KR20030014238A

KR20030014238A - Ｗｔ1 관련 질환의 검사 방법

Info

Publication number: KR20030014238A
Application number: KR1020027015826A
Authority: KR
Inventors: 하루오 스기야마
Original assignee: 하루오 스기야마
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-24
Publication date: 2003-02-15
Also published as: EP1288661A1; US7824865B2; ATE437368T1; EP2045604B1; KR101141319B1; US20050148037A1; KR20080066862A; JP3846199B2; CA2704596A1; CA2704596C; ES2328107T3; EP1288661A4; AU2001258827B2; CA2409208C; KR20100095478A; ES2389328T3; WO2001090750A1; CA2409208A1; DE60139314D1; US20110124123A1

Abstract

백혈병, 고형암, 이형성(atypia) 등의 WT1 관련 질환의 존재 유무를 진단하고, 치료 경과 및 예후를 더욱 간편하고 신뢰성 있게 검출할 수 있는 검사 방법에 있어서, 검체 중의 WT1에 대한 항체량을 측정하고, 상기 측정값 및 그 시간 경과에 따른 변화를 해당 검사에 있어서의 임상 지표로서 이용하는 것을 특징으로 하는 WT1 관련 질환의 검사 방법을 제공한다.

Description

ＷＴ1 관련 질환의 검사 방법{METHOD FOR EXAMINING WT1-RELATED DISEASE}

WT1 유전자는, 윌름씨(Wilms') 종양의 원인 유전자로서 단리된 징크 핑거(zinc finger)형의 전사 인자이며, 그의 유전자 산물(WT1 단백질)은, 억제 영역(repression domain), 활성화 영역(activation domain) 및 징크 핑거로 이루어진 구조를 갖고 있다.

본 발명자 등은, 상기 WT1 유전자의 발현 레벨이 급성 백혈병에서 높고, 그 발현 레벨이 예후(豫後)와 역상관하며, 발현 레벨을 측정함으로써 급성 백혈병의 MRD(minimal residual disease; 최저 잔류병)세포를 검출할 수 있음을 앞서 보고했다(Blood, Vol.84, No.9, p3071 (1994)). 또한, 본 발명자 등은 WT1 유전자의 발현 레벨의 측정에 의해, 각종의 고형암(solid cancer) 및 조직 이형성(tissue atypia)을 검출할 수 있음도 발견했다(WO 97/39354).

WT1 유전자의 전사물 또는 번역물을 측정하는 것으로 이루어지는 상기 WT1 유전자의 발현 레벨의 측정은, WT1 관련 질환의 존재의 유무를 판정함에 있어서 임상적으로 중요한 의의를 갖고 있다.

본 발명은, WT1 관련 질환의 검사 방법, 더욱 상세하게는 상기 질환의 존재의 유무를 판정하고, 또한 상기 질환의 진전, 치료 경과 및 예후(豫後)를 판단하는 방법에 관한 것이다.

도1은, 실시예1의 (1)에 따라 제조된 WT1 항원의 구조를 모식적으로 도시한 도면이다.

도2는, 실시예1의 (2)에 따른 WT1 항원과 WT1 항체 간의 반응성 시험 결과를 도시한 도면이다.

도3은, 실시예2에 따른 본 발명의 검사법에 의해 얻어진 WT1 관련 질환 환자 및 건강한 사람의 WT1 항체가(antibody titers)(IgG)를 도시한 그래프이다.

도4는, 실시예2에 따른 본 발명의 검사법에 의해 얻어진 WT1 관련 질환 환자 및 건강한 사람의 WT1 항체가(IgG)를 도시한 그래프이다.

도5는, 실시예2에 따른 본 발명의 검사법에 의해 얻어진 WT1 관련 질환 환자 및 건강한 사람의 WT1 항체가(IgM)를 도시한 그래프이다.

도6은, 실시예2에 따른 본 발명의 검사법에 의해 얻어진 WT1 관련 질환 환자 및 건강한 사람의 WT1 항체가(IgM)를 도시한 그래프이다.

도7은, 실시예3에 따른 본 발명의 검사법에 의해 얻어진 급성 백혈병의 치료시작 전 및 완전 관해시의 WT1 항체가의 추이를 도시한 그래프이다.

도8은, 실시예4에 따른 본 발명의 검사법에 의해 얻어진 WT1 관련 질환 환자 및 건강한 사람의 WT1 항체가(IgM)를 도시한 그래프이다.

도9는, 실시예4에 따른 본 발명의 검사법에 의해 얻어진 WT1 관련 질환 환자 및 건강한 사람의 WT1 항체가(IgG)를 도시한 그래프이다.

도10은, 실시예4에 따른 본 발명의 검사법에 의해 얻어진 WT1 관련 질환의 WT1 항체가(IgG 및 IgM)를 도시한 그래프이다.

도11은, 실시예5의 (1)에 따라서 시험된, 본 발명의 검사법에 따른 WT1 항체 검출계의 특이성을 도시한 그래프이다.

도12는, 실시예5의 (2)에 따라서 시험된 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석 결과를 도시한 도면이다.

본 발명의 목적은, WT1 관련 질환의 새로운 검사 방법, 특히 상기 질환을 진단하고, 치료 효과, 예후 등도 판정할 수 있는 효과적인 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자 등은, 상기 목적을 달성하기 위해서 계속해서 연구를 거듭하는 과정에서 WT1 관련 질환 환자의 혈청 등의 검체 중에 WT1에 대한 항체가 검출되었고, 질환 치유의 정도에 상응하여 상기 항체의 양이 감소하였으므로, 상기 WT1에 대한 항체의 양은 WT1 관련 질환의 신규의 임상 지표가 될 수 있다는 것과, WT1 관련 질환의 존재 유무를 측정함으로써 질환의 진전 뿐만 아니라 치료 경과를 판정할 수 있으며, 예후를 높은 신뢰도로 모니터하고 평가할 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명은, 이러한 발견에 기초하여 완성된 것이다.

본 발명은, WT1 관련 질환의 검사 방법에 있어서, 검체 중의 WT1에 대한 항체량을 측정하고, 상기 측정값을 해당 검사의 임상 지표로서 사용하는 것을 특징으로 하는 WT1 관련 질환의 검사 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은, 이하의 각 태양의 WT1 관련 질환의 검사 방법을 제공한다.

1. WT1 관련 질환의 존재의 유무를 판정하는 방법.

2. WT1 관련 질환의 진전, 치료 경과 및 예후를 판정하는 방법.

3. 골수 이형성 증후군(MDS; myelodysplastic syndrome)에서 백혈병으로의 진전을 판정하는 방법.

