ES2327313T3 - Pentamidina para el tratamiento del cancer. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica adecuada para inhibir la proliferación de células cancerígenas un crecimiento de tumores que comprende pentamidina y un agente que induce roturas en cadenas de ADN seleccionado entre el grupo que consiste en cisplatino, mitomicina C, adriamicina y etopósido.
Description
Pentamidina para el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere a agentes de
quimioterapia para el tratamiento del cáncer.
Las células cancerígenas proliferan más
rápidamente que las células normales. La velocidad de mitosis y
replicación del ADN es, por lo tanto, significativamente mayor en
células cancerígenas. Los agentes que inhiben la replicación del
ADN y la recombinación afectan a las células cancerígenas más que
las células normales.
Muchos agentes de quimioterapia para el
tratamiento del cáncer inhiben la replicación del ADN mediante la
inducción de roturas en el ADN. Algunos fármacos, tales como la
mitomicina, inducen roturas en el ADN en parte mediante su unión al
propio ADN. Otros agentes anticancerígenos interfieren con las
enzimas de topoisomerasa, que modifican la estructura del ADN. Al
hacer esto, induce roturas de cadenas. Normalmente, las roturas son
transientes, pero en presencia de un inhibidor de enzima de
topoisomerasa, tal como etopósido, las roturas son vividas más
tiempo y exponen el ADN a un daño permanente.
Los organismos vivos reparan el ADN mediante una
variedad de mecanismos que incluyen un sistema de reparación de
excisiones. Las enzimas que median en la reparación de la excisión
cortan el ADN dañado. Entonces reemplazan las secuencias de ADN
dañado con las secuencias correctas. Este sistema de reparación
disminuye la eficiencia de las terapias contra el cáncer que
dependen de la quimioterapia que induce las roturas del ADN. La
pérdida en la eficiencia necesita el uso de altas concentraciones de
quimioterapia que rompen el ADN para obtener una inhibición
satisfactoria de la proliferación del cáncer. Estas quimioterapias
son muy tóxicas y tienen efectos secundarios dañinos. La necesidad
de usar altas concentraciones es un inconveniente significativo.
Se ha sugerido que la
endo-exonucleasa puede funcionar en la reparación
del ADN y la recombinación. La patente US 5.324.830 de Resnick
et. al. describe el aislamiento de un segmento de ADN que
codifica una endo-exonucleasa, RhoNuc de S.
cerevisiae. La patente US 5.489.524 describe la caracterización
de un gen para endo-exonucleasa de mamífero y el
aislamiento de endo-exonucleasa de primate. Sin
embargo, no se ha sugerido previamente que la inhibición de la
actividad de la endo-exonucleasa sea efectiva para
inhibir el proceso de reparación del ADN o la proliferación de
células cancerígenas.
En Pérez et al., la unión de
Pt-pentamidina (pentamidina platino) ha mostrado que
causa una fuerte estabilización de la doble hélice de ADN
nucleosomal hasta la desnaturalización por calor. Además, en
complejos de nucleosoma: Pt-pentamidina el ADN
nucleosomal desnaturalizado puede reasociarse a 71ºC.
En la patente US 5.204.352, se proporcionaron
compuestos que presentaban un alto nivel de actividad
antiparasítica, especialmente contra parásitos del género
Trypanosoma. Los compuestos comprendían sales
heteroaromáticas cuaternarias aril-sustituidas. Se
sugirió que los compuestos de esta patente serían competitivos con
pentamidina en el tratamiento de la tripanosomiasis. La patente US
5.084.480 describe sales de pentamidina, formulaciones que
contienen estas sales y el uso de estas sales para el tratamiento de
profilaxis o Pneumocystis carinii. Se describen el gluconato
de pentamidina y el lactonato como que tienen una alta solubilidad
en agua, mientras proporcionan alternativas potencialmente menos
tóxicas al isetionato de pentamidina.
En Tuan et al., la pentamidina se utilizó
en pacientes de trasplante de médula ósea que sufren neumonitis
Pneumocystis carinii. En Waalkes et al., se estudiaron
los pacientes con enfermedades malignas complicadas mediante
neumonía intersticial difusa debido a la Pneumocystis carinii
probada o sospechosa a los que se les dio pentamidina durante la
terapia. Después de la administración intramuscular de pentamidina,
los niveles de plasma eran bajos y la excreción urinaria prolongada.
Después de una única inyección intraperitoneal en ratones, los
niveles de distribución del tejido y el diseño de excreción para la
pentamidina se determinaron en varios intervalos de tiempo. Hubo
almacenamien-
to del fármaco en tejidos y la excreción se retrasó. La concentración más alta de pentamidina se encontró en el riñón.
to del fármaco en tejidos y la excreción se retrasó. La concentración más alta de pentamidina se encontró en el riñón.
Existe una necesidad de compuestos que inhiban
la proliferación de células cancerígenas que sean menos tóxicas que
la quimioterapia convencional. Existe la necesidad tradicional de
compuestos que inhiban la reparación del ADN para inhibir la
proliferación de las células cancerígenas. También existe la
necesidad de compuestos que se puedan utilizar en combinación con
la quimioterapia convencional para mejorar la eficiencia del
tratamiento contra el cáncer. También existe la necesidad de que
estos compuestos utilizan en combinación con quimioterapia
convencional, de manera que la combinación permita el uso de dosis
menores de quimioterapia a los pacientes de cáncer sin pérdida de
la eficiencia terapéutica.
La presente invención se refiere al
descubrimiento de que las células cancerígenas tienen
concentraciones mayores de endo-exonucleasa que las
células normales. La proliferación de células cancerígenas y el
crecimiento de tumores se pueden inhibir mediante la inhibición de
la actividad de la endo-exonucleasa. El cáncer
también se puede diagnosticar basado en las concentraciones
elevadas de endo-exonucleasa en las células
cancerígenas.
La proliferación de las células cancerígenas de
crecimiento de tumores, por lo tanto, se puede inhibir
administrando a pacientes compuestos que inhiban la actividad de la
endo-exonucleasa.
