ES2324994T3 - Iniciador para polimerizacion radicalica viva que comprende un grupo funcional que puede reaccionar con polipeptidos o similares, polimero tipo peine obtenido con el mismo, conjugados con polipeptido y farmacoobtenido a partir del mismo. - Google Patents

Iniciador para polimerizacion radicalica viva que comprende un grupo funcional que puede reaccionar con polipeptidos o similares, polimero tipo peine obtenido con el mismo, conjugados con polipeptido y farmacoobtenido a partir del mismo. Download PDF

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Giuseppe Mantovani
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Abstract

Método de producción de un polímero tipo peine que comprende las etapas de: (a) proporcionar: (i) una pluralidad de monómeros que son lineales, ramificados o en forma de estrella, sustituidos o no sustituidos, y tienen un resto olefínicamente insaturado, pudiendo el resto olefínicamente insaturado experimentar polimerización por adición; (ii) un compuesto iniciador; comprendiendo el compuesto iniciador un enlace escindible de manera homolítica. (iii) un catalizador que puede catalizar la polimerización del monómero; y (b) hacer que el catalizador catalice, en combinación con el iniciador, la polimerización de una pluralidad de los monómeros para producir el polímero tipo peine; en el que el compuesto iniciador (ii) comprende un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazarse covalentemente a una sustancia biológica seleccionada de una proteína, un polipéptido, un ácido nucleico, un hidrato de carbono o una grasa y en el que los monómeros en (i) comprenden alcoxi-poliéteres.

Description

Iniciador para polimerización radicálica viva que comprende un grupo funcional que puede reaccionar con polipéptidos o similares, polímero tipo peine obtenido con el mismo, conjugados con polipéptido y fármaco obtenido a partir del mismo.
La invención se refiere a procedimientos de preparación de polímeros tipo peine a partir de monómeros que comprenden alcoxi-poliéteres, tales como polialquilenglicol tal como poli(etilenglicol) o politetrahidrofurano (PTHF). Tales métodos pueden incluir el uso de un compuesto iniciador que comprende un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazarse a una proteína o un polipéptido. Los polímeros tipo peine terminados y compuestos iniciadores, y sus usos, también están incluidos dentro de la invención.
Se conoce bien en la técnica la modificación de proteínas con polímeros tales como poli(etilenglicol), que se conoce con la abreviatura PEG. Fabrican derivados de PEG, por ejemplo, Shearwater Corporation, Huntsville, AL., EE.UU., y Enzon, Inc., Bridgewater, NJ., EE.UU. Se revisan los usos de PEG en catálogos de estas dos empresas, y de hecho en el Informe Anual de 2002 de Enzon, Inc.
Se ha encontrado que la unión de PEG a proteínas o polipéptidos, conocida como pegilación, tiene varios beneficios. En primer lugar, esto reduce la antigenicidad e inmunogenicidad de una molécula a la que se une PEG. PEG también produce semividas circulantes in vivo notablemente mejoradas debido o bien a que se elude el aclaramiento renal como resultado de que el polímero aumenta el tamaño aparente de la molécula por encima del límite de filtración glomerular, y/o bien a través de eludir los mecanismos de aclaramiento celular. PEG puede mejorar notablemente la solubilidad de las proteínas y los polipéptidos a los que se une, por ejemplo, se ha encontrado que PEG es soluble en muchos disolventes diferentes, oscilando desde agua hasta muchos disolventes orgánicos tales como tolueno, cloruro de metileno, etanol y acetona. Una aplicación de esto ha consistido en usar anticuerpos modificados con PEG, por ejemplo para el reparto en fases de células o moléculas diana. También se ha encontrado que la pegilación potencia la resistencia proteolítica de la proteína conjugada y mejora la biodisponibilidad mediante pérdidas reducidas en los sitios de inyección subcutánea. También se ha observado que la pegilación reduce la toxicidad de las proteínas o los polipéptidos a los que se une, mejora la estabilidad térmica y mecánica de las moléculas y permite la formulación mejorada en materiales usados para algunas estrategias de administración con liberación retardada. Estas ventajas se revisan, por ejemplo, en los artículos de Chapman A.P. (Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 54 (2002), páginas 531-545). La química de la pegilación de polipéptidos y proteínas se revisa adicionalmente en el artículo de Roberts, M.J., et al. (Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 54 (2002), páginas 459-476), y el artículo de Kinstler, O., et al. (Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 54 (2002), páginas 477-485).
Hay en el mercado varios fármacos pegilados, por ejemplo, PEG-INTRON^{TM} es un producto de \alpha-interferón producido por Schering-Plough y Enzon, Inc. que se usa para tratar la hepatitis C y el cáncer. Prothecan^{TM} es una versión potenciada con PEG de camptotecina, un inhibidor de la topoisomerasa I que es eficaz contra algunos cánceres. También se han producido taxol y varios productos a base de enzimas pegilados que muestran, por ejemplo, una mejor captación en tumores y efectos secundarios reducidos en comparación con los compuestos no pegilados. Tal como se trata en la revisión de Roberts (citado anteriormente), pueden unirse polímeros tales como PEG mediante varios aminoácidos reactivos en moléculas de proteína o polipéptido, incluyendo lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, tirosina, grupos amino N-terminal y grupos ácido carboxílico C-terminal. En el caso de glicoproteínas, pueden oxidarse grupos hidroxilo vecinales con peryodato para formar dos restos formilo reactivos. Puede unirse una amplia variedad de grupos funcionales a compuestos tales como PEG para permitir que se unan a grupos amina de lisina y grupos amina N-terminal. Estos incluyen succinato de succinimidilo, hidroxisuccinamida y ésteres de hidroxisuccinamida, derivados de aldehído tales como propionaldehído y acetaldehído, derivados de propionato y butanoato de succinimidilo, carbonato de benzotriazol, carbonato de p-nitrofenilo, carbonato de triclorofenilo y carbonilimidazol. Se sabe que compuestos tales como tresilato se enlazan a proteínas mediante ataque nucleófilo. También hay varios compuestos que pueden reaccionar con residuos de cisteína en proteínas o polipéptidos. Estos incluyen maleimidas, vinilsulfonas, sulfuros de piridilo y yodoacetamidas. Además, también puede usarse carbonato de succinimidilo como grupo funcionalizado para unir PEG u otros polímeros a los aminoácidos alanina o histidina en una proteína o un polipéptido. Como ya se ha indicado, la reacción de tales grupos funcionalizados ya está bien caracterizada tal como se indica en los artículos de Roberts, Kinsler y Chapman, y de hecho tal como se muestra, por ejemplo, en el catálogo de Shearwater (2001).
El PEG actualmente en el mercado normalmente está en forma de largos polímeros de poli(etilenglicol) o poli(etilenglicoles) ramificados o en forma de estrella.
Los solicitantes han identificado ahora que es posible producir polímeros tipo peine lo que permite que se varíe y que se controle el tamaño del polímero unido a sustancias biológicas, por ejemplo, proteínas y polipéptidos, ácidos nucleicos (ADN y ARN), hidratos de carbono y grasas. Esto permite la posibilidad de producir una amplia variedad de diferentes polímeros para su unión a proteínas y polipéptidos, que pueden variar en tamaño y volumen hidrodinámico para variar las propiedades del compuesto al que se une el polímero. Por ejemplo, esto puede usarse para variar la estabilidad, solubilidad, toxicidad y/o tiempo de retención del fármaco de un fármaco que se ha unido covalentemente a tales copolímeros. Tales copolímeros pueden producirse de manera controlada mediante la denominada polimerización viva por radicales.
La polimerización viva por radicales es objeto de la solicitud de patente internacional número WO 97/47661. También se muestran catalizadores de polimerización soportados e iniciadores de la polimerización específicos en los documentos WO 99/28352 y WO 01/94424. Básicamente, el sistema utiliza un compuesto complejado con un metal de transición. Este compuesto es preferiblemente una organodiimina, aunque uno de los nitrógenos de la diimina preferiblemente no es parte de un anillo aromático (por ejemplo, un 1,4-diaza-1,3-butadieno, una 2-piridincarbaldehído-imina, una oxazolidona o un quinolin-carbaldehído).
También se conocen sistemas vivos por radicales libres, que implican el uso de iniciadores de radicales libres, véanse por ejemplo los documentos WO 96/30421 y WO 97/18247. Esto se revisa en Kamigaito, et al., Chem. Rev. (2001), Vol. 12, páginas 3689-3745.
En el pasado, se ha utilizado una combinación del catalizador y los iniciadores para polimerizar monómeros olefínicamente insaturados, tales como monómeros vinílicos. Los inventores se han dado cuenta ahora de que estos sistemas pueden utilizarse para producir polímeros tipo peine de manera controlada. Estos polímeros tipo peine pueden tener un grupo funcional unido a ellos mediante química convencional. Sin embargo, los inventores también se han dado cuenta de que los iniciadores utilizados en la polimerización viva por radicales se unen al polímero tipo peine como resultado de la reacción del iniciador con los monómeros. Esto significa que es posible funcionalizar el polímero tipo peine en el mismo momento de la producción del copolímero, utilizando un iniciador funcionalizado.
En consecuencia, el primer aspecto de la invención proporciona un método de producción de un polímero tipo peine que comprende las etapas de:
(a)
proporcionar:
(i)
una pluralidad de monómeros que son lineales, ramificados o en forma de estrella, sustituidos o no sustituidos; y tienen un resto olefínicamente insaturado unido a los mismos, pudiendo el resto olefínicamente insaturado experimentar polimerización por adición;
(ii)
un compuesto iniciador; comprendiendo el compuesto iniciador un enlace escindible de manera homolítica;
(iii)
un catalizador que puede catalizar la polimerización del monómero; y
(b)
hacer que el catalizador catalice, en combinación con el iniciador, la polimerización de una pluralidad de los monómeros para producir el polímero tipo peine;
en el que el compuesto iniciador (ii) comprende un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazarse a una sustancia biológica, seleccionada de una proteína, un polipéptido, un ácido nucleico, un hidrato de carbono o una grasa y en el que los monómeros en (i) comprenden alcoxi-poliéteres tales como poli(alquilenglicol) o politetrahidrofurano.
El polímero tipo peine puede tener un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazar por ejemplo, una proteína o un polipéptido, unirse a la misma/al mismo usando química convencional. Sin embargo, como ya se ha indicado, es posible producir compuestos iniciadores que tienen ese resto unido a ellos. Por tanto, el compuesto iniciador comprende un resto que, cuando se une a un polímero tipo peine, puede enlazarse a una sustancia biológica, tal como una proteína o un polipéptido, un ácido nucleico (ADN o ARN), hidratos de carbono o
grasas.
Preferiblemente, el poli(alquilenglicol) es un polímero de un alquilenglicol que contiene desde 2-10, especialmente al menos 3, átomos de carbono, lo más preferiblemente poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) o poli(butilenglicol). Por ejemplo, puede usarse poli(etilenglicol).
