ES2325101T3 - Procedimiento para la conversion de germoplasma. - Google Patents
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Abstract
Un método de producción de semillas de maíz híbridas resistentes a glifosato, comprendiendo dicho método: (i) aplicar glifosato a una población de donantes parentales masculinos resistentes a herbicida que comprenden el alelo dominante de resistencia a glifosato (R), en un estadio vegetativo avanzado antes de la floración; (ii) usar dicha población tratada con glifosato de donantes parentales masculinos resistentes a glifosato para fertilizar plantas de maíz femeninas no tratadas; (iii) obtener semillas de maíz a partir de dichas plantas de maíz femeninas fertilizadas.
Description
Procedimiento para la conversión de
germoplasma.
La presente invención se refiere a un método
para producir semillas de maíz híbridas resistentes a glifosato.
Este método generalmente es útil en la producción de híbridos así
como en la producción de plantas transgénicas en general.
La incorporación de un gen que confiere
resistencia a los herbicidas tales como glifosato en plantas es bien
conocido, por ejemplo de Gasser et al., Recent adv-
Phytochem, New York, Plenum Press 1988 22, p. 45-55.
Dichas plantas, en particular las plantas de maíz, están
disponibles en el mercado, por ejemplo de DeKalb Genetics. En el
caso de la resistencia a glifosato, las plantas incluyen un gen que
confiere aproximadamente un suceso de resistencia a glifosato,
GA21, que está basado en el gen que codifica una enzima de sitio
activo alterada.
Por ejemplo, las plantas diploides pueden ser
homocigóticas (denominadas RR donde R es resistencia a glifosato) o
heterocigóticas Rr para la resistencia a glifosato, dependiendo de
su método de producción y linaje.
Cuando se usan en programas de cultivo de
plantas, las plantas heterocigóticas darán como resultado la
producción de una proporción significativa de plantas que no poseen
el rasgo de resistencia al herbicida. Por ejemplo, cuando se trata
de plantas resistentes a glifosato, se debe representar en forma de
diagrama tal como:
Rr*Rr> RR +
2 Rr +
rr
R = el transgén y r = azigoto salvaje
\vskip1.000000\baselineskip
Donde uno de los parientes no lleva el rasgo de
resistencia, más aún, la progenie carecerán del rasgo, es decir
Rr*Rr > rR +
rr
Esto significa que las plantas heterocigóticas
normalmente no pueden ser usadas como donantes del gen en la
producción de semilla comercial para que los agricultores las hagan
crecer, debido a que muchas de las semillas podrían carecer del
rasgo y no se alcanzarían los niveles deseados de pureza.
Sin embargo, actualmente se preferiría el uso de
plantas heterocigóticas al uso de las homocigóticas en la
producción de semillas. Esto se debe a que el fenómeno del
silenciamiento del gen, en el que los sucesos de transformación se
vuelven inestables o dejan de funcionar tras varias generaciones,
ocurre más frecuentemente en plantas homocigóticas.
Existe la necesidad de un proceso donde el
rendimiento de plantas que demuestran un rasgo deseado, tal como
resistencia a herbicida, esté aumentado en programas de cultivo, que
incluyen plantas heterocigóticas.
Los solicitantes han encontrado que aplicando un
herbicida a un estadio particular del desarrollo de la planta, se
puede potenciar el mantenimiento de la resistencia al herbicida en
el polen y por ello, en la progenie.
La invención proporciona un método de producción
de semillas de maíz híbridas resistentes a glifosato, dicho método
comprende:
(i) aplicar glifosato a una población de
donantes parentales masculinos resistentes al herbicida que
comprende el alelo dominante de resistencia a glifosato (R), en un
estado vegetativo avanzado antes de la floración;
(ii) usar dicha población tratada de donantes
parentales masculinos resistentes a glifosato para fertilizar
plantas de maíz femeninas;
(iii) obtener semillas de maíz a partir de
dichas plantas de maíz femeninas fertilizadas.
El documento WO97/23634 describe un método de
producción de semillas híbridas resistentes a herbicida. Este
método comprende activar una planta de cultivo que es heterozigótica
para un transgén hacia la producción de semillas que llevan el
transgén al nebulizar plantas que son transformadas con una
construcción que comprende un gen de resistencia a fitotoxina con
clorsufuron y cruzar estas plantas. De forma alternativa, sólo a uno
de los parientes se nebuliza y se retrocruza con el otro pariente
no nebulizado. En el documento WO97/23634 se encontró que al
nebulizar al pariente hembra se obtienen mejores resultados que al
nebulizar al pariente macho.