Los compuestos que inhiben la actividad de la
endo-exonucleasa se pueden proporcionar en
combinación con quimioterapia convencional que provoca rupturas en
el ADN, para inhibir la proliferación de células cancerígenas del
crecimiento de tumores. La proliferación de las células cancerígenas
y el crecimiento de tumores, por lo tanto, se pueden inhibir
mediante la administración a un paciente de un compuesto que inhiba
la actividad de la endo-exonucleasa en combinación
con fármacos de quimioterapia convencional que provocan roturas en
el ADN. Los compuestos que inhiben la actividad de la
endo-exonucleasa, por lo tanto, se pueden utilizar
en combinación con agentes que provocan roturas en el ADN para
inhibir la proliferación de células cancerígenas y el crecimiento
de tumores.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una composición farmacéutica para inhibir la
proliferación de células cancerígenas y el crecimiento de tumores
que comprende pentamidina y un compuesto que induce roturas en las
cadenas de ADN, seleccionado entre el grupo que consiste en
cisplatino, mitomicina C, adriamicina y etopósido.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una utilización de la pentamidina en la preparación de
un medicamento para inhibir la proliferación de células cancerígenas
o para inhibir el crecimiento de tumores en un paciente.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona la utilización de pentamidina en combinación con un
compuesto que induce roturas en las cadenas de ADN seleccionado
entre el grupo que consiste en cisplatino, mitomicina C,
adriamicina, etopósido e irradiación de ionización en la preparación
de un medicamento para inhibir la proliferación de células
cancerígenas y para inhibir el crecimiento de tumores en un
paciente.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona la utilización de un anticuerpo en
endo-exonucleasa para la preparación de un agente
para el diagnóstico de cáncer en un paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es un gráfico de barras que muestra
el nivel de endo-exonucleasa en varias líneas
celulares;
La figura 2 es un gráfico que muestra la
supervivencia de varias células en presencia de diferentes
cantidades de pentamidina utilizando un ensayo clonogénico;
La figura 3 es un gráfico de barras que muestra
el efecto de combinación de diferentes fármacos (mitomicina C +
pentamidina, etopósido + pentamidina) sobre la muerte celular;
La figura 4 es un gráfico de barras que muestra
el efecto de combinación de cisplatino y pentamidina sobre la
muerte celular;
La figura 5 es un gráfico que muestra el efecto
de un implante de polímero de pentamidina sobre el crecimiento de
tumores en el modelo de ratón de tumor RIF;
La figura 6 es un gráfico que muestra el efecto
de combinación del implante de polímero de pentamidina y la
irradiación sobre el crecimiento de tumores en un modelo de ratón de
tumor RIF;
La figura 7 es un gráfico que muestra el efecto
de la pentamidina sobre el crecimiento de un tumor primario en el
modelo de carcinoma de pulmón de Lewis en ratones;
La figura 8 es un gráfico que muestra la
toxicidad de la pentamidina administrada mediante una vía
intraperitoneal;
La figura 9 es un gráfico que muestra el efecto
contra el cáncer de la pentamidina en vivo;
La figura 10 es un gráfico que muestra el efecto
contra el cáncer que la pentamidina y el cisplatino tanto de manera
individual como en combinación en vivo;
La figura 11 es un gráfico que muestra el efecto
contra el cáncer de la pentamidina y el cisplatino tanto
individualmente como en combinación en vivo;
La figura 12 es un gráfico que muestra el efecto
contra el cáncer de la pentamidina y el cisplatino tanto
individualmente como en combinación en vivo;
La figura 13 es un gráfico que muestra el efecto
de la pentamidina en el crecimiento de tumores primarios de
carcinoma de pulmón de Lewis;
La figura 14a es un gráfico que muestra el
efecto contra cáncer de la pentamidina y el cisplatino tanto
individualmente como en combinación en vivo;
La figura 14b es un gráfica de barras que
muestra el efecto contra el cáncer de la pentamidina y el cisplatino
tanto individualmente como en combinación en vivo;
La figura 15 es un gráfico de barras que muestra
el efecto contra el cáncer de la pentamidina y el cisplatino tanto
individualmente como en combinación en vivo;
La figura 16 un gráfico de barras que muestra el
efecto de la pentamidina sobre la incidencia de la metástasis de
pulmón inducida por el carcinoma de pulmón de Lewis;
La figura 17 es un gráfico de barras que muestra
el efecto contra el cáncer de la pentamidina y el cisplatino tanto
individualmente como en combinación en vivo;
La figura 18 es un gráfico que muestra el efecto
contra el cáncer de la pentamidina y la adriamicina en
vivo;
La figura 19 es un gráfico de barras que muestra
el efecto de la pentamidina y la adriamicina sobre el peso corporal
para el tumor primario en vivo; y
La figura 20 es un gráfico de barras que muestra
el efecto contra la metástasis de la pentamidina y la adriamicina
en vivo.
Para los propósitos de las figuras, OP se
refiere a la pentamidina, Adr se refiere a la adriamicina y CDDP se
refiere al cisplatino.
La invención se refiere al sorprendente
descubrimiento de que la endo-exonucleasa juega un
papel importante en la proliferación celular. Se requiere para
crecimiento normal y para la reparación de tejido. La
endo-exonucleasa juega un papel especial en células
que proliferan rápidamente, tales como las células cancerígenas.
Esta enzima se encuentra en altas concentraciones en las células
cancerígenas, donde realmente ayuda a mantener el crecimiento del
tumor. La endo-exonucleasa funciona reparando las
roturas en las moléculas de ADN, que llevan todos los genes para
hacer funcionar las células. Las roturas del ADN a menudo se
producen durante el proceso de división celular y se deben reparar
si la proliferación celular continúa.
Se ha encontrado que los compuestos químicos que
inhiben la actividad de la endo-exonucleasa inhiben
la proliferación de células cancerígenas y el crecimiento de
tumores. Los compuestos que inhiben la actividad de la
endo-exonucleasa también se pueden utilizar en
combinación con agentes que provocan roturas del ADN,
preferiblemente roturas de cadena doble en el ADN. La combinación de
estos tipos de compuestos u otros agentes proporciona una
herramienta valiosa para la terapia contra cáncer.
La presente invención se refiere al resultado
inesperado de que la pentamidina inhibe la actividad de la
endo-exonucleasa. Se conocía previamente que la
pentamidina tenía una actividad antifúngica. Se ha encontrado que
la pentamidina inhibe la actividad de la
endo-exonucleasa de manera suficiente para detener
el crecimiento de las líneas celulares cancerígenas in
vitro, la pentamidina también ralentiza el crecimiento de
tumores en animales con cánceres muy agresivos. El tratamiento
contra el cáncer con pentamidina es especialmente ventajoso porque
la pentamidina tiene una baja toxicidad respecto a los agentes de
quimioterapia estándar. Los efectos secundarios de la pentamidina
son a menudo diferentes a los de los agentes de quimioterapia
estándar, de manera que cuando la pentamidina y esos agentes se
utilizan juntos, el perfil de los efectos secundarios es
potencialmente menos peligroso.
La invención también se refiere al efecto de
combinación de utilizar compuestos conocidos y otros agentes que
provocan roturas de cadena simple o cadena doble del ADN con
pentamidina para inhibir la proliferación de células cancerígenas y
el crecimiento de tumores. Se ha encontrado que los compuestos y
otros agentes que provocan roturas de cadena doble del ADN trabajan
especialmente bien en combinación con la pentamidina. Esto inhibe
la proliferación de células y el crecimiento de tumores. Los agentes
pueden provocar roturas de cadena doble directamente pueden
provocar roturas de cadena simple que progresan a roturas de cadena
doble. Esto es común en los sistemas biológicos.
La invención también se refiere a la utilización
de pentamidina para inhibir la acción de la
endo-exonucleasa para inhibir la proliferación de
células cancerígenas y el crecimiento de tumores. Uno también podría
utilizar este compuesto para inhibir el crecimiento de tumores en
solitario en combinación con fármacos conocidos que provocan
roturas del ADN. Los agentes que inducen la roturas del ADN que
están dentro del alcance de la presente invención incluyen
cisplatino, mitomicina C, adriamicina, etopósido e irradiación de
ionización.
