ES2328107T3 - Procedimiento para examinar una enfermedad relacionada con wt1. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para analizar el síndrome mielodisplásico (MDS) y/o la leucemia, que comprende la medición, en una muestra, de la cantidad de anticuerpo contra el antígeno del tumor de Wilms 1 y utilizar el valor de la medición como un marcador clínico para el análisis.
Description
Procedimiento para examinar una enfermedad
relacionada con WT1.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de examen para una enfermedad relacionada con WT1 y,
más particularmente, a un procedimiento para analizar la presencia
de dicha enfermedad y evaluar la progresión, el curso de la
curación y el pronóstico de la enfermedad.
El gen WT1 constituye un factor de transcripción
de dedos de zinc, aislado como un gen asociado etiológicamente con
el tumor de Wilm y su producto génico (la proteína WT1), presenta
una estructura que comprende un dominio de represión, un dominio de
activación un dedo de zinc.
Los presentes inventores informaron
anteriormente de que el nivel de expresión del gen WT1 es alto en la
leucemia aguda, que este nivel de expresión está relacionado
inversamente con el pronóstico de la enfermedad, y que el MRD
(enfermedad residual mínima) de la leucemia aguda, puede detectarse
midiendo dicho nivel de expresión [Blood, Vol. 84, nº 9, pág 3071
(1994)]. Además, los inventores descubrieron que midiendo el nivel
de expresión del gen WT1, pueden detectarse varios tipos de cáncer
sólido y de tejidos atípicos (WO97/39354).
La determinación de dicho nivel de expresión del
gen WT1, que comprende la medición del producto de transcripción o
de traducción del gen WT1, posee un gran significado clínico en la
búsqueda de la presencia de una enfermedad relacionada con el
WT1.
El objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un nuevo procedimiento para el examen de una
enfermedad relacionada con WT1, particularmente de un procedimiento
efectivo para diagnosticar la enfermedad y evaluar la eficacia de
una terapia y el pronóstico de esta enfermedad.
Durante su continua investigación para cumplir
con el objetivo anteriormente mencionado, los inventores
descubrieron que las cantidades del anticuerpo
anti-WT1 detectadas en el suero o de otras muestras
de ensayo de los pacientes con la enfermedad relacionada con el
WT1, disminuyen con la curación de la enfermedad, de forma que la
cantidad del anticuerpo anti-WT1 puede constituir
un nuevo marcador clínico de la enfermedad relacionada con WT1, y
que midiendo dicha cantidad, puede detectarse la presencia de una
enfermedad relacionada con WT1, así como pueden controlarse y
evaluar con una alta seguridad la progresión, curso de la curación y
pronóstico de la enfermedad.
La presente invención se ha desarrollado
basándose en los hallazgos anteriores.
La invención proporciona un procedimiento para
analizar una enfermedad relacionada con WT1, que comprende la
medición de la cantidad de anticuerpo contra WT1 en una muestra y
utilizando el valor de la medición como un marcador clínico o
índice para el análisis.
En particular, la invención proporciona las
maneras siguientes de analizar la enfermedad relacionada con
WT1:
- 1.
- Procedimiento que comprende la detección de la presencia de una enfermedad relacionada con WT1.
- 2.
- Procedimiento para evaluar la progresión, curso de la curación, y pronóstico de una enfermedad relacionada con WT1.
- 3.
- Procedimiento para controlar la progresión de un síndrome demielodisplásico a leucemia.
- 4.
- Procedimiento para dilucidar una remisión completa de la leucemia.
- 5.
- Procedimiento que comprende el ensayo de un anticuerpo anti-WT1 mediante una inmunorreacción utilizando un antígeno WT1.
- 6.
- Procedimiento tal como se ha definido anteriormente, en el que el antígeno WT1 es una proteína WT1 que contiene un dominio de represión y un dominio de activación, pero que carece de un dedo de zinc.
- 7.
- Procedimiento tal como se ha definido anteriormente, en el que el anticuerpo anti-WT1 es un anticuerpo IgG o un anticuerpo IgM.
- 8.
- Procedimiento que comprende la utilización a lo largo del tiempo de la cantidad del anticuerpo anti-WT1 como un marcador clínico.
- 9.
- Procedimiento que comprende la utilización de la proporción cuantitativa del anticuerpo IgG y del anticuerpo IgM contra WT1, como un marcador clínico.
La representación de los aminoácidos, péptidos,
secuencias nucleótidas, ácidos nucleicos, etc., mediante las
abreviaturas en la presente memoria, está de acuerdo invariablemente
con las normas del IUPAC-IUB, "The Guidelines for
Drafting Specifications and Equivalents referring to Nucleotide
Sequences or Amino Acid Sequences" (editado por la Oficina
Japonesa de Patentes) y las convenciones que predominan en este
campo particular de la técnica.
El procedimiento para analizar la enfermedad
relacionada con WT1, según la invención, se lleva a cabo midiendo
la cantidad de anticuerpo anti-WT1 en una
muestra.
La muestra que se menciona anteriormente no está
limitada, siempre que comprenda un anticuerpo
anti-WT1. La muestra puede ser una derivada de un
paciente que padezca una enfermedad relacionada con WT1, o un
paciente del que se sospecha padece la enfermedad, y una muestra
derivada de un paciente que recibió tratamiento por la enfermedad
relacionada con WT1. La muestra puede estar constituida por un
fluido corporal en el que se encuentran generalmente anticuerpos,
tal como la sangre, orina o similares.
Haciendo referencia al análisis con respecto a
la presencia de la enfermedad relacionada con el WT1, según la
invención, pueden ejemplificarse diversas enfermedades relacionadas
con WT1, tales como dicha leucemia aguda y otros tipos de
leucemia.
El anticuerpo anti-WT1 que va a
ensayarse según la invención, es un anticuerpo para el producto de
expresión (proteína WT1) del gen WT1 [Cell, 60, 509, (1990);
Nature, 343, 774 (1990)]. Comprende todos los anticuerpos
relevantes que se detecten en un individuo. El anticuerpo como tal
incluye varias inmunoglobulinas tales como el anticuerpo IgG, el
anticuerpo IgA y el anticuerpo IgM.
El ensayo del anticuerpo
anti-WT1 según la invención, puede llevarse a cabo
mediante diversas procedimientos rutinarios que se utilizan en la
técnica de la determinación de anticuerpos, tales como un
procedimiento de inmunoensayo que utiliza un antígeno WT1, entre
otros. Un ejemplo específico del procedimiento del inmunoensayo es
una técnica sándwich en fase sólida.
La técnica sándwich en fase sólida puede
llevarse a cabo típicamente de la siguiente forma: Un antígeno
(antígeno WT1) que puede realizar una reacción específica
antígeno-anticuerpo, con el anticuerpo objetivo
contra WT1 (anticuerpo anti-WT1), se inmoviliza en
primer lugar, añadiéndose entonces una muestra. Entonces, tiene
lugar una reacción antígeno-anticuerpo, entre el
antígeno inmovilizado y el anticuerpo que se encuentra en la
muestra, de forma que el anticuerpo anti-WT1 que se
encuentra en la muestra se une al antígeno inmovilizado. Entonces,
este anticuerpo unido se detecta con un reactivo de detección de
anticuerpos, por lo que puede ensayarse en la muestra el anticuerpo
anti-WT1 que se encuentra en ella.