El método de la invención puede ser aplicado a
plantas de maíz, que son resistentes a glifosato. En particular, el
método de resistencia al herbicida de las plantas se logra a través
de un gen endógeno modificado que produce una planta que no está
afectada por la presencia del herbicida.
El herbicida para uso en el método de la
invención es glifosato y sales del mismo, como aquellas vendidas
como Roundup^{tm} y Touchdown^{tm}. Otros herbicidas que pueden
ser usados de esta manera son Acetolactato Sintasa (ALS) e
inhibidores (AHAS) (vendidos como Pursuit^{tm} y Sceptre^{tm}),
donde el mecanismo de resistencia al herbicida de la planta es la
alteración del sitio activo tal como se describe más arriba.
La invención es aplicable cuando las plantas son
plantas de maíz.
Lo que constituye un "estado vegetativo
avanzado" adecuado puede variar de una planta a otra, dependiendo
del desarrollo del polen. Esto puede ser determinado en cada caso
usando métodos de ensayo rutinarios. Sin embargo, en general,
comprenderá un estado equivalente a V5 o por encima, por ejemplo
hasta V16 en maíz. Una descripción de estos estados de crecimiento
en el maíz se da por S. W. Ritchie et al., "How a Corn
Plant Develops. Rev. Feb. 1982" Special Report (Iowa State
University os Science and Technology, Co-operative
Extension Service, No. 48) 1982, 21 p:col.ill; cuyo contenido se
incorpora en la presente memoria por referencia.
La invención se basa en la desviación
estadísticamente significativa de la segregación observada a partir
de la segregación esperada que se observa en una serie de
experimentos. El alelo de resistencia a glifosato, denominado R, se
comporta de una manera dominante. Por ello, las plantas u
homocigóticas R (es decir RR) o heterocigóticas R (es decir Rr)
serán resistentes a aplicaciones foliares de glifosato. Al empezar
por una composición alélica conocida, la segregación observada
puede ser comparada estadísticamente con la segregación esperada
usando un ensayo Chi-Cuadrado, una herramienta
estadística aceptada para comparar la desviación de valores
observados a partir de los esperados. Se encontró que, usando este
método de análisis, la segregación varía de una manera
estadísticamente significativa.
Especialmente, se ha observado que una planta de
maíz que es heterozigótica para el suceso de resistencia a
Glifosato GA21 se comporta como si fuera RR cuando se usa como polen
parental en un cruce con otra planta de maíz y cuando primero se ha
nebulizado con glifosato en un estadio vegetativo relativamente
avanzado, pero antes de la floración. En cambio, si la planta Rr no
se nebuliza con glifosato, o si la nebulización se realiza en un
estado vegetativo temprano del crecimiento, la planta se comporta
normalmente, y contribuyen ambos pólenes R y r en el cruce.
En el diagrama:
Con glifosato rr* Rr > Rr solo
Sin glifosato, o glifosato temprano rr* Rr >
rR + rr
Efectos similares no se ven en gametos
femeninos, o en conjuntos de semillas.
Sin limitarse a ninguna teoría o modo de acción,
se piensa que el herbicida residual dentro de la planta mata, o
inactiva, el polen r durante el desarrollo. Esto es consistente con
el modo de acción conocido del herbicida glifosato, que es
fácilmente translocado en la planta y que se acumulará en lugares de
alta actividad metabólica (sumideros) tales como las borlas y
anteras en desarrollo. Hay que mencionar también que GA21 es un
método de protección alternativo a la enzima, no un sistema de
degradación de herbicida, por lo que GA21 por sí mismo no debería
afectar a la distribución y persistencia del herbicida en la
planta.
El método de la invención se puede usar de
varias formas. En una forma, se puede usar para mejorar la pureza
de la producción de semillas endogámicas e híbridas (especialmente
cultivos resistentes a herbicidas, al prevenir la producción de
polen carente de los genes deseados).