En su forma más común, éste es un poliéter lineal o ramificado terminado con grupos hidroxilo. Éste se sintetiza mediante polimerización aniónica con apertura de anillo de óxido de etileno iniciada por ataque nucleófilo de un ion hidróxido al anillo de epóxido. También es posible modificar polietilenglicol, por ejemplo situando un grupo monometoxilo en un extremo para producir monometoxi-PEG (mPEG). Éste se sintetiza mediante polimerización iónica con apertura de anillo iniciada con iones metóxido y está disponible comercialmente. Sin embargo, cantidades traza de agua presentes en la mezcla de reacción provocan la producción de cantidades significativas de PEG que está terminado en ambos extremos con grupos hidroxilo. Esto es indeseable, ya que el resto que puede enlazarse a proteínas o péptidos se unirá entonces a ambos extremos de la cadena polimérica, lo que provocará la reticulación no deseada de proteínas en el organismo.
Un método que pretende minimizar la producción de esta impureza consiste en iniciar la apertura de anillo del óxido de etileno mediante ataque nucleófilo de un ion benzoxilo al anillo de epóxido. De manera similar al procedimiento anterior, se produce monobenzoxi-PEG, así como la cadena de PEG terminada en ambos extremos con hidroxilo. Esta mezcla se metila, produciendo una cadena terminada con BzO y OMe, y dimetoxi-PEG. La hidrogenación de esta mezcla elimina el grupo benzoxilo para producir mPEG y dimetoxi-PEG. Sigue estando presente dimetoxi-PEG como impureza inerte. Sin embargo, incluso usando este procedimiento, el producto obtenido todavía contiene el 5-10% del dihidroxi-PEG no deseado según su certificado de análisis.
El procedimiento de la presente invención da lugar a un producto que es sustancialmente puro al 100%, eliminando sustancialmente la totalidad de la impureza dihidroxi-PEG, evitando así las desventajas de los procedimientos conocidos y eliminando la posibilidad de la reticulación de proteínas.
Están disponibles polímeros ramificados y en forma de estrella tales como PEG a partir de varias fuentes comerciales, tales como Enzon y Shearwater. También pueden obtenerse politetrahidrofuranos a partir de fuentes comerciales, tales como Aldrich (Gillingham, Dorset, RU.).
Preferiblemente, el peso molecular del metacrilato de PEG es de 475, 1100, 2080, 5000 ó 20.000.
El polialquilenglicol y el politetrahidrofurano comprenden un resto olefínicamente insaturado, por ejemplo en el extremo de la cadena polimérica. Este resto olefínicamente insaturado puede experimentar polimerización adicional.
El monómero olefínicamente insaturado puede ser un metacrilato, un acrilato, un estireno, metacrilonitrilo o un dieno tal como butadieno.
Los ejemplos de restos olefínicamente insaturados que pueden usarse incluyen metacrilato de metilo, metacrilato de etilo, metacrilato de propilo (todos los isómeros), metacrilato de butilo (todos los isómeros) y otros metacrilatos de alquilo; los correspondientes acrilatos; también metacrilatos y acrilatos funcionalizados incluyendo metacrilato de glicidilo, metacrilato de trimetoxisililpropilo, metacrilato de alilo, metacrilato de hidroxietilo, metacrilato de hidroxipropilo, metacrilatos de dialquilaminoalquilo tales como metacrilato de dimetiletilamino; (met)acrilatos de fluoroalquilo; ácido metacrílico, ácido acrílico; ácido fumárico (y ésteres), ácido itacónico (y ésteres), anhídrido maleico: estireno, \alpha-metil-estireno; haluros de vinilo tales como cloruro de vinilo y fluoruro de vinilo; acrilonitrilo, metacrilonitrilo; glicerol; haluros de vinilideno de fórmula CH_{2} = C(Hal)_{2} en la que cada halógeno es independientemente Cl o F; butadienos opcionalmente sustituidos de fórmula CH_{2} = C(R^{15}) C(R^{15}) = CH_{2} en la que R^{15} es independientemente H, alquilo C_{1} a C_{10}, Cl o F; ácidos sulfónicos o derivados de los mismos de fórmula CH_{2} = CHSO_{2}OM en la que M es Na, K, Li, N(R^{16})_{4} en el que cada R^{16} es independientemente H o alquilo C_{1} a C_{10}, COZ, ON, N(R^{16})_{2} o SO_{2}OZ y Z es H, Li, Na, K o N(R^{16})_{4}; acrilamida o derivados de la misma de fórmula CH_{2} = CHCON(R^{16})_{2} y metacrilamida o un derivado de la misma de fórmula CH_{2} = C(CH_{3})CON(R^{16})_{2}.
Pueden usarse mezclas de tales monómeros.
Tales restos insaturados pueden unirse, por ejemplo, en un extremo del polímero, mediante química convencional. Alternativamente, tales monómeros pueden obtenerse comercialmente. Por ejemplo, acrilato, diacrilato, metacrilato y dimetacrilato de PEG están disponibles comercialmente a partir de Aldrich (Gillingham, Dorset, RU.).
El resto insaturado puede unirse al polialquilenglicol o politetrahidrofurano por medio de cualquier grupo de unión adecuado, por ejemplo por medio de una unión de metil éter. De ese modo, es posible utilizar metacrilato de metil éter de poli(etilenglicol) (disponible de Aldrich Chemicals). Una ventaja de usar la técnica de polimerización viva por radicales es que pueden usarse sin purificación adicional compuestos disponibles comercialmente tales como éste, que tienen inhibidores de radicales libres, tales como hidroquinonas. Con sistemas convencionales basados en radicales libres, la presencia de un inhibidor de radicales libres inhibirá la reacción de polimerización por adición. Este no es el caso con la polimerización viva por radicales.
El compuesto iniciador puede comprender un enlace escindible de manera homolítica con un átomo de halógeno. Éste puede contener un enlace que se rompe sin la formación de cargas enteras en ningún átomo mediante fisión homolítica. Tal como se describe en los documentos WO 97/01589, WO 99/28352 y WO 01/94424, se cree que no parece que se formen verdaderos radicales libres usando algunos catalizadores. Se cree que esto se produce de manera concertada mediante lo cual el monómero se inserta en el enlace sin la formación de una especie de radical libre diferenciada en el sistema. Es decir, durante la propagación esto da como resultado la formación de un nuevo enlace carbono-carbono y un nuevo enlace carbono-halógeno sin la formación de radicales libres. No se produce un radical libre que es un átomo o grupo de átomos que tienen un electrón de valencia desapareado y que es una entidad separada sin interacciones, mediante la interacción del compuesto iniciador con el monómero con el que interacciona.
Se describen compuestos iniciadores adecuados, por ejemplo, en el documento WO 97/47661. Sin embargo, es preferible que el compuesto iniciador también comprenda un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazarse a una proteína o un polipéptido. Estos restos se conocen en la técnica, tal como se describe de hecho en Roberts, et al. (citado anteriormente), Chapman (citado anteriormente) y, por ejemplo, en los catálogos de Enzon y Shearwater.
El iniciador puede ser tioéster o xantato. Éstos se usan en las denominadas RAFT (polimerización de transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible y mediada por óxido nítrico) y catálisis MADIX. Los iniciadores y sus reacciones se describen en los documentos WO 99/31144, WO 98/01478 y US 6.153.705.
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Preferiblemente, el compuesto iniciador (ii) se selecciona de:
A-S-C(O)-R, A-S-C(S)-O-R, R-S-C(O)-A, R-S-C(S)-O-A, en los que R es alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada, cíclico, heterocíclico o aromático, C_{1} a C_{20}, sustituido o no sustituido;
1
en los que:
X =
un haluro, especialmente Cl o Br,
A =
un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazarse a una proteína o un polipéptido,
B
es un grupo de unión y puede o no estar presente.
A se selecciona preferiblemente de succinato de succinimidilo, N-hidroxisuccimimida, propionato de succinimidilo, butanoato de succinimidilo, propionaldehído, acetaldehído, tresilato, triazina, vinilsulfona, carbonato de benzotriazol, maleimida, sulfuro de piridilo, yodoacetamida y carbonato de succinimidilo.
El grupo de unión se selecciona preferiblemente de un grupo alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada, cíclico, heterocíclico o aromático, C_{1} a C_{20}, sustituido o no sustituido; -(CH_{2}Z)_{a}CH_{2}-, -CH_{2}ZCH_{2}-, -(CH_{2}CH_{2}Z)_{n}-R, -(CH_{2}CH(CH_{3})Z)_{n}-R, -(CH_{2})_{b}-C(O)-NH-(CH_{2})_{c}-, -(CH_{2})_{a}-NH-C(O)-(CH_{2})_{y}-, -N(R)_{2}-; -S-; -N-R; u -O-R; en los que R = alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada, cíclico, heterocíclico o aromático, C_{1} a C_{20}, sustituido o no sustituido, Z es O o S, y n, a, b y c son independientemente números enteros que pueden seleccionarse entre 1 y 10. Preferiblemente, el grupo de unión contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 átomos de carbono. Lo más preferiblemente, el grupo de unión es metilo, etilo, propilo, butilo o pentilo.
Preferiblemente, el resto que puede reaccionar con la proteína o polipéptido tiene la fórmula:
2 
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3
4 
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Lo más preferiblemente, el iniciador (ii) tiene una fórmula:
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5 
\newpage
El iniciador tiene un compuesto seleccionado de:
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6 
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7 
\newpage
El catalizador puede ser capaz de catalizar la reacción de polimerización mediante polimerización viva por radicales (véase por ejemplo, el documento WO 97/47661) o polimerización viva por radicales libres (véanse por ejemplo, los documentos WO 96/30421, WO 97/18247 y Kamagaito M., et al., Chem. Rev. (2001), Vol. 101 (12), páginas 3689-3745).
Preferiblemente, el catalizador comprende un ligando que es cualquier compuesto que contiene N, O, P o S que puede coordinarse en un enlace \delta a un metal de transición o cualquier compuesto que contiene carbono que puede coordinarse en un enlace \pi al metal de transición, de manera que no se forman enlaces directos entre el metal de transición y los radicales poliméricos en crecimiento.
El catalizador puede comprender un primer compuesto
\vskip1.000000\baselineskip
MY
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en el que:
M es un metal de transición que tiene un estado de oxidación que puede oxidarse en un estado de oxidación
formal,
Y es un contraión mono, divalente o polivalente.