\newpage
Las composiciones o mezclas de estos compuestos
y otros agentes se pueden administrar a pacientes que incluyen
humanos y animales. Las composiciones incluyen todas las
formulaciones farmacéuticas de un compuesto y un compuesto en su
estado puro. Las combinaciones incluyen dos o más composiciones.
Esto incluye dos o más formulaciones diferentes de un compuesto tal
como una formulación de tableta y una formulación líquida. Las
mezclas de dos o más compuestos en la misma formulación también
están incluidas en el alcance de la invención. Las composiciones
también incluyen excipientes tales como micelas, vesículas y
liposomas, que mejoran el rendimiento terapéutico del compuesto y
otros agentes. La acción de las vesículas, micelas y liposomas
incluye la mejora de la solubilización de los compuestos y agentes,
mejorando su suministro a las células tumorales, e interactuando
con las células tumorales para hacer estas células más permeables a
los compuestos agentes. La mejora de la eficiencia podría mejorar
el tratamiento o permitir resultados equivalentes con una
dosificación reducida y efectos secundarios reducidos.
Las líneas celulares para adenocarcinoma de
colon humano (HT29), adenocarcinoma de mama humano (MCF7) y
carcinoma epiteloide humano (HeLa) se pidieron a partir del American
Type Culture Collection (ATCC) y tienen los números de acceso ATCC
HTB-38, HTB-22, y
CCL-2 respectivamente. La célula primaria normal,
NHDF, se obtuvo a partir del Dr. Shirley Lehnert. Estas células son
fibroblastos de piel humana normal. Estas células crecieron en
medio RPMI suplementado con 10% FCS a 37ºC en una incubadora
humidificada con 5% CO_{2}.
Ejemplo
1
El nivel de endo-exonucleasa en
las líneas celulares se determinó con el procedimiento Immunoblot
tal como se describe por parte de Chow y Resnick (1987). Las
células que crecían de manera exponencial se hirvieron en tampón de
lisis (0,125 M Tris-HCl pH 7,0, 20% glicerol, 4%
SDS, 0,5 mM EDTA). Las células lisadas se centrifugaron a
continuación a 10.000 g durante 10 minutos y 25 \mul del
supernatante se electroforisaron en un gel de
SDS-poliacrilamida 10% (SDS-PAGE)
según el procedimiento descrito por parte de Laemmli (1970). Las
proteínas que se separaron del gel SDS-PAGE se
transfirieron de manera electroforética a una membrana de
nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se hizo reaccionar a
continuación son antisuero de conejo crecido contra la
endo-exonucleasa CV-1 de mono en
tampón B (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM
NaCl) que contenía un 0,5% de polvo de leche desnatada según el
procedimiento previamente descrito de Chow y Resnick (1988). Después
de que la membrana fuera alabada tres veces en el tampón B durante
15 minutos, la proteína A (un polipéptido aislado del
staphylococcus aureus que se une a la región Fc que las
moléculas de inmunoglobulina si interactúa en el sitio de unión del
antígeno) se conjugó con peroxidasa de rábano en tampón B que
contenía un 0,5% de polvo de leche desnatada se añadió a la
membrana y se incubó durante tres horas a temperatura ambiente. La
membrana se lavó posteriormente con tampón B durante 15 minutos.
Las señales positivas se indicaron mediante el desarrollo de color
del substrato de
4-cloro-1-naftol en
la correspondiente posición de la proteína en la reacción enzimática
de la peroxidasa de rábano. Las cantidades relativas de señales
positivas se detectaron utilizando un escáner HP4c y el programa de
software Light Tool Research software.
Basado en este procedimiento, se calcularon los
niveles de endo-exonucleasa en las células normales
y en las líneas celulares HT29, MCF-7 y HeLa. Los
resultados presentados en la figura 1 muestra que el nivel de la
endo-exonucleasa es mucho mayor en células
cancerígenas que en células normales. Los resultados sugieren que
la inhibición de la enzima proporcionaría medios para atacar
preferentemente las células cancerosas. Además, los resultados
sugieren que la medición de las concentraciones de la enzima en
fluidos o tejidos corporales proporciona unos medios de detección
del cáncer y de monitorización de su progreso.
Ejemplo
2
La supervivencia celular se determinó según los
siguientes procedimientos:
Supervivencia celular - Ensayo clonogénico: Se
utilizó una medición clonogénica de la supervivencia celular para
determinar la efectividad inicial de la pentamidina según el
procedimiento descrito en Sadekova et al. (1997). En este
procedimiento, se cultivaron células de fase de manera logarítmica
(intervalo de 1000 a 3000 células/50 mm dependiendo del eficiencia
de la preparación en placas) sobre placas de cultivo celular junto
con varias concentraciones de fármacos (que varían entre 0,2 \muM
a 20 mM). Después de una semana de crecimiento, las colonias
celulares y vinieron con violeta cristal y se contaron los números
de colonias.
Supervivencia celular - Ensayo MTT: El
procedimiento MTT
(3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5
difenil tertrazolim bromuro) de determinación del crecimiento
celular/citotoxicidad ofrece una alternativa conveniente para
determinar la supervivencia celular. El MTT es una sal de
tetrazolio que se prende mediante dehidrogenasas mitocondriles de
células vivas. El desprendimiento convierte el MTT soluble en agua
amarillo en un cristal de formazán púrpura insoluble. Los cristales
se pueden solubilizar con una solución de 50%
N,N-dimetilformamida (vol/vol), 20% SDS (peso/vol)
(pH 4,7), y la absorbancia se determinó en una longitud de onda de
570 nm. Las células muertas no se desprendieron del MTT y el MTT no
es detectable en esta longitud de onda. La cantidad de MTT que se
desprende aumenta al aumentar el número de células, y disminuye como
resultado de la citotoxicidad celular (Niks y Otto 1990, Hussain
et al. 1993).
Las células se cultivaron a partir de cultivos
celulares utilizando el protocolo estándar (Tripsina/EDTA). Las
células (1000 a 5000 células dependiendo del tipo de célula en 50
\mul) se colocaron a continuación en placas y se incubaron
durante una noche a 37ºC antes de la adición de los reagentes
experimentales (es decir, el fármaco de interés), para el
experimento de combinación, ambos fármacos se añadieron. Después de
dos días de incubación a 37ºC, se añadieron a continuación 10 \mul
de una solución de 5 mg/ml de MTT a todos los pozos experimentales,
así como al pozo de control del medio. Las placas se incubaron
además durante cuatro horas. Se añadió un tampón de solubilización
de 100 \mul de MTT y las placas se incubaron durante una noche a
37ºC. Las placas se leyeron a continuación sobre el lector de placas
ELISA con una absorbancia a 570 nm y una referencia a 630 nm.
Línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis y
Cultivo Celular: El clon del carcinoma de pulmón de Lewis, M47, es
un modelo metastásico. Las células del carcinoma de pulmón de Lewis
se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con
suero bovino fetal y penicilina-estreptomicina. Para
la inducción del tumor, se lavaron las células tres veces con una
solución de tampón de fosfato. Con continuación se volvieron a
suspender en una disolución de 1x10^{6} células/0,1 ml. Solamente
se utilizaron las células donde la viabilidad era mayor del 95%
para estudios en vivo.
La cadena de razón utilizada en este estudio fue
C57BL/10. Después de una semana de aclimatación, las células se
trasplantaron en los ratones de manera subcutánea, como una
suspensión de células tumorales. Todos los animales se inocularon
en el mismo sitio.
Para medir el efecto de los fármacos sobre el
tumor primario, las soluciones de fármacos se administraron
mediante inyección intraperitoneal (ip) cada dos días. Los animales
se sometieron, sobre una base diaria, a examen general. Se
monitorizó el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo. Para
determinar el efecto de los fármacos sobre la metástasis tumoral,
los tumores se dejaron crecer hasta alcanzar un tamaño de
0,5-1,0 cm^{3}. Los ratones se separaron de manera
aleatoria en varios grupos y se proporcionaron los fármacos mediante
ip. Al final de cada experimento, los animales se sacrificaron y se
les practicó una autopsia. Los tumores, órganos o ambos se
retiraron bajo condiciones estériles. Los tumores se pesaron. Los
órganos se examinaron para cambios patológicos importantes y a
continuación se colocaron en formalina. Los pulmones se colocaron
en fijador de Bouin y las metástasis superficiales del pulmón se
contaron utilizando un estereomicroscopio.
Línea celular RIF (Fibrosarcoma inducido por
Radiación) y Cultivo Celular: El clon de fibrosarcoma inducido por
radiación, RIF-1, es un modelo de tumor sólido. Las
células de RIF-1 se mantuvieron en medio DMEM
suplementado con suero bovino fetal y
penicilina-estreptomicina. Para la inducción del
tumor, se inyectaron 2 x 10^{5} células s.c. en las espaldas de
los ratones desde la cadena C3H. Los tumores aparecieron en 10 días
y alcanzaron un volumen de 94-130 mm^{3} en tres
semanas. Se prepararon implantes de polímero de poli (ácido
carboxifenoxipropano-co-sebácico) o
poli (CPP-SA) que contenían el fármaco y se
implantaron en el tumor según el procedimiento descrito por parte
de Yapp et al. (1997). La misma persona midió los tamaños de
los tumores cada dos días hasta que alcanzó cuatro veces el volumen
inicial en el momento del implante. El volumen final fue de 400
mm^{3}.
Para el experimento de combinación, se
suministró una dosis de señal de irradiación gamma (^{60}Co,
Theratron 780) con un índice de dosificación de 1 Gy/min 24 horas
después del implante del polímero que contenía el fármaco.
Ejemplo
3
La endo-exonucleasa humana es lo
según el procedimiento descrito por parte de Liu y et al
(1995). Las células cultivadas se separaron con
tripsina-EDTA y las suspensiones celulares se
centrifugaron a 4ºC con una fuerza de
700 g durante 10 minutos. Las cuentas celulares se lavaron dos veces con salino tamponado con fosfato frío (PBS). Las células se volvieron a suspender a continuación y se sonicaron en 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, que contenía 5 mM EDTA y 1 mM PMSF (tampón A). Las suspensiones de lisis celular resultante se centrifugaron a 4ºC a 10.000 g durante 15 minutos. Los supernatantes se cargaron a continuación sobre una columna definida de anticuerpo-proteína A-Sefarosa, tal como se describió previamente por parte de Chow y Resnick (1987). Después de lavarse de manera extensiva con tampón A, (es decir, hasta que el A_{280} de los eluatos era cero), la columna se eluyó a continuación con tampón A que contenía 3,5 M MgCl_{2} para eludir la endo-exonucleasa. La endo-exonucleasa eluída se dializó de manera extensiva contra el tampón A por lo menos 2 cambios de tampón y un cambio de agua destilada. La endo-exonucleasa se concentró a continuación mediante liofilización.
700 g durante 10 minutos. Las cuentas celulares se lavaron dos veces con salino tamponado con fosfato frío (PBS). Las células se volvieron a suspender a continuación y se sonicaron en 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, que contenía 5 mM EDTA y 1 mM PMSF (tampón A). Las suspensiones de lisis celular resultante se centrifugaron a 4ºC a 10.000 g durante 15 minutos. Los supernatantes se cargaron a continuación sobre una columna definida de anticuerpo-proteína A-Sefarosa, tal como se describió previamente por parte de Chow y Resnick (1987). Después de lavarse de manera extensiva con tampón A, (es decir, hasta que el A_{280} de los eluatos era cero), la columna se eluyó a continuación con tampón A que contenía 3,5 M MgCl_{2} para eludir la endo-exonucleasa. La endo-exonucleasa eluída se dializó de manera extensiva contra el tampón A por lo menos 2 cambios de tampón y un cambio de agua destilada. La endo-exonucleasa se concentró a continuación mediante liofilización.
Las actividades de la nucleasa se determinaron
midiendo la liberación de radiactividad soluble ácida del ADN
pBR322 de cadena simple desnaturalizado con calor y marcado con
\gamma-^{32}P según el procedimiento descrito
por parte de Chow y Resnick (1983). Una única de actividad se
definió como la cantidad de deoxiribonucleasa que obtiene 1 \mug
de ADN soluble en ácido en 30 min a 37ºC. Para el ensayo de
inhibición con los fármacos, los fármacos añadieron a la
endo-exonucleasa antes del inicio de la reacción de
la nucleasa. La tabla 1 muestra los niveles de la inhibición de la
endo-exonucleasa mediante varios agentes de
quimioterapia.
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Ejemplo
4
La medición clonogénica de supervivencia celular
se utilizó para determinar la efectividad inicial de la pentamidina
según el procedimiento descrito anteriormente.
Los índices de supervivencia en presencia de
pentamidina de las células primarias, y las células MCF7 y HeLa
utilizando el ensayo clonogénico se muestran en la figura 2. Los
resultados mostrados en la figura 2 se muestran que la pentamidina
preferentemente ataca las células cancerígenas de una manera que
depende de la dosis. Las líneas celulares MCF7 y HeLa cancerosas se
compararon con las células de fibroblastos primarias humanas. Los
índices de supervivencia de las células se midieron en diferentes
dosis de pentamidina. La pentamidina empezó a matar las células
cancerígenas en concentraciones de 0,1 mM y fue letal a una
concentración de 10 mM. Bajo estas condiciones, la pentamidina no
tuvo ningún efecto sobre las células humanas primarias normales. La
dependencia de la dosis y la selectividad hacia las células
cancerígenas muestran que la pentamidina es un útil agente contra
el cáncer.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
5
Las actividades contra el cáncer de la
pentamidina y una serie de agentes contratantes conocidos se
muestran en la tabla 2.
