＩ．生理活性因子の取り込みおよび／または放出方法） マトリクス中の増殖因子または他の生理活性タンパク質の取り込みに対する好
ましい実施形態において、このマトリクスは、フィブリンおよび外因性分子から
形成され、凝固の間にフィブリン中に取り込まれる基質を含む。外因性ペプチド
は、２つのドメイン（そのうちの１つは、ＸＩＩＩａなどの架橋酵素に対する基
質であるドメイン）を含むように設計され得る。第ＸＩＩＩａ因子は、凝固の間
は活性なトランスグルタミナーゼである。この酵素（通常トロンビンによる切断
によって第ＸＩＩＩ因子から形成される）は、グルタミン側鎖およびリジン側鎖
の間に形成されるアミド結合を介してフィブリン鎖を互いに接着するように機能
する。この酵素はまた、凝固の間に他のタンパク質をフィブリンに接着するよう
に機能する（例えば、タンパク質α２プラスミンインヒビター）。このタンパク
質のＮ末端ドメイン（特に、配列ＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号２０））は、第ＸＩ
ＩＩａ因子に対して有効な基質として機能するように示されている。次いで、こ
のペプチドの第二のドメインは、生理活性因子（例えばペプチド、またはタンパ
ク質、または多糖）であるように選択され得る（Ｓａｋｉｙａｍａ−Ｅｌｂｅｒ
ｔら、（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５：３８９
−４０２および本明細書中）。このように、外因性生理活性因子は、凝固の間に
フィブリン中に第ＸＩＩＩａ因子基質を介して組み込まれ得る。

【００２７】 （Ａ．タンパク質の放出におけるヘパリン親和性の使用） 治癒およびフィブリンへの再生において目的の多くの生理活性タンパク質を取
り込む単純な方法は、本明細書に記載の方法の１つによってヘパリンをフィブリ
ンゲルへ接着し、そしてヘパリンを使用してヘパリン結合タンパク質（例えば、
ヘパリン結合増殖因子）を分離することである。これは、２つの方法のうち１つ
（直接的にヘパリン結合ペプチドをフィブリンゲルへ架橋してヘパリンをこのペ
プチドに非共有結合的に結合する（ヘパリン結合ドメインおよび第ＸＩＩＩａ因
子基質を含む二機能性ペプチドを使用する）ことによってか、またはヘパリン−
ペプチドキメラを直接的にカップリングする（このヘパリンは第ＸＩＩＩａ因子
基質を含むペプチドに化学的に接着される）ことによってのいずれか）で達成さ
れ得る。取り込みの方法によらず、取りこまれたヘパリンは、次いで、フィブリ
ンゲルにおいてタンパク質（例えば、ヘパリン結合親和性を有する増殖因子）を
、タンパク質が自然に細胞外マトリクスに分離される方法に類似の様式で分離し
得る。ヘパリンはまた、タンパク質分解性分解からこれらの因子を保護し、そし
てこれらの因子がマトリクスから放出されるまでその活性を延長し得る。

【００２８】 （ヘパリン結合ペプチドの取り込みを介するヘパリンの取り込み） 共有結合的または非共有結合的なフィブリンゲルへのヘパリンの接着は、これ
らの材料に新規な機能を追加する。ヘパリンの接着は、フィブリンマトリクスが
ヘパリン結合タンパク質（増殖因子を含む）をタンパク質を傷つけない様式で結
合することを可能にし、そしてゲルからのタンパク質の遊離拡散を防ぐ。このこ
とは、２つの機能のうちの１つ（ゲルの分解またはタンパク質のいくつかの他の
高親和性タンパク質（例えば、細胞表面レセプター）への結合のいずれか）によ
ってヘパリン結合タンパク質の徐放を可能にする。

【００２９】 ヘパリンは、ペプチドキメラおよびヘパリン自体からなる２部分系を使用して
非共有結合的にフィブリンへ接着され得る。このペプチドキメラは、２つのドメ
イン（第ＸＩＩＩａ因子基質および多糖結合ドメイン）からなる。一旦、このペ
プチドキメラがフィブリンゲルに架橋されると、非共有結合相互作用によってヘ
パリン（または他の多糖）を接着する。

【００３０】 自発的にヘパリンを結合しない増殖因子を分離するために、フィブリンに接着
し得る機能性の付加を介してこのタンパク質を改変することが必要である。この
ことは、いくつかの方法で達成し得る。例として、これは、第ＸＩＩＩａ因子基
質の付加を介してまたはヘパリン結合ドメインを得られた融合タンパク質に付加
することによって達成され得る。

【００３１】 合成された第ＸＩＩＩａ因子基質の付加は、ネイティブな増殖因子配列および
融合タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで第ＸＩＩＩａ因
子基質を含む融合タンパク質を発現することによって達成され得る。この改変は
、ＤＮＡレベルでなされる。タンパク質全体は、固相化学合成によって合成する
という点で困難性を示す。増殖因子をコードするこのＤＮＡ配列は、細菌性発現
のために最適なコドン使用を適合される。次いで、このＤＮＡ配列は、細菌性Ｄ
ＮＡに頻繁に生じるコドンを使用して所望の第ＸＩＩＩａ因子基質について決定
される。

【００３２】 一連の遺伝子フラグメントは、ＤＮＡ合成の前に設計される。ほとんどのＤＮ
Ａ合成のエラー頻度（約５０ｂｐ毎のエラーを含む）に起因して、遺伝子は、約
１００ｂｐ長になるように構築される。これは、適切なＤＮＡ配列を含むコロニ
ーを見出すためにスクリーニングされなければならないコロニーの数を減少する
。１つの遺伝子が終了し、そして次に始まる位置は、この遺伝子中の天然に存在
する独特の制限酵素切断部位に基づいて選択され、可変長のフラグメント（また
はオリゴヌクレオチド）を生じる。このプロセスは、所定のＤＮＡ配列中の制限
酵素部位の位置および頻度を同定するソフトウェアの使用によっておおいに援助
される。

【００３３】 一旦、遺伝子フラグメントが首尾良く設計されると、共通の制限酵素部位は、
各フラグメントの末端に含まれて、各フラグメントのクローニングプラスミドへ
のライゲーションを可能にする。例えば、各遺伝子フラグメントへのＥｃｏＲＩ
部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の付加により、ｐＵＣ１９のポリリンカークロー
ニング領域への挿入が可能になる。次いで、各遺伝子フラグメントの３’１本鎖
および５’１本鎖は、クローニングベクターへの挿入のために適切な粘着末端を
用いる標準的な固相合成を使用して合成される。次いで、切断および脱塩に続い
て、１本鎖フラグメントは、ＰＡＧＥによって精製され、そしてアニーリングさ
れる。リン酸化の後、アニーリングされたフラグメントは、クローニングベクタ
ー（例えば、ｐＵＣ１９）へライゲーションされる。

【００３４】 ライゲーション後、このプラスミドを、ＤＨ５−Ｆ’コンピテントセルへ形質
転換し、そしてイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）／５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）
プレート上にプレートして、遺伝子フラグメントの挿入についてスクリーニング
する。次いで、遺伝子フラグメントを含む得られたコロニーを、適切な長さの挿
入についてスクリーニングする。これは、アルカリ溶解ミニプレッププロトコー
ルによって形質転換された細胞のコロニーからプラスミドを精製すること、およ
び遺伝子フラグメントのいずれかの末端に存在する制限酵素部位でこのプラスミ
ドを消化することによって達成される。アガロースゲル電気泳動による適切な長
さのフラグメントの決定の際に、このプラスミドを、配列決定する。

【００３５】 適切な配列を有する遺伝子フラグメントを含むプラスミドを同定する場合、次
いでこのフラグメントを切断し、そして使用して、全遺伝子を構築する。各時点
で、１つのプラスミドを、挿入点で酵素を用いて切断し、そしてプラスミドの脱
リン酸化後にアガロースゲルから精製する。その間に、挿入されるべきフラグメ
ントを含む第２のプラスミドをまた、切断して、そして挿入されるべきフラグメ
ントを、アガロースゲルから精製する。次いで、この挿入ＤＮＡを、脱リン酸化
プラスミドへライゲーションする。このプロセスは、全遺伝子が構築されるまで
続く。次いで、この遺伝子を、発現ベクター（例えば、ｐＥＴ１４ｂ）へ移動し
、そして発現のための細菌へ形質転換する。この最終ライゲーション後、全遺伝
子を、配列決定されて、正しいことを確認する。

【００３６】 融合タンパク質の発現は、細菌がｍｉｄ−ｌｏｇ期増殖に達するまで細菌を増
殖し、次いで、融合タンパク質の発現を誘導することで達成される。発現は、約
３時間続き、次いで細胞を収穫する。細菌細胞ペレットを得た後、この細胞を、
溶解する。この細胞膜および細胞屑を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を用いて細胞溶
解ペレットを洗浄することで除去し、封入体を相対的に純粋な形式にする。この
融合タンパク質を、高い尿素濃縮物を使用して可溶化し、そしてヒスチジン親和
性クロマトグラフィーによって精製する。次いで、生じたタンパク質を、尿素の
量をゆっくりと減少するように透析することで徐々に復元し、そして凍結乾燥す
る。