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El catalizador también puede estar definido por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
[MLm]^{n+}A^{n-}
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
M =
un metal de transición que tiene un estado de oxidación que puede oxidarse en un estado de oxidación formal,
L =
una organodiimina en la que al menos uno de los nitrógenos de la diimina no es parte de un anillo aromáti- co,
A =
anión,
n =
número entero de 1 a 3,
m =
un número entero de 1 a 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El ion metálico puede unirse a un ligando de coordinación, tal como (CH_{3}CN)_{4}. Y puede elegirse de Cl, Br, F, I, NO_{3}, PF_{6}, BF_{4}, SO_{4}, CN, SPh, SCN, SePh o triflato (CF_{3}SO_{3}). Puede usarse triflato de cobre (I). Éste está disponible en forma de un complejo de benceno disponible comercialmente, (CF_{3}SO_{3}Cu)_{2}C_{6}H_{6}.
El compuesto usado preferido especialmente es CuBr.
A puede ser F, Cl, Br, I, N, O_{3}, SO_{4} o CuX_{2} (en el que X es un halógeno).
El metal de transición puede seleccionarse de Cu^{+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+}, Ru^{2+}, Ru^{3+}, Cr^{2+}, Cr^{3+}, Mo^{2+}, Mo^{3+}, W^{2+}, W^{3+}, Mn^{3+}, Mn^{4+}, Rh^{3+}, Rh^{4+}, Re^{2+}, Re^{3+}, Co^{+}, Co^{2+}, V^{2+}, V^{3+}, Zn^{+}, Zn^{2+}, Au^{+}, Au^{2+}, Ag^{+} y Ag^{2+}.
\newpage
Preferiblemente la organodiimina tiene una fórmula seleccionada de:
\vskip1.000000\baselineskip
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8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que R_{1}, R_{2}, R_{10}, R_{11}, R_{12} y R_{13} pueden variarse independientemente y R_{1}, R_{2}, R_{10}, R_{11}, R_{12} y R_{13} pueden ser H, alquilo saturado de cadena lineal, de cadena ramificada o cíclico, hidroxialquilo, carboxialquilo, arilo (tal como fenilo o fenilo sustituido en el que la sustitución es tal como se describe para R_{4} a R_{9}), CH_{2}Ar (en el que Ar = arilo o arilo sustituido) o un halógeno. Preferiblemente R_{1}, R_{2}, R_{10}, R_{11}, R_{12} y R_{13} pueden ser un alquilo C_{1} a C_{20}, hidroxialquilo o carboxialquilo, en particular alquilo C_{1} a C_{4}, especialmente metilo o etilo, n-propilisopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, ciclohexilo, 2-etilhexilo, octilo, decilo o laurilo.
\newpage
Los ligandos preferidos incluyen:
9 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
10 
\newpage
\global\parskip0.880000\baselineskip
11
en las que:
* indica un centro quiral
R_{14} = hidrógeno, alquilo de cadena ramificada C_{1} a C_{10}, carboxi- o hidroxi-alquilo C_{1} a C_{10}.
Preferiblemente, el catalizador es
12
Preferiblemente, la organodiimina es N-(n-propil)-2-piridilmetanimina (NMPI), N-etil-2-piridil-metanimina o N-(n-etil)-2-piridilmetanimina.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se describen otros catalizadores en los documentos WO 96/30421 y WO 97/18247.
Preferiblemente el catalizador comprende un grupo bipiridina, tal como 4,4'-di(5-nonil)-2.2'-bipiridilo (dNbpy).
Puede usarse una pluralidad de diferentes monómeros tal como se define en la parte (i) de la invención. Esto permite la producción de copolímeros estadísticos.
Alternativa, o adicionalmente, puede producirse un copolímero de bloque polimerizando adicionalmente uno o más de diferentes monómeros olefínicamente insaturados. Por ejemplo, los monómeros olefínicamente insaturados pueden seleccionarse de metacrilato de metilo, metacrilato de etilo, metacrilato de propilo (todos los isómeros), metacrilato de butilo (todos los isómeros) y otros metacrilatos de alquilo; los correspondientes acrilatos; también metacrilatos y acrilatos funcionalizados incluyendo metacrilato de glicidilo, metacrilato de trimetoxisililpropilo, metacrilato de alilo, metacrilato de hidroxietilo, metacrilato de hidroxipropilo, metacrilatos de dialquilaminoalquilo; (met)acrilatos de fluoroalquilo; ácido metacrílico, ácido acrílico; ácido fumárico (y ésteres), ácido itacónico (y ésteres), anhídrido maleico: estireno, \alpha-metil-estireno; haluros de vinilo tales como cloruro de vinilo y fluoruro de vinilo; acrilonitrilo, metacrilonitrilo; haluros de vinilideno de fórmula CH_{2} = C(Hal)_{2} en la que cada halógeno es independientemente Cl o F; butadienos opcionalmente sustituidos de fórmula CH_{2} = C(R^{15}) C(R^{15}) = CH_{2} en la que R^{15} es independientemente H, alquilo C_{1} a C_{10}, Cl o F; ácidos sulfónicos o derivados de los mismos de fórmula CH_{2} = CHSO_{2}OM en la que M es Na, K, Li, N(R^{16})_{4} en el que cada R^{16} es independientemente H o alquilo C_{1} a C_{10}, COZ, ON, N(R^{16})_{2} o SO_{2}OZ y Z es H, Li, Na, K o N(R^{16})_{4}; acrilamida o derivados de los mismos de fórmula CH_{2} = CHCON(R^{16})_{2} y metacrilamida o un derivado de la misma de fórmula CH_{2} = C(CH_{3})CON(R^{16})_{2}.
Los monómeros pueden polimerizarse antes o después de la polimerización de los monómeros tal como se define en la parte (I) de la invención.
La reacción de polimerización puede ser reactiva en varios disolventes diferentes, tales como disolventes hidrófobos o hidrófilos. Estos incluyen agua, propionitrilo, hexano, heptano, dimetoxietano, dietoxietano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dietil éter, N,N-dimetilformamida, anisol, acetonitrilo, difenil éter, isobutirato de metilo, butan-2-ona, tolueno y xileno.
La temperatura de reacción puede llevarse a cabo desde -20 hasta superior a 200ºC, especialmente de +5 a 130ºC. El documento WO 97/47661, por ejemplo, muestra ejemplos de polimerización viva por radicales y las condiciones típicas que pueden usarse.
Preferiblemente, la razón de organodiimina:metal de transición es de 0,01 a 1000, preferiblemente de 0,1 a 10, y de ion de metal de transición (como MY):iniciador es de 0,0001 a 1000, preferiblemente de 0,1 a 10, en la que el grado de polimerización está controlado por la razón de monómero con respecto a iniciador. Todas las razones se proporcionan como peso:peso. Preferiblemente, los componentes son el catalizador de fórmula: [MLm]^{n+}A^{n-} (definida anteriormente) que está a una razón de catalizador:iniciador de 3:1 a 1:100.
Preferiblemente, la cantidad de diimina:metal usada en el sistema es de entre 100:1 y 1:1, preferiblemente de 5:1 a 1:1, más preferiblemente de 3:1 a 1:1, en peso.
Preferiblemente la concentración de monómero en un disolvente usado es del 100% - 1%, preferiblemente del 100% - 5%, vol:vol.
Las razones preferidas de iniciador con respecto a catalizador son de 1:100 - 100:1, normalmente 1:1.
Las razones preferidas de monómero:iniciador son de 1:1 a 10.000:1, especialmente de 5:1 a 100:1.
La reacción puede realizarse bajo una atmósfera inerte tal como nitrógeno o argón, y puede llevarse a cabo en suspensión, emulsión, miniemulsión o en una dispersión.
Preferiblemente, el catalizador es un catalizador soportado, es decir, al menos una parte del catalizador está unida a un soporte. Tales catalizadores soportados se muestran, por ejemplo, en el documento WO 99/25352.
El soporte puede ser inorgánico, tal como sílice, especialmente gel de sílice. Alternativamente, el soporte puede ser orgánico, especialmente un polímero orgánico, tal como un polímero orgánico reticulado, incluyendo poli(estireno-w-divinilbenzona). El soporte puede estar en forma de perlas. La ventaja de usar un catalizador soportado es que permite que se retire el catalizador del sistema y se recicle/reutilice.
El polímero tipo peine puede incorporar un monómero marcado de manera fluorescente. Por ejemplo, el método puede comprender adicionalmente una etapa de copolimerización o polimerización en bloque con al menos un monómero marcado de manera fluorescente que puede experimentar polimerización por adición. Esto puede llevarse a cabo simplemente usando un monómero que tiene un resto fluorescente, tal como fluoresceína, o cumarina, unido a un resto olefínicamente insaturado. El resto olefínicamente insaturado puede seleccionarse de los restos insaturados definidos anteriormente.
Preferiblemente, el marcador fluorescente es cumarina, especialmente cumarina 343. La cumarina es particularmente ventajosa porque permite que el polímero tipo peine se use para unirse a proteínas y que la unión de las proteínas se visualice usando un microscopio confocal. Esto permite, por ejemplo, la detección de proteínas individuales o en efecto la visualización de células bacterianas u otras células completas. De hecho, los resultados iniciales han indicado que pueden visualizarse fácilmente células bacterianas, usando un polímero tipo peine según la invención, para unirse a células de E. coli y Streptomyces.
Un aspecto adicional de la invención proporciona compuestos iniciadores que pueden usarse en una reacción de polimerización viva por radicales que comprende un resto que, cuando se une a un polímero, puede enlazarse a una proteína o un polipéptido. También se proporcionan iniciadores para su uso en una reacción de polimerización viva por radicales que tienen las fórmulas siguientes:
A-S-C(O)-R, A-S-C(S)-O-R, R-S-C(O)-A, R-S-C(S)-O-A, en las que R es alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada, cíclico, heterocíclico o aromático, C_{1} a C_{20}, sustituido o no sustituido;
13
en las que:
X =
un haluro, especialmente Cl o Br,
A =
un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazarse a una proteína o un polipéptido,
B
es un grupo de unión y puede o no estar presente.
Preferiblemente, A se selecciona de succinato de succinimidilo, N-hidroxisuccimimida, propionato de succinimidilo, butanoato de succinimidilo, propionaldehído, acetaldehído, tresilato, triazina, vinilsulfona, carbonato de benzotriazol, maleimida, sulfuro de piridilo, yodoacetamida y carbonato de succinimidilo.
Preferiblemente, el grupo de unión se selecciona de un grupo alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada, cíclico, heterocíclico o aromático, C_{1} a C_{20}, sustituido o no sustituido; -(CH_{2}Z)_{a}CH_{2}-, -CH_{2}ZCH_{2}-, -(CH_{2}CH_{2}Z)_{n}-R, -(CH_{2}CH(CH_{3})Z)_{n}-R, -(CH_{2})_{b}-C(O)-NH-(CH_{2})_{c}-, -(CH_{2})_{a}-NH-C(O)-(CH_{2})_{y}-, -N(R)_{2}-; -S-; -N-R; u -O-R; en los que R = alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada, cíclico, heterocíclico o aromático, C_{1} a C_{20}, sustituido o no sustituido, Z es O o S, y n, a, b y c son independientemente números enteros que pueden seleccionarse entre 1 y 10.