4. 백혈병의 완전 관해(complete remission)를 판정하는 방법.

5. WT1에 대한 항체량의 측정을 WT1 항원을 이용한 면역 반응에 의하여 행하는 방법.

6. WT1 항원이 억제 영역 및 활성화 영역은 포함하고, 징크 핑거는 흠결한 WT1 단백질인 방법.

7. WT1에 대한 항체가 IgG 항체 또는 IgM 항체인 방법.

8. 시간 경과에 따른 WT1에 대한 항체량의 변화을 임상 지표로서 사용하는 방법.

9. WT1에 대한 IgG 항체와 IgM 항체의 양비(量比)를 임상 지표로 하는 방법.

본 명세서에 있어서의 아미노산, 펩티드, 염기 서열, 핵산 등의 약호(略號)에 의한 표시는, IUPAC-IUB의 규정, 「염기 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서 등의 작성을 위한 가이드라인」(일본 특허청편) 및 해당 분야에서의 관용 기호를 따르는 것으로 한다.

본 발명에 관계되는 WT1 관련 질환의 검사 방법은, 검체에 있어서의 WT1에 대한 항체량을 측정하는 것에 의해 실시된다.

상기에 있어서 검체(샘플)로서는, WT1에 대한 항체를 보유하는 것이면 제한은 없다. 이 검체에는, WT1 관련 질환 환자 또는 질환을 보유한 것으로 의심되는 환자로부터 유래하는 검체 및 이전에 WT1 관련 질환의 치료를 받았던 적이 있는 환자로부터 유래하는 검체가 포함된다. 상기 검체는, 일반적으로 항체의 존재가 알려져 있는 체액, 예를 들면 혈액, 뇨(尿) 등일 수 있다.

본 발명에 의해 검사되는 WT1 관련 질환으로서는, 전술한 급성 백혈병을 포함하는 각종의 백혈병, 고형암, 이형성 등의 각종 WT1 관련 질환을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 측정되는 WT1에 대한 항체란, WT1 유전자(문헌 「Cell,60, 509 (1990); Natute,343, 774 (1990)」참조)의 발현 산물(WT1 단백질)에 대한 항체를 말한다. 이것에는 피험자에게서 발견되는 해당 항체의 모두가 포함된다. 이러한 항체에는 IgG항체, IgA항체, IgM 항체 등의 각종 면역글로불린이 포함된다.

본 발명에 따른 WT1에 대한 항체량의 측정은, 예를 들면 WT1 항원을 이용한 면역측정법 등의 항체 측정 기술에 있어서 관용되는 각종 방법에 따라서 실시할 수 있다. 면역 측정법 중 하나의 구체적인 예로서, 고상화 샌드위치법(solid-phase sandwich technique)을 예시할 수 있다.

상기 고상화 샌드위치법은, 예를 들면 다음과 같이하여 실시할 수 있다. 즉, 먼저 측정 대상으로 하는 WT1에 대한 항체(WT1 항체; anti-WT1 antibody)와 특이적으로 항원-항체 반응을 할 수 있는 항원(WT1 항원)을 고상화해 두고, 이것에 검체 시료를 첨가한다. 그 결과, 고상화된 항원과 시료 중의 항체 사이에서 항원-항체 반응이 일어나고, 시료 중에 존재하는 WT1 항체가 고상화된 항원과 결합한다. 다음으로, 이렇게 결합된 항체를 항체 검출 시약을 이용하여 검출한다. 이것에 의해서, 피검시료 중에 존재하는 WT1 항체를 측정할 수 있다.

상기 고상화 샌드위치법은 또한 이하의 다른 방법에 의하여 행할 수 있다. 즉, 먼저 항체 검출 시약을 고상화하고, 이것에 검체 중의 항체를 포착시키고, 이어서 WT1 항원을 첨가하여 포착된 항체 중 WT1 항체에 결합시킨다. 또한, 상기 항원에 대한 특이 항체가 표식된 표식체를 상기 항원과 결합시킴으로써, 검체 중에 존재하는 목적하는 WT1 항체를 검출 및 측정할 수 있다.

이들 측정 방법에 있어서, 다양한 수단 및 그것이 변형된 것 중에서의 선택은 당업계의 숙련된 자에게 잘 공지된 것이고, 상기 수단 및 변형된 것 중 어느 것도 본 발명에의 적용에 제한없이 충분히 사용될 수 있다(「임상검사법 제요」, 카네하라출판, 1995년 등 참조).

상기에 있어서 이용되는 항체 검출 시약으로서는, IgG 등의 다양한 면역글로불린을 검출하기 위해서 일반적으로 사용되고 있는 각종 시약을 제한없이 사용할 수 있다. 그 예로서는, 예를 들면 측정할 인간 IgG, 인간 IgM, 또는 그들 양자 등에 특이적으로 결합하는 항-인간 IgG항체, 항-인간 IgM 항체, 항-인간 Ig(G+M) 항체 등과 그들의 조제물 등을 들 수 있다. 이들은 시판품으로서 구입할 수 있고, 또한 통상적인 방법에 따라서 조제할 수도 있다.

또한, 상기에 있어서 이용되는 WT1 항원은, WT1 유전자 산물(단백질)에 대한 특이 항원이면 좋다. 상기 항원은, WT1 단백질 그 자체일 수도 있고, 적어도 WT1 단백질-특이 항원 결정기(epitope)를 가지는 WT1 단백질의 단편 등일 수도 있다. 이들의 WT1 항원에는, WT1 단백질의 아미노산 서열 정보에 따라서 화학적으로 합성한 것, 또는 유전자 공학적 방법에 의해 조제한 것 등이 포함된다. 또한, 이용하고자 하는 WT1 항원을 본 발명에 양호하게 사용할 수 있는지 없는지는, 예를 들면, WT1 관련 질환 환자가 보유하는 WT1 항체로서 이미 확인된 항체를 이용하여, 해당 항체와의 항원-항체 반응을 통상적인 방법에 따라서 실시함으로써 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 측정계의 항원으로서 특히 적합한 WT1 항원은, WT1 단백질의 억제 영역 및 활성화 영역을 포함하고 또한 징크 핑거가 결여된 것이다. 그 중에서도, 특히 WT1 단백질의 아미노산 서열에 있어서의 1~294-잔기로 이루어지는 부분 서열의 단백질(이하 이것을「HWT3」라고 함)이 더욱 적합하다. 상기 HWT3는 이미 알려진 WT1 유전자를 이용한 유전자 공학적 방법에 의해, 예를 들면, 후술하는 실시예에 구체적인 예로서 나타낸 방법 및 이것에 준하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

WT1 유전자를 이용한 유전자 공학적 방법에 의한 WT1 항원의 제조는, 종래 공지의 일반적인 유전자 재조합 기술(recombinant gene technology)에 따를 수 있다. 더욱 상세하게는, 원하는 WT1 유전자가 숙주 세포 중에서 발현될 수 있도록 재조합 DNA를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 형질 전환시키고, 얻어진 형질 전환체를 배양함으로써, 형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외 유전자 발현 산물로서 원하는 WT1 항원을 생산할 수 있다.