【００３７】 （ヘパリン−ペプチドキメラの取り込みを介するヘパリンの取り込み） 多糖片（ヘパリン−第ＸＩＩＩａ因子基質ペプチドキメラ）は、凝固の間にフ
ィブリンに取り込まれて、固定化されたヘパリン部位を提供して、増殖因子を結
合してその放出を遅くし得る。ヘパリン（または他の多糖（例えば、ヘパリン硫
酸またはコンドロイチン硫酸））は、ヘパリン−ペプチドキメラを構築すること
で第ＸＩＩＩａ因子を使用して直接フィブリンに接着され得る。このキメラは、
２つのドメイン（第ＸＩＩＩａ因子基質からなるペプチドドメインおよび多糖ド
メイン（例えば、ヘパリン））を含む。これらのキメラは、改変されたヘパリン
（または別の多糖）（例えば、ペプチドカップリングがヘパリン分子上で生じる
部位を制御するように独特な反応基を１つの末端で含む）を使用して作製される
。ペプチド上の独特な官能基（例えば、カップリングが所望されるペプチドの末
端のみに存在する側鎖）の使用を介して、ペプチド上のカップリングの位置は、
さらに制御され得る。ヘパリンの鎖（末端とは反対）に沿った第ＸＩＩＩａ因子
基質ペプチドを取り込むこと、および１つのヘパリン鎖あたり１つより多いこの
ようなペプチドを取り込むことでさえ、可能でもあるが、好ましいアプローチは
、単一の第ＸＩＩＩａ因子基質ペプチドをヘパリンの１つの末端で取り込むこと
である。次いで、これらのキメラは、第ＸＩＩＩａ因子の酵素的活性によって、
凝固の間にフィブリンゲルに共有結合的に架橋され、ヘパリンのフィブリンゲル
への直接接着を可能にし得る。

【００３８】 （タンパク質の放出速度を決定する際のヘパリンの濃度の役割） 増殖因子：ヘパリン−ペプチドキメラの最適比、または増殖因子：ヘパリン：
ヘパリン結合ペプチドの最適比ならびにヘパリン−ペプチドキメラまたはフィブ
リンへ取り込まれたヘパリン結合ペプチドの最適密度の決定は、重要である。ヘ
パリンに対する相対的に強い親和性にもかかわらず、ヘパリン結合増殖因子は、
短い時間の尺度でマトリクスから解離する。従って、過剰な結合部位は、増殖因
子が再びマトリクスに結合する前に拡散しないことを確実にする。この平衡はま
た、解離部位に近く隣接する細胞表面レセプターへの遊離増殖因子の結合を可能
にする。徐放のこの方法は、増殖因子の比較的長期な結合および増殖因子の局所
細胞への速やかな放出の両方を提供する。本明細書中で記載されるように、高い
比（従って放出の低い速度）が、最も所望される生物学的応答を提供する場合は
、いつもではない。特に、いくつかの増殖因子の場合、放出のより速やかな速度
が所望される場合があり得る。

【００３９】 どのような増殖因子に対する結合部位の比が、非常に緩やかな増殖因子放出に
よって決定される場合、細胞増殖用途に最適であるかを数学的に予測することが
試みられている。マトリクスからの増殖因子の受動放出の速度は、ヘパリン結合
性長因子に対するペプチドおよびヘパリンの比を介して調節され得、ヘパリン結
合増殖因子と比較してより過剰なヘパリンおよびヘパリン結合ペプチドは、より
緩やかな受動放出を導くことが示された。しかし、このような方法を使用して、
最適の放出特性を予測することが常に可能なわけではない。例えば、この例は、
ＢＭＰ−２が有利により速やかに物質（等モルにより近いＢＭＰ−２に対するヘ
パリンおよびヘパリン結合ペプチドの比を有する）から放出され得ることを示す
。いくつかの場合において、より良い結果は、より低いヘパリン対増殖因子比で
得られる。

【００４０】 活性形態においてヘパリン含有送達システムが増殖因子を送達する能力は、骨
形成の異所性モデルにおいて試験され、ここで送達システムおよびＢＭＰ−２を
含有するフィブリンマトリクスは、ラットにおいて皮下に移植された。このモデ
ルにおいて、骨形成のために好ましい条件は、１：１の低いヘパリン対増殖因子
比であった。より高い比（例えば、５：１またはそれより大きい）の付加は、骨
形成に対して阻害性であった。これらの結果は、以前に公開されていた研究に基
づいては予期されず、かつ低いヘパリン対増殖因子比はＢＭＰ−２の送達におい
て予期されない用途を有することが示唆される（実施例５を参照のこと）。

【００４１】 外因性第ＸＩＩＩ因子のフィブリノーゲン調製物への添加を、使用して、フィ
ブリンマトリクスと共に取り込まれたヘパリン結合ペプチドの数を増加し得、ヘ
パリン結合ペプチドがヘパリンに対する固定化部位および細胞接着部位の両方を
利用することが可能になる。ペプチド濃度におけるこの増加は、このような物質
が軸索伸長、および細胞移動の他の形式を、細胞接着部位としてのヘパリン結合
ドメインの使用を介して促進する能力を高め得た。ヘパリン結合ペプチドが接着
ペプチドとして作用し、従ってフィブリン中の細胞移動の速度を高め得ることが
示されている（Ｓａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９９）ＦＡＳＥＢ Ｊ．
１３：２２１４−２２２４）。しかし、この応答は、クロット中の１モルのフィ
ブリノーゲンあたり約８モルの取り込まれたペプチドを必要とした。従って、ヘ
パリン結合増殖因子の持続放出において親和性部位として使用するヘパリンに結
合するためのこれらのヘパリン結合ペプチドの多数の使用は、ヘパリン結合ペプ
チドの有益な接着効果を取り除き得る。この制限は、より高いレベルの外因性ヘ
パリン結合ペプチドの取り込みによって克服され得る。この取り込みは、フィブ
リノーゲン調製物へのより高いレベルの第ＸＩＩＩａ因子の添加を介して達成さ
れ得、従って、ペプチドが同時に両方の効果を有することを可能にする。従って
、１モルフィブリノーゲンあたり８モルのペプチドより大きい比（すなわち、１
モルフィブリノーゲンあたり２５モルのペプチド）でのさらなるペプチドの取り
込みは、薬剤送達のためにヘパリン結合ペプチドが細胞接着部位およびヘパリン
固定化部位として両方を利用することを可能にするのに有用であり得た。例えば
、５％のヘパリン結合部位を、使用して、薬物送達のためにヘパリンを固定化し
得、そして他の９５％は、細胞接着ドメインとして利用するために占有されず、
かつ遊離のままであり、従ってヘパリン結合ペプチドが、同じ物質中で細胞接着
ドメインおよび増殖因子固定化部位の両方として使用されることを可能にする。
ヘパリン結合ペプチドのこの二重使用は、外因性第ＸＩＩＩａ因子から利益を得
る。これは、相対的に高い数のヘパリン結合部位は、フィブリン物質中における
細胞接着および細胞移動を高めるためにフィブリンへ取り込まれなければならな
い（１モルのフィブリノーゲンあたり８モルのペプチド）ことが示されているか
らである。

【００４２】 （ヘパリン親和性部位の組み込みのための二ドメイン（ｂｉ−ｄｏｍａｉｎ）
ペプチドの使用） ペプチド−ペプチドキメラ（１方のドメイン上に第ＸＩＩＩａ基質を有し、他
方のドメイン上にヘパリン結合ペプチドを有する）の多くの可能性のある組み合
わせが存在する。これらの異なる組み合わせは、異なる利点および不利な点を有
する。例えば、いくつかの第ＸＩＩＩａ基質は、他よりもさらに効率的に取り込
まれる。さらに、異なるヘパリン結合ペプチドは、ヘパリンに対して異なる親和
性を有する。このペプチドの可能性のある免疫原性が、１つのさらなる検討事項
である。ヒトタンパク質の配列に基づいてペプチド配列を利用することが可能で
あるけれども、これらの２つのヒト配列の間の融合は、新しく、そして決して患
者の免疫系によってはみられない。従って、このような融合が免疫原性であり、
そしてどれか一方のタンパク質に対して、または融合部位自体に対して抗体を誘
導する危険性がある程度存在する。一般に、ペプチド配列が短いほど、長いポリ
ペプチド配列よりも抗原性応答を誘導する傾向が小さくなる。従って、α２プラ
スミンインヒビター第ＸＩＩＩａ因子基質およびアンチトロンビンＩＩＩヘパリ
ン結合ドメインを有するキメラは、例えば、血小板第４因子由来のヘパリン結合
ドメインと対応する二ドメインペプチドよりも抗原性応答を誘導する可能性が幾
分か大きいようである。

【００４３】 フィブリンネットワーク内にヘパリンを固定するために用いた二ドメインキメ
ラが免疫原性である可能性を低下させるさらなるアプローチは、１つのドメイン
においては、第ＸＩＩＩａ基質（例えば、タンパク質α２プラスミンインヒビタ
ーから）、および他方のドメインとしてヘパリン鎖を用いて、２つの間の共有結
合により、直接、ペプチド−ヘパリンキメラを形成することである。この様式で
は、天然ではないペプチド配列が融合部位に存在し、そのため免疫学的相互作用
の可能性は非常に低い。

【００４４】 （タンパク質の放出における融合タンパク質の使用） 当業者は、ヘパリンに対する親和性によるタンパク質の放出における融合タン
パク質の使用をさらに考慮し得る。ここでは、ヘパリンに結合しない生理活性タ
ンパク質の融合物がヘパリン結合ドメインを用いて構築されて、ヘパリンに結合
する融合タンパク質を生じ得る。さらに、ヘパリンに対する親和性を介したフィ
ブリン内の生理活性タンパク質の組み込みに対する代替として、このタンパク質
は、第ＸＩＩＩａ因子を用いて直接組み込まれ得る。それらが第ＸＩＩＩａ因子
について基質ドメインを保有する場合、天然にまたは組み換えタンパク質内への
組み込みのいずれかによって、生物学的に活性なタンパク質および第ＸＩＩＩａ
基質ドメインを有する融合タンパク質を形成することが可能である。

