ES2323957T3 - Procedimiento para la fabricacion de estructuras de tejido tridimensionales y estructuras de tejido fabricadas con este procedimiento. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de fabricación de estructuras de tejido tridimensionales sin soporte, en el que - células aisladas consistentes en cartílago o hueso o médula ósea aspirada o Nucleus pulposus o Anulus fibrosus crecen en un medio de adhesión sobre un soporte sólido, - estas células crecidas maduran con un cambio de medio periódico durante dos a cinco días para formar una capa de células, - a continuación, esta capa de células crecida es lavada al menos una vez con un tampón de cultivo celular exento de iones Ca 2 +- y Mg 2 +, - para luego ser incubado con este tampón en una incubadora durante 30 a 90 minutos, lo cual da lugar a la separación de la capa de células del soporte, - la capa de células desprendida es transferida al medio de cultivo celular y separada mecánicamente, de modo que se produzca un agrupamiento celular, - este agrupamiento celular es incubado durante hasta siete días cambiando periódicamente el medio, de modo que madure un agrupamiento celular, - y a continuación de esta incubación, este agrupamiento celular es sometido respectivamente al menos a una carga de presión cíclica con la sucesiva conformación mecánica.
Description
Procedimiento para la fabricación de estructuras
de tejido tridimensionales y estructuras de tejido fabricadas con
este procedimiento.
La presente invención el refiere a un
procedimiento de fabricación de estructuras de tejido
tridimensionales sin soporte, particularmente de células óseas o
condrocitos, así como las estructuras de tejido fabricadas según
este procedimiento.
Desde hace tiempo se sabe que los cultivos
celulares de células animales y humanas son cultivables, donde las
células crecen como monocapa sobre substratos de soporte o
formaciones tridimensionales, en los que se forman sobre soportes o
en el medio nutritivo circundante. El aislamiento o la suspensión
de las células de estos cultivos se efectúa por tratamientos
mecánicos y/o enzimáticos (Toni Lindl, "cultivo celular y
tisular", Editorial Espectro, 4ª edición, página
97-101). El fascículo DE 199 62 456 A1 divulga un
procedimiento y un equipamiento para la fabricación, el examen y la
simulación de cultivos celulares tridimensionales así como un
sistema de prueba in vitro de agentes activos medicinales.
Las células en este caso son introducidas en un líquido protector,
por ejemplo ácido hialurónico, y prensadas a través de un material
poroso, teniendo lugar una carga mecánica cíclica o permanente. La
alimentación de las células se garantiza en este caso por difusión
mediante una membrana, un filtro o un material sinterizado poroso,
de modo que tenga lugar un crecimiento de las células sobre el
soporte.
El problema de este procedimiento es que el
material de soporte utilizado no es del todo biológicamente
reabsorbible y las células para su utilización ulterior, por
ejemplo el transplante, deben desprenderse de manera mecánica o
enzimática del material de soporte, para no implantar el soporte
también.
La invención se basa por lo tanto en la tarea de
proveer un procedimiento de fabricación de estructuras de tejido
tridimensionales sin soporte, que se obtengan sin desprendimiento
mecánico o enzimático de las estructuras celulares de los
materiales de soporte y sin usar citoquinas u otros aditivos
bioactivos.
Esta tarea es solucionada mediante un
procedimiento según la reivindicación 1. Las configuraciones
ventajosas del procedimiento según la invención están indicadas en
las reivindicaciones secundarias.
El carácter de la invención consiste en que se
producen, debido a las etapas individuales del procedimiento, a
partir de células eucarióticas, unas superficies mecánicamente
acondicionadas o creaciones tridimensionales de células óseas o
condrocitos, que pueden utilizarse directamente para la
implantación.
La invención se describirá detalladamente a
continuación con ayuda del ejemplo de realización.
Las células aisladas consistentes en cartílago,
hueso, médula ósea aspirada, en Nucleus pulposus o Anulus
fibrosus son absorbidas en el medio de adhesión. El medio de
adhesión sirve para la primera adhesión de las células al fondo de
los recipientes de cultivo. 5-10x10^{3} de
células/cm^{2}, de condrocitos, células óseas, células del
cartílago intervertebral o células aisladas de la médula ósea
(2x10^{5} células/cm^{2}) son transferidas en botellas de
cultivo celular de 75 cm^{2}. Para la adhesión de las células
arriba citadas se utiliza un agente DMEM "bajo en glucosa"
(10% FCS, 100 U penicilina/ml, 100 \mug estreptomicina/ml) usual
en el mercado.
