ES2329584T3

ES2329584T3 - Proteinas de garrapatas de union a quimiocinas cc.

Info

Publication number: ES2329584T3
Application number: ES04804972T
Authority: ES
Inventors: Christine Power; Amanda Proudfoot; Achim Frauenschuh
Original assignee: Merck Serono SA
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-21
Publication date: 2009-11-27
Anticipated expiration: 2024-12-21
Also published as: IL176327A0; JP2008505604A; ATE437179T1; AU2004309111A1; NO20063413L; US20070224125A1; JP4809242B2; EP1697404A2; IL176327A; US7393660B2; EP1697404B1; DE602004022191D1; WO2005063812A3; WO2005063812A2; AU2004309111B2; CA2544334A1

Abstract

Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 4 (rsChBP-1); b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 6 (rsChBP-1 maduro); c) una proteína al menos alrededor de un 70% idéntica en la secuencia de aminoácidos a una proteína de a) o b), y que se une a una quimiocina CC; d) un fragmento de una proteína de a), b) o c), cuyo fragmento se une a una quimiocina CC; y e) un fragmento de una proteína de a), b) o c), cuyo fragmento o proteína tiene una actividad inmunomoduladora.

Description

Proteínas de garrapatas de unión a quimiocinas CC.

Campo de la invención

La invención se refiere a antagonistas nuevos de quimiocinas CC y a sus usos, en particular como compuestos antiinflamatorios y en el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con las quimiocinas CC.

Antecedentes de la invención

Las quimiocinas son proteínas proinflamatorias pequeñas secretadas que actúan como mediadores en la migración direccional de los leucocitos desde la sangre hasta la zona de la lesión. Dependiendo de la posición de las cisteínas conservadas que caracterizan a esta familia de proteínas, la familia de quimiocinas se puede dividir estructuralmente en quimiocinas C, CC, CXC y CX_{3}C que se unen a una serie de receptores de membrana (Baggiolini M et al., 1997; Fernández EJ y Lolis E, 2002). Estos receptores de membrana, todos receptores de siete hélices acoplados a proteína G, permiten que las quimiocinas ejerzan su actividad biológica sobre las células seleccionadas como objetivo, que pueden presentar combinaciones específicas de receptores según su estado y/o tipo. Los efectos fisiológicos de las quimiocinas resultan de un sistema complejo e integrado de interacciones concurrentes: los receptores tienen a menudo una especificidad parcialmente coincidente por el ligando, de forma que un único receptor se puede unir a diferentes quimiocinas. Una única quimiocina también se puede unir a diferentes
receptores.

Los estudios sobre las relaciones estructura-actividad indican que las quimiocinas tienen dos sitios principales de interacción con sus receptores, la región aminoterminal flexible y el bucle conformacionalmente rígido que sigue a la segunda cisteína. Se piensa que las quimiocinas se acoplan a los receptores por medio de la región del bucle, y se cree que este contacto facilita la unión de la región aminoterminal que da como resultado la activación del receptor.

Normalmente, las quimiocinas se producen en la zona de la lesión y provocan la migración y la activación de los leucocitos, por lo que desempeñan un papel fundamental en los procesos inflamatorios, inmunitarios, homeostáticos, hematopoyéticos y angiogénicos. Así, se considera que estas moléculas son buenos candidatos para la intervención terapéutica en las enfermedades asociadas a tales procesos. La inhibición de las quimiocinas, o de sus receptores, puede reducir la maduración, el reclutamiento y la activación de los leucocitos, así como otros procesos patológicos relacionados con la angiogénesis o la arterioesclerosis (Baggiolini M, 2001; Loetscher P y Clark-Lewis I, 2001; Godessart N y Kunkel SL, 2001).

Además de las quimiocinas, los anticuerpos y los péptidos inhibidores mutantes y las moléculas inhibidoras pequeñas que bloquean los receptores, la búsqueda de antagonistas de quimiocinas eficaces se ha extendido también a una serie de virus y otros organismos que, al entrar en contacto con los hospedadores humanos o mamíferos, muestran actividades inmunomoduladoras potentes que afectan al hospedador.

La imitación viral de las citocinas, quimiocinas y sus receptores puede indicar estrategias de modulación inmunitaria para el desarrollo de productos terapéuticos (Alcami A, 2003; Lindow M et al., 2003). Recientemente, se han revisado los factores inmunomoduladores expresados por los artrópodos hematófagos (tales como mosquitos, moscas de la arena y garrapatas) (Gillespie, RD et al., 2000; Nuttall PA et al., 2000; Schoeler GB y Wikel SK, 2001).

En particular, las glándulas salivales de las garrapatas producen una mezcla compleja de moléculas bioactivas que tienen, en particular, actividades antiinflamatorias, antihemostáticas y antiinmunitarias. Estas incluyen proteínas bioactivas que controlan la histamina, se unen a las inmunoglobulinas, o inhiben la cascada alternativa del complemento u otras proteasas.

El efecto de estas moléculas es, probablemente, proporcionar un sitio privilegiado en la interfase garrapata-hospedador que protege a la garrapata de los mecanismos inmunitarios normales innatos y adquiridos del hospedador que combaten las infecciones, lo que asegura una alimentación eficaz.

Además, se considera que las glándulas salivales de la garrapata son la vía principal mediante la cual los patógenos transmitidos por la garrapata entran en el hospedador durante la alimentación, ya que las garrapatas usan sus glándulas salivales como medio para concentrar la sangre devolviendo el exceso de fluido y los iones al hospedador, lo que posiblemente transmite los patógenos residentes en estas glándulas. De hecho, se admite cada vez más que la modulación inducida por la garrapata de la inmunidad del hospedador es un factor importante en la transmisión eficaz o el establecimiento de patógenos transmitidos por las garrapatas.

Se han caracterizado actividades inmunomoduladoras en extractos de saliva de garrapata (Alarcon-Chaidez FJ et al., 2003; Bergman DK et al., 2000; Anguita J et al., 2002; Gwakisa P et al., 2001; Leboulle G et al, 2002; Kopecky J et al., 1999; Kovar L et al., 2002; Gillespie RD et al., 2001). Por ejemplo, la saliva de Rhipicephalus sanguineus inhibe la producción estimulada por antígenos de inmunoglobulinas y la expresión de IFN-\gamma, IL-2 e IL-5 de una manera dependiente de la dosis (Matsumoto K et al., 2003).

Se han detectado actividades de unión de quimiocinas CXC, en particular actividades de unión de CXCL8/Interleu-
cina 8 (pero no se han caracterizado en cuanto a las secuencias proteicas específicas) en la saliva preparada a partir de varias especies de garrapatas de la familia ixodidae (Dermacentor reticulatus, Amblyomma variegatum, Rhipicephalus appendiculatus, Haemaphysalis inermis, Ixodes ricinus), que ponían de manifiesto una reducción del nivel de IL-8 detectable, y que inhibían la quimiotaxis inducida mediante IL-8 de granulocitos sanguíneos humanos (Hajnicka V et al., 2001; Kocakova P et al. 2003; documentos WO 01/58941; WO 01/48484).

Los antígenos de Rhipicephalus sanguineus generan respuestas inmunitarias potentes mediadas por células en animales resistentes, pero no en animales vulnerables. La saliva introducida durante las infestaciones por garrapatas reduce la capacidad de un hospedador animal vulnerable para responder a los antígenos de la garrapata que podrían estimular una respuesta inmunitaria protectora. Como consecuencia, los animales presentan una migración celular alterada hacia el sitio de alimentación de la garrapata, lo cual puede representar una respuesta deficiente contra las garrapatas (Ferreira BR et al., 2003).

Se ha detectado un homólogo de la citocina proinflamatoria Factor Inhibidor de la Migración de Macrófagos en la garrapata, Amblyomma americanum. Esta secuencia inhibió la migración de los macrófagos humanos en un ensayo funcional in vitro en la misma medida que el MIF humano recombinante (Jaworski DC et al., 2001; documento WO 01/78770).

A pesar de la gran cantidad de bibliografía, solamente unos cuantos artículos enumeran secuencias de cADN identificadas mediante secuenciación aleatoria y cribados diferenciales de bibliotecas generadas a partir de diversos tejidos y/o especies de garrapatas. Se han publicado listas de secuencias de cADN para Amblyomma americanum y de Dermacentor andersoni en diferentes etapas del desarrollo (Hill CA y Gutiérrez JA, 2000), glándulas salivales de Amblyomma americanum macho sin alimentar y alimentado (Bior AD et al., 2002), Ixodes scapularis macho en apareamiento (Packila M y Guilfoile PG, 2002), glándulas salivales de Amblyomma variegatum (Nene V et al, 2002), de Rhipicephalus appendiculatus (Nene V et al., 2004), y de Ixodes scapularis (Valenzuela JG et al., 2002a; Francischetti IM et al., 2002).

Sin embargo, la gran mayoría de estas secuencias no están caracterizadas bioquímicamente o funcionalmente, y se introducen muchas anotaciones solamente basándose en la similitud de secuencias con proteínas conocidas implicadas en funciones celulares básicas, tales como las caracterizadas previamente en las glándulas salivales de garrapatas por las actividades enzimáticas o por la inducción de una respuesta de anticuerpos. En particular, no hay indicaciones de proteínas de garrapata que actúen como proteínas de unión de quimiocinas CC.

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Resumen de la invención

Sorprendentemente, se ha descubierto que la saliva de Rhipicephalus sanguineus (garrapata del perro) contiene actividades de unión de quimiocinas CC. En particular, se ha clonado una proteína nueva denominada rsChBP-1, que se une a quimiocinas CC y que puede inhibir la producción de TNF-\alpha inducido por lipopolisacáridos (LPS) liberado por los monocitos, a partir de una biblioteca de cADN de Rhipicephalus sanguineus, y se han expresado en células de mamífero. Esta proteína, así como sus derivados, fragmentos o moléculas miméticas, se pueden usar de forma terapéutica, p.ej., como moduladores de la inflamación o como moléculas objetivo para la vacunación y para el control de garrapatas y de patógenos transmitidos por garrapatas.

Un primer objetivo de la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 o de un fragmento o análogo suyo. Los polipéptidos preferidos de esta invención se unen a una quimiocina CC, y pueden inhibir la producción de TNF-\alpha inducido por lipopolisacáridos (LPS) liberado por los monocitos. Un ejemplo específico de tal polipéptido es rsChBP-1 o un fragmento suyo.

Un segundo objetivo de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido como se definió anteriormente. Tales ácidos nucleicos incluyen también los oligonucleótidos aislados a partir de ellos y los vectores que contienen dichas moléculas, en particular los vectores de expresión.

Un tercer objetivo de esta invención consiste en anticuerpos que se unen selectivamente a los polipéptidos definidos anteriormente.

Un cuarto objetivo de esta invención se refiere a células hospedadoras y animales transgénicos que no son humanos que expresan un polipéptido como se definió anteriormente, así como a los métodos para producir tales células y animales transgénicos que no son humanos.

Un quinto objetivo de esta invención es un proceso para la preparación de un polipéptido como se definió anteriormente, generalmente mediante el uso de técnicas recombinantes.

Un sexto objetivo de la invención es una composición farmacéutica (que incluye una vacuna o producto inmunógeno) que comprende un polipéptido o molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente y un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un séptimo objetivo de la invención se refiere al uso de un polipéptido o molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente como medicamento, en particular para la preparación de un medicamento para la regulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un mamífero, así como a los métodos de tratamiento correspondientes.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Descripción de las figuras

Figura 1: unión de quimiocinas radiomarcadas a extractos de saliva de Rhipicephalus sanguineus (rsSE) o a una proteína de unión de quimiocinas CC del virus de la ectromelia (vCCI). El extracto y la proteína se aplicaron en paralelo sobre diferentes filtros de nitrocelulosa en la cantidad indicada (celda superior izquierda), y después cada filtro se incubó con la quimiocina radiomarcada específica indicada en la columna (derecha).

