ES2326022A1 - Procedimiento mejorado para la produccion de biodiesel. - Google Patents

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Abstract

La presente invención se dirige a un procedimiento para la obtención de una mezcla de ésteres de ácidos grasos, apta para como carburante o combustible en motores ciclo diésel, que comprende: a) obtención de una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, mediante el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono; y b) conversión de los triglicéridos contenidos en la biomasa obtenida en la etapa a) en una mezcla de ésteres de ácidos grasos. Asimismo, la invención se dirige a dicho microorganismo oleaginoso, a un procedimiento para su selección y a polinucleótidos obtenidos a partir del mismo.

Description

Procedimiento mejorado para la producción de biodiésel.
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de combustible para motores de ciclo diésel a partir de aceites de origen microbiano, así como a los microorganismos que producen dichos aceites. Asimismo, la invención se dirige a dicho microorganismo oleaginoso, a un procedimiento para su selección y a polinucleótidos obtenidos a partir del mismo.
Estado de la técnica
La producción actual de biodiésel se basa en la transesterificación (o alcoholisis) de triglicéridos de origen vegetal (girasol, colza, palma y otras especies) con alcoholes de bajo peso molecular (metanol, etanol) para producir metil/etil ésteres de ácidos grasos y glicerina. La reacción de esterificación es factible con cualquier alcohol pero prácticamente sólo el metanol y etanol se utilizan para este proceso (EP 523 767). El alcohol metílico es el más utilizado debido a su bajo coste y a sus propiedades físico-químicas que le permiten reaccionar con cualquier aceite de baja acidez.
La producción de biodiésel se realiza a partir de triglicéridos y alcohol, combinándose éstos en una proporción 10/1 en peso. Por lo que partiendo de 1 tonelada de aceite, se obtienen aproximadamente I tonelada de biodiésel y unos 100 kg de glicerina cruda.
La glicerina cruda, con una riqueza del 70-85%, se puede purificar mediante una fase de acondicionamiento donde además de un paso de neutralización se realiza una evaporación con el fin de incrementar su concentración hasta alcanzar un 90-95%. Finalmente este producto concentrado se purifica a través de columnas obteniéndose glicerina de alta pureza cuyo destino es principalmente la industria farmacéutica y cosmética. Sin embargo, el crecimiento reciente del mercado de biodiésel, por encima del 50% anual, ha generado la saturación del mercado mundial de glicerina. Esta situación se agravará en un futuro próximo si se cumplen los objetivos de substitución de los carburantes actuales por biocarburantes establecidos por los Organismos Públicos dando lugar a un excedente de glicerina cruda en los mercados mundiales. En esta situación su valorización comercial mediante purificación, no parece la solución más atractiva para las plantas de biodiésel, ya que el proceso de purificación resulta demasiado costoso para competir en un mercado saturado. Debido a esta situación, se han comenzado a considerar otras aplicaciones como su posible utilización como combustible, a pesar de los inconvenientes desde el punto de vista medio
ambiental.
Por otra parte, el proceso de producción de biodiésel actual, en su mayoría a partir de semillas oleaginosas o de aceites vegetales, depende en gran medida del precio de estas materias primas que suponen entre un 50-60% de los costes de producción. Aunque la utilización de aceites usados, u otro tipo de grasas, pueden reducir el precio de la materia prima, este proceso requiere una serie de etapas adicionales para el refinamiento de estos aceites. Por lo tanto es necesario explorar nuevas estrategias para reducir el precio del biodiésel, especialmente aquellas que disminuyan el número de etapas, mejoren los rendimientos, y utilicen materias primas más económicas.
Recientemente se ha propuesto la utilización de aceites no comestibles como reservas alternativas para producir biodiésel, en particular aceites de semillas de Jatropa curcas, Pongamia pinnata o Madhuca indica (Shah et al., Energy fuels, 2004, 18, 154-159; Karmee SK et al, 2005, Bioresource Technol, 96, 1425-1429; Ghadge SV et al, Bioresource Technol, 2006, 97, 379-384). Sin embargo, estas alternativas no son viables en todos los países debido a las condiciones climáticas o geográficas.
La producción actual de triglicéridos a partir de cultivos herbáceos oleaginosos o de plantas leñosas con alto contenido en aceites es de unas 120 millones de toneladas al año. Si se cumplen las expectativas de crecimiento del mercado del biodiésel, el suministro de estos triglicéridos se encontrará en una situación límite pudiendo, incluso, poner en peligro el suministro de alimentos y la industria oleoquímica tradicional. La producción de más cultivos de este tipo requiere una gran cantidad de tierras cultivables, situación que en muchas regiones no es posible.
Por tanto, la industria del biodiésel necesita reservas alternativas de triglicéridos que se puedan obtener por otras vías y, en especial, de aquellas que puedan operar en continuo y sin requerimientos de grandes extensiones cultivables.
