ES2321822T3 - Antagonistas de los receptores de eg-vegf/procineticina 2. - Google Patents
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Abstract
Uso de una composición farmacéutica que como componente activo contiene una sustancia inhibidora elegida del grupo formado por un anticuerpo dirigido contra el polipéptido EG-VEGF, un ácido nucleico antisentido de EG- VEGF, un anticuerpo dirigido contra procineticina 2, un ácido nucleico antisentido de procineticina 2, un ácido nucleico antisentido de los receptores de EG-VEGF/procineticina 2 y un anticuerpo dirigido contra un receptor de EG- VEGF/procineticina 2, para la preparación de un medicamento para la detección de la receptividad uterina o para el tratamiento o la prevención de las siguientes enfermedades del endometrio: endometriosis y hemorragias disfuncionales.
Description
Antagonistas de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2.
La invención se refiere a antagonistas de los
receptores de EG-VEGF/procineticina 2 y a su uso
como medicamentos para el tratamiento de las enfermedades del
endometrio: endometriosis y hemorragias disfuncionales.
La endometriosis es una de las enfermedades
ginecológicas más frecuentes, que afecta aproximadamente al
2-10% de las mujeres en edad reproductiva (Gazvani
y Templeton 2002, Reproduction 123, 217-226; Smith
2001, Trends Endocrinol. Metab. 12, 147-151). Está
causada por la implantación ectópica de tejido endometrial,
principalmente en la cavidad peritoneal. Además de dolores y de
otros numerosos síntomas, muchas pacientes de endometriosis son
estériles. Las razones de la esterilidad se desconocen en su mayor
parte (Ryan y Taylor 1997, Obstet. Gynecol. Surv. 52,
365-371; Haney 1997, Reprod. Med. Rev. 6,
145-161).
En la actualidad no se dispone de una terapia
causal para el tratamiento de la endometriosis. El tratamiento de
la endometriosis se basa en el concepto de supresión de estrógenos.
A una intervención invasiva, en la que se eliminan u obliteran los
focos de endometriosis durante una laparoscopia o laparotomía, sigue
normalmente un tratamiento medicamentoso que, mediante la inducción
de un bajo nivel de estrógenos, conduce a una inhibición al menos
parcial de la proliferación de los focos de endometriosis remanentes
no reconocibles (Sillem 1998, Programmed® 23, supl. 1,
1-28). Debido en parte a su androgenicidad, los
medicamentos utilizados tienen numerosos efectos secundarios,
ocasionan hemorragias por disrupción, trastornos climatéricos y
osteopenia. Aunque el tratamiento medicamentoso ha demostrado ser
efectivo como tratamiento inicial de la endometriosis, hasta ahora
no ha podido conseguirse una reducción de la alta tasa de
recidiva.
El cáncer de endometrio es la cuarta forma más
frecuente de cáncer en los países occidentales. En función del
estadio en el momento del diagnóstico, la tasa de supervivencia
después de 5 años es del 27% al 88%. Una de las causas principales
parece ser un elevado nivel de estrógenos (Akhmedkhanov y col. 2001,
Ann. N. Y. Acad. Sci. 943, 296-315). Dicho nivel
conduce al aumento de la proliferación de las células del
endometrio, lo que puede ocasionar fallos en la replicación del ADN
y mutaciones somáticas y puede conducir finalmente a un tumor
maligno. Como en el caso de otros tumores, la angiogénesis desempeña
un papel esencial en el cuadro clínico del cáncer endometrial.
Varios estudios han constatado un aumento de la vascularización y
una sobreexpresión del factor de crecimiento endotelial VEGF
(vascular endothelial growth factor) y
de sus receptores (Abulafia y col. 1999, Gynecol. Oncol. 72,
220-231).
Actualmente se usan varias terapias para el
tratamiento del cáncer de endometrio. Los antiestrógenos muestran
una buena efectividad, pero frecuentemente debe realizarse también
una terapia adicional con citostáticos o radiaciones.
Aproximadamente el 10% de las mujeres sufren
regularmente fuertes hemorragias durante la menstruación ocasionadas
por cambios en los vasos sanguíneos del endometrio. En el
endometrio de dichas mujeres se ha demostrado un aumento de la tasa
de proliferación de las células endoteliales (Kooy 1996, Hum.