【００４５】 上記の融合タンパク質のいずれかの合成は、分子生物学的技術を利用すること
によって達成され得る。これを行うために、このタンパク質鎖内のアミノ末端も
しくはカルボキシ末端、または可能性としては他のいずれかに融合した配列を架
橋もしくは結合することで、目的のタンパク質配列全体を含む融合タンパク質が
作製され得る。これはＤＮＡレベルで行われる。なぜなら、第ＸＩＩＩａ因子架
橋基質またはヘパリン結合ドメインのいずれかをコードする配列は、例えば、も
とのタンパク質のコドンの初めまたは終わりに挿入され得るからである。これら
の改変されたタンパク質が発現される場合は、主なタンパク質ドメインのアミノ
末端もしくはカルボキシ末端、または他のいずれかに目的のさらなるドメインを
含む。タンパク質合成のために設計された自然の機構を使用することにより、高
い忠実度を有する大きいタンパク質を合成および精製することが可能になる。

【００４６】 標準的な分子生物学的技術を用いて、タンパク質配列またはＤＮＡ配列が既知
である任意の増殖因子の融合タンパク質を作製し得、ヘパリン結合ドメインまた
は酵素基質のような新規のドメインの付加が可能になる。これらの融合タンパク
質は、このタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに対して、または例えば
、このタンパク質鎖内に新規なドメインを付加するように構築され得る。この改
変は、増殖因子をコードするＤＮＡ配列、および架橋または結合の配列（例えば
、ヘパリン結合ドメイン）をコードするＤＮＡ配列の両方を含む遺伝子を構築す
ることによってＤＮＡレベルで作製される。次いで、このＤＮＡを発現プラスミ
ドに連結し、そして細菌に形質転換する。発現の誘導の際、細菌は大量の融合タ
ンパク質を生成する。発現後、このタンパク質は細胞溶解物から精製され、そし
て再折り畳み（リフォールディング）されなければならない。精製はしばしば、
高レベルで発現された哺乳動物タンパク質が細菌内で封入体を形成する傾向によ
って単純になる。

【００４７】 （組み込みのための融合タンパク質の設計） 組み換え融合タンパク質は、いくつかの異なるスキームを用いてフィブリンゲ
ル中に組み込まれ得る。最初の設計において、第ＸＩＩＩａ基質は、このタンパ
ク質に直接組み込まれた。この改変されたタンパク質が、フィブリンの重合化の
間に存在する場合、このタンパク質は、二ドメインペプチドと同様の様式でフィ
ブリンマトリクスに直接組み込まれる。別の方法は、ヘパリン結合ドメインを組
み込むために合成された融合タンパク質を含む。この実施例において、二結合ペ
プチド、ヘパリン、およびヘパリン結合融合タンパク質が、フィブリン重合化混
合物に含まれる。重合化の間、二ドメインペプチドは、フィブリンゲルに架橋さ
れる。この二ドメインペプチドは、ヘパリン結合配列に加えて、第ＸＩＩＩａ因
子基質配列を含む。このヘパリンは、フィブリンゲルに組み込まれた二ドメイン
ペプチドに結合し、そしてフィブリンマトリクスにトラップされる。このトラッ
プされた（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）ヘパリンは、操作されたヘパリン結合ドメイン
に対する結合によってフィブリン内のヘパリン結合融合タンパク質を隔離するよ
うに働く。この組み込みは、架橋されたペプチドが細胞に制御されたタンパク質
分解を通じてゲルから除去されるまで、この増殖因子を隔離するのに十分安定で
あることが示されている。

【００４８】 この技術は、第ＸＩＩＩａ基質配列と目的のタンパク質との間に酵素分解部位
を組み込むことによってさらに改変され得る。この酵素分解部位のＫ_ｍおよびｋ_ｃａｔ の注意深い選択により、分解がタンパク質マトリクスの前もしくは後のい
ずれかで生じるように、そして／または類似のもしくは類似していない酵素を利
用することにより、マトリクスを、各タイプのタンパク質および適用について仕
立てられている分解部位の位置で分解するように制御され得る。この新しいタン
パク質は、上記のようなフィブリンマトリクスに直接架橋され得る。しかし、酵
素分解部位を組み込むことは、タンパク質分解の間、タンパク質の遊離を変更す
る。細胞由来プロテアーゼが、隔離されたタンパク質に到達する場合、このプロ
テアーゼは、新しく形成された分解部位でこの操作されたタンパク質を切断する
。得られた分解産物は、遊離したタンパク質を含む。この遊離したタンパク質は
、いまやどのような操作された融合配列も、どのような分解フィブリンもほぼ含
まない。従って、この遊離タンパク質は、ネイティブの増殖因子の一次配列にほ
ぼ同一であり、そして潜在的にさらに生理活性である。類似の方法がヘパリン結
合融合タンパク質で用いられ得る。次いでこれらの新しいタンパク質は、プロテ
アーゼ分解部位、および新しいヘパリン結合ドメインを含む。このヘパリン結合
融合タンパク質は、ヘパリン結合ペプチドの共有結合（固定）を介したフィブリ
ンへのヘパリンの組み込みによってこのマトリクス中に隔離される。ここでも、
付加された新しいプロテアーゼ分解部位を考慮すれば、この放出されたタンパク
質は、天然のタンパク質に対する一次配列と同一である。

【００４９】 （ＩＩＩ．使用方法） 本明細書に記載されたポリマーは、移植の前にまたは移植時に、架橋されて、
組織の修復、再生、もしくは再構築、および／または生理活性因子の放出のため
のマトリクスを形成し得る。ある場合には、移植部位で組織に対してマトリクス
を一致させるために投与の部位で架橋を誘導することができる。他の場合には、
移植の前にマトリクスを調製することが都合がよく、このマトリクスがヘパリン
またはヘパリン結合ペプチド（増殖因子のような他の生理活性分子に結合するた
めに用いられる）を取り込む場合には、これらの因子は、移植の前にまたは移植
の時点でこのマトリクスに添加され得る。もともと充填された因子が放出された
場合には、これらの生理活性因子を有するマトリクスを、同様に「再充填（ｒｅ
−ｆｉｌｌ）する」ことも、ある場合には都合よい。

【００５０】 架橋は、内因性の架橋剤の添加によって、またはポリマーが第ＸＩＩＩａ因子
基質を含む場合には、手術手順の間、または移植の部位に局所的にトロンビンを
付与することにより、達成され得る。

【００５１】 細胞はまた、移植の前にもしくは移植の時点で、または移植の後でさえ、ポリ
マーの架橋の時点もしくはその後のいずれかで添加されて、マトリクスを形成し
得る。これは、細胞増殖または内殖を促進するように設計された間質性空間を生
成するようにマトリクスを架橋することに対する追加であり得るか、またはその
代わりであり得る。

【００５２】 ほとんどの場合、細胞成長または増殖を促進するようにマトリクスを移植する
ことが所望され得るが、いくつかの場合には、細胞増殖の速度を阻害するために
生理活性因子が用いられる。特定の適用は、手術後の接着の形成を阻害すること
である。

【００５３】 以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。組成物お
よび方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の、概念、精
神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物、方法およびこの
方法の工程のまたはこの工程の順序に対して、バリエーションが適用され得るこ
とが当業者には明白である。

【００５４】 （実施例１：増殖因子に結合するヘパリン結合ペプチドを介したヘパリンの間
接的カップリング） 標準的な固相合成によって、第ＸＩＩＩａ因子基質およびヘパリン結合ドメイ
ンの両方を含むペプチドキメラを合成した。サンプルペプチドは、以下の配列：
ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＫ（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ（配列番号２１）を含む
ペプチドであり、ここでこのペプチドのＮ末端は、第ＸＩＩＩａ因子基質を含み
、そしてイタリック体の配列（ここで、後半に表記した（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬ
ＹＲＫＡはイタリック体である）は、ＡＴＩＩＩのヘパリン結合ドメイン由来の
改変ペプチドを含む（ｄＬは、ダンシルロイシンを示し、これを用いて、蛍光に
よるこのペプチドの検出が可能になる）。

【００５５】 サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、以前に開発された組み込み方法を用
いた、フィブリンゲルに架橋したペプチドの量を決定した。アンチトロンビンＩ
ＩＩ由来のヘパリン結合ドメインおよび蛍光標識を含む二ドメインペプチドを、
重合化の間、フィブリンゲルに組み込んだ。遊離のペプチドをゲルから洗浄し、
そしてフィブリンネットワークをプラスミンで分解した。分解産物を高速液体ク
ロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって分析して、１モル
あたりのフィブリノーゲン（ＵＶ吸収）に存在するペプチドの量を（蛍光によっ
て）決定した。ペプチド改変ゲルからの蛍光シグナルは、遊離のペプチドだけか
らのシグナルよりも早期の溶出時間で出現し、このことは改変ゲル中に存在した
全てのペプチドがフィブリンに架橋されたことを示した（図１）。プラスミンで
分解したペプチドネットワークおよびフィブリンネットワークの両方について既
知の濃度標準に基づいた定量によって、１モルあたりのフィブリノーゲンに８．
７±０．２モルのペプチドが組み込まれたことが示された（ｎ＝１０）。