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En la tabla 2, los tipos de células cancerígenas
son: H520 - NSCLC (carcinoma escamoso, tumor primario), H460 -
NSCLC (gran carcinoma celular, efusión pleural), H661 - NSCLC (gran
carcinoma celular, nodo linfático), MCF-7 - cáncer
de mama (Adenocarcinoma, efusión pleural), HT29 - cáncer de colon
(Adenocarcinoma, tumor primario). El periodo de tiempo en el que
las células están expuestas al compuesto se indica en términos de
días. Los datos indicados mediante el número 3 se obtuvieron del
National Cancer Institute.
LC_{50} es la concentración de un fármaco o
producto químico que marca el 50% de las células. Los resultados
muestran que la pentamidina es un agente contra el cáncer. Nosotros
también muestran que la pentamidina es más letal con las células
que el etopósido, pero menos que la mitomicina C. la efectividad de
la pentamidina aumenta si el experimento se realiza a lo largo de
cuatro días, opuesto a dos. Esto sugiere que las roturas de cadenas
que se producen de manera natural en el ADN son relativamente
infrecuentes y que una exposición prolongada a la pentamidina es
beneficiosa.
El uso clínico de estos agentes depende del
equilibrio entre la actividad contra el cáncer y los efectos
secundarios dañinos. Así, un agente relativamente no tóxico, que se
puede dar en una alta concentración puede ser más efectivo que un
agente más agresivo pero tóxico, que solamente se puede tolerar en
dosis muy pequeñas. Basado en los datos clínicos conocidos, la
pentamidina tiene una baja toxicidad.
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Las actividades contra el cáncer de la
pentamidina y la distamicina A y el berenil se muestran en la tabla
3.
Los tipos de células cancerígenas son: H520 -
NSCLC (carcinoma escamoso, tumor primario), H460 - NSCLC (gran
carcinoma celular, efusión pleural), H661 - NSCLC (gran carcinoma
celular, nodo linfático), MCF-7 - cáncer de mama
(Adenocarcinoma, efusión pleural), HT29 - cáncer de colon
(Adenocarcinoma, tumor primario).
El periodo de tiempo en días en los que las
células están expuestas al compuesto se indica en la tabla 3.
Estos resultados muestran que estos inhibidores
de endo-exonucleasa tienen actividad contra el
cáncer.
Ejemplo
6
Los datos en la tabla 4 muestran el efecto de
combinar pentamidina con mitomicina C, etopósito y cisplatino.
La comparación de los datos en las tablas 2 y 4
muestra que la utilización de pentamidina en combinación con
mitomicina reduce las concentraciones de estos fármacos necesarios
para conseguir la muerte celular. Lo mismo se aplica a la
pentamidina y al etopósido. La magnitud del efecto sugiere que la
utilización de pentamidina en combinación con mitomicina y
etopósido provoca una destrucción muy eficiente de las células
cancerígenas. Esto permite el suministro de dosis mucho menos
tóxicas que fármacos contra el cáncer, tales como la mitomicina y
el etopósido.
La figura 3 muestra que la combinación de
mitomicina y etopósido con pentamidina es de 50 a más de 1000 veces
más eficiente para matar células cancerígenas que la utilización de
mitomicina C y etopósido en solitario.
Hemos definido la eficiencia de la combinación
como sigue:
Eficiencia =
([Pentamidina]_{O}/[Pentamidina]_{C})*([P]_{O}/[P]_{C})
En esta ecuación [Pentamidina]_{o} es
la dosis LC_{50} de pentamidina cuando se utiliza en solitario
mientras que [Pentamidina]_{c} es la dosis LC_{50}
requerida en el experimento de combinación. "P" representa
Mitomicina o Etopósido y los subíndices "o" y "c" se
refieren respectivamente al experimento cuando los materiales se
utilizaron en solitario y en el experimento de combinación.
La figura 4 muestra que combinando cisplatino y
pentamidina se produce un aumento incluso más profundo en la
eficiencia para matar las células cancerígenas. La combinación de
cisplatino con pentamidina es de hasta 16.000 veces más eficiente
que la utilización de cisplatino en solitario. Este aumento
sorprendente es consistente con los mecanismos conocidos de acción
de los agentes de quimioterapia. La mitomicina C y el etopósido
consiguen la muerte celular a través de un mecanismo complejo que
implica roturas de cadena simple. Relativamente pocas de estas
roturas de cadena simple progresan a roturas de cadena doble. Por el
contrario, el cisplatino opera mediante mecanismos que finalmente
induce las roturas de cadena doble. La
endo-exonucleasa repara las roturas de cadena
doble. Estos resultados demuestran que el cultivo celular, la
inhibición de la endo-exonucleasa con pentamidina
aumenta la eficiencia de la actividad contra el cáncer de los
agentes que inducen las roturas de cadena doble mucho más que los
agentes que inducen las roturas de cadena simple.
La adición de pentamidina a un tratamiento de
quimioterapia permite reducir las concentraciones de agentes de
quimioterapia sin ninguna pérdida de eficiencia. También mejora la
eficiencia del tratamiento.
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Ejemplo
7
La figura 5 muestra los resultados de un
experimento preliminar donde ratones con tumores de fibroblasto
(RIF) bastante grandes (100 mm^{3}) (una línea celular derivada
del cáncer de piel) recibieron implantes tumorales con un polímero
biodegradable que contiene una gente contra el cáncer estándar
salino, de pentamidina o 5-fluorouracil. La
pentamidina tuvo una eficacia intermedia en la ralentización del
crecimiento del tumor entre el control salino y el
5-fluorouracil. El resultado es positivo porque los
tumores sólidos ya estaban bien establecidos y las dosis de
pentamidina nos habían optimizado.
El sistema de implantes de polímero es una
manera conveniente de administrar el fármaco de interés. La
biodegradación del polímero provoca que el fármaco se libere. Sin
embargo, la degradación es completar después de tres o cuatro días,
después de lo cual ya no está disponible más fármaco. A pesar de
estas limitaciones, la pentamidina ha mostrado que es efectiva en
el periodo cuando el fármaco estuvo disponible.
La figura 6 muestra los resultados de un
experimento similar utilizando un implante de polímero para
suministrar pentamidina. El experimento se realizó en razones con
tumores de fibroblasto (RIF) que también fueron tratados con
radiación (24 horas después del implante) poco después de que los
tumores hubieran alcanzado un tamaño de
100 mm^{3}. Los resultados en la figura 6 muestran que los efectos beneficiosos del tratamiento de radiación han finalizado el día 12 después del tratamiento. Sin embargo, los animales tratados con la combinación de radiación y pentamidina no tuvieron ningún crecimiento significativo del tumor durante un período mucho más largo. La pentamidina se suministró a través de un implante de polímero y, por lo tanto, fue consumido después de tres o cuatro días. Sin embargo, los efectos beneficiosos de su acción fueron bastante persistentes. Los ratones de prueba no mostraron señales obvias de ningún efecto secundario debido al uso de la pentamidina.