Preferiblemente, el resto que puede reaccionar con una proteína o un polipéptido tiene una fórmula:
14 
\newpage
\global\parskip0.890000\baselineskip
15
Preferiblemente el iniciador tiene una fórmula de:
16
El iniciador especialmente tiene la fórmula:
17
170
En condiciones normales, los iniciadores a base de aldehídos tenderán a reaccionar no selectivamente con proteínas, es decir, reaccionarán de manera sustancialmente igual tanto con átomos de nitrógeno terminales como, por ejemplo, un grupo NH_{2} de lisina, si las condiciones de reacción no se controlan. Sin embargo, con el pKa de reacción correcto para el aldehído particular elegido, puede controlarse el aldehído para que se dirija específicamente al nitrógeno terminal.
Un aspecto adicional de la invención proporciona polímeros tipo peine que pueden enlazarse a una proteína o un polipéptido que pueden obtenerse mediante un método de la invención.
Un aspecto adicional proporciona un polímero tipo peine que tiene una fórmula general:
A-(D)_{d}-(E)_{e}-(F)_{f}
en la que:
\quad
A es un resto que puede enlazarse a una proteína o un polipéptido,
\quad
D, puede obtenerse mediante polimerización adicional de uno o más monómeros olefínicamente insaturados que no son tal como se define en E.
\quad
E puede obtenerse mediante polimerización adicional de una pluralidad de monómeros que son lineales, ramificados o en forma de estrella, sustituidos o no sustituidos, y tienen un resto olefínicamente insaturado.
\quad
F, cuando está presente, puede obtenerse mediante polimerización adicional de uno o más monómeros olefínicamente insaturados que no son tal como se define en E.
\quad
d y f son un número entero entre 0 y 500, especialmente de 0 a 300 o de 0 a 100.
\quad
e es un número entero de 0 a 1000, especialmente de 0 a 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ó 900; en el que E comprende un alcoxi-poliéter.
Los monómeros preferidos usados para obtener E son poli(alquilenglicol) o politetrahidrofurano.
Esto incluye tanto polímero tipo peine funcionalizado como polímero tipo peine no funcionalizado, en el que el resto que puede unirse a una proteína o un polipéptido puede unirse después mediante otra química.
Preferiblemente, el polímero tipo peine tiene un peso molecular total promedio de 2.000-80.000, especialmente de 20.000-40.000.
Ejemplos de polímeros tipo peine preferidos, que pueden obtenerse según el procedimiento de la invención, son:
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Estos polímeros pueden usarse o bien directamente para reaccionar con biomoléculas útiles o bien simplemente convertirse en nuevas macromoléculas que reaccionarán con biomoléculas útiles.
El polímero tipo peine puede marcarse de manera fluorescente, especialmente con una cumarina. Todavía un aspecto adicional de la invención proporciona un método de unión de un polímero a un compuesto que comprende hacer reaccionar un polímero tipo peine según la invención con dicho compuesto. El compuesto puede ser una proteína o un polipéptido o puede ser, en efecto, cualquier compuesto que tiene un grupo tiol libre o amina libre adecuado, dependiendo del iniciador usado. Tales compuestos incluyen aminas, tales como bencilaminas y etilendiamina, aminoácidos e hidratos de carbono tales como azúcares.
Preferiblemente, tales compuestos son compuestos biológicamente activos, tales como fármacos. También se proporciona la combinación de tales compuestos en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos pueden incluir agentes quimioterápicos para el cáncer, antibióticos, antifúngicos y/o inmunosupresores.
Por ejemplo, las figuras 23 y 24 muestran perfiles de HPLC y SDS-PAGE para la reacción de lisozima con un polímero preparado según la invención. Estas figuras ilustran claramente el avance de la reacción a medida que el polímero se conjuga selectivamente sólo con uno de los siete grupos amino de la lisozima.
Todavía un aspecto adicional de la invención proporciona un método de marcaje de manera fluorescente de un compuesto, virus, microorganismo o célula que comprende la etapa de hacer reaccionar el compuesto, virus, microorganismo o célula con un polímero tipo peine marcado de manera fluorescente según la invención. También se proporciona el uso de un polímero tipo peine como marcador fluorescente.
El polímero tipo peine marcado de manera fluorescente puede usarse para unir anticuerpos que, a su vez, pueden usarse para enlazarse selectivamente a antígenos predefinidos. Esto permite que tenga lugar el marcaje selectivo de los compuestos.
Se conocen bien en la técnica métodos de producción de tales anticuerpos y, en efecto, pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante el método bien conocido de Kohler-Milstein.
Previamente, cuando se han usado polímeros para enlazarse a proteínas, tenían que ser de bajo peso molecular, ya que un polímero con un peso molecular, por ejemplo, de 20.000 no podría excretarse del organismo por el hígado. Para combatir este problema, se unieron cuatro polímeros de peso molecular de aproximadamente 5.000 cada uno a la proteína, y finalmente se excretaron sin problemas. Una ventaja que se proporciona mediante los polímeros tipo peine de la invención es que tienen pesos moleculares de 20.000 y que todavía se unen a las proteínas sin los problemas de excreción que se encuentran con los polímeros convencionales. Esto se debe a una unión éster que se encuentra en cada "dedo" del polímero tipo peine. Los resultados preliminares muestran que esta unión éster se hidroliza fácilmente por enzimas, haciendo que los dedos se desprendan gradualmente de la estructura principal del polímero. Esto permite que un polímero con un peso molecular de 20.000 se vuelva más pequeño con el tiempo hasta que alcanza un peso molecular que le permite que lo excrete el hígado. Los polímeros de cadenas convencionales no pueden ofrecer esta ventaja sino que permanecen en el torrente sanguíneo sin excretarse.
Los resultados iniciales indican que los polímeros tipo peine de la invención son estables durante semanas en suero de rata, pero se degradan lentamente de la manera descrita anteriormente.
Ahora se describirá la invención sólo a modo de ejemplo con referencia a los siguientes ejemplos:
La figura 1 muestra la evolución de la distribución del peso molecular y la polidispersidad para la LRP (polimerización viva por radicales) de metacrilato de metilo iniciada por un iniciador de N-hidroxisuccinimida (NHS).
La figura 2 muestra curvas de SEC para poli(MMA) funcionalizado con NHS, curva continua, y el producto (poli(MMA) funcionalizado con N-bencilamida, curva de trazos).
Figura 3. Representación gráfica de la cinética de primer orden para la LRP de PEGMA iniciada por NHS-Br, [PEGMA]_{o}/[CuBr]_{o}/[NHSBr]_{o}/[L]_{o} = 10/1/1/2,1 en tolueno (al 33% v/v) a 30ºC.
Figura 4. Evolución de la distribución del peso molecular y la polidispersidad para la LRP de PEGMA iniciada por NHSBr, [PEGMA]_{o}/[CuBr]_{o}/[NHSBr]_{o}/[L]_{o} = 10/1/1/2,1 en tolueno (al 33% v/v) a 30ºC.
Figura 5. Evolución de la distribución del peso molecular y la polidispersidad para la LRP de MPEG(395)MA iniciada usando el iniciador 1, [MPEG(395)MA]_{o}/[CuBr]_{o}/[NHSBr]_{o} = 10/1/1/2 en tolueno (al 50% v/v) a 30ºC.
Figura 6. Región seleccionada (2,7-4,3 ppm) del espectro de ^{1}H-RMN de un poli(MPEG(395)MA) funcionalizado con éster de NHS preparado a partir del iniciador 1 (M_{n} = 6400 g.mol^{-1}, M_{w}/M_{n} = 1,09).
Figura 7. Representación gráfica de la cinética de primer orden para la LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 2, [MPEG(395)MA]_{0}/[CuBr]_{0}/[NHSBr]_{0}/[ligando propilo]_{0} = 10/1/1/2 en tolueno (al 50% v/v) a 30ºC.
Figura 8. Evolución de la distribución del peso molecular y la polidispersidad para la LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 2, [MPEG(395)MA]_{0}/[CuBr]_{0}/[NHSBr]_{0}/[ligando propilo]_{0} = 10/1/1/2 en tolueno a 30ºC.
Figura 9. Representación gráfica de la velocidad para la TMM-LRP de MPEG(1000)MA, iniciador 8, [monómero]:[iniciador]:[CuCl]:[L] = 5:1:2:2, T = 70ºC.
Figura 10. Dependencia de M_{n} con la conversión para el MPEG(1000)MA, iniciador 8, [monómero]:[iniciador]:
[CuCl]:[L] = 5:1:1:2, T = 70ºC.
Figura 11. Representación gráfica de la velocidad para la TMM-LRP de MPEG(1000)MA, iniciador 8, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 20:1:1:2, T = 50ºC.
Figura 12. Dependencia de M_{n} con la conversión para la TMM-LRP de MPEG(1000)MA, iniciador 8, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 20:1:1:2, T = 50ºC.
Figura 13. Representación gráfica de la velocidad para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 10, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 6:1:1:2.
Figura 14. Dependencia de M_{n} con la conversión para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 10, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 6:1:1:2.
Figura 15. Representación gráfica de la velocidad para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 10, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 28:1:1:2. T = 40ºC.
Figura 16. Dependencia de M_{n} con la conversión para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 10, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 6:1:1:2. T = 40ºC.
Figura 17. Representación gráfica de la velocidad para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 10, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 28:1:1:2. T = 60ºC.
Figura 18. Dependencia de M_{n} con la conversión para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 10, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 6:1:1:2. T = 60ºC.
Figura 19. Experimento de ^{1}H-RMN en línea: Representación gráfica de la velocidad para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 10, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 10:1:1:2. T = 40ºC.
Figura 20. Representación gráfica de la velocidad para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 11, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 8:1:1:2. T = 30ºC.
Figura 21. Dependencia de M_{n} con la conversión para la TMM-LRP de MPEG(395)MA usando el iniciador 11, [monómero]:[iniciador]:[CuBr]:[L] = 8:1:1:2. T = 30ºC.
Figura 22. Representación gráfica de la cinética para la hidrólisis de poli(MPEG(395)MA) terminado en N-succinimidilo iniciada por 1 en diferentes tampones.
Figura 23. Perfiles de HPLC para la reacción de poli(MPEG(395)MA) terminado en succinimida preparado a partir del iniciador 1 (M_{n} = 6400 g.mol^{-1}, M_{w}/M_{n} = 1,11) con lisozima ([polímero]/[lisozima] 20:1).