Figura 2: caracterización bioquímica de las actividades de unión de quimiocinas CC en la saliva de Rhipicephalus sanguineus mediante el uso de un ensayo de proximidad de centelleo (SPA). La interacción entre CCL/MIP-1\alpha radiomarcado y CCR1 inmovilizada sobre esferas de SPA se midió sin un competidor, con el competidor natural (MIP-1\alpha), o con dos cantidades de extracto de proteínas de saliva de garrapata. Se obtuvo un perfil similar mediante el uso de las mismas esferas de SPA y CCL5/RANTES radiomarcado o sin marcar.

Figura 3: detección de la actividad de unión de quimiocinas CC en medio de cultivo de HEK293 mediante entrecruzamiento químico a ^{125}l-MIP-1\alpha. (A) Titulación del control positivo (la proteína de unión de quimiocinas CC viral vCCI) añadido al medio de cultivo de HEK293 en la cantidad indicada y en presencia del agente de entrecruzamiento (BS^{3}). La quimiocina CC radiomarcada libre migra en forma de una banda de 8 kDa. El complejo entrecruzado radiomarcado formado por la quimiocina CC y vCCI migra en forma de una banda de 35-45 kDa. (B) Cribado de clones individuales de la biblioteca de expresión de cADN de Rhipicephalus sanguineus expresada en células mamíferas HEK293. La señal observada en el experimento de entrecruzamiento con el medio de cultivo de un clon de HEK293 específico transformado con esta biblioteca de cADN (Clon 2) se compara con la señal obtenida con el medio de cultivo de HEK293 que contiene vCCI, en presencia (carriles +) o en ausencia (carriles -) del reactivo de entrecruzamiento (BS3). Se indica la quimiocina CC radiomarcada libre y los complejos entrecruzados (entre la quimiocina CC radiomarcada y la proteína de unión de quimiocinas CC de garrapata o viral).

Figura 4: secuencia de ADN del Clon 2 (ID SEC Nº: 3), que incluye el ORF que codifica la secuencia de aminoácidos de rsChBP-I (ID SEC Nº: 4). La porción codificante del ADN está alineada con la secuencia de aminoácidos. La secuencia señal (predicha mediante el algoritmo SIGNALJ) está subrayada. Los sitios de poliadenilación predichos están recuadrados.

Figura 5: alineación de las secuencias de aminoácidos de rsChBP-I (ID SEC Nº: 4) con avChBP-I (ID SEC Nº: 8) e isChBP-I (ID SEC Nº: 10), dos secuencias de proteínas codificadas mediante ORFs identificados en cADNs de Amblyomma variegatum e lxodes scapularis sin anotar, respectivamente. La numeración corresponde a la posición de los nucleótidos en las secuencias de cADN respectivas del Clon 2 (ID SEC Nº: 3), BM289643 (ID SEC Nº: 7), y AF483738 (ID SEC Nº: 9). Los residuos idénticos y conservados (indicados con +) entre rsChBP-I y avChBP-I, y entre rsChBP-I e isChBP-I, están indicados en negrita.

Figura 6: inhibición de la inducción de TNF-\alpha inducido por LPS por los monocitos-en espera de la descripción científica

Figura 7: actividad de unión de quimiocinas CC de rsChBP-I recombinante expresado en medio de cultivo de HEK293. La interacción entre CCL3/MIP-1\alpha radiomarcado y CCR1 se mide en un ensayo de proximidad de centelleo llevado a cabo con o sin el competidor natural, o con una cantidad creciente de medio de cultivo de células HEK293 que expresan rsChBP-1 añadida a la muestra.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones y métodos nuevos para modular una respuesta inflamatoria. Más en particular, la presente invención describe proteínas nuevas que tienen propiedades de unión de quimiocinas CC que se pueden usar para modular una respuesta inflamatoria. Los ejemplos demuestran que esta proteína, derivada de la saliva de garrapatas, se puede expresar y purificar en forma recombinante, y que se une a las quimiocinas CC e inhibe la liberación inducida por LPS de TNF-\alpha por los monocitos.

Un primer objetivo de la invención consiste en un polipéptido rsChBP-1, es decir, cualquier polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 o de un fragmento o análogo suyo. Los polipéptidos preferidos de esta invención se unen a una quimiocina CC, e inhiben la liberación inducida por LPS de TNF-\alpha por los monocitos. Los polipéptidos particulares de esta invención se seleccionan del grupo que consiste en:

a): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 (ID SEC Nº: 4);

b): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 maduro (ID SEC Nº: 6);

c): una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de a) o b) en condiciones rigurosas, y dicha molécula de ácido nucleico codifica una proteína que se une a una quimiocina CC;

d): una proteína al menos alrededor de un 70% idéntica en la secuencia de aminoácidos a una proteína de a), b) o c), y que se une a una quimiocina CC;

e): un fragmento de una proteína de a), b), c) o d), cuyo fragmento se une a una quimiocina CC; y

f): un fragmento de una proteína de a), b), c) o d), cuyo fragmento tiene una actividad inmunomoduladora.

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En una realización preferida, la proteína se selecciona del grupo que consiste en:

a): una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 (ID SEC Nº: 4);

b): una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 maduro (ID SEC Nº: 6);

c): un fragmento de una proteína de a) o b), cuyo fragmento se une a una quimiocina CC;

d): un mutante activo de una proteína de a) o b), en cuyo mutante se han añadido, delecionado o sustituido uno o más residuos de aminoácidos, y cuyo mutante se une a una quimiocina CC;

e): una proteína de fusión, la cual comprende una proteína de a), b), c) o d) unida de manera operable a una o más secuencias de aminoácidos elegidas entre las siguientes: un dominio extracelular de una proteína asociada a membranas, una región constante de inmunoglobulina, un dominio de multimerización, un péptido señal, una señal de exportación, y una secuencia de etiqueta.

Los polipéptidos de la invención pueden estar en una forma madura, que resulta de una o más modificaciones postraduccionales (glicosilación, fosforilación, modificación con endo/exo-peptidasas para eliminar el péptido señal, por ejemplo) o de la adición en el marco de lectura de secuencias que codifican secuencias heterólogas (tales como etiquetas o dominios que mejoran la detección y/o la purificación).

Los polipéptidos que esta invención o sus ácidos nucleicos correspondientes pueden estar en forma aislada (p.ej., no en su medio natural), lo que incluye los polipéptidos y ácidos nucleicos recombinantes o sintéticos.

Los ejemplos demuestran que los polipéptidos rsChBP-1 se unen a las quimiocinas CC, y se pueden usar para inhibir (p.ej., reducir) la liberación inducida por LPS de TNF-\alpha por los monocitos. Esta caracterización se llevó a cabo haciendo uso de una serie de ensayos bioquímicos, que incluyen el uso de quimiocinas CC radiactivas, o de ensayos funcionales que incluyen los ensayos basados en células. Como se demuestra en los ejemplos, los polipéptidos rsChBP-1 se unen en particular a quimiocinas CC tales como CCL3/MIP-1\alpha. Se demostró que rsChBP-1 inhibe la liberación inducida por LPS de TNF-\alpha por los monocitos, lo que indica una actividad inmunomoduladora. Tal espectro de actividad (es decir, unión de quimiocinas y la inhibición de la liberación de TNF-\alpha inducida por LPS por los monocitos) confiere a los polipéptidos rsCHBP-1 de esta invención un amplio intervalo de utilidad terapéutica, como se discute más adelante.

En el contexto de la presente invención, un fragmento de un polipéptido designa cualquier fragmento que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos consecutivos de dicha secuencia polipeptídica. Los fragmentos particulares de esta invención comprenden 16, 20, 25 o más residuos de aminoácidos de una proteína rsCHBP-1 como se discute en el presente documento. Los fragmentos de la invención mantienen la capacidad de unirse a una quimiocina, y al menos una actividad biológica de una proteína de tamaño completo, p.ej., una actividad inmunógena o una actividad inmunomoduladora.

A este respecto, en el contexto de la presente invención, una "actividad inmunomoduladora" designa cualquier actividad detectada in vitro o in vivo que afecta a la respuesta inmunitaria de una manera positiva o negativa. Los ejemplos de tales actividades son las actividades inmunizantes, actividades inmunosupresoras, actividades antiinflamatorias, actividades pro/anti-apoptóticas, o actividades antitumorales.

También se describen fragmentos que se ha identificado que proporcionan una actividad inmunizante cuando se administran a un mamífero. Estos fragmentos deberían tener propiedades antigénicas e inmunógenas apropiadas para generar una respuesta inmunitaria cuando sea necesario (por ejemplo, contra garrapatas u organismos patógenos transmitidos por las garrapatas). La bibliografía proporciona muchos ejemplos de cómo se pueden identificar tales secuencias funcionales como antígenos vacunales candidatos, y finalmente administrarlos con adyuvantes y/o entrecruzados con un vehículo (Mulenga A et al. 2000; documentos WO 01/80881; WO 03/030931; WO 01/87270). Se puede usar un antígeno específico o grupo de antígenos identificado en rsChBP-1 para prevenir o reducir la infección o enfermedad por ectoparásitos en un animal, de forma que la inmunidad del animal hacia el ectoparásito se potencia por la exposición natural del animal al ectoparásito (documento WO 95/22603). Finalmente, el fragmento se puede usar también para generar anticuerpos dirigidos hacia la proteína completa para aplicaciones de cribado o de diagnóstico.

Las propiedades de rsChBP-1 definidas anteriormente, y ejemplificadas en el presente documento mediante el uso de variantes recombinantes de esta secuencia, se pueden mantener, o incluso potenciar, en los mutantes activos. Esta categoría de moléculas incluye análogos naturales o sintéticos de dicha secuencia, en los que se han añadido, delecionado o sustituido uno o más residuos de aminoácidos, con tal de que exhiban la misma actividad biológica caracterizada en la presente invención a niveles comparables o superiores, tal como se determina por los medios descritos en los Ejemplos más adelante.

En particular, la expresión "activo" o "biológicamente activo" significa que tales compuestos alternativos deberían mantener, o incluso potenciar, la unión de quimiocinas CC y las propiedades inmunomoduladoras de rsChBP-1.

Las moléculas mutantes activas se pueden generar mediante técnicas de mutagénesis dirigida, técnicas combinatorias a nivel de la secuencia de ADN codificante (tales como barajado de ADN, expresión/selección en fagos), o mediante estudios de diseño asistido por ordenador, o cualquier otra técnica conocida adecuada, que proporcione un grupo limitado de péptidos o polipéptidos mutados o acortados sustancialmente correspondientes. Un experto en la técnica puede obtener y ensayar de manera rutinaria estas moléculas alternativas mediante el uso de las enseñanzas presentadas en la técnica anterior y en los Ejemplos más adelante.

De acuerdo con la presente invención, los cambios preferidos en estos mutantes activos se conocen habitualmente como sustituciones "conservativas" o "seguras", e implican residuos que no son básicos. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas con aminoácidos que tienen propiedades químicas suficientemente similares, para conservar la estructura y la función biológica de la molécula. Es evidente que las inserciones y las deleciones de aminoácidos se pueden hacer también en las secuencias definidas anteriormente sin alterar su función, en particular si las inserciones o las deleciones implican solamente unos cuantos aminoácidos, p.ej., menos de diez, y preferiblemente menos de tres, y si no eliminan o desplazan aminoácidos que son críticos para la conformación funcional de una proteína o de un péptido.