상기 WT1 항원의 제조에 채용할 수 있는 각종 조작, 예를 들면 유전자 및 그 단편의 화학적 합성; 절단, 삭제, 부가 및 결합 등을 목적으로 하는 효소 처리; 단리; 정제; 선택 등과; 재조합 DNA의 숙주 세포로의 도입; 및 형질 전환 세포의 배양 등은 모두 통상적인 방법에 따라 행할 수 있다(예를 들면 「분자 유전학 실험법」, 교리쯔 출판주식회사 1993년 발행;「PCR 테크놀로지」, 다까라슈조 주식회사 1990년 발행, Science,224, 1431(1984); Biochem. Biophys. Res. Comm.,130, 692(1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA.,80, 5990(1983); Moplecular Cloning, by T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory(1982) 등 참조).

소망에 따라, WT1 항원은, 그 물리적 및/또는 화학적 성질 등을 이용한 각종 분리 조작(예를 들면 「생화학 데이터북 II」, 1175-1259페이지, 제1판 제1쇄, 1980년 6월 23일, 주식회사 도쿄화학 동인 발행 등 참조)에 따라서, 상기 발현 산물 등으로부터 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 검사법에 있어서 검체 중의 WT1 항체량의 측정은, 또한, 공지의 방법 및 수단 등을 포함하는 각종의 측정계를 이용하여 실시할 수 있다. 상기 측정계에 있어서, 공지의 측정 시약 등을 적합하게 이용할 수 있다.

예를 들면, 고상법을 채용하는 측정계에서는, 항원 또는 항체를 통상적인 방법에 따라 고상(solid phase)에 고정화한다. 상기 고상으로서는, 통상 사용되는 불용성 및 불활성의 담체를 널리 이용할 수 있다. 이것에는, 예를 들면 유리, 셀룰로오스 분말, 세파덱스(Sephadex), 세파로스(Sepharose), 폴리스티렌, 여과지, 카르복시메틸셀룰로오스, 이온 교환 수지, 덱스트란, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 폴리아미드 수지, 유리 비즈, 비단(silk), 폴리아민-메틸비닐에테르-말레인산 공중합체(polyamine-methyl vinyl ether-maleic acid copolymer), 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레인산 공중합체 등의 각종의 소재로 이루어지는 스틱(sticks), 비즈(beads), 마이크로플레이트(microplates), 시험관 등이 포함된다.

항원 또는 항체의 고정화도 특히 제한 없이 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 이 방법에는 물리적 결합을 이용한 방법과 화학적 결합을 이용한 방법 및 양자를 이용한 방법이 포함된다. 대표적으로는, 예를 들면 공유결합법으로서 디아조법(diazo method), 펩티드법[산아미드 유도체법(acid amid derivative method), 카르복실클로라이드 수지법, 카르보디이미드 수지법, 무수말레인산 유도체법, 이소시아네이트 유도체법, 불화시안활성화 다당체법(cyanogen bromide-activated polysaccaride method), 셀룰로오스카르보네이트 유도체법, 축합 시약을 사용하는 방법 등], 알킬화법, 가교 시약(crosslinking agent)에 의한 담체 결합법(support-binding method)[가교 시약으로서 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 헥사메틸렌이소시아네이트 등을 사용함], Ugi 반응에 의한 담체 결합법(carrier bingding method) 등의 화학적 결합 반응을 이용하는 방법; 이온 교환 수지와 같은 담체를 이용하는 이온 결합법; 및 유리 비즈 등의 다공성 유리를 담체로서 사용하는 물리적 흡착법 등의 방법을 예시할 수 있다.

각 측정계에 사용되는 표식제는 특히 제한되지 않고, 종래 공지된 것 중 어느 것이어도 좋다. 그 구체적인 예로서는, 면역 측정법에 있어서 관용되는 각종 방사성 동위 원소류; 알칼라인포스파타아제(ALP; alkaline phosphatase), 퍼옥시다아제(POX; peroxidase) 등의 효소류; 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC; fluorescein isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(RITC;tetramethylrhodamine isothiocyanate) 등의 형광 물질류; 및 기타, 1N-(2,2,6,6-테트라메틸-1-옥실-4-피페리딜)-5N-(아스파르테이트)-2,4-디니트로벤젠[TOPA] 등을 예시할 수 있다.

효소 표식을 위한 효소 표식 물질로서는, 상기에 예시한 것 외에도, 마이크로퍼옥시다아제, 키모트립시노겐, 프로카르복시펩티다아제, 글리세로알데하이드-3-인산탈수소효소, 아밀라아제, 포스포릴라아제, D-나아제, P-나아제 등을 사용할 수도 있다. 이들의 표식 물질에 의한 표식 방법은, 공지의 방법에 따라서 실시할 수 있다(예를 들면, 「모노클로날 항체」, 이와사키 다쓰오 외저, 코단샤 사이언티픽, 1984년; 「효소 면역 측정법」 제2판, 이시가와 에이지 외저, 이가쿠 쇼인, 1982년 등 참조).

효소 활성의 측정도 또한 사용하는 효소의 종류에 따라서 공지의 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 표식제로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우는 기질로서 ABTSJ[2,2'-아지노-비(3'-에틸벤조티아졸린 술폰산)]을 이용하고, 표식제로서 알카리포스파타아제를 사용하는 경우는 기질로서 p-니트로페닐포스페이트를 이용하여, 분광 광도계 등으로 기질의 분해를 측정함으로써 각 효소의 활성을 측정할 수 있다(「효소 면역 측정법」, 제2판, 이시가와 에이지 외저, 이가쿠 쇼인, 1982년 등 참조). 상기 효소 표식 물질 대신 방사성 동위 원소류 또는 형광 물질류를 사용하는 경우는, 이들을 이용하는 공지의 방법에 따라서 각 표식체의 측정을 실시할 수 있다.

각 측정계에서 사용되는 용매는, 각 측정계에 있어서의 반응에 나쁜 영향을주지 않는 것이면 좋다. 일반적으로 사용되는 적합한 용매의 구체적인 예로서는, 구연산 완충액, 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 초산 완충액 등의 pH 약 5-9 정도의 완충액을 들 수 있다.