Figura 24. SDS-PAGE para la conjugación de lisozima con poli(MPEG(395)MA) terminado en succinimida preparado a partir del iniciador 1 (M_{n} = 6400 g.mol^{-1}, M_{w}/M_{n} = 1,11) (20 equivalentes).
Figura 25. Perfiles de HPLC para la reacción de poli(MPEG(395)MA) terminado en succinimida preparado a partir del iniciador 1 (M_{n} = 6400 g.mol^{-1}, M_{w}/M_{n} = 1,11) con lisozima ([polímero]/[lisozima] 5:1).
Figura 26. Perfiles de HPLC para la reacción de poli(MPEG(395)MA) terminado en succinimida preparado a partir del iniciador 1 (M_{n} = 6400 g.mol^{-1}, M_{w}/M_{n} = 1,11) con lisozima ([polímero]/[lisozima] 2:1).
Figura 27. Comparación de los perfiles de HPLC de diversos conjugados de lisozima obtenidos con diferentes razones de polímero/lisozima usando poli(MPEG(395)MA) 
\hbox{terminado en succinimida preparado a partir del iniciador
 1.}
Figura 28. Representación gráfica de la cinética para la hidrólisis del grupo de extremo de succinimida del polímero poli(MPEG(395)MA) iniciada por 2 en diferentes tampones.
Figura 29. Espectro de ^{1}H-RMN de un poli(MPEG(395)MA) funcionalizado con éster de NHS (iniciador 2) (M_{n} = 2700 g.mol^{-1}, M_{w}/M_{n} = 1,12).
Figura 30. Espectro de ^{1}H-RMN de un poli(MPEG(395)MA) funcionalizado con N-bencilamina (M_{n} = 2800 g.mol^{-1}, M_{w}/M_{n} = 1,15).
Figura 31. Perfiles de HPLC para la reacción de poli(MPEG(395)MA) preparado a partir del iniciador 2 (M_{n} = 2700 g.mol^{-1}, M_{w}/M_{n} = 1,12) con lisozima ([polímero]/[lisozima] 30:1).
Figura 32. SDS-PAGE para la conjugación de poli(MPEG(395)MA) preparado a partir del iniciador 2 con lisozima a diferente tiempo de reacción y diferente razón polímero/proteína (a) 5/1, (b) 10/1 y (c) 30/1.
Figura 33. Cromatografía SEC-HPLC de la reacción de conjugación de lisozima con el polímero terminado en aldehído (M_{n}~22.000, PDi 1,09).
Figura 34. Reacción de Retro-Diels-Alder: (\blacksquare = "iniciador" y \blacktriangle = señales de maleimido) a) t =0; b) t = 3,5 h; c) t=7 h.
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Síntesis de N-[2-(2'-bromo-2'-metilpropioniloxi)-etil]ftalimida, 6 
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Se disolvió N-(2-hidroxietil)ftalimida (Aldrich, al 99%) (19,12 g, 0,1 mol) en THF anhidro (250 ml) con trietilamina (28,1 ml, 0,2 mol) bajo nitrógeno en un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con un agitador magnético. Se enfrió el matraz hasta 0ºC con un baño de hielo antes de la adición gota a gota de bromuro de 2-bromoisobutirilo (13,9 ml, 0,11 mol). Se agitó la mezcla durante 45 minutos y se dejó que alcanzase la temperatura ambiente. Posteriormente, se vertió la mezcla de reacción en un exceso de agua fría y se extrajo con dietil éter (3 x 50 ml). Se lavó la fase orgánica con una disolución acuosa saturada de Na_{2}CO_{3} (3 x 50 ml), agua acidificada (pH = 4,5, 3 x 50 ml), y de nuevo la disolución acuosa saturada de Na_{2}CO_{3} (3 x 50 ml). Se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4} anhidro y se filtró. Finalmente se eliminó el disolvente a presión reducida usando el evaporador rotatorio con el fin de aislar el compuesto del título (30,6 g, rendimiento del 90%) como un sólido amarillento.
p.f. 63-65ºC, IR (sólido, celda de ATR) \delta (cm^{-1}) 1774 (C_{cicl}=O), 1705 (C=O); ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 298 K, 300 MHz) \delta 1,81 (s, 6H, C(CH_{3})_{2}Br), 3,95 (t, 2H, J= 5,3 Hz, CH_{2}N), 4,35 (t, 2H, J = 5,4 Hz, CH_{2}O), 7,67 (m, 2H, CH Ar), 7,78 (m, 2H, CH Ar). ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 298 K, 75 MHz) \delta 31,00 (2C, C(CH_{3})_{2}Br), 37,12 (1C, CH_{2}N), 55,92 (1C, C(CH_{3})_{2}
Br), 63,42 (1C, CH_{2}O), 123,78 (2C, CH Ar), 132,35 (1C, C Ar), 133,54 (2C, CH Ar), 168,40 (2C, C_{cicl}=O), 171,87 (1 C, C=O).
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Síntesis de N-(2-bromo-2-metilpropioniloxi)succinimida, 7 
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Esto se preparó a partir de la N-hidroxisuccinimida (NHS) usando un procedimiento similar al facilitado anteriormente para la síntesis del compuesto 6. El disolvente usado en este caso era diclorometano anhidro ya que NHS es insoluble en THF. Se obtuvo el compuesto del título con un rendimiento del 85% como un sólido blanco.
p.f. 72-74ºC; IR (sólido, celda de ATR) \nu (cm^{-1}) 1772 (C_{cicl}=O), 1728 (C=O); ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 298 K, 300 MHz) \delta 2,08 (s, 6H, C(CH_{3})_{2}Br), 2,87 (s, 4H, CH_{2}). ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 298 K, 75 MHz) \delta 26,03 (2C, CH_{2}), 31,09 (2C, C(CH_{3})_{2}Br), 51,60 (1C, C(CH_{3})_{2}Br), 167,89 (1C, C=O), 169,02 (2C, C_{cicl}=O); EM (+EI), (m/z) 266, 265, 156, 151, 149, 123, 121, 116, 115, 91, 87, 70, 69. Anál. calc. para C_{8}H_{10}NO_{4}Br: C = 36,39; H = 3,82; N = 5,30, Br = 30,26. Hallado: C = 36,35; H = 3,82; N = 5,03; Br = 30,17.
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4-[(4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il)amino]fenol, 4
Se enfrió una disolución de 2,4-dicloro-6-metoxi-1,3,5-triazina ^{29} (9,00 g, 50,0 mmol) en 100 ml de acetona hasta 0ºC y, con agitación, se añadió 4-aminofenol sólido (5,46 g, 50,0 mmol) en pequeñas porciones durante aproximadamente 2 min. Se dejó entonces que la suspensión blanca se calentara hasta la temperatura ambiental y se agitó durante 1 h más, mientras se neutralizaba con una disolución acuosa 2 M de Na_{2}CO_{3}. Entonces se vertió la mezcla en 500 ml de hielo/agua y se filtró y secó el precipitado blanco resultante, dando 9,60 g (38,0 mmol, rendimiento del 76%) de 4-[(4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il)amino]fenol que puede usarse para la siguiente etapa sin purificaciones adicionales. Se obtuvo una muestra analítica mediante cromatografía ultrarrápida (CC, SiO_{2}, éter de petróleo/Et_{2}O 1:1, R_{f} = 0,14). El análisis por RMN (d_{6}-DMSO) reveló la presencia, en disolución, de 2 isómeros rotacionales (razón molar de 7:3).
p.f. 172ºC desc.; IR \nu_{(NH)} 3476 cm^{-1}. \nu_{(OH)} 3269 cm^{-1}.
Isómero mayoritario ^{1}H-RMN (d_{6}-DMSO, 298 K, 300 MHz) \delta 3,94 (s, 3H, OCH_{3}); 6,79 (d, J = 8,8 Hz, 2H, CH Ar), 7,48 (d, J = 8,8 Hz, 2H, CH Ar), 9,40 (s, 1H, OH), 10,46 (s, 1H, NH); ^{13}C{^{1}H}-RMN (d_{6}-DMSO, 298 K, 75 MHz) \delta 55,52 (1C, OCH_{3}); 115,46 (2C, CH Ar), 123,91 (2C, CH Ar), 129,49 (1C, C Ar), 154,44 (1C, C Ar), 164,81 (1C, C Ar), 169,57 (1C, C Ar), 171,23 (1C, C Ar).
Isómero minoritario ^{1}H-RMN (d_{6}-DMSO, 298 K, 300 MHz) \delta 3,96 (s, 3H, OCH_{3}); 6,79 (d, J = 8,9 Hz, 2H, CH Ar), 7,39 (d, J = 8,9 Hz, 2H, CH Ar), 9,42 (sa, 1H, OH), 10,10,32 (s, 1H, NH); ^{13}C{^{1}H}-RMN (d_{6}-DMSO, 298 K, 75 MHz) \delta 55,10 (1C, OCH_{3}); 115,46 (2C, CH Ar), 123,03 (2C, CH Ar), 129,26 (1 C, C Ar), 154,76 (1 C, C Ar), 165,20 (1C, C Ar), 170,48 (1C, C Ar), 170,64 (1C, C Ar); Anál. calc. para C_{10}H_{9}ClN_{4}O_{2}: C = 47,54, H = 3,59, N = 22,18, Cl = 14,03, Hallado: C = 47,57, H = 3,55, N = 22,10, Cl = 14,8.
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2-bromo-2-metilpropionato de 4-[(4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il)amino]fenilo, 5
23
Se añadió gota a gota una disolución de bromuro de 2-bromoisobutirilo (1,0 ml, 7,90 mmol) en 20 ml de THF a una disolución de 4-[(4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il)amino]fenol (1,9 g, 7,52 mmol) y trietilamina en 100 ml de THF, a -10ºC. Durante la adición (aproximadamente 15 min.) se observó la precipitación de bromuro de trietilamonio. Se monitorizó la reacción mediante CCF (SiO_{2}, éter de petróleo/Et_{2}O 1:1, 4-[(4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il)amino]fenol (material de partida) R_{f} = 0,14; 2-bromo-2-metilpropionato de 4-[(4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il)amino]fenilo (producto final) R_{f} = 0,26). Tras 1,5 h, se vertió la suspensión blanca en un matraz cónico que contenía 150 ml de Et_{2}O y se retiró la sal de amonio por filtración sobre un filtro de vidrio poroso sinterizado. Entonces se evaporó el disolvente a presión reducida dando un residuo bruto blanco que se suspendió en 10 ml de pentano y se filtró. Se obtuvieron 2,56 g (6,37 mmol, rendimiento del 85%) de 2-bromo-2-metilpropionato de 4-[(4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il)amino]fenilo como un sólido blanco. El análisis por ^{1}H-RMN (d_{6}-DMSO) reveló la presencia, en disolución, de 2 isómeros rotacionales (razón molar de 7:3).
p.f. 107-108ºC; IR \nu_{(NH)} 3365 cm^{-1}. \nu(C=O) 1747 cm^{-1}.