La bibliografía proporciona muchos modelos sobre los cuales se puede llevar a cabo la selección de las sustituciones de aminoácidos conservativas, basándose en estudios estadísticos y fisicoquímicos de la secuencia y/o de la estructura de la proteína natural (Rogov SI y Nekrasov AN, 2001). Los experimentos de diseño de proteínas han demostrado que el uso de subgrupos específicos de aminoácidos puede producir proteínas plegables y activas, lo que ayuda en la clasificación de las sustituciones "sinónimas" de aminoácidos que se pueden acomodar más fácilmente en la estructura de la proteína, y que se pueden usar para detectar homólogos y parálogos funcionales y estructurales de rsCHBP-1 (Murphy LR et al., 2000). Los grupos de aminoácidos sinónimos y los grupos sinónimos más preferidos para las sustituciones son los definidos en la Tabla I.

Los mutantes activos de rsChBP-1 pueden resultar de alteraciones de secuencia que reducen la inmunogenicidad de dicha proteína de unión de quimiocinas CC cuando se administran a un mamífero. La bibliografía proporciona muchos ejemplos de estas alteraciones de secuencia que se pueden diseñar e introducir en este ámbito o para otras optimizaciones funcionales que permiten una administración segura y eficaz de una proteína terapéutica, especialmente cuando es una proteína no humana, no mamífera o no natural (Schellekens H, 2002). Los ejemplos de aproximaciones técnicas para conseguir estas moléculas son la evolución dirigida (Vasserot AP et al., 2003), el diseño racional (Marshall SA et al., 2003), la bioinformática (Gendel SM, 2002), la identificación y la neutralización de epítopos de células T CD4+ (documentos WO 03/104263; WO 03/006047; WO 02/98454; WO 98/52976; WO 01/40281), la fusión con otras secuencias proteicas (documentos WO 02/79415; WO 94/11028), o la conjugación con otros compuestos (documento WO 96/40792).

Las secuencias derivadas de rsChBP-1 activas pueden ser análogos u ortólogos naturales de rsCHBP-1 que se pueden aislar, en particular, de otras especies de garrapatas, en particular las que pertenecen a la familia lxodidae, y más en particular a la subfamilia Rhipicephalinae, a la que pertenece Rhipicephalus sanguineus, así como a otras subfamilias como Ixodinae (que incluye Ixodes scapularis e Ixodes ricinus) o Amblyomminae (que incluye Amblyomma variegatum y Amblyomma americanum). Se han identificado secuencias de cADN que codifican polipéptidos que comparten cierta homología con rsChBP-1 a partir de Amblyomma variegatum (ID SEC Nº: 7) e Ixodes scapularis (ID SEC Nº: 9). Se muestra una alineación de los polipéptidos codificados por tales secuencias de cADN en la Fig. 5. De forma alternativa, se pueden identificar ortólogos en mamíferos, tales como el hombre y el ratón.

Existe una información limitada sobre el genoma y el transcriptoma de los artrópodos hematófagos, y en su mayor parte está asociada a las secuencias ribosómicas y mitocondriales, que se estudiaron para determinar las relaciones filogenéticas basándose en su conservación (Murrell A et al., 2001). Los datos genómicos de las garrapatas están disponibles solamente en formatos parciales y preliminares (Ullmann AJ et al., 2002), pero se pueden llevar a cabo análisis adicionales de los genes de las garrapatas que codifican las proteínas de unión de quimiocinas CC mediante el uso del ADN genómico que se puede extraer de las garrapatas de la familia ixodidae mediante la aplicación de métodos y condiciones específicas (Hill CA y Gutiérrez, J A 2003), en particular para la detección de cualquier polimorfismo significativo en las proteínas de las glándulas salivales, como ya se ha demostrado (Wang H et al., 1999). Las secuencias genómicas y proteicas de estos organismos es importante para entender su fisiología y su biología, y por lo tanto proporcionan información útil para entender el papel de las proteínas de la invención en las relaciones entre el hospedador, el parásito, y los patógenos transmitidos por el parásito (Valenzuela JG,
2002b).

La caracterización bioquímica y fisiológica de las actividades de unión de quimiocinas CC descrita para la proteína homóloga a rsChBP-1 en la presente invención se puede llevar a cabo mediante la aplicación de cualquiera de las técnicas recientemente mejoradas para el estudio de las garrapatas y de los patógenos transmitidos por las garrapatas, tales como la electroforesis en gel bidimensional (Madden RD et al., 2004) o la interferencia de ARN (Aljamali MN et al, 2003). Además, se pueden llevar a cabo estudios adicionales para cartografiar el sitio de reconocimiento de las quimiocinas CC en estas proteínas y los mecanismos del antagonismo de las quimiocinas CC (Seet BT et al., 2001; Beck CG et al., 2001; Burns JM et al., 2002; Webb LM et al., 2004) o para identificar las modificaciones postraduccionales relevantes (Alarcón-Chaidez FJ et al., 2003).

Otro objetivo de la invención son las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido rsChBP-1 como se definió anteriormente unido de manera operable a un dominio heterólogo, p.ej., una o más secuencias de aminoácidos que se pueden elegir entre las siguientes: un dominio extracelular de una proteína asociada a membranas, las regiones constantes de inmunoglobulinas (región Fc), dominios de multimerización, señales de exportación, y secuencias de etiquetas (tales como las que ayudan en la purificación mediante afinidad: etiqueta HA, etiqueta de histidinas, péptidos GST, FLAAG o MBP).

En el contexto de una proteína de fusión, la expresión "unido de manera operable" indica que el polipéptido rsChBP-1 y las secuencias de aminoácidos adicionales están asociadas por medio de enlace(s) peptídico(s), directamente o por medio de residuos espaciadores (p.ej., un ligador). De esta manera, la proteína de fusión se puede producir de forma recombinante, mediante la expresión directa en una célula hospedadora de una molécula de ácido nucleico que codifica la misma, como se discutirá más adelante. Además, si es necesario, las secuencias de aminoácidos adicionales incluidas en la proteína de fusión se pueden eliminar, al final del proceso de producción/purificación o in vivo, p.ej., por medio de una endo/exo-peptidasa apropiada, como se discutirá más adelante. El resto heterólogo se puede unir de manera operable a la porción N- o C-terminal del polipéptido rsChBP-1.

El diseño de los restos y/o espaciadores, así como los métodos y las estrategias para la construcción, purificación, detección, maduración y uso de las proteínas de fusión, se discuten ampliamente en la bibliografía (Nilsson J et al., 1997; "Applications of chimeric genes and hybrid proteins", Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000). En general, se desea que las secuencias heterólogas proporcionen propiedades adicionales sin afectar a la actividad terapéutica de la proteína original (unión de quimiocinas CC, por ejemplo) de una manera significativa. Los ejemplos de tales propiedades adicionales son un procedimiento de purificación más fácil, una semivida más duradera en los fluidos corporales, un resto de unión adicional, la maduración por medio de una digestión endoproteolítica, la estabilidad durante la producción recombinante, o la localización extracelular. Esta última característica es de importancia particular para definir un grupo específico de proteínas de fusión o quiméricas incluidas en la definición anterior, ya que permite que los polipéptidos se localicen en el espacio en el que se facilita el aislamiento y la purificación de estos polipéptidos, y en el que las quimiocinas CC son activas normalmente.

La elección de una o más de estas secuencias a fusionar con un polipéptido rsChBP-1 es funcional para un uso específico y/o un protocolo de purificación de dicha proteína en forma de proteína recombinante. Estas secuencias se pueden elegir entre los tres grupos básicos siguientes de secuencias heterólogas.

Un primer grupo de tales secuencias consiste en secuencias que ayudan a la secreción y la purificación de la proteína mediante el uso de técnicas de ADN recombinante, tales como un péptido señal y señales de exportación (Rapoport TA et al.; 1996), o secuencias de etiquetas que ayudan en la purificación mediante afinidad (etiqueta H, etiqueta de histidinas, GST, FLAG, o MBP).

Un segundo grupo de secuencias heterólogas está representado por aquellas que permiten una mejor estabilidad y bioactividad de las proteínas.

Un ejemplo típico de una estrategia que permite una semivida prolongada de una proteína es la fusión con albúmina sérica humana, o con péptidos y otras secuencias modificadas (p.ej., mediante miristoilación), que permite la unión a albúmina sérica humana circulante (Chuang VT et al., 2002; Graslund T et al., 1997; documento WO 01/77137). De forma alternativa, la secuencia adicional puede ayudar en el transporte a una localización específica, tal como el cerebro (documento WO 03/32913).

Otra manera de mejorar la estabilidad de una proteína recombinante cuando se administra a un sujeto es generar multímeros de la proteína fusionando dominios aislados de otras proteínas, lo que permite la formación de dímeros, trímeros, etc. Los ejemplos de secuencias proteicas que permiten la multimerización de los polipéptidos de la invención son los dominios aislados de proteínas tales como hCG (documento WO 97/30161), colágeno X (documento WO 04/33486), C4BP (documento WO 04/20639), proteínas Erb (documento WO 98/02540), o péptidos de hélice \alpha doble (documento WO 01/00814).

Un ejemplo bien conocido de tales proteínas de fusión está representado por la región constante/Fc de las proteínas inmunoglobulinas humanas, que permite la dimerización común en las inmunoglobulinas humanas. Se describen en la bibliografía diferentes estrategias para generar proteínas de fusión que comprenden una proteína terapéutica y un fragmento de inmunoglobulina (documentos WO 91/08298; WO 96/08570; WO 93/22332; WO 04/085478; WO 01/03737, WO 02/66514). Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica RSCHBP-1 maduro se puede clonar en un vector de expresión fusionada a la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia señal de rsChBP-1
original (o cualquier otra secuencia de señalización/exportación apropiada) en su extremo 5', y la secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de la cadena pesada lambda de la inmunoglobulina humana IgG1 (nº de acc. del NCBI CAA75302; segmento 246-477) en su extremo 3'. El vector resultante se puede usar para transformar una línea de células hospedadoras CHO o HEK293, y se pueden seleccionar los clones que expresan y secretan de manera estable la proteína de fusión recombinante que tiene rsChBP-1 en el extremo N-terminal y la secuencia de IgG1 en el extremo C-terminal. Este clon se puede usar después para aumentar la producción y para purificar la proteína de fusión recombinante a partir del medio de cultivo. De manera alternativa, se puede invertir la posición del ácido nucleico que codifica la región constante de la cadena pesada lambda de la inmunoglobulina humana IgG1 y de rsChBP-1, y la proteína resultante se puede expresar y secretar todavía mediante el uso de la secuencia señal original de rsChBP-1, o de cualquier otra secuencia de señalización/exportación apropiada. Mediante el uso de esta técnica también puede ser posible generar heterodímeros si las dos construcciones diferentes que expresan una proteína de fusión rsChBP-1-Fc y la otra proteína de fusión diferente basada en Fc (por ejemplo, otra proteína de unión de quimiocinas CC) se coexpresan en la misma célula hospedadora (documento WO 00/18932).

Un grupo adicional de secuencias heterólogas está representado por aquellas que añaden una actividad funcional adicional que puede actuar de forma sinérgica o amplificar las mostradas por rsChBP-1. Estas secuencias, que se espera aislar de un dominio extracelular de una proteína asociada a membranas (tal como un receptor de quimiocinas CC) o que estén presentes en una proteína secretada, pueden ser activas también como antagonistas de quimiocinas CC, y en general deberían tener una actividad inmunomoduladora.