La producción de lípidos a partir de microorganismos ha sido, desde hace tiempo, objeto de investigación. Algunos hongos, levaduras y algas poseen la capacidad de acumular, intracelularmente, hasta más de un 70% de su biomasa en forma de lípidos (Ratledge C, Acta Biotechnol, 1991, 11, 429-438) durante periodos de stress metabólico, por lo que, de forma similar a lo que sucede con las semillas vegetales, se les denomina microorganismos oleaginosos (Ratledge, Biochemie, 2004, 86, 807-815).
Algunas levaduras pertenecientes a los géneros Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, Cryptococcus, Debaryomyces, Candida o Lypomyces y algunas microalgas del género Chlorella acumulan triglicéridos conteniendo unos perfiles de ácidos grasos de las series C16 y C18 (eg. palmítico, esteárico, oleico) muy similares a los presentes en los aceites vegetales como, por ejemplo, la colza o soja. Por lo que, potencialmente, los aceites procedentes de estos microorganismos (aceites de origen microbiano, SCO) podrían ser utilizados para producir biodiésel, ya que cumplirían los estándares indicados en la normativa EN 14214.
Existe poca información sobre la producción de biodiésel a partir de lípidos producidos por microorganismos. Recientemente se ha descrito un proceso utilizando la microalga Chorella starkey (Bioresource Technol, 2006, 97, 841-846) y otro con levaduras (J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82, 775-780). Sin embargo, en ambos casos la materia prima utilizada fue glucosa por lo que el balance económico del proceso no resulta viable.
Subproductos/residuos orgánicos generados a partir de procesos industriales de los sectores agroalimentario, forestal o industrial, son susceptibles de ser utilizados como materia prima para la producción de compuestos de mayor valor añadido mediante la utilización de microorganismo o enzimas. Entre estos subproductos se encontraría la glicerina cruda procedente de la industria del biodiésel.
En base a estos antecedentes, resultaría necesario desarrollar procesos mejorados en la industria del biodiésel que solucionaran desde el punto de vista estratégico, económico y técnico:
-
los problemas generados por los enormes excedentes de glicerina cruda.
-
la desventaja de utilizar materias primas que implican un precio elevado o grandes extensiones cultivables.
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Breve descripción de la invención
Los autores de la presente invención han desarrollado un nuevo procedimiento para la producción de un combustible biodiésel a partir de glicerina como fuente de carbono, logrando un proceso con rendimientos similares a los establecidos, pero mejorando la calidad del producto y el coste del proceso de producción. Concretamente, el proceso permite obtener una mezcla de ésteres de ácidos grasos, apta como carburante o combustible para motores tipo diésel, a partir de biomasa microbiana con un alto contenido en triglicéridos.
Así, un primer aspecto de la presente invención se dirige a un procedimiento para la obtención de biodiésel que comprende:
a)
obtención de una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, mediante el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono;
b)
conversión de los triglicéridos contenidos en la biomasa obtenida en la etapa a) en una mezcla de ésteres de ácidos grasos.
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En una realización particular, la biomasa microbiana obtenida en el apartado a) se somete a una separación de los triglicéridos contenidos en ella, los cuales son convertidos posteriormente en una mezcla de ésteres de ácidos grasos según la etapa b).
En una realización particular, en el paso a) se obtiene una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos entre el 20% y el 70% en peso seco.
En otra realización particular de la invención, se adicionan semillas vegetales oleaginosas a la biomasa microbiana, previamente a la obtención de la mezcla de ésteres de ácidos grasos.
Asimismo, la invención se dirige a un procedimiento para la obtención de biodiésel que comprende:
a.
obtención de una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, mediante el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono;
b.
opcionalmente separación de los triglicéridos de la biomasa microbiana;
c.
conversión de los triglicéridos contenidos en la biomasa obtenida en la etapa a) o de los triglicéridos separados en la etapa b) en una mezcla de ésteres de ácidos grasos mediante alcoholisis en medio ácido, de manera que se obtiene una fase que comprende ésteres de ácidos grasos y otra fase que comprende glicerina y restos celulares;
d.
una primera separación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos y la fase que comprende glicerina y restos celulares obtenidas en la etapa c);
e.
neutralización de la fase que comprende los ésteres de ácidos grasos separada en la etapa d) de manera que se obtiene una fase que comprende ésteres de ácidos grasos y una fase que comprende agua y restos de alcohol;
f.
una segunda separación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos y la fase que comprende agua y restos de alcohol obtenidas en la etapa e);
g.
purificación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos separada en la etapa f).