Esta técnica sándwich en fase sólida puede
llevarse a cabo de la manera alternativa siguiente. Así, en primer
lugar, el reactivo que detecta el anticuerpo es inmovilizado para
provocar la captura de los anticuerpos que se encuentren en la
muestra, añadiéndose entonces el antígeno del WT1, que provoca la
unión del anticuerpo anti-WT1 entre los anticuerpos
capturados. A continuación, un anticuerpo marcado obtenido marcando
el anticuerpo específico contra dicho antígeno provoca unirse a
dicho antígeno, para detectar y determinar de este modo el
anticuerpo objetivo anti-WT1 que se encuentra en la
muestra.
La selección de varios medios y su modificación
en estas técnicas de ensayo resultan invariablemente bien conocidos
por los expertos en la materia y cualquiera de dichos medios y
versiones pueden utilizarse sustancialmente de manera no limitativa
en la práctica de la presente invención [referencia, Rinsho Kensaho
Teiyo (Protocolos de ensayo de laboratorio clínico), Kanehara
Publishing Co., 1995, por ejemplo].
Con respecto al reactivo de detección del
anticuerpo que va a utilizarse tal como se ha mencionado
anteriormente, pueden utilizarse de manera no limitativa diversos
reactivos que se utilizan rutinariamente para detectar varias
inmunoglobulinas, tal como la IgG. Los ejemplos de dichos reactivos
incluyen el anticuerpo anti IgG humano, el anticuerpo anti IgM
humano, y el anticuerpo anti Ig (G+M) humano que se unen
específicamente al IgG humano, IgM humano, o a ambos, que van a
determinarse, y una preparación suya. Estos pueden obtenerse a
partir de orígenes comerciales o prepararse opcionalmente mediante
procedimientos establecidos per se.
El antígeno WT1 que va utilizarse como se ha
indicado anteriormente puede ser cualquier antígeno que sea
específico para el producto del gen WT1 (proteína). Este antígeno
puede ser una proteína WT1 como tal, o el fragmento suyo que posea
un epítopo específico de la proteína WT1. El antígeno WT1 mencionado
anteriormente, incluye el antígeno sintetizado químicamente de
acuerdo con la información de la secuencia aminoácida con respecto
a la proteína WT1 o al antígeno preparado mediante una técnica de
ingeniería genética. Debe apreciarse que si un candidato a antígeno
WT1 puede utilizarse satisfactoriamente en la práctica de la
invención, puede dilucidarse fácilmente, por ejemplo, llevando a
cabo una reacción antígeno-anticuerpo de forma
rutinaria, utilizando un anticuerpo que se ha establecido sea el
anticuerpo WT1 albergado por un paciente con enfermedad relacionada
con el WT1.
\newpage
En la presente invención, el antígeno WT1, que
está particularmente adaptado como el antígeno del sistema de
ensayo, es uno que contiene el dominio de represión y el dominio de
activación de la proteína WT1, y que todavía es defectuoso en los
dedos de zinc. Entre sus especies, es particularmente preferida una
proteína (a la que se hará brevemente referencia en adelante como
HWT3), que tiene una secuencia parcial que consiste en la parte de
los residuos 1~294 de la secuencia aminoácida de la proteína WT1.
HWT3 puede obtenerse mediante una técnica de ingeniería genética
que utiliza el gen conocido WT1, por ejemplo, mediante el
procedimiento descrito como un ejemplo específico en la sección de
Mejor Modo de poner en práctica la invención, que se presenta a
continuación o mediante cualquier procedimiento análogo.
La producción de un antígeno WT1 mediante una
técnica de ingeniería genética utilizando el gen WT1, puede ser
llevada a cabo según la tecnología génica recombinante general
conocida hasta la fecha. Más particularmente, mediante el
procedimiento que comprende construir un ADN recombinante tal que el
gen WT1 de interés pueda expresarse en las células huésped,
transfectando con él a éstas, y dejando crecer al transformante que
resulta, el objetivo del antígeno WT1 puede producirse como un
producto de expresión génica intra o extracelular del
transformante.
Las diversas operaciones y manipulaciones que
pueden utilizarse en la producción anteriormente mencionada del
antígeno WT1, tales como la síntesis química, el tratamiento
enzimático para la fragmentación, la deleción, adición y unión de
un gen o de sus fragmentos, el aislamiento, purificación, selección,
etc., la introducción del ADN recombinante en las células huésped,
y el cultivo de las células transformantes entre otras, pueden
llevarse a cabo según procedimientos establecidos [referencia,
"Bunshi Idengaku Jikkenho" (Protocolos experimentales en
Genética Molecular), Kyoritsu Publishing Co., 1993; PCR Technology,
Takara Shuzo Co., 1990; Science, 224, 1431 (1984); Biochem.
Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci,
USA, 80, 5990 (1983); Molecular Cloning, por T. Maniatis et
al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982), etc.].
Si se desea, el antígeno WT1 puede aislarse y
purificarse a partir del producto de expresión mencionado
anteriormente o similar, según las diversas técnicas separadoras
que utilizan sus propiedades físicas y/o químicas [por ejemplo,
"Biochemistry Data Book II", páginas 1175-1259,
Primera Edición 1ª impresión, 23 de junio de 1980, publicado por
K.K. Tokyo Kagaku Dojin, etc.].
La determinación de la cantidad del anticuerpo
anti-WT1 en una muestra, según la invención, puede
realizarse asimismo utilizando diversos sistemas de ensayo,
utilizando medios y técnicas conocidos. En dichos sistemas de
ensayos, los reactivos de ensayo conocidos hasta la fecha, por
ejemplo, pueden utilizarse ventajosamente.
Adoptando un sistema de ensayo que utilice una
técnica en fase sólida como ejemplo, el antígeno o el anticuerpo es
inmovilizado en una fase sólida de forma rutinaria. Como la fase
sólida, los transportadores o soportes insolubles e inertes, son
varillas, perlas, microplacas, tubos de ensayo, etc., realizados en
diversos materiales, tales como vidrios, polvo de celulosa,
Sephadex, Sepharose, poliestireno, papel de filtro,
carboximetilcelulosa, resinas de intercambio iónico, dextrano,
películas de plástico, tubos de plástico, resinas poliamídicas,
perlas de vidrio, seda, copolímero de éter
poliamín-metil vinilo-ácido maleico, copolímero de
aminoácidos, copolímero etileno-ácido maleico, y así
sucesivamente.