【００５６】 共有結合した二ドメインペプチド（その１ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子基質
であり、そしてその１ドメインは、アンチトロンビンＩＩＩに基づくヘパリン結
合ドメインである）をまた含むフィブリン細胞内殖マトリクス由来のヘパリン結
合増殖因子の放出のためのこのアプローチを評価するために、後根神経節を以下
に示すような、種々の条件下で、フィブリンゲル内で３次元的に培養した。

【００５７】 （ヘパリン結合ペプチドの使用のための架橋プロトコール） １）４ＬのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）
に対して２４時間フィブリノーゲン（８ｍｇ／ｍｌ）を透析する ２）０．２μｍシリンジフィルターを用いてフィブリノーゲンを濾過滅菌する ３）以下のペプチド溶液を作製する：

【００５８】

【表３】 ４）トロンビン溶液を作製する：５ｍｌ ＴＢＳに１００単位含有 ５）各ペプチド溶液に１．４ｍｌのフィブリノーゲンを添加する ６）ゲルを作製する：２０μｌのＴＢＳ＋５０ｍＭ ＣａＣｌ_２、４０μｌの
トロンビン溶液（２０単位／ｍｌ）、および３４０μｌのペプチド溶液＋フィブ
リノーゲンを添加する（上記の溶液を６ゲル作製する） ７）３７℃で１時間インキュベートする ８）２４時間で５回洗浄する。最初の４回は１ｍｌのＴＢＳを用い、最後の１
回はニューロン培地を用いる ９）８日目にニワトリ胚後根神経節を解剖する １０）各ゲルに１つの神経節を置いて、３７℃で１時間置く １１）各ゲルに１ｍｌの神経培地を添加する １２）２４時間後培地を交換する。

【００５９】 後根神経節を用いたこれらの研究の結果を図２に示す。ペプチドおよびヘパリ
ンなしで添加した場合、ｂＦＧＦは、神経突起成長を増強せず、このことは、用
いた洗浄プロトコールが十分であることを示す。神経突起増強は、用量依存性の
様式で結合したｂＦＧＦの１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの両方の添加によっ
て増大する。１．０μｇ／ｍｌの結合したＶＥＧＦの添加によって、神経突起伸
長は増大せず、このことはｂＦＧＦの効果が、新脈管形成を促進する能力には因
らないことを示唆した。

【００６０】 （実施例２：ヘパリン−ペプチドキメラの合成） 還元的アミノ化を介して、Ｎ末端上に第ＸＩＩＩａ因子基質を、およびＣ末端
にポリリジンを含むペプチドを、一方の末端に特有のアルデヒド基を有するヘパ
リンオリゴサッカライドにカップリングすることによって、ヘパリン−ペプチド
キメラを合成する。以下の配列ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＫＫＫＧ（配列番号２２）
を有するペプチドを、標準的な固相ペプチド化学で合成する。ヘパリンオリゴサ
ッカライドを、ヘパリンの標準的亜硝酸分解によって作製し、切断されたオリゴ
サッカライドの還元末端上にアルデヒドの形成を生じる。カップリングの間、リ
ジン側鎖のアミノ基は、ヘパリンオリゴサッカライドの還元末端上のアルデヒド
を攻撃して、シッフ塩基を形成する。次いでこのシッフ塩基を還元して安定な生
成物を形成する。サンプルカップリングプロトコールは以下に示す。当業者はま
た、ヘパリンをさらに単純なα２プラスミンインヒビター基質部位ＮＱＥＱＶＳ
Ｐ（配列番号２０）にカップリングし得る。第一級アミンは、ペプチドのＮ末端
にのみ存在する。ペプチドが、従来どおり固相樹脂上に合成されるとき、Ｎ末端
はダングリングに曝露され、そしてＮ末端上のαアミンが脱保護され、第一級ア
ミンが反応に利用可能である。ヘパリンの反応型は、Ｇｒａｉｎｇｅｒ，Ｄら（
１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．２２：２３１〜２４９に記載の
ように、特定の酸での切断によって容易に形成され、末端アルデヒド基とヘパリ
ンフラグメントを形成し得る。この反応性アルデヒドは、樹脂（その上に縮合さ
れた）に結合されたままのペプチドを通過し、シッフ塩基（水素化ホウ素シアン
ナトリウムで容易に還元されてさらに安定な型である二級アミンを形成し得る）
に結合されるペプチド−ヘパリンキメラを形成し得る。

【００６１】 他のアプローチが使用され得る。例えば、アルデヒドヘパリンは、上記された
のと同様に、過剰のエチレンジアミンとの反応およびシッフ塩基の還元によって
第一級アミノヘパリンに変換され得る。遊離残基エチレンジアミンからの精製は
、透析によって達成され得る。このアミンヘパリンは、まだ保護されているＥ残
基上のカルボキシル基を有する固相樹脂からペプチドを切断することによって、
続いてペプチド合成からの標準的試薬を用いたＣ末端上のカルボキシル基の活性
化によって、続いてこのＥ残基上のカルボキシル基の脱保護によって、このＣ末
端カルボキシル基上に縮合され得る。

【００６２】 （カップリングプロトコール：） １）５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９）中に、１．８ｍＭのペプチドおよび１
．８ｍＭの亜硝酸分解ヘパリンを溶解する。３０分間反応させる ２）１６０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ_３を添加し、１２時間反応させる ３）２４０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ_３を添加し、１２時間反応させる ４）希塩酸でｐＨ７に調整する ５）最終濃度１ＭにＮａＣｌを添加する ６）４Ｌの脱イオン水に対して２４時間透析する ７）凍結乾燥して反応生成物を得る ８）サイズ排除クロマトグラフィーによって反応収率を分析する ９）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物の精製を達成す
る （ヘパリン−ペプチドキメラの使用のための架橋プロトコール：を使用する） １）４ＬのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）
に対して２４時間フィブリノーゲン（８ｍｇ／ｍｌ）を透析する ２）０．２μｍシリンジフィルターを用いてフィブリノーゲンを濾過滅菌する ３）以下のキメラ溶液を作製する：

【００６３】

【表４】 ４）トロンビン溶液を作製する：５ｍｌ ＴＢＳに１００単位含有 ５）各キメラ溶液に１．４ｍｌのフィブリノーゲンを添加する ６）ゲルを作製する：２０μｌのＴＢＳ＋５０ｍＭ ＣａＣｌ_２、４０μｌの
トロンビン溶液（２０単位／ｍｌ）、および３４０μｌのキメラ溶液＋フィブリ
ノーゲンを添加する（上記の溶液を６ゲル作製する） ７）３７℃で１時間インキュベートする ８）２４時間で５回洗浄する。最初の４回は１ｍｌのＴＢＳを用い、最後の１
回はニューロン培地を用いる ９）８日目にニワトリ胚後根神経節を解剖する １０）各ゲルに１つの神経節を置いて、３７℃で１時間置く １１）各ゲルに１ｍｌの神経培地を添加する １２）２４時間後培地を交換する。

【００６４】 （実施例３：融合タンパク質およびペプチドキメラにおける分解部位） （第ＸＩＩＩａ因子基質を含む−ＮＧＦ融合タンパク質およびプラスミン分解
部位） −ＮＧＦ融合タンパク質を、−ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンマトリクス
に酵素的に架橋することを可能にする内因性架橋基質を用いて発現し、これは薬
物送達系のベース材料として役立つ。プラスミン基質は、この架橋基質と融合タ
ンパク質の−ＮＧＦドメインとの間に位置し、これは分解リンカーとして働き、
そして酵素切断によって−ＮＧＦがそのネイティブの配列とほとんど同一の形態
でこのマトリクスから放出されることを可能にする。このＮＧＦ融合タンパク質
を、第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ活性によってフィブリンに共有
結合し、そしてこれを細胞関連酵素活性に応答して活性な増殖因子を放出するこ
の送達系の能力を決定するために、神経再生のインビトロモデルにおいて試験し
た。

【００６５】 （遺伝子合成） ２つの−ＮＧＦ融合タンパク質を、組換えタンパク質発現によって作製した。
各タンパク質は、２−プラスミンインヒビター、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号２
３）由来のトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）第ＸＩＩＩａ因子基質からなるタン
パク質のＮ末端に、架橋基質を含んだ。各−ＮＧＦ融合タンパク質はまた、この
タンパク質のＣ末端にネイティブの−ＮＧＦ配列を含んだ。２つのプラスミン基
質（Ｐ）（機能的プラスミン基質（ＬＩＫ／ＭＫＰ、ここで／は切断部位を示す
）または非機能的プラスミン基質（ＬＩＮＭＫＰ）のいずれか）のうちの１つを
、架橋基質と融合タンパク質の−ＮＧＦドメインとの間に配置し、ここで、プラ
スミン基質における切断部位のリジン残基を、プラスミン基質を非機能的にする
ために、アスパラギン（ａｓｐａｒｉｇｉｎ）残基に変更した。機能的プラスミ
ン基質を含む融合タンパク質を、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦと示し、そして、非機能的プ
ラスミン基質を含む融合タンパク質を、ＴＧ−Ｐ_ｉ−ＮＧＦと示す。

【００６６】 発現するタンパク質配列は、以下である：

【００６７】

【表５】 （配列番号２４）、ここで、斜体の領域は、この発現ベクター由来のヒスチジン
タグであり、そして下線を引かれた領域は、トロンビン切断部位である。この残
基は、第ＸＩＩＩａ因子についての架橋基質配列であり、そして二重下線が引か
れている領域は、プラスミン基質を示す。