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En un aspecto adicional, la invención se dirige a un microorganismo oleaginoso capaz de acumular triglicéridos utilizando glicerina como fuente de carbono.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para seleccionar microorganismos oleaginosos capaces de acumular triglicéridos utilizando glicerina como única fuente de carbono que comprende:
(i)
obtener cepas capaces de crecer en glicerina como única fuente de carbono;
(ii)
seleccionar las cepas de la etapa (i) productoras de triglicéridos.
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Descripción detallada de la invención
En la presente invención los términos "biomasa" o "biomasa microbiana" se refieren al conjunto de células del microorganismo una vez crecidas en el medio de cultivo.
El biodiésel es un biocarburante, combustible renovable, descrito según las especificaciones ASTM (asociación internacional de normativa de calidad) como ésteres monoalquílicos de ácidos grasos de cadena larga (con 8 o más carbonos) derivados de lípidos renovables tales como aceites vegetales o grasas animales, y que se emplean en motores de ignición de comprensión (motores diésel). En la presente invención, los aceites provienen de la biomasa microbiana anteriormente definida.
En la presente invención "microorganismo oleaginoso" se refiere a una levadura, hongo filamentoso o microalga que posee la capacidad de acumular intracelularmente lípidos, durante periodos de stress metabólico (Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, Cryptococcus, Debaryomyces, Candida, Lypomyces o Chlorella).
En un primer aspecto, la presente invención se dirige a un procedimiento para la obtención de biodiésel que comprende:
a)
obtención de una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, mediante el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono;
b)
conversión de los triglicéridos contenidos en la biomasa obtenida en la etapa a) en una mezcla de ésteres de ácidos grasos.
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En una realización particular, la biomasa microbiana obtenida en el apartado a) se somete a una separación de los triglicéridos contenidos en ella, los cuales son convertidos posteriormente en una mezcla de ésteres de ácidos grasos. Preferentemente, esta separación comprende una extracción.
El proceso de obtención de la biomasa microbiana en la etapa a) implica el cultivo de los microorganismos oleaginosos en matraces o biorreactores hasta alcanzar un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco.
En una realización particular, el cultivo de los microorganismos se realiza durante 2-5 días a una temperatura entre 18ºC y 30ºC, preferentemente entre 23ºC y 30ºC con agitación constante. Una vez alcanzada la máxima cantidad intracelular de triglicéridos, las células se recogen mediante alguno de los procedimientos habitualmente utilizados para este fin como, por ejemplo, filtración o centrifugación.
En una realización particular, el contenido de triglicéridos alcanzado en la biomasa se encuentra comprendido entre el 20% y el 70% del peso seco.
En una realización preferida de la invención el microorganismo utilizado para producir biomasa es una levadura. En realizaciones aún más preferentes la levadura es del género Rhodosporidium y en especial se prefieren las cepas Rhodosporidium toruloides CECT 13006 y Rhodosporidium toruloides CECT 13007.
Los microorganismos se crecen en medios de cultivo en los que está presente glicerina como fuente de carbono, la cual se encuentra en exceso en relación con la fuente de nitrógeno presente en el mismo medio, pudiendo ser ésta extracto de levadura, peptona, corn steep liquor (licor de macerado de maíz), urea, glutamato sódico o fuentes de nitrógeno inorgánico como diferentes sales de amonio, aunque no limitada a éstas.
Además de glicerina, en el medio de cultivo pueden estar presentes otras fuentes de carbono, como por ejemplo aunque sin limitación, glucosa, melazas, sacarosa, fructosa, almidones o ácidos grasos. De acuerdo a una realización particular de la invención se usa glicerina como fuente de carbono en el medio de fermentación, preferentemente en una cantidad que supone entre el 70-100% del total de los carbohidratos empleados. Por cuestiones económicas, se prefiere que la glicerina usada sea glicerina cruda, es decir, tenga una riqueza entre aproximadamente 70% y 85%.
En otra realización particular de la invención, el procedimiento de la invención comprende adicionalmente la adición de semillas vegetales oleaginosas a la biomasa microbiana obtenida en la etapa a) como paso previo a la obtención de la mezcla de ésteres de ácidos grasos. Semillas vegetales adecuadas son, por ejemplo, girasol, colza, palma, soja, nabina o coco.
Por su parte, la preparación de la mezcla de los ésteres de ácidos grasos se realiza mediante alcoholisis de los triglicéridos contenidos en la biomasa microbiana obtenida en la etapa a) directamente o bien sobre los triglicéridos una vez separados de la biomasa microbiana. En esta reacción se puede utilizar un catalizador para mejorar la velocidad y el rendimiento final. Preferentemente, la alcoholisis se realiza en medio ácido, es decir, utiliza un ácido como catalizador. La acidificación puede realizarse mediante el uso de cualquier ácido como, por ejemplo, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, o ácido fosfórico, aunque no tiene porqué limitarse a éstos. El alcohol utilizado en la reacción está preferentemente en un exceso entre 5 y 40 veces en peso con respecto a la biomasa, más preferiblemente entre 10 y 30 veces. En una realización particular, la reacción se deja proceder con agitación constante entre 20 y 36 horas, a una temperatura entre 40ºC y 70ºC, preferiblemente entre 50ºC y 70ºC. También de manera preferente la alcoholisis de la biomasa se realiza con alcoholes que presentan 1, 2, 3 o 4 carbonos. De manera aún más preferente el alcohol es metanol o etanol, siendo el metanol el alcohol más preferido.