Como se mencionó anteriormente, la secuencia adicional incluida en las proteínas de fusión se puede eliminar, p.ej., al final del proceso de producción o purificación, o in vivo, si es necesario, p.ej., por medio de una endo/exo-peptidasa apropiada. Por ejemplo, la secuencia espaciadora incluida en la proteína recombinante puede presentar un sitio de reconocimiento para una endopeptidasa (tal como una caspasa) que se puede usar para escindir enzimáticamente la proteína deseada de la secuencia heteróloga in vivo o in vitro. De forma alternativa, si la secuencia proteica a expresar no contiene una metionina inicial (por ejemplo, si la secuencia codifica solamente la secuencia madura de la proteína, sin el péptido señal), una proteína de la invención se puede expresar correctamente en una célula hospedadora con una metionina inicial. Este aminoácido adicional se puede mantener posteriormente en la proteína recombinante resultante, o se puede eliminar por medio de una exopeptidasa, tal como Metionina Aminopeptidasa, según los métodos descritos en la bibliografía (Van Valkenburgh HA y Kahn RA, 2002; Ben-Bassat A, 1991).

Se pueden obtener variantes o análogos adicionales de los polipéptidos de la invención en forma de moléculas miméticas peptídicas (también denominadas moléculas peptidomiméticas), en las que la naturaleza del péptido o del polipéptido se ha modificado químicamente a nivel de las cadenas laterales de los aminoácidos, de la quiralidad de los aminoácidos, y/o del esqueleto peptídico. Estas alteraciones pretenden proporcionar antagonistas con características mejoradas de purificación, potencia y/o farmacocinética. Por ejemplo, cuando el problema es que el péptido es susceptible a la escisión mediante peptidasas tras la inyección en el sujeto, la sustitución de un enlace peptídico especialmente sensible con una molécula mimética peptídica no escindible puede proporcionar un péptido más estable, y así más útil como agente terapéutico. De manera similar, la sustitución de un residuo de L-aminoácido es una manera habitual de hacer que el péptido sea menos sensible a la proteolisis, y finalmente más similar a compuestos orgánicos distintos de los péptidos. También son útiles los grupos bloqueantes aminoterminales tales como t-butiloxicarbonilo, acetilo, teilo, succinilo, metoxisuccinilo, suberilo, adipilo, azelailo, dansilo, benciloxicarbonilo, fluorenilmetoxicarbonilo, metoxiazelailo, metoxiadipilo, metoxisuberilo, y 2,4-dinitrofenilo. Se conocen en la técnica otras muchas modificaciones que proporcionan una potencia incrementada, actividad prolongada, facilidad de purificación, y/o semivida incrementada (documento WO 02/10195; Villain M et al., 2001). La alternativa preferida, los grupos "sinónimos" para los derivados de aminoácidos incluidos en las moléculas miméticas peptídicas, son los definidos en la Tabla II. "Derivado de aminoácido" quiere decir un aminoácido o entidad química similar a los aminoácidos distinto de los 20 aminoácidos naturales codificados genéticamente. En particular, el derivado de aminoácido puede contener restos alquilo sustituidos o no sustituidos que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos, y que pueden incluir uno o más heteroátomos. Los derivados de aminoácidos se pueden producir de novo o se pueden obtener a partir de fuentes comerciales (Calbiochem-Novabiochem AG, Suiza; Bachem, EE.UU.). Las técnicas para la síntesis y el desarrollo de moléculas miméticas peptídicas, así como de moléculas miméticas no peptídicas, se conocen bien en la técnica (Hruby VJ y Balse PM, 2000; Golebiowski A et al., 2001). También se describen en la bibliografía diversas metodologías para incorporar aminoácidos no naturales a las proteínas, mediante el uso de sistemas de traducción in vivo e in vitro, para investigar y/o mejorar la estructura y la función de las proteínas (Dougherty DA,
2000).

Como se discutirá más adelante, los polipéptidos de la invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye las técnicas recombinantes y las técnicas de síntesis química.

Un objetivo adicional de la invención consiste en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se definió anteriormente, es decir, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 o de un fragmento o análogo suyo. Las moléculas de ácidos nucleicos particulares de esta invención se seleccionan del grupo que consiste en:

a): una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 (ID SEC Nº: 3);

b): una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de rsChBP-1 maduro (ID SEC Nº: 5);

c): una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico de a) o b) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína que se une a una quimiocina CC;

d): una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína al menos alrededor de un 70% idéntica en la secuencia de aminoácidos a una proteína de a) o b), y que se une a una quimiocina CC;

e): una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico de a) o b), cuyo fragmento se une a una quimiocina CC; y

f): una variante degenerada de una molécula de ácido nucleico de a), b), c), d), e).

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En particular, la molécula de ácido nucleico codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en:

d): un mutante activo de una proteína de a) o b), en cuyo mutante se han añadido, delecionado o sustituido uno o más residuos de aminoácidos, y cuyo mutante se une a una quimiocina CC; y

En el contexto de la presente invención, una "variante degenerada" designa todas las secuencias de ácidos nucleicos que, debido a la degeneración del código genético, codifican la misma secuencia de aminoácidos que un ácido nucleico de referencia.

Además, la expresión "molécula de ácido nucleico" abarca todos los tipos diferentes de ácidos nucleicos, que incluyen, pero sin limitación, los ácidos desoxirribonucleicos (p.ej., ADN, cADN, gADN, ADN sintético, etc.), ácidos ribonucleicos (p.ej., ARN, ARNm, etc.) y ácidos nucleicos peptídicos (APN). En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN, tal como una molécula de ADN bicatenaria, generalmente un cADN.

Si las realizaciones principales se dirigen al ADN y a las secuencias proteicas de rsChBP-1 descritas en los ejemplos, las realizaciones específicas incluyen una serie de secuencias relacionadas con rsChBP-1, tales como las secuencias de ADN o ARN capaces de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas (disolución de prelavado de SSC 5X, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, SSC 5X, durante la noche) con las secuencias de ADN que codifican rsChBP-1, y que codifican una proteína de unión de quimiocinas CC.

Por ejemplo, la invención proporciona la secuencia del cADN de Rhipicephalus sanguineus que expresa rsCBP-1 (ID SEC Nº: 3).

En otras realizaciones preferidas, las secuencias relacionadas con rsChBP-1 son moléculas de ADN que codifican proteínas que son al menos alrededor de un 70%, preferiblemente un 80%, y lo más preferiblemente un 90% idénticas en la secuencia de aminoácidos a rsChBP-1. Este valor se puede calcular con cualquiera de los programas especializados, tales como FASTA (Pearson WR, 2000), y, para los fragmentos o las secuencias parciales, se calcula respecto de la porción de rsChBP-1 que está presente en el fragmento.

Otra realización preferida es un oligonucleótido que comprende un fragmento, o que híbrida específicamente a una región, de la secuencia de una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente. Tales oligonucleótidos contienen generalmente entre 5 y 100 nucleótidos de longitud, y se pueden seleccionar, p.ej., del grupo que consiste en oligonucleótidos de al menos alrededor de 20 nucleótidos de longitud, oligonucleótidos de al menos alrededor de 30 nucleótidos de longitud, y oligonucleótidos de al menos alrededor de 50 nucleótidos de longitud. Estos oligonucleótidos se pueden usar para detectar (mediante PCR o transferencia de Southern, por ejemplo) las secuencias (no) codificantes en los transcritos que codifican rsChBP-1 y las secuencias relacionadas en una muestra, o para generar y subclonar variantes recombinantes de rsChBP-1.

En una realización adicional, las moléculas de ácido nucleico definidas anteriormente se pueden incluir en un vector de clonación o de expresión. A este respecto, un objetivo particular de esta invención consiste en un vector de expresión que comprende un promotor asociado de manera operable a una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente, en particular un promotor específico de tejido, un promotor constitutivo o un promotor regulado (p.ej., inducible). El vector puede comprender cualquier elemento regulador adicional, tal como un terminador, potenciador, origen de replicación, marcador seleccionable, etc. El vector puede ser un plásmido, cósmido, vector viral, fago, cromosoma artificial, y similares.

En un aspecto particular, este vector puede comprender:

a): un ADN de la invención; y

b): un casete de expresión;

en el que dicho ADN (a) está asociado de manera operable a un promotor específico de tejido, constitutivo, o inducible incluido en la secuencia (b).

De forma opcional, si el ácido nucleico codificante (es decir, la secuencia (a)) no contiene un codón para una metionina inicial (por ejemplo, si esta secuencia codifica solamente la secuencia madura de la proteína, sin el péptido señal), el vector o el casete de expresión pueden contener también una secuencia ATG que se clona en posición 5' respecto de tal secuencia, de forma que se puede expresar correctamente con una metionina inicial. Este aminoácido adicional se puede mantener en la proteína recombinante resultante, o se puede eliminar por medio de una enzima, tal como Metionina Aminopeptidasa, según los métodos descritos en la biografía (Van Valkenburgh HA y Kahn RA, 2002; Ben-Bassat A, 1991).

Este vector puede permitir la expresión de las proteínas de la invención no solamente en cultivo de tejidos, sino también in vivo, por razones experimentales o terapéuticas. Por ejemplo, las células que sobreexpresan la proteína de la invención se pueden transferir (p.ej., encapsular) a un modelo animal para comprobar los efectos fisiológicos de la administración constante de la proteína, antes de aplicar las células a humanos. De forma alternativa, el vector se puede usar para la transferencia génica mediada por retrovirus, o para cualquier otra técnica que permita la introducción y la expresión de un vector o de la secuencia codificante de ADN aislada en un animal bajo el control de un promotor endógeno. Esta aproximación permite la generación de animales transgénicos que no son humanos en los que las proteínas de la invención se expresan de manera constitutiva o de una manera regulada (p.ej., en tejidos específicos y/o tras la inducción con compuestos específicos). Se aplicaron aproximaciones similares a otras proteínas de unión de quimiocinas que no son de mamíferos, y se mostraron diversos efectos congénitos y patológicos (Jensen KK et al, 2003; Pyo R et al, 2004; Bursill CA et al., 2004).

Otro objetivo de la invención son las células hospedadoras transformadas o transfectadas con el vector de clonación o de expresión indicado anteriormente. Estos vectores se pueden usar en un proceso de preparación de los polipéptidos de la invención. A este respecto, un objetivo de la invención es un método para la preparación de un polipéptido rsChBP-1 como se definió anteriormente, que comprende cultivar las células recombinantes como se definieron anteriormente en condiciones que permiten o que favorecen la expresión y la recuperación del polipéptido rsChBP-1. Cuando el vector expresa el polipéptido en forma de una proteína secretada en el espacio extracelular, la proteína se puede recoger y purificar más fácilmente a partir de las células cultivadas en vista del procesamiento posterior.

Muchos libros y revistas proporcionan enseñanzas sobre cómo clonar y producir proteínas recombinantes mediante el uso de vectores y células hospedadoras procarióticas o eucarióticas, tales como algunos títulos de la serie "A Practical Approach", publicada por Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001). En particular, los ejemplos muestran cómo, una vez que se ha identificado la secuencia de ADN que codifica rsCHBP-1 mediante el cribado de la biblioteca de cADN de Rhipicephalus sanguineus, el ORF se puede adaptar, modificar e insertar en vectores de expresión para obtener la proteína recombinante correspondiente.