Reprod. 11, 1067-1072). Además se han observado
diferencias estructurales en los vasos sanguíneos como, por ejemplo,
la incompleta formación de la capa de células de músculo liso
(Abberton y col. 1999, Hum. Reprod. 14, 1072-1079).
Dado que la pérdida de sangre durante la menstruación se regula en
parte por la constricción de los vasos sanguíneos, es de suponer
que los defectos de la musculatura lisa contribuyan
considerablemente a la hemorragia.
Además de la intervención quirúrgica
(histerectomía), el tratamiento puede ser también medicamentoso.
También en este caso se emplean hormonas esteroides. Además se usan
sustancias antiinflamatorias no esteroideas, que son muy efectivas,
pero que tienen muchos efectos secundarios, de modo que pueden
usarse solamente durante relativamente poco tiempo (Irvine y
Cameron 2000, Baillieres Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol.
13, 189-202).
Existe la necesidad urgente de encontrar nuevos
procedimientos de tratamiento y sustancias que permitan un
tratamiento preciso de las enfermedades del endometrio. La presente
invención soluciona el problema mediante un nuevo procedimiento de
terapia, en el que los polipéptidos EG-VEGF,
procineticina 2 y los correspondientes receptores sirven como
sustancias diana para nuevos medicamentos.
El EG-VEGF (endocrine
gland derived vascular endothelial
growth factor), denominado también procineticina, 1,
ya ha sido descrito como factor de crecimiento específico para
células endoteliales de la corteza adrenérgica de las cápsulas
suprarrenales. Su expresión se ha demostrado en los ovarios, los
testículos, la placenta y en las cápsulas suprarrenales (LeCouter y
col. 2001, Nature 412, 877-884). Además se han
demostrado efectos contráctiles sobre los músculos lisos del tracto
gastrointestinal (Li y col. 2001, Mol. Pharmacol. 59,
692-698). En el documento WO 02/00711 (Genentech,
Inc) se dan a conocer la secuencia de ácido nucleico y la
correspondiente secuencia de aminoácidos del polipéptido
EG-VEGF, así como su uso en el tratamiento de
enfermedades relacionadas con tejidos productores de hormonas (por
ejemplo el ovario). Los polipéptidos EG-VEGF y
procineticina 2 (también denominado Bv8) pertenecen a la misma
familia, presentan el 60% de identidad y son similares en el 75%.
Las dos proteínas presentan una región conservada que comprende 10
restos de cisteína (Wechselberger y col. 1999, FEBS Lett. 462,
177-181). La expresión de procineticina 2 se ha
demostrado casi exclusivamente en los testículos y en el cerebro
(Wechselberger y col. 1999, FEBS Lett. 462, 177-181;
LeCouter y col. 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100,
2685-2690). La procineticina 2 estimula la
angiogénesis en los testículos (LeCouter y col. 2003, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 100, 2685-2690), la contracción de
los músculos lisos del tracto gastrointestinal (Li y col. 2001,
Mol. Pharmacol. 59, 692-698) y transmite el ritmo
circadiano del núcleo supraquiasmático del cerebro (Cheng y col.
2002, Nature 417, 405-410). La importancia de
EG-VEGF o procineticina 2 en el endometrio no se
considera. El papel de EG-VEGF o procineticina 2 en
las enfermedades del endometrio no se conocía hasta ahora.
En la presente invención ha podido mostrarse que
EG-VEGF se expresa en el endometrio y que se regula
al alza en la denominada ventana de implantación del ciclo (figs. 3
y 4). Mediante determinaciones semicuantitativas y cuantitativas se
compararon entre sí los ARNm de endometrio humano de tres grupos de
estudio clínico. Los resultados de estos estudios demostraron que
en mujeres sanas el ARNm de EG-VEGF está regulado al
alza en el grupo b (cuando la ventana de implantación está abierta)
en comparación con el grupo de control a (antes de abrirse la
ventana de implantación). También en el grupo c (pacientes de
endometriosis) se constató un incremento de la cantidad de ARNm de
EG-VEGF.