Además de los catalizadores homogéneos de tipo ácido anteriormente señalados, en otras realizaciones de la invención se utilizan catalizadores ácidos heterogéneos (por ejemplo, Zeolitas, Resinas Sulfónicas, SO_{4}/ZrO_{2}, WO_{3}/ZrO_{2}), básicos heterogéneos (por ejemplo, MgO, CaO, Na/NaOH/Al_{2}O_{3}), básicos homogéneos (por ejemplo, KOH, NaOH) o enzimáticos (Lipasas, como por ejemplo: Candida, Penicillium, Pseudomonas).
Asimismo, la invención se dirige a un procedimiento para la obtención de biodiésel que comprende:
a.
obtención de una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, mediante el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono;
b.
opcionalmente separación de los triglicéridos de la biomasa microbiana;
c.
conversión de los triglicéridos contenidos en la biomasa obtenida en la etapa a) o de los triglicéridos separados en la etapa b) en una mezcla de ésteres de ácidos grasos mediante alcoholisis en medio ácido, de manera que se obtiene una fase que comprende ésteres de ácidos grasos y otra fase que comprende glicerina y restos celulares;
d.
una primera separación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos y la fase que comprende glicerina y restos celulares obtenidas en la etapa c);
e.
neutralización de la fase que comprende los ésteres de ácidos grasos separada en la etapa d) de manera que se obtiene una fase que comprende ésteres de ácidos grasos y una fase que comprende agua y restos de alcohol;
f.
una segunda separación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos y la fase que comprende agua y restos de alcohol obtenidas en la etapa e);
g.
purificación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos separada en la etapa f).
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Las etapas a), b) y c) se llevan a cabo según se ha descrito anteriormente. En una realización particular de la invención, la etapa d) de separación de las fases se realiza mediante un proceso de centrifugación.
La etapa e) de neutralización de la fase que comprende los ésteres de ácidos grasos, sirve para retirar el exceso de alcohol y, en su caso, de ácido. La neutralización se realiza convenientemente añadiendo una solución de una base débil como, por ejemplo, hidróxido sódico, hidróxido potásico o hidróxido amónico, a una cantidad determinada de agua que, preferiblemente varía entre 1/3 y 1/10 en volumen de la cantidad de fase que comprende los ésteres de ácidos grasos separada en la etapa d). En una realización particular de la invención, dicha neutralización se puede llevar a cabo en varias etapas, por ejemplo una primera etapa en donde se emplea una concentración de base de 0,05-0,3% en peso sobre el agua añadida y una segunda etapa que emplea entre un 0,01 y 0,1% en peso sobre el agua añadida.
En una realización particular, durante esta etapa de neutralización se lleva a cabo una agitación mecánica durante un tiempo de unos 15-60 minutos a velocidad regulada para evitar la aparición de emulsiones.
En una realización particular, la segunda separación de las fases efectuada en la etapa f) se realiza mediante decantación por gravedad obteniéndose una fase formada por agua y restos de alcohol y una fase que contiene los ésteres de ácidos grasos.
Dichos ésteres se pueden purificar mediante la eliminación de los restos de agua y alcohol en un evaporador. La evaporación de pequeñas cantidades de agua y el alcohol, frecuentemente metanol o etanol, proporciona un proceso con menor demanda energética al requerir temperaturas inferiores a las utilizadas para la destilación de los ésteres durante la purificación de los mismos.
El biodiésel así obtenido puede ser recirculado si presenta un contenido en agua mayor que el establecido por la Norma 14214.
Microorganismos oleaginosos
Como se ha indicado anteriormente, el procedimiento para la obtención de biodiésel comprende el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención se dirige a un microorganismo oleaginoso capaz de acumular triglicéridos utilizando glicerina como fuente de carbono.
En otra realización particular, el microorganismo es capaz de acumular un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, preferiblemente entre un 20% y un 70%.
En el contexto de la presente invención, el microorganismo oleaginoso puede ser una levadura, un hongo filamentoso o una microalga. En una realización preferida de la invención el microorganismo es una levadura. En realizaciones aún más preferentes la levadura es del género Rhodosporidium y en especial se prefieren las cepas Rhodosporidium toruloides CECT 13006 y Rhodosporidium toruloides CECT 13007.