La inmovilización del antígeno o del anticuerpo
puede también llevarse a cabo, sustancialmente sin restricción,
mediante la tecnología conocida. Esta tecnología incluye los
procedimientos que dependen del enlace físico, los que dependen del
enlace químico, y los que utilizan ambos. Los ejemplos típicos son
varios procedimientos que utilizan reacciones de unión química
tales como el enlace covalente, por ejemplo, el procedimiento diazo,
el procedimiento peptídico (procedimiento derivado de la amida
ácida, procedimiento de la resina de cloruro de carboxilo,
procedimiento de la resina de carbodiimida, procedimiento derivado
del anhídrido maleico, procedimiento derivado del isocianato,
procedimiento polisacárido activado por el bromuro de cianógeno,
procedimiento derivado del carbonato de celulosa, procedimiento del
reactivo de condensación, etc), procedimiento de alquilación,
procedimiento de unión al soporte utilizando un reactivo de
entrecruzamiento (glutaraldehído, isocianato de hexametileno, o
similar, se utiliza como el agente de entrecruzamiento), el
procedimiento de unión al transportador utilizando una reacción
Ugi), etc.; el procedimiento de enlace iónico que utiliza una resina
de intercambio iónico o transportador similar; y el procedimiento
de adsorción física que utiliza un vidrio poroso, tal como perlas
de vidrio, como transportador.
El agente de marca para utilizar en cada sistema
de ensayo no está particularmente limitado, pero puede ser
cualquiera de los agentes que se conocen hasta la fecha. Los
ejemplos específicos incluyen los diversos radioisótopos que se
utilizan convencionalmente en inmunoensayos; enzimas tales como la
fosfatasa alcalina (ALP), peroxidasa, (POX), etc.; sustancias
fluorescentes tales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC),
etc.; el isotiocianato de tetrametilrodamina (RITC), etc.; y otros,
por ejemplo, el
1N-(2,2,6,6-tetrametil-1-oxil-4-piperidil)-5N-(aspartato)-(2,4-dinitrobenceno
(TOPA).
Como enzimas para marca enzimática, pueden
utilizarse no sólo las sustancias mencionadas anteriormente, sino
también la microperoxidasa, quimiotripsinógeno, procarboxipeptidasa,
gliceroaldehído-3-fosfórico
deshidrogenasa, amilasa, fosforilasa, D-nasa,
P-nasa, etc. La marca con dicho agente marcador
puede llevarse a cabo mediante tecnología conocida [referencia,
(Tatsuo Iwasaki et al: Monoclonal Antibody, Kodansha
Scientific, 1984; Eiji Ishikawa et al: Enzime Immunoassay,
2ª edición, Igaku Shoin, 1982; etc.].
\newpage
La determinación de la actividad enzimática
puede también realizarse de la forma conocida según el tipo de
enzima empleada. Por ejemplo, dicha determinación puede llevarse a
cabo utilizando ABTSJ
(2,2'-azino-bi(3-etilbenzotiazo-
lina-ácido sulfónico) como el sustrato cuando se utiliza una peroxidasa como agente marcador, o p-nitrofenil fosfato como el sustrato cuando se utiliza fosfatasa alcalina como agente de marca, y midiendo la descomposición del sustrato con un espectrofotómetro o similar [referencia, Eiji Ishikawa et al; Enzime Immunoassay, 2ª edición., Igakushoin, 1982, por ejemplo].
lina-ácido sulfónico) como el sustrato cuando se utiliza una peroxidasa como agente marcador, o p-nitrofenil fosfato como el sustrato cuando se utiliza fosfatasa alcalina como agente de marca, y midiendo la descomposición del sustrato con un espectrofotómetro o similar [referencia, Eiji Ishikawa et al; Enzime Immunoassay, 2ª edición., Igakushoin, 1982, por ejemplo].
Cuando se utiliza un radioisótopo o una
sustancia fluorescente como marca en lugar de dicha enzima, la
determinación de la inmunoglobulina marcada puede llevarse a cabo
mediante la técnica conocida que utiliza la marca particular.
El disolvente que debe utilizarse en cada
sistema de ensayo, puede ser cualquier disolvente que no afecte de
forma adversa la reacción en el sistema de ensayo particular. Los
ejemplos de disolvente preferidos para su utilización general son
soluciones tampón que tengan valores pH dentro del intervalo de
aproximadamente 5-9, tales como solución tampón
citrato, solución tampón fosfato, solución tampón
Tris-HCl, solución tampón acetato, y así
sucesivamente.
Las condiciones de la reacción inmune (unión) no
están, tampoco, particularmente limitadas. Así, pueden utilizarse
las condiciones de utilización rutinaria para los inmunoensayos de
este tipo. Generalmente, la temperatura de la reacción no es
superior a aproximadamente 45ºC, preferentemente es del orden de
aproximadamente 4-40ºC, siendo el tiempo de
reacción de aproximadamente 1-40 horas.
La característica más importante de la
invención, consiste en utilizar la cantidad de anticuerpo
anti-WT1 en una muestra, como un marcador clínico
de la enfermedad relacionada con WT1.
Comparado con los individuos sanos, el nivel de
anticuerpo anti-WT1 en un paciente con enfermedad
relacionada con el WT1, está significativamente elevado, y
disminuye con el progreso de la cura de la enfermedad. Por tanto,
tomando este nivel de anticuerpo anti-WT1 y su
cambio, particularmente el curso temporal de la cantidad del
anticuerpo anti-WT1 como un marcador clínico, pueden
evaluarse la presencia de enfermedad relacionada con el WT1, el
curso de la curación y el pronóstico. Una disminución en la cantidad
de anticuerpo anti-WT1 en una muestra, puede
considerarse como un marcador clínico particularmente deseable.
En el contexto de la presente invención se
descubrió que, entre dichos varios anticuerpos
anti-WT1, las cantidades del anticuerpo IgM
anti-WT1 y del anticuerpo IgG
anti-WT1, los respectivos cursos temporales, y el
curso temporales de su proporción, sirven como marcadores más
efectivos de la presencia, curso de la curación, y pronóstico de
una enfermedad relacionada con el WT1.
Además, en el contexto de la presente invención
se descubrió que la enfermedad relacionada con WT1, particularmente,
el síndrome mielodisplásico (MDS), tiene lugar un cambio del
anticuerpo de WT1 de IgM a IgG asociado con la progresión de la
enfermedad. Por tanto, rastreando el curso temporal de la proporción
presencial del anticuerpo IgM anti-WT1 con respecto
al anticuerpo IgG anti-WT1, es posible controlar la
progresión de la enfermedad en dicho MDS, es decir, el curso de la
progresión desde la anemia resistente al tratamiento (RA) a través
de la RA con un exceso de blastos, a la RAEB en transformación
(RAEB-t) y posteriormente, a la leucemia.
Los inventores encontraron posteriormente que el
anticuerpo anti-WT1 desaparece en la remisión
completa de una enfermedad relacionada con WT1, tal como la
leucemia, y que, por tanto, el intervalo de tiempo en el cual esta
desaparición del anticuerpo persiste, puede considerarse como el
período de tiempo durante el cual el estado anterior de remisión
completa se mantiene.