La unión de EG-VEGF o
procineticina 2 a dos receptores relacionados acoplados a la
proteína G (GPR73a y GPR73b) conduce a la activación de dichos
receptores. Estos asociados fisiológicos de los polipéptidos
EG-VEGF y procineticina 2 no han sido identificados
y caracterizados hasta hace poco tiempo (Lin y col. 2002, J. Biol.
Chem. 277, 19276-19280). Los efectos transmitidos
por los receptores son responsables de los efectos biológicos de
EG-VEGF y procineticina 2 que, a su vez, son
responsables de las enfermedades patológicas del endometrio.
En la presente invención ha podido demostrarse
que la expresión de EG-VEGF, de procineticina 2 y
del receptor de EG-VEGF, GPR73a, es claramente
superior en lesiones procedentes de distintas pacientes enfermas de
endometriosis, que en tejido sano (fig. 5).
Además ha podido identificarse una nueva
variante humana de corte y empalme de GPR73a (fig. 2c). El ARN de
esta variante contiene un exón adicional que, sin embargo, contiene
un codón de parada y, por lo tanto, conduce a una proteína
truncada. El receptor truncado se extiende solamente hasta el tercer
dominio transmembrana y, por lo tanto, no debe ser capaz de llevar
a cabo la transducción de la señal. Este receptor podría ser un
inhibidor negativo dominante de GPR73a o de GPR73b, que atrapa
ligandos o se une a heterodímeros.
Una inhibición de la unión del factor de
crecimiento EG-VEGF o de procineticina 2 a los
receptores de EG-VEGF, por un lado, o una
inhibición directa de los polipéptidos EG-VEGF o
procineticina 2 reprime la función biológica de
EG-VEGF o procineticina 2. Esta inhibición permite
el tratamiento preciso de las enfermedades expuestas anteriormente.
La invención pone a disposición los agentes farmacéuticos para dicho
tratamiento preciso.
Por lo tanto, la invención reside en el uso de
una composición farmacéutica, que contiene como componente activo
una sustancia inhibidora elegida del grupo formado por:
un anticuerpo dirigido contra
EG-VEGF o procineticina 2, un ácido nucleico
antisentido de EG-VEGF o procineticina 2, un ácido
nucleico antisentido de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2 y un anticuerpo dirigido
contra un receptor de EG-VEGF/procineticina 2, para
la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención
de las enfermedades del endometrio: endometriosis y hemorragias
disfuncionales.
El ácido nucleico de EG-VEGF
comprende tanto ADN, como ADNc y ARN o partes de éstos. Las
secuencias de ADN y proteína se representan en la fig. 1.
Preferentemente, el ácido nucleico de EG-VEGF es un
ADN.
El ácido nucleico de procineticina 2 comprende
tanto ADN, como ADNc y ARN o partes de éstos. Las secuencias de ADN
y proteína se describen en el banco de datos GeneBank, con el número
de acceso NM_021935. Preferentemente, el ácido nucleico de
procineticina 2 es un ADN.
El ácido nucleico de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2 comprende tanto ADN, como
ADNc y ARN o partes de éstos. Las secuencias de ADN y proteína se
representan en las fig. 2a y 2b. Las secuencias de ADN y proteína
de la nueva variante de corte y empalme se representan en la fig.
2c. Preferentemente, el ácido nucleico de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2 es un ADN.
Por polipéptido EG-VEGF se
entiende la secuencia completa así como también partes de la
misma.
Por polipéptido procineticina 2 se entiende la
secuencia completa así como también partes de la misma.
El ácido nucleico antisentido de
EG-VEGF es un ADN y/o ARN complementario de un ARNm
de EG-VEGF. Puede comprender la totalidad de la
secuencia complementaria o secuencias parciales.
El ácido nucleico antisentido de procineticina 2
es un ADN y/o ARN complementario de un ARNm de procineticina 2.
Puede comprender la totalidad de la secuencia complementaria o
secuencias parciales.
El ácido nucleico antisentido de los receptores
de EG-VEGF/procineticina 2 es un ADN y/o ARN
complementario de un ARNm de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2. Puede comprender la
totalidad de la secuencia complementaria o secuencias
parciales.