La autoridad internacional de depósito de los microorganismos de la invención ha sido la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
En otro aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para la selección de microorganismos oleaginosos capaces de acumular triglicéridos utilizando glicerina como única fuente de carbono que comprende:
(i)
obtener cepas capaces de crecer en un medio de cultivo que comprende glicerina como única fuente de carbono;
(ii)
seleccionar las cepas de la etapa (i) productoras de triglicéridos.
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En la etapa (i), puede usarse cualquier medio de cultivo de glicerina conocido en la técnica para seleccionar las cepas, por ejemplo Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, Cryptococcus, Debaryomyces, Candida o Lypomyces o Chlorella. Preferiblemente, el medio de cultivo de glicerina comprende medio MMG (por litro: nitrógeno base para levaduras (YNB) sin aminoácidos, 6,7 g; glicerina cruda, 47 g; suplementado con cloramfenicol (50 \mug/mL).
En la etapa (ii), la selección de las cepas productoras de triglicéridos se puede llevar a cabo mediante un muestreo utilizando una tinción, por ejemplo, con rojo Nilo y posterior análisis por fluorescencia.
Las cepas de levaduras definidas en la presente invención han sido identificadas a través de las secuencias de nucleótidos correspondiente a la región D1/D2 de la subunidad 26S del ADN ribosómico y a un fragmento de la región ITS total situada entre las subunidades 18S y 26S.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido caracterizado por presentar la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, que corresponde a la región D1/D2 de la subunidad 26S del ADN ribosómico de Rhodosporidium toruloides CECT 13006.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido caracterizado por presentar la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, que corresponde a la región ITS total situada entre las subunidades 18S y 26S de Rhodosporidium toruloides CECT 13006.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido caracterizado por presentar la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 3, que corresponde a la región D1/D2 de la subunidad 26S del ADN ribosómico de Rhodosporidium toruloides CECT 13007.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido caracterizado por presentar la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4, que corresponde a la región ITS total situada entre las subunidades 18S y 26S de Rhodosporidium toruloides CECT 13007.
Como entiende el experto en la materia, los polinucleótidos de la invención pueden emplearse como sondas, o para diseñar cebadores o sondas a partir de ellos, para identificar otras especies del género Rhodosporidium.
Ejemplos 1. Selección de microorganismos capaces de crecer en glicerina cruda como única fuente de carbono
El aislamiento de estos microorganismos se realizó mediante dos estrategias a partir de muestras de tierra tomadas en los márgenes del Río Tinto (Huelva). A 1 g de muestra depositado en un tubo de ensayo se añadieron 10 mL de solución salina y se agitó de forma intensa durante 10 min. A partir de esta suspensión se prepararon diluciones seriadas 1:10 en solución salina, sembrándose 0,1 mL en placas conteniendo medio YPG (por litro: extracto de levadura, 10 g; peptona bacteriológica, 20 g; glicerina cruda, 47 g; suplementado con cloramfenicol (50 \mug/mL) para inhibir el crecimiento bacteriano. Las placas se incubaron a 28ºC durante 4-5 días y las colonias crecidas se transfirieron a placas de medio MMG (por litro: nitrógeno base para levaduras (YNB) sin aminoácidos, 6,7 g; glicerina cruda, 47 g; suplementado con cloramfenicol (50 \mug/mL). Las placas se incubaron a 28ºC durante 5-7 días.
En la segunda estrategia, una porción de una muestra se pulverizó en un mortero estéril y 1 g de la misma se añadió a un matraz conteniendo 50 mL de medio MMG suplementado con rosa de bengala (50 \mug/mL) y cloramfenicol (50 \mug/mL). El matraz se incubó a 28ºC y 250 rpm durante 24 h. A continuación se transfirieron 0,5 mL de este cultivo a otro matraz conteniendo MMG con un 8% de glicerina cruda incubándose en las mismas condiciones. Este proceso se repitió de nuevo pero utilizando medio MMG conteniendo un 12% de glicerina cruda. A partir de los cultivos conteniendo un 8-12% de glicerina, se sembraron diluciones en placas de medio MMG. Estas se incubaron a 28ºC durante 7 días.
Mediante estos dos procedimientos se obtuvieron 470 colonias en el medio YPG, de las cuales se seleccionaron 230 capaces de crecer en MMG.
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2. Selección de microorganismos capaces de crecer en glicerina cruda como única fuente de carbono y acumular triglicéridos
La capacidad para acumular triglicéridos se analizó mediante un muestreo utilizando la tinción con rojo Nilo (Kimura K, et al., 2004, J. Microbiol. Methods, 56, 331-338).
