ES2326358T3

ES2326358T3 - Secuencias suprimidas en m. bovis bcg/m. bovis o m. tuberculosis, procedimiento de deteccion de las micobacterias que utiliza dichas secuencias y vacunas.

Info

Publication number: ES2326358T3
Application number: ES00910960T
Authority: ES
Inventors: Stewart Cole; Stephen Gordon; Roland Buchrieser-Brosch; Alain Billault; Thierry Garnier
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2009-10-08
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: CA2368088C; US8357493B2; EP1161562B1; DE60042268D1; PT1161562E; US20050250120A1; CA2368088A1; EP1161562B9; AU3298900A; CY1109210T1; FR2791067A1; FR2791067B1; EP1161562A1; US20130164749A1; ATE432360T1; WO2000055362A1; DK1161562T3

Abstract

Procedimiento de detección y de identificación que permite discriminar M. bovis BCG y M. bovis de M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas: a) aislar el ADN a partir de la muestra biológica a analizar u obtener un ADNc a partir del ARN de la muestra biológica, b) detectar las secuencias de ADN de la micobacteria presente en dicha muestra biológica, c) comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en el genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1, d) comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

Description

Secuencias suprimidas en M. bovis BCG/M bovis o M. tuberculosis, procedimiento de detección de las micobacterias que utiliza dichas secuencias y vacunas.

La presente invención tiene por objeto la puesta en evidencia de secuencias nucleotídicas que permiten distinguir en particular, en términos de diagnóstico, una inmunización que resulta de una vacunación mediante BCG de una infección por M. tuberculosis. Las secuencias en cuestión son específicas o bien de M. bovis BCG/M. bovis, o bien de M. tuberculosis. La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de detección de las secuencias en cuestión, un procedimiento para la detección de anticuerpos generados por los productos de expresión de estas secuencias así como los kits para llevar a cabo estos procedimientos. Por último, la presente solicitud de patente tiene por objeto nuevas vacunas.

El porcentaje importante de mortalidad y de morbilidad causado por Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis, genera la necesidad de desarrollar nuevas vacunas y unos tratamientos quimio-terapéuticos aún más rápidos. En efecto, la aparición de cepas de M. tuberculosis que resisten a los anti-tuberculosos y el riesgo incrementado en los pacientes inmunodeprimidos, por ejemplo en los pacientes que padecen SIDA, de desarrollar una tuberculosis, hace necesario la puesta a punto de métodos rápidos, específicos y fiables para el diagnóstico de la tuberculosis y la puesta a punto de nuevas vacunas. La vacuna BCG convencional se deriva de una cepa de Mycobacterium bovis que ha sido atenuada mediante unos pasos en serie repetidos sobre agar de bilis de patata-glicerinox (Calmette, 1927; Bloom y Fine, 1994). Sin embargo, a pesar de prácticamente 50 años de uso mundial, la razón de la atenuación de M. bovis BCG se desconoce todavía. Persisten unas cuestiones en cuanto a la protección conferida por la vacuna contra la tuberculosis pulmonar, con una eficacia comprendida entre 0 y 80% (Fine, 1994). Además, existen numerosas sub-cepas de BCG y ofrecen unos niveles variados de protección contra la tuberculosis en un modelo de ratón (Lagranderie et al., 1996). La atenuación de la cepa de origen de M. bovis puede haber sido causada por unas mutaciones en el genoma del bacilo que han sido seleccionadas durante los pasos en serie de la cepa, mutaciones que han seguido siendo estables en el genoma. Sin embargo, como se ha perdido la cepa de M. bovis de origen, la comparación directa de esta última con M. bovis BCG es imposible. A pesar de ello, la identificación de diferencias genéticas entre M. bovis, M. bovis BCG y M. tuberculosis es susceptible de revelar unas localizaciones cuya alteración podría haber conducido a la atenuación de M. bovis BCG.

El ADN de M. tuberculosis tiene más del 99,9% de homología con el ADN de los demás miembros del complejo tuberculoso (M. bovis, M. microti, M africanum). Aunque muy emparentadas, estas cepas se pueden diferenciar en base a su gama de hospedante, a su virulencia para el ser humano y a sus características fisiológicas (Heifets y Good, 1994). Tal como en el caso de la atenuación del BCG, la base genética para las diferencias fenotípicas entre los bacilos tuberculosos es muy desconocida. Sin embargo, la riqueza de la información contenida en la secuencia genómica de M. tuberculosis H37Rv daba lugar a pensar que las variaciones genéticas entre las cepas iban a ser descubiertas (Cole et al., 1998). La comparación genómica presenta una herramienta potente para dichas investigaciones debido a que los genomas completos se pueden estudiar preferentemente al estudio de los genes en su individualidad. Un estudio comparativo anterior de M. bovis y M. bovis BCG mediante hibridación genómica sustractiva ha mostrado que tres regiones, denominadas RD1, RD2 y RD3 estaban suprimidas en M. bovis BCG en comparación con M. bovis (Mahairas et al., 1996). Sin embargo, la función, llegado el caso, de estas regiones en la atenuación de M. bovis BCG no se ha establecido claramente. De manera similar, otros estudios de las diferencias genómicas entre M. bovis, M. bovis BCG y M. tuberculosis han mostrado que existían numerosas localizaciones polimórficas entre estas cepas (Philipp et al., 1996). A pesar de que la naturaleza exacta de estos polimorfismos no haya sido aclarada, unos análisis suplementarios han revelado que un polimorfismo se debía a la supresión de 12,7 kb en M. bovis y BCG en comparación con M. tuberculosis (Brosch et al., 1998). A partir de este momento, parece que existen dos clases de supresiones: las que están ausentes de BCG pero presentes en M. bovis y M. tuberculosis y las que están ausentes de M. bovis y BCG pero presentes en M. tuberculosis.

El banco de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de M. tuberculosis H37Rv depositado en la CNCM con el nº I-1945 el 19 de noviembre de 1997 y descrito en la solicitud WO 9954487 manifiesta el conocimiento completo de la secuencia genómica de M. tuberculosis y presenta un potencial como herramienta para las aplicaciones postgenómicas tales como las comparaciones genómicas (Brosch et al., 1998). Con el fin de impulsar más las investigaciones en las diferencias genómicas entre M. tuberculosis y M. bovis BCG, los inventores han preparado un banco BAC de M. bovis BCG depositado el 30 de junio de 1998 en la CNCM con el nº I-2049 y descrito en la solicitud WO 9954487. Este tipo de banco presenta en efecto ciertas ventajas. En primer lugar, el sistema BAC puede mantener amplios insertos de ADN micobacterianos, hasta 120 kb. Los 4,36 Mb del genoma de M. bovis BCG se podían representar por lo tanto en 50 a 60 clones, simplificando el almacenamiento y la manipulación del banco. En segundo lugar, el sistema BAC puede permitir con toda tranquilidad replicar los insertos sin generar ninguna reestructuración o ninguna supresión en los clones. Por eso, las alteraciones del inserto no pueden ser el origen de error para la variación en el genoma. En tercer lugar, el posicionamiento de los clones BAC sobre el cromosoma de M. bovis BCG es susceptible de generar un mapa de clones que se solapan, lo que debería permitir la comparación directa de los segmentos locales sobre el genoma de M. tuberculosis y M. bovis BCG, siendo al mismo tiempo un recurso interesante para la secuenciación del genoma de M. bovis BCG.

La construcción de un banco BAC de M. bovis BCG-Pasteur (I-2049) se describe a continuación así como su uso, en conjunción con el banco BAC de M. tuberculosis H37Rv (I-1945), como herramienta para las comparaciones genómicas. Con este enfoque, los inventores han podido identificar nuevas supresiones e inserciones entre los bacilos tuberculosos, lo que permite tener una estimación en dos genomas de la dinámica y de la diferenciación en el complejo de M. tuberculosis.

La vía principal para extraer la información biológica a partir del genoma es la comparación entre los genomas. La tecnología de los biochips o "chips de ADN" (Chee et al., 1996; DeRisi et al., 1997) descrita por ejemplo en las patentes WO 97/02357 y WO 97/29212 permite efectuar las alineaciones y seleccionar las secuencias de interés. Por otro lado, la disponibilidad de un juego mínimo de clones de BAC para los genomas de M. bovis BCG y M. tuberculosis H37Rv ha procurado a los inventores unas herramientas listas para usar para dichos estudios comparativos. El banco de BAC de M. bovis BCG contiene más de 1.500 clones con un tamaño medio de los insertos de aproximadamente 75 kb. 57 clones cubren el genoma de BCG que incluye un fragmento HindIII de 120 kb que estaba ausente del banco de BAC de M. tuberculosis. La construcción de los chips de BAC a partir del banco de M. bovis BCG debía permitir a los inventores extender sus estudios comparativos en lo referente al bacilo tuberculoso. Estos fragmentos pueden hibridarse con ADN genómico a partir de aislados clínicos de M. tuberculosis o de las cepas epidérmicas para identificar otras supresiones o reorganizaciones, y a partir de ahí, permitir una nueva estimación en lo referente a la plasticidad del genoma así como la identificación de los genes y de los productos de los genes que pueden estar implicados en la virulencia.

Al final de los experimentos relacionados a continuación, los inventores han identificado 10 localizaciones o loci que están ausentes en M. bovis BCG en comparación con M. tuberculosis. Unas hibridaciones con el ADN genómico de M. bovis han revelado que 7 de estos loci eran asimismo suprimidos en M. bovis en comparación con M. tuberculosis. Así, en el texto siguiente, cada vez que se trate de características comunes al genoma de M. bovis BCG y al de M. bovis, se indicará que se trata del "genoma de M. bovis BCG/M. bovis".

Después, se ha comprobado que 3 de las supresiones específicas que aparecían en M. bovis BCG eran idénticas a las regiones RD1, RD2 y RD3 definidas por el equipo de Stover (Mahairas et al., 1996). Así, guardando la nomenclatura anterior, los inventores han denominado las otras 7 supresiones del genoma de M. bovis BCG/M. bovis, RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 y RD10.

Otras supresiones han resultado ser específicas del genoma de M. tuberculosis, entendiéndose que las secuencias "correspondientes" estaban presentes en M. bovis BCG/M. bovis; han sido denominadas RvD1 y RdV2 (Tablas 1 y 2).

Las supresiones RD5-RD10, RvD1 y RvD2 han permitido a los inventores identificar de manera profundizada la dinámica del genoma en el bacilo tuberculoso y han proporcionado unas indicaciones relativas a las bases genéticas de la diferenciación fenotípica del complejo. La identificación de RvD1 y de RvD2 como supresiones del genoma de M. tuberculosis H37Rv muestra que el proceso de supresión no funciona sólo en un solo sentido, y la pérdida de informaciones puede tener lugar por lo tanto al mismo tiempo en las cepas bovinas y en las cepas humanas. Se constata que 8 de las 10 supresiones detectadas están localizadas en una región del cromosoma en la que probablemente tiene lugar la terminación de la replicación.

A continuación, los inventores han puesto en evidencia, en el seno de cada región suprimida, varios ORF (o marcos abiertos de lectura) o genes y han intentado determinar la función putativa de cada uno de ellos (Tabla 1).

La presente solicitud describe unas secuencias nucleotídicas suprimidas del genoma de M. bovis BCG/M. bovis y presentes en el genoma de M. tuberculosis o a la inversa, seleccionadas de entre los ORF y genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964. Rv1965. mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, IpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075, echA1, Rv0223c, RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758.

Mediante la expresión "secuencia nucleotídica" según la presente invención, se entiende tanto un ADN bicatenario, un ADN monocatenario como unos productos de transcripción de dichos ADN.

Más particularmente, las secuencias nucleotídicas enumeradas anteriormente se agrupan en regiones nucleotídicas según la siguiente repartición:

-: RD5: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c,

-: RD6: Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c,

-: RD7: Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, lprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977,

-: RD8: ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG,

-: RD9: cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075,

-: RD10: echA1, Rv0223c,

-: RvD1: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c,

-: RvD2: RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758.