Isómero mayoritario: ^{1}H-RMN (d_{6}-DMSO, 298 K, 400 MHz) \delta 2,05 (s, 6H, C(CH_{3})_{2}Br), 3,96 (s, 3H, OCH_{3}), 7,17 (d, J = 8,9 Hz, 2H, CH Ar), 7,77 (d, J = 8,9 Hz, 2H, CH Ar), 10,78 (s, 1H, NH); ^{13}C{^{1}H}-RMN (d_{6}-DMSO, 298 K, 100,6 MHz) \delta 30,42 (2C, CH_{3}), 55,75 (sa, 1C, OCH_{3}), 57,29 (1C, C(CH_{3})_{2}Br), 121,96 (2C, CH Ar), 122,12 (2C, CH Ar), 136,29 (1C, C Ar), 146,61 (sa, 1C, C Ar), 165,10 (sa, 1C, C Ar), 169,89 (sa, 1C, C Ar), 170,16 (1C, C=O), 171,33 (sa, 1C, C Ar).
Isómero minoritario:^{1}H-RMN (d_{6}-DMSO, 298 K, 400 MHz) \delta 2,05 (s, 6H, C(CH_{3})_{2}Br), 3,96 (s, 3H, OCH_{3}), 7,17 (d, J = 8,9 Hz, 2H, CH Ar), 7,69 (d, J = 8,9 Hz, 2H, CH Ar), 10,66 (s, 1H, NH); ^{13}C{^{1}H}-RMN (d_{6}-DMSO, 298 K, 100,6 MHz) \delta 30,42 (2C, CH_{3}), 55,75 (sa, 1C, OCH_{3}), 57,29 (1C, C(CH_{3})_{2}Br), 121,96 (2C, CH Ar), 122,73 (2C, CH Ar), 136,29 (1C, C Ar), 146,61 (sa, 1C, C Ar), 165,10 (sa, 1C, C Ar), 169,89 (sa, 1 C, C Ar), 170,16 (1C, C=O), 171,33 (sa, 1C, C Ar).
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Polimerización típica de MMA
Se puso CuBr (0,134 g, 0,934 mmol) en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se equipó el tubo con un septo de goma, se vació y se purgó con N_{2} seco tres veces. Se transfirieron metacrilato de metilo (10 ml, 93,4 mmol) y xileno (20 ml) al tubo mediante una jeringuilla desgasificada. Se agitó la mezcla rápidamente bajo nitrógeno y se añadió N-(n-propil)-2-piridilmetanimina (NMPI) (0,408 g, 1,86 mmol) confiriendo un color marrón/rojo intenso a la disolución. Se añadió el iniciador apropiado (0,934 mmol) y se desgasificó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación. Se puso la mezcla resultante en un baño de aceite controlado con termostato a 90ºC. Se tomaron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se midió la conversión mediante gravimetría secando hasta peso constante en un horno de vacío a 70ºC. Se retiró el catalizador de las muestras haciéndolas pasar a través de una columna de alúmina básica activada antes de la SEC. (véase la figura 1).
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TABLA 1 Polimerización de MMA en disolución de xileno (al 33% v/v) a 90ºC
24 
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Polimerización típica de estireno
Se puso CuBr (0,055 g, 0,38 mmol) en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se equipó el tubo con un septo de goma, se vació y se purgó con N_{2} seco tres veces. Se transfirió estireno (10 ml, 96 mmol) al tubo mediante una jeringuilla desgasificada. Se agitó la mezcla rápidamente bajo nitrógeno y se añadió 4,4'-di(5-nonil)-2,2'-bipiridilo (dNbpy) (0,314 g, 0,768 mmol), confiriendo un color marrón/rojo intenso a la disolución. Se añadió el iniciador 1 (0,035 g, 0,048 mmol, 0,192 mmol de sitios de iniciación) y se desgasificó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación. Se puso la mezcla resultante en un baño de aceite controlado con termostato a 110ºC durante 4,5 horas. Se retiró el catalizador de las muestras haciéndolas pasar a través de una columna de alúmina básica activada antes de la SEC.
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Estudios cinéticos para los iniciadores 6 y 7
Se retiraron muestras periódicamente usando jeringuillas desgasificadas y se enfriaron bruscamente en nitrógeno líquido para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se determinó la conversión mediante RMN en un instrumento Bruker DPX 300. Para la polimerización viva por radicales iniciada por 6, se hicieron pasar las muestras por una columna de alúmina básica y luego se filtraron en una jeringuilla equipada con un filtro hidrófobo de 0,22 \mum antes de los estudios del peso molecular. En el caso de la LRP iniciada por 7, se determinó el peso molecular diluyendo la muestra con THF y dejándola sedimentar durante la noche para precipitar los residuos de catalizador. Entonces se filtró el líquido superior con un filtro hidrófobo de 0,22 \mum. Este método se eligió para los polímeros funcionalizados con N-hidroxisuccinimida ya que estos polímeros no podían hacerse pasar por alúmina básica.
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Síntesis de un poli(MMA) funcionalizado con N-bencilamida
Se añadió bencilamina a una disolución de poli(metacrilato de metilo) terminado en N-hidroxisuccinimida en THF anhidro. Se disolvieron poli(metacrilato de metilo) terminado en N-hidroxisuccinimida (M_{n} = 3200 g mol^{-1}, PDI = 1,06) (1,00 g, 0,313 mmol) y tres equivalentes de bencilamina (0,100 ml, 0,938 mmol) en 10 ml de THF seco en un tubo Schlenk seco y se agitó a 50ºC durante 3 días bajo nitrógeno. Tras la reacción, se precipitó el polímero en éter de petróleo frío (véase la figura 2).
Esto muestra que pueden añadirse grupos funcionales de N-bencilamida y pueden usarse para alcanzar los grupos amida libres de la clase que se encuentra en las proteínas.
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Esquema
Acoplamiento de un poli(MMA) terminado en N-hidroxisuccinimida con bencilamina 
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Iniciador de N-hidroxisuccininida (1) (NHS-Br)
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Reactivos
Se desgasificaron metacrilato de metil éter de poli(etilenglicol) (M_{n} = aproximadamente 475, Aldrich, 99%) y tolueno anhidro burbujeando nitrógeno seco durante 30 minutos antes de su uso. Se preparó el ligando N-(n-propil)-2-piridilmetanimina tal como se describió previamente^{1}. Se purificó bromuro de cobre (I) (Avocado, 98%) según fue necesario mediante un método basado en el de Keller y Wycoff^{2}. Otros reactivos eran todos productos comerciales y se usaron sin purificación adicional.
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Procedimiento típico
Se llevaron a cabo las polimerizaciones a 30ºC mediadas por bromuro de cobre (I)/N-(n-propil)-2-piridilmetanimina. Una fórmula de polimerización típica se basa en el 33% v/v de monómero en tolueno. La razón de iniciador/Cu(I)Br/ligando es de 1/1/2,1 con respecto a una base molar. Se cargó un tubo Schlenk seco con Cu(I)Br (0,3099 g, 2,16x10^{-3} mol), NHS-Br (1) (0,5704 g, 2,16x10^{-3} mol) y una barra magnética antes de desoxigenarse mediante ciclado entre nitrógeno y vacío tres veces. Entonces se añadieron al matraz PEGMA (10 ml, 2,27x10^{-2} mol) y tolueno (20 ml). Se sometió la mezcla inmediatamente a tres ciclos de desgasificación mediante congelación-bombeo-descongelación. Finalmente, se añadió N-(n-propil)-2-piridilmetanimina (0,707 ml, 4,54x10^{-3} mol) y se puso el matraz en un baño de aceite termostatizado a 30ºC.
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Estudios cinéticos
Se retiraron muestras periódicamente usando jeringuillas desgasificadas y se enfriaron bruscamente en nitrógeno líquido para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se determinó la conversión mediante RMN en un instrumento Brüker DPX 300 MHz. Se determinó el peso molecular diluyendo la muestra con tolueno y dejándola sedimentar durante la noche para retirar los complejos de cobre. Entonces se filtró el líquido superior con un filtro hidrófobo de 0,22 \mum. Este método se eligió debido a la dificultad encontrada para hacer pasar el polímero por una columna de alúmina básica. Se determinaron los pesos moleculares promedio en número (M_{n}) mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC, Size Exclusión Chromatography) en un sistema equipado con una precolumna de 5 mm, dos columnas Polymer Labs mixed E, un detector diferencial del índice de refracción y un inyector automático. Se eluyó el sistema con THF a una velocidad de 1 ml/min. Se usó tolueno como marcador de
flujo.
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Purificación
Se purificaron los poli(PEGMA) funcionalizados con N-hidroxisuccinimida mediante dos purificaciones consecutivas a partir de una disolución de tolueno en dietil éter.
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TABLA 1 Datos cinéticos para la polimerización de PEGMA iniciada por NHS-Br en disolución de tolueno (al 33% v/v) a 30ºC ([PEGMA]_{0}/[CuBr]_{0}/[NHSBr]_{0}/[L]_{0} = 10/1/1/2,1) 
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27 
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TABLA 2 Caracterización de poli(PEGMA) preparado mediante LRP
280 
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Bibliografía
(a) D. M. Haddleton, M. C. Crossman, B. H. Dana, D. J. Duncalf, A. M. Henning, D. Kukulj y A. J. Shooter, Macromolecules, 1999, 32, 2110.
(b) R. N. Keller y W. D. Wycoff, Inorg. Synth., 1947, 2, 1.
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Polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (2080) usando el iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida [PEG]/[I]/[Cu]/[L] =19,2/1/1/2 en disolución de tolueno al 80% (AJ U2-27a) a 30ºC
Se pusieron el iniciador de N-hidroxisuccinimida (0,05 g, 0,189 mmol), Cu(I)Br (0,027 g, 0,189 mmol, 1 eq) y metacrilato de metoxipolietilenglicol (PEG) (peso molecular promedio = 2080, 7,55 g, 3,63 mmol) y un agitador magnético en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se vació el tubo Schlenk y se purgó con nitrógeno seco tres veces. Se añadió tolueno desoxigenado (28 ml) al tubo Schlenk. Se desoxigenó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación y luego se añadió N-etil-2-piridilmetanimina (0,05 g, 0,38 mmol) desgasificada. Se puso la reacción en un baño de aceite controlado con termostato a 30ºC (t=0) y se retiraron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se siguió la conversión mediante espectrometría de ^{1}H-RMN y el análisis del peso molecular mediante SEC.
Se purificó el polímero mediante la adición gota a gota de la disolución de reacción a una disolución con agitación vigorosa de dietil éter (400 ml). Se filtró el polvo blanco resultante, se disolvió en tolueno (20 ml) y se precipitó en dietil éter (400 ml). Este procedimiento se repitió tres veces.
