ES2321118T3 - Dispositivo y procedimiento para la deteccion de macromoleculas cargadas. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo para la detección de macromoléculas, que comprende un sensor (1,2) sensible a iones con una capa (2) sensible a iones en cuya superficie están inmovilizadas moléculas sonda (3) que son capaces de efectuar una unión específica con moléculas diana que se han de detectar, caracterizado porque las moléculas sonda están dispuestas inmovilizadas sobre la capa sensible a iones a una distancia mínima as entre sí de tal manera que durante una unión con las moléculas diana se induzca una redistribución de los iones en los espacios intermoleculares (4) de las moléculas sonda.
Description
Dispositivo y procedimiento para la detección de
macromoléculas cargadas.
La invención se refiere a un dispositivo y a un
procedimiento para la detección de macromoléculas cargadas. Por el
documento WO 99/51330 A se conoce un dispositivo de este tipo.
Las micromatrices de ADN, denominadas también
chips de ADN, son importantes para el uso en la tecnología genética
y médica en cuanto al análisis paralelo de secuencias de ácido
nucleico.
Los chips de ADN constan típicamente de un
sustrato de vidrio o de silicio con una matriz de micropuntos para
el experimento de unión o de hibridación propiamente dicho. En este
caso hibridan dos cadenas sencillas (ADNcs) complementarias para dar
una molécula de cadena doble (ADNcd). Cada micropunto presenta
sondas de ADN de cadena sencilla que se unen o hibridan con
moléculas diana complementarias de una solución de analito que se ha
de estudiar. La hibridación de ADN es altamente selectiva. Sólo
pueden hibridar eficazmente secuencias de ADN complementarias. Los
chips de ADN permiten la detección simultánea de las más diversas
moléculas diana o fragmentos de ADN. La detección también es posible
en mezclas de soluciones complejas.
Por el documento DE 10048997 A1 se conoce un
dispositivo capacitivo basado en el efecto de campo para la
detección de macromoléculas cargadas, en particular de secuencias de
polinucleótidos, en una solución eléctricamente conductora. El
procedimiento indicado se basa en que muchas macromoléculas están
presentes en solución en forma disociada y llevan, en parte, una
carga elevada. Cuando se detectan las macromoléculas diana
disociadas en la solución de muestra con una sonda de ADN fijada a
la superficie del aislante de la compuerta, puede producirse un
enriquecimiento de cargas en la superficie del aislante. Este
enriquecimiento provoca un desplazamiento de los portadores de carga
en el semiconductor y/o un desplazamiento de la línea característica
C/V (capacitancia/voltaje) y, con ello, un cambio en la
capacitancia del condensador formado por el sistema
semiconductor/aislante/solución de muestra/ metal (como electrodo de
referencia) que se puede registrar.
Por el documento US 2003/0152929 A1 se conoce
para la determinación de ADN desconocido un transistor de efecto de
campo con compuerta flotante. La disposición comprende diferentes
puntos de detección, cada uno de los cuales consta de un transistor
de efecto de campo con compuerta flotante de
poli-Si. Cuando se produce un acontecimiento de
hibridación entre la sonda de ADN conocida sobre la compuerta del
transistor y el ADN diana desconocido que se ha de estudiar en la
solución de analitos, aumenta la carga negativa sobre la compuerta
del transistor. Esto tiene como consecuencia un cambio detectable en
la corriente de dren.
Por el documento US 648639 B2 se conoce un
sensor basado en un transistor de efecto de campo (FET) del modo de
agotamiento para la detección cuantitativa sin marcado de moléculas
diana cargadas y no cargadas. En este caso ya fluye una corriente de
dren a un voltaje de compuerta de 0 V. La sonda de ADN se inmoviliza
sobre un electrodo de compuerta flotante de Au, que a su vez está
dispuesto sobre un aislante de la compuerta de
SiO_{2}-Si_{3}N_{4}. El sensor reacciona al
acontecimiento de hibridación con un cambio en la corriente de dren
del FET.
Un cambio de corriente es inducido por una
modificación del electrolito a causa de la unión entre el ADN diana
y la sonda de ADN. Esto conduce a un cambio en el grosor de capa
efectivo del aislante de la compuerta y, por lo tanto, a un cambio
en la capacitancia. El cambio de corriente también es inducido por
el enriquecimiento de moléculas cargadas sobre la compuerta, lo que
produce un cambio en el voltaje de umbral del transistor.