면역 반응(결합) 조건에도 특히 제한은 없다. 이러한 종류의 면역 측정법에서 사용되는 통상의 조건을 채용할 수 있다. 일반적으로 반응 온도는 약 45℃ 이하, 바람직하게는 약 4-40℃ 범위의 온도가 채용되고, 반응 시간은 약 1-40 시간이다.

본 발명의 최대의 특징은, 측정된 검체의 WT1 항체량을 WT1 관련 질환의 임상 지표로서 이용하는 것에 있다.

WT1 관련 질환 환자에 있어서의 WT1 항체량은, 건강한 사람에 비해 현저히 증가하고, 또한 질환의 치료가 진행됨에 따라 저하된다. 따라서, WT1 항체량 및 그 변화, 특히 WT1 항체량의 시간 경과에 따른 변화를 임상 지표로 함으로써, WT1 관련 질환의 존재, 치료 경과 및 예후를 판정하는 것이 가능해진다. 검체 중의 WT1 항체량의 저하는, 특히 바람직한 임상 지표로서 파악할 수 있다.

본 발명자는, 상기 WT1 항체 중에서도, IgM형 WT1 항체와 IgG형 WT1 항체의 항체량과 그들 각각의 시간 경과에 따른 변화 및 양자 비율의 시간 경과에 따른 변화가 WT1 관련 질환의 존재, 치료 경과 및 예후의 판정에 보다 유효한 지표가 됨을 발견했다.

또한, 본 발명자는, WT1 관련 질환, 특히 골수 이형성 증후군에 있어서의 질환의 진전과 관련하여, IgM에서 IgG로의 WT1 항체의 클래스 스위치(class switch)가 일어남을 확인하였다. 따라서, 상기 IgG형 WT1 항체에 대한 IgM형 WT1 항체의 존재비의 시간 경과에 따른 변화를 조사하는 것에 의하면, 상기 MDS 질환의 진전, 즉 불응성 빈혈(RA, refractory anemia)로부터 과잉 모세포(blasts)를 동반하는 불응성 빈혈(RAEB, RA with excess of blasts)을 거쳐, 형질 전환을 동반하는 RAEB(RAEB-t, RAEB in transformation)로의 진전, 나아가서는 백혈병으로의 진전이 확인 가능하다.

또한, 본 발명자는, 예를 들면 백혈병 등의 WT1 관련 질환이 완전 관해되면, WT1 항체가 소실되므로, 항체의 소실이 지속되는 기간을 상기의 완전 관해 상태가 지속되는 기간으로서 간주할 수 있다는 것을 발견하였다.

WT1 관련 질환 환자에 있어서의 WT1 항체의 검출, 즉, WT1 항체 양성 환자의 확인은, 이 환자가 WT1에 대한 체액성 면역 반응(humoral immune response)을 일으키고 있음을 의미한다. 따라서, WT1 항체의 검출 자체는 WT1 관련 질환에 있어서의 해당 환자의 면역 적격성(immunological competence)을 판정 내지 진단함에 있어서 유용하다. WT1에 대한 면역 반응을 일으키고 있는 환자는, 일으키고 있지 않은 환자에 비해 면역성(immunity)이 높은만큼, 그 예후가 좋을 가능성이 있는 점에서, WT1 관련 질환 환자에 있어서의 WT1 항체의 측정은 WT1 관련 질환, 특히 각종의 암환자에 있어서의(암에 대한) 면역 적격성을 진단함에 있어서도 매우 유용하다.

본 발명의 검사 방법은, 상기 검사를 위한 검사제, 바람직하게는 검사 키트(검사제)를 이용하여 간편하게 실시될 수 있다. 본 발명은 WT1 관련 질환의 존재,치료 경과 및 예후를 판정하기 위한 검사제를 또한 제공한다.

본 발명의 검사제는 WT1 항원, 즉 측정 대상인 WT1 항체와 항원-항체 반응을 할 수 있는 항원을 유효 성분으로서 포함한다. 해당 검사제는, 해당 측정계에 이용되는 항체 검출 시약 등의 임의의 시약을 부가적으로 포함할 수 있다. 또한, 측정의 실시의 편익을 위한 적당한 시약류, 예를 들면 항체 희석액, 반응 희석액, 완충액, 세정액, 표식체 검출 시약 등을 포함할 수도 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1WT1 항체의 측정

(1) WT1 항원의 제조

플라스미드 pBluescript II(Stratagene사 제)에 WT1 유전자(Blood, Vol.91,p.2969(1998))를 삽입하여, 이 pBluescript II/WT1 (+/+)을 템플릿(template)으로 하고, 5' 말단에 EcoRI 인식 서열을 부가한 프라이머(primer)(서열 번호: 1)와 3' 말단에 NotI 인식 서열을 부가한 프라이머(서열 번호: 2)를 이용하여 PCR을 행함으로써, DNA 단편을 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편은, WT1 단백질의 1번째에서 294번째의 아미노산 서열을 코딩하는 WT1 유전자 cDNA의 일부에 해당한다.

이어서, 수득한 DNA 단편을 pGEX-5X-3(Amersham Pharmacia Biotech)에 삽입하여, 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)로 전이시켰다. 융합 단백질의 가용성을 높이기 위해, 티오레독신(Thioredoxin) 발현 플라스미드 pT-Trx를 동시에 전이시켰다. 상기 대장균을 하룻밤 배양한 후, 대장균액을 10배 희석하고 37℃에서 1.5시간 배양한 후, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도 0.1 mM로 첨가하여, 5시간 동안 더욱 배양했다. 그 후, 균체를 회수하고, 용해액(cytolytic solution)[50 mM Tris-HCl(pH7.5), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Prefabloc SC(Boehringer Mannheim), 10㎍/㎖ leupeptin, 1 mM DTT]을 첨가한 후, 초음파로 파쇄하고, 원심분리하여 상청액을 회수했다. 상청액 중의 융합 단백질을 글루타치온-세파로스 4B(Amersham Pharmacia Biotech)에 결합시킨 후, 세정하고, 용출 완충액[50 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 20 mM 환원 글루타치온, 1 mM DTT]으로 융합 단백질을 용출하여, GST(glutathione-S-transferase)-WT1 융합 단백질 HWT3을 회수했다.

같은 방법으로, 이하와 같이, HWT2(WT1 단백질의 1번째에서 181번째의 아미노산 서열을 코딩하는 WT1 cDNA 단편) 및 HWT4(WT1 단백질의 182번째에서 294번째의 아미노산 서열을 코딩하는 WT1 cDNA 단편)을 제조했다.