La detección del anticuerpo
anti-WT1 en un paciente con enfermedad relacionada
con el WT1, es decir, la confirmación de un paciente positivo al
anticuerpo anti-WT1, proporciona evidencia de que el
paciente se presenta con una respuesta humoral inmune al WT1. Por
tanto, la detección de un anticuerpo anti-WT1 es
útil para la evaluación o el diagnóstico de la competencia
inmunológica del paciente. Comparado con un paciente que no presenta
una respuesta inmune, un paciente que presenta ésta posee una
inmunidad más alta y puede tener un pronóstico mucho mejor. Por
tanto, la determinación del anticuerpo anti-WT1 en
un paciente con enfermedad relacionada con WT1, se utiliza
habitualmente para diagnosticar la competencia inmunológica contra
la enfermedad relacionada con el WT1, particularmente (contra el
cáncer) en varios pacientes cancerosos.
El procedimiento de examen de la invención puede
llevarse a cabo conveniente utilizando un agente de prueba,
preferentemente un equipo de prueba (reactivo de ensayo). La
presente invención proporciona además un reactivo de análisis para
dilucidar la presencia, curso de la curación, y pronóstico de una
enfermedad relacionada con el WT1.
El reactivo de análisis de la invención
comprende un antígeno WT1, es decir, un antígeno que puede
experimentar una reacción antígeno-anticuerpo con
el anticuerpo anti-WT1 que va a ensayarse, como un
ingrediente activo. Este reactivo de análisis puede comprender
además un reactivo opcional tal como un agente detector de un
antígeno que es útil para el sistema particular de ensayo. Además,
puede contener reactivos apropiados que ayuden en el proceso de
determinación, tal como un diluyente del anticuerpo, un diluyente de
la reacción, un tampón, una solución de lavado, y un agente marcado
que detecte la actividad, entre otros.
La figura 1 es una vista esquemática que ilustra
las estructuras de los antígenos WT1 producidos de acuerdo con el
Ejemplo 1-(1).
La figura 2 es una vista que representa los
resultados del análisis para la reactividad entre el antígeno WT1 y
el anticuerpo anti-WT1, de acuerdo con el Ejemplo
1-(2).
La figura 3 es un gráfico que representa los
títulos del anticuerpo anti-WT1 (IgG) en pacientes
con una enfermedad relacionada con el WT1, y en voluntarios sanos,
determinado mediante el procedimiento de examen de la invención en
el Ejemplo 2.
La figura 4 es un gráfico que representa los
títulos del anticuerpo anti-WT1 (IgG) en pacientes
con una enfermedad relacionada con el WT1 y en voluntarios sanos,
determinado mediante el procedimiento de examen de la invención en
el Ejemplo 2.
La figura 5 es un gráfico que representa los
títulos del anticuerpo anti-WT1 (IgM) en pacientes
con una enfermedad relacionada con el WT1, y en voluntarios sanos,
determinado mediante el procedimiento de examen de la invención en
el Ejemplo 2.
La figura 6 es un gráfico que representa los
títulos del anticuerpo anti-WT1 (IgM) en pacientes
con una enfermedad relacionada con el WT1 y en voluntarios sanos,
determinado mediante el procedimiento de examen de la invención en
el Ejemplo 2.
La figura 7 es un gráfico que representa el
curso temporal del anticuerpo anti-WT1 antes del
comienzo de la terapia y después de la completa remisión de la
leucemia aguda, determinado mediante el procedimiento de examen de
la invención en el Ejemplo 3.
La figura 8 es un gráfico que representa los
títulos del anticuerpo anti-WT1 (IgM) en pacientes
con una enfermedad relacionada con el WT1, y en voluntarios sanos,
determinado mediante el procedimiento de examen de la invención en
el Ejemplo 4.
La figura 9 es un gráfico que representa los
títulos del anticuerpo anti-WT1 (IgG) en pacientes
con una enfermedad relacionada con el WT1 y en voluntarios sanos,
determinado mediante el procedimiento de examen de la invención en
el Ejemplo 4.
La figura 10 es un gráfico que representa los
títulos del anticuerpo anti-WT1 (IgM e IgG) en una
enfermedad relacionada con el WT1, determinado mediante el
procedimiento de examen de la invención en el Ejemplo 4.
La figura 11 es un gráfico que representa la
especificidad de un sistema de ensayo del anticuerpo
anti-WT1 que materializa el procedimiento de examen
de la invención, tal como se analiza en el Ejemplo 5-(1).
La figura 12 es una vista que representa los
resultados de un análisis de transferencia Western realizado en el
Ejemplo 5-(2).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos siguientes ilustran la invención
con mayor detalle. Debe, sin embargo, apreciarse que éstos no
definen el alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen WT1 (Blood, Vol. 91, pág. 2969 (1998)),
se integró en el plásmido pBluescript II (producto de Stratagene),
y utilizando este pBluescript II/WT1 (+/+) como matriz, se amplificó
el fragmento de ADN mediante PCR, utilizando un cebador preparado
añadiendo una secuencia de reconocimiento EcoR I en el extremo 5'
(SEC ID nº:1) y un cebador preparado añadiendo una secuencia de
reconocimiento Not I en el extremo 3' (SEC ID nº:2). El fragmento
amplificado de ADN corresponde a una parte del ADNc del gen WT1 que
codifica la secuencia de los aminoácidos 1 a 294 de la proteína
WT1.
Entonces, el fragmento de ADN así obtenido se
unió a un pGEX-5x-3 (Amersham
Pharmacia Biotech), utilizándose para transfectar Escherichia
coli BL 21 (DE3). Para una potenciación de la solubilidad de la
proteína de fusión, las células se transfectaron simultáneamente
con el plásmido pT-Trx de expresión de la
tioredoxina. E. coli se cultivó por la noche y el líquido de
cultivo se diluyó 10 veces, incubándose a 37ºC durante 1,5 horas, y
añadiéndose a continuación
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) a una concentración final de 0,1 mM, seguido posteriormente
por 5 horas de incubación. Las células se recuperaron entonces y,
después de añadir una solución citolítica [50 mM
Tris-ClH (pH 7,5), 50 mM NaCl, 1 mm EDTA, 1 mM
Prefabloc SC (Boehringer Mannheim), 10 \mug/ml de leupeptina, 1
mM DTT], se trataron con ultrasonidos y se centrifugaron,
recuperándose el sobrenadante. La proteína de fusión en el
sobrenadante se conjugó con la glutation-sefarosa
4B (Amersham Pharmacia Biotech), que fue entonces lavada, y que se
eluyó con un tampón de elución (50 mM Tris-HCl (pH
7,5), 150 mM NaCl, 20 mM glutatión reducido, 1 mM DTT), para
recuperar la proteína de fusión HWT3 de GST-WT1.
De forma similar, tal como se describe a
continuación, se obtuvieron HWT2 (el fragmento WT1ADNc que codifica
la secuencia daminoácida 1 a 181 de la proteína WT1) y HWT4 (el
fragmento WT1ADNc que codifica la secuencia aminoácida 182 a 294 de
la proteína WT1).