El inconveniente reside en que con los sensores
basados en el efecto de campo antes descritos sólo se alcanzan
amplitudes reducidas de la señal, puesto que aparece el denominado
efecto de apantallamiento por contraiones en el que la carga
negativa del ADN en solución es apantallada por contraiones de carga
positiva. Otras deficiencias son la alta deriva de los sensores, la
inestabilidad y la mala reproducibilidad de los elementos de los
sensores, causadas, por ejemplo, por la compuerta flotante, la
ausencia o realización insuficiente del electrodo de referencia y
los materiales extremadamente delgados del aislante de la
compuerta.
El principio de los sensores basados en el
efecto de campo presentados asume que durante el acontecimiento de
hibridación, la carga de la molécula diana cambia la carga en la
zona de la compuerta del sensor. En el semiconductor se induce un
cambio de carga igual pero opuesto, lo que se traduce en un cambio
en el comportamiento operativo del elemento (cambio en la
capacitancia, el voltaje de banda plana, el voltaje de umbral, la
conductividad en el canal, la corriente). En realidad, sin embargo,
la carga eléctrica de las moléculas sonda inmovilizadas o diana
puede ser apantallada y/o neutralizada de forma más o menos completa
por pequeños contraiones presentes en la solución de analito. Esto,
a su vez, enmascara o reduce la señal que se puede medir en el
experimento de hibridación de ADN. En el peor de los casos se
obtiene así una carga neta igual a cero, es decir, que el sensor de
efecto de campo situado debajo de la capa de ADN no puede recibir,
pese al acontecimiento de hibridación, ninguna señal de medida. Por
este motivo resulta ineficaz la medición directa de las cargas de
las macromoléculas cargadas en soluciones con concentraciones
elevadas de iones, por ejemplo en soluciones fisiológicas, mediante
los sensores basados en el efecto de campo presentados del estado de
la técnica.
Para reducir los efectos del apantallamiento por
contraiones y obtener una señal de medida suficientemente alta ha de
trabajarse con los sensores presentados en soluciones de analito con
una concentración baja de iones, de unos pocos milimoles (mM). Los
inconvenientes residen en este caso en que la probabilidad de
hibridación es reducida y la hibridación tarda más.
Asimismo resulta desventajoso que durante el
acontecimiento de hibridación sólo deba producirse una interacción
con la superficie entre las moléculas sonda de ADN inmovilizadas y
sus moléculas diana complementarias. No deben producirse
interacciones entre iones pequeños presentes en la solución de
analito y la superficie de la compuerta. Para lograrlo, la sonda de
ADN inmovilizada debe formar una monocapa compacta y cerrada sin
poros ni orificios, lo que no es factible. Desventajosamente es
posible la penetración de iones inorgánicos pequeños y de moléculas
de agua en la capa de compuerta. Puesto que estas capas de
compuerta, habitualmente en forma de SiO_{2}, SiO_{2}
silanizado, Si_{3}N_{4}, Au o materiales similares, pueden
presentar propiedades electroactivas o quimiosensibles, por ejemplo
sensibilidad a pH, iones y/o redox, la interacción entre los iones
pequeños de la solución de analito y la superficie de la compuerta
puede dar lugar a un enmascaramiento, a una reducción e incluso a
una falsificación de la señal inducida por las macromoléculas que se
han de detectar. En los trabajos antes descritos no se tienen en
cuenta estos fenómenos ni tampoco los posibles efectos de
redistribución de cargas (causados por los efectos de
apantallamiento por contraiones) en la interfase entre la capa de
compuerta y la solución de analito.
El objetivo de la invención es, por lo tanto,
proporcionar un dispositivo y un procedimiento para la detección sin
marcado de macromoléculas cargadas que no presente las deficiencias
indicadas del estado de la técnica.
El objetivo se alcanza mediante un dispositivo
de acuerdo con la reivindicación principal y mediante un
procedimiento de acuerdo con la reivindicación secundaria. Las
configuraciones ventajosas se desprenden de las reivindicaciones que
hacen referencia a ellas respectivamente.
El dispositivo comprende un sensor sensible a
iones con una capa sensible a iones. En la superficie de la capa
sensible a iones están inmovilizadas las moléculas sonda para la
detección de las moléculas diana. Ambos tipos de moléculas efectúan
una unión específica en condiciones adecuadas.
De acuerdo con la invención, las moléculas sonda
están inmovilizadas en la superficie de la capa sensible a iones a
una distancia mínima entre sí. La distancia mínima se dimensiona de
tal manera que en caso de unión de las moléculas se induzca en la
superficie de la capa sensible a iones, en función del tamaño de la
molécula sonda y de la molécula diana así como de las condiciones
estéricas, una redistribución de los iones y, con ello, un cambio en
la concentración de iones en los espacios intermoleculares. Este
cambio en la concentración de iones y/o en la sensibilidad a iones
de la capa sensible a iones sirve de base para la señal de
medida.