즉, pBluescript II/WT1 (+/+)을 템플릿으로 하여, 5' 말단에 EcoRI 인식 서열을 포함하는 프라이머 및 3' 말단에 NotI 인식 서열을 포함하는 프라이머(HWT2에 대해서는 서열 번호: 1로 표시되는 서열의 5'-프라이머 및 서열 번호: 3으로 표시되는 서열의 3'-프라이머, HWT4에 대해서는 서열 번호: 4로 표시되는 서열의 5'-프라이머 및 서열 번호: 2로 표시되는 서열의 3'-프라이머를 각각 사용)를 이용하여 PCR를 행하고, 목적하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 수득한 각 DNA 단편을 pGEX-5X-3(Amersham Pharmacia Biotech)에 삽입하고, 대장균 BL21(DE3)로 전이시켰다. 상기와 같이 하여, 이 대장균으로부터 WT1 융합 단백질 HWT2 및 HWT4을 각각 회수했다.

상기에 따라 수득한 HWT2, HWT3 및 HWT4의 각 단백질의 구조를, WT1과 비교하여 도1에 모식적으로 도시한다.

도1 중, 1-181영역은 억제 영역이고, 182-294 영역은 활성화 영역이며, 징크 핑거가 여기에 계속되고 있다.

(2) WT1 항원과 WT1 항체 간의 반응성 시험

상기 (1)에서 제조한 WT1 항원과 WT1 항체 간의 반응성을 다음과 같이 시험했다.

즉, GST 융합 단백질을 250㎍/㎖의 농도로 PBS(phosphate buffered saline)에 용해하고, 25㎍/㎠의 농도로 니트로셀룰로오스막(Optitran, Schleicher & Schuell)에 흡착시켰다. 이 니트로셀룰로오스막을 PBS로 세정하고, 2% 소혈청 알부민(BSA; bovine serum albumin) 용액에 2시간 담근 후, 도트-블롯(dot-blot) 장치(Schleicher & Schuell)에 장착했다. GST 융합 단백질이 흡착된 니트로셀룰로오스막 상에, WT1 항체 용액을 20㎕ 놓고, 1시간 반응시켜, PBS로 세정한 후, HRP(horseradish peroxidase)-결합 IgG 항체와 1시간 동안 더욱 반응시켰다. 세정 후, 이 막을 기질 용액(Renaissance(등록 상표), NEN Life Science Products)에 담그어 반응시키고, 건조한 후, 상기 막을 감광 필름(Hyperfilm MP, Amersham Life Science)에 포개어 필름을 감광한다. 필름 상의 밴드의 농도를 컴퓨터화 가능한 스캐닝 분석 시스템(Molecular Dynamics)을 이용하여 측정하고, 항체가를 농도계 단위(densitometric units)로서 산출했다.

사용한 WT1 항체는 하기와 같다.

·S-Cruz 180: 인간 WT1의 N-말단 180-아미노산 서열을 포함하는 GST 융합 단백질에 대한 토끼 폴리클로날 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.사 제)

·Pharmingen: 인간 WT1의 엑손 5(Exon 5)의 서열에 해당하는 합성 펩티드에 면역성을 주어 수득한, 엑손 5의 서열을 인식하는 마우스 항-인간 WT1 단백질 모노클로날 항체(Pharmingen사 제)

(3) 결과

결과를 도2에 도시한다.

도2에 도시한 결과로부터 다음의 것을 알 수 있다. 즉, HWT2는 토끼 폴리클로날 항체인 S-Cruz 180과만 반응하고, HWT4는 마우스 모노클로날 항체인 Pharmingen과만 반응하는데 반해, HWT3는 그 양자와 반응하는 것이 밝혀졌다.

검체 중의 WT1 항체를 광범위하게 검출함에 있어서, 이하, HWT3를 WT1 항체 검출용 항원으로서 사용했다.

실시예 2WT1 관련 질환의 검사 1

(1) 검체의 제조

피검 혈청을 2% BSA 및 0.05% 트윈 20를 포함하는 PBS로 2500배 희석하여 검체 시료로 했다.

(2) 항원 흡착막의 제조

HWT3 융합 단백질 용액(250㎍/㎖)을 니트로셀룰로오스막(Optitran, Schleicher & Schuell)에 25㎍/㎠의 농도로 1시간의 올려 놓고 흡착시켰다. 이 막을 PBS로 세정한 후, 블록킹 용액(blocking solution)[2% BSA 용액]에 2시간 담근 후, 세정하여 항원 흡착막으로서 사용했다.

(3) WT1 항체의 측정

상기 (2)에서 수득한 항원 흡착막을 이용하여, (1)에서 제조한 검체 시료 중에 포함된 WT1 항체(IgG 및 IgM)의 각각을 실시예1의 (2)에 따라서 측정했다.

즉, GST 융합 단백질을 흡착한 니트로셀룰로오스막을 도트-블롯 장치에 장착하고, 이 막 위에 피검 시료(희석 혈청)을 20㎕ 올려 놓고, 1시간 인큐베이션했다. PBS로 세정한 후, 1% BSA/PBS 중에서, IgM 항체인 경우에는 HRP-결합 염소 항-인간 IgM 항체(ICN Pharmaceuticals Inc.)와 막을, 1시간 동안 더 반응시켰다. IgG 항체인 경우에는 HRP-결합 토끼 항-인간 IgG 항체(ICN Pharmaceuticals Inc.)와 막을1시간 동안 더 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 막을 PBS로 세정하고, 기질 용액에 담그어 기질과 반응시킨 후 건조하였다. 얻어진 막을 감광 필름에 포개어 필름을 감광함으로써, 필름 상의 밴드의 농도를 측정하여, 항체가를(농도계 단위로) 구했다. 또한, 이들의 조작은 모두 실온에서 행했다.

(4) 측정 결과

(a) 건강한 성인 43명 및 WT1 관련 질환 환자 33명[골수 이형성 증후군(MDS) 환자 12명, 급성 골수성 백혈병(AML) 환자 12명, 급성 림프성 백혈병(ALL) 환자 4명 및 만성 골수성 백혈병(CML) 환자 5명]의 각 검체를 이용하여, 상기 방법에 따라서 수득한 결과를 도3∼도6에 도시한다.

각 도면 중, 종축은 항체가(농도계 단위)를, 횡축은 각 검체를 나타낸다.

도3에 도시한 결과로부터, WT1 관련 질환 환자는 건강한 사람에 현저히 높은(p<0.001) IgG형 WT1 항체가를 가지는 것을 알 수 있다.

도4에 도시한 결과로부터, AML 및 MDS 환자는 건강한 사람에 비해 현저히 높은 IgG형 WT1 항체가를 가지는 것을 알 수 있다.