De manera interesante, 3 de las supresiones (RD5, RD6 y RD8) contienen 6 genes que codifican para unas proteínas PE y PPE. Como se ha sugerido que estas proteínas tienen una función eventual en la variación antigénica (Cole et al., 1998), se puede deducir que estos loci pueden representar unos sitios de hipervariabilidad entre las cepas tuberculosas.

Por lo menos 9 proteínas susceptibles de ser exportadas o expuestas en la superficie están codificadas por RD4 a RD10, lo que indica que estos polipéptidos desempeñan quizás una función importante en el reconocimiento inmunitario del bacilo. Se ha demostrado efectivamente que unos polipéptidos segregados pueden desempeñar una función de estimulante potencial en el sistema inmunitario y son susceptibles de desempeñar una función de antígenos conocidos para intervenir durante la etapa precoz de la infección (Elhay et al., 1998; Horwitz et al., 1995; Rosenkrands et al., 1998).

El hecho de que RD5 y RD6 contengan unos genes que codifican para unas proteínas que pertenecen a la familia de ESAT-6 de la cual 14 están organizados en 11 loci distintos es particularmente significativo (F. Tekaia, S. Gordon, T. Garnier, R. Brosch, B.G. Barrell y S.T. Cole, presentado). ESAT-6 es un antígeno con célula T principal que parece ser segregado por el bacilo tuberculoso virulento de una manera independiente del péptido señal (Harboe et al., 1996). Se acumula en el medio extracelular durante las fases precoces de crecimiento y su gen se localiza en RD1, una región que está suprimida del genoma de M. bovis BCG (Mahairas et al., 1996; Philipp et al., 1996). 3 de las 10 regiones RD contienen así unos genes de la familia de ESAT-6, lo que indica que otros sitios de genes ESAT-6 pueden dar lugar asimismo a unas supresiones o a unas recolocaciones.

La secuencia genómica de M. tuberculosis H37Rv ha revelado por otra parte, la presencia de 4 genes altamente emparentados que codifican para unas enzimas de fosfolipasa C denominadas plcA, plcB, plcC y plcD (Cole et al., 1998). La fosfolipasa C ha sido reconocida como factor de virulencia importante en un cierto número de bacterias que incluyen Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes y Pseudomonas aeruginosa, en las que desempeña una función intracelular en la diseminación de las células bacterianas, en la supervivencia intracelular y en la citolisis (Titball, 1003). La supresión RD5 engloba 3 genes (plcA, plcB y plcC), estando esta región ausente de M. bovis, M. bovis BCG y M. microti. La puesta en evidencia de la actividad de la fosfolipasa C en M. tuberculosis, M. microti y M. bovis pero no en M. bovis BCG, ha sido descrita anteriormente (Johansen et al., 1996; Wheeler y Ratledge, 1992) así como la función de las enzimas codificadas por plcA y plcB (conocidas asimismo con la denominación mpcA y mpcB) en la hidrólisis al mismo tiempo de la fosfatidilcolina y de la esfingomielina. Los niveles de la actividad de fosfolipasa C detectados en M. bovis son muy inferiores a los observados en M. tuberculosis que están en concordancia con la pérdida de plcABC, siendo la actividad de la esfingomielinasa todavía detectable. Los datos de secuencias presentados en este caso muestran que la fosfolipasa en toda su longitud está codificada por el gen plcD en M. bovis BCG-Pasteur, y que su importante similitud de secuencia con los productos de plcA y plcB indica que está probablemente dotada al mismo tiempo de una actividad fosfolipasa y de una actividad esfingomielinasa. Por lo tanto, es probable que plcD pueda ser responsable de la actividad residual de fosfolipasa C en las cepas que presentan la supresión RD5, tal como M. bovis, aunque sea difícil relacionar esta interpretación con la ausencia observada de fosfolipasa C a pesar de la presencia de esfingomielinasa en la cepa de M. bovis BCG usada en otros estudios (Johansen et al., 1996; Wheeler y Raledge, 1992). Los estudios de la expresión con el gen plcD clonado deberían aclarar este punto.

Se ha descrito el gen mce por el equipo de Riley como que codifica para una proteína putativa de M. tuberculosis de tipo invasiva, cuya expresión en E. coli permite la invasión de las células HeLa (Arruda et al., 1993). Se han identificado otras tres proteínas Mce como partes del proyecto de secuenciación del genoma con su gen que ocupa la misma posición en cuatro grandes operones muy conservados que comprenden por lo menos ocho genes (Cole et al., 1998; Harboe et al., 1996). Es difícil deducir los efectos de la pérdida de mce3 (RD7) sobre M. bovis, M. microti y M. bovis BCG debido a que las tres copias de mce restantes podrían complementar cualquier pérdida de actividad, salvo que los operones estén expresados diferencialmente. Sin embargo, es interesante observar que RD7 está ausente de ciertos miembros del complejo de M. tuberculosis que no son virulentos para el ser humano, lo que sugiere que RD7 pueda desempeñar una función específica en la enfermedad humana.

El genoma de M. tuberculosis H37Rv codifica asimismo para seis proteínas (EphA-F) que muestran una similitud con unas hidrolasas epóxidos mientras que por lo menos 21 enoil-CoA-hidrolasa (EchA1-21) y múltiples aldehídos deshidrogenasas están presentes (Cole et al., 1998). La pérdida de ephA (RD8), echA1 y el aldehído deshidrogenasa codificado por Rv0223c (RD10) en M. bovis BCG/M. bovis se puede compensar por lo tanto mediante otras enzimas aunque la especificidad del sustrato de las enzimas de M. tuberculosis sea desconocida. Las hidrolasas epóxidos están consideradas generalmente como unas enzimas de detoxificación; un informe reciente ha mostrado asimismo que desempeñaban una función en la activación de las leucotoxinas (Moghaddam et al., 1997), un ácido graso tóxico producido por los leucocitos que están implicados en el síndrome de insuficiencia respiratoria en el adulto. Sin embargo, la cuestión de saber si las hidrolasas epóxidos de M. tuberculosis pueden modificar químicamente unas quimioquinas hospedantes sigue sin respuesta. Alternativamente, éstas pueden desempeñar una función en la detoxificación lipídica de los productos de peroxidación generados por los radicales oxígenos a partir de macrófagos activados.

RD9 es una región suprimida de los genomas de M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG y M. microti en comparación con M. tuberculosis. En consecuencia, en oposición con las demás regiones RD, la localización de M. africanum es próxima de M. bovis, lo que indica la presencia de esta cepa entre M. tuberculosis y M. bovis (Heifets y Good, 1994). De manera similar, la región RD4 puede diferenciar M. microti de las cepas bovinas (Tabla 2).

Las proteínas codificadas por RD4 a RD10 pueden presentar por lo tanto unos antígenos interesantes, que permiten la discriminación de individuos vacunados por el BCG de pacientes infectados por M. tuberculosis.

La presente solicitud describe asimismo un procedimiento de detección y de identificación discriminante de M. bovis BCG y M. bovis de M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende las etapas siguientes:

a): aislar el ADN a partir de la muestra biológica a analizar u obtener un ADNc a partir del ARN de la muestra biológica,

b): detectar las secuencias de ADN de la micobacteria presente en dicha muestra biológica,

c): analizar dichas secuencias.

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Así, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de detección y de identificación que permite discriminar M. bovis BCG y M. bovis de M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas:

c): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en el genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1,

d): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y la secuencia nucleotídica de RvD2 con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

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Preferentemente, las secuencias nucleotídicas tal como se definen en las etapas c) y d) se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD5: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c,

-: RD6: Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c,

-: RD8: ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG,

-: RD9: cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075,

-: RD10: echA1, Rv0223c,

-: RvD1: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c,

-: RvD2: RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758.

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Preferentemente, en el marco de la presente invención, la muestra biológica está constituida por un fluido, por ejemplo suero humano o animal, sangre, una biopsia, líquido bronco-alveolar o líquido pleural.

El análisis de las secuencias buscadas puede realizarse, por ejemplo, mediante una electroforesis sobre gel de agarosa. Si se observa la presencia de un fragmento de ADN que migra en el sitio esperado, se puede concluir que la muestra analizada contenía ADN de micobacteria. Este análisis se puede realizar asimismo mediante la técnica de hibridación molecular usando una sonda nucleica. Esta sonda será ventajosamente marcada por un elemento no radioactivo (sonda fría) o radioactivo.

Ventajosamente, la detección de las secuencias de ADN de las micobacterias se realizará por medio de secuencias nucleotídicas complementarias de dichas secuencias de ADN. A título de ejemplo, podrá tratarse de sondas nucleotídicas marcadas o no marcadas; podrá tratarse asimismo de cebadores con vistas a una amplificación.

La técnica de amplificación usada puede ser la PCR pero también otras técnicas alternativas tal como la técnica SDA (Strand Displacement Amplification) o técnica de amplificación con desplazamiento de hebras, la técnica TAS (Transcription-based Amplification System), la técnica NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) o la técnica TMA (transcription Mediated Amplification).

Los cebadores de acuerdo con la invención tienen una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 17 y SEC ID nº 18, siendo:

-: el par SEC ID nº 1/SEC ID nº 2 específico de RD4,

-: el par SEC ID nº 3/SEC ID nº 4 específico de RD5,

-: el par SEC ID nº 5/SEC ID nº 6 específico de RD6,

-: el par SEC ID nº 7/SEC ID nº 8 específico de RD7,

-: el par SEC ID nº 9/SEC ID nº 10 específico de RD8,

-: el par SEC ID nº 11/SEC ID nº 12 específico de RD9,

-: el par SEC ID nº 13/SEC ID nº 14 específico de RD10,

-: el par SEC ID nº 15/SEC ID nº 16 específico de RvD1, y

-: el par SEC ID nº 17/SEC ID nº 18 específico de RvD2,

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En una variante, la solicitud describe asimismo un procedimiento de detección y de identificación discriminante de M. bovis BCG y M. bovis de M. tuberculosis en una muestra biológica que comprende las etapas siguientes:

a): poner en contacto la muestra biológica a analizar con por lo menos un par de cebadores tal como se han definido anteriormente, habiendo sido el ADN contenido en la muestra, llegado el caso, previamente hecho accesible a la hibridación,

b): amplificar el ADN de la micobacteria,

c): poner en evidencia la amplificación de los fragmentos de ADN.

Los fragmentos amplificados se pueden identificar mediante una electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida, mediante una electroforesis capilar o también mediante una técnica cromatográfica (filtración sobre gel, cromatografía hidrófoba o cromatografía intercambiadora de iones). La especificación de la amplificación se puede controlar mediante hibridación molecular usando unas sondas, unos plásmidos que contienen estas secuencias o su producto de amplificación.

Los fragmentos nucleotídicos amplificados se pueden usar como agente reactivo en unas reacciones de hibridación con el fin de poner en evidencia la presencia, en una muestra biológica, de un ácido nucleico diana de secuencias complementarias a las de dichos fragmentos nucleotídicos amplificados.

Estas sondas y amplicones se pueden marcar o no mediante unos elementos radioactivos o mediante unas moléculas no radioactivas tales como unas enzimas o unos elementos fluorescentes.

La presente invención tiene asimismo por objeto un kit para la detección y la identificación discriminante de M. bovis BCG y M. bovis de M. tuberculosis en una muestra biológica que comprende los elementos siguientes:

a): por lo menos un par de cebadores tal como se han definido anteriormente,

b): los agentes reactivos necesarios para efectuar una reacción de amplificación de ADN,

c): eventualmente, los elementos necesarios que permiten verificar o comparar la secuencia y/o el tamaño del fragmento amplificado, por ejemplo unos agentes reactivos necesarios para una electroforesis o para una cromatografía, o unas sondas necesarias para una hibridación molecular.

En efecto, en el marco de la presente invención, en función del par de cebadores usado, se pueden obtener unos resultados muy diferentes. Así, el uso de cebadores internos a la supresión, tales como se describen en la presente invención para RD4, RD5 y RD8, hace que no se puede detectar ningún producto de amplificación en M. bovis BCG. Sin embargo, el uso de cebadores externos a la zona de supresión no proporciona necesariamente el mismo resultado, en lo que se refiere por ejemplo al tamaño del fragmento amplificado, en función de la importancia de la zona suprimida en M. bovis BCG. Así, el uso del par de cebadores SEC ID nº 5/SEC ID nº 6 para la detección de RD6 es susceptible de dar lugar a un amplicón en M. bovis BCG de aproximadamente 3.801 pb mientras que el uso del par de cebadores SEC ID nº
11/SEC ID nº 12 para la detección de RD9 dará lugar en M. bovis BCG a un amplicón de aproximadamente 1.018 pb.