Las moléculas sonda están inmovilizadas sobre la
capa sensible a iones a una distancia entre sondas. Se unen a las
moléculas diana complementarias que se han de detectar en la
solución de analito. El dispositivo registra el acontecimiento de
unión por detección de la redistribución de iones en los espacios
intermoleculares y/o del cambio en la sensibilidad a iones de la
capa sensible a iones.
En el marco de la invención se ha reconocido que
la unión sobre la capa sensible a iones conduce a un cambio de
potencial en la interfase entre la capa sensible a iones y la
solución de analito en los espacios intermoleculares de las
moléculas sonda. El cambio en la conductividad o en la impedancia de
la capa sensible a iones es registrado por el sensor sensible a
iones. El sensor sensible a iones se usa como transductor para la
detección de la unión de macromoléculas cargadas.
El dispositivo es especialmente adecuado para la
detección de una hibridación entre ácidos nucleicos. En este caso,
la molécula sonda y la molécula diana son ácidos nucleicos
complementarios entre sí, por ejemplo ARN o ADN.
Como molécula sonda puede estar inmovilizado
sobre la capa sensible a iones ventajosamente al menos un tipo de
ácido nucleico. También pueden estar inmovilizados sobre la
superficie diferentes tipos de ácidos nucleicos. Los ácidos
nucleicos ADNcs de cadena sencilla inmovilizados hibridan con sus
ácidos nucleicos complementarios para dar ADNcd de cadena doble.
Por medio de la inmovilización de las moléculas
sonda se garantiza ventajosamente una reducción del número de
moléculas sonda de ADNcs necesarias para la inmovilización, pues
para el registro de la señal de medida no se requiere una capa
compacta. De este modo se puede reducir la duración de la
inmovilización. La distancia media entre las moléculas sonda
individuales puede encontrarse preferentemente en el intervalo de
2,5 nm a 11 nm, lo que equivale a una densidad de moléculas de
aproximadamente 2,0 x 10^{13} moléculas/cm^{2} a 1,0 x 10^{12}
moléculas/cm^{2}. En concreto, los valores pueden restringirse a
un intervalo de 3,5 nm a 6 nm, lo que equivale a una densidad de
sondas de 1,0 x 10^{13} moléculas/cm^{2} a 3,5 x 10^{12}
moléculas/cm^{2}.
La capa sensible a iones permite una interacción
específica con el ion correspondiente (por ejemplo sodio, potasio)
de la solución de analito. Una propiedad especialmente ventajosa de
la capa sensible a iones reside en que ésta presenta puntos de unión
activos para la interacción reversible con iones de la solución de
analito, por ejemplo un enlace iónico, un intercambio iónico o una
extracción iónica. Como capa sensible a iones se pueden usar
membranas selectivas tanto para cationes como para aniones.
\newpage
La capa sensible a iones puede comprender, por
ejemplo, una membrana de intercambio iónico, una membrana portadora
neutra, una membrana portadora cargada, una membrana basada en
polímeros, una membrana sólida o una membrana de vidrio. También
pueden servir de capas selectivas de iones las membranas basadas en
la coextracción iónica reversible. Es imaginable construir la capa
selectiva de iones con capas inorgánicas modificadas por
implantación de iones (por ejemplo, una capa de SiO_{2} o de
Si_{3}N_{4} implantada con diferentes elementos químicos tales
como B, Al, Ga, In o Tl), difusión de iones (por ejemplo, difusión
de iones F^{-} a SiO_{2}) o con moléculas complejantes de iones.
Dependiendo de la solución de analito que se ha de estudiar, el
aislante de la compuerta de un sensor de efecto de campo puede
servir directamente de capa sensible a iones.
La capa sensible a iones puede presentar sobre
la superficie sitios de unión para la inmovilización de las
moléculas sonda y grupos superficiales para la interacción con los
iones de la solución de analito.
Asimismo se pueden usar películas poliméricas
delgadas con pocos grupos activos en la superficie, como, por
ejemplo, teflón, parileno y materiales que reaccionan sensiblemente
frente al denominado potencial interfacial mixto.
En otra configuración de la invención la capa
sensible a iones también puede componerse de un material que posee
un pH_{pzc} (point of zero charge, punto de carga cero) superior
al pH_{s} de la solución de analito que se usa para la
inmovilización y/o la unión. Para pH_{pzc} > pH_{s}, la
superficie de la capa sensible a iones está cargada positivamente y
permite así una inmovilización y/o hibridación rápida de las
moléculas de ADN cargadas negativamente.