100 mm^{3}. Los resultados en la figura 6 muestran que los efectos beneficiosos del tratamiento de radiación han finalizado el día 12 después del tratamiento. Sin embargo, los animales tratados con la combinación de radiación y pentamidina no tuvieron ningún crecimiento significativo del tumor durante un período mucho más largo. La pentamidina se suministró a través de un implante de polímero y, por lo tanto, fue consumido después de tres o cuatro días. Sin embargo, los efectos beneficiosos de su acción fueron bastante persistentes. Los ratones de prueba no mostraron señales obvias de ningún efecto secundario debido al uso de la pentamidina.
La figura 7 muestra la efectividad de la
pentamidina como una gente contra el cáncer cuando se utiliza
contra el modelo del tumor primario de carcinoma de pulmón de Lewis.
La pentamidina se suministró mediante inyección diaria. Los
resultados muestran que la pentamidina era tan efectiva en la
inhibición del crecimiento del cáncer como el cisplatino, un
compuesto que actualmente se utiliza para el tratamiento de cáncer
de pulmón.
Los implantes de tumores de pulmón en el
carcinoma de pulmón de Lewis forman tumores secundarios mediante
metástasis. El efecto de la pentamidina sobre la incidencia de estas
metástasis de pulmón se estudió en un estudio separado. En los
exámenes post-mortem, se contaron las
metástasis de pulmón de los ratones. La pentamidina redujo la
metástasis de una manera que depende de la dosis mediante un factor
de tres con la dosis probada más alta. Los resultados de estos
exámenes post-mortem se indican en la tabla
5.
Ejemplo
8
Se suministró pentamidina. La solución se
realizó mediante la disolución de pentamidina en agua destilada
estéril. La solución de pentamidina fue dividida en alícuotas y se
almacenan a -20ºC bajo recepción. Inmediatamente antes del uso, el
stock de fármaco se descongeló rápidamente, se mantuvo a 4ºC y se
protegió contra la luz hasta la administración. Se proporcionaron
cisplatino y adriamicina. Estos fármacos se prepararon como se
indicó para la preparación clínica. La solución salina (0,9%) de
cloruro de sodio se almacenó a 4ºC.
Se utilizó el clon del carcinoma de pulmón de
Lewis, M47, con un alto potencial metastásico en el pulmón. Los
tumores inducidos por el M47 se han caracterizado bien en relación
con sus índices de crecimiento y respuesta a los fármacos de
quimioterapia estándar. La célula utilizada se confirmó que estaba
libre de micoplasma. Las células se mantuvieron en medio
RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%
y penicilina-estreptomicina al 1% bajo 5% CO_{2}.
A continuación las células se propagaron y los stocks de los mismos
pasos establecieron emocionaron el nitrógeno líquido. Se realizaron
estudios de oncoenzimas con el mismo stock de células y el mismo
número de pasos.
Para la inducción del tumor, las células
crecieron a una confluencia del 70% del medio completo y a
continuación se recogieron utilizando solución de
tripsina-EDTA [0,05% tripsina 0,53 mM
EDTA-4Na en H_{B}SS sin Ca++. Mg++, y NaHCO3;
Cellgro no. 25-052-Li]. Las células
se centrifugaron a continuación y se lavaron tres veces con
solución de tampón de fosfato [D-PBS, Ca++ y Mg++
free; Cellgro no. 21-031-LV], y se
volvieron a suspender en una disolución de 0,1 a 1x10^{6}
células/0,1 ml. Se examinó la viabilidad mediante teñido azul de
tripán y solamente se utilizaron células en las cuales la viabilidad
era mayor del 95% para los estudios en vivo.
La cadena de ratón utilizaba en este estudio es
C57BL/10 de Charles River Inc. los animales se guardaron cinco por
caja y se alimentaron con una dieta de pienso animal y agua ad
libitum. Después de una semana de aclimatación, se
trasplantaron células LLC de manera subcutánea, como una suspensión
de células tumorales [2-5x10^{5} células viables
por 0,1 ml], en la región axilar del flanco derecho. Todos los
animales fueron inoculados en el mismo sitio. Los animales se
sometieron, sobre una base diaria, a examen general. El crecimiento
de los tumores se monitorizó cada segundo o tercer día utilizando
calibres. Los parámetros medidos fueron: tumor medido a lo largo
del eje más largo (longitud) y eje perpendicular más corto (anchura)
y el volumen relativo del tumor (en cm^{3}) se calculó mediante
la fórmula: [longitud (cm) x (anchura cm)^{2}]
(aproximadamente 10-15 días), los ratones se
seleccionaron de manera aleatoria en uno de los siguientes
grupos:
Los animales se sometieron a cirugía para
retirar el tumor primario. Los ratones se anestesiaron ligeramente
con Forane. La piel por encima del tumor se lavó con betadine y
etanoles, en una tolva de flujo laminar. Se realizó una pequeña
incisión en la piel (0,5-1 cm) utilizando un
escalpelo estéril, del tumor se separó cuidadosamente de los
tejidos normales (piel y músculo). Las células de carcinoma de
pulmón de Lewis (en una etapa temprana de crecimiento;
1-3 semanas) son un tumor bien localizado la
separación fue fácil de conseguir sin ningún daño significativo a
los tejidos normales. El tumor se retiró, se casó en algunos casos
se fijó para propósitos de histopatología. En seguida se cerró con
clips de acero inoxidable quirúrgicos (Autoclips; 9 mm; Clay Adams,
Inc. Parsippany, NJ). Este lugar también se desinfectó con betadine
y el animal se guardó tal como se ha descrito anteriormente.
En este grupo, los ratones se separaron de
manera aleatoria después de la cirugía en un grupo de cinco por
jaula. Las jaulas se asignaron de manera aleatoria a grupos
experimentales específicos. Los ratones se marcaron a continuación
mediante números utilizando el procedimiento de "punción en la
oreja". Los ratones fueron comprobados sobre la base diaria para
asegurar la ausencia de infección. Los animales con malestares se
sacrificaron inmediatamente. Para cada experimento, se incluyó un
grupo separado extra adicional de control para determinar el
momento óptimo para el sacrificio para obtener un número
significativo de metástasis de pulmón bien localizados. Este grupo
al mismo procedimiento experimental que el grupo 1 con excepción del
tratamiento con fármacos. Basado en este grupo, se encontró que un
periodo de aproximadamente dos semanas después de la retirada del
tumor primario resultó en un promedio de 25-35
nódulos.
Las condiciones para este grupo fueron idénticas
al grupo utilizado para los experimentos sobre metástasis con
excepción de que el tumor primario no se retiró, los animales se
mantuvieron hasta que los tumores alcanzaron gran tamaño que
justificaba el sacrificio del animal, o los animales manifestaron un
malestar que justificó su sacrificio (movilidad reducida, síntomas
respiratorios severos, etc.).
La pentamidina y los fármacos de quimioterapia
se suministraron como se describe en los resultados. A los animales
de control se les proporcionó el mismo volumen de solución salina
[0,9% de cloruro de sodio]. La dosis de cada fármaco se normalizó
al peso corporal por animal.