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TABLA 1 Datos para la polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (2080) con un iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida a 30ºC en disolución de tolueno al 80%
29 
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Se liofilizó Bisomer S20W (disolución acuosa al 50% de metacrilato de metoxipolietilenglicol) antes de su uso para eliminar toda el agua.
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[PEG]/[I]/[Cu]/[L] = 19,2/1/1/2 en disolución de tolueno al 80% (AJ U2-27b) a 50ºC
Se pusieron el iniciador de N-hidroxisuccinimida (0,05 g, 0,189 mmol), Cu(I)Br (0,027 g, 0,189 mmol, 1 eq) y metacrilato de metoxipolietilenglicol (PEG) (peso molecular promedio = 2080, 7,55 g, 3,63 mmol) y un agitador magnético en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se vació el tubo Schlenk y se purgó con nitrógeno seco tres veces. Se añadió tolueno desoxigenado (28 ml) al tubo Schlenk. Se desoxigenó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación y luego se añadió N-etil-2-piridilmetanimina (0,05 g, 0,38 mmol) desgasificada. Se puso la reacción en un baño de aceite controlado con termostato a 50ºC (t=0) y se retiraron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se siguió la conversión mediante espectrometría de ^{1}H-RMN y el análisis del peso molecular mediante SEC.
Se purificó el polímero mediante la adición gota a gota de la disolución de reacción a una disolución con agitación vigorosa de dietil éter (400 ml). Se filtró el polvo blanco resultante, se disolvió en tolueno (20 ml) y se precipitó en dietil éter (400 ml). Este procedimiento se repitió tres veces.
TABLA 2 Datos para la polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (2080) con un iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida a 50ºC en disolución de tolueno al 80%
30 
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Se liofilizó Bisomer S20W (disolución acuosa al 50% de metacrilato de metoxipolietilenglicol) antes de su uso para eliminar toda el agua.
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[PEG)/[I]/[Cu]/[L] = 19,2/1/1/2 en disolución de tolueno al 80% (AJ U2-27c) a 90ºC
Se pusieron el iniciador de N-hidroxisuccinimida (0,05 g, 0,189 mmol), Cu(I)Br (0,027 g, 0,189 mmol, 1 eq) y metacrilato de metoxipolietilenglicol (PEG) (peso molecular promedio = 2080, 7,55 g, 3,63 mmol) y un agitador magnético en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se vació el tubo Schlenk y se purgó con nitrógeno seco tres veces. Se añadió tolueno desoxigenado (28 ml) al tubo Schlenk. Se desoxigenó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación y luego se añadió N-etil-2-piridilmetanimina (0,05 g, 0,38 mmol) desgasificada. Se puso la reacción en un baño de aceite controlado con termostato a 90ºC (t=0) y se retiraron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se siguió la conversión mediante espectrometría de ^{1}H-RMN y el análisis del peso molecular mediante SEC.
Se purificó el polímero mediante la adición gota a gota de la disolución de reacción a una disolución con agitación vigorosa de dietil éter (400 ml). Se filtró el polvo blanco resultante, se disolvió en tolueno (20 ml) y se precipitó en dietil éter (400 ml). Este procedimiento se repitió tres veces.
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TABLA 3 Datos para la polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (2080) con un iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida a 90ºC en disolución de tolueno al 80%
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Se liofilizó Bisomer S20W (disolución acuosa al 50% de metacrilato de metoxipolietilenglicol) antes de su uso para eliminar toda el agua.
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[PEG]/[I]/[Cu]/[L] = 23,9/1/1/2 en disolución de tolueno al 66% (AJ U2-11) a 90ºC
Se pusieron el iniciador de N-hidroxisuccinimida (2,5 g, 9,47 mmol), Cu(I)Br (1,35 g, 9,47 mmol, 1 eq) y metacrilato de metoxipolietilenglicol (PEG) (peso molecular promedio = 628, 142,0 g, 0,226 mol) y un agitador magnético en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se vació el tubo Schlenk y se purgó con nitrógeno seco tres veces. Se añadió tolueno desoxigenado (261 ml) al tubo Schlenk. Se desoxigenó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación y luego se añadió N-propil-2-piridilmetanamina (2,80 g, 0,019 mol) desgasificada. Se puso la reacción en un baño de aceite controlado con termostato a 90ºC (t=0) y se retiraron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se siguió la conversión mediante espectrometría de ^{1}H-RMN y el análisis del peso molecular mediante SEC.
Se purificó el polímero mediante la adición gota a gota de la disolución de reacción a una disolución con agitación vigorosa de dietil éter (1000 ml). Se lavó el aceite resultante con dietil éter (3 x 1000 ml) y luego se secó a vacío.
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TABLA 4 Datos para la polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (628) con un iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida a 90ºC en disolución de tolueno al 66%
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Se usó Bisomer MPEG550MA tal como se proporcionó.
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Polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (1080) usando el iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida [PEG]/[I]/[Cu]/[L] = 13,9/1/1/2 en disolución de tolueno al 66% (AJ U2-13) a 90ºC
Se pusieron el iniciador de N-hidroxisuccinimida (0,526 g, 1,99 mmol), Cu(I)Br (0,29 g, 2,02 mmol, 1 eq) y metacrilato de metoxipolietilenglicol (PEG) (peso molecular promedio = 1080, 29,62 g, 0,027 mol) y un agitador magnético en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se vació el tubo Schlenk y se purgó con nitrógeno seco tres veces. Se añadió tolueno desoxigenado (60 ml) al tubo Schlenk. Se desoxigenó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación y luego se añadió N-etil-2-piridilmetanimina (0,51 g, 3,96 mmol) desgasificada. Se puso la reacción en un baño de aceite controlado con termostato a 90ºC (t=0) y se retiraron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se siguió la conversión mediante espectrometría de ^{1}H-RMN y el análisis del peso molecular mediante SEC.
Se purificó el polímero mediante la adición gota a gota de la disolución de reacción a una disolución con agitación vigorosa de dietil éter (1000 ml). Se lavó el aceite resultante con dietil éter (3 x 1000 ml) y luego se secó a vacío.
TABLA 5 Datos para la polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (1080) con un iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida a 90ºC en disolución de tolueno al 66%
33 
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[PEG]/[I]/[Cu]/[L] = 9,3/1/1/2 en disolución de tolueno al 66% (AJ U2-15) a 90ºC
Se pusieron el iniciador de N-hidroxisuccinimida (0,5 g, 1,89 mmol), Cu(I)Br (0,27 g, 1,89 mmol, 1 eq) y metacrilato de metoxipolietilenglicol (PEG) (peso molecular promedio = 1080, 18,90 g, 0,018 mol) y un agitador magnético en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se vació el tubo Schlenk y se purgó con nitrógeno seco tres veces. Se añadió tolueno desoxigenado (35 ml) al tubo Schlenk. Se desoxigenó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación y luego se añadió N-etil-2-piridilmetanimina (0,51 g, 3,79 mmol) desgasificada. Se puso la reacción en un baño de aceite controlado con termostato a 90ºC (t=0) y se retiraron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se siguió la conversión mediante espectrometría de ^{1}H-RMN y el análisis del peso molecular mediante SEC.
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TABLA 6 Datos para la polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (1080) con un iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida a 90ºC en disolución de tolueno al 66%
34 
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Se liofilizó Bisomer S10W (disolución acuosa al 50% de metacrilato de metoxipolietilenglicol) antes de su uso para eliminar toda el agua.
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Polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (628) usando el iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida [PEG]/[I]/[Cu]/[L] = 6,4/1/1/2 en disolución de tolueno al 66% (AJ U2-31a) a 30ºC
Se pusieron el iniciador de N-hidroxisuccinimida (0,5 g, 1,89 mmol), Cu(I)Br (0,27 g, 1,89 mmol, 1 eq) y metacrilato de metoxipolietilenglicol (PEG) (peso molecular promedio = 628, 7,57 g, 0,012 mol) y un agitador magnético en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se vació el tubo Schlenk y se purgó con nitrógeno seco tres veces. Se añadió tolueno desoxigenado (14 ml) al tubo Schlenk. Se desoxigenó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación y luego se añadió N-etil-2-piridilmetanimina (0,51 g, 3,79 mmol) desgasificada. Se puso la reacción en un baño de aceite controlado con termostato a 30ºC (t=O) y se retiraron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se siguió la conversión mediante espectrometría de ^{1}H-RMN y el análisis del peso molecular mediante SEC.
TABLA 7 Datos para la polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (628) con un iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida a 30ºC en disolución de tolueno al 66%
35
Se usó Bisomer MPEG550MA tal como se proporcionó.
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[PEG]/[I]/[Cu]/[L] = 6,4/1/1/2 en disolución de tolueno al 66% (AJ U2-31b) a 50ºC
Se pusieron el iniciador de N-hidroxisuccinimida (0,5 g, 1,89 mmol), Cu(I)Br (0,27 g, 1,89 mmol, 1 eq) y metacrilato de metoxipolietilenglicol (PEG) (peso molecular promedio = 628, 7,57 g, 0,012 mol) y un agitador magnético en un tubo Schlenk secado en la estufa. Se vació el tubo Schlenk y se purgó con nitrógeno seco tres veces. Se añadió tolueno desoxigenado (14 ml) al tubo Schlenk. Se desoxigenó la disolución resultante mediante tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación y luego se añadió N-etil-2-piridilmetanimina (0,51 g, 3,79 mmol) desgasificada. Se puso la reacción en un baño de aceite controlado con termostato a 50ºC (t=O) y se retiraron muestras periódicamente para el análisis de la conversión y el peso molecular. Se siguió la conversión mediante espectrometría de ^{1}H-RMN y el análisis del peso molecular mediante SEC.
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TABLA 8 Datos para la polimerización de metacrilato de metoxipolietilenglicol (628) con un iniciador derivado de N-hidroxisuccinimida a 50ºC en disolución de tolueno al 66%
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Se usó Bisomer MPEG550MA tal como se proporcionó.

Claims (46)

1. Método de producción de un polímero tipo peine que comprende las etapas de:
(a)
proporcionar:
(i)
una pluralidad de monómeros que son lineales, ramificados o en forma de estrella, sustituidos o no sustituidos, y tienen un resto olefínicamente insaturado, pudiendo el resto olefínicamente insaturado experimentar polimerización por adición;
(ii)
un compuesto iniciador; comprendiendo el compuesto iniciador un enlace escindible de manera homolítica.