En general, los vectores pueden ser vectores episómicos o de integración (no) homóloga, que se pueden introducir en las células hospedadoras apropiadas mediante cualquier medio adecuado (transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.) para transformarlas. Los factores de importancia en la selección de un vector plasmídico, viral o retroviral particular incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector se pueden reconocer y seleccionar de las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desea en un hospedador particular; y si es deseable poder "transferir" el vector entre células hospedadoras de especies diferentes. Los vectores deberían permitir la expresión de las proteínas aisladas de la invención, o de las proteínas de fusión que las contienen en la célula hospedadora procariótica o eucariótica bajo el control de secuencias reguladoras de la iniciación/terminación transcripcional apropiadas, que se eligen para que sean activas constitutivamente o inducibles en dicha célula. Una línea celular sustancialmente enriquecida en tales células se puede aislar después para proporcionar una línea celular estable.

Para las células hospedadoras eucarióticas (p.ej., células de levadura, insectos o mamíferos), se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, dependiendo de la naturaleza del hospedador. Pueden derivar de fuentes virales, tales como adenovirus, papilomavirus bovino, virus de simio o similares, en los que las señales reguladoras están asociadas a un gen particular que tiene un nivel elevado de expresión. Los ejemplos son el promotor TK del virus herpes, el promotor temprano de SV40, el promotor del gen gal4 de levadura, etc. Se pueden seleccionar señales reguladoras de la iniciación transcripcional que permitan la represión y la activación, de forma que la expresión de los genes se pueda modular. Las células que se han transformado de forma estable mediante el ADN introducido se pueden seleccionar introduciendo también uno o más marcadores que permiten la selección de las células hospedadoras que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar también fototrofia a un hospedador auxótrofo, resistencia a biocidas, p.ej. antibióticos, o a metales pesados tales como cobre, o similares. El gen marcador seleccionable se puede unir directamente a las secuencias génicas de ADN a expresar, o se puede introducir en la misma célula mediante cotransfección. También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteínas de la invención.

Las células hospedadoras para la producción recombinante pueden ser células procarióticas o eucarióticas. Las células procarióticas particularmente adecuadas incluyen bacterias (tales como Bacillus subtilis o E. coli) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinantes. Se prefieren las células hospedadoras eucarióticas, p.ej. células de mamífero, tales como células humanas, de mono, de ratón, y células de ovario de hámster chino (CHO), porque proporcionan modificaciones postraduccionales a las moléculas proteicas que incluyen un plegamiento correcto o la glicosilación en los sitios correctos. Las células hospedadoras eucarióticas alternativas son las células de levadura transformadas con vectores de expresión en levadura. Además, las células de levadura pueden llevar a cabo modificaciones peptídicas postraduccionales que incluyen la glicosilación. Existen varias estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras potentes y un número de copias elevado de plásmidos que se pueden utilizar para la producción de las proteínas deseadas en levaduras. Las levaduras reconocen las secuencias líder de los productos génicos de mamíferos clonados y secretan los péptidos que albergan las secuencias líder (es decir, pre-péptidos).

Para la producción a largo plazo y con elevado rendimiento de un polipéptido recombinante, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable el polipéptido de interés se pueden transformar mediante el uso de vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación virales y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector distinto. Tras la introducción del vector, las células se pueden dejar en cultivo durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia para la selección, y su presencia permite el cultivo y la recuperación de las células que expresan de manera eficaz las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de manera estable se pueden hacer proliferar mediante el uso de técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para ese tipo de células. Después se puede aislar una línea celular sustancialmente enriquecida en tales células para proporcionar una línea celular estable.

Un método particularmente preferido para la producción con elevado rendimiento de un polipéptido recombinante de la presente invención es por medio del uso de la amplificación mediante dihidrofolato reductasa (DHFR) en células CHO deficientes de DHFR, mediante el uso de niveles sucesivamente crecientes de metotrexato como se describió en el documento US 4.889.803. El polipéptido obtenido puede estar en una forma glicosilada.

Las líneas celulares mamíferas disponibles como hospedadores para la expresión se conocen en la técnica, e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) que incluyen, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, células de melanoma de Bowes y de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2), y otras líneas celulares. En el sistema de baculovirus, los materiales para los sistemas de expresión baculovirus/células de insecto están disponibles comercialmente en forma de equipo de, entre otros, Invitrogen.

De forma alternativa, los polipéptidos de esta invención se pueden preparar mediante síntesis artificial. A este respecto, los ejemplos de técnicas de síntesis química son la síntesis en fase sólida y la síntesis en fase líquida. Como síntesis en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido correspondiente al extremo carboxiterminal del péptido a sintetizar se une a un soporte que es insoluble en los disolventes orgánicos, y mediante la repetición alternada de reacciones, una en la que se condensan uno por uno en orden desde el extremo carboxiterminal hacia el extremo aminoterminal los aminoácidos con los grupos amino y los grupos funcionales de las cadenas laterales protegidos con grupos protectores apropiados, y una en la que se liberan los aminoácidos unidos a la resina o el grupo protector de los grupos amino de los péptidos, la cadena peptídica se elonga de esta manera. Los métodos de síntesis en fase sólida se clasifican en líneas generales en el método tBoc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector usado. Los grupos protectores usados generalmente incluyen tBoc (t-butoxicarbonilo), CI-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibencidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Cl2-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; NO_{2} (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo). Tras la síntesis del polipéptido deseado, éste se somete a la reacción de desprotección y la escisión del soporte sólido. Tal reacción de escisión del péptido se puede llevar a cabo con fluoruro de hidrógeno o con ácido trifluorometanosulfónico para el método Boc, y con TFA para el método Fmoc. Se describen proteínas totalmente sintéticas de un tamaño comparable al de rsCHBP-1 en la bibliografía (Brown A et al., 1996).

Los polipéptidos de la presente invención se pueden producir, formular, administrar o usar genéricamente en otras formas alternativas que pueden ser preferibles según el método deseado de uso y/o producción. La proteína de la invención se puede modificar postraduccionalmente, por ejemplo mediante glicosilación, como se muestra en los ejemplos.

En general, la proteína de la invención se puede proporcionar en forma de fracciones, precursores, sales, derivados, conjugados o complejos activos.

Como se indicó anteriormente, la expresión "activo" o "biológicamente activo" significa que tales compuestos alternativos deberían mantener, o incluso potenciar, las propiedades de unión de quimiocinas CC y/o inmunomoduladoras de rsChBP-1.

El término "fracción" se refiere a cualquier fragmento de la cadena polipeptídica del propio compuesto, solo o en combinación con moléculas relacionadas o residuos unidos a él, por ejemplo residuos de carbohidratos o fosfatos. Tales moléculas también pueden ser el resultado de otras modificaciones que no alteran normalmente la secuencia primaria, por ejemplo derivatización química in vitro de péptidos (acetilación o carboxilación), y aquellas producidas mediante la modificación de la proteína de forma postraduccional, tales como mediante fosforilación (introducción de residuos de fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina), o mediante glicosilación (mediante la exposición del péptido a enzimas que afectan a la glicosilación, p.ej., enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamíferos) durante su síntesis y/o en las etapas de procesamiento posteriores. En particular, se ha caracterizado rsChBP-1 en saliva de garrapata y en ambas formas recombinantes descritas en el presente documento en un estado más o menos intensamente glicosilado. Esta modificación se puede llevar a cabo in vitro, mediante el uso de la enzima modificadora apropiada, o in vivo, mediante la elección de las células hospedadoras apropiadas para la producción recombinante.

Los "precursores" son compuestos que se pueden convertir en los compuestos de la presente invención mediante el procesamiento metabólico y enzimático antes o después de la administración a las células o al organismo.

La expresión "sales" en el presente documento se refiere tanto a las sales de los grupos carboxilo como a las sales de adición de ácidos de los grupos amino de los péptidos, polipéptidos o análogos de los mismos de la presente invención. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar por medios conocidos en la técnica, e incluyen las sales inorgánicas, por ejemplo, las sales de sodio, calcio, amonio, hierro o zinc, y similares, y las sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales de adición de ácidos incluyen, por ejemplo, las sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y las sales con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Cualquiera de tales sales debería tener una actividad sustancialmente similar a los péptidos y polipéptidos de la invención o sus análogos.

El término "derivados", como se usa en el presente documento, se refiere a los derivados que se pueden preparar a partir de grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de los restos de aminoácidos o en los grupos amino- o carboxi-terminales según métodos conocidos. Tales derivados incluyen, por ejemplo, ésteres o amidas alifáticas de los grupos carboxilo y derivados de N-acilo de los grupos amino libres o derivados de O-acilo de los grupos hidroxilo libres, y se forman con grupos acilo, como por ejemplo grupos alcanoilo o aroilo.

Las proteínas de la invención pueden estar en forma de un conjugado o complejo activo con una molécula elegida entre marcadores radiactivos, biotina, marcadores fluorescentes, agentes citotóxicos, y agentes de administración de fármacos. Los conjugados o complejos útiles se pueden generar mediante el uso de moléculas y métodos conocidos en la técnica, por diversas razones, por ejemplo para permitir la detección de la interacción con quimiocinas CC o con otras proteínas (marcadores radiactivos o fluorescentes, biotina), la eficacia terapéutica (agentes citotóxicos), o para mejorar los agentes en cuanto a la eficacia de la administración de fármacos, tal como con polietilenglicol y otros polímeros naturales o sintéticos (Harris JM y Chess RB, 2003; Greenwald RB et al., 2003; Pillai O y Panchagnula R, 2001).

Estos compuestos derivados de rsChBP-1 se pueden producir tras una modificación dirigida de un residuo apropiado, en una posición interna o terminal. Los residuos se pueden usar para la unión, con tal de que tengan una cadena lateral disponible para la unión de polímeros (es decir, la cadena lateral de un aminoácido que alberga un grupo funcional, p.ej., lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, histidina, etc.). De forma alternativa, un residuo en estos sitios se puede sustituir con un aminoácido diferente que tenga una cadena lateral disponible para la unión de polímeros.

Por ejemplo, se puede añadir una cisteína adicional que permita la PEGilación directa en el extremo N- o C-terminal de la secuencia proteica madura mediante técnicas de ADN recombinante o de forma enzimática. Alternativamente, la cisteína se puede incluir en la proteína mediante la sustitución de un residuo, por ejemplo correspondiéndose con un sitio de glicosilación.

Además, las cadenas laterales de los aminoácidos codificados genéticamente se pueden modificar químicamente para la unión de un polímero, o se pueden emplear aminoácidos no naturales con grupos funcionales apropiados en las cadenas laterales. La unión del polímero puede darse no solamente en la cadena lateral del aminoácido que se da de forma natural en una posición específica del antagonista o en la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural que sustituye al aminoácido que se da de forma natural en una posición específica del antagonista, sino también en un carbohidrato u otro resto que está unido a la cadena lateral del aminoácido en la posición seleccionada como objetivo.

Los polímeros adecuados para estos fines son biocompatibles, es decir, son atóxicos para los sistemas biológicos, y se conocen muchos de dichos polímeros. Tales polímeros puede ser de naturaleza hidrófoba o hidrófila, biodegradables, no biodegradables, o una combinación de los mismos. Estos polímeros incluyen los polímeros naturales (tales como colágeno, gelatina, celulosa, ácido hialurónico), así como los polímeros sintéticos (tales como los poliésteres, poliortoésteres, polianhídridos). Los ejemplos de polímeros no degradables hidrófobos incluyen los polidimetil siloxanos, poliuretanos, politetrafluoroetilenos, polietilenos, poli(cloruros de vinilo), y poli(acrilatos de metilo). Los ejemplos de polímeros no degradables hidrófilos incluyen poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(alcohol vinílico), poli(N-vinil pirrolidona), polialquilenos, poliacrilamida, y sus copolímeros. Los polímeros preferidos comprenden una unidad repetitiva secuencial de óxido de etileno, tal como polietilenglicol (PEG).