\newpage
Un anticuerpo contra EG-VEGF,
procineticina 2 o los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2 puede ser monoclonal o
policlonal. Puede estar dirigido contra EG-VEGF,
procineticina 2 o los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2 o contra fragmentos de
éstos. La obtención de un anticuerpo tal se realiza por
procedimientos estándar mediante la inmunización de animales de
ensayo.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se preparan de manera en sí conocida con los excipientes sólidos o
líquidos o los disolventes habituales y con los coadyuvantes
farmacéuticos y técnicos habituales según el modo de administración
y con una dosificación adecuada. Los comprimidos pueden obtenerse,
por ejemplo, por mezcla del principio activo con coadyuvantes
conocidos, por ejemplo, diluyentes inertes como dextrosa, sacarosa,
sorbitol, manitol, polivinilpirrolidona, desintegrantes como almidón
de maíz o ácido algínico, aglutinantes como almidón y gelatina,
lubricantes como carboxipolimetileno, carboximetilcelulosa,
acetatoftalato de celulosa o acetato de polivinilo. Las cápsulas
que contienen un principio activo pueden prepararse, por ejemplo,
mezclando el principio activo con un excipiente inerte como lactosa
o sorbitol y encapsulándolo en cápsulas de gelatina.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención pueden emplearse también en disoluciones adecuadas como,
por ejemplo, disolución salina fisiológica.
Para la administración por vía parenteral son
especialmente adecuadas disoluciones oleosas como, por ejemplo,
disoluciones en aceite de sésamo, aceite de ricino y aceite de
semillas de algodón. Para aumentar la solubilidad pueden añadirse
codisolventes como, por ejemplo, benzoato de bencilo o alcohol
bencílico.
Asimismo, la composición farmacéutica según la
invención puede usarse para el diagnóstico de la endometriosis. En
este caso se determinan las cantidades de EG-VEGF o
procineticina 2, por ejemplo, mediante un ensayo ELISA o un chip de
proteínas. Un aumento de la expresión de EG-VEGF o
de procineticina 2 indica la existencia de endometriosis.
Además, la presente invención puede tener
aplicación mediante el uso de la composición farmacéutica como
agente de terapia génica. En este caso se bloquean los efectos de
EG-VEGF o procineticina 2 mediante el empleo de la
terapia génica. En ello se construye y administra un vector que
contiene una secuencia antisentido de EG-VEGF o
procineticina 2 o una secuencia antisentido de un receptor de
EG-VEGF o procineticina 2. Algunos ejemplos son
vectores derivados de adenovirus, virus asociado a adenovirus, virus
del herpes simple o SV40. La terapia génica puede realizarse como
se ha descrito (Gomez-Navarro y col. 1999, Eur. J.
Cancer, 35, 867-885). La administración puede tener
lugar de forma local, es decir, directamente en el útero, o
sistémica, es decir, a través de la circulación sanguínea. Esto
conduce a un bloqueo de la expresión de EG-VEGF, de
procineticina 2 o de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2 en el endometrio. De esta
manera se inhibe la función biológica de EG-VEGF o
de procineticina 2.
Otra aplicación de la terapia génica consiste en
que se construye y administra un vector que contiene la secuencia
de la variante de corte y empalme de GPR73a. Algunos ejemplos son
vectores derivados de adenovirus, virus asociado a adenovirus,
virus del herpes simple o SV40. La terapia génica puede realizarse
como se ha descrito (Gomez-Navarro y col. 1999,
Eur. J. Cancer, 35, 867-885). La administración
puede tener lugar de forma local, es decir, directamente en el
útero, o sistémica, es decir, a través de la circulación sanguínea.
Esto conduce a un bloqueo de la función de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2, GPR73a y/o GPR73b en el
endometrio. De esta manera la transducción de señales inducida por
EG-VEGF o procineticina 2 se detiene
prematuramente.
La presente invención se refiere además al uso
de una composición farmacéutica según la invención para la
detección de la receptividad uterina. La receptividad uterina es una
condición previa para una satisfactoria anidación del blastocisto.
Esta implantación solamente puede tener lugar durante un breve
espacio de tiempo, la denominada ventana de implantación, que en
humanos está abierta durante la fase secretora media, es decir
aproximadamente 7-9 días después de la ovulación.