【００６８】 遺伝子構築のために使用したクローニングプラスミドは、ｐＵＣ １８であっ
た。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’で以下のようである：

【００６９】

【表６】 （配列番号２５）。

【００７０】 組換えタンパク質発現によって−ＮＧＦ融合タンパク質を合成するために、こ
のタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。一旦、この遺伝子フラグ
メントを設計すると、Ｅｃｏ ＲＩ部位およびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を各フラグ
メントの末端に付加して、これらのフラグメントのｐＵＣ１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｂ
ａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のポリクローニングリンカーへのクローニ
ングを可能にした。各遺伝子フラグメントの３’および５’一本鎖オリゴヌクレ
オチドを、２つのクローニング制限部位に対する粘着性の末端を用いてＭｉｃｒ
ｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって合成した。
この一本鎖オリゴヌクレオチドを、変性ポリ−アクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）を使用して精製し、各フラグメントについて最も高い分子量バンドをこ
のゲルから抽出し、そして対応する３’および５’リゴヌクレオチドフラグメン
トをアニールした。このアニールしたフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡキナーゼ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒ
ｌａｎｄ）でリン酸化し、そしてｐＵＣ １８に連結した。連結後、このプラス
ミドをＤＨ５−Ｆ’コンピテント細胞へと形質転換し、そしてイソプロピル−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）／アンピシリン（Ａｍｐ）プレー
トへとプレートして、このプラスミドへのこの遺伝子フラグメントの挿入につい
てスクリーニングした。挿入した遺伝子フラグメントを含むコロニー由来のプラ
スミドを、正確な配列を有する遺伝子フラグメントを含むコロニーを同定するた
めに配列決定した。各フラグメントについての正確な配列を得た後、このフラグ
メントを、この融合タンパク質についての完全な遺伝子を形成するために、構築
した。手短に言うと、フラグメント２を含むプラスミドを、酵素ＥｃｏＲ Ｖお
よびＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化し、
そしてこのフラグメントを、非変性ＰＡＧＥによって精製した。フラグメント１
を含むプラスミドを、酵素Ｅｃｏ ＲＶおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、アル
カリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で脱リン酸し
、そしてこの消化したプラスミドを、アガロースゲル電気泳動で精製した。フラ
グメント２を、フラグメント１を含む消化したプラスミドに連結して、フラグメ
ント１および２の両方を含むプラスミドを得た。このプラスミドをＤＨ５−Ｆ’
コンピテント細胞へと形質転換し、そしてＡｍｐプレートにプレートした。得ら
れたコロニーを、両方のフラグメントを含むプラスミドについてスクリーニング
し、そしてこれらのプラスミドを配列決定した。このプロセスを、−ＮＧＦ融合
タンパク質についての完全な遺伝子が構築されるまで繰り返した。

【００７１】 ＴＧ−Ｐ_ｉ−ＮＧＦ融合タンパク質のための遺伝子を、部位特異的変異誘発に
よってＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ遺伝子から作製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を、この遺伝子の所望の改変を含むプライマーを使用して、プラスミン基質をコ
ードするこの融合タンパク質の遺伝子の領域を改変するために行った。テンプレ
ートとしてＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ遺伝子を使用して、２つの反応を行った（一方はプ
ライマーＡおよびプライマーＢを用いて、そして他方はプライマーＣおよびプラ
イマーＤを用いて）。

【００７２】 プライマーＡ ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ ＡＣＣＡＴＧ（Ｍ１３逆方向） プライマーＢ ＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴ ＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣ ＡＧＴ プライマーＣ ＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴ ＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧ ＧＡＡ プライマーＤ ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧ ＧＣＣＡＧＴ（Ｍ１３） （配列番号２６〜２９）。この２つの反応からの産物を、アガロースゲル電気泳
動によって精製し、そして第３の反応のためのプライマーとして使用した。プラ
イマーＡおよびＤもまた、所望の産物を増幅（ａｍｐｌｙ）するために第３の反
応に添加した。この最終反応産物を、Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消
化し、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製した。このＰＣＲフラグメン
トをｐＵＣ １８にクローニングし、そして正確なＰＣＲ産物を同定するために
配列決定した。

【００７３】 （タンパク質の発現） この−ＮＧＦ融合タンパク質の各々についての完全な遺伝子を、ｐＵＣ１８か
ら消化して切り出し、そして発現ベクターｐＥＴ１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）に連結した。この発現ベクターを、発現宿主
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへと形質転換し、融合タンパク質発現の厳密な調
節を可能にした。この融合タンパク質を、これらが中間対数（ｍｉｄ−ｌｏｇ
ｐｈａｓｅ）増殖期（６００ｎｍでの光学密度０．４〜０．６）に達するまでＥ
．ｃｏｌｉを増殖し、次いで培養培地への０．４ｍＭのＩＰＴＧの添加によって
タンパク質発現を誘導することによって、発現した。この細菌を、２時間後に、
５５００×ｇでの遠心分離によって収集した。収集後、この細胞を、１／１０培
地容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に懸
濁した。リゾチーム（０．４ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮａｓｅ（５ｎｇ／ｍＬ）を
、この収集した細胞に添加し、そしてこの溶液を３７℃で３０分間インキュベー
トした。この封入体を、１０，０００×ｇの遠心分離１５分によって細胞溶解物
から収集した。この封入体を含むペレットを、６Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｕＨ
Ｃｌ）を含む４０ｍＬ／リットルの培地容量の結合緩衝液５ｍＭ イミダゾール
、０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ７．９）中、室温で
９０分間再懸濁した。この溶液中の不溶性物質を、２０，０００×ｇでの遠心分
離２０分によって収集し、そして溶解した融合タンパク質を含む上清を、さらな
る精製のために保管した。

【００７４】 （タンパク質の精製） この融合タンパク質は、このタンパク質のＮ末端に精製のためのトロンビン切
断可能ヒスチジンタグを有した。なぜなら、−ＮＧＦ融合タンパク質のための遺
伝子は、ｐＥＴ１４ｂのＮｄｅ Ｉ部位とＢａｍ ＨＩ部位との間に挿入さるた
めである。ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して、この−ＮＧＦ融合タ
ンパク質を精製した。Ｈｉｓ Ｂｉｎｄ^ＴＭ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）をクロマト
グラフィーカラムにパッキングし（１リットルの培地容量当り２．５ｍＬの吸着
床容量）、Ｎｉ^＋＋を充填し、そして６ＭのＧｕＨＣｌを含む結合緩衝液で平衡
化した（製造者の指示に従って）。融合タンパク質を含む上清を、５μｍのシリ
ンジフィルタで濾過し、そしてこのカラムにロードした。このカラムを、８Ｍの
尿素を含む１０カラム容量の結合緩衝液、および８Ｍの尿素を含む６カラム容量
の洗浄緩衝液（２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した。この融合タンパク質を、８Ｍの尿素を
含む４カラム容量の溶出緩衝液（１Ｍ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で溶出した。この溶出画分中の−ＮＧ
Ｆ融合タンパク質の存在を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥによ
って確認した。

【００７５】 （タンパク質の再折り畳み） ５倍過剰の氷冷折り畳み緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、２５０ｍＭ
ＮａＣｌ、２ｍＭの還元グルタチオンおよび０．２ｍＭの酸化グルタチオン、ｐ
Ｈ８．０）を、この精製−ＮＧＦ融合タンパク質に、１．３Ｍの最終尿素濃度が
達成されるまでゆっくりと添加することによって、−ＮＧＦ融合タンパク質を折
り畳みした。この融合タンパク質を、攪拌しながら４℃で４８時間再折り畳みし
た。この再折り畳み融合タンパク質を、１０％のグリセロールを含む５０倍過剰
の貯蔵緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．
０）に対して、４℃で一晩透析した。この融合タンパク質を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ^ＴＭ コンセントレータ（５０００ＭＷのカットオフ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＫ）を使用する遠心分離によって、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセ
イで測定する場合に約３００〜４００μｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。

【００７６】 （−ＮＧＦ融合タンパク質のフィブリンマトリクスへの取り込み） フィブリンマトリクスへの−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込みの効率を決定す
るために、ＴＧ−Ｐ_ｉ−ＮＧＦ融合タンパク質をビオチンで標識して、直接酵素
連結免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による−ＮＧＦの定量化を可能にした。２
０倍モル過剰のスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ＬＣビオチン
（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド中の１０ｍｇ／ｍＬビオチンのストック溶液（３７℃で１０
分間溶解した）からの１ｍｇ／ｍＬの濃度で、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ
、０．０１Ｍ リン酸緩衝液、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、ｐ
Ｈ７．４）中の−ＮＧＦ融合タンパク質に添加した。この反応を、室温で２時間
進めた。次いで、未反応のビオチンを、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用す
るゲル濾過クロマトグラフィーによって除去した。

【００７７】 既知量の標識された−ＮＧＦを、コーティング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３ 、ｐＨ８）中、４℃で一晩９６ウェルプレートに吸着させた。このウェルを、
ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間、室温でブロックした。
このウェルを、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ緩衝液）中
で３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したストレ
プトアビジンを、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬまで希釈し、そして各ウェルに１時間
添加した。このウェルを、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、次いでＡＢＴＳ（２，
２’−アジノ（Ａｚｉｎｏ）−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スル
ホン酸））展開溶液（０．１Ｍ ＮａＣ_２Ｈ_３Ｏ_２、０．０５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４ 、０．１％ ＡＢＴＳ、０．０１％ Ｈ_２Ｏ_２、ｐＨ４．２）中でインキュベ
ートした。１〜５分後、この反応を、等量の０．６％ ＳＤＳの添加によって停
止し、そして各ウェルの吸光度を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（
Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）のＥＬ３１１ＳＸプレートリーダーを使用
して４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍの吸光度に対する−ＮＧＦ濃度の標準曲
線を、直接ＥＬＩＳＡアッセイからのこれらの測定を使用して作成した。