El método de unión preferido emplea una combinación de síntesis peptídica y ligadura química. De forma ventajosa, la unión de un polímero hidrosoluble será por medio de un espaciador biodegradable, especialmente en la región aminoterminal de una proteína. Tal modificación actúa para proporcionar la proteína en una forma de precursor (o "profármaco"), que, tras la degradación del espaciador, libera la proteína sin la modificación polimérica.

La presente invención proporciona también anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, que son inmunorreactivos con las proteínas de la invención y que se pueden generar mediante la inmunización de un animal con estas proteínas, que se pueden purificar a partir de fuentes naturales, que se pueden expresar en forma de proteínas recombinantes mediante células hospedadoras, o que se pueden sintetizar químicamente (en forma de la proteína completa o como un péptido que imita un epítopo específico de la proteína). Estos anticuerpos que se unen a rsChBP-1 y a proteínas derivadas de rsChBP-1 se pueden usar, por ejemplo, en aplicaciones diagnósticas (p.ej., para identificar animales que han estado en contacto con saliva de garrapata). La generación mediante la inmunización de un animal y la modificación de estos anticuerpos se puede llevar a cabo siguiendo las enseñanzas de la bibliografía (Kipriyanov SM y Le Gall F, 2004; Holt LJ et al., 2003; Presta L, 2003).

Las proteínas de la invención se pueden proporcionar en formas más o menos purificadas. Los ejemplos muestran cómo clonar los ácidos nucleicos necesarios para expresar rsChBP-1 recombinante, cómo purificar rsChBP-1 recombinante o natural mediante el uso de la afinidad hacia las quimiocinas CC y mediante técnicas cromatográficas, y cómo seleccionar las células que expresan de forma apropiada esta proteína por medio de ensayos para la detección de las actividades de unión de quimiocinas CC.

En particular, la purificación de los antagonistas naturales, sintéticos o recombinantes de la invención se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos para este fin, es decir, cualquier procedimiento convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares. Un procedimiento de purificación adicional que se puede usar con preferencia para purificar la proteína de la invención es la cromatografía de afinidad mediante el uso de anticuerpos monoclonales o grupos de afinidad, que se unen a la proteína seleccionada como objetivo y que se producen y se inmovilizan sobre una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen las proteínas se pasan a través de la columna. La proteína se unirá a la columna mediante heparina o mediante el anticuerpo específico, mientras las impurezas pasarán a través de ella. Después del lavado, la proteína se eluye del gel mediante un cambio en el pH o en la fuerza iónica. De forma alternativa, se puede usar la HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento). La elución se puede llevar a cabo mediante el uso de un disolvente basado en agua-acetonitrilo empleado habitualmente para la purificación de proteínas. Las preparaciones purificadas de las proteínas de la invención, como se usan en el presente documento, se refieren a las preparaciones que tienen al menos un 1% (en peso seco), y preferiblemente al menos un 5% en peso, de dichas proteínas.

Otro objetivo de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un polipéptido rsChBP-1 como se definió anteriormente (en forma de proteínas y sus formas alternativas descritas anteriormente) como ingrediente activo, y un diluyente o vehículo adecuado.

Otro objetivo de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido rsChBP-1 como se definió anteriormente, o un vector o célula hospedadora recombinante correspondiente, y un diluyente o vehículo adecuado.

Un objetivo adicional de esta invención se refiere al uso de un polipéptido rsChBP-1 como se definió anteriormente, o un ácido nucleico que codifica el mismo, para la fabricación de un medicamento para el uso en la regulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto.

Estas composiciones se pueden usar como medicamentos, en particular para la regulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un mamífero, y más en particular como compuestos antiinflamatorios.

En general, dada la implicación de las quimiocinas CC en muchos trastornos humanos y veterinarios, las proteínas de unión de quimiocinas CC de la invención se pueden usar como antagonistas de quimiocinas CC (tales como CCL5/RANTES, CCL3/MIP-1 \alpha, o CCL2/MCP-1) para el tratamiento o la prevención de trastornos relacionados con las quimiocinas CC en animales. Una lista no exhaustiva de los trastornos relacionados con las quimiocinas CC incluye: trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inmunitarias, infecciones, enfermedades alérgicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades metabólicas, enfermedades gastrointestinales, enfermedades neurológicas, sepsis, enfermedades relacionadas con el rechazo de trasplantes, o enfermedades fibróticas. Los ejemplos no limitantes de estas enfermedades son los siguientes: artritis, artritis reumatoide (AR), artritis psoriásica, psoriasis, artritis reumatoide, reestenosis, sepsis, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis sistémica, esclerodermia, polimiositis, glomerulonefritis, fibrosis, enfermedades alérgicas o de hipersensibilidad, dermatitis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, fibromas, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, choque séptico, infección viral, cáncer, endometriosis, trasplante, enfermedad injerto contra huésped (GVHD), daño por reperfusión cardiaca y renal, y ateroescle-
rosis.

Las proteínas de la invención, o los fragmentos específicos, se pueden usar como ingredientes activos en la fabricación de composiciones farmacéuticas para la regulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un mamífero, por ejemplo composiciones antiinflamatorias. De forma alternativa, las proteínas de la invención, o los fragmentos específicos, se pueden usar como ingredientes activos en la fabricación de composiciones farmacéuticas para la vacunación de un mamífero contra parásitos, virus o bacterias. El proceso para la preparación de tales composiciones farmacéuticas comprende combinar rsChBP-1 junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente
aceptable.

Se puede usar una composición farmacéutica que contiene una proteína de la invención como ingrediente activo para la unión de una quimiocina CC in vivo, el bloqueo de la unión de una quimiocina CC a un receptor de superficie celular correspondiente y por lo tanto la producción de un efecto potencialmente terapéutico, tal como un efecto antiinflamatorio. También se puede usar una composición farmacéutica que contiene una proteína de la invención como ingrediente activo para la unión de análogos de quimiocinas CC presentes en virus, bacterias o parásitos para bloquear la entrada de dichos virus, bacterias o parásitos a las células. Las composiciones farmacéuticas para la vacunación de un mamífero contra un parásito, un virus o una bacteria pueden comprender un fragmento de la proteína de la invención como ingrediente activo. Las composiciones indicadas anteriormente pueden comprender además una sustancia inmunosupresora o antiinflamatoria adicional.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener, en combinación con las proteínas de la invención como ingrediente activo, diluyentes y vehículos farmacéuticamente aceptables, vehículos y aditivos biológicamente compatibles que son adecuados para la administración a un animal (por ejemplo, solución salina fisiológica), y finalmente pueden comprender agentes auxiliares (como excipientes, estabilizantes o adyuvantes) que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de cualquier forma aceptable para cumplir las necesidades del modo de administración. Por ejemplo, el uso de biomateriales y otros polímeros para la administración de fármacos, así como las diferentes técnicas y modelos para validar un modo de administración específico, se describen en la bibliografía (Luo B y Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001).

"Farmacéuticamente aceptable" pretende abarcar cualquier vehículo que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo, y que sea atóxico para el hospedador al que se administra. Por ejemplo, para la administración parenteral, los ingredientes activos anteriores se pueden formular en formas farmacéuticas unitarias para inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, solución de albúmina sérica y solución de Ringer. Los vehículos se pueden seleccionar también de almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato magnésico, estearato sódico, monoestearato de glicerol, cloruro sódico, leche descremada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, y los diversos aceites, que incluyen los de petróleo y los de origen animal, vegetal o sintético (aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite mineral, aceite de
sésamo).

Los expertos en la técnica pueden usar y determinar cualquier modo de administración aceptado para establecer los niveles sanguíneos deseados de los ingredientes activos. Por ejemplo, la administración puede ser mediante diversas vías parenterales tales como las vías subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica, rectal, oral o bucal. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar también en formas farmacéuticas de liberación sostenida o controlada, que incluyen las inyecciones de liberación lenta, las bombas osmóticas, y similares, para la administración prolongada del polipéptido a una velocidad predeterminada, preferiblemente en formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración única de dosis
precisas.

La administración parenteral puede ser mediante inyección rápida o mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la técnica, y que se pueden preparar según métodos rutinarios. Además, se puede administrar una suspensión de los compuestos activos en forma de suspensiones para inyección aceitosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosas que pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetil celulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes. Las composiciones farmacéuticas incluyen soluciones adecuadas para la administración mediante inyección, y contienen de alrededor del 0,01 al 99,99 por ciento, preferiblemente de alrededor del 20 al 75 por ciento de compuesto activo junto con el excipiente.

Se entiende que la dosis administrada dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si existe, la frecuencia del tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. La dosis se adaptará al sujeto individual, tal como un experto en la técnica entiende y puede determinar. La dosis total necesaria para cada tratamiento se puede administrar mediante dosis múltiples o en una única dosis. La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar sola o junto con otros agentes terapéuticos dirigidos a la enfermedad, o dirigidos hacia otros síntomas de la enfermedad. Normalmente, una dosis diaria de ingrediente activo está comprendida entre 0,01 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal por día. Normalmente, 1 a 40 miligramos por kilogramo por día administrados en dosis divididas o en forma de liberación sostenida son eficaces para obtener los resultados deseados. Se puede llevar a cabo una segunda administración o administraciones posteriores a una dosis, que es igual, menor o mayor que la dosis inicial o previa administrada al individuo.

Otro aspecto de la invención es el uso de una proteína codificada por un ADN de la invención como medicamento, en particular en la preparación de una composición para la regulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un mamífero.

También se describen métodos para la inmunización de un animal contra un ectoparásito que se alimenta de sangre, o para la regulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un animal que lo necesita, que comprende administrar a dicho animal una proteína de la invención durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para regular dicha respuesta inmunitaria.

También se describe un método para tratar o prevenir las enfermedades relacionadas con las quimiocinas CC, que comprende la administración de una cantidad eficaz de los compuestos de la presente invención.

Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de los ingredientes activos que es suficiente para producir un efecto en el curso y la gravedad de la enfermedad, lo que conduce a la reducción o la remisión de dicha patología. La cantidad eficaz dependerá de la vía de administración y de la enfermedad del paciente.

La expresión "enfermedades relacionadas con las quimiocinas CC" indica cualquier enfermedad debida a una producción de quimiocinas CC excesiva o incontrolada, que conduce a una infiltración masiva de monocitos/macrófagos/
neutrófilos/células T, y en la que la administración de rsChBP-1 puede proporcionar un efecto beneficioso. Se proporcionó anteriormente una lista no exhaustiva de tales enfermedades crónicas, agudas o hereditarias.

Las aplicaciones terapéuticas de los antagonistas de quimiocinas CC de la invención y de los reactivos relacionados se pueden estudiar (en cuanto a la seguridad, la farmacocinética y la eficacia) por medio de los ensayos in vivo o in vitro que hacen uso de células de mamíferos, tejidos y modelos (Coleman R et al., 2001; Li A, 2001; Methods Mol. Biol vol. 138, "Chemokines Protocols", editado por Proudfoot A et al., Humana Press Inc., 2000; Methods Enzymol, vol. 287 y 288, Academic Press, 1997). Una lista no limitante de ensayos incluye: movilización de calcio, desgranulación, aumento de citocinas proinflamatorias, aumento de proteasas, inhibición del reclutamiento celular in vitro e
in vivo.