(iii)
un catalizador que puede catalizar la polimerización del monómero; y
(b)
hacer que el catalizador catalice, en combinación con el iniciador, la polimerización de una pluralidad de los monómeros para producir el polímero tipo peine;
en el que el compuesto iniciador (ii) comprende un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazarse covalentemente a una sustancia biológica seleccionada de una proteína, un polipéptido, un ácido nucleico, un hidrato de carbono o una grasa y en el que los monómeros en (i) comprenden alcoxi-poliéteres.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el alcoxi-poliéter es poli(alquilenglicol) o politetrahidrofurano.
3. Método según las reivindicaciones 1 a 2, en el que la sustancia biológica es una proteína o un polipéptido.
4. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la sustancia biológica es un ácido nucleico o un hidrato de carbono.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el catalizador puede catalizar la polimerización del monómero mediante polimerización viva por radicales o viva por radicales libres.
6. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el catalizador comprende un ligando que es cualquier compuesto que contiene N, O, P o S que puede coordinarse en un enlace \delta a un metal de transición o cualquier compuesto que contiene carbono que puede coordinarse en un enlace \pi al metal de transición, de manera que no se forman enlaces directos entre el metal de transición y los radicales poliméricos en crecimiento.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el catalizador comprende:
un primer compuesto MY, en el que M es un metal de transición que puede oxidarse en un estado de oxidación formal, especialmente Cu^{+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+}, Ru^{2+}, Ru^{3+}, Cr^{2+}, Cr^{3+}, Mo^{2+}, Mo^{3+}, W^{2+}, W^{3+}, Mn^{3+}, Mn^{4+}, Rh^{3+}, Rh^{4+}, Re^{2+}, Re^{3+}, Co^{+}, Co^{2+}, V^{2+}, V^{3+}, Zn^{+}, Zn^{2+}, Au^{+}, Au^{2+}, Ag^{+} y Ag^{2+}, e Y es un contraión monovalente o uno divalente; y
una organodiimina, en la que al menos uno de los nitrógenos no es parte de un anillo aromático.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el catalizador comprende un compuesto de fórmula:
[ML_{m}]^{n+}A^{n-}
en la que
M =
un metal de transición que puede oxidarse en un estado de oxidación formal, especialmente Cu^{+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+}, Ru^{2+}, Ru^{3+}, Cr^{2+}, Cr^{3+}, Mo^{2+}, Mo^{3+}, W^{2+}, W^{3+}, Mn^{3+}, Mn^{4+}, Rh^{3+}, Rh^{4+}, Re^{2+}, Re^{3+}, Co^{+}, Co^{2+}, V^{2+}, V^{3+}, Zn^{+}, Zn^{2+}, Au^{+}, Au^{2+}, Ag^{+} y Ag^{2+},
A =
un anión,
n =
un número entero de 1 a 3,
m =
un número entero de 1 a 2,
L =
una organodiimina, en la que al menos uno de los nitrógenos no es parte de un anillo aromático.
9. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el poli(alquilenglicol) es poli(etilenglicol) (PEG) o poli(propilenglicol).
10. Método según la reivindicación 9, en el que el peso molecular de la parte de PEG del monómero está entre 450 y 20.000.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el iniciador comprende un enlace escindible de manera homolítica con un átomo de halógeno.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el compuesto iniciador (II) se selecciona de:
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en los que:
X =
un haluro, especialmente Cl o Br,
A =
un resto que, cuando se une al polímero tipo peine, puede enlazarse a una proteína o un polipéptido,
B
es un grupo de unión y puede o no estar presente.
13. Método según la reivindicación 12, en el que A se selecciona de succinato de succinimidilo, N-hidroxisuccinimida, propionato de succinimidilo, butanoato de succinimidilo, triazina, vinilsulfona, propionaldehído, acetaldehído, tresilato, carbonato de benzotriazol, maleimida, sulfuro de piridilo, yodoacetamida y carbonato de succinimidilo.
14. Método según las reivindicaciones 12 a 13, en el que el grupo de unión, cuando está presente, se selecciona de un grupo alquilo C_{1} a C_{20}, cíclico, heterocíclico o aromático, de cadena lineal, de cadena ramificada, sustituido o no sustituido; -(CH_{2}Z)_{a}CH_{2}-, -CH_{2}ZCH_{2}-, -(CH_{2}CH_{2}Z)_{n}-R, -(CH_{2}CH(CH_{3})Z)_{n}-R, -(CH_{2})_{b}-C(O)-NH-(CH_{2})_{c}-, -(CH_{2})_{a}-
NH-C(O)-(CH_{2})_{y}-, -N(R)_{2}-; -S-; -N-R; u -O-R; en los que R = alquilo C_{1} a C_{20}, cíclico, heterocíclico o aromático, de cadena lineal, de cadena ramificada, sustituido o no sustituido, Z es O o S, y n, a, b y c son independientemente números enteros que pueden seleccionarse entre 1 y 10.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que el resto que puede reaccionar con una proteína o un polipéptido tiene una fórmula:
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16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que el iniciador (ii) tiene una fórmula:
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17. Método según las reivindicaciones 12 a 16, en el que el iniciador tiene una fórmula:
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43 
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44 
\newpage
18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, en el que la organodiimina se selecciona de:
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45 
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en los que:
R_{1}, R_{2}, R_{10}, R_{11}, R_{12} y R_{13} pueden seleccionarse independientemente y pueden seleccionarse de H, alquilo saturado de cadena lineal, de cadena ramificada o cíclico, hidroxialquilo, carboxialquilo, arilo, CH_{2}Ar (en el que Ar es arilo o arilo sustituido) o un halógeno;
R_{3} a R_{9} pueden seleccionarse independientemente y pueden seleccionarse de H, alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada o cíclico, hidroxialquilo, carboxialquilo, arilo, CH_{2}Ar, un halógeno, OCH_{2n+1} (en el que n es un número entero de 1 a 20), NO_{2}, CN, O = CR (en el que R = alquilo, arilo, arilo sustituido, bencilo PhCH_{2} o un bencilo sustituido).
\newpage
19. Método según la reivindicación 18, en el que la organodiimina es N-(n-propil)-2-piridilmetanimina (NMPI), N(n-etil)-2-piridilmetanimina, N-etil-2-piridilmetanimina, o se selecciona de:
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46
47
48
en las que:
* indica un centro quiral; y
R_{14} = hidrógeno, alquilo de cadena ramificada C_{1} a C_{10}, carboxi- o hidroxi-alquilo C_{1} a C_{10}.
20. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el catalizador comprende un grupo bipiridina.
21. Método según la reivindicación 20, en el que el catalizador es 4,4'-di(5-nonil)-2,2'-bipiridilo (dNbpy).
22. Método según cualquier reivindicación anterior, que comprende el uso de una pluralidad de diferentes monómeros tal como se define en la parte (i) de la reivindicación 1.
23. Método según cualquier reivindicación anterior, que comprende adicionalmente la etapa de producir un copolímero de bloque de los monómeros tal como se define en la parte (i) de la reivindicación 1, con uno o más de diferentes monómeros olefínicamente insaturados.
24. Método según la reivindicación 23, en el que el polímero tipo peine que comprende los monómeros tal como se definen en la parte (i) de la reivindicación 1 se polimeriza con el iniciador (ii) y el catalizador (iii), antes de la adición del uno o más de diferentes monómeros olefínicamente insaturados.
25. Método según la reivindicación 23, en el que el uno o más de diferentes monómeros olefínicamente insaturados se polimerizan con el iniciador (ii) y el catalizador (iii), antes de la polimerización de los monómeros tal como se definen en la parte (i) de la reivindicación 1.
26. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que el uno o más de diferentes monómeros olefínicamente insaturados se seleccionan de metacrilato de metilo, metacrilato de butilo, acrilato, metacrilato y estireno.
27. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que los reactivos se hacen reaccionar en un disolvente hidrófobo o hidrófilo.
28. Método según la reivindicación 27, en el que el disolvente se selecciona de agua, propionitrilo, hexano, heptano, dimetoxietano, dietoxietano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dietil éter, N,N-dimetilformamida, anisol, acetonitrilo, difenil éter, isobutirato de metilo, butan-2-ona, tolueno y xileno.
29. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la reacción de polimerización se lleva a cabo a de -20 a 200ºC.
30. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el catalizador es un catalizador soportado.
31. Método según cualquier reivindicación anterior, que comprende adicionalmente la etapa de copolimerizar o polimerizar en bloque con al menos un monómero marcado de manera fluorescente que puede experimentar polimerización adicional.
32. Método según la reivindicación 31, en el que el marcador fluorescente es una cumarina.
33. Polímero tipo peine que puede enlazarse a una sustancia biológica seleccionada de una proteína, un polipéptido, un ácido nucleico, un hidrato de carbono o una grasa, que puede obtenerse mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32.
34. Polímero tipo peine según la reivindicación 33, que puede enlazarse a una proteína o un polipéptido.
35. Polímero tipo peine que tiene una fórmula general:
A-(D)_{d}-(E)_{e}-(F)_{f}
en la que:
\quad
A es un resto que puede enlazarse covalentemente a una proteína o un polipéptido,
\quad
D puede obtenerse mediante polimerización adicional de uno o más monómeros olefínicamente insaturados que no son tal como se define en E.
\quad
E puede obtenerse mediante polimerización adicional de una pluralidad de monómeros que son lineales, ramificados o en forma de estrella, sustituidos o no sustituidos, y tienen un resto olefínicamente insaturado,
\quad
F, cuando está presente, puede obtenerse mediante polimerización adicional de uno o más monómeros olefínicamente insaturados que no son tal como se define en E;
\quad
d y f son un número entero entre 0 y 500.
\quad
e es un número entero de 0 a 1000;
en el que E comprende un alcoxi-poliéter.
36. Polímero tipo peine según la reivindicación 35, en el que E es un poli(alquilen)glicol o politetrahidrofurano.
37. Polímero tipo peine según las reivindicaciones 33 a 36, que tiene un peso molecular promedio de 2.000 a 80.000.
38. Polímero tipo peine según una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, que está marcado de manera fluorescente.
39. Polímero tipo peine según la reivindicación 38, que está marcado de manera fluorescente con una cumarina.
40. Método de unión de un polímero a un compuesto que comprende hacer reaccionar un polímero tipo peine según una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39, con dicho compuesto.
41. Compuesto que puede obtenerse haciendo reaccionar una proteína, un polipéptido, un ácido nucleico, un tiol, un hidrato de carbono, una diamina y/o un compuesto que contiene bencilamina con un polímero tipo peine según una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39, para formar una proteína, un polipéptido, un tiol, una amina y/o un compuesto que contiene bencilamina unido covalentemente a dicho polímero tipo peine.
42. Compuesto según la reivindicación 41, que es una proteína o un polipéptido, un tiol y/o un compuesto que contiene bencilamina.
43. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 42, que es biológicamente activo.
44. Compuesto según la reivindicación 43, que es un fármaco.
45. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
46. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, para su uso como un agente quimioterápico, un antibiótico, un agente antifúngico y/o inmunosupresor.
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