Así, con pBluescript II/WT1(+/+) como matriz, se
llevó a cabo una PCR utilizando un cebador que contenía una
secuencia de reconocimiento EcoRI en el extremo 5' y un
cebador que contenía una secuencia de reconocimiento NotI en
el extremo 3' (el cebador-5' con la secuencia de SEC
ID nº:1 y el cebador-3' con la secuencia de SEC ID
nº:3 para HWT2, o el cebador-5' con la secuencia de
SEC ID nº:4, y el cebador-3' con la secuencia de
SEC ID nº:2 para HWT4), para amplificar el fragmento objetivo ADN.
Cada ADN obtenido de esta forma se clonó en
pGEX-5X-3 (Amersham Pharmacia
Biotech) y se utilizó para transfectar Escherichia coli BL21
(DE3). A partir de esta E. coli, se recuperaron las
proteínas de fusión HWT2 o HWT4 de WT1, de la misma forma que se
describió anteriormente.
Las estructuras de las proteínas HWT2, HWT3 y
HWT4 respectivas obtenidas tal como se ha llevado a cabo
anteriormente, se muestran esquemáticamente en comparación con WT1
en la figura 1.
En la figura 1, la región 1-181
representa un dominio de represión, la región
182-294 representa un dominio de activación,
seguido por un dedo de zinc.
\vskip1.000000\baselineskip
La reactividad entre el antígeno WT1 y el
anticuerpo WT1 que se concibieron como se indicó anteriormente en
(1), se ensayó de la siguiente manera:
Así, la proteína de fusión GST se disolvió en
PBS a una concentración de 250 \mug/ml y se adsorbió en una
membrana de nitrocelulosa (Optitran, Schleicher & Schuell) a una
concentración de 25 \mug/cm^{2}. Esta membrana de
nitrocelulosa se lavó con PBS, se sumergió en una solución de
albúmina sérica bovina (BSA) al 2% durante 2 horas, y se montó en
un dispositivo de transferencia (Schleicher & Schuell), Sobre la
membrana de nitrocelulosa que transporta adsorbida la proteína de
fusión GST, se situaron 20 \mul de solución de anticuerpo
anti-WT1, haciéndose reaccionar durante 1 hora, y
después de lavar con PBS, se hizo reaccionar posteriormente la
membrana durante 1 hora, con el anticuerpo anti-IgG
conjugado con HRP. Después de lavar, la membrana se sumergió en una
solución sustrato (Renaissance^{TM}, NEN Life Science products)
para reacción, y después de secar, se dejó la membrana en contacto
con una película fotosensible (Hyperfilm MP, Amersham Life
Science). Después de exponer la película, la densidad de la banda en
ésta se midió con un sistema de análisis computarizado de rastreo
(Molecular Dynamics). para calcular el título del anticuerpo en
unidades densitométricas.
Los anticuerpos anti-WT1 que se
utilizaron fueron los siguientes:
- *
- S-Cruz 180: un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína de fusión GST, que contiene la secuencia N-terminal de 180 residuos del WT1 humano (producto de Santa Cruz Biotechnology, Inc)
- *
- Pharmingen: un anticuerpo monoclonal de ratón anti-proteína WT1 humana que reconoce la secuencia exónica 5, tal como se obtiene inmunizando un péptido sintético que corresponde a la secuencia del exón 5 del WT1 humano (producto de Pharmingen).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se presentan en la figura 2.
Puede deducirse lo siguiente a partir de los
resultados representados en la figura 2. Así, mientras que HWT2
reacciona exclusivamente con el anticuerpo policlonal de conejo
S-Cruz 180, y HWT4 reacciona exclusivamente con el
anticuerpo monoclonal Pharmingen de ratón, se encontró que HWT3
reaccionó con ambos.
Para la detección de amplio espectro de los
anticuerpos anti WT1 en una muestra, se utilizó HWT3 como el
antígeno para detectar los anticuerpos anti-WT1 en
una muestra en el procedimiento siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
El suero de ensayo se diluyó 2500 veces con PBS
que contenía 2% de BSA y 0,05% de Tween 20 para preparar una
muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución de la proteína de fusión HWT3 (250
\mug/ml) se dispuso y se dejó que se adsorbiera sobre una
membrana de nitrocelulosa (Optitran, Schleicher & Schuell) a una
concentración de 25 \mug/cm^{2} durante 1 hora. Esta membrana
se lavó con PBS, se sumergió entonces en una solución bloqueadora
((solución de albúmina sérica bovina al 2%) durante 2 horas, se
lavó otra vez y se utilizó como la membrana en la que se había
adsorbido el antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando la membrana en la que se había
adsorbido el antígeno, obtenida tal como se ha mencionado
anteriormente en el punto (2), se determinó cada uno de los
anticuerpos anti-WT1 (IgG e IgM) contenidos en la
muestra que se había preparado en el punto (1), de la misma forma
que se describe en el Ejemplo 1-(2).
De este modo, la membrana de nitrocelulosa que
soportaba la proteína de fusión GST tal como fue adsorbida, se
montó en un dispositivo de transferencia y 20 ìl de la muestra
(suero diluido) se dispusieron sobre la membrana, incubándose
durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se hizo reaccionar
posteriormente la membrana en BSA/PBS al 1%, con el anticuerpo
anti-IgM humano de cabra conjugado a HRP (ICN
Pharmaceuticals Inc.), en el caso del anticuerpo IgM durante 1
hora. En el caso del anticuerpo IgG, se hizo reaccionar
posteriormente con el anticuerpo anti-IgG humano de
conejo, conjugado a HRP (ICN Pharmaceuticals Inc.) durante 1 hora.
Después de la finalización de la reacción, la membrana se lavó con
PBS, se sumergió en una solución de sustrato para reacción, se
secó, y se situó en estrecho contacto con la película fotosensible.
Ésta se expuso entonces, y se midió la densidad de la banda sobre
la película para determinar el título del anticuerpo (en unidades
densitométricas). Estos procedimientos se llevaron a cabo
invariablemente a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) Los resultados obtenidos utilizando muestras
de 43 voluntarios adultos humanos y de 33 pacientes con enfermedad
relacionada con el WT1 ((12 con síndrome mielodisplásico (MDS), 12
con leucemia mielocítica aguda (AML), 4 con leucemia linfocítica
aguda (ALL) y 5 con leucemia mielocítica crónica (CML)), de acuerdo
con el procedimiento descrito anteriormente, se presentan en las
figuras 3-6.
En cada figura, las ordenadas representan
títulos de anticuerpo (unidades densitométricas) y las abscisas
representan cada muestra.
Los resultados representados en la figura 3
indican que, comparados con los voluntarios sanos, los pacientes
con enfermedad relacionada con WT1, presentan títulos de anticuerpos
IgG anti-WT1 significativamente altos
(p<0,001).
Los resultados representados en la figura 4
indican que, comparados con los voluntarios sanos, los pacientes
con AML y con MDS presentan títulos de anticuerpos IgG
anti-WT1 significativamente altos.