Dado que la presente invención muestra que la expresión de
EG-VEGF está regulada al alza cuando la ventana de
implantación está abierta, mediante la medida de la cantidad de
ARNm de EG-VEGF o de polipéptido
EG-VGEF puede determinarse el momento adecuado para
una transferencia del óvulo fertilizado por fecundación in
vitro. La medida se realiza por medio de una transferencia de
ARN (northern), una reacción de PCR o la hibridación de chips o por
medio de un ensayo inmunológico.
Además, la invención se refiere a un
procedimiento para la detección de la receptividad uterina, en lo
que se determina la cantidad de polipéptido EG-VEGF
y/o la cantidad de ácido nucleico de EG-VEGF con
ayuda de una composición farmacéutica según la invención.
Primeramente se toma una muestra de sangre o una muestra del
endometrio de las mujeres y después se determina la cantidad de ARNm
de EG-VEGF o de polipéptido
EG-VEGF.
También se describe el uso de composiciones
farmacéuticas para la identificación de sustancias que influyen en
los efectos de EG-VEGF o procineticina 2. Los
efectores son sustancias que influyen en la actividad biológica de
los polipéptidos EG-VEGF o procineticina 2, bien por
la unión a los polipéptidos EG-VEGF o procineticina
2 o por competencia con los polipéptidos EG-VEGF o
procineticina 2 en su unión a sus asociados fisiológicos. Los
efectores pueden ser también sustancias que se unen preferentemente
a la variante de corte y empalme del receptor y, por lo tanto,
modulan o inhiben la función de GPR73a o GPR73b. Los efectores
pueden ser sustancias de bajo peso molecular o también péptidos o
proteínas como, por ejemplo, anticuerpos. Otra posibilidad la
representan ácidos nucleicos como los oligómeros Spiegelmere o
aptámeros que, debido a su estructura espacial, pueden unirse
específicamente a la molécula diana y de este modo impedir la
interacción de un ligando con su receptor. Para identificar estos
efectores, se trata con EG-VEGF o procineticina 2
una célula que expresa un receptor de
EG-VEGF/procineticina 2. Esto conduce a una
alteración del nivel de calcio intracelular, lo que se mide a su
vez. Los antagonistas son sustancias que pueden inhibir el flujo de
entrada de calcio. Además, las variantes de corte y empalme de los
receptores pueden coexprimirse junto con GPR73a o GPR73b, con el fin
de buscar sustancias que provoquen selectivamente la
heterodimerización y de este modo bloqueen las señales inducidas
por EG-VEGF o procineticina 2. También pueden usarse
otros sistemas de detección para el cribado de antagonistas de
EG-VEGF/procineticina 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 1 muestra la secuencia de ADN y proteína
de EG-VEGF humano.
La fig. 2 muestra las secuencias de ADN y
proteína de los receptores de EG-VEGF/procineticina
2 humanos, GPR73a (2a), GPR73b (2b) y de la nueva variante de corte
y empalme de GPR73a (2c).
La fig. 3 muestra la expresión del ARN de
EG-VEGF en el endometrio, detectada por el
procedimiento RT-PCR. Es obvia una regulación al
alza del gen de EG-VEGF humano en el grupo b
(LH+7-9/fec.) en comparación con el grupo a
(LH+2-4). Se utilizaron "cebadores" específicos
para EG-VEGF. Como control interno se amplificó una
sonda antisentido de S9. Después de la amplificación por PCR, los
productos se separaron en un gel de agarosa y se tiñeron con
bromuro de etidio. La intensidad de las bandas se cuantificó. Grupo
a: antes de la apertura de la ventana de implantación; grupo b:
tiempo en que la ventana de implantación está abierta en mujeres
sanas; LH: hormona luteinizante; 2-4 ó
7-9: espacio de tiempo en días.