La invención tiene asimismo por objeto el uso de por lo menos un par de cebadores tal como se ha definido anteriormente para la amplificación de secuencias de ADN de M. bovis BCG y M. bovis o M. tuberculosis.

El interés del uso de varios pares de cebadores será evidentemente cruzar los resultados obtenidos con cada uno de ellos para afinar el resultado del análisis. En efecto, cuando se indica, en el marco de la presente invención, que ciertas supresiones son específicas de M. bovis BCG/M. bovis, esto no es del todo exacto, puesto que algunas de ellas se encuentran asimismo en M. microti OV254, en M. tuberculosis CSU #93 y en M. africanum así como en ciertos aislados clínicos (Tabla 2). Así, el uso del par de cebadores SEC ID nº 1/SEC ID nº 2 específico de la región RD4 no dará lugar a unos amplicones de tamaño normal con M. bovis BCG/M. bovis en la muestra biológica. Sin embargo, si el par de cebadores usado es SEC ID nº 5/SEC ID nº 6 específico de RD6 y si no se encuentran unos amplicones de tamaño normal, no será posible, a partir de este único resultado, discriminar entre la presencia, en la muestra biológica, de M. bovis BCG/M bovis, M. microti OV254 y M. tuberculosis CSU#93.

La discriminación será más radical cuando se trate de determinar si la micobacteria presente en la muestra biológica a analizar es M. bovis BCG/M. bovis o M. tuberculosis H37Rv puesto que los pares de cebadores SEC ID nº 15/SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17/SEC ID nº 18 son específicos sólo de M. tuberculosis H37Rv. Por consiguiente, la ausencia de amplicón de tamaño normal durante el uso de uno u otro de estos pares de cebadores se podrá considerar como significativa de la presencia de M. tuberculosis H37Rv en la muestra biológica analizada.

La presente solicitud describe asimismo los productos de expresión de la totalidad o parte de las secuencias nucleotídicas suprimidas del genoma de M. bovis BCG/M. bovis y presentes en M. tuberculosis o a la inversa tales como se enumeran en la Tabla 1.

Mediante la expresión "producto de expresión" se entiende cualquier proteína, polipéptido o fragmento polipeptídico que resulta de la expresión de la totalidad o parte de dichas secuencias nucleotídicas y preferentemente que presentan por lo menos una de las siguientes características:

-: capacidad para exportar o segregar por una micobacteria y/o ser inducido o reprimido durante la infección por la micobacteria, y/o

-: capacidad para inducir, reprimir o modular directa o indirectamente un factor de virulencia de micobacteria, y/o

-: capacidad para inducir una reacción de inmunogenicidad dirigida contra una micobacteria, y/o

-: capacidad para ser reconocido por un anticuerpo específico de micobacteria.

En efecto, la presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de detección discriminante in vitro de anticuerpos dirigidos contra M. bovis BCG y M. bovis o de anticuerpos dirigidos contra M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un producto de expresión de la totalidad o parte de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis tal como se definen en las etapas 1) y 2) siguientes:

1): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en el genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1, y

2): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y la secuencia nucleotídica de RvD2 con el nº Y18606 en la base de datos EMBL;

b): poner en evidencia el complejo antígeno-anticuerpo formado.

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Preferentemente, las secuencias nucleotídicas tal como se definen en la etapa a) de dicho procedimiento se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD5: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD6: Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD7: Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD8: ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD9: cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RvD1: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, Rv2024c, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 en la base de datos EMBL.

-: RvD2: RvD2-rplcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

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La solicitud describe asimismo un procedimiento de detección discriminante de una vacunación con M. bovis BCG o de una infección por M. tuberculosis en un mamífero, que comprende las siguientes etapas:

a): preparar una muestra biológica que contiene unas células, más particularmente unas células del sistema inmunitario de dicho mamífero y más particularmente todavía, unas células T,

b): incubar la muestra biológica de la etapa a) con por lo menos un producto de expresión según la presente invención,

c): detectar una reacción celular que indica una sensibilización previa del mamífero a dicho producto, en particular la proliferación celular y/o la síntesis de proteínas tales como el interferón gamma.

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Así, la invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de detección in vitro que permite discriminar una vacunación con M. bovis BCG de una infección por M. tuberculosis en un mamífero, que comprende las siguientes etapas:

a): incubar células de dicho mamífero, más particularmente las células del sistema inmunitario de dicho mamífero y más particularmente todavía las células T con por lo menos un producto de expresión de la totalidad o parte de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis tal como se define en las etapas 1) y 2) siguientes:

2): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y la secuencia nucleotídica de RvD2 con el nº Y18606 en la base de datos EMBL; y

b): detectar una reacción celular que indica una sensibilización previa del mamífero a dicho producto, en particular la proliferación celular y/o la síntesis de proteínas tales como el interferón gamma.

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-: RD9: cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

La proliferación celular se podrá medir por ejemplo mediante la incorporación de ^{3}H-timidina.

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La solicitud describe asimismo un kit para el diagnóstico in vitro de una infección por M. tuberculosis en un mamífero eventualmente vacunado previamente con M. bovis BCG que comprende:

a): un producto de expresión de acuerdo con la presente invención,

b): llegado el caso, los agentes reactivos para la constitución del medio propicio para la reacción inmunológica,

c): los agentes reactivos que permiten la detección de los complejos antígeno-anticuerpo producidos por la reacción inmunológica,

d): llegado el caso, una muestra biológica de referencia (control negativo) desprovista de anticuerpos reconocidos por dicho producto,

e): llegado el caso, una muestra biológica de referencia (control positivo) que contiene una cantidad predeterminada de anticuerpos reconocidos por dicho producto.

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Así, la presente solicitud describe asimismo un kit para el diagnóstico in vitro de una infección por M. tuberculosis en un mamífero eventualmente vacunado previamente con M. bovis BCG, que comprende:

a): un producto de expresión de la totalidad o parte de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis tal como se define en las etapas 1) y 2) siguientes:

c): los agentes reactivos que permiten la detección de los complejos antígeno-anticuerpo producidos mediante la reacción inmunológica,

Preferentemente, las secuencias nucleotídicas tal como se definen en la parte a) de dicho kit se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD9: cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

Los agentes reactivos que permiten la detección de los complejos antígeno-anticuerpo pueden comprender un marcador o ser susceptibles de ser reconocidos a su vez por un agente reactivo marcado, más particularmente en el caso en el que el anticuerpo usado no está marcado.

La invención tiene asimismo por objeto unos anticuerpos mono-o o policlonales, sus fragmentos o anticuerpos quiméricos, capaces de reconocer específicamente un producto de expresión de la totalidad o parte de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis tal como se definen en las etapas 1) y 2) siguientes:

2): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y la secuencia nucleotídica de RvD2 con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

Preferentemente, dichas secuencias nucleotídicas se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD9: cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

La presente invención se refiere por lo tanto asimismo a un procedimiento para la detección de la presencia de un antígeno que permite discriminar un antígeno de M. bovis BCG y M. bovis de un antígeno de M. tuberculosis en una muestra biológica que comprende las etapas siguientes:

a): poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo según la invención,

b): poner en evidencia la amplificación del complejo antígeno-anticuerpo formado.

La invención se refiere asimismo al kit para la detección discriminante de la presencia de un antígeno de M. bovis BCG y M. bovis con relación a un antígeno de M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende los siguientes elementos:

a): un anticuerpo de acuerdo con la invención,

b): los agentes reactivos para la constitución del medio propicio para la reacción inmunológica,

c): los agentes reactivos que permiten la detección de los complejos antígeno-anticuerpo producidos mediante la reacción inmunológica.

Los agentes reactivos mencionados anteriormente son bien conocidos por el experto en la materia, quien no tendrá ninguna dificultad para adaptarlos al contexto de la presente invención.

La invención tiene asimismo por objeto una composición inmunógena, caracterizada porque consiste en por lo menos un producto de expresión de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis tal como se definen en las etapas 1) y 2) siguientes:

1): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en el genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1, y

2): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y la secuencia nucleotídica de RvD2 con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

-: RD9: cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

Ventajosamente, la composición inmunógena de acuerdo con la invención entra en la composición de una vacuna cuando se presenta en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y eventualmente con uno o más adyuvantes de la inmunidad tal como el alumbre o un representante de la familia de los muramilpéptidos o también de adyuvante incompleto de Freund.

La presente solicitud describe asimismo una vacuna que comprende por lo menos un producto de expresión de la totalidad o parte de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma en M. tuberculosis tal como se definen en las etapas 1) y 2) siguientes:

2): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y la secuencia nucleotídica de RvD2 con el nº Y18606 en la base de datos EMBL;

en asociación con un vehículo farmacéuticamente compatible y, llegado el caso, uno o más adyuvantes de la inmunidad apropiados.

-: RD8: ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, tal como se definen en la tabla 1.

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

Los conocimientos estándares sobre la evolución del complejo de M. tuberculosis se basan en la hipótesis de que M. tuberculosis se deriva de M. bovis (Sreevatsan et al., 1997). Sin embargo, la distribución de RD1 a RD10 entre el complejo tuberculoso sugiere que una evolución lineal de M. tuberculosis a partir de M. bovis es demasiado simplista. En efecto, aparece de manera más probable que los dos bacilos se derivan de una cepa madre común, que las supresiones reflejan por lo tanto la adaptación de los bacilos a su nicho particular, es decir, que la pérdida de RD4 a RD10 ha ayudado probablemente a que M. bovis se convierta en un agente patógeno de los bovinos más potente que M. tuberculosis. Unos estudios genómicos funcionales determinarán qué función desempeñan estas supresiones en la diferenciación fenotípica del complejo tuberculoso.

Por último, los inventores han puesto en evidencia, siempre mediante la comparación del BAC de M. tuberculosis H37Rv y del BAC de M. bovis BCG, dos duplicaciones en el genoma de M. bovis BCG-Pasteur, denominados DU1 y DU2. Se trata de duplicaciones de regiones de varias decenas de kilobases que parecen estar ausentes al mismo tiempo de la cepa tipo de M. bovis y de M. tuberculosis H37Rv. La puesta en evidencia de estas dos duplicaciones se realizó a consecuencia de una digestión de los mismos clones para cada BAC con HindIII y un análisis sobre gel de electroforesis en campo pulsado (PFGE). Estas observaciones han sido confirmadas por la hibridación del ADN cromosómico digerido procedente de M. bovis BCG, de la cepa tipo de M. bovis y M. tuberculosis H37Rv con unas sondas seleccionadas que cubren las regiones duplicadas. Se han preparado unos cebadores específicos para las regiones reorganizadas y se han ensayado sobre el ADN genómico a partir de asilados adicionales de M. bovis BCG y M. tuberculosis.

Se ha determinado que DU1 y DU2 estaban presentes en tres cepas de M. bovis BCG, e incluso en M. bovis BCG-Pasteur y ausentes de otras tres sub-cepas de M. bovis BCG.

Estas dos duplicaciones están asimismo ausentes de la cepa tipo de M. bovis y de M. tuberculosis H37Rv.

Así, siempre en el marco de la presente invención en relación con la detección discriminante de M. bovis o M. tuberculosis, la invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de detección y de identificación discriminante de M. bovis BCG o M. tuberculosis en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas:

-: la digestión por una enzima de restricción de por lo menos una parte del genoma de la micobacteria presente en la muestra biológica a analizar, y

-: analizar los fragmentos de restricción así obtenidos.

La digestión por una enzima de restricción se puede realizar en efecto o bien sobre la totalidad del genoma de la micobacteria, o bien sobre uno o más clones del banco realizado a partir del genoma en cuestión.

Preferentemente, la enzima de restricción usada en el marco de dicho procedimiento es HindIII.