Los estándares normales para la producción de
semillas permiten un 2-4% de semillas híbridas fuera
de tipo. Sin embargo, si el cultivo contiene un rasgo de
resistencia a herbicida, y el rasgo no está presente en los fuera
de tipo, morirán cuando el agricultor use el herbicida para el
control de las malas hierbas. La muerte de estas plantas puede
causar el interés del agricultor y, teóricamente al menos, puede
reducir, de alguna forma, el rendimiento (con el alcance de que los
fuera de tipo, los que han sobrevivido, puedan tener una colección
de grano). Esto se ha vuelto una cuestión significativa en los
EE.UU. durante el último par de años.
Una posible fuente de fuera de tipos se da
cuando el pariente macho se usa como donante del rasgo en un campo
de producción, y (usando glifosato como un ejemplo) contiene tanto
genotipos rr como Rr, así como el homozigótico deseado RR.
Obviamente, se puede usar glifosato por sí mismo para eliminar rr de
las hileras macho, por lo que no son un problema. Pero, debido a
que el rasgo es dominante, el herbicida no eliminará las plantas Rr.
Sin embargo, usando una nebulización de polen vegetativo tardío tal
como se describe más arriba, se eliminará el polen r estos
heterocigotos, por lo que se comportará como RR. Por tanto, se
evitará una fuente de fuera de tipo susceptibles.
\newpage
Así, en una aspecto adicional, la invención
proporciona, en el proceso para la conversión de germoplasma que se
da como resultado en la producción de semillas híbridas resistentes
a herbicida, un método para reducir el número de fuera de tipo
susceptibles a herbicida en la población de híbridos resistentes a
herbicida, dicho método comprende aplicar una nebulización a las
plantas parentales macho con dicho herbicida en el estadio
vegetativo tardío del crecimiento de forma que cualquier
heterocigoto entre la población producirá un polen que muestra
resistencia a herbicida como el rasgo dominante.
El método de la invención también puede ser
usado en el proceso para la conversión de germoplasto que se da
como resultado en la producción de plantas transgénicas.
Frecuentemente, la resistencia a herbicida se usa como un marcador
selectivo para permitir la selección de transformantes de éxito, que
incluyen un gen de rasgo deseado. En términos amplios, las plantas
se co-transforman con el gen del rasgo deseado así
como un gen de resistencia a herbicida. El gen del rasgo y el gen
de resistencia a herbicida preferiblemente están unidos, de forma
que ambos comparten el mismo destino en el proceso de
transformación. La aplicación de los herbicidas a los
transformantes eliminará los transformantes sin éxito, que no son
resistentes a herbicida, dejando sólo aquellas plantas que incluyen
el gen del rasgo deseado.
Usando el método de la invención, la unión, y
preferiblemente la unión estrecha, del gen del rasgo deseado al gen
de resistencia al herbicida se maximizará la producción de polen que
contiene el rasgo de las hileras de plantas macho, incluso si las
hileras contienen heterocigotos. Las ventajas asociadas al uso de
este polen en programas de cultivo son claras.
Así, en un aspecto adicional, la invención
proporciona un proceso para la conversión de germoplasma al
transformar una planta de maíz con un transgén deseado, dicho método
comprende
(i) transformar células de la planta de maíz con
un transgén deseado, dicho método comprende:
- \bullet
- una construcción que comprende un transgén deseado;
- \bullet
- un alelo dominante de resistencia a glifosato (R);
(ii) hacer crecer las plantas de maíz a partir
de dichas células de la planta de maíz;
(iii) aplicar glifosato a una población de
donantes parentales masculinos resistentes a herbicida que
comprenden el alelo dominante de resistencia a glifosato (R), en un
estado vegetativo avanzado antes de la floración;
(iv) usar dicha población tratada con glifosato
de donantes parientes macho resistentes a glifosato para fertilizar
plantas de maíz femeninas no tratadas;
(v) obtener semillas de dichas plantas de maíz
femeninas fertilizadas.
Adecuadamente, el transgén deseado y el gen de
resistencia al herbicida estarán en la misma construcción antes de
la transformación, aunque también se pueden usar los procedimientos
de co-transformación tal como se conocen en el
estado de la técnica.
Este método o proceso para la conversión de
germoplasma es particularmente ventajoso ya que proporciona un
rasgo deseado en alta pureza a partir del pariente macho.
Los transgenes deseados son bien conocidos en el
estado de la técnica. Éstos incluyen genes, que controlan la
esterilidad y/o fertilidad, así como genes que causan rasgos de
calidad tales como alto contenido en aceite.