【００７８】 プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンを水に溶解し、そしてＴｒｉｓ
緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ，３３ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２
ｇ／Ｌ ＫＣｌ）、ｐＨ７．４に対して２４時間透析した。−ＮＧＦ融合タンパ
ク質を、５ｍＭ Ｃａ^＋＋および４ ＮＩＨ単位／ｍＬのトロンビンと共に３７
℃で１時間インキュベートして、精製に使用したヒスチジンタグを除去した。こ
の−ＮＧＦ融合タンパク質溶液を、８ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノーゲンと同
じ比率で混合し、そして３７℃で６０分間重合した。フィブリンマトリクスを、
２４時間にわたって５回洗浄し、そして各洗浄液を、このマトリクスから洗浄さ
れた−ＮＧＦの総量を決定するために保管した。２４時間後、−ＮＧＦを含むフ
ィブリンマトリクスを、０．１Ｕのブタプラスミンで分解した。洗浄液中の−Ｎ
ＧＦおよびマトリクスに残っている−ＮＧＦの量を、直接ＥＬＩＳＡによって上
記のように定量し、そして−ＮＧＦ標準曲線を、実施した各ＥＬＩＳＡについて
作成した。

【００７９】 −ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンマトリクスに共有結合していることを直
接示すために、ウエスタンブロットを行った。フィブリンマトリクスを作製し、
そして取り込み定量アッセイにおいて記載したように洗浄した。このマトリクス
を、上記のように、２４時間かけて５回洗浄し、次いでプラスミンで分解した。
この分解産物を、１３．５％変性ゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離
した。このゲルからのタンパク質を、活性化したＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ^ＴＭポ
リビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｖｏｌｋｅｔ
ｓｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に、４００ｍＡの電流を用いて１時間かけ
て移した。この膜を一晩乾燥した。膜に移したタンパク質（分子量マーカーを含
む）を、０．２％のＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色することによって可視化した。こ
の膜に結合した非特異的タンパク質を、ＴＢＳ中の３％ ＢＳＡで２時間ブロッ
クした。この膜を、３％ＢＳＡ中０．２μｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ヒト−ＮＧＦ
抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ
）と共に１時間インキュベートした。この膜を、ＴＢＳで５分間かけて３回洗浄
し、そして二次抗体、３％ ＢＳＡ中０．５μｇ／ｍＬの濃度のＨＲＰ結合体化
ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｚｕｇ，Ｓ
ｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に３０分間インキュベートした。この膜をＴＢＳで
３回洗浄し、次いでＴＢＳ中で１：５に希釈した増感した化学発光ＨＲＰ基質（
Ｐｉｅｒｃｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に５分間イン
キュベートした。この膜から過剰の液体を除去し、そしてこれをプラスチックで
覆い、そしてＸ線フィルムに５〜６０秒間曝露した。

【００８０】 フィブリンマトリクスの重合の間に存在する−ＮＧＦ融合タンパク質について
の分子量の増加が実際に観察されたが、架橋基質を欠く−ＮＧＦの場合、洗浄後
このマトリクスには−ＮＧＦは観察されなかった。この結果は、ＮＧＦ融合タン
パク質が、第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ活性を介して、重合の間
にフィブリンマトリクスに共有結合的に固定されたことを直接示した。

【００８１】 （固定化−ＮＧＦ融合タンパク質の生理活性） 共有結合的に固定された−ＮＧＦ融合タンパク質が制御された様式で誘導され
る能力を決定するために、−ＮＧＦ融合タンパク質を、重合の間にフィブリンマ
トリクスに組み込み、そしてこれらのマトリクスがインビトロで神経突起の伸長
を増大する能力を、ニワトリＤＲＧを使用してアッセイした。ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ
は、この培養培地にＮＧＦが存在しない未改変フィブリンに対して３５０％を超
えて神経突起伸長を増大すること、および培地にネイティブの１０ｎｇ／ｍＬの
ＮＧＦを含む未改変フィブリンよりも５０％増大することを見出した（図３）。
ＴＧ−Ｐ_ｉ−ＮＧＦ（これは、非機能的プラスミン基質を含む）は、プラスミン
によってネイティブの形態ではフィブリンマトリクスから切断され得ず、そして
試験した濃度のいずれかでフィブリンマトリクス内に共有結合的に固定される場
合、培養培地中のネイティブのＮＧＦに対して有意な神経突起の伸長の増大を起
こさなかった。しかし、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ（これは、機能的プラスミン基質を含
む）は、プラスミンによってネイティブのＮＧＦに非常に類似した形態でこのマ
トリクスから切断され得、そして培養培地に存在するネイティブのＮＧＦの同様
の用量と比較した場合でさえも、神経突起の伸長の増大が観察された。ＴＧ−Ｐ
−ＮＧＦ融合タンパク質についての用量応答効果を観察し、１〜５μｇ／ｍＬの
−ＮＧＦ融合タンパク質が重合混合物に存在する場合に、最適な用量を達成した
。これらの結果は、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ融合タンパク質が、フィブリンマトリクス
内に固定される場合に生理活性を有することを実証し、これは、このタンパク質
が細胞関連マトリクス分解によって活性な形態で放出され得ることを示唆する。
ＰＣ１２細胞活性アッセイにおける−ＮＧＦ融合タンパク質の低い活性にもかか
わらず、プラスミン分解可能な−ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンに共有結合
される場合、これは培養培地中のネイティブのＮＧＦの同じ用量よりも神経突起
の伸長のより高いレベルを促進した。これらの結果はまた、−ＮＧＦ融合タンパ
ク質が完全に活性化されていることを示唆し、これらはそのネイティブの構造に
類似の形態でフィブリンマトリクスから放出されているに違いない。

【００８２】 （−ＮＧＦ融合タンパク質架橋の効率） フィブリンマトリクスへの−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込みの効率を決定す
るために、このタンパク質をビオチンで標識し、そして重合混合物中にビオチン
標識された−ＮＧＦ融合タンパク質を含むフィブリンマトリクスについて直接Ｅ
ＬＩＳＡを行った。ビオチン標識された−ＮＧＦ融合タンパク質を、重合の間に
フィブリンマトリクス中に取り込んだ。任意の未結合−ＮＧＦ融合タンパク質を
除去するために洗浄した後、このマトリクスをプラスミンで分解し、そして分解
したマトリクス中の−ＮＧＦおよび洗浄液中の−ＮＧＦの量を定量した。フィブ
リンマトリクス中に取り込まれた−ＮＧＦ融合タンパク質のパーセンテージは、
重合混合物における−ＮＧＦの濃度の関数として図４に示される。試験した−Ｎ
ＧＦ融合タンパク質の濃度範囲にわたって、融合タンパク質のうち５０〜６０％
が、フィブリンマトリクスの重合の間に取り込まれた。この結果は、ＮＧＦ融合
タンパク質が、第ＸＩＩＩａ因子の作用を介してフィブリンマトリクスに効率的
に取り込まれることを実証した。

【００８３】 （ヘパリン結合メインおよびプラスミン分解部位を有する−ＮＧＦ融合タンパ
ク質） ＮＧＦは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で融合タンパク質として発現され得、これは、ヘパ
リン結合ドメインをＮ末端に、プラスミン基質を中央に、そしてＮＧＦ配列をこ
のタンパク質のＣ末端に含む。これは、所望の融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａを含む合成遺伝子を構築することによって達成される。発現のためのこのタン
パク質配列は、以下の通りである：

【００８４】

【表７】 （配列番号３０）、ここで、斜体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグ
であり、そして下線を引かれた領域は、トロンビン切断部位である。破線での下
線は、ヘパリン結合配列を示し、そして二重下線は、プラスミン基質を示す。

【００８５】 遺伝子構築のために使用したクローニングプラスミドは、ｐＵＣ １８であっ
た。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’で以下の通りである：

【００８６】

【表８】 （配列番号３１）。

【００８７】 この遺伝子を、マップに示されるように、ｐＵＣ １８のポリリンカークロー
ニング領域においてＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入する。

【００８８】 構築後、この遺伝子を発現ベクターに挿入する。次いで、発現および精製を、
上記のように行う。

【００８９】 （実施例４：自発的にヘパリンに結合する増殖因子の融合タンパク質） （Ａ．ＮＧＦとの第ＸＩＩＩａ基質融合タンパク質の生合成） ＮＧＦは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて融合タンパク質として発現され得、タンパク
質のＮ末端に第ＸＩＩＩａ因子基質およびタンパク質のＣ末端にヒト−ＮＧＦ配
列を含む。これは、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む合成遺伝子
を構築することにより達成される。この発現されるタンパク質配列は以下のよう
なものである。

【００９０】

【表９】 ここで、イタリック体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そ
して下線の領域は、トロンビン切断部位である。これらの残基は、第ＸＩＩＩａ
因子に対する架橋基質配列である。