En lo que se refiere al análisis de los fragmentos de restricción, éste puede consistir en contar dichos fragmentos y/o en determinar su longitud. En efecto, tal como se explica a continuación, la digestión por HindIII de M. bovis BCG da lugar a un fragmento de más que los obtenidos después de la digestión por HindIII del genoma de M. tuberculosis H37Rv. El número de los fragmentos así obtenidos se puede completar asimismo por la determinación de su longitud. Esto se puede realizar por medio de técnicas bien conocidas por el experto en la materia, por ejemplo sobre un gel de electroforesis de campo pulsado (PFGE). Así, se ha podido determinar que el fragmento suplementario que aparece después de la digestión por HindIII del genoma de M. bovis BCG-Pasteur presentaba un tamaño de aproximadamente 29 kb.

Otra manera de analizar los fragmentos de restricción que resultan de la digestión enzimática del genoma de la micobacteria tal como se ha descrito anteriormente, consiste en poner en contacto dichos fragmentos con por lo menos una sonda apropiada, que cubre por ejemplo la región duplicada, en unas condiciones de hibridación con el fin de identificar después el número y el tamaño de los fragmentos que han hibridado. Las sondas usadas para ello pueden ser marcadas o no marcadas según las técnicas bien conocidas por el experto en la materia.

Así, la sonda se puede obtener mediante amplificación del ADN genómico con los cebadores seleccionados de entre el grupo constituido por SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 33 o SEC ID nº 34, siendo el par:

-: SEC ID nº 31/SEC ID nº 32 específico de DU1

-: SEC ID nº 33/SEC ID nº 34 específico de DU2

También se pueden analizar los fragmentos efectuando una amplificación de los fragmentos obtenidos con unos cebadores seleccionados de entre el grupo constituido por SEC ID nº 19, SEC ID nº 20, SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 27 y SEC ID nº 28 siendo:

-: SEC ID nº 19, SEC ID nº 20/SEC ID nº 21 específicos de JDU1

-: SEC ID nº 22, SEC ID nº 24/SEC ID nº 23, SEC ID nº 25 específicos de JDU2A

-: SEC ID nº 26/SEC ID nº 27, SEC ID nº 28 específicos de JDU2B

Por último, se pueden amplificar asimismo los fragmentos obtenidos con unos cebadores seleccionados de entre el grupo constituido por SEC ID nº 35, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37 y SEC ID nº 38 específicos de DU1 y después analizarlos mediante secuenciación.

Leyendas de las figuras

Figuras 1A A 1D: Mapa del BAC de Mycobacterium bovis BCG Pasteur superpuesta al BAC de M. tuberculosis H37Rv y a los mapas de cósmido (estas figuras se deben leer de izquierda a derecha y de arriba abajo, la figura 1A arriba a la izquierda, la figura 1B arriba a la derecha, la figura 1C abajo a la izquierda y la figura 1D abajo a la derecha).

Los clones "X" corresponden a los clones en pBeloBAC11 de M. bovis BCG, los clones "XE" corresponden a los clones en pBACe3.6 de M. bovis BCG, los clones "Rv" corresponden a los clones en pBeloBAC11 de M. tuberculosis, los clones "Y" corresponden a los clones en el cósmido pYUB328 de M. tuberculosis y los clones "I" corresponden a los clones en el cósmido pYUB412 de M. tuberculosis. La localización de cada región de supresión se muestra en el mapa. Las barras de escala indican la posición sobre el genoma de M. tuberculosis.

Figura 2A a 2F: Vista general de las regiones suprimidas RD5-RD10.

Las regiones suprimidas a partir del genoma de M. tuberculosis están delimitadas por unas flechas con una secuencia que flanquea cada supresión. Los ORF (marcos abiertos de lectura) se representan mediante unas cajas "dirigidas" que muestran el sentido de la transcripción tal como se ha descrito anteriormente (Cole et al., 1998). Las funciones putativas y las familias de los ORF se describen en la Tabla 3. Los codones stop se indican mediante unas pequeñas barras verticales.

Figura 3: Detección de la supresión RD5.

Unas digestiones del clon Rv143 de BAC con las endonucleasas EcoRI, PstI y StuI han revelado que unos fragmentos de 1,5 kb (EcoRI), 1,5 kb (PstI), 1,3 y 2,7 kb (StuI) no mostraban ninguna unión con unas sondas de ADN de M. bovis o de M. bovis BCG (las bandas que faltan están indicadas mediante unas flechas). El tamaño en kilobases (kb) se indica a la izquierda.

Figura 4: Las regiones RvD1 y RvD2.

A. Polimorfismo de tamaño en unos amplicones generados por unos cebadores que flanquean (i) RvD1 y (ii) RvD2. Se han realizado unas reacciones de PCR por medio del kit GeneAmp XL PCR (Perkin Elmer) con unas matrices de ADN de M. tuberculosis H37Rv, M. bovis y M. bovis BCG Pasteur en combinación con unos cebadores descritos en la Tabla 3. El tamaño en kilobases se indica a la izquierda de cada imagen.

B. Estructura de los ORF de los loci de RvD1 y RvD2. La secuencia de los dos loci se ha determinado a partir de M. bovis BCG Pasteur, mostrándose la secuencia flanqueante en M. tuberculosis H37Rv. Las funciones putativas de los ORF se describen en la Tabla 1 con unas barras verticales que representan los codones stop.

Figura 5: Región duplicada DU1 en M. bovis BCG-Pasteur en comparación con la misma región en M. tuberculosis H37Rv.

Figura 6: Región duplicada DU2 en M. bovis BCG-Pasteur en comparación con la misma región en M. tuberculosis H37Rv.

La presente solicitud no está limitada a la descripción anterior y se pondrá más claramente de manifiesto a partir de la descripción de los ejemplos siguientes que no se deben considerar de ninguna manera limitativos de la presente invención.

Ejemplos I. Procedimientos y resultados Construcción de un banco BAC de M. bovis BCG-Pasteur

Unos intentos anteriores para clonar unos insertos muy largos de ADN micobacterianos (120-180 kb) en el vector pBeloBAC11 han fracasado (Brosch et al., 1998). Para establecer si esta determinación de tamaño se debía al vector pBeloBAC11, los inventores han ensayado en paralelo el vector pBACe3.6 de BAC que usa el sistema de selección sacB (Lawes y Maloy, 1995; Pelicic et al., 1996). Unas uniones realizadas con unos fragmentos en unas gamas de tamaño de 50-125 kb han proporcionado 5 a 10 veces menos transformantes en pBACe3.6 que las uniones de control que usan pBeloBAC11 (clon X). El tamaño de un inserto en los clones pBACe3.6 estaba aproximadamente comprendido en el intervalo entre 40 y 100 kb, similar a lo que se había observado para pBeloBAC11. Esto sugiere que un tamaño de aproximadamente 120 kb es realmente el tamaño límite superior para la factibilidad de la clonación de ADN micobacteriano.

Definición del juego mínimo de los BAC de BCG

Se han secuenciado 100 clones seleccionados al azar a partir de los bancos de pBeloBAC11 y de pBACe3.6 en los extremos para determinar su posición con relación al cromosoma de M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998). Esto ha proporcionado una red mínima de clones sobre el genoma pero con un grupo preferencial en la proximidad del único operón rrn, lo que se ha observado asimismo durante la construcción del mapa de BAC de M. tuberculosis (Brosch et al., 1998). Para llenar los huecos entre los clones posicionados, se han elaborado unos cebadores de PCR, en base a la secuencia del genoma completo de M. tuberculosis, para cribar unos pools de BAC para unos clones específicos. Usando esta metodología, se han aislado unos clones que cubren más del 98% del genoma y se han posicionado sobre la secuencia del genoma de M. tuberculosis.

Fue necesario un juego mínimo de 57 clones de BAC de M. bovis BCG para cubrir el genoma (Figura 1). 56 de estos clones proceden del banco pBeloBAC11 y 1 procede del banco pBACe3.6, es decir, XE015 (a aproximadamente 680 kb). Debido a que unos experimentos anteriores habían mostrado que los clones de M. tuberculosis basados en pBeloBAC11 presentaban una excepcional estabilidad (Brosch et al., 1998), se han preferido estos clones al sistema pBACe3.6 menos caracterizado. El clon XE015 representa una región para la cual los clones de pBeloBAC11 no se podían encontrar. Dos zonas de aproximadamente 36-52 kb, no cubiertas por ningún clon, están localizadas a aproximadamente 2.660 kb y aproximadamente 2.960 kb sobre el genoma. Previamente, el aislamiento de cósmidos y de clones de BAC de M. tuberculosis que cubrían la región a aproximadamente 2.960 kb planteó ciertos problemas (Brosch et al., 198) lo que sugiere que esta región podría contener unos genes que son perjudiciales para E. coli.

Uso de los chips BAC para detectar unas supresiones en el genoma de M. bovis BCG

Se trata de la puesta en evidencia, a partir del banco de BAC de M. tuberculosis H37Rv, de 63 clones que cubren 97% del genoma (Brosch et al., 1998). El análisis in silico de la secuencia del genoma de M. tuberculosis ha revelado que la digestión de estos clones o bien con PvuII o bien con EcoRI daba lugar a un número razonable de fragmentos de restricción para cada clon. Los fragmentos digeridos han migrado a través de los geles de agarosa, han dado lugar a unos puntos sobre unas membranas y han sido hibridados después con ADN genómico marcado con ^{32}P de M. bovis BCG y M. bovis. Los fragmentos de restricción que no han hibridado con las sondas de ADN han sido considerados como ausentes en los genomas de M. bovis o BCG. Como el cribado inicial usaba sólo dos enzimas, es posible que otras supresiones hayan pasado desapercibidas. Sin embargo, es probable que todas las supresiones importantes (> 5 kb) hayan sido detectadas por este enfoque.

A partir de un análisis del conjunto del genoma, se han identificado 10 loci que parecen estar ausentes de M. bovis BCG con relación a M. tuberculosis. Unas hibridaciones con el ADN genómico de M. bovis han revelado que 7 de estos loci estaban suprimidos asimismo en M. bovis con relación a M. tuberculosis. Un análisis más preciso ha revelado que las tres supresiones específicas de M. bovis BCG eran idénticas a las regiones RD1-RD3 definidas por el equipo de Stover (Mahairas et al., 1996). Guardando la nomenclatura anterior, las 7 supresiones se han designado M. bovis/BCG RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 y RD10 (Figuras 1 y 2). Se han usado las reacciones de secuenciación que usan los clones de BAC correspondiente como matriz para definir precisamente las zonas terminales de las supresiones (Figura 2, Tabla 1).

RD4

RD4 es una supresión de 12,7 kb caracterizada anteriormente como una región ausente de M. bovis y M. bovis BCG de las sub-cepas Pasteur, Glaxo y Danemark (Brosch et al., 1998). Entre las proteínas codificadas por los 11 ORF, algunas muestran unos parecidos con unas enzimas implicadas en la síntesis de los lipopolisacáridos. Para determinar si RD4 era suprimido sólo en las cepas bovinas, M. africanum, M. microti, M. tuberculosis CSU#93 y 27 aislados clínicos de M. tuberculosis han sido examinados para la presencia del locus (Tabla 2). Unas reacciones de PCR que usan unos cebadores internos a RD4 (Tabla 3) sólo han generado unos productos en unas cepas no bovinas.

RD5

RD5 tiene un tamaño de 8.964 pb localizados entre las posiciones genómicas 2626067-2635031 (Figura 3, Tabla 1). La región contenía 8 ORF (Tabla 1), tres de ellos: plcA, plcB y plcC, codifican para unas enzimas de fosfolipasa C mientras que otros dos codifican para unas proteínas que pertenecen respectivamente a las familias de ESAT-6 y QILSS (Cole et al., 1998; F. Tekaia, S. Gordon, T. Garnier, R. Brosch, B. G. Barrell y S. T. Cole, presentado). El ORF Rv2352c codifica para una proteína PPE que es un miembro de la gran familia de las proteínas en M. tuberculosis (Cole et al., 1998). Otra proteína de la familia de PPE (Rv2352c) está truncada en M. bovis BCG debido a que una de las supresiones de las partes terminales está situada en el ORF. Unas búsquedas en las bases de datos han revelado que un segmento de 3.013 pb de RD5 era virtualmente idéntico al locus mpt40 descrito anteriormente, mostrado por Pattaroyo et al., como ausente en M. bovis y M. bovis BCG (Leao et al., 1995). Se han usado unos cebadores destinados a amplificar la parte interna de RD5 (Tabla 3) en unas reacciones de PCR con ADN que procede de bacilos tuberculosos variados. No se ha producido ningún amplicón a partir de las matrices de M. bovis, M. bovis BCG y M. microti (Tabla 2), lo que indica que M. microti está asimismo desprovisto del locus RD5.