En particular, este efecto se puede usar en la
tecnología de hibridación. Por ejemplo, usando la resistencia a
glifosato como un marcador/parte selectiva de una construcción para
un gen de muerte del gametofito masculino (gen S de esterilidad en
macho), se pueden crear plantas de estructura RSrs. Si ésta se
nebuliza con herbicida en un estadio vegetativo avanzado tal como
se describe en la presente memoria, será macho totalmente estéril.
Esto se debe a que el gen S esteriliza al polen R, y el glifosato en
sí invalida al polen r. Así, esto se puede usar como un pariente
hembra estéril en el campo de producción, eliminando así la
necesidad del caro despenachado a mano.
En cambio, si la planta crece en ausencia del
herbicida, todavía producirá el polen r. Así, los suministros del
heterocigoto pueden aumentar al hacerlo crecer en un campo de
aumento normal aislado sin glifosato, en cuyo caso estará en una
relación 1:1 de semillas RSrs y rsrs.
Los tipos rsrs no deseados, que también serán
producidos en este proceso, pueden ser fácilmente separados en la
siguiente generación, por ejemplo aplicando el herbicida.
Con el fin de aumentar las semillas parientes de
una generación a otra, se nebulizó con glifosato en un estadio
temprano del crecimiento, que eliminará las plantas
susceptibles, pero no afectará a la fertilidad de los heterocigotos
supervivientes.
Si se necesitan plantas como parientes hembra en
el campo de producción, se las podría nebulizar tanto antes como
después, primero para eliminar las plantas susceptibles, y segundo
para imponer la esterilidad masculina en los supervivientes. En
dicho sistema, el herbicida puede considerarse que actúa como un
"interruptor" en la esterilidad masculina.
Por ello, en un aspecto adicional, la invención
proporciona un método o proceso para la conversión de germoplasma,
dicho método de producción de plantas de maíz que son machos
estériles reversibles, dicho método comprende
(i) transformar una planta de maíz con una
construcción que comprende un gen de muerte del gametofito masculino
(S) y un gen de resistencia a glifosato (R);
(ii) seleccionar un transformante que es
heterozigótico con respecto a dichos genes de estructura RSrs, y
(iii) donde se necesiten plantas macho
estériles, aplicar glifosato a las plantas de maíz crecidas a partir
de dichos transformantes en un estado vegetativo avanzado antes de
la floración con el fin de inutilizar el polen fértil residual de
las mismas.
La selección en el estadio (ii) es llevada a
cabo de forma adecuada nebulizando herbicida en un estadio temprano
del crecimiento, tal como se mencionó más arriba.
En este sistema, puede ser de utilidad si el
pariente macho en el campo de producción también lleva resistencia a
herbicida similar, para evitar problemas de la derivación de la
nebulización en una línea pariente susceptible.
Este proceso permite el mantenimiento/aumento de
semillas parientes como un simple campo de aumento en lugar de como
un bloque de cruce, que es necesario para sistemas tradicionales de
esterilidad de machos, por ejemplo ECM (esterilidad citoplásmica de
machos).
Para algunos cultivos como trigo, es altamente
deseable ser capaz de plantar el macho con la hembra, en lugar de
tener los parientes en hileras separadas (el movimiento de polen de
una planta a otra es un problema para el trigo híbrido). Con el fin
de conseguir esto, la línea parental hembra lleva de forma adecuada
una resistencia dominante adicional y diferente al herbicida (por
ejemplo Liberty), mientras que el macho sólo lleva una, tal como la
resistencia a glifosato. Ambas nebulizaciones, temprana y tardía,
del herbicida común, en particular glifosato, pueden llevarse a
cabo como antes, con el fin de producir hembras que son estériles en
el género macho y para producir polen, que incluye resistencia
dominante a glifosato. Posteriormente, la aplicación del herbicida
adicional, tal como Liberty, tras la floración mataría las plantas
macho.
En una realización particular de la invención,
los rasgos como alto contenido en aceite, que se expresan en el
grano, pueden ser parcialmente cambiados por glifosato. Para este
propósito, la resistencia a glifosato es usada como un
marcador/parte selectiva de la construcción/fuertemente unida al
rasgo de calidad, y el rasgo de calidad está proporcionado por el
polinizador (que está en lo alto del sistema de cruce de alto
contenido en aceite). Luego, un polinizador heterozigótico puede o
proporcionar polen con rasgo puro, o una mezcla 1:1 de polen con y
sin rasgo, dependiendo de si ha sido nebulizado con glifosato en el
tiempo apropiado.