Como sensor sensible a iones se puede usar tanto
un sensor sensible a cationes como uno sensible a aniones. El sensor
sensible a iones puede comprender un sensor semiconductor basado en
el efecto de campo, por ejemplo un sensor capacitivo EIS
(electrolyte-insulator-semiconductor,
electrolito-aislante-semiconductor)
o EMIS
(electrolyte-membrane-insulator-semiconductor,
electrolito
-membrana-aislante-semiconductor),
estructuras FET (field-effect transistor, transistor
de efecto de campo), tales como ISFET (ion-sensitive
field-effect transistor, transistor de efecto de
campo sensible a iones) o CHEMFET
(chemically-sensitive field-effect
transistor, transistor de efecto de campo sensibles químicamente),
transistores de película fina, FET orgánicos o un LAPS
(light-adressable potentiometric sensor, sensor
potenciométrico activado por luz).
Para un funcionamiento estable, el dispositivo
contiene preferentemente un electrodo de referencia o un elemento de
referencia, por ejemplo de Ag/AgCl. El electrodo de referencia o el
elemento de referencia puede estar integrado ventajosamente en el
sensor sensible a iones.
De forma alternativa se pueden usar principios
transductores conductométricos o impedimétricos. Estos sensores se
basan en cambios dependientes de la concentración de iones en la
conductividad o impedancia de la capa sensible a iones y no
requieren un elemento de referencia. Un sensor conductométrico o
impedimétrico sensible a iones presenta electrodos
interdigitales.
El acontecimiento de unión o de hibridación
entre las moléculas sonda y diana genera una señal eléctrica en la
disposición de medida, estando la amplitud de la señal
correlacionada con el grado de interacción entre las moléculas sonda
y diana. Como magnitud a medir servirá el cambio en la capacitancia
o en el voltaje de una estructura EIS y/o EMIS, la corriente
fotoeléctrica en el caso del LAPS o el cambio en la conductividad
del canal o en la corriente o en el voltaje de compuerta en el caso
del FET. De forma alternativa, las moléculas hibridadas pueden
registrarse mediante un cambio en la conductividad o en la
impedancia en el caso de un sensor basado en el principio
transductor conductométrico y/o impedimétrico.
El dispositivo puede comprender un sensor
sensible a cationes y uno sensible a aniones. De este modo se logra
ventajosamente aumentar la sensibilidad del dispositivo.
El dispositivo de acuerdo con la invención es
adecuado para la detección simultánea sin marcado de la hibridación
de diferentes moléculas diana, siempre que se combinen en una matriz
varios de los dispositivos antes descritos. Con el dispositivo se
puede determinar la secuencia de diferentes moléculas diana.
Las moléculas sonda usadas pueden ser moléculas
biológicas o sintéticas que poseen una afinidad específica para
poder efectuar eficazmente la unión, por ejemplo una hibridación,
con las moléculas diana. Preferentemente se consideran para ello
moléculas de ADNcs, moléculas de ARN de cadena sencilla,
oligonucleótidos y otras macromoléculas cargadas.
Las moléculas sonda se pueden inmovilizar sobre
la capa sensible a iones directamente o con la ayuda de cebadores.
La inmovilización se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante
adsorción, complejamiento de biotina/ avidina o moléculas
conectoras. Las moléculas sonda también pueden sintetizarse
directamente en la capa sensible a iones.
Como moléculas diana se pueden usar moléculas de
ADNcs, moléculas de ARN de cadena sencilla, oligonucleótidos y otras
macromoléculas cargadas que son complementarias a las moléculas
sonda correspondientes.
Para suprimir las magnitudes perturbadoras, el
dispositivo puede estar dispuesto en forma de disposición
diferencial. Las magnitudes perturbadoras son cambios en el valor de
pH y/o en la concentración de iones masivos en el analito, en la
temperatura, en el potencial del electrodo de referencia y efectos
causados por una adsorción inespecífica de macromoléculas. La
disposición diferencial presenta un segundo sensor sensible a iones
con moléculas sonda inmovilizadas que no son complementarias a las
moléculas diana que se han de detectar. La amplitud de la señal
diferencial entre ambos sensores sirve de señal de medida para el
acontecimiento de hibridación. La disposición diferencial permite
asimismo reducir las magnitudes perturbadoras en la señal del sensor
que son causadas por una adsorción inespecífica de moléculas no
complementarias.