Después de la adhesión de las células al fondo
de la botella de cultivo se usa otro medio de cultivo celular. Como
medio de cultivo se utiliza una mezcla de 1/1 de DMEM "alto
contenido en glucosa" y Ham's F12, el cual es suplementado con
las siguientes otras adiciones: 10% FCS, 50 \mug de ácido
ascórbico/ml, 30 \mug de ácido
\alpha-cetoglutárico/ml, 100 U penicilina/ml y 100
\mug estreptomicina/ml. El cultivo se realiza en la incubadora
con 90% de humedad, 5% de CO_{2} a 37ºC. El cambio de medio se
efectúa cada tres a cuatro días.
Una vez logrado el 100% de la confluencia, los
cultivos monocapa deben "madurar posteriormente" aún de dos a
cinco días. Al sexto día se elimina el medio y la monocapa se lava
con 2x10 ml de una solución PBS estéril (pH 7,4) sin suplementación
de Ca y Mg. A cada botella se añaden 15 ml de la misma solución y
se incuba durante 30 a 90 minutos en una incubadora (90% de
humedad, 5% de CO_{2}, 37ºC). Durante este tiempo (control visual)
se desprende la monocapa del fondo del recipiente de cultivo.
Después de su desprendimiento completo, el vellón celular monocapa
que se encuentra en la suspensión es aspirado mediante una pipeta de
10 ml (cuidadosamente) y es transmitido a tubos de 50 ml estériles.
A continuación se añaden 10 ml del medio de cultivo (con cuidado
para que no se destruya el vellón) y se centrifugan de 100 a 1000 g
durante 10 minutos. Luego se elimina el sobrante y se aplica
cuidadosamente 5 ml del medio de cultivo fresco sobre el pellet. El
tubito no se cierra completamente y se pone verticalmente en la
incubadora. Transcurridos uno o dos días se forma claramente un
agrupamiento esférico visible del pellet. En este estado, el
agrupamiento madura hasta siete días, con un cambio diario del
medio (agente de cultivo, 5 ml). Luego, el agrupamiento es
transmitido mediante una cuchara estéril a una cavidad de una placa
Multiwell 6.
\newpage
La primera carga de presión se efectúa después
de la transmisión del agrupamiento. Esta primera carga de presión
se efectúa con un pistilo de vidrio con una superficie lisa
discoidal (diámetro de 1 a 3 cm^{2}). Bajo primera carga de
presión entendemos la compresión del agrupamiento hasta que adquiere
aproximadamente el 50% de su tamaño inicial. La frecuencia de
presión es del orden de 0,5 Hz, el tiempo de carga entre 15 y 25
segundos. Después de esta carga, este agrupamiento presenta el
aspecto de un "crêpe". Seguidamente se elimina el medio (con
precaución). Luego, el agrupamiento es plegado y vuelto como una
tarta de manzana. A continuación se añaden con un cuentagotas 2 ml
del medio de cultivo por agrupamiento. El cultivo ulterior tiene
lugar en la incubadora.
Al segundo día, la carga de presión se efectúa 2
veces (0,5 Hz, durante 15 a 25 segundos). A continuación se repite
el "procedimiento a modo de tarta de manzana". Al tercer día
se efectúa tres veces una carga (0,5 Hz, 15 a 25 segundos), con la
repetición de la "fabricación de tartas de manzana". Este
procedimiento se repite hasta el 5º día de cultivo (la
"fabricación de tartas de manzana" puede ser parada ya antes
del 5º día de cultivo, cuando el agrupamiento se mantiene en una
forma de gel estable). Si se ha producido o quedado estable esta
estructura celular tridimensional, el cultivo ulterior puede ser
continuado (carga de presión) manualmente o con un reactor de
presión previsto para ello. Una vez lograda la forma de agrupamiento
estable similar a un gel, la presión puede ser aumentada
gradualmente hasta 10 veces por día (0,5 Hz, 15 a 25 segundos, 10 a
500 g/cm^{2}). Transcurridos 12 a 20 días de carga, el
agrupamiento (en el ensayo) alcanza una resistencia suficiente para
utilizar este material obtenido de esta manera "in
vitro" para ensayos de transplante o transplantes
autólogos.