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Un objetivo adicional de la invención son los equipos de ensayo que contienen cualquiera de los compuestos descritos en asociación con las proteínas de unión de quimiocinas CC de la invención. Por ejemplo, un equipo para la detección de una quimiocina CC o de un análogo, una proteína de unión de quimiocinas CC o un receptor, la interacción de una quimiocina CC y una proteína de unión de quimiocinas CC, o los antagonistas o agonistas de dicha interacción, que comprende un reactivo de detección y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

a): Una molécula de ácido nucleico (p.ej., un ADN);

b): Un oligonucleótido;

c): Una proteína; y

d): Un anticuerpo;

derivado de la proteína de unión de quimiocinas CC de la invención.

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Estos equipos se pueden usar en métodos aplicables in vitro o in vivo, en los que una muestra se pone en contacto con uno de estos compuestos, que pueden estar marcados o inmovilizados en un soporte sólido.

La presente invención se ha descrito con referencia a las realizaciones específicas, pero el contenido de la descripción comprende todas las modificaciones y sustituciones que pueden ser llevadas a cabo por una persona experta en la técnica sin ir más allá del significado y el propósito de las reivindicaciones.

La invención se describirá a continuación por medio de los siguientes Ejemplos, que no se deberían considerar de ninguna manera limitantes de la presente invención. Los Ejemplos se referirán a las Figuras especificadas en el presente documento más adelante.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Caracterización bioquímica de las actividades de unión de quimiocinas en la saliva de Rhipicephalus sanguineus (garrapata del perro)

La saliva de la garrapata Rhipicephalus sanguineus ya se ha usado para identificar moléculas que tienen actividades inmunomoduladoras (Matsumoto K et al., J Vet Med Sci 2003; Matsumoto K et al., 2001; Ferreira BR y Silva JS, 1998), pero no para la unión o la modulación de actividades dirigidas específicamente hacia las quimiocinas CC.

Se obtuvo saliva bruta de la garrapata Rhipicephalus sanguineus según el protocolo publicado (Ferreira BR y Silva JS, 1998). Se ensayaron las alícuotas de los extractos de saliva de Rhipicephalus sanguineus (rsSE) mediante el uso de diferentes ensayos que incluyen, como control negativo, albúmina de suero bovino (BSA) y, como control positivo, una proteína del virus de la ectromelia (denominada vCCI o p35) que se une específicamente a las quimiocinas CC (Smith VP y Alcami A, 2000; Alcami A, 2003), para comparar la especificidad de unión y los efectos dosis-respuesta.

En un primer ensayo, se aplicaron diferentes cantidades de rsSE y de vCCI a filtros de nitrocelulosa en paralelo, y cada uno de ellos se expuso a una quimiocina CC recombinante radiomarcada diferente (CCL/MCP-1, CCL3/MlP-1\alpha, y CCL5/RANTES) o a una quimiocina CXC (CCL8/Interleucina 8). Mientras no se detectó la unión de BSA con ninguna quimiocina radiomarcada, se detectó una actividad de unión específica de quimiocinas CC, comparable a la detectada mediante el uso de vCCI, en los filtros incubados con cualquiera de las quimiocinas CC. Al mismo tiempo, no se observó unión en los filtros a los que se aplicó rsSE y vCCI cuando se incubaron con CXCL/Interleucina-8 (Figura 1).

En un segundo ensayo, rhSE y vCCI se expusieron a pares quimiocina/receptor de quimiocinas mediante el uso del ensayo de proximidad de centelleo (SPA), una técnica basada en esferas que permite medir las interacciones moleculares con gran precisión. En particular, se diseñó un SPA específico para detectar moléculas que interfieren con la interacción quimiocina/receptor de quimiocinas (Alouani S, 2000). Las esferas de SPA de aglutinina de germen de trigo se recubrieron con membranas celulares aisladas de células CHO transfectadas de manera estable que expresaban un receptor de quimiocinas específico (tal como CCR1 o CXCR2), y después se incubaron con la quimiocina radiomarcada sola, en combinación con la quimiocina natural, o en combinación con diferentes cantidades de rhSE.

Este ensayo demostró que la interacción entre las quimiocinas CC, en particular para las que se unen a CCR1 (CCL3/MIP-1\alpha y CCL5/RANTES) está sometida a competición por parte de rhSE de una manera dependiente de la dosis (Figura 2). El mismo ensayo, cuando se aplicó para la pareja CXCR2/CXCL8, confirmó los resultados negativos obtenidos con los filtros de nitrocelulosa aplicados.

Se llevó a cabo un experimento de SPA de inhibición cruzada mediante el uso de un competidor de quimiocinas CXC en presencia de una pareja quimiocina CC radiomarcada/receptor de quimiocinas y viceversa. La quimiocina CXC (CXCL8/Interleucina 8) no interfiere con la inhibición mediada por rhSE de la unión de CCR1/CCR5 de una quimiocina CC radiomarcada (CCL3/MIP-1\alpha), lo que confirma la especificidad de la actividad de unión de rhSE por las quimiocinas CC.

También se detectaron actividades de unión de quimiocinas CC similares en los ensayos descritos anteriormente en la saliva de la especie de garrapata Amblyomma, lo que indica que otras especies de garrapatas expresan actividades de unión de quimiocinas CC.

Además, los experimentos de entrecruzamiento mediante el uso de rhSE y quimiocinas radiomarcadas demostraron que el reactivo de entrecruzamiento (bis-(sulfosuccinimidil)suberato o BS3) genera una especie molecular que tiene un peso molecular total aparente de aproximadamente 20 kDa al separarlo mediante SDS-PAGE. Debido a que CCL3/MIP-1\alpha radiomarcado migra en SDS-PAGE en forma de una proteína de 8 kDa, rhSE expresa una proteína de unión de quimiocinas CC que tiene un peso molecular en el intervalo de 10-15 kDa.

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Ejemplo 2

Construcción y cribado de una biblioteca de cADN de Rhipicephalus sanguineus y caracterización de rsChBP-I

La actividad de unión de quimiocinas CC identificada en rhSE se identificó después a nivel de la secuencia de ADN/proteína generando una biblioteca de cADN de glándulas salivales de Rhipicephalus sanguineus, que se usó después para producir mezclas de células mamíferas que expresaban tales cADNs en forma de proteínas secretadas en el medio de cultivo.

Mediante la comparación de la actividad de unión de quimiocinas CC detectada en el medio de cultivo obtenido de las células que expresaban vCCI (o medio de cultivo "punteado" con vCCI recombinante) como control, estos medios se cribaron después mediante el uso de una quimiocina CC radiomarcada (CCL3/MIP-1\alpha), partiendo de mezclas de células y reduciendo progresivamente hasta clones de cADN únicos.

Se eligieron células de riñón embrionario humano 293 (células HEK293; nº de cat. de la ATCC CRC-1573; mantenidas en mezcla DMEM-F12 Nut, 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, L-Glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de disolución de penicilina-estreptomicina) para expresar vCCI y la biblioteca de cADN de glándulas salivales de Rhipicephalus sanguineus.

Se obtuvieron los medios de cultivo de las células HEK293 cultivadas en medio completo. Después de tres días en cultivo, se recogió el medio de cultivo condicionado, se centrifugó para eliminar los residuos celulares y se usó el sobrenadante en un ensayo de entrecruzamiento o SPA.

Los experimentos de entrecruzamiento se llevaron a cabo con muestras transferidas a una placa de 96 pocillos de fondo plano (Costar). La quimiocina CC radiomarcada (50 \mul de ^{125}I-CCL3/MIP-1\alpha 0,23 nM) se añadió a cada muestra, que después se incubó con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Después se transfirieron alícuotas de 25 \mul de cada pocillo a otro pocillo que contenía 0,5 \mul de BS3 50 mM (agente de entrecruzamiento) y se incubó después durante 2 horas con agitación. Después de este tiempo, se añadieron 5 \mul de tampón de muestras 10X (Tris-HCl 0,1 M de pH 8 y DTT 10 mM) a cada pocillo para parar la reacción de entrecruzamiento. Las muestras se llevaron a ebullición después durante 5 minutos y se sometieron a electroforesis en un gel de Bis-Tris SDS-poliacrilamida del 10% (Invitrogen NuPAGE, nº de catálogo NP0301BOX). Tras la electroforesis, el gel se selló con SaranwrapTM y se expuso en una pantalla de formación de imágenes de almacenamiento de fósforo de tipo K (Biorad) durante 8 horas. Las pantallas de formación de imágenes se escanearon con una resolución de 100 \mum mediante el uso de un lector Personal FX Phosphoimager de Biorad.

La biblioteca de cADN de Rhipicephalus sanguineus se construyó en pTriplEx2 (BD Biosciences Clontech). Las glándulas salivales se recogieron de 100 Rhipicephalus sanguineus adultas y se almacenaron inmediatamente en una disolución RNAlater helada (Ambion) hasta su uso posterior. Se extrajo el ARN total mediante el uso del método TRlzol (Gibco-BRL) según las instrucciones del fabricante, y la biblioteca de cADN se construyó mediante el uso del equipo de construcción de bibliotecas de cADN SMART (Clontech), y el cADN se fraccionó por tamaños con una columna ChromaSpin 400 (Clontech) según las instrucciones del fabricante. El tamaño de los insertos de cADN clonados osciló de alrededor de 0,6 kb a 1,5 kb en un 80% de los insertos.

Tanto la secuencia de ADN (ID SEC Nº: 1) que codifica la proteína de control vCCI (ID SEC Nº: 2) como la biblioteca de cADN de glándulas salivales de Rhipicephalus sanguineus se subclonaron en el plásmido de expresión pEXP-lib (BD Biosciences Clontech).

El vector pEXP-Lib contiene un casete de expresión que comprende el promotor/potenciador temprano inmediato principal de citomegalovirus (CMV) seguido por un sitio de clonación múltiple que incluye sitios Sfi IA y Sfi IB (dos sitios Sfi I distintos que difieren en sus secuencias interpalindrómicas), seguido por un sitio de entrada interno del ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV), que permite la traducción de dos marcos de lectura abiertos a partir de un ARN mensajero, seguido por el gen que codifica la resistencia a puromicina (puromicina-N-acetil-transferasa), y seguido por la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Los ribosomas pueden entrar en el ARNm bicistrónico en el extremo 5' para traducir el gen de interés en la orientación apropiada, o en el IRES de ECMV para traducir el marcador de resistencia a antibiótico. Cuando se cultivan las células transformadas con el vector pEXP-Lib, el antibiótico ejerce una presión selectiva sobre el casete de expresión completo; así, una dosis elevada de antibiótico (10-100 \mug/ml de puromicina) selecciona solamente las células que expresan un nivel elevado del gen de interés. Esta presión selectiva asegura también que la expresión del gen de interés sea estable a lo largo del tiempo en el cultivo.

Las células HEK293 se transfectaron con plásmidos pEXP-Lib mediante el uso de un equipo de transfección GenePorter2 (Gene Therapy Systems) según el protocolo del fabricante.

La secuencia de la proteína vCCI (ID SEC Nº: 2) se detectó en el medio de cultivo de las células HEK mezclada con una ^{125}I-CCL3/MlP-1\alpha mediante el uso de BS3 (un reactivo de entrecruzamiento) cuando el medio se "punteó" con vCCI recombinante y cuando el medio fue de HEK293 que expresaban vCCI. La adición de reactivo de entrecruzamiento genera un complejo proteico que contiene el complejo de quimiocina CC radiomarcada que se separa en SDS-PAGE en forma de una banda que migra a \sim40-45 kDa. Este método de entrecruzamiento es muy sensible, ya que se pueden detectar complejos incluso en el intervalo de pesos de nanogramos (Figura 3A).