RD6

RD6 ha sido cartografiado a nivel de la secuencia de inserción IS1532, un elemento IS que falta en M. microti, M. bovis y M.bovis BCG (Gordon et al., 1998) (Tabla 1). La delimitación del tamaño de la supresión se ha complicado por la presencia de regiones repetidas que flanquean directamente el elemento IS y que necesitan el uso de cebadores fuera de la región repetida (Tabla 3). Estos cebadores han amplificado unos productos en M. bovis y M. bovis BCG que son aproximadamente 5 kb más pequeños que el amplicón de M. tuberculosis. Se ha utilizado el método con ayuda de cebador para localizar precisamente las uniones de supresiones y ha revelado una supresión de 4928 pb en M. bovis y M. bovis BCG (posición genómica de M. tuberculosis 3846807-3841879). Al igual que el elemento IS1532, se ha determinado que RD6 contenía dos genes que codifican para unas proteínas PPE (Rv3425 y Rv3426) y una parte de Rv3424c cuya función se desconoce (Tabla 1).

RD7

La supresión RD2 descrita en Mahairas et al. (Mahairas et al., 1996) ha sido cartografiada en el clon Rv420 de M. tuberculosis y los resultados obtenidos por los inventores han sugerido la existencia de una supresión suplementaria en M. bovis BCG muy cercana de RD2. Se han repetido una hibridaciones usando ADN genómico de M. bovis como sonda, puesto que esta cepa contiene unas secuencias RD2, simplificando así la identificación de otros fragmentos suprimidos. Este análisis (Figura 2) ha revelado una supresión de 12.718 pb en M. bovis BCG con relación a M. tuberculosis, localizada 336 pb corriente arriba de RD2, en las posiciones 2208003-2220721 sobre el genoma de M. tuberculosis. La región RD7 contiene 14 ORF (Tabla 3). 8 de ellos (Rv1964-1971) constituyen una parte del operón con el gen putativo de invasina mce3 (Cole et al., 1998). Los ORF Rv1968, Rv1969, Rv1971, Rv1973 y Rv1975 podrían codificar para unas eventuales proteínas exportadas o expresadas en la superficie puesto que contienen unas secuencias señal N-terminales putativas o unos anclajes membranarios. Todas son miembros de la familia Mce y tienen unas propiedades comunes (Tekaia et al., presentado). De manera interesante, Mce3 y Rv1968 contienen el tripéptido "RGD" o Arg-Gly.Asp, un motivo implicado en el enganche celular (Ohno, 1995; Relman et al., 1989). Rv1977, que está truncado por RD7, codifica para una proteína que presenta unas similitudes (38,5% de identidad sobre 275 aminoácidos) con un polipéptido hipotético y la cepa PCC 6803 de Synechocystis. Un análisis PCR (Tabla 2) ha revelado que RD7 estaba presente en 30 aislados clínicos de M. tuberculosis así como en M. africanum y M. tuberculosis CSU#93. El locus estaba sin embargo ausente de M. microti, M. bovis y M. bovis BCG.

RD8

RD8 engloba una región de 5.895 pb posicionada sobre la secuencia genómica de M. tuberculosis a 4556836-4062731. La supresión contiene 6 ORF (Figura 2, Tabla 1) con un séptimo ORF: IpqQ que codifica para una lipoproteína truncada en su extremo 5' por la supresión. Entre estos 6 ORF, Rv3619c y Rv3620c codifican para unos miembros de las familias de ESAT-6 y QILSS (Cole et al., 1998, Harboe et al., 1996; F. Tekaia, et al., presentado) y otros 2 ORF codifican para unas proteínas PE y PEE. Los 2 otros ORF, ephA y Rv3618 codifican respectivamente para una hidrolasa epóxido putativa y para una monooxigenasa. El análisis PCR dirigido contra un segmento interno de RD8 (Tabla 2) ha revelado que la región estaba asimismo suprimida en el tipo salvaje de M. bovis y M. microti.

RD9 y RD10

La supresión de 2.030 pb englobada por RD9 cubre 2 ORF, Rv2037c y Rv2074, que codifican probablemente de forma respectiva para una oxidoreductasa y una proteína desconocida (Tabla 1). 2 ORF adicionales están truncados por RD9: Rv2075c codifica para una proteína exportada putativa mientras que cobL codifica para una metiltransferasa precorrina implicada en la síntesis de la cobalamina. El análisis PCR con unos cebadores flanqueantes (Tabla 3) ha revelado que RD9 está asimismo presente en M. africanum y M. microti (Tabla 2). RD10 es una supresión de 1.903 pg que trunca 2 ORF, echA1 y Rv0223, que codifican una enoil CoA hidratasa y una aldehído deshidrogenasa respectivamente (Tabla 1). Unas reacciones de PCR han revelado que RD10 estaba ausente en M. microti así como en M. bovis y BCG.

Otras diferencias entre M. tuberculosis y BCG

Teniendo en cuenta el hecho de que los genomas de los bacilos tuberculosos están altamente conservados (Sreevatsan et al., 1997), la comparación local directa se puede emprender de manera simple y determinada examinando los perfiles de enzima de restricción generados a partir de los clones de BAC de M. tuberculosis y M. bovis BCG que cubren las mismas regiones. Una cartografía comparativa de la zona englobada por el clon X318 ha identificado esta zona como muy diferente de los clones correspondientes de M. tuberculosis. Los datos relativos a las secuencias terminales a partir del clon X066 han revelado que si su secuencia terminal SP6 permitía posicionarlo a aproximadamente 2.380 kb sobre la matriz de M. tuberculosis, la secuencia terminal T7 no generaba ninguna similitud significativa con cualquier secuencia de H37Rv, indicando que un extremo de X066 era interno al segmento de ADN presente en BCG pero ausente de H37Rv. Se han utilizado unos cebadores de secuenciado para caminar a lo largo del clon X318 del BAC de BCG (Figura 1) y han revelado la inserción en la posición 2.238.724 pb en el genoma de M. tuberculosis. Usadas en unas reacciones PCR, las matrices de M. bovis BCG y M. bovis han generado unos amplicones aproximadamente 5 kb más grandes que el producto de M. tuberculosis H37Rv (Figura 4A). El inserto completo, designado RvD1, ha sido secuenciado a partir de X318 BCG. El inserto de 5.014 pb prolongaba el ORF, Rv2024c de M. tuberculosis de 2,8 kb y contenía un ORF adicional, RvD1-ORF2, de 954 pb (Tabla 1, Figura 4B). RvD1-ORF1 se superpone en el punto de unión 5' de la supresión y se extiende en el interior del ADN flanqueante. El análisis FASTA ha revelado que RvD1-ORF1 y ORF2 codifican para unas proteínas que no presentan ninguna similitud significativa con otras proteínas en las bases de datos. Rv2024c extendido ha mostrado ciertas similitudes (36,5% de identidad sobre 946 aminoácidos) con una proteína hipotética de Helicobacter pylori (nº de registro 025380). La pérdida de esta secuencia no tiene claramente ninguna consecuencia sobre la virulencia de M. tuberculosis H37Rv puesto que esta cepa es totalmente virulenta en los modelos animales. Un análisis PCR específico del locus ha demostrado su presencia en varios, pero no en todos, los aislados clínicos así como en todas las cepas BCG ensayadas (Tabla 2).

Un ORF que codifica para una fosfolipasa, plcD, está interrumpido por IS6110 en M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998). Para determinar si plcD estaba intacto en otros miembros del complejo tuberculoso, se han usado unos cebadores que flanqueaban el sitio de inserción IS6110 (Tabla 3) en unas reacciones de PCR con M. bovis, M. bovis BCG y M. tuberculosis H37Rv. Esto ha revelado un polimorfismo al locus plcD en el que los amplicones de M. bovis y de M. bovis BCG eran aproximadamente 5 kb más grandes que el producto de H37Rv (Figura 4A). Esta supresión de aproximadamente 5 kb en el genoma de M. tuberculosis H37Rv con relación a M. bovis BCG se ha denominado RvD2. La secuenciación del clon X086 del BAC de M. bovis BCG ha revelado que RvD2 estaba posicionado entre las bases 1987699-19890045 en el genoma de M. tuberculosis. La región comprende 6,5 kb y contiene 3 ORF que codifican para una proteína desconocida, una oxidorreductasa y una proteína membranaria, y prolonga el gen plcD para codificar para un producto de 514 aminoácidos (Figura 4B, Tabla 1).

II. Datos experimentales Cepas bacterianas y plásmidos

Las cepas del complejo de M. tuberculosis (Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis y Mycobacterium bovis BCG) y sub-cepas de M. bovis BCG (Danemark, Glaxo, Russe, Japonais, Pasteur y Moreau) se han obtenido a partir de los stocks de laboratorios (Unidad de G.M.B., Instituto Pasteur). Mycobacterium tuberculosis CSU#93 ha sido proporcionado por John BELISLE, Department of Microbiology, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523. Unos aislados clínicos no epidérmicos de M. tuberculosis han sido proporcionados por Beate HEYM, Hopital Ambroise Paré, 9 avenida Charles de Gaulle, 92104 BOULOGNE CEDEX, FRANCIA. Los vectores de BAC pBeloBAC11 (Kim et al., 1996) y pBACe3.6 (Genbank nº de registro U80929) han sido proporcionados por H. SHIZUYA, Department of Biology, California Institute of Technology, Pasadena, CA, y P. de JONG, Roswell Park Cancer Institute, Human Genetics Department, Buffalo, NY, respectivamente. Los vectores y los recombinantes derivados han sido mantenidos en E. coli DH10B.

Preparación del ADN genómico

La preparación del ADN genómico en unas cubas de agarosa a partir de M. bovis BCG Pasteur se ha realizado como se ha indicado anteriormente (Philipp et al., 1996; Philipp et al., 1996) pero con dos digestiones con proteinasa K durante 24 h cada una, mejor que con una digestión de 48 horas. Se han almacenado las cubas en EDTA 0,2 M a 4ºC y se han lavado 2 veces en 50 ml de Tris-EDTA (pH 8)/Triton X-100 (0,1%) a 4ºC durante 1 h, y se han lavado a continuación 2 veces en 50 ml de un tampón de enzima de restricción Triton X-100 (0,1%) durante 1 h a temperatura ambiente antes de su utilización.

Construcción del banco BAC

Se ha preparado un vector de ADN tal como se ha indicado anteriormente (Woo et al., 1994). Se han realizado unas digestiones parciales con HindIII y EcoRI del ADN en agarosa, para la clonación en pBeloBAC11 y pBACe3.6 respectivamente, y después una migración en campo eléctrico homogéneo de contorno preciso (CHEF) tal como se ha descrito anteriormente (Brosch et al., 1998). Se han escindido 5 zonas, 50-75 kb, 75-100 kb, 100-125 kb, 125-150 kb y 150-170 kb a partir de los geles de agarosa y se han almacenado en TE a 4ºC. Se han realizado unas ligaduras con los vectores pBeloBAC11 y pBACe3.6 y una transformación en E. coli DH10B tal como se ha descrito anteriormente (Brosch et al., 1998). Los transformantes pBeloBAC11 han sido seleccionados sobre agar LB que contiene 12,5 \mug/ml de cloramfenicol, 50 \mul/ml de X-gal y 25 \mug/ml de IPTG, y han sido cribados después con unas colonias recombinantes blancas. Los transformantes pBACe3.6 han sido seleccionados sobre agar LB que contiene 12,5 \mul/ml de cloramfenicol y 5% de sacarosa. Los clones recombinantes han sido re-inoculados, en dos ejemplares, en unas placas de microtitulación de 96 pocillos que contienen un medio 2xYT con 12,5 \mug/ml de cloramfenicol y han sido incubados toda la noche a 37ºC. Se añadió entonces un volumen igual de glicerol al 80% a los pocillos y se conservó una placa a -80ºC como placa maestra. La placa restante se usó para realizar unos conjuntos de clones con fines de cribado (véase anteriormente).