도5에 도시한 결과로부터, WT1 관련 질환 환자는 건강한 사람에 비해 현저히 높은(p=0.003) IgM형 WT1 항체가를 가지는 것을 알 수 있다.

도6에 도시한 결과로부터, AML 및 MDS의 환자는 건강한 사람에 비해 현저히 높은 IgM형 WT1 항체가를 가지는 것을 알 수 있다.

이들의 점에서, IgG형 및/또는 IgM형 WT1 항체의 측정에 의해, AML, ALL, CML, MDS 등의 WT1 관련 질환의 존재 진단이 가능해짐이 밝혀졌다.

실시예 3WT1 관련 질환 환자 예후의 검사

실시예 2와 같이 하여, 6명의 급성 백혈병 환자의 치료 전과 치료 후(완전 관해시)의 IgG형 WT1 항체가를 측정했다.

수득한 결과를 도7에 도시한다.

도7에 있어서, 횡축은 각 환자에 대한 치료 전 및 완전 관해되었을 때를 나타내고, 종축은 각 검체의 WT1 항체가를 나타낸다. 또한, 도면 중 각 라인 (1)∼(6)은 각각 WT1 관련 질환 환자를 나타내고, 도면 중 실선은 말초 혈관 줄기 세포 이식(peripheral blood stem cell transplantation)에 의해서 완전 관해된 환자 4명을 의미하고, 점선은 화학 요법에 의해서 완전 관해된 환자 2명을 의미한다.

도7로부터 다음의 것을 알 수 있다. 즉, 완전 관해에 이르기까지 충분하게 효과적인 치료를 계속하면, 본 발명의 방법에 의해 치료 전에 검출된 IgG형 WT1 항체가는 검출 감도 이하로 저하된다.

이상의 점에서, IgG형 WT1 항체가를 추적함으로써 치료의 유효성을 확인 및 진단할 수 있고, 이를 바꾸어 말하면, 상기 항체가는 최저 잔류 백혈병량을 반영하는 것임이 밝혀졌다.

실시예 4WT1 관련 질환의 검사 2

(1) 검체의 제조

건강한 성인 43명 및 WT1 관련 질환 환자 46명[골수 이형성 증후군(MDS) 환자 16명, 급성 골수성 백혈병(AML) 환자 16명, 급성 림프성 백혈병(ALL) 환자 7명및 만성 골수성 백혈병(CML) 환자 7명]으로부터 혈청을 모았다. MDS 환자 집단은, 불응성 빈혈(RA) 환자 6명, 과잉 모세포를 동반하는 불응성 빈혈(RAEB) 환자 4명 및 형질 전환을 동반하는 RAEB(RAEB-t) 환자 6명으로 나뉜다.

피검 혈청은, 사용할 때까지 -20℃로 보존했다.

(2) WT1 항체의 측정을 위한 WT1 항원의 조제

WT1 부분 단백질(1-294(HWT3))에 상당하는 DNA 서열을 실시예1의 (1)과 같이 PCR법에 의해 증폭시켜, 이것을 C 말단에 히스티딘 태크(His-Tag) 서열을 가지는 플라스미드 벡터 pET-21b(+)[Novagen Inc., Madison, WI]에 클론화했다. 수득한 플라스미드를 대장균 XL1-Blue로 전이시키고, 상기 형질 전환체를 제한 효소 매핑(restriction enzyme mapping) 및 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)에 의해 검사했다. 이어서, 플라스미드 DNA를 대장균 BL21(DE3)[Stratagene, La Jolla, CA]로 전이시켜 재조합체를 제조하였다.

재조합 대장균 BL21(DE3)을 37℃에서 A600=0.6까지 배양하고, 0.1μM IPTG의 존재하에 4시간 인큐베이션하여, WT1 부분 단백질을 유도했다. 대장균을 6,000g으로 10분간 원심 분리하여 회수하고, 완충액 A(100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH8.0) 4 ㎖에(배양액 200㎖ 당) 재현탁시켜, -80℃에서 보존했다. 빙상(氷上) 융해 후, 대장균을 초음파 파쇄(3회, 2분)하고, 6,000g으로 10분간 원심분리했다. 봉입체(inclusion body)를 포함하는 펠릿(pellet)을 완충액 B(100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 6 M 요소, 15 mM 이미다졸, 20 mM β-ME) 중에재현탁하고, 빙상에서 약한 교반 하에 1시간 인큐베이션하여 단백질을 변성시켰다.

수득한 용액을 니켈 니트로 트리아세틱 아가로스(nickel nitro triacetic agarose)[Qiagen, Hilden, Germany]를 포함하는 컬럼에 로드하여, 단백질을 결합시켰다. 완충액 C(1% 트윈을 포함하지만, β-ME를 포함하지 않는 상기 완충액 B)로 세정한 후, 완충액 D(150 mM 이미다졸을 포함하지만, β-ME를 포함하지 않는 상기 완충액 B, pH8.0) 4 ml로 WT1 부분 단백질을 용출시켰다. 재조합 단백질을 리홀딩시키기 위해서, 용출액을 카세트(cassette)[Slide-a-Lyzer cassette, Pierce Chemical Company, IL] 중에 넣고, 하룻밤동안 4℃에서 과잉의 20 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 8.0) 완충액으로 투석시켰다.

이어서 재조합 단백질을 센트리콘-30(Centricon-30)[Millipore Corp., Bedford, MA]을 이용하여 농축시키고, 단백질 농도를 단백질 분석 키트(Bio-Rad Labs., Hercules, CA)를 이용하여 브레드포드(bradford)법에 의해 측정했다. 수득한 단백질의 순도 및 특이성을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 웨스턴 블롯 분석으로 확인하고, 상기 단백질을 30% (v/v) 글리세롤 용액화하여, 사용시까지 -80℃로 저장했다.

(3) WT1 항체의 측정

상기에서 수득한 WT1 부분 단백질(HWT3)을 니트로셀룰로오스막(Optitran, Schleicher & Schuell)에 2.5㎍/㎠의 농도로 결합시켰다(실온에서 1시간 인큐베이션). 상기 막을 PBS로 세정하고, 1% BSA 함유 PBS 중에서 2시간 블록킹시킨 후, 사양서에 따라 도트-블롯 장치(Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)에 장착했다.

측정은, 실시예 2에 따라서 행했다. 즉, 상기 (1)에서 조제한 피검 혈청 20㎕(1% BSA 및 0.1% 트윈 20 함유 PBS를 사용하여, IgM의 경우에는 혈청을 1/500배로 희석하고, IgG의 경우에는 혈청을 1/2500배로 희석함)을 각각의 웰에 넣고, 실온에서 1시간 인큐베이션했다. PBS로 세정한 후 1% BSA/PBS 중에서, HRP-결합 염소 항-인간 IgM 항체 또는 HRP-결합 토끼 항-인간 IgG 항체와 막을 실온에서 1시간 동안 더욱 반응시켰다.