Se crecieron cultivos en medio MMG a pequeña escala (1 mL) en placas de 96 pocillos a 28ºC, 250 rpm durante 72 horas. Transcurrido este tiempo se tomaron 0,5 mL de cultivo que se diluyeron en un mismo volumen de tampón PBS (10 mM tampón fosfato potásico, 0,15 M KCl, pH 7.0). A 0,4 mL de esta suspensión se añadieron 0,01 mL de una solución de rojo Nilo (0,5 \muLg/mL), la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se transfirieron 0,1 mL a una placa microtiter midiéndose la fluorescencia en un lector de placas a 600 nm. Doce cultivos mostraron una medida de fluorescencia mayor que la cepa utilizada como control, Rhodosporidium toruloides CBS14, y se seleccionaron como posibles productores de triglicéridos. Estas doce cepas y la control se cultivaron, por triplicado, a 28ºC, 250 rpm durante 96 horas en matraces conteniendo 50 mL de medio MEM (para 1 litro: glicerina cruda, 47 g; extracto de levadura, 1,5 g; fosfato monopotásico, 0,75 g; nitrato amónico, 0,28 g; CaCl\cdot2H_{2}O, 0,4 g; y MgSO_{4}\cdot72H_{2}O, 0,4 g, ajustado a pH 5 con HCl concentrado). Las células se recogieron por centrifugación, dos tubos se escurrieron y se secaron en una estufa a 50ºC durante 24 h para determinar el peso seco. El otro tubo se escurrió sobre papel de filtro y las células se resuspendieron en 5 mL de agua conteniendo 0,75 mL de hidróxido amónico. La suspensión se agitó suavemente y se incubó en un baño a 60-70ºC durante 15 minutos. Se enfrió y se añadieron 5 mL de etanol agitando con fuerza. A continuación se añadieron 12,5 mL de éter etílico, se agitó brevemente y se añadió el mismo volumen de éter de petróleo. La mezcla se separó por centrifugación retirándose la fase orgánica a un matraz esférico de fondo plano. La fase orgánica se evaporó a sequedad en un rotavapor y el matraz se introdujo en una estufa a 102ºC hasta obtener un peso constante.
Mediante esta medida por gravimetria se identificaron dos cepas capaces de acumular un 25,3% y un 27,2% de su peso seco en forma de materia triglicéridos. Ambas se identificaron, mediante la secuenciación de la región D1/D2 de la subunidad 26S del ADN ribosómico y un fragmento de la región ITS total (Espaciador interno de transcripción, Internal Transcribed Spacer) situada entre las subunidades 18S y 26S, como dos cepas distintas de Rhodosporidium toruloides mostrando también diferencias frente a las secuencias de esta especie depositadas en las bases de datos existentes. Ambas cepas se han depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como Rhodosporidium toruloides 0376 (CECT nº 13006) y Rhodosporidium toruloides 0770 (CECT nº 13007).
Para amplificar la zona Dl/D2 correspondiente a la subunidad 28S del ADN ribosómico se han empleado los oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7. Así mismo, la región ITS total situada entre las subunidades 18S y 26S se amplificó utilizando los oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido caracterizado por presentar la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido caracterizado por presentar la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 6.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido caracterizado por presentar la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 7.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido caracterizado por presentar la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8.
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3. Producción de biodiésel por fermentación de microorganismos capaces de crecer en glicerina cruda como única fuente de carbono y acumular triglicéridos
Células de Rhodosporidium toruloides CECT13007 crecidas en medio sólido YPG (composición sobre la base de 1 litro: extracto de levadura 10 g; peptona bacteriológica 20 g, glicerina cruda 47 g; agar, 20 g), se utilizaron para inocular 50 mL del mismo medio. Al cabo de 24 h de incubación en un agitador orbital (200 rpm, 28ºC) , se transfirieron 25 mL este cultivo a matraces de 1 litro conteniendo 250 mL de YPG. Las células se incubaron de nuevo 24 h en un agitador orbital (200 rpm, 28ºC). A continuación se transfirieron 150 mL de este cultivo a un fermentador conteniendo 1,35 litros de medio MEM. Este medio consiste en (sobre la base de 1 litro): glicerina cruda, 47 g; extracto de levadura, 1,5 g; fosfato monopotásico, 0,75 g; nitrato amónico, 0,28 g; CaCl\cdot_{2}H_{2}O, 0,4 g; y MgSO_{4}\cdot72H_{2}O, 0,4 g, ajustado a pH 5 con HCl concentrado.
El fermentador se mantuvo a 28ºC, la concentración de oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% manteniendo una agitación de 250 rpm. Al cabo de 72 horas la concentración de biomasa en el fermentador era de 24,4 g/L y el contenido intracelular de triglicéridos fue del 52,3%. La composición de ácidos grasos presentes se analizó mediante cromatografia de gases observándose una cantidad mayoritaria de ácido palmítico (24%), esteárico (8%), oléico (55%) y linoleico (2%).