Los resultados representados en la figura 5
indican que, comparados con los voluntarios sanos, los pacientes
con enfermedad relacionada con WT1, presentan títulos de anticuerpos
IgM anti-WT1 significativamente altos
(p=0,0003).
Los resultados representados en la figura 6
indican que, comparados con los voluntarios sanos, los pacientes
con AML y con MDS presentan títulos de anticuerpos IgM
anti-WT1 significativamente altos.
Estos hallazgos evidencian que determinando los
anticuerpos IgG y/o IgM anti-WT1, es posible
diagnosticar la presencia de enfermedades relacionadas con el WT1,
tales como AML, ALL, CML y MDS.
\vskip1.000000\baselineskip
De la misma forma que se describe en el Ejemplo
2, se midió el título de anticuerpos IgG anti-WT1 en
6 pacientes afectos de leucemia aguda, y después del tratamiento
(cuando se produce la remisión completa (CR)).
Los resultados se presentan en la figura 7.
Haciendo referencia a la figura 7, las abscisas
se refieren a antes del tratamiento y a después de la remisión
completa para cada paciente, y las ordenadas se refieren al título
de los anticuerpos anti-WT1 de cada muestra.
Siguiendo con la descripción de las figuras, las líneas (1)-(6)
representan a los pacientes respectivos con enfermedad relacionada
con WT1, de las cuales, las líneas continuas se relacionan con los
cuatro pacientes en los que el trasplante de células troncales
sanguíneas periféricas dio lugar a una remisión completa, mientras
que las líneas a trazos representan los dos pacientes en los que la
quimioterapia dio lugar a una remisión completa.
A partir de la figura 7, puede apreciarse lo
siguiente: Así, el título de anticuerpos IgG
anti-WT1 que se detecta antes del tratamiento,
según el procedimiento de la invención, cae definitivamente por
debajo del límite de detección cuando el tratamiento ha sido lo
bastante efectivo como para proporcionar una remisión completa
(CR).
Los hallazgos anteriores indican que la
eficiencia de un tratamiento puede confirmarse y diagnosticarse
llevando a cabo el seguimiento del título de anticuerpos IgG
anti-WT1, estableciéndose de forma diferente que
este título refleja la enfermedad residual mínima.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recuperaron los sueros a partir de los 43
voluntarios adultos sanos y de los 46 pacientes con enfermedades
relacionadas con WT1 (16 con síndrome mielodisplásico (MDS), 16 con
leucemia mielocítica aguda (AML), 7 con leucemia linfocítica aguda
(ALL) y 7 con leucemia mielocítica crónica (CML)). El análisis de la
población de patentes MDS fue: 6 con anemia resistente al
tratamiento (RA), 4 con anemia resistente al tratamiento con exceso
de blastos (RAEB), y 6 con RAEB en transformación
(RAEB-t).
Los sueros de ensayo se guardaron
a-20ºC hasta que se utilizaron.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia del ADN que corresponde al
fragmento de la proteína WT1 (1-294 (HWT3)), se
amplificó mediante PCR, de la misma forma que en el Ejemplo 1-(1),
clonándose en el vector plasmídico pET-21b(+), que
posee la secuencia C-terminal His- Tag (Novagen
Inc., Madison, WI). El plásmido resultante se utilizó para
transfectar Escherichia coli
XL1-Blue, examinándose el transformante mediante
mapeado de enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Entonces, este ADN plasmídico se usó para transfectar
Escherichia coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla,
CA), para preparar un ADN recombinante.
La E. coli BL21 (DE3) recombinante se
cultivó hasta que A600=0,6 a 37ºC, y se incubó en presencia de 0,1
\muM IPTG durante 4 horas, para inducir un fragmento proteico de
WT1. Las células de E. coli se recuperaron centrifugando a
6.000 g durante 10 minutos, se volvieron a suspender en 4 ml (por
200 ml de cultivo) de tampón A (100 mM NaH_{2}PO_{4}, 10 mM
Tris-HCl, pH 8,0), y se guardaron a -80ºC. Después
de descongelar en hielo, E. coli se fragmentó mediante
ultrasonidos (x3, 2 min), y se centrifugó A 6.000 g durante 10
minutos. El sedimento que contenía el cuerpo de inclusión se volvió
a suspender en tampón B (100 mM NaH_{2}PO_{4}, 10 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 6 M urea, 15 mM
imidazol, 20 mM de \beta-ME) y se guardaron en
hielo bajo agitación moderada durante 1 hora para desnaturalizar la
proteína.
Una columna que contenía niquel nitro triacético
agarosa (Qiagen, Hilden, Alemania), se cargó con la solución
resultante para permitir que la proteína se inmovilizara. Se lavó la
columna con tampón C (el tampón B anterior que contenía Tween al
1%, pero no \beta-ME), y se eluyó el fragmento
proteico de WT1 con 4 ml de tampón D (el tampón B anterior que
contenía 150 mM de imidazol, pero sin contener
\beta-ME, pH 8,0). Para volver a mantener la
proteína recombinante, se emplazó el eluado en una cassette
(cassette Slide-a-Lyzer, Pierce
Chemical Company, IL) y se dializó contra un exceso de tampón 20 mM
Tris- HCl (pH 8,0) a 4ºC por la noche.
La proteína recombinante se concentró entonces
con Centricon-30 (Millipore Corp., Bedford, MA),
midiéndose la concentración proteica mediante el procedimiento
Bradford, utilizando un equipo de análisis proteico
(Bio-Rad Labs, Hercules, CA). Se ensayó la pureza y
la especificidad de la proteína resultante mediante
SDS-PAGE y análisis de transferencia Western,
solubilizándose dicha proteína en una solución de glicerol (v/v) al
30%, y guardándose a -80ºC hasta que se utilizó.
\newpage
El fragmento proteico (HWT3) de WT1 obtenido
anteriormente se conjugó con una membrana de nitrocelulosa
(Optitran, Schleicher & Schuell) a una concentración de 2,5
\mug/cm^{2} (1 hora de incubación a temperatura ambiente). Esta
membrana se lavó con PBS y, después de bloqueo durante 2 horas en
BSA-PBS, se montó en un dispositivo de
transferencia (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania), según la
(presente) memoria.
La determinación se llevó a cabo de acuerdo con
el Ejemplo 2. Así, 20 \mul del suero de ensayo preparado según el
punto (1) anterior (utilizando PBS que contenía BSA al 1% y Tween 20
al 0,1%, diluyéndose el suero 1/500 veces en el caso de IgM o
1/2.500 veces en el caso de IgG), se aplicaron a cada pocillo y se
incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar
con PBS, la membrana se hizo reaccionar, en BSA al 1%/PBS, con el
anticuerpo anti-IgM humano de cabra, conjugado a HRP
o con el anticuerpo anti-IgG humano de conejo,
conjugado a HRP, durante 1 hora.