PBS로 충분히 세정한 후, 같은 방법으로 항체가를 구했다. 한편, 결과는 적어도 2번의 시험의 평균값으로 구했다.

(4) 결과

(a) 상기 방법에 따라서 수득한 결과(각 검체 중의 IgM형 또는 IgG형 WT1 항체의 측정 결과)를, 표1과 도8(IgM형 WT1 항체의 측정 결과) 및 도9(IgG형 WT1 항체의 측정 결과)에 나타낸다.

각 도면 중, 종축은 항체가(농도계 단위)를, 횡축은 각 검체를 나타낸다. 단, 각 도면 중 ●은 IgM형 또는 IgG형 WT1 항체를 단독으로 함유한 검체를 나타내고, ○은 IgM형 WT1 항체와 IgG형 항-WT1 항체의 양자를 함유하는 검체를 나타낸다. 또한, WT1 항체에 사용되는 컷오프(cut-off)값은, IgM형 항체의 경우에는 항체가 600, IgG형 항체의 경우에는 항체가 500으로 했다(Clin. Chem.,39, 561 (1993)).

괄호 내 수치는 백분율(%)을 나타낸다.

^*를 붙인 수치에는 IgM+IgG 항-WT1 항체를 가지는 경우의 개수가 포함된다.

표1과 도8 및 도9에 나타낸 결과로부터 다음의 것을 알 수 있다.

즉, WT1 관련 질환 환자 46명 중, 24명(52.2%)에게서 IgM형 WT1 항체가 검출되었다. 한편, 건강한 사람에서는 43명 중, 7명(16.2%)에게서 검출되었다.

IgM형 WT1 항체 검출율(p=0.0001)과 IgM형 WT1 항체가(p<0.0001)는 모두, 건강한 사람에 비해 WT1 관련 질환 환자에 있어서 현저하게 높았다.

WT1 관련 질환의 4개의 타입에 있어서 IgM형 WT1 항체가를 각각 건강한 사람과 비교한 결과, ALL을 제외한 WT1 관련 질환 환자의 모두에 있어서 상기 항체가는 건강한 사람에 비해 현저하게 높은 것을 알았다.

IgG형 WT1 항체는, WT1 관련 질환 환자 46명 중 23명(50.0%)에게서 검출되었지만, 건강한 사람에게서는 43명 중 불과 2명(4.7%) 밖에 검출되지 않았다.

IgG형 WT1 항체 검출율(p=0.0001)과 IgG형 WT1 항체가(p<0.0001)는 모두 건강한 사람에 비해 WT1 관련 질환 환자에 있어서 현저하게 높았다. 또한, WT1 관련 질환 환자에 있어서의 IgG형 WT1 항체가를 각각 건강한 사람의 그것과 대비한 결과, ALL을 제외한 3개의 타입, 즉 AML, CML 및 MDS에서 상기 항체가는 건강한 사람에 비해 현저하게 높은 것을 알았다.

IgM형과 IgG형 WT1 항체의 양자의 생산은, WT1 관련 질환 환자와 건강한 사람의 사이에서 현저한 대조를 나타내고 있다. WT1 관련 질환 환자에서는 46명 중 10명(21.7%)이 IgM형 및 IgG형의 WT1 항체 둘 다를 생산하고 있었음에 반해, 건강한 사람 43명 중에서는 같은 예를 볼 수 없었다. 주목해야 할 것은, IgG형 WT1 항체의 가장 높은 항체가를 나타내는 3명의 환자(2명의 AML 및 1명의 MDS)는 동시에 IgM형 WT1 항체도 생산하였고, 또한, AML 환자 16명 중 6명(37.5%)과 MDS 환자 16명 중 4명(25.0%)은 IgM형 및 IgG형 WT1 항체의 양자를 생산하였음에 반해, ALL 환자와 CML 환자 중에는 누구도 양자의 항체를 동시에 생산하지 않았다는 것이다.

또한, WT1 항체가와 각각의 WT1 발현 레벨(RT-PCR) 또는 환자 연령 사이 및 WT1 항체의 존재와 각각의 환자 성별, 환자 병상 및 생사 사이에서는 어떤 연관도 발견되지 않았다.

(b) 백혈병 환자 4명에 대해, 진단시 및 계속되는 완전 관해(continuing complete remission, CCR)시의 양자에 있어서 WT1 항체가를 측정했다.

그 결과를 표2에 나타낸다.

환자 상태^≠는, CCR시에 WT1 항체가를 측정했을 때의 환자 상태를 나타낸다. 괄호 내 수치⁺⁺는 정상 범위(㎎/㎗)를 나타낸다.

표2에 나타낸 결과로부터, 이들 모든 환자에서는 진단시에 검출된 비교적 높은 WT1 항체가가 CCR시에는 검출되지 않았다. 이들 환자는, 3.1-5.5년에 걸쳐 CCR을 유지하고 있고, 혈청 IgM, IgG 및 IgA는 정상 레벨에 있으며, 시험시에는 어떠한 면역 억제제도 투여되지 않았다. 이러한 발견은, 이들 환자가 강력한 화학 요법 또는 동종 골수 이식에 의한 면역 억제 상태에서 완전히 회복되고 있음을 나타낸다. 따라서, CCR시에 있어서의 WT1 항체의 소실은 백혈병성 종양에 대한 부담의 소실 또는 경감 및 잇따르는 WT1 항원에 의한 면역 자극의 소실의 결과로 생각된다.

(c) WT1 항체의 클래스 스위치

MDS 환자 16명(6명의 RA, 4명의 RAEB 및 6명의 RAEB-t)에 관해서, IgM형 및 IgG형 WT1 항체를 측정했다. 결과를 도10에 도시한다.

도10에 도시한 결과로부터 다음의 것을 알 수 있다. 즉, RA 환자 6명 중 5명에 있어서 IgM형 항-WT1 항체가 검출되었고, 상기 5명 중 3명은 비교적 높은 항체가를 갖고 있었다. 이에 반해, IgG형 WT1 항체는 6명 중 4명에서 검출되지 않았고, 검출된 그 외 2명의 항체가도 낮았다.

RAEB 환자에 있어서는, 4명 중 2명에게서 IgM형 항체가 검출되었고, 3명에게서 IgG형 항체가 검출되었다. IgM형 WT1 항체가는 상기 RA 환자의 그것보다 낮았고, IgG형 WT1 항체가는 높았다.