La fig. 4 muestra la expresión del ARN de
EG-VEGF en el endometrio, detectada por el
procedimiento TaqMan. Es obvia una regulación al alza del gen de
EG-VEGF humano en los grupos b
(LH+7-9/fec.) y c
(LH+7-9/endometriosis), en comparación con el grupo
a (LH+2-4). Se utilizaron "cebadores"
específicos para EG-VEGF. Adicionalmente se
determinaron las cantidades de ARNm de LIF y calcitonina, dos genes
cuya regulación al alza durante la ventana de implantación es
conocida. Las cantidades de los productos de la reacción de PCR se
determinaron mediante tinción con SYBER Green. Todas las cantidades
de ARNm se equipararon con la cantidad de ARNm de actina. Grupo a:
antes de la apertura de la ventana de implantación; grupo b: tiempo
en que la ventana de implantación está abierta en mujeres sanas;
grupo c: tiempo en que la ventana de implantación está abierta en
pacientes de endometriosis; LH: hormona luteinizante;
2-4 ó 7-9: espacio de tiempo en
días.
La fig. 5 muestra la expresión del ARN de
EG-VEGF y del receptor de EG-VEGF,
GPR73a (denominado aquí EG-VEGF R1) en lesiones
procedentes de pacientes enfermas de endometriosis, detectada por el
procedimiento TaqMan. La expresión relativa de ARNm se equiparó con
la cantidad de ARNm de ciclofilina. En el caso de las pacientes
DF31h1, DF33h1 y DF26h1, las muestras corresponden a tejido eutópico
de pacientes sanas de control (barras blancas), las muestras de las
pacientes de endometriosis AV103, AV104, FC108 y DF51 proceden del
endometrio (eutópico, h1; barras grises) o de lesiones ectópicas
(e1 o e3; barras negras). Es obvia una regulación al alza del gen
de GPR73a (EG-VEGF R1) humano en distintas lesiones
en comparación con el tejido sano. Se utilizaron "cebadores"
específicos para GPR73a (EG-VEGF R1). Como control
se midieron las cantidades de ARNm de GPR73a
(EG-VEGF R1) en los testículos y en el endometrio.
Las cantidades de los productos de la reacción de PCR se
determinaron mediante tinción con SYBER Green.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Grupo a (LH más 2-4 días):
dos días después de desencadenarse la ovulación por la secreción de
la hormona luteinizante (LH) el endometrio todavía no es receptivo
para un embrión. Este grupo estuvo compuesto de pacientes que
participaban en un programa de fecundación in vitro (FIV) a
causa de una obstrucción de trompas o de la esterilidad del esposo
y presentaban un endometrio normal.
2. Grupo b (LH más 7-9 días): en
este momento, la "ventana de implantación" está abierta y el
endometrio es receptivo para la implantación del blastocisto. Por
la apertura de la "ventana de implantación" se espera la
expresión o inhibición de genes cuyos productos proteicos desempeñan
una papel esencial en la anidación del embrión.
3. Grupo c (LH más 7-9 días más
endometriosis): en este momento la ventana de implantación está
abierta en las mujeres sanas. Sin embargo, las pacientes de este
grupo eran estériles por razones desconocidas y padecían
endometriosis.
Se tomaron muestras de endometrio de las
pacientes pertenecientes a los dos grupos
LH+2-4/fec. (a) y LH+7-9/fec. (b) y
se sometieron a congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido. A
partir de dichas muestras se aisló el ARN total con el kit RNeasy
(Qiagen). A continuación se hizo una digestión con Dnasa I
(Invitrogen). Después, partiendo de 5,7 \mug de ARN total se
realizó una síntesis de la primera cadena con los kits ProSTAR First
Strand RT-PCR de Stratagene. Para la determinación
semicuantitativa de las cantidades de EG-VEGF se
emplearon 0,5 \mul de la primera cadena de ADN y cebadores
específicos para EG-VEGF
(5'-TCAATCATGCTCCTCCTAGTAACTGTG-3'
y 5'-AAGTCCATGGAGCAGCGGTAC-3'). Las
condiciones de la reacción de PCR fueron: 2 min a 94ºC; 20 s a 94ºC,
20 s a 65ºC, 40 s a 72ºC (40 ciclos); 10 min a 72ºC. Como control
interno se amplificó ARN de S9 (cebadores: 5'-
AGGACCCACGGCGTCTGTTCG-3' y
5'-ATCCAGCAGCCCAGGAGGGAC-3'). Las
condiciones de la reacción de PCR fueron: 2 min a 94ºC; 20 s a
94ºC, 20 s a 60ºC, 40 s a 72ºC (24 ciclos); 10 min a 72ºC. Después
de la reacción, los productos de amplificación se separaron en un
gel de agarosa al 2% y se tiñeron con bromuro de etidio. La
intensidad de las bandas se determinó con el aparato GelDoc. (Fig.