Una aplicación adicional del método de la
invención es evitar el silenciamiento del gen por transgenes.
Un problema principal para la conversión de
germoplasma por tecnología de transformación es que muchos sucesos
de transformación se vuelven inestables, tienen efectos secundarios
adversos en la planta hospedadora, o paran de funcionar varias
generaciones por debajo del rastreo de la planta transformante
principal. Esto necesita la producción de muchos sucesos y rastreo
empírico para encontrar unos que sean estables y que se puedan usar:
esto es largo, costoso, y, actualmente, probablemente la etapa
limitante de la tecnología.
Se ha observado que los problemas aparecen más
frecuentemente cuando las plantas se crean siendo homocigóticas
para el rasgo introducido (TT). Normalmente, es necesario tener
dichas plantas, con el fin de crear un pariente, que administrará el
rasgo en la producción híbrida.
Usando el método de la invención, se puede
evitar la conversión del germoplasma por la producción de plantas
homocigóticas. Usando la resistencia a glifosato como un marcador
selectivo, sólo es necesario producir y mantener una línea parental
homozigótica RTrt (siempre que esta línea sea usada como macho en un
cruce híbrido). Tal como se mencionó más arriba, el uso de
glifosato, nebulizado selectivamente sobre el pariente macho en el
campo de producción, hará su función como el homozigótico RTRT,
aunque se evitan los problemas asociados a los homocigotos normales
en términos de silenciamiento génico.
Así, en un aspecto adicional, la invención
proporciona un método o proceso de conversión del germoplasma por
producción de una planta transgénica que demuestra un rasgo deseado,
dicho método comprende cruzar una planta hembra que carece del
rasgo deseado, con el polen obtenido de una planta macho que es
heterozigótica para dicho rasgo deseado y también para una
resistencia a herbicida, y aplicar herbicida a la progenie en un
estadio avanzado del crecimiento vegetativo con el fin de asegurar
que el rasgo y la resistencia al herbicida son dominantes en el
polen.
De esta manera, la progenie del cruce segregará
Rr o rr. El rr puede ser separado en la generación siguiente
aplicando el herbicida, dejando así sólo las plantas Rr. Tras tratar
con herbicida de una manera que mata selectivamente el germinado r,
se pueden usar aquellas plantas como machos en otro cruce con la
hembra carente del rasgo, produciendo el siguiente ciclo de
progenie Rr y rr.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La progenie de un cruce entre una planta
homozigótica resistente (RR) y una planta homozigótica susceptible
(rr) se plantaron en el Garst Research Center cerca de Slater, IA, y
en el Hawai Research Center cerca de Kunia, HI. Se esperaba que
ninguna de las progenies pudieran segregar la resistencia a las
aplicaciones foliares de glifosato. Para ensayar esto, la progenie
que crece en el sitio de ensayo de IA se nebulizó con glifosato a un
ritmo de 1,81 Kilogramos (64 onzas) por 4,05 m^{2} (1 acre)
durante los estadios de crecimiento V5 y V6 (26 días tras el
transplante). Al mismo tiempo y ritmo, se nebulizaron varias plantas
en una hilera de plantas susceptibles conocidas. Todas las parcelas
nebulizadas se examinaron para la mortalidad de las plantas 7 días
después de la nebulización. Tal como se esperaba, todas las plantas
susceptibles control murieron mientras que las plantas resistentes
heterocigóticas putativas estaban vivas (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una segunda aplicación de 0,91 kilogramos por
4,05 m^{2} (1 acre) se aplicó a las plantas resistentes
heterocigóticas en el estadio de crecimiento V7 a V8 (9 días
después). Estas plantas comprendían la clase "Nebulizada" en
experimentos posteriores. En HI, ninguna de las plantas se nebulizó
con glifosato y estas plantas comprendían la clase "No
nebulizada" en experimentos posteriores. En ambas localizaciones,
se hicieron cruces entre las plantas resistentes heterocigóticas y
las plantas susceptibles homocigóticas.
\vskip1.000000\baselineskip
La progenie de los cruces de cada clase se
plantó en la localización de HI. Todas las plantas de la progenie
de cada clase se nebulizaron con glifosato a un ritmo de 1,81
Kilogramos (64 onzas) por 4,05 m^{2} (1 acre) durante los
estadios de crecimiento V3 a V4. Tres días tras la aplicación, se
hicieron las cuentas de las plantas resistentes y susceptibles para
cada clase. La segregación esperada, 1:1 resistente a susceptible,
se comparó con la segregación observada para cada clase (Tabla 2).