Después de lavar completamente con PBS, se midió
el título del anticuerpo de la misma forma que anteriormente. Cada
resultado se expresó en el promedio de, por lo menos, dos
mediciones.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) Los resultados obtenidos mediante el
procedimiento citado anteriormente (los resultados de la
determinación del anticuerpo IgM o IgG anti-WT1 en
cada muestra), se representan en la Tabla 1, y en la figura 8 los
resultados de la determinación del anticuerpo IgM
anti-WT1 y en la figura 9, los resultados de la
determinación del anticuerpo IgG anti-WT1.
En cada figura, las ordenadas representan el
título del anticuerpo (unidades densitométricas) y las abscisas,
cada muestra. Debe comprenderse que, en cada figura, los círculos
negros representan una muestra que contiene sólo el anticuerpo IgM
o el IgG anti-WT1, y los círculos blancos
representan una muestra que contiene los dos anticuerpos IgM
anti-WT1 e IgG anti-WT1. Además, el
valor de extinción que se utilizó para el anticuerpo
anti-WT1 fue el título del anticuerpo de 600 para el
anticuerpo IgM, o el título del anticuerpo de 500 para el
anticuerpo IgG (Clin. Chem., 39, 561 (1993)).
A partir de los resultados representados en la
Tabla 1, la figura 8 y la figura 9, puede deducirse lo que se
expone a continuación.
Así, en 24 (52,2%) de 46 pacientes con
enfermedad relacionada con WT1, se detectó anticuerpo IgM
anti-WT1. Por otra parte, se descubrió en 7 (16,2%)
de los 43 voluntarios sanos.
Comparados con los voluntarios sanos, tanto la
tasa de detección de los anticuerpos IgM anti-WT1
(p=0,0001) como el título de anticuerpos IgM
anti-WT1 (p<0,0001) fueron significativamente más
altos en los pacientes con la enfermedad relacionada con el
WT1.
La comparación de los títulos de anticuerpos IgM
anti-WT1 en los 4 tipos de enfermedad relacionada
con el WT1, con los títulos correspondientes en los voluntarios
sanos, reveló que en los pacientes con todos los tipos de
enfermedad relacionada con el WT1, excepto ALL, el título de
anticuerpos fue significativamente más alto que en los voluntarios
sanos.
Los anticuerpos IgG anti-WT1 se
detectaron en 23 (50,0) de los 46 pacientes con enfermedad
relacionada con el WT1, pero sólo en 2 (4,7%) de los 43 voluntarios
sanos.
Comparados con los voluntarios sanos, tanto la
tasa de detección de los anticuerpos IgG anti-WT1
(p=0,0001) como el título de anticuerpos IgG
anti-WT1 (p<0,0001) fueron significativamente más
altos en los pacientes con la enfermedad relacionada con el WT1.
Además, la comparación de los títulos de anticuerpos IgG
anti-WT1 en los pacientes con enfermedad
relacionada con el WT1 con los títulos correspondientes en
voluntarios sanos, reveló que en tres tipos de la enfermedad,
exceptuando ALL, principalmente en AML, CML y MDS, este título de
anticuerpos fue significativamente más alto cuando se comparó con
los voluntarios sanos.
La producción de los anticuerpos IgM e IgG anti
WT1 mostró un contraste notable entre los pacientes con la
enfermedad relacionada con el WT1 y los voluntarios sanos. Tanto los
anticuerpos IgM como los IgG anti-WT1 se produjeron
en 10 (21,7%) de los 46 pacientes con enfermedades relacionadas con
el WT1, pero ninguno de los 43 voluntarios sanos, presentó ninguno
de ellos. Se debe considerar que 3 pacientes (2 con AML y 1 con
MDS) que mostraban los títulos más altos del anticuerpo IgG
anti-WT1, habían producido simultáneamente
anticuerpos IgM anti-WT1 y que mientras 6 (el
37,5%) de 16 pacientes con AML y 4 (el 25,0%) de 16 pacientes con
MDS habían producido tanto anticuerpos IgM como IgG
anti-WT1, ninguno de los pacientes de ALL y de CML
habían producido simultáneamente los dos anticuerpos.
No se encontró correlación entre el título de
anticuerpos anti-WT1 y cada uno de los niveles de
expresión de WT1 (RT-PCR) y la edad de los
pacientes, o entre la presencia de anticuerpos
anti-WT1 y el sexo, situación patológica, y
supervivencia/muerte de cada uno de los pacientes.
(b) En 4 pacientes leucémicos, el título de
anticuerpos anti-WT1 se midió tanto en el
diagnóstico como durante la remisión continuada completa (CCR).
Los resultados se presentan en la Tabla 2.
Se deduce a partir de los resultados en la Tabla
2 que, en todos estos pacientes, que los títulos de anticuerpos
anti-WT1 comparativamente altos que se encontraron
en la etapa de diagnóstico y no se detectaron en la etapa de CCR.
En estos pacientes, la duración de la CCR sería de entre 3,1 y 5,5
años, los títulos séricos de IgM, IgG e IgA permanecieron al nivel
normal, y no se habría administrado ningún inmunosupresor durante el
tiempo del ensayo. Estos hallazgos sugieren que se habrían
recuperado completamente del estado inmunodeprimido provocado por
una quimioterapia potente o por el trasplante alogénico de médula
ósea. Por tanto, se considera que la ausencia de anticuerpos
anti-WT1 en la etapa CCR es el resultado de la
desaparición o del alivio de la carga tumoral leucémica y de la
desaparición subsiguiente de la estimulación inmunológica debida al
antígeno WT1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron los anticuerpos IgM e IgG
anti-WT1 en 16 pacientes de MDS (6 con RA, 4 con
RAEB y 6 con RAEB-t). Los resultados se presentan
en la figura 10.
Se puede deducir lo siguiente de los resultados
representados en la figura 10. Así, se detectó el anticuerpo IgM
anti-WT1 en 5 de los 6 casos RA y, en 3 de estos 5
casos, se encontraron títulos de anticuerpos comparativamente
altos. Contrariamente, no se detectaron anticuerpos IgG
anti-WT1 en 4 de los 6 casos, siendo también bajos
los títulos de anticuerpos en los 2 casos restantes.
Entre los pacientes de RAEB, se detectaron los
anticuerpos IgM anti-WT1 e IgG
anti-WT1 en 2 y 3, respectivamente, de 4 casos. Los
títulos de anticuerpos IgM anti-WT1 fueron
inferiores a los de dichos pacientes de RA, mientras que los
títulos de anticuerpos IgG anti-WT1 fueron más
altos.
Los pacientes de RAEB-t fueron
claramente distintos de los que presentaban RA. Así, se encontraron
títulos bajos de anticuerpos IgM anti-WT1 en 2 de 6
casos, mientras que se encontraron altos títulos de anticuerpos IgG
anti-WT1 en 5 de los 6 casos.
Estos hallazgos indican convincentemente que,
asociado con la progresión de MDS a partir de RA, a través de RAEB
a RAEB-t, existe un cambio en el tipo de
inmunoglobulina del anticuerpo anti-WT1, desde IgM a
IgG.