Las células se cosecharon por centrifugación y se secaron a 50ºC durante 8 horas.
En un matraz de fondo redondo equipado con un condensador se añadieron 10 g de biomasa (5,2 g de triglicéridos) y 100 mL de solución ácida en metanol. La suspensión se calentó a 60ºC con fuerte agitación a presión atmosférica durante 20 horas. Concluida la reacción se detuvo la agitación y la mezcla se separó mediante centrifugación. Se obtuvieron dos fases: una ligera, conteniendo los ésteres metílicos y metanol en exceso, y una fase pesada formada por glicerina, restos de metanol, catalizador y sales.
La purificación de la fase ligera se realizó mediante dos lavados con agua alcalina con hidróxido sódico a una concentración del 0,1% en peso sobre el agua añadida. En cada lavado se dejó decantar hasta lograr una buena separación de la fase orgánica y acuosa. Se retiró la fase acuosa y se recogieron los ésteres metílicos para eliminar los restos de metanol y agua mediante evaporación en un evaporador de película descendente a vacío a una presión absoluta de 100 mbar y 120ºC de temperatura. La cantidad final obtenida fue de 5,09 g de ésteres metílicos lo que representa un rendimiento del 98%.
Los ésteres metílicos así obtenidos son aptos para su uso como combustible de automoción en motores diésel cumpliendo las especificaciones de la Norma Europea 14214 para este tipo de combustibles (ver Tabla 1).
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TABLA 1 Propiedades como combustible de la mezcla de ésteres metílicos de SCO
1
4. Obtención de biodiésel a partir de una mezcla de semillas y biomasa oleaginosas
Biomasa de Rhodosporidium toruloides CECT13006 obtenida según el procedimiento descrito en el ejemplo anterior, y con un contenido intracelular en triglicéridos del 53,4%, se mezcló con semillas de girasol en las siguientes proporciones (semillas/biomasa): 90/10, 80/20 y 75/25. La materia grasa se extrajo por extrusión utilizando una prensa (oil expeller XP100, Alban Blanch). Para realizar la transesterificación, se preparó el catalizador (metóxido de sodio) mediante la mezcla de 0,27 litros de metanol y 3 gramos de hidróxido sódico. El aceite se pesó en un reactor y se calentó hasta alcanzar los 50ºC con constante agitación. A continuación se añadió el catalizador y la reacción se dejó proceder durante 60 minutos. Transcurrido este tiempo, se detuvo la agitación y se realizó la separación de las fases por centrifugación. La purificación de los ésteres metílicos se realizó según los pasos indicados en el ejemplo anterior. El rendimiento alcanzado en los ensayos realizados con las diferentes proporciones de semillas y biomasa fue superior al 98%.
El análisis del biodiésel obtenido mostró unos resultados prácticamente similares a los obtenidos en el caso de utilizar únicamente las semillas de girasol y los parámetros cumplieron los requisitos establecidos por la norma EN14214.
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5. Obtención de biodiésel a partir del aceite extraído de la biomasa oleaginosa
Diez gramos de células de la cepa Rhodosporidium toruloides CECT 13006, conteniendo un 53,7% de grasa, se resuspendieron en 20 mL de agua desmineralizada. A continuación se añadieron 2,5 mL de una solución al 25% de hidróxido amónico, se agitó suavemente y se incubó en un baño a 60ºC durante 15 minutos. La mezcla se enfrió y se añadieron 10 mL de etanol agitando vigorosamente. Se añadieron 40 mL de éter etílico y se agitó nuevamente, a continuación se añadieron 40 mL de éter de petróleo volviéndose a agitar. La mezcla se centrifugó a 6.000 rpm y la fase ligera (orgánica) se separó a un matraz esférico de fondo plano previamente pesado. Se repitió la extracción utilizando la mitad de volumen en cada caso y la grasa extraída se mezcló en el mismo matraz de fondo plano. Para lograr eliminar posibles restos de etanol o agua, el matraz se sometió a una corriente de nitrógeno durante 1 hora. La cantidad de triglicéridos obtenida fue de 5,12 gramos.
La transesterificación se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo anterior alcanzándose un rendimiento del 98,7%. El análisis del biodiésel obtenido cumplió todos los parámetros exigidos por la norma EN14214.
<110> NEURON BIOPHARMA S.A.