RAEB-t 환자의 경우는 RA 환자의 경우와는 명확히 달랐다. 6명 중 2명은 낮은 역가의 IgM형 WT1 항체를 갖고 있고, 한편 6명 중 5명은 높은 역가의 IgG형 WT1 항체를 생산하였다.

이것들로부터, MDS의 병 상태의 RA에서 RAEB를 거쳐 RAEB-t에 이르는 진전과 관련하여, IgM에서 IgG로의 WT1 항체의 면역글로불린의 클래스 스위치가 일어나는 것이 강하게 시사된다.

실시예 5WT1 항체 검출계의 특이성 확인 시험

(5-1) IgG형 WT1 항체 양성 검체 혈청, IgG형 WT1 항체 음성 검체 혈청 및WT1 폴리클로날 항체 용액(S-Cruz180)의 각각에, 실험 실시 단백질(HWT3, 알부민(HSA) 또는 인간 트랜스페린)의 소정량을 첨가하여, 실시예4에 기재된 방법에 따라서, WT1 항체의 측정(Inhibition Assay)을 행했다.

결과를 도11에 도시한다.

도11에 있어서 종축은 억제 %(% inhibition)를, 횡축은 실험 실시 단백질의 첨가량(ng/웰)을 나타내고, 그래프 중 (1)은 WT1 항체 양성 검체 + HWT3을, (2)는 WT1 항체 양성 검체 + HSA를, (3)은 WT1 항체 양성 검체 + 트렌스페린을, (4)는 WT1 항체 음성 검체 + HWT3을, (5)는 WT1 항체 음성 검체 + HSA를, (6)은 WT1 항체 음성 검체 + 트렌스페린을, (7)은 WT1 폴리클로날 항체 용액 + HWT3을, (8)은 WT1 폴리클로날 항체 용액 + HSA를, (9)는 WT1 폴리클로날 항체 용액 + 트렌스페린을 각각 나타낸다.

도11에 도시한 결과로부터, WT1 항체 양성 검체 및 WT1 폴리클로날 항체 용액에 검출계 항원인 HWT3 단백질을 첨가하면 WT1 항체의 검출이 HWT3 단백질의 첨가량에 의존하여 다양하게 억제되었다. 또한, 이 HWT3 첨가량 의존적 억제는, IgM형 WT1 항체 양성 검체를 사용한 경우에도 동일하게 확인할 수 있었다. 한편, HSA 및 트렌스페린의 첨가에서는 이러한 억제는 유발되지 않았고, 또한 WT1 항체 음성 검체에서는 HWT3의 첨가에 의한 영향을 받지 않았다.

이러한 점으로부터, 본 WT1 항체 검출계는 WT1에 대한 항체를 특이적으로 검출하는 것임이 확인되었다.

(5-2) K562(적백혈병 세포주, erythroleukemia cell line) 세포핵 라이세이트(lysate)를 10% SDS-PAGE에 넣고, 웨스턴 블롯 분석용 WT1 단백질(천연 WT1 단백질)을 제조했다. 실시예4에서 측정한 IgG형 WT1 항체 양성 검체 및 상기 음성 검체를 이용하여, WT1 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 행했다. 검체 혈청을 50배 희석하고, 제 2항체로서 ALP 표식 항-(토끼 또는 인간)IgG 항체를 사용했다. 또한, 양성(陽性) 대조로서 WT1 폴리클로날 항체 용액(S-Cruz180)을 사용했다.

결과를 도12에 도시한다.

도12에서, WT1의 위치는 사이즈 마커와 함께 왼쪽란에 도시한다.

레인(1)은 양성 대조(S-Cruz180)를 사용한 결과를, 레인(2)는 실시예4에서 1336의 항체가를 가지는 것으로 측정된 IgG형 WT1 항체 양성(ALL) 검체를 사용한 결과를, 레인(3)은 마찬가지로 754의 항체가를 가지는 것으로 측정된 IgG형 WT1 항체 양성(AML) 검체를 사용한 결과를, 레인(4)는 실시예4에서 컷오프값 이하였던 IgG형 WT1 항체 음성(RAEB-t) 검체를 사용한 결과를, 그리고 레인(5) 및 (6)은 마찬가지로 IgG형 WT1 항체 음성의 건강한 사람의 검체를 사용한 결과를 각각 나타낸다.

도12에 도시한 결과로부터, 천연의 WT1 단백질은 본 발명의 검출계에서 WT1 항체 양성으로 확인된 혈청으로 검출할 수 있음(WT1 항체 음성 혈청으로는 검출할 수 없음)을 알 수 있고, 본 발명의 검출계에 의해 천연의 WT1 단백질을 인식하는 원하는 WT1 항체가 검출되는 것이 확인되었다.

본 발명에 의하면, WT1 관련 질환의 존재 내지 치료 경과 및 예후를 판정하기 위한 새로운 검사 방법이 제공된다. 본 발명의 검사 방법에 의하면, WT1 관련 질환의 검출 및 진단이 가능하고, 또한 MDS에서 백혈병으로의 진전 뿐만 아니라 백혈병의 완전 관해도 판정할 수 있다.

Claims

WT1 관련 질환의 검사 방법에 있어서, 검체 중의 WT1에 대한 항체량을 측정하고, 상기 측정값을 해당 검사의 임상 지표로서 사용하는 것을 특징으로 하는 WT1 관련 질환의 검사 방법.
제1항에 있어서,

WT1 관련 질환의 존재의 유무를 판정하는 것인

검사 방법.
제1항에 있어서,

WT1 관련 질환의 진전, 치료 경과 및 예후를 판정하는 것인

검사 방법.
제3항에 있어서,

골수 이형성 증후군으로부터 백혈병으로의 진전을 판정하는 것인

검사 방법.
제3항에 있어서,

백혈병의 완전 관해를 판정하는 것인

검사 방법.
제1항에 있어서,

WT1에 대한 항체량의 측정을 WT1 항원을 사용한 면역 반응에 의하여 행하는

검사 방법.
제2항에 있어서,

WT1 항원이, 억제 영역 및 활성화 영역은 포함하고 징크 핑거는 흠결한 WT1 단백질인

검사 방법.
제1항에 있어서,

WT1에 대한 항체가 IgG 항체 또는 IgM 항체인

검사 방법.
제3항에 있어서,

WT1에 대한 항체량의 시간 경과에 따른 변화를 임상 지표로 하는

검사 방법.
제3항에 있어서,

WT1에 대한 IgG 항체와 IgM 항체와의 양비를 임상 지표로 하는

검사 방법.