\vskip1.000000\baselineskip
(5-1) A cada uno de los sueros
positivos al anticuerpo IgG anti-WT1, sueros
negativos al anticuerpo IgG anti-WT1 y solución del
anticuerpo policlonal anti-WT1
(S-Cruz-180), se añadió una cantidad
predeterminada de la proteína ensayo (HWT3, albúmina (HSA) o
transferrina humana), llevándose a cabo la determinación del
anticuerpo-anti WT1 (ensayo de inhibición), de
acuerdo con el procedimiento que se describe en el Ejemplo 4.
Los resultados se presentan en la figura 11.
Haciendo referencia a la figura 11, las
ordenadas representan el porcentaje de inhibición y las abscisas
representan el nivel de adición (ng/pocillo) de la proteína de
prueba. En el gráfico, (1) representa la muestra positiva al
anticuerpo anti-WT1 + HWT3, (2) representa la
muestra positiva al anticuerpo anti-WT1 + HSA, y (3)
representa la muestra positiva al anticuerpo
anti-WT1 + transferrina, (4) representa la muestra
negativa al anticuerpo anti-WT1 + HWT3, (5)
representa la muestra negativa al anticuerpo
anti-WT1 + HSA, (6) representa la muestra negativa
al anticuerpo anti-WT1 + transferrina, (7)
representa la solución del anticuerpo policlonal
anti-WT1 + HWT3, (8) representa la solución del
anticuerpo policlonal anti-WT1 + HSA, y (9)
representa la solución del anticuerpo policlonal
anti-WT1 + la transferrina.
anti-WT1 + la transferrina.
Resulta evidente a partir de los resultados
representados en la figura 11, que la adición de la proteína HWT3,
antígeno del sistema de detección, a la muestra positiva al
anticuerpo anti-WT1, o la solución del anticuerpo
policlonal anti-WT1, provocó una inhibición variable
de la detección del anticuerpo anti-WT1 en una forma
dependiente del nivel de adición de la proteína HWT3. Esta
inhibición dependiente del nivel de HWT3 pudo confirmarse asimismo
cuando se utilizó la muestra positiva al anticuerpo IgM
anti-WT1. Por otra parte, la adición de HSA o la
transferrina no provocó tal inhibición y, cuando la muestra era
negativa al anticuerpo anti-WT1, la adición de HWT3
no tuvo influencia.
Estos hallazgos evidenciaron que este sistema de
ensayo del anticuerpo anti-WT1 proporciona la
detección específica de los anticuerpos contra WT1.
(5-2) Se sometió a
SDS-PAGE al 10% un lisado nuclear de K562 (progenie
celular eritroleucémica), para preparar una proteína WT1 (proteína
natural WT1), para análisis de transferencia Western. Utilizando las
muestras positivas y negativas al anticuerpo IgG
anti-WT1, que se utilizaron en los ensayos llevados
a cabo en el Ejemplo 4, se realizó el análisis de transferencia
Western de la proteína WT1. Los sueros del ensayo se diluyeron 50
veces, y como segundo anticuerpo, se utilizó anticuerpo IgG
anti(conejo o humano) marcado con ALP. Como control
positivo, se utilizó solución de anticuerpo policlonal
anti-WT1 (S-Cruz 180).
Los resultados se presentan en la figura 12.
Haciendo referencia a la figura 12, la posición
de WT1 se muestra a lo largo de los marcadores de tamaño en la
columna izquierda.
El carril 1 representa el resultado con control
positivo (S-Cruz 180), el carril 2 representa el
resultado obtenido con la muestra (ALL) positiva al anticuerpo IgG
anti-WT1, que se ensayó tenía un título de
anticuerpos de 1366 en el Ejemplo 4, el carril 3 representa el
resultado obtenido con la muestra (AML) positiva al anticuerpo IgG
anti-WT1, que se ensayó tenía un título de
anticuerpos de 754, el carril 4 representa el resultado obtenido
con la muestra (RAEB-t) negativa al anticuerpo IgG
anti-WT1, que se encontró era inferior al valor de
extinción en el Ejemplo 4, y los carriles 5 y 6 representan los
resultados obtenidos con las muestras de los voluntarios sanos,
negativas al anticuerpo IgG anti-WT1.
Resulta evidente a partir de los datos en la
figura 12, que la proteína WT1 natural puede detectarse, en el
sistema de ensayo de la invención, con un suero que se descubrió era
positivo al anticuerpo anti-WT1 (indetectable con
el correspondiente suero negativo), pudiendo detectarse, según este
sistema de ensayo de la invención, los anticuerpos objetivos
anti-WT1 que reconocen la proteína natural WT1.
De acuerdo con la invención, se proporciona un
nuevo procedimiento de examen para la presencia de una enfermedad
relacionada con el WT1 tal como la leucemia, el curso temporal de su
curación, y su pronóstico. El procedimiento de examen de la
invención no sólo permite la detección y el diagnóstico de las
enfermedades relacionadas con el WT1, sino también el control de la
progresión de la enfermedad a partir de MDS a la leucemia, e incluso
la confirmación de la remisión completa de la leucemia.
<110> Haruo SUGIYAMA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de detección de las
enfermedades asociadas a WT1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P01-37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000-152923 &
JP 2001-14927
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<151>
2000-5-24 &
2001-1-23
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' de WT1
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipttgaattcaa tgggctccga cgtgcgg
\hfill27
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<210> 2
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<211> 26
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Secuencia artificial
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<223> cebador 3' de WT1
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipttgtcgacga agacaccgtg cgtgtg
\hfill26
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<210> 3
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador 3' para HWT2
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipttgtcgacca tgggatcctc atgctt
\hfill26
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<210> 4
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador 5' para HWT4
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgaattcag atccaatggg ccagcag
\hfill27
Claims (9)
1. Procedimiento in vitro para analizar
el síndrome mielodisplásico (MDS) y/o la leucemia, que comprende la
medición, en una muestra, de la cantidad de anticuerpo contra el
antígeno del tumor de Wilms 1 y utilizar el valor de la medición
como un marcador clínico para el análisis.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el procedimiento está destinado a analizar la presencia o
ausencia del MDS y/o de la leucemia.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el procedimiento está destinado a evaluar la progresión,
curso de la curación, o pronóstico del MDS y/o de la leucemia.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el procedimiento está destinado a evaluar la remisión
completa de la leucemia.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la determinación de la cantidad del anticuerpo
anti-tumor de Wilms 1, se lleva a cabo mediante una
inmunoreacción que utiliza un antígeno del tumor de Wilms 1.
6. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el antígeno del tumor de Wilms 1 es una proteína del tumor
de Wilms 1 que contiene un dominio de represión y un dominio de
activación pero que no contiene un dedo de zinc.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el anticuerpo anti-tumor de Wilms 1 es un
anticuerpo IgG o un anticuerpo IgM.
8. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el curso temporal de la cantidad del anticuerpo
anti-tumor de Wilms 1, se utiliza como un marcador
clínico.
9. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la proporción cuantitativa del IgG anticuerpo
anti-tumor de Wilms 1, con respecto al anticuerpo
IgM anti-tumor de Wilms 1, se utiliza como marcador
clínico.
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