Preparación de ADN a partir de recombinantes y determinación del tamaño de los insertos

Se ha preparado un recombinante que comprende un plásmido de ADN a partir de 40 ml de cultivo y se ha puesto en crecimiento sobre el medio 2xYT que contiene 12,5 \mug/ml de cloramfenicol tal como se ha descrito anteriormente (Brosch et al., 1998). Se han digerido 100-200 ng de ADN con DraI (Gibco-BRL) y se han separado los productos de restricción sobre un gel de electroforesis en campo pulsado (PFGE) con un aparato CHEF de LKB-Pharmacia que usa un gel de agarosa al 1% (peso/volumen) y un impulso de 4 segundos durante 15 h a 6,25 V/cm. Se han usado unos marcadores PFGE de tamaño medio e inferior (New England Biolabs) como tamaño estándar. Los tamaños de los insertos han sido estimados después de la coloración con bromuro de etidio y de la visualización con luz UV.

Reacciones de secuenciación

Se han realizado unas reacciones de secuenciación tal como se ha indicado anteriormente (Brosch et al., 1998). Para unos clones aislados a partir del banco de pBeloBAC11, se han usado los cebadores SP6 y T7 para secuenciar los extremos de los insertos, mientras que para los clones pBACe3.6 se han usado los cebadores derivados del vector. Las reacciones han sido cargadas sobre unos geles de poliacrilamida al 6% y se ha realizado una electroforesis con un secuenciador de ADN automático 373A o 377 (Applied Biosystems) durante 10 a 12 h. Las reacciones han proporcionado generalmente entre 300 y 600 pb de secuencias legibles.

Chips BAC

Se han seleccionado los clones que se superponían a partir del banco pBeloBAC11 de M. tuberculosis H37Rv (Brosch et al., 1998) de tal manera que el 97% del genoma de M. tuberculosis estaba representado. Se ha digerido el ADN preparado a partir de estos clones con EcoRI (Gibco-BRL) o PvuII (Gibco-BRL) y se ha migrado en unos geles de agarosa al 0,8%, de 25 cm de longitud, con un bajo voltaje durante 12 a 16 h. Después de la coloración y de la visualización con UV, se han tratado los geles de agarosa con el método Southern estándar y se han transferido los ADN sobre unas membranas de nitrocelulosa Hybond-C Extra (Amstersham). Se ha fijado el ADN a la membrana mediante calor a 80ºC durante 2 h. Se ha marcado el ADN genómico de M. tuberculosis H37Rv, Mycobacterium bovis ATCC 19210 y M. bovis BCG Pasteur con [\alpha-^{32}P]dCTP mediante el kit Prime-It II (Stratagene). Se han purificado las sondas a través de una columna P10 (Biorad) antes de su uso. Se han realizado unas hibridaciones tal como se ha descrito anteriormente (Philipp et al., 1996). Se han puesto en disolución las sondas marcadas purificadas en una disolución de 5xSSC (1xSSC es 0,5 M de cloruro de sodio; 0,015 M de citrato de sodio), y 50% (peso/volumen) de formamida. Se ha realizado la hibridación a 37ºC, y se han lavado las membranas durante 15 min. a temperatura ambiente en 2xSSC/SDS al 0,1%, y después en 1xSSC/SDS al 0,1% y por último en 0,1xSSC/SDS al 0,1%. Se han interpretado los resultados a partir de los autorradiogramas. En general, fue difícil visualizar sobre los autorradiogramas los fragmentos de menos de 1 kb, sobre todo después de la utilización repetida de las membranas. Los fragmentos superiores a 1 kb han dado unos resultados más claros. Los clones aparecidos que contienen unos fragmentos sin contrapartida en M. bovis BCG han sido re-inoculados para unos análisis ulteriores. La secuencia genómica ha permitido el establecimiento de mapas de restricción con el objetivo de determinar las zonas de supresión sospechadas, permitiendo seleccionar unas enzimas que proporcionan la mejor resolución de las regiones. Así, unos clones podían ser digeridos con una segunda gama de enzimas (generalmente PstI y StuI, con EcoRI incluido como control) e hibridados para obtener un tamaño más preciso de la supresión. Los cebadores de secuenciación que flanquean las supresiones han sido así designados y usados en las reacciones de secuenciación con el BAC correspondiente de M. bovis BCG usado como matriz.

Análisis PCR

Los cebadores usados en las reacciones de PCR se listan en las Tablas 3 y 4. Se han realizado las reacciones para unos productos esperados de menos de 3 kb con una polimerasa Taq estándar (Boehringer Mannheim). Las reacciones utilizaban 5 \mul de tampón 10xPCR (100 mM de \beta-mercaptoetanol, 600 mM de Tris HCl, pH 8,8), 20 mM de MgCl_{2}, 170 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 5 \mul de mezcla nucleotídica a 20 mM, 0,2 \muM de cada cebador, 10-50 ng de matriz de ADN, DMSO al 10%, 0,5 unidades de polimerasa Taq y agua destilada estéril a 50 \mul. Se han realizado los ciclos térmicos con un amplificador PTC-100 (MJ Inc.) con una etapa de desnaturalización inicial de 90 segundos a 95ºC seguida por 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 1 min. a 55ºC y 2 min. a 72ºC.

Las reacciones de PCR susceptibles de dar lugar a unos productos superiores a 3 kb se han realizado por medio del kit de PCR GeneAmp XL (Perkin Elmer). Se han llevado a cabo las reacciones según las instrucciones de los fabricantes, con 0,8 mM de Mg(OAc)_{2}, 0,2 \muM de cada cebador y 10-30 mg de matriz de ADN por reacción. Los ciclos térmicos se llevaron a cabo a 96ºC durante 1 min., seguidos a continuación por 15 ciclos en 2 etapas a 94ºC durante 15 segundos y 70ºC durante 7 min., seguidos de 20 ciclos en 2 etapas a 94ºC durante 15 segundos y 70ºC durante 8 min. más 15 segundos por ciclo.

Análisis informático

Se han transferido los datos que se refieren a las secuencias del secuenciador automatizado ABI373A a las estaciones de trabajo Digital o Sun, y se han editado por medio del programa TED a partir del conjunto Staden. Se han comparado las secuencias editadas con la base de datos de los inventores que se refiere a M. tuberculosis (H37Rv.dbs) para determinar las posiciones relativas de las secuencias terminales sobre la secuencia del genoma de M. tuberculosis. Con este método, se ha construido una cartografía de los clones BAC de M. bovis BCG usando la secuencia de M. tuberculosis H37Rv como matriz.

Para realizar la comparación genómica, se han realizado unas digestiones in silico mediante unas enzimas de restricción con el programa NIP (Nucleotide Interpretation Program) a partir del conjunto Staden. Se ha usado el programa Display and Analysis (DIANA) del centro Sanger, Cambridge, UK, para interpretar los datos de secuencia.

Números de registro de las secuencias de ADN

Las secuencias nucleotídicas que flanquean cada locus RD en M. bovis BCG han sido depositadas en la base de datos EMBL. Los números de registro para RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 y RD10 son respectivamente AJ007300, AJ131209, AJ007301, AJ131210, Y181604 y AJ132559. Las secuencias de RvD1 y RvD2 en M. bovis BCG han sido depositadas con los n^{os} Y18605 e Y18606 respectivamente.

Puesta en evidencia de la región duplicada DU1

DU1 ha sido la primera región duplicada observada cuando se han comparado las bandas de digestión por HindIII del clon X038 del BAC de BCG y del clon Rv13 del BAC de H37Rv. Los dos clones X038 y Rv13 tenían unas secuencias terminales idénticas, que se extienden de la posición HindIII \sim3.67 kb al sitio HindIII \sim0027 kb (a través de 4.411.529 b) sobre la secuencia del genoma de M. tuberculosis H37Rv (MTBH37RV), englobando el origen de replicación.

El análisis in silico de los sitios de restricción HindIII para la zona dada entre \sim4.367 kb y \sim0027 kb ha revelado un sitio HindIII en la posición \sim4.404 kb. Por consiguiente, la digestión de estos clones debería mostrar dos fragmentos de restricción más la banda específica del vector a aproximadamente 8 kb. Fue el caso para el clon Rv13 de H37Rv. Por el contrario, el clon X038 del BAC de BCG mostraba tres bandas más la banda específica del vector a aproximadamente 8 kb, dos de ellas eran idénticas al esquema de Rv13. La banda adicional presenta un tamaño de aproximadamente 29 kb. Unos análisis PFGE suplementarios que usan DraI han revelado que X038 es realmente 29 kb más largo que Rv13. Mediante un cribado PCR de los pools del BAC de BCG que usa unos oligonucleótidos seleccionados, los inventores han podido identificar tres clones X de más que cubren las partes de esta región genómica en BCG: X585, X592, X703. La secuencia terminal y el análisis PFGE han mostrado que cada uno de estos clones contiene un inserto de tamaño diferente, que corresponde a las tres bandas observadas en los resultados de digestión de X038 (Figura 5).

Las secuencias terminales son: X585 (\sim4.367-4.404 kb); X592 (\sim4.404-4.404 kb); X703 (\sim4.404-0027 kb). Las secuencias han sido repetidas dos veces con los mismos resultados. El resultado curioso según el cual el clon X592 tiene unos extremos T7 y SP6 en la misma región genómica se podía explicar por una duplicación de esta región genómica en BCG y ha dado asimismo la indicación sobre la dimensión de la reorganización. Unos análisis de restricción comparativos adicionales de los clones X585, X592, X703 y X038 con EcoRI han revelado que X592 y X703 tienen el mismo esquema de restricción con la excepción de una banda de 10 kb presente en X703 pero ausente de X592. En base a estos resultados, se han preparado unos cebadores para la amplificación de la región de unión en la que el segmento de ADN duplicado se une a la región única.

El análisis PCR con unos cebadores a 16.000 y 4398.700 pb (SEC ID nº 19 y 21) ha dado un producto de un tamaño esperado a partir del clon X592 y asimismo sobre el ADN genómico de BCG-Pasteur. La secuenciación de los productos PCR obtenidos directamente sobre el ADN de BAC del clon X592 ha revelado que la unión estaba realmente localizada en las bases 16,732/4398,593 en comparación con la secuencia genómica de H37Rv y que esta reorganización genómica resultaba en la truncadura de los genes Rv3910 y pknB. Sin embargo, en la medida en la que esta reorganización es una duplicación en tándem, unas copias intactas de los dos genes podían estar presentes en las regiones cercanas. El análisis PCR con unos cebadores flanqueantes de los genes Rv3920 y pknB ha confirmado esto cuando se ha utilizado el ADN genómico del BCG-Pasteur y de M. tuberculosis H37Rv. Una prueba adicional de la reorganización ha sido obtenida usando un fragmento PCR de 500 pb que engloba la región oriC de H37Rv como sonda marcada con ^{32}P para hibridar los productos de digestión del ADN genómico de M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG-Pasteur en las condiciones astringentes descritas anteriormente (Philipp et al., 1996). Mientras que en M. bovis y M. tuberculosis, se ha detectado una banda de tamaño medio de aproximadamente 35 kb, en M. bovis BCG-Pasteur dos bandas han hibridado, una de aproximadamente 35 kb y la otra de 29 kb. En conclusión, DU1 corresponde a una duplicación en tándem de 29.668 pb que resulta en una merodiploidia para la región sigM-pabA (Rv3911-Rv0013).

El análisis PCR que usa unos cebadores a 16,000F (SEC ID nº 19) o 16,500F (SEC ID nº 20) (cebadores sentido) y a 4398,770R (SEC ID nº 21) (cebador inverso) sobre el ADN genómico de cepas variadas de BCG (Pasteur, Glaxo, Cophenhague, Russie, Prague, Japon) ha revelado que se han obtenido unos productos sólo a partir de tres cepas incluyendo M. bovis BCG-Pasteur. Las otras tres cepas han dado siempre unos resultados negativos a pesar de la confirmación de los controles positivos.