3)
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras de endometrio de las
pacientes pertenecientes a los tres grupos
LH+2-4/fec. (a), LH+7-9/fec. (b),
LH-7-9/endometriosis (c) y se
sometieron a congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido. A partir
del tejido pulverizado por trituración en mortero en nitrógeno
líquido se aisló el ARN total por medio del reactivo TRIZOL
(Invitrogen). Partiendo de 5 \mug de ARN total se realizó en
primer lugar una digestión con Dnasa I (Invitrogen) y, a
continuación, una síntesis de la primera cadena usando el sistema
SUPERSCRIPT II First Strand Synthesis para RT-PCR
(Invitrogen). En la amplificación de los productos transcritos para
su cuantificación relativa se emplearon 0,125 \mul de ADN de la
primera cadena de ADN. La amplificación se realizó mediante el uso
de pares de cebadores específicos (EG-VEGF:
5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCA-3' y
5'-CGGGAACCTGGAGCACAG-3';
calcitonina:
5'-CAACTTTGTGCCCACCAATGT-3' y
5'-GAGTCATTCAGCTGCTCAGGC-3': factor
inhibidor de la leucemia (LIF):
5'-CTAGTTCCCCACCTCAATCCC-3' y
5'-AAGGCCATGTGCTTTTCAGTG-3') y del
kit SYBR Green PCR Master Mix (PE Biosystems), con las siguientes
condiciones para la reacción de PCR: 10 min a 95ºC; 15 s a 95ºC, 1
min a 60ºC (40 ciclos). Como control interno se amplificó el ARN de
la subunidad 1A de la citocromooxidasa (cebadores:
5'-CGTCACAGCCCATGCATTTG-3' y
5'-GGTTAGGTCTACGGAGGCTC-3'. La
medición de la fluorescencia como medida del incremento de los
productos de amplificación se llevó a cabo en línea mediante el
aparato de detección ABI Prism 7700 Sequence Detector (PE
Biosystems). La pureza de los productos de amplificación se comprobó
mediante el registro de curvas de fusión. (Fig. 4)
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez recogido, el tejido se sometió a
congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido. A partir del tejido
pulverizado por trituración en mortero en nitrógeno líquido se aisló
el ARN total por medio del reactivo TRIZOL (Invitrogen). Se llevó a
cabo un enriquecimiento del ARN-poliA^{+} en un
procedimiento discontinuo mediante el uso de
oligo(dT)-celulosa (Pharmacia). Partiendo de
100-400 ng de ARN-poliA^{+} se
realizó una síntesis de la primera cadena usando el sistema
SUPERSCRIPT II First Strand Synthesis para RT-PCR
(Invitrogen). En la amplificación de los productos transcritos para
su cuantificación relativa se emplearon 0,25 \mul de la primera
cadena de ADN. La amplificación se realizó como PCR múltiple
mediante el uso de pares de cebadores específicos
(EG-VEGF:
5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCA-3' y
5'-CGGGAACCTGGAGCACAG-3'; receptor
de EG-VEGF, GPR73a:
5'-ATTGACAGGTATCTGGCTATTGTCC-3' y
5'-CCAAGGCAATCAGGCCAGT-3'), las
sondas TaqMan correspondientes (EG-VEGF:
5'-TET-ACACCTGTCCTTGCTTGCCCAACC-TAMRA-3';
receptor de EG-VEGF, GPR73a:
5'-FAM-CTGAGACCACGGATGAAGTGCCAAACA-TAMRA-3')
y el kit TaqMan PCR Master Mix (PE Biosystems), con las siguientes
condiciones para la reacción de PCR: 2 min a 50ºC; 10 min a 95ºC;
15 s a 95ºC, 1 min a 62ºC (40 ciclos). Como control interno se
amplificó el ARN de ciclofilina (cebadores:
5'-GAAGTTGGCCGCATGAAGA-3' y
5'-GCCTAAAGTTCTCGGCCGT-3'; sonda:
5'-VIC-CGAGCTCTTTGCAGACGTTGTGCCT-TAMRA-3').