【００９１】 遺伝子構築に用いられたクローニングプラスミドは、ｐＵＣ１８（これは、ポ
リリンカークローニング領域の配列が逆であることを除いてｐＵＣ１９と同一で
ある）であった。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手したｐＵＣ
１９のマップを以下に示す。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’に向かっ
て以下のような配列である。

【００９２】

【表１０】 この遺伝子は、マップに示されるように、ｐＵＣ１８のポリリンカークローニ
ング領域中のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されている。遺
伝子構築後、この遺伝子を、発現ベクターｐＥＴ １４ｂのＮｄｅＩ部位とＢａ
ｍＨＩ部位との間に挿入する。Ｎｏｖａｇｅｎから入手したｐＥＴ １４ｂベク
ターのマップを以下に示す。この遺伝子の発現ベクターへの挿入後、プラスミド
をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞中に形質転換する。この細胞
を、約０．６のＯＤに達するまで増殖させ、次いでＩＰＴＧ（溶液中の最終濃度
０．４ｍＭ）を用いて融合タンパク質の発現を誘導する。発現を２〜３時間継続
する。この細胞を５分間氷上に静置し、次いで４℃にて５分間、５０００×ｇで
の遠心分離により収集する。それらを、０．２５培養容量の冷５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に２５Ｃにて再懸濁する。これらの細胞を前回と同様
に遠心分離し、ペレットを凍結する。細胞を解凍の際に溶解させる。

【００９３】 この細胞溶解物を遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットをＴｒｉｔｏｎ Ｘ
１００に再懸濁する。次いで、この溶液を遠心分離し、上清を廃棄する。ペレッ
トを６Ｍ尿素に再懸濁し、そして融合タンパク質をヒスチジンアフィニティーク
ロマトグラフィーにより精製する。ヒスチジンタグを重合の間にトロンビンによ
り切断し得、そして標準的な洗浄手順の間にゲルから洗浄し得る。

【００９４】 （Ｂ．ＮＧＦのヘパリン結合ドメイン融合タンパク質の生合成） ＮＧＦを、タンパク質のＮ末端にヘパリン結合ドメインおよびタンパク質のＣ
末端にＮＧＦ配列を含む融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現し得る
。これを、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む合成遺伝子を構築す
ることにより達成する。この発現されるタンパク質配列は、以下のようなもので
ある。

【００９５】

【表１１】 ここで、イタリック体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そ
して下線の領域は、トロンビン切断部位である。点線で下線を引いた領域は、ヘ
パリン結合配列である。

【００９６】 遺伝子構築に用いられたクローニングプラスミドはｐＵＣ１８であった。この
遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’に向かって以下のような配列である。

【００９７】

【表１２】 この遺伝子は、マップに示されるように、ｐＵＣ１８のポリリンカークローニ
ング領域中のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されている。構
築後、この遺伝子を、発現ベクターに挿入する。次いで、発現および精製を、上
記のように実施する。

【００９８】 （実施例５：ヘパリン親和性の二ドメインペプチドを有するフィブリンマトリ
クスからのＢＭＰ２の送達） フィブリンマトリクスに結合した骨形成因子がこの因子の放出を制御し得るこ
と、およびこのマトリクスが移植される場合、皮下での異所性の骨が形成される
ことが実証された。この手順は骨欠陥における骨形成と異なるが、生理活性増殖
因子のインビボでの放出を制御する能力を試験するための適切な方法を提供する
。

【００９９】 フィブリンゲルを、配列ＬＮＱＥＱＶＳＰＫ（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ
（配列番号３６）を有する異なる二ドメインペプチドを用いて合成した。このペ
プチドは、第１のドメインにおける２−プラスミンインヒビターについての第Ｘ
ＩＩＩａ因子基質配列および第２のドメインにおける抗トロンビンＩＩＩのヘパ
リン結合ドメインの模倣物に由来する。ＢＭＰ−２はヘパリン結合タンパク質で
あり、そして上記の配列に結合する。ゲルをペプチド（１ｍＭ）、ヘパリン、お
よび組換えヒトＢＭＰ−２の存在下（ヘパリン：ＢＭＰ−２の比が１：１および
４０：１）で重合した。

【０１００】 等量の形態形成タンパク質、ＢＭＰ−２を有するが、ヘパリンおよび二ドメイ
ンペプチドを欠くコントロールゲルを作製した。次いで、これらのゲルを、ラッ
トに皮下移植し、そして２週間維持した。マトリクスを取り出したとき、ペプチ
ド−ヘパリン放出系を含まなかったゲルから骨はほとんどから全く観察されなか
ったが、この系を含んだゲルは有意な骨形成を示した。

【０１０１】 これは、取り出されたマトリクスの質量において最も見出された。これを表３
に示す。

【０１０２】

【表１３】 この放出系は、マトリクス内での異所性の骨の形成を増強し、このことは、イン
ビボでの放出系の可能性を実証する。

【０１０３】 （実施例６：外因性第ＸＩＩＩ因子を用いたペプチドの組込み） 標準的な沈殿方法を通じて獲得した精製フィブリノーゲンは、二ドメインペプ
チドの組込みにおける制限因子（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）として作
用する少量の内因性第ＸＩＩＩａ因子を含む。これを、精製フィブリノーゲンを
用いて実証した。内因性第ＸＩＩＩａ因子の濃度に基づき、８．２ｍｏｌペプチ
ド／ｍｏｌフィブリノーゲンまでの濃度での二ドメインペプチドの組込みが可能
であった。外因性第ＸＩＩＩａ因子の添加が、ペプチド組込みのレベルを増強す
ることを実証した。これは特に、ゲル内の二ドメインペプチド濃度の制御に関係
し、次に細胞接着にも影響をおよぼし、そしてヘパリンおよび増殖因子の組込み
に対する上限も決定する。いくつかの場合、標準的な精製フィブリノーゲンを用
いて可能な増加を超えて、細胞接着、ヘパリンの濃度、または増殖因子の濃度が
増加することが利点であり得る。

【０１０４】 プールされた血漿から精製された外因性第ＸＩＩＩ因子を用いて、二ドメイン
ペプチド（ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））をゲル中に組込んだ。
１Ｕの外因性第ＸＩＩＩ因子をフィブリンゲル１ｍＬ当たりに添加し、そして共
有結合的に組込まれた二ドメインペプチドのレベルを、クロマトグラフィー分析
を通して分析した。この結果を表５に示す。１Ｕ／ｍＬの外因性第ＸＩＩＩ因子
を添加した場合、組込みのレベルは２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲ
ンに達した。この組込みのレベルは、可能な結合部位の数に基づく理論的な限界
に近い。

【０１０５】 市販のフィブリン接着キットに組込まれる二ドメインペプチド（ｄＬＮＱＥＱ
ＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））の能力もまた、実証した。Ｔｉｓｓｕｃｏｌキ
ットを入手し、次いで複数のサンプルに分画した。外因性の二ドメインペプチド
を６ｍＭまで添加し、そして組込みのレベルをクロマトグラフィー分析を通して
分析した（図６）。ペプチド組込みのレベルを、３つの別々のキットについて広
範囲の二ドメインペプチドの初期濃度にわたって試験した。組込みのレベルを測
定した場合、最大組込みが５ｍＭよりも大きい外因性ペプチドの濃度で生じたこ
とが観察された。それは、これらの高密度マトリクスにおいて、拡散が組込みの
プロセスにおいて役割を果たしはじめていることであり得る。しかし、非常に高
レベルの組込みが、少なくとも２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンに
達するレベルで観察された。さらに、広範囲の存在する可能性のあるタンパク質
濃度を有するフィブリン接着キットの組成物において有意な可能性が存在する。
しかし、これは、明らかに、二ドメイペプチドの組込みに有意に影響を及ぼさず
、組込みのプロフィールは、試験された３つのキット全てについて同様であった
。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、プラスミン分解されたペプチド含有フィブリンゲルおよび遊離ペプチ
ドの蛍光検出クロマトグラムである。_２ＰＩ_１〜７−ＡＴＩＩＩ_{１２１〜１３４} ペプチドが取り込まれた分解したフィブリンゲル（−）、取り込まれたペプチド
を含む分解したフィブリンゲルに遊離状態で添加された同じペプチドを有する分
解したフィブリンゲル（…）、および遊離ペプチド単独（−−）のサイズ排除ク
ロマトグラフィーを示す。Ｎ末端ロイシン残基は、ダンシル化した（ｄＬと省略
される）。遊離ペプチドは、より低い分子量に対応して、凝固の間にフィブリン
中に取り込まれたペプチドが溶出する時間よりも長い時間で溶出された。これは
、分解したフィブリンへの共有結合、従って第ＸＩＩＩａ因子活性の作用を介す
る共有結合的な取り込みを実証する。

【図２】 図２は、４８時間でのＤＲＧ神経突起の伸長に対するマトリクス結合ｂＦＧＦ
の効果のグラフである。平均値および平均の標準偏差が示される。（^＊は、改変
されていないフィブリンと比較してｐ＜０．０５であることを示す）。

【図３】 図３は、フィブリンマトリクス中のＤＲＧ神経突起の伸長に対する固定化され
た−ＮＧＦ融合タンパク質の効果のグラフである。平均値および平均の標準誤差
が示される。 は、ネイティブなＮＧＦを示す。 は、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦを示す
。 は、ＴＧ−Ｐ_ｉ−ＮＧＦを示す。^＊は、培養培地中のＮＧＦを有する改変さ
れていないフィブリンに対してｐ＜０．０００１であることを示す。この結果は
、マトリクスに結合した−ＮＧＦが、フィブリンマトリクスを介して、培地中の
同じ濃度のＮＧＦと比較して、神経突起の伸長を増強することを実証する。