Como se esperaba, la cepa tipo de M. bovis y de M. tuberculosis H37Rv era asimismo todavía negativa. Un resumen de los datos de cartografía se muestra en la Figura 5.

La región dnaA-dnaN se observa de manera general como el origen de replicación funcional de las micobacterias en la medida en la que después de la inserción en unos plásmidos de los que falta su propio origen de replicación, la capacidad para replicarse de manera autónoma ha sido restaurada. En la medida en la que BCG-Pasteur es diploide para la región dnaA-dnaN, los inventores han estudiado si existían unas diferencias entre los nucleótidos de las dos copias presentes sobre los dos clones BAC X592 y X703. El análisis de la secuencia del ADN de los BAC usando unos cebadores de regiones flanqueantes e internas de la región intergénica dnaA-dnaN no ha revelado ninguna diferencia entre las dos copias de la región mínima oriC. Además, estas secuencias eran idénticas a las dadas a conocer en la bibliografía para esta cepa de BCG. Este estudio sugiere que las dos copias de oriC deberían ser funcionales.

Puesta en evidencia de la región duplicada DU2

La segunda gran reorganización genómica observada en el cromosoma de M. bovis BCG-Pasteur se ha encontrado mediante el análisis de varios clones de BAC de BCG que cubren una región genómica de aproximadamente 200 kb (3.550-3.750 kb). Sus tamaños evaluados mediante PFGE no eran acordes con los esperados a partir del genoma de H37Rv y de los datos relativos a las secuencias terminales. Las comparaciones directas han sido complicadas por la presencia de un elemento IS6110 en esta región del cromosoma de M. tuberculosis H37Rv que ha conducido a una pequeña supresión RvD5.

Las secuencias terminales del BAC X495 eran ambas localizadas en los alrededores del sitio HindIII a 3.594 kb, mientras que los resultados PFGE mostraban que el clon tiene un tamaño de aproximadamente 106 kb, que contiene tres fragmentos HindIII, de aproximadamente 37,5 kb, aproximadamente 37 kb y aproximadamente 24 kb además del vector. La banda de 24 kb era aproximadamente 2 kb más larga que el fragmento correspondiente HindIII de 22 kb en Rv403. Esta observación ha llevado a la hipótesis de que la región genómica en los alrededores de 3.594 kb debía haber sido duplicada, dando esto lugar a la introducción de un nuevo sitio HindIII donde termina el clon X495. Para demostrarlo, se han ensayado varios cebadores en la región cromosómica de 3.589 kb a 3.594 kb para la secuenciación del ADN del BAC X495 y se ha identificado una unión (JDU2A) en las bases 3690124/3590900 con relación a la secuencia genómica de H37Rv. Esto conducía a una interrupción del gen lpdA (Rv3303) pero los resultados de PCR han indicado que una copia intacta de este gen está presente en la región duplicada.

El análisis sistemático de otros clones en la proximidad ha permitido la identificación de 2 BAC independientes del BCG (X094 y X1026) que comprendían el mismo fragmento cromosomal 3.594 a 3.749 kb. Aunque los datos de secuencias terminales sugerían que estos clones debían tener un tamaño de aproximadamente 155 kb, el tamaño estimado por unas digestiones por HindIII o DraI seguidas por una separación por PFGE era sólo de aproximadamente 100 kb. Esta diferencia indicaba que los insertos de clones X094 y X1026 se extendían probablemente de los sitios repetidos HindIII a 3.594 kb al sitio auténtico HindIII en la posición 3.749 kb, y que una supresión interna había tenido lugar en el interior de la unidad duplicada.

Esto se ha confirmado mediante unos experimentos de hibridación en las condiciones astringentes descritas anteriormente sobre un ADN genómico, digerido por HindIII, de M. tuberculosis H37Rv, M. bovis y BCG-Pasteur usando un ADN del clon X495 radiomarcado. El tamaño de una de las bandas que se hibridaban con este ADN en los perfiles HindIII de M. tuberculosis H37Rv y M. bovis era de aproximadamente 22 kb, mientras que la banda correspondiente en BCG era de 24 kb, exactamente lo que se observaba con los clones BAC. Además, los resultados de hibridación mostraban que una banda de 34 kb en el perfil HindIII del clon X094 se hibridaba asimismo con el ADN genómico del clon X495, lo que confirmaba que los clones X094 y X1026 contenían ADN duplicado de la región genómica cubierta por X495. Unas reacciones de PCR y la secuencia del ADN del clon BAC X094 han permitido la identificación de un segundo punto de unión JDU2B en una posición equivalente a 3608471/3671535 en M. tuberculosis H37Rv. Esto confirmaba que DU2 resultaba de una duplicación directa de una región de 99.225 pb que corresponde a las secuencias entre las posiciones 3590900 y 3690124 en el genoma de M. tuberculosis H37Rv, y que una supresión interna de 63.064 había tenido lugar después. La unidad residual DU2 presenta así una longitud de 36.162 pb, lo que es coherente con los datos de cartografía, y BCG-Pasteur es diploide para los genes Rv3213c-Rv3230c, y Rv3290c-Rv3302c.

Por último, unos experimentos de PCR, de cartografía por PFGE y de secuenciación de las secuencias terminales con el BAC X094 han sugerido que el BCG-Pasteur contenía ADN adicional en la región cromosomal del sitio HindIII 3.691 a 3.749 kb. La comparación directa con el clon BAC Rv403 de M. tuberculosis ha permitido la puesta en evidencia de dos sitios suplementarios HindIII en esta región en la medida en la que los fragmentos HindIII de 48 kb presentes en Rv403 (correspondiente al fragmento de 3.691 a 3.749) estaban representados por dos bandas de 22 y 36 kb en BCG. Esta región del cromosoma de M. tuberculosis H37Rv contiene una copia de IS6110 que no está flanqueada por las unidades repetidas características directas de 3 pb. Está claro ahora que había inicialmente dos copias de IS6110 que han servido como sustrato para un evento de recombinación. Esto ha dado lugar a la supresión de un segmento de 4 kb del genoma de M. tuberculosis H37Rv (RvD5), que está todavía presente en BCG, al igual que en M. bovis y los aislados clínicos de M. tuberculosis. El análisis de la secuencia de esta región ha indicado que este fragmento de 4 kb contiene dos sitios HindIII y que falta en éste la secuencia IS6110 que está presente en este sitio en M. tuberculosis H37Rv. Usando unos cebadores internos para RvD5 (Tabla 4), los inventores han obtenido unos amplicones con el ADN genómico de todas las cepas de M. bovis BCG ensayadas y la cepa de M. bovis, al igual que con el ADN de clones X094 y X1026, pero no con las cepas de M. tuberculosis H37Rv y H37Ra.

Unos experimentos con múltiples juegos de cebadores (3689.500F (SEC ID nº 22) ó 3689.900F (SEC ID nº 24) (sentido) 3591.000R (SEC ID nº 23), 3591.500R (SEC ID nº 25) ó 3592.000R (inversa)) para amplificar la región de unión a nivel de la base 3690124/3590900 (descrita anteriormente) en diferentes cepas de M. bovis BCG han revelado que unos amplicones se podían obtener sólo a partir de M. bovis BCG-Pasteur y a partir de otras dos sub-cepas de BCG, mientras que las otras sub-cepas de BCG no daban ningún amplicón. La confirmación de los resultados se podrá realizar sobre unos puntos HindIII hibridados con el ADN marcado procedente de la región 3689500F-3690.000R que debería dar lugar a unas bandas con unas cepas de BCG reorganizadas, una de ellas presenta un tamaño de aproximadamente 24 kb, aproximadamente 2 kb de más que la banda correspondiente en las digestiones genómicas de M. bovis y de M. tuberculosis. La segunda banda de aproximadamente 35 kb debería sólo estar presente en las cepas reorganizadas y no en M. tuberculosis H37Rv o la cepa tipo de M. bovis (Figura 6).

El cribado de clones de 2000 X y XE (Gordon et al., 1999) para unos BAC que contienen al mismo tiempo las uniones JDU2A y JDU2B, es decir, que cubren la región completa reorganizada, ha permitido la identificación de tres BAC (X1070, XE377 y XE256) que han producido unos amplicones con los dos juegos de cebadores. Se ha estimado que los insertos son respectivamente de un tamaño de 95, 86 y 97 kb por PFGE. En base a estos resultados de PCR, de los datos que corresponden a las secuencias terminales y de la presencia de tres fragmentos cromosomales HindIII de 37, 36 y 24 kb, los inventores han concluido que el clon X1070 solapa el clon X495, y sin embargo, contenía un fragmento cromosomal HindIII de 36 kb que no estaba presente ni en el clon X495 ni en el clon X094 y, con los datos de secuencias terminales, esto sugería la presencia de una tercera copia del sitio HindIII a 3.594 kb en la región reorganizada. Se han obtenido nuevas pruebas de ello cuando se han analizado los clones XE256 y XE377 aislados de un banco EcoRI en pBACe3.6. En función de los datos de las secuencias terminales, XE256 se extiende del sitio EcoRI a 3.597 kb al sitio EcoRI a 3.713 kb, y XE377 del sitio EcoRI a 3.679 kb al sitio EcoRI a 3.715 kb. El hecho de que estos clones daban de manera repetida unos amplicones para las dos regiones de unión citadas JDU2A y JDU2B no era acorde con sus tamaños y sus secuencias terminales. Sin embargo, estos datos eran coherentes con el hecho de que la región de 36.162 pb de DU2 estaba presente no sólo como una sino más bien como dos copias en tándem. La hibridación (según el método de Philipp et el., 1996) de los fragmentos de ADN digerido por HindIII de los clones XE256, X1070 y XE377 con una sonda de 0,5 kb de la región genómica 3.675 kb ha confirmado los resultados de PCR. Un fragmento de 24 kb del clon X1070 se hibridaba, equivalente al del clon X495, y un fragmento único de 36 kb que corresponde a una copia adicional de DU2 también estaba presente. Dos fragmentos de 33 y 34 kb del clon XE256 se hibridaban con la sonda. El fragmento de 33 kb corresponde a una región que se extiende del sitio HindIII presente en el vector adyacente al sitio EcoRI de clonación al sitio HindIII más cercano en el inserto micobacteriano, mientras que el fragmento de 34 kb es idéntico al presente asimismo en el clon X094. El fragmento de 33 kb solapaba en parte el clon X1070 mientras que el fragmento de 34 kb HindIII era idéntico al presente en los clones X094 y XE377.

Estos datos indicaban que dos copias en tándem de DU2 existen en el genoma de BCG-Pasteur. Esto se ha confirmado mediante las hibridaciones de los productos de digestión por HindIII del ADN genómico de BCG-Pasteur, M. tuberculosis H37Rv y M. bovis puesto que todos se hibridaban con la sonda 3.675. Tal como se esperaba, se ha observado sólo una banda de 22 kb con M. tuberculosis y M. bovis mientras que se han detectado tres bandas de 24, 34 y 36 kb, mediante hibridación, en el genoma de BCG-Pasteur. Sin embargo, la señal de hibridación para el fragmento a 36 kb era muy baja. El hecho de que las bandas de 24 y 36 kb presentes en el clon de BAC X1070 se hibridan con la sonda 3675 con la misma intensidad, a pesar de que las presentes en el ADN genómico de BCG-Pasteur no lo hacen, sugiere que sólo una sub-población del cultivo de BCG-Pasteur contiene la segunda copia de DU2. Así, la diferencia observada en la intensidad de hibridación puede reflejar que la segunda copia de DU2 se ha adquirido sólo recientemente e indica que unas variantes que contienen una o dos copias de DU2 existen probablemente en el mismo cultivo de M. bovis BCG-Pasteur.