El sistema celular tridimensional regenerado con
el procedimiento según la invención puede ser utilizado como
sistema modelo y sistema de ensayo así como para transplantes.
Además, la estructura sirve de modelo para la comprobación de la
eficacia de los productos farmacéuticos. Adicionalmente, este
producto regenerado tridimensional es adecuado como modelo de ensayo
y sistema de liberación para aplicaciones de genes y terapéuticas
celulares de vehículos de transporte específicos como sistemas
basados en "VLP" y también para sistemas de transporte
adenovirales y retrovirales.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
\bullet DE 19962456 A1 [0002]
\bullet TONI LINDL Cultura celular y
de tejidos, espectro, Editorial 97-101
[0002]
Claims (7)
1. Procedimiento de fabricación de estructuras
de tejido tridimensionales sin soporte, en el que
- -
- células aisladas consistentes en cartílago o hueso o médula ósea aspirada o Nucleus pulposus o Anulus fibrosus crecen en un medio de adhesión sobre un soporte sólido,
- -
- estas células crecidas maduran con un cambio de medio periódico durante dos a cinco días para formar una capa de células,
- -
- a continuación, esta capa de células crecida es lavada al menos una vez con un tampón de cultivo celular exento de iones Ca^{2}+- y Mg^{2}+,
- -
- para luego ser incubado con este tampón en una incubadora durante 30 a 90 minutos, lo cual da lugar a la separación de la capa de células del soporte,
- -
- la capa de células desprendida es transferida al medio de cultivo celular y separada mecánicamente, de modo que se produzca un agrupamiento celular,
- -
- este agrupamiento celular es incubado durante hasta siete días cambiando periódicamente el medio, de modo que madure un agrupamiento celular,
- -
- y a continuación de esta incubación, este agrupamiento celular es sometido respectivamente al menos a una carga de presión cíclica con la sucesiva conformación mecánica.
2. Procedimiento para la fabricación de
estructuras de tejido tridimensionales sin soporte según la
reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el
primer paso de cargas de presión cíclicas da lugar a un
agrupamiento celular que se reduce al 50% de su tamaño antes del
tratamiento a presión, y se produce la conformación mecánica
plegando el agrupamiento celular solamente una vez.
3. Procedimiento de fabricación de estructuras
de tejido tridimensionales sin soporte según la reivindicación 2,
caracterizado por el hecho de que la carga de presión se
efectúa con una frecuencia de presión de 0,5 Hz y un tiempo de
carga de 15 a 25 segundos.
4. Procedimiento de fabricación de estructuras
de tejido tridimensionales sin soporte según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el segundo y siguientes
pasos de cargas de presión cíclicas son interrumpidos cada vez por
una conformación mecánica intermedia plegando la agrupación celular
solamente una vez.
5. Procedimiento de fabricación de estructuras
de tejido tridimensionales sin soporte según la reivindicación 5,
caracterizado por el hecho de que la carga de presión se
efectúa con una frecuencia de presión de 0,5 Hz y un tiempo de
carga entre 15 y 25 segundos.
6. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones arriba indicadas, caracterizado por el
hecho de que la carga de presión cíclica con la sucesiva
conformación es interrumpida después del 5º día de cultivo y el
agrupamiento celular es cargado con una frecuencia de presión de
0,5 Hz, un tiempo de carga entre 15 y 25 segundos con una presión
de 10 a 500 g/cm^{2} hasta 10 veces por día durante un período de
hasta 20 días.
7. Estructuras de tejido tridimensionales sin
soporte fabricadas conforme al procedimiento según la
reivindica-
ción 1.
ción 1.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
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| US5792603A (en) * | 1995-04-27 | 1998-08-11 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Apparatus and method for sterilizing, seeding, culturing, storing, shipping and testing tissue, synthetic or native, vascular grafts |
| DE19962456A1 (de) * | 1999-12-22 | 2001-07-12 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Verfahren und Apparatur zur Herstellung, Untersuchung und mechanischen Stimulation dreidimensionaler Gewebezellkulturen |
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