La pentamidina y el cisplatino se indicaron
mediante inyecciones intraperitoneales. La adriamicina señorito de
manera intravenosa. La pentamidina y los fármacos de quimioterapia
también se suministraron a los animales en momentos diferentes. Se
les proporciona cada segundo día para un total de cinco veces.
También es posible indicar la pentamidina y todos los fármacos de
quimioterapia de manera intravenosa y al mismo tiempo. Este
procedimiento de régimen de administración o de provocar una
eficiencia de combinación diferente.
Al final de cada experimento (un total de
5-8 semanas), los animales se sacrificaron mediante
dislocación y se les realizó la autopsia. Los tumores, órganos o
ambos se retiraron bajo condiciones estériles (utilizando una tolva
de flujo laminar). Los tumores se pesaron. Los órganos (5 por grupo)
se examinaron para grandes cambios patológicos de continuación se
colocaron en formalina a 10%. Los pulmones se colocaron en fijador
de Bouin al 10% en una solución de formalina, se contaron las
metástasis de la superficie del pulmón utilizando un
estereomicroscopio con una magnificación de 4x o un vidrio de
magnificación, y en algunos casos los pulmones se incrustaron en
cera de parafina según los procedimientos estándar. Los tejidos
incrustados se utilizaron para confirmar las metástasis y también
examinar los cambios histopatológicos.
Para algunos experimentos que implican
combinaciones de fármacos, se extrajo sangre de 3-5
animales por grupo mediante punción cardíaca. La sangre se recogió
en tubos con heparina y se analizó.
La prueba T Student de dos vías se utilizó para
comparar la significancia estadística entre varios grupos.
Se realizó un estudio preliminar ratones que no
tenían tumores para examinar la dosis máxima tolerable de
pentamidina se puede utilizar para los estudios contra los tumores.
Se probaron tres inyecciones intraperitoneales (día 1, día 3 y día
5) de 25, 50, 100 y 200 mg/Kg de peso corporal respectivamente.
Todos los animales que recibieron
100 mg/Kg de peso corporal murieron debido a la aguda toxicidad tal como se muestra en la figura 8. Esto se observó incluso después de utilizar inyección IP. Las dosis de 25 y 50 mg/Kg de peso corporal fueron toleradas sin ningún efecto secundario aparente. Por lo tanto, las dosis menores o iguales a 50 mg/Kg se utilizaron para examinar la actividad biológica de la pentamidina.
100 mg/Kg de peso corporal murieron debido a la aguda toxicidad tal como se muestra en la figura 8. Esto se observó incluso después de utilizar inyección IP. Las dosis de 25 y 50 mg/Kg de peso corporal fueron toleradas sin ningún efecto secundario aparente. Por lo tanto, las dosis menores o iguales a 50 mg/Kg se utilizaron para examinar la actividad biológica de la pentamidina.
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Se utilizaron varios experimentos independientes
para examinar las propiedades contra los tumores de la pentamidina
sobre crecimiento del tumor primario LLC. Estos experimentos indican
que la dosis más activa es de 50 mg/Kg (p < 0,01), tal como se
muestra las figuras 10 a 15. El efecto contra el tumor de la
pentamidina fue muy claro el último día del crecimiento del tumor
(día 14-16), tal como se muestra en la figura 10.
Indicar que la pentamidina fue tan activa como el cisplatino con una
dosis de 3-4 mg/Kg/ip (Figura 13). Además, en un
experimento mostrado en las figuras 14a y 14b, es importante indicar
que si la pentamidina se combinaba con 3 mg/Kg de cisplatino,
algunos animales mostraron una regresión completa de los tumores.
Sin embargo, estos animales no se mantuvieron durante un periodo de
tiempo más largo para asegurar el tumor no volvía a crecer.
Combinaciones de 50 mg/Kg de pentamidina y adriamicina mostraron
algún efecto beneficioso (figura 18) pero como la adriamicina es muy
tóxica en la dosis más alta probada (7,5 mg/Kg/iv, 100% de
mortalidad (figura 19)), mientras que la dosis mínima de 5 mg/Kg
tiene un efecto potente contra el tumor como lo tenía la
pentamidina, se pueden requerir dos es menores para un aumento
adicional de la eficiencia de la combinación.
En el experimento preliminar, se observó que la
pentamidina en una dosis de 50 mg/Kg inhibe la metástasis del
pulmón en más del 50% en comparación con el control tratado con
salino (p < 0,001), tal como se muestra en la figura 16. También
se confirmó esto en experimentos posteriores. Una dosis de
pentamidina de 50 mg/Kg encontró que era la más activa (p <
0,01), mientras que dosis de 10-25 mg/kg no tenían
ningún efecto significativo. Microscópico mostró claramente que el
número de nódulos metastásicos era claramente reducido en animales
tratados con pentamidina y los tamaños de los nódulos eran menores,
en comparación con el grupo tratado con salino. Una combinación
de
50 mg/Kg/ip de pentamidina y 4 mg/kg/ip de cisplatino mostró un efecto mejorado tal como se muestra en la figura 17. De una manera similar, una combinación de 50 mg/Kg/ip de pentamidina y 5 mg/kg de adriamicina/iv mostró un efecto beneficioso, tal como se muestra en la figura 20.
50 mg/Kg/ip de pentamidina y 4 mg/kg/ip de cisplatino mostró un efecto mejorado tal como se muestra en la figura 17. De una manera similar, una combinación de 50 mg/Kg/ip de pentamidina y 5 mg/kg de adriamicina/iv mostró un efecto beneficioso, tal como se muestra en la figura 20.
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Este estudio indica que la pentamidina inhibe el
crecimiento del tumor de carcinoma del pulmón de Lewis en dosis
tolerables después de administración intraperitoneal crónica.
Se observó claramente un efecto contra la
metástasis de una manera dependiente del efecto de la dosis en
grupos donde el tumor primario se retiró después alcanzar un tamaño
de 0,5 a 1 cm^{3}. La máxima dosis tolerada de 50 mg/Kg fue la
más activa. El examen macroscópico revela que los números de nódulos
de pulmón se redujeron y, cuando estaban presentes, eran menores en
los grupos tratados con pentamidina comparados con los
controles.
La combinación de pentamidina y fármacos de
quimioterapia mejora claramente la respuesta terapéutica a la vista
de los datos obtenidos.
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Composiciones farmacéuticas de los compuestos
anteriores se utilizan para el tratamiento de pacientes que tienen
cáncer. Los vehículos para suministrar los compuestos de la presente
invención a los tejidos objetivo a través del cuerpo humano
incluyen salino y D5W (5% de dextrosa y agua). Los recipientes
utilizados para la preparación de formas de dosificación oral de
los compuestos de la presente invención incluyen aditivos tales
como un tampón, solubilizador, agente de suspensión, agente de
emulsión, agente de control de la viscosidad, aroma, relleno de
lactosa, antioxidante, preservativo o tinte. Se prefieren
escribientes para parenteral y otra administración. Estos
escribientes incluyen albúmina de suero, ácido glutámico o
aspártico, fosfolípidos y ácidos grasos.