Se han obtenido unos resultados similares con unos fragmentos de ADN genómico digeridos por XbaI de M. tuberculosis, M. bovis y BCG-Pasteur que se hibridaban con la sonda 3675. En la digestión de M. tuberculosis H37Rv, la sonda 3.675 se hibridaba con un fragmento de 183 kb (posición genómica 3.646 kb a 3.829 kb). El fragmento correspondiente de M. bovis era de más o menos 178 kb, debiéndose esta diferencia de tamaño a la ausencia de varios elementos de inserción que están presentes sólo en el fragmento genómico de 183 kb de M. tuberculosis H37Rv. El producto de digestión por XbaI de BCG-Pasteur contenía dos fragmentos de 215 y 250 kb que se hibridaban con la sonda 3.675. Estos dos fragmentos correspondían al fragmento de 178 kb observado en el genoma de M. bovis aumentado por 36 ó 72 kb debido a la presencia de una o de dos copias de DU2. Es interesante observar que la señal de hibridación para el fragmento de 250 kb era menos intensa que la señal obtenida para el fragmento de 215 kb, lo que confirma las observaciones anteriores con los productos de digestión por HindIII.

Estas observaciones indican que esta región del genoma de BCG es todavía dinámica y que una sub-población de células es triploide para los genes Rv3213c-Rv3230c, y Rv3290c-Rv3302c. Estos datos de comparación entre la secuencia del genoma de M. tuberculosis H37Rv y de BCG-Pasteur indican que BCG-Pasteur debería ser triploide para por lo menos 58 genes, y que en un punto de su evolución, su ancestro común contenía unas copias duplicadas de 60 genes suplementarios que se han perdido cuando ha tenido lugar la supresión interna a DU2. Además, la presencia de DU1 y de DU2 y, en particular, la puesta en evidencia del hecho de que DU2 esté presente en forma de dos copias en una sub-población de BCG-Pasteur, sugiere que el proceso de duplicación en tándem en BCG es todavía dinámico.

La invención proporciona por lo tanto unos datos que pueden permitir comparar las diferentes cepas de BCG entre sí. Por otro lado, la invención muestra el interés de usar las estrategias de cartografía mediante los BAC como complemento de la secuenciación del genoma y permite la puesta en evidencia de los eventuales inconvenientes de los proyectos que se basan sólo en la secuenciación de clones mediante la técnica de "disparo". Así, sin esta biblioteca de BAC, es muy probable que estas reorganizaciones genómicas complejas presentes en las cepas de M. bovis BCG no hubieran sido detectadas. Por lo tanto, una ventaja de la presente invención es que proporciona unos datos que permiten la caracterización y eventualmente las clasificaciones inmunogénicas y protectoras, de las diferentes cepas de BCG usadas en la actualidad en clínica y para unas aplicaciones vacunales, así como proporciona unos elementos que permiten la identificación específica de M. tuberculosis con relación a M. bovis y M. bovis BCG, o unos elementos que permiten la identificación específica de M. bovis BCG con relación a M. bovis. La presente invención proporciona así unos elementos importantes para el estudio y la epidemiología de la tuberculosis, así como para los próximos estudios de reorganizaciones genómicas en las diferentes bacterias. La técnica desarrollada en la presente invención se ejempli-
fica mediante los resultados de la presente invención y se puede aplicar a otros genomas bacterianos y/o de parásitos.

Así, el hecho de que M. bovis BCG-Pasteur y otras dos sub-cepas de M. bovis BCG desempeñan una función completamente duplicada de genes responsables de procedimientos principales tales como, entre otros, la división celular y la traducción de la señal, que comprende dos orígenes de replicación, es uno de los aspectos sorprendentes revelado a los inventores mediante este enfoque de las comparaciones genómicas.

Puesto que el material biológico está sujeto a cambios, y debido a que los ensayos de vacunación BCG han dado unos resultados muy variables de protección (0-80%), podría ser importante evaluar si esta variación en la eficacia de protección se puede atribuir en parte a la elección de la sub-cepa BCG usada.

Por lo tanto, conviene llevar a cabo unas investigaciones complementarias con el fin de determinar si existe una correlación entre las particularidades genómicas y las variaciones fenotípicas entre las diferentes sub-cepas de BCG.

Los bancos de BAC han sido depositados en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM), 25 rue du Dr Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, Francia, según las disposiciones del Tratado de Budapest.

BAC de M. tuberculosis H37Rv: Número de Orden I1945

BAC de M. bovis BCG: Número de Orden I2049

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TABLA 2 Distribución de las supresiones entre el complejo de M. tuberculosis

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TABLA 3 Cebadores PCR

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TABLA 4 Cebadores para la identificación de las regiones duplicadas

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<110> INSTITUTO PASTEUR

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<120> Secuencias suprimidas en M. bovis BCG/M. bovis o M. tuberculosis, procedimiento de detección de las micobacterias que utiliza dichas secuencias y vacunas.

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<130> D18014

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<160> 38

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<210> 1

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Mycobacterium tuberculosis

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<220>

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<223> Y277-32F

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<213> Mycobacterium tuberculosis

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<223> Y277-32R

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatccaacac gcagcaacca g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plcC-B.SP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggattcctgg actggcgttg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plcC-B.3P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccacccaag aaaccgcac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Y78-dell

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaaaatcg cctcgtcgcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Y78-del2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacctgtatt cgtcgttgct gacc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Rv420-flankl.F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtaatcgt ggccgacaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RV420-flank2.R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttgcggcc caatgaatc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RD8-ephA.F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgtgattt ggtgagacga tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RD8-ephA.R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttcctcct gactaatcca ggc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB2329.5F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgcccgtc gtgcgcgaa

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB2332.5R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtggctcg gcacgcaca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RD10-264F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgcgaaaga ggtcatctaa ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RD10-267R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agatgctcaa gccgtgcacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TBoli2268469.F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgccacaa acgtactatc tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TBoli2269064.R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtttcaccg gctgtcgttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Y28-IS6110B.5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccacaccgc aggattggca ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Y28-RHS.2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcgagtgca tgaacgcaac cgag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB16.0F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagccaacga tgatgatgac c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB16.5F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcacggtc ggtgtcgtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB4398.7R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaactgca ggggtggtac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3689.5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagttgttc agccgcgtct t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3591.OR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accggggtgt cggccagtt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3689.9F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgcggccac cgtgcgtaa

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3591.5R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgcctatg actgataccc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3608.0F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacagggtc gcggagtct

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3672.0R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgaggaggt cgagtcctgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3671.7R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttcatga ggtgctaggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RvD5-intF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttcacgt tcattactgt tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RvD5-intR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgcgctta tctctagcgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB4411.0F

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggccactc actgccttc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

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<213> Mycobacterium bovis BCG

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB0.3R

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<400> 32

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\hskip-.1em\dddseqskip

acggtagtgt cgtcggcttc

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

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<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3675.0F

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaacaccgt caactactcg a

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB3675.5R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

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\hskip-.1em\dddseqskip

atcgcagaac tccggcgaca

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> TB1.2F

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatctgatc gccgacgcc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB1.5F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccgtcagcg ctccaagcg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TB1.8F

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccccaaac tgcacaccct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Mycobacterium bovis BCG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> TB2.2R

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<400> 38

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatccggaaa tcgtcagacc g

\hfill

21

Claims

1. Procedimiento de detección y de identificación que permite discriminar M. bovis BCG y M. bovis de M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas:

d): comparar dichas secuencias con las secuencias nucleotídicas presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

2. Procedimiento de detección y de identificación según la reivindicación 1, caracterizado porque las secuencias nucleotídicas tal como se definen en las etapas c) y d) se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD5: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c,

-: RD6: Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c,

-: RD8: ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG,

-: RD9: cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075,

-: RD10: echA1, Rv0223c,

-: RvD1: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c,

-: RvD2: RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la detección de las secuencias de ADN de la micobacteria se realiza por medio de secuencias nucleotídicas complementarias de dichas secuencias de ADN.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la detección de las secuencias de ADN de la micobacteria se realiza mediante la amplificación de estas secuencias con la ayuda de cebadores.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que los cebadores tienen una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 17 y SEC ID nº 18 siendo:

-: el par SEC ID nº 3/SEC ID nº 4 específico de RD5,

-: el par SEC ID nº 5/SEC ID nº 6 específico de RD6,

-: el par SEC ID nº 7/SEC ID nº 8 específico de RD7,

-: el par SEC ID nº 9/SEC ID nº 10 específico de RD8,

-: el par SEC ID nº 11/SEC ID nº 12 específico de RD9,

-: el par SEC ID nº 13/SEC ID nº 14 específico de RD10,

-: el par SEC ID nº 15/SEC ID nº 16 específico de RvD1, y

-: el par SEC ID nº 17/SEC ID nº 18 específico de RvD2.

6. Kit para la detección y la identificación que permite discriminar M. bovis BCG y M. bovis de M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende los siguientes elementos:

a): por lo menos un par de cebadores tales como los definidos en la reivindicación 5,

7. Uso de por lo menos un par de cebadores tales como los definidos en la reivindicación 5, para la amplificación de secuencia de ADN de M. bovis BCG, M. bovis o M. tuberculosis.

8. Procedimiento de detección in vitro de anticuerpos que permite discriminar unos anticuerpos dirigidos contra M. bovis BCG y M. bovis, de anticuerpos dirigidos contra M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un producto de expresión de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1 o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL,

b): poner en evidencia el complejo antígeno-anticuerpo formado.

9. Procedimiento de detección discriminante según la reivindicación 8, caracterizado porque las secuencias nucleotídicas tales como las definidas en la etapa a) de dicho procedimiento están agrupadas en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

-: RvD2: RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

10. Procedimiento de detección in vitro que permite discriminar una vacunación con M. bovis BCG de una infección por M. tuberculosis en un mamífero, que comprende las siguientes etapas:

a): incubar células de dicho mamífero, más particularmente las células del sistema inmunitario de dicho mamífero y más particularmente todavía las células T con por lo menos un producto de expresión de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1 o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL,

11. Procedimiento de detección discriminante según la reivindicación 10, caracterizado porque las secuencias nucleotídicas tal como se definen en la etapa a) de dicho procedimiento se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

12. Kit para el diagnóstico in vitro de una infección por M. tuberculosis en un mamífero eventualmente vacunado previamente con M. bovis BCG, que comprende:

a): un producto de expresión de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1 o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL,

13. Kit según la reivindicación 12, caracterizado porque las secuencias nucleotídicas tal como se definen en la parte a) de dicho kit se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

14. Anticuerpos mono- o policlonales, sus fragmentos o anticuerpos quiméricos, caracterizados porque son capaces de reconocer específicamente un producto de expresión de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1 o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

15. Anticuerpos mono- o policlonales, sus fragmentos o anticuerpos quiméricos según la reivindicación 14, caracterizados porque dichas secuencias nucleotídicas se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.

16. Procedimiento para la detección de la presencia de un antígeno que permite discriminar un antígeno de M. bovis BCG y M. bovis de un antígeno de M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende las etapas siguientes:

a): poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo según la reivindicación 14 ó 15,

b): poner en evidencia el complejo antígeno-anticuerpo formado.

17. Kit para la detección discriminante de la presencia de un antígeno de M. bovis BCG y M. bovis con relación a un antígeno de M. tuberculosis en una muestra biológica, que comprende:

a): un anticuerpo tal como se define en la reivindicación 14 ó 15,

18. Composición inmunógena, caracterizada porque consiste en por lo menos un producto de expresión de las secuencias nucleotídicas ausentes de los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y presentes en M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rv1965, mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, IprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1 o presentes en los genomas de M. bovis BCG y de M. bovis y ausentes del genoma de M. tuberculosis seleccionadas de entre los ORF y los genes siguientes: RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758, habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD1 depositada con el nº Y18605 y habiendo sido la secuencia nucleotídica de RvD2 depositada con el nº Y18606 en la base de datos EMBL.

19. Composición inmunógena según la reivindicación 18, caracterizada porque dicho por lo menos un producto de expresión está en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, eventualmente, con uno o más adyuvantes de la inmunidad.

20. Composición inmunógena según la reivindicación 18, caracterizada porque dichas secuencias nucleotídicas se agrupan en regiones nucleotídicas RD5 a RD10 y RvD1 y RvD2 según la siguiente repartición:

-: RD10: echA1, Rv0223c, tal como se definen en la tabla 1.