Cuando este método se aplicó a las células HEK293 transformadas con una biblioteca de cADN de Rhipicephalus sanguineus, fue posible cribar, partiendo de mezclas de células, un único clon (Clon 2) que expresaba una proteína de unión de quimiocinas CC (identificada como rsChBP-I) que forma un complejo con CCL3/MlP-1\alpha radiomarcado que migra en SDS-PAGE en forma de una banda de aprox. 20 kDa (Figura 3B). Esta banda, que está en el mismo intervalo de pesos que la actividad de unión de quimiocinas CC nativa detectada en la saliva de garrapatas, aparece en forma de una mancha, debido probablemente a la presencia de isoformas que tienen diferentes niveles de glicosilación.

Se secuenció el cADN que codifica rsChBP-I expresado por el Clon 2. Este cADN de 585 pb de longitud (ID SEC Nº: 3) contiene un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido de 111 aminoácidos (ID SEC Nº: 4), potencialmente secretado y que no tiene una homología significativa con ninguna proteína de unión de quimiocinas CC conocida (Figura 4). Dado el peso molecular, esta secuencia de rsChBP-I debería corresponder a al menos una de las actividades de unión de quimiocinas CC identificadas en la saliva de garrapatas.

La secuencia de rsChBP-I tiene ciertas similitudes con una secuencia proteica codificada por un ORF en un cADN de 515 pb de longitud sin caracterizar (nº de acc. de GenBank BM289643; ID SEC Nº: 7) aislado de las glándulas salivales de Amblyomma variegatum (Nene V et al., 2002) y por un ORF en un cADN de 396 pb de longitud sin caracterizar (nº de acc. de GenBank AF483738; ID SEC Nº: 9) aislado de las glándulas salivales de Ixodes scapularis (Valenzuela JG et al., 2002). Estas dos secuencias proteicas adicionales (identificadas como avChBP-I e isChBP-I; Figura 5) contienen varias cisteínas conservadas (residuos 40, 59, 64, 76, 86, 98, y 99 en rsChBP-I), y son homólogas a la secuencia de Rhipicephalus sanguineus cribada también en cuanto a la longitud de la proteína (alrededor de 110 aminoácidos).

Las propiedades de unión de quimiocinas CC de la proteína codificada por el Clon 2 se ensayaron también mediante el uso de la aproximación basada en SPA. Como se demostró para rsSE (Figura 2), la señal de SPA medida en presencia de rsChBP-I es inversamente proporcional a la cantidad de medio de cultivo de HEK293-Clon 2 añadido a la muestra, con un efecto de inhibición dependiente de la dosis sobre la unión de CCL3/MIP-1\alpha radiomarcado a las esferas de SPA (Figura 7).

Por lo tanto, se puede concluir que rsChBP-I, avChBP-I, e isChBP-I pueden ser miembros de una familia nueva de proteínas que tienen propiedades de unión de quimiocinas CC.

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Ejemplo 3

Ensayos funcionales para la caracterización de rsChBP-1 Liberación de TNF-\alpha inducida por LPS por los monocitos

Se determinó la actividad biológica de rsChBP-1 mediante un ensayo que analizó la capacidad de la proteína rsChBP-1 de inhibir la liberación de TNF-\alpha inducida por LPS por los monocitos.

Se sembró una línea celular de monocitos, THP-1, en matraces de 225 ml a una densidad de 2,5 x 10^{5} células/ml en medio de cultivo (medio RPMI que contiene un 10% de FCS, 1% de penicilina-estreptomicina). Las células se diferenciaron después cultivándolas en Vitamina D3 80 nM durante 72 h. Las células diferenciadas se colocaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10^{5} células diferenciadas por pocillo, en 150 \mul de medio de cultivo. Se añadieron diluciones en serie de proteína rsCHBP-1 (como se muestra en la Figura 6) a las células en un volumen de 50 \mul, y las células se dejaron durante 24 h en el medio que contenía las proteínas de ensayo. Al siguiente día, se añadió LPS a las células hasta una concentración final de 2,5 ng/ml durante 3,5 h. Las placas se centrifugaron, se extrajo el medio de los pocillos, y se almacenó a -80ºC antes de llevar a cabo el ELISA.

El ELISA de TNF-\alpha se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante, mediante el uso del equipo de ELISA de TNF-\alpha humano DuoSet (R & D Systems DY210). Las placas de ELISA de 96 pocillos se revistieron con 100 \mul de anticuerpo de captura, diluido hasta 4 \mug/ml en PBS. Las placas se dejaron durante la noche a temperatura ambiente para esta etapa de incubación. Se retiró la disolución de anticuerpos de captura, y los pocillos se saturaron con 200 \mul de FCS del 10% en PBS, durante 45 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces en tampón de lavado (PBS que contenía un 0,05% de Tween-20). Se añadieron 100 \mul de medio recogido de las células por pocillo y se dejó incubar durante 2,5 h a temperatura ambiente. Se usaron diluciones de TNF-\alpha humano recombinante como patrón, según las instrucciones del equipo. Tras la incubación, las placas se lavaron 3 X en tampón de lavado, y se incubaron con 300 ng/ml de anticuerpo de detección diluido en PBS, 0,05% de Tween-20. Las placas se lavaron 4 X en tampón de lavado, y después se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con 100 \mul por pocillo de estreptavidina-HRP (diluida 1:10.000 en PBS y un 0,05% de Tween-20). Tras la incubación, las placas se lavaron 3 X en tampón de lavado, y se incubaron durante 10 min en la oscuridad con 100 \mul/pocillo de sustrato Supersignal ELISA Pico-Chemiluminescent (Pierce, 37070), según las instrucciones del fabricante. Se midió el nivel de quimioluminiscencia en un luminómetro Ascent Luminoskan.

Resultados: Se demostró que rsChBP-1 inhibe la liberación inducida por LPS de TNF-\alpha por una línea celular monocítica, lo que indica que rsChBP-1 puede funcionar como un agente inmunomodulador. La CI_{50} obtenida en este ensayo para la proteína rsChBP-1 fue 1 \mug/ml.

TABLA I

1

TABLA II

2

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<110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

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<120> NUEVAS PROTEÍNAS DE GARRAPATA CON UNIÓN DE QUIMIOCINAS CC

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<130> WO956

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<150> EP03104973.7

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<151> 24-12-2003

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<160> 10

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 744

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<212> ADN

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<213> virus de la ectromelia

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<400> 1

3

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<210> 2

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<211> 247

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<212> PRT

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<213> virus de la ectromelia

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<400> 2

4

5

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<210> 3

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<211> 585

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<212> ADN

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<213> Rhipicephalus sanguineus

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<400> 3

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6

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<210> 4

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<211> 111

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<212> PRT

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<213> Rhipicephalus sanguineus

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<400> 4

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7

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<210> 5

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<211> 420

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<212> ADN

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<213> Rhipicephalus sanguineus

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<400> 5

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8

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<210> 6

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<211> 92

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<212> PRT

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<213> Rhipicephalus sanguineus

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<400> 6

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9

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<210> 7

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<211> 515

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<212> ADN

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<213> Amblyomma variegatum

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<400> 7

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10

11

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<210> 8

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<211> 108

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<212> PRT

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<213> Amblyomma variegatum

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<400> 8

12

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<210> 9

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<211> 396

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<212> ADN

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<213> Ixodes scapularis

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<400> 9

13

14

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<210> 10

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<211> 101

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<212> PRT

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<213> Ixodes scapularis

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<400> 10

15

Claims

1. Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 4 (rsChBP-1);

b): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 6 (rsChBP-1 maduro);

c): una proteína al menos alrededor de un 70% idéntica en la secuencia de aminoácidos a una proteína de a) o b), y que se une a una quimiocina CC;

d): un fragmento de una proteína de a), b) o c), cuyo fragmento se une a una quimiocina CC; y

e): un fragmento de una proteína de a), b) o c), cuyo fragmento o proteína tiene una actividad inmunomoduladora.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en:

a): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 4 (rsChBP-1);

b): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 6 (rsChBP-1 maduro);

e): una proteína de fusión, la cual comprende una proteína de a), b), c) o d), unida de manera operable a una o más secuencias de aminoácidos elegidas entre las siguientes: un dominio extracelular de una proteína asociada a membranas, una región constante de inmunoglobulina, un dominio de multimerización, una hormona proteica heterodimérica, un péptido señal, una señal de exportación, y una secuencia de etiqueta.

3. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque dicho polipéptido se modifica postraduccionalmente.

4. La proteína de la reivindicación 3, caracterizada porque dicha proteína está glicosilada.

5. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha proteína está en forma de una fracción, precursor, sal, derivado, conjugado o complejo activo.

6. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicha proteína está PEGilada.

7. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en:

e): una proteína de fusión, la cual comprende una proteína de a), b), c) o d), unida de manera operable a una o más secuencias de aminoácidos elegidas entre las siguientes: un dominio extracelular de una proteína asociada a membranas, una región constante de inmunoglobulina, un dominio de multimerización, un péptido señal, una señal de exportación, y una secuencia de etiqueta.

9. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizada porque la quimiocina CC es CCL5/RANTES, CCL3/MIP-1\alpha, y/o CCL2/MCP-1.

10. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en la que dicha molécula es una molécula de ADN, en particular una molécula de cADN.

11. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, en la que dicha molécula comprende o es una secuencia de ADN de ID SEC Nº: 3 ó 5.

12. Un vector de clonación o de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.

13. Un vector de expresión de la reivindicación 12, que comprende además un promotor asociado de manera operable a dicha molécula de ácido nucleico, en particular un promotor específico de tejido, constitutivo o inducible.

14. Una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 12 ó 13.

15. Una célula que se ha modificado genéticamente para producir una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

16. Un proceso para la preparación de un polipéptido, que comprende cultivar una célula hospedadora según la reivindicación 14 en condiciones que permiten o favorecen la expresión.

17. El proceso de la reivindicación 16, que comprende además purificar la proteína.

18. El proceso de la reivindicación 16 ó 17, que comprende además formular la proteína para la administración en humanos.

19. Un animal transgénico que no es humano que expresa una proteína de unión de quimiocinas CC, caracterizado porque las células de dicho animal contienen una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, o un vector de expresión de las reivindicaciones 12 ó 13.

20. Un anticuerpo inmunorreactivo con un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, excepto la parte e) de la reivindicación 2.

21. Un anticuerpo de la reivindicación 20 que es un anticuerpo monoclonal.

22. Un anticuerpo de la reivindicación 20 ó 21 que es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

23. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, o una célula de las reivindicaciones 14 ó 15, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composición según la reivindicación 23, para el uso como un medicamento.

25. El uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composición según la reivindicación 23, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un mamífero.

26. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composición según la reivindicación 23, para el uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con las quimiocinas CC en animales.

27. El polipéptido de la reivindicación 26, caracterizado porque la quimiocina CC es CCL5/RANTES, CCL3/MIP-1\alpha, y/o CCL2/MCP-1.

28. El uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal contra un ectoparásito que se alimenta de sangre.

29. El uso de una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con las quimiocinas CC.

30. Un equipo para la detección de una quimiocina CC o un análogo, una proteína de unión de quimiocinas CC o un receptor, la interacción de una quimiocina CC y de una proteína de unión de quimiocinas CC, o los antagonistas o agonistas de dicha interacción, que comprende un reactivo de detección y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

a): Una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7;

b): Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

c): Un anticuerpo de la reivindicación 20, 21 ó 22.

31. Un método para la detección in vitro o in vivo de una quimiocina CC o un análogo, una proteína de unión de quimiocinas CC o un receptor, la interacción de una quimiocina CC y de una proteína de unión de quimiocinas CC, o los antagonistas o agonistas de dicha interacción, en el que dicho método comprende poner en contacto una muestra con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

a): Una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7;

b): Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

c): Un anticuerpo de la reivindicación 20, 21 ó 22.