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<120> PROCEDIMIENTO MEJORADO PARA LA PRODUCCIÓN DE BIODIÉSEL
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<130> P3786ES00
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<160> 8
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 550
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<212> ADN
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<213> Rhodosporidium toruloides 
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<400> 1
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2 
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<210> 2
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<211> 560
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<212> ADN
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<213> Rhodosporidium toruloides 
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<400> 2
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3
4 
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<210> 3
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<211> 550
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<212> ADN
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<213> Rhodosporidium toruloides 
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<400> 3
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5 
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<210> 4
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<211> 561
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<212> ADN
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<213> Rhodosporidium toruloides 
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<400> 4
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6 
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<210> 5
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador empleado para amplificar la región Dl/D2 de la subunidad 26S del ADN ribosómico Rhodosporidium 
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<400> 5
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7 
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<210> 6
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador empleado para amplificar la región ITS total de Rhodosporidium 
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<400> 6
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8 
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<210> 7
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador empleado para amplificar la región Dl/D2 de la subunidad 26S del ADN ribosómico de Rhodosporidium 
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<400> 7
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9 
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<210> 8
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador empleado para amplificar la región ITS total de Rhodosporidium 
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<400> 8
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10

Claims (23)

1. Un procedimiento para la obtención de biodiésel que comprende:
a)
obtención de una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, mediante el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono;
b)
conversión de la biomasa obtenida en la etapa a) en una mezcla de ésteres de ácidos grasos.
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2. Procedimiento según reivindicación 1, en el que la biomasa microbiana obtenida en el apartado a) se somete a una separación de los triglicéridos contenidos en ella como paso previo a la posterior conversión de éstos en una mezcla de ésteres de ácidos grasos según la etapa b).
3. Procedimiento según reivindicación 2, en el que la separación comprende una extracción.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el contenido en triglicéridos en la biomasa microbiana está comprendido entre el 20% y el 70% en peso seco.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el microorganismo es una levadura.
6. Procedimiento según reivindicación 5, en el que el microorganismo es una levadura del género Rhodosporidium.
7. Procedimiento según reivindicación 6, en el que el microorganismo es Rhodosporidium toruloides CECT 13006.
8. Procedimiento según reivindicación 6, en el que el microorganismo es Rhodosporidium toruloides CECT 13007.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la glicerina constituye un 70-100% de la fuente de carbono.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende adicionalmente la adición de semillas vegetales oleaginosas a la biomasa obtenida en la etapa a) como paso previo a su conversión en ésteres de ácidos grasos.
11. Procedimiento según reivindicación 1 ó 2 en el que la etapa b) se realiza mediante alcoholisis.
12. Procedimiento según reivindicación 11, donde la alcoholisis se realiza en medio ácido.
13. Procedimiento según reivindicación 11 ó 12, en el que la alcoholisis se realiza a una temperatura comprendida entre 40ºC y 70ºC.
14. Procedimiento según reivindicación 13, en el que la alcoholisis se realiza a una temperatura comprendida entre 50ºC y 70ºC.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la alcoholisis se realiza con metanol o etanol.
16. Procedimiento según reivindicación 15, en el que la alcoholisis se realiza con metanol.
17. Un procedimiento para la obtención de biodiésel que comprende:
a)
obtención de una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, mediante el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono;
b)
opcionalmente separación de los triglicéridos de la biomasa microbiana;
c)
conversión de los triglicéridos contenidos en la biomasa obtenida en la etapa a) o de los triglicéridos separados en la etapa b) en una mezcla de ésteres de ácidos grasos mediante alcoholisis en medio ácido, de manera que se obtiene una fase que comprende ésteres de ácidos grasos y otra fase que comprende glicerina y restos celulares;
d)
una primera separación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos y la fase que comprende glicerina y restos celulares obtenidas en la etapa c);
e)
neutralización de la fase que comprende los ésteres de ácidos grasos separada en la etapa d) de manera que se obtiene una fase que comprende ésteres de ácidos grasos y una fase que comprende agua y restos de alcohol;
f)
una segunda separación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos y la fase que comprende agua y restos de alcohol obtenidas en la etapa e);
g)
purificación de la fase que comprende ésteres de ácidos grasos separada en la etapa f).obtención de una biomasa microbiana con un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco, mediante el empleo de un microorganismo oleaginoso que utiliza glicerina como fuente de carbono.
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18. Microorganismo oleaginoso capaz de acumular triglicéridos utilizando glicerina como fuente de carbono.
19. Microorganismo oleaginoso según reivindicación 18, donde dicho microorganismo es capaz de acumular un contenido en triglicéridos igual o superior al 20% en peso seco.
20. Microorganismo según reivindicación 18 ó 19, donde dicho microorganismo es una levadura.
21. Microorganismo según reivindicación 20, donde dicho microorganismo es una levadura del género Rhodosporidium.
22. Microorganismo según reivindicación 21, donde dicho microorganismo es Rhodosporidium toruloides CECT 13006.
23. Microorganismo según reivindicación 21, donde dicho microorganismo es Rhodosporidium toruloides CECT 13007.
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