【図４】 図４は、ビオチン標識−ＮＧＦを使用して直接的ＥＬＩＳＡで定量した、外因
性第ＸＩＩＩａ因子基質を使用した−ＮＧＦ融合タンパク質のフィブリンマトリ
クス中への取り込みの量のグラフである。−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込み効
率は、試験された濃度の範囲にわたって比較的一定であった。

【図５】 図５は、ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１）の、外因性第ＸＩＩＩ因
子が添加されたフィブリンゲル中への取り込みのグラフである。１Ｕ／ｍＬを添
加した場合、取り込みのレベルは、２５ｍｏｌのペプチド／ｍｏｌのフィブリノ
ーゲンよりも多くが達成され得るように増加した。

【図６】 図６は、二ドメインペプチド（ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））
の、希釈していないフィブリン接着剤（ｇｌｕｅ）中への取り込みのグラフであ
る。３つの別々のキットを試験し、そしてそれぞれの場合において高レベルの取
り込みが観察され得、これは２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンに達
した。最大取り込みのために必要とされる外因性ペプチドの濃度は、少なくとも
５ｍＭであり、これは、作製される高度に濃いフィブリンマトリクス中への、拡
散の限界におそらく起因する。取り込みのレベルは非常に一致しており、それぞ
れのキットは、同様の取り込みプロフィールを提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｌ 27/00 Ａ６１Ｐ 41/00 33/00 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 41/00 Ｃ０７Ｋ 1/04 43/00 １０５ 14/495 Ｃ０７Ｋ 1/04 14/52 14/495 14/745 14/52 Ａ６１Ｌ 33/00 Ｔ 14/745 Ａ６１Ｋ 37/12 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シェンゼ， ジェイソン ツェー． スイス国 ツェーハー−8008 チューリッ ヒ， アローザ シュトラーセ 12 (72)発明者 サキヤマ−エルベルト， シェリー エ ー． スイス国 ツェーハー−8044 チューリッ ヒ， ホッホシュトラーセ ９ Ｆターム(参考） 4C076 CC26 EE37 EE41 EE42 4C081 AA12 AB19 AC16 CD06 CD07 CD15 CD20 4C084 AA01 NA14 ZA89 4C086 AA01 EA26 EA27 NA14 ZA89 ZB22 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA01 DA65 EA34 FA33

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞増殖または内部増殖に適した架橋したマトリクスであっ
   て、少なくとも１つの操作したタンパク質または多糖片が該マトリクスに共有結
   合またはイオン結合しており、 該操作したタンパク質または多糖片は、 生理活性因子または多糖を含む第１のドメイン、 第２のドメインであって、該操作したタンパク質または多糖片が、該第２の
   ドメインにより該マトリクスに連結される、ドメイン、および、 酵素分解または加水分解部位、 を含む、マトリクス。
2. 【請求項２】 前記生理活性因子がペプチドである、請求項１に記載のマト
   リクス。
3. 【請求項３】 前記ペプチドが少なくとも１つのヘパリン結合ドメインを含
   む、請求項２に記載のマトリクス。
4. 【請求項４】 前記生理活性因子が増殖因子またはタンパク質である、請求
   項１に記載のマトリクス。
5. 【請求項５】 前記生理活性因子がヘパリン結合増殖因子である、請求項４
   に記載のマトリクス。
6. 【請求項６】 前記ヘパリン結合増殖因子が、トランスフォーミング増殖因
   子β、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血管上皮増殖因子、インターロ
   イキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖
   因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、ヘパリン結合増殖関連分子、およびそ
   れらの混合物からなる群より選択される、請求項５に記載のマトリクス。
7. 【請求項７】 前記生理活性因子が酵素である、請求項１に記載のマトリク
   ス。
8. 【請求項８】 前記多糖が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびコンドロイチ
   ン硫酸からなる群より選択される、請求項１に記載のマトリクス。
9. 【請求項９】 前記マトリクスがタンパク質、多糖、糖タンパク質、および
   合成物質からなる群より選択される、請求項１〜請求項８のいずれかに記載のマ
   トリクス。
10. 【請求項１０】 前記マトリクスがフィブリンを含む、請求項９に記載のマ
    トリクス。
11. 【請求項１１】 前記分解部位が、前記第１のドメインと第２のドメインと
    の間に存在する、請求項１〜請求項１０のいずれかに記載のマトリクス。
12. 【請求項１２】 前記分解部位が酵素分解部位であり、該酵素分解部位はプ
    ラスミンおよびマトリクスメタロプロテイナーゼからなる群より選択される酵素
    により切断される、請求項１に記載のマトリクス。
13. 【請求項１３】 前記第２のドメインが、架橋酵素の基質ドメインである、
    請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載のマトリクス。
14. 【請求項１４】 前記第２のドメインがトランスグルタミナーゼ基質ドメイ
    ンを含む、請求項１３に記載のマトリクス。
15. 【請求項１５】 前記第２のドメインが第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインであ
    る、請求項１４に記載のマトリクス。
16. 【請求項１６】 前記第２のドメインが配列番号２０を含む、請求項１５に
    記載のマトリクス。
17. 【請求項１７】 マトリクスを作製するための方法であって、以下： ａ．架橋したマトリクスを形成し得る少なくとも１つのマトリクスを提供する
    工程であって、該マトリクスは、タンパク質、多糖、糖タンパク質、および合成
    物質からなる群より選択される、工程、 ｂ．操作したタンパク質または多糖片を該マトリクスに添加する工程であって
    、該操作したタンパク質または多糖片は、 生理活性因子または多糖を含む第１のドメイン、 第２のドメイン、および、 酵素分解または加水分解部位、 を含む、工程、ならびに ｃ．該マトリクスを架橋する工程であって、その結果、該マトリクスは、該操
    作したタンパク質または多糖片の該第２のドメインに連結される、工程、 を包含する、方法。
18. 【請求項１８】 前記生理活性因子が、ペプチド、増殖因子、および酵素か
    らなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記生理活性因子がヘパリン結合増殖因子である、請求項
    １８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記ヘパリン結合増殖因子が、トランスフォーミング増殖
    因子β、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血管上皮増殖因子、インター
    ロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増
    殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、ヘパリン結合増殖関連分子、および
    それらの混合物からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記生理活性因子が、少なくとも１つのヘパリン結合ドメ
    インを含むペプチドである、請求項１８に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記多糖が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびコンドロイ
    チン硫酸からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記分解部位が、前記第１のドメインと前記第２のドメイ
    ンとの間に存在する、請求項１７〜請求項２２のいずれかに記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記第２のドメインが、架橋酵素の基質ドメインである、
    請求項１７〜請求項２３のいずれかに記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記第２のドメインが、トランスグルタミナーゼ基質ドメ
    インを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記第２のドメインが、第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインを
    含む、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 操作したタンパク質または多糖片であって、 生理活性因子または多糖を含む第１のドメイン、 該操作したタンパク質または多糖片をマトリクスに連結し得る第２のドメイン
    、および、 酵素分解または加水分解部位、 を含む、操作したタンパク質または多糖片。
28. 【請求項２８】 前記生理活性因子が、ペプチド、増殖因子、および酵素か
    らなる群より選択される、請求項２８に記載の操作したタンパク質または多糖片
    。
29. 【請求項２９】 前記生理活性因子がヘパリン結合増殖因子である、請求項
    ２８に記載の操作したタンパク質または多糖片。
30. 【請求項３０】 前記ヘパリン結合増殖因子が、トランスフォーミング増殖
    因子β、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血管上皮増殖因子、インター
    ロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増
    殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、ヘパリン結合増殖関連分子、および
    それらの混合物からなる群より選択される、請求項２９に記載の操作したタンパ
    ク質または多糖片。
31. 【請求項３１】 前記生理活性因子が、少なくとも１つのヘパリン結合ドメ
    インを含むペプチドである、請求項３０に記載の操作したタンパク質または多糖
    片。
32. 【請求項３２】 前記多糖が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびコンドロイ
    チン硫酸からなる群より選択される、請求項２７に記載の操作したタンパク質ま
    たは多糖片。
33. 【請求項３３】 前記分解部位が、前記第１のドメインと前記第２のドメイ
    ンとの間に存在する、請求項２７〜請求項３２のいずれかに記載の操作したタン
    パク質または多糖片。
34. 【請求項３４】 前記分解部位が酵素分解部位であり、該酵素分解部位は、
    プラスミンおよびマトリクスメタロプロテイナーゼからなる群より選択される酵
    素により切断される、請求項２７〜請求項３３のいずれかに記載の操作したタン
    パク質または多糖片。
35. 【請求項３５】 前記第２のドメインが、架橋酵素の基質ドメインである、
    請求項２７〜請求項３４のいずれかに記載の操作したタンパク質または多糖片。
36. 【請求項３６】 前記第２のドメインがトランスグルタミナーゼ基質ドメイ
    ンを含む、請求項３５に記載の操作したタンパク質または多糖片。
37. 【請求項３７】 前記第２のドメインが第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインを含
    む、請求項３６に記載の操作したタンパク質または多糖片。
38. 【請求項３８】 医薬として使用するための、請求項１〜請求項１６のいず
    れかに記載のマトリクス。
39. 【請求項３９】 硬組織欠損または軟組織欠損の処置のための医薬の製造の
    ための、請求項１〜請求項１６のいずれかに記載のマトリクスの使用。