La formulación preferida es en forma líquida
almacenada en un vial o en una bolsa intravenosa. Los compuestos de
la presente invención también se pueden formular en forma sólida o
semisólida, por ejemplo píldoras, tabletas, cremas, ungüentos,
polvos, emulsiones, cápsulas de gelatina, cápsulas, supositorios,
geles o membranas.
La ruta de administración preferida es
intravenosa. Otras rutas aceptables y administración incluyen
administración oral, tópica, rectal, parenteral (inyectable), local,
de inhalación y epidural. Las composiciones de la invención también
se pueden conjugar para transportar moléculas o incluirse en
modalidades del transporte tales como vesículas y micelas para
facilitar el transporte de las moléculas. Los procedimientos para la
preparación de composiciones farmacéutica mente aceptables que se
pueden administrar a los pacientes son conocidos en la técnica.
Las composiciones de la invención también se
pueden conjugar para transportar moléculas, anticuerpos
monoclonales o transportar modalidades tales como vesículas y
micelas que se dirigen preferentemente a las células cancerígenas o
que potencian las células cancerígenas para recibir los
fármacos.
Las composiciones farmacéuticas incluyen los
compuestos de la presente invención se pueden administrar humanos o
animales. Las dosis que se administran dependen de la condición del
paciente individual, la indicación del fármaco, la estabilidad
física y química del fármaco, la toxicidad, el efecto deseado y de
la ruta elegida de administración (Robert Rakel, ed., Conn's
Current Therapy (1995, W.B. Saunders Company, USA)). Estas
composiciones farmacéuticas se utilizan para el tratamiento del
cáncer.
Ejemplo
9
Suero de pacientes de cáncer fue colocado en
gotas sobre una membrana de nitocelulosa y fue sondado con
antisuero de conejo elevado contra la
endo-exonucleasa según el procedimiento descrito por
parte de Liu et al (1995). En este procedimiento, una
muestra de la proteína de endo-exonucleasa se coloca
en gotas sobre un substrato de membrana. Una solución de
anticuerpos policlonales de conejo se añadieron a la membrana sobre
la cual se han colocado en gotas las muestras. Los anticuerpos se
unen a la proteína. Después del lavado, una segunda solución de un
anticuerpo de anti-conejo o una proteína A
comercialmente disponible se añade con peroxidasa de rábano picante
(hrp). Después del lavado, se añade finalmente la membrana
4-cloro-1-naptol.
Éste reacciona con la hrp conjugada para producir un color azul. La
intensidad del color es proporcional a la cantidad de
endo-exonucleasa presente. En resumen, las proteínas
del suelo se colocaron en gotas sobre la membrana utilizando el
aparato de transferencia por ranuras Bio-Rad. La
membrana se sumergió a continuación con 10 mM
Tris-HCl, pH 8,0 que contenía 1 mM EDTA. Después del
lavado, la membrana si hubo un anticuerpo de
anti-endo-exonucleasa en tampón B
(10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) que
contenía un 1% del polvo de leche desnatada. Después de lavar la
membrana tres veces en tampón B durante 15 minutos, se añadió a la
membrana anti-conejo-Igg conjugado
con peroxidasa de rábano picante o proteína A conjugada con
peroxidasa de rábano picante en tampón B que contenía un 1% del
polvo de leche desnatada y se incubó durante tres horas a
temperatura ambiente. La membrana se lavó posteriormente con tampón
B durante 15 minutos, conteniendo el tampón 1 M NaCl durante 30
minutos, y el tampón B otra vez durante 15 minutos. Después del
lavado, se añadió a la membrana una solución de
4-cloro-1-naftol. La
ración con cualquier peroxidasa de rábano picante presente produjo
un color azul.
Con las muestras de suero de 37 pacientes de
cáncer (metástasis de cáncer de mama) de historia conocida, se
encontró una correlación entre la supervivencia y el nivel de
endo-exonucleasa. Con un punto de corte para una
alta endo-exonucleasa que se utilizó de 5,5, el
grupo de pacientes que tenía una supervivencia promedio de 38,91
meses tenía un bajo nivel de endo-exonucleasa,
mientras que el grupo que tenía una supervivencia promedio de 10,43
meses tenía altos niveles de endo-exonucleasa. El
valor p de 0,02 indicó una alta significancia estadística para el
resultado. Además, virtualmente todos los pacientes de cáncer fueron
detectados con niveles anormales de
endo-exonucleasa (por encima del valor detectado con
individuos libres de cáncer), mientras que el marcador de
diagnóstico de cáncer estándar, CEA, solamente se probó positivo en
el 25% de las muestras de suero de los pacientes.
El estudio indicó que el nivel de
endo-exonucleasa tiene una buena correlación con la
longitud de la supervivencia en pacientes con cáncer de mama
metastásico.
Se detectó un nivel anormal de
endo-exonucleasa en casi todos las muestras de los
pacientes, mientras que el marcador diagnóstico del cáncer
estándar, CEA, dio resultados positivos en solamente un 25%
aproximadamente de las muestras de los mismos pacientes.
Aunque la invención se ha descrito con
realizaciones preferidas, debe entenderse que se podrán realizar
modificaciones a cómo serán evidentes para los expertos en la
materia. Estas modificaciones y variaciones suelen considerar
dentro del articulado y alcances de la presente invención.
Chow, T. Y.-K., y Resnick, M. A.
(1983) The identification of a deoxyribonuclease controlled
by the RAD52 gene of Saccharomyces cerevisiae. In Friedberg,
E. C. and Bridges, B. A. (eds), Cellular Responses to DNA
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Claims (7)
1. Composición farmacéutica adecuada para
inhibir la proliferación de células cancerígenas un crecimiento de
tumores que comprende pentamidina y un agente que induce roturas en
cadenas de ADN seleccionado entre el grupo que consiste en
cisplatino, mitomicina C, adriamicina y etopósido.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicha pentamidina o dicho agente se
conjuga a un agente de transporte para suministrarse a las células
cancerígenas.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 2, en la que el agente de transporte se selecciona
entre el grupo que consiste en micelas, vesículas, liposomas y
anticuerpos monoclonales.
4. Utilización de pentamidina en combinación con
un agente que induce roturas en cadenas de ADN seleccionado entre
grupo que consiste en cisplatino, mitomicina C, adriamicina y
etopósido para la preparación de un medicamento para inhibir la
proliferación de células cancerígenas o para inhibir el crecimiento
de tumores en un paciente.
5. Utilización de pentamidina en la preparación
de aditamentos para inhibir la proliferación de células cancerígenas
o para inhibir el crecimiento de tumores en un paciente.
6. Utilización de un anticuerpo de
endo-exonucleasa para la preparación de un agente
para el diagnóstico de cáncer en un paciente.
7. Pentamidina para su uso en la inhibición de
la proliferación de células cancerígenas con crecimiento de tumores
en combinación con irradiación de ionización.
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