La medición de la fluorescencia como medida del incremento de los
productos de amplificación se llevó a cabo en línea mediante el
aparato de detección ABI Prism 7700 Sequence Detector (PE
Biosystems).
Para la cuantificación relativa del ARN de
procineticina 2 se emplearon 0,5 \mul de la primera cadena de ADN
a partir de ARN-poliA^{+}. La amplificación se
realizó usando pares de cebadores específicos
(5'-CTCCTGTCATGG
CACGGAA-3' y 5'-AGCCCAACAGCAGAGCTGAA-3') y el kit SYBR Grenn PCR Master Mix (Eurogentec) con las siguientes condiciones para la reacción de PCR: 2 min a 50ºC; 10 min a 95ºC; 15 s a 95ºC, 1 min a 60ºC (40 ciclos). Como control interno se amplificó de nuevo el ARN de ciclofilina. (Fig.5)
CACGGAA-3' y 5'-AGCCCAACAGCAGAGCTGAA-3') y el kit SYBR Grenn PCR Master Mix (Eurogentec) con las siguientes condiciones para la reacción de PCR: 2 min a 50ºC; 10 min a 95ºC; 15 s a 95ºC, 1 min a 60ºC (40 ciclos). Como control interno se amplificó de nuevo el ARN de ciclofilina. (Fig.5)
\newpage
Se establece una línea celular (por ejemplo, CHO
o HEK) que expresa de manera transitoria o estable los receptores
de EG-VEGF/procineticina 2, GPR73a, GPR73b o la
variante de corte y empalme de GPR73a. Después de la adición de un
ligando se investiga un banco de datos de sustancias para encontrar
sustancias que repriman la unión del ligando (ensayo de unión).
Alternativamente se realiza un ensayo funcional. Se mide la
liberación de calcio causada por el ligando, por ejemplo, mediante
un ensayo de luminiscencia basado en ecuorina. En este caso se
cotransfectan las células con un plásmido de expresión de ecuorina.
La ecuorina se une al calcio liberado, lo que conduce a un aumento
de la luminiscencia. La inhibición de esta actividad por medio de un
antagonista de los receptores se usa como magnitud de medida para
el ensayo.
Claims (3)
1. Uso de una composición farmacéutica que como
componente activo contiene una sustancia inhibidora elegida del
grupo formado por un anticuerpo dirigido contra el polipéptido
EG-VEGF, un ácido nucleico antisentido de
EG-VEGF, un anticuerpo dirigido contra procineticina
2, un ácido nucleico antisentido de procineticina 2, un ácido
nucleico antisentido de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2 y un anticuerpo dirigido
contra un receptor de EG-VEGF/procineticina 2, para
la preparación de un medicamento para la detección de la
receptividad uterina o para el tratamiento o la prevención de las
siguientes enfermedades del endometrio: endometriosis y hemorragias
disfuncionales.
2. Uso de una composición farmacéutica que como
componente activo contiene una sustancia inhibidora elegida del
grupo formado por un anticuerpo dirigido contra el polipéptido
EG-VEGF, un ácido nucleico antisentido de
EG-VEGF, un anticuerpo dirigido contra procineticina
2, un ácido nucleico antisentido de procineticina 2, un ácido
nucleico antisentido de los receptores de
EG-VEGF/procineticina 2 y un anticuerpo dirigido
contra un receptor de EG-VEGF/procineticina 2, para
el diagnóstico de la endometriosis.
3. Procedimiento para la detección de la
receptividad uterina en muestras de endometrio de pacientes,
caracterizado porque mediante un anticuerpo dirigido contra
el polipéptido EG-VEGF o contra procineticina 2 y/o
mediante la determinación del ARNm de EG-VEGF o de
procineticina 2 se determinan las cantidades incrementadas de
polipéptido EG-VEGF y/o de ácido nucleico de
EG-VEGF.
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