La segregación entre la progenie de la clase No nebulizada no
difería significativamente de la segregación esperada
(Chi-Cuadrado = 2,12, d.f. = 1, Prob > 0,1). Sin
embargo, la segregación entre la progenie de la clase Nebulizada
difería significativamente de la segregación esperada
(Chi-Cuadrado = 669,34, d.f. = 1, Prob <
0,01).
La ausencia de progenie susceptible entre la
clase nebulizada proporciona clara evidencia de que al tratar
plantas heterocigóticas resistentes con altas dosis de glifosato en
los estadios del crecimiento de la planta V5 y posteriores impone
una selección que favorece la producción exclusiva de polen
resistente.
Claims (12)
1. Un método de producción de semillas de maíz
híbridas resistentes a glifosato, comprendiendo dicho método:
(i) aplicar glifosato a una población de
donantes parentales masculinos resistentes a herbicida que
comprenden el alelo dominante de resistencia a glifosato (R), en un
estadio vegetativo avanzado antes de la floración;
(ii) usar dicha población tratada con glifosato
de donantes parentales masculinos resistentes a glifosato para
fertilizar plantas de maíz femeninas no tratadas;
(iii) obtener semillas de maíz a partir de
dichas plantas de maíz femeninas fertilizadas.
2. Un método según la reivindicación 1, donde
las plantas de maíz femeninas no tratadas son homocigóticas (rr)
sensibles a glifosato, que proporcionan semillas de maíz
heterocigóticas (Rr) para dicho alelo de resistencia a
glifosato.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2,
donde en la etapa (i), el glifosato es aplicado en el estadio V5
del crecimiento o más tarde.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde las plantas parentales de maíz macho
contienen además un transgén deseado.
5. Un método según la reivindicación 4, donde el
transgén adicional es un gen, que codifica un rasgo de calidad, que
es liberado por un polinizador.
6. Un método según la reivindicación 5, donde el
rasgo de calidad comprende un sistema de alto contenido en
aceite.
7. Un método según la reivindicación 4, donde el
transgén es un gen de control de la fertilidad/esterilidad.
8. Un método según la reivindicación 7, donde
dicho gen de control de la fertilidad/esterilidad es un gen de
esterilidad masculina.
9. Un método o proceso de conversión de
germoplasma por producción de plantas de maíz que son machos
estériles reversibles, comprendiendo dicho método:
(i) transformar una planta de maíz con una
construcción que comprende un gen de muerte del gametofito masculino
(S) y un gen de resistencia a glifosato (R);
(ii) seleccionar un transformante que es
heterozigótico con respecto a dichos genes de estructura RSrs, y
(iii) cuando se necesiten machos estériles,
aplicar glifosato a las plantas de maíz que crecen a partir de
dichos transformantes en un estadio vegetativo avanzado antes de la
floración con el fin de invalidar el polen fértil residual de las
mismas.
10. Un método según la reivindicación 9, donde
la selección en la etapa (ii) es llevada a cabo aplicando glifosato
en un estadio temprano del crecimiento.
11. Un método o proceso de conversión de
germoplasma por transformación de un planta de maíz con un transgén
deseado, comprendiendo dicho método:
(i) transformar células de planta a partir de
maíz con un transgén deseado, comprendiendo dicho método:
- \bullet
- una construcción que comprende un transgén deseado;
- \bullet
- un alelo dominante de resistencia a glifosato (R) tal como se define en la reivindicación 1;
(ii) hacer crecer plantas de maíz a partir de
dichas células de planta de maíz transformadas;
(iii) aplicar glifosato a una población de
donantes parentales masculinos resistentes a herbicida que
comprenden el alelo dominante de resistencia a glifosato (R), en un
estadio vegetativo avanzado antes de la floración;
(iv) usar dicha población tratada con glifosato
de donantes parentales masculinos resistentes a glifosato para
fertilizar plantas de maíz femeninas no tratadas.;
(v) obtener semillas a partir de dichas plantas
de maíz femeninas fertilizadas.
12. Un método según la reivindicación 11, donde
el maíz parental femenino carece del transgén deseado.
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