Adicionalmente se puede usar un metal noble como
electrodo de pseudorreferencia. Como materiales para la
pseudorreferencia pueden concebirse Pt o Au.
El dispositivo de acuerdo con la invención puede
comprender una estructura de matriz formada por varios sensores
sensibles a iones, en la que sobre la capa sensible a iones de cada
sensor sensible a iones de la matriz están inmovilizadas moléculas
sonda de ADNcs con una secuencia determinada para la unión a las
moléculas diana correspondientes presentes en soluciones de analito
complejas. Puesto que la hibridación de ADN es altamente selectiva,
sólo pueden hibridar eficazmente entre sí secuencias de ADN
complementarias. De este modo se puede determinar la secuencia de
bases nucleotídicas en el fragmento de ADN diana. Una matriz de este
tipo permite detectar simultáneamente diferentes moléculas diana o
fragmentos de ADN incluso en soluciones de analito complejas.
El procedimiento para la detección de la unión
de macromoléculas cargadas prevé la detección de una redistribución
de iones en los espacios intermoleculares inducida por la unión.
Ésta sirve para detectar una hibridación entre moléculas sonda y
moléculas diana.
Para realizar la calibración, la señal de medida
se registra ventajosamente primero en una solución sin moléculas
diana y después en una solución que contiene las moléculas diana que
se han de detectar.
La magnitud del cambio provocado por la
hibridación en la señal de medida está correlacionada con el grado
de interacción entre las moléculas diana y sonda. De este modo se
genera una señal diferencial. La magnitud de la señal diferencial
resultante está directamente correlacionada con el grado de
interacción molecular. La señal medida del sensor puede ser una
capacitancia, una corriente, una corriente fotoeléctrica, un
voltaje, una conductividad o una impedancia.
El procedimiento se realiza preferentemente
sumergiendo el dispositivo en la solución de analito para la unión
entre las moléculas sonda y las moléculas diana. La solución de
analito presenta para ello una fuerza iónica cualquiera, comprendida
preferentemente en el intervalo de 5 mM a 0,5 M.
La magnitud del cambio provocado por la unión o
la hibridación en la señal de medida está correlacionada con el
grado de interacción entre las moléculas diana y sonda. Dependiendo
del tipo de sensor sensible a iones, la señal de medida obtenida
puede ser un cambio en, por ejemplo, la capacitancia, la corriente,
la corriente fotoeléctrica, el voltaje, la conductividad o la
impedancia. El acontecimiento de hibridación puede efectuarse en una
solución de analito con concentraciones iónicas bajas o altas,
comprendidas entre menos de 1 mM y más de 1 M, preferentemente en el
intervalo de 5 mM a 0,5 M.
El procedimiento puede comprender una
disposición diferencial formada por un sensor sensible a iones con
moléculas sonda inmovilizadas que son complementarias a las
moléculas diana que se han de detectar y un sensor de referencia
sensible a iones con moléculas sonda inmovilizadas que no son
complementarias a las moléculas diana que se han de detectar. El
sensor con moléculas de ADN hibridadas presenta una señal de medida
que se comporta de forma distinta a la de los sensores que no han
tenido como consecuencia un acontecimiento de hibridación. El
procedimiento se basa en el registro de la señal diferencial
provocada por la hibridación, estando la magnitud de la señal
diferencial resultante directamente correlacionada con el grado de
interacción molecular.
El procedimiento presenta ventajosamente una
mayor sensibilidad y se puede usar en soluciones de analito con una
fuerza iónica baja o alta. Asimismo resulta ventajoso que la capa
sensible a iones no tenga que presentar una monocapa compacta de
moléculas sonda (por ejemplo ADNcs) en la superficie. Por eso
funciona con capas menos compactas y/o porosas de moléculas sonda
inmovilizadas y se puede usar para la medición continua de la unión
en un análisis en tiempo real. El procedimiento se puede usar para
la detección cuantitativa y cualitativa de macromoléculas
cargadas.
A continuación se describe con más detalle la
invención mediante un ejemplo de realización y la figura
adjunta.
La fig. 1 muestra esquemáticamente un corte
transversal a través del dispositivo de acuerdo con la
invención.
La fig. 2 muestra las curvas halladas para la
relación entre las concentraciones medias de cationes y aniones en
los espacios intermoleculares antes y después de la hibridación.
El dispositivo comprende un sensor 1 sensible a
iones con una capa 2 sensible a iones sobre un sustrato (fig. 1). La
superficie está cubierta con moléculas sonda de ADNcs 3. Para
simplificar se han representado las moléculas de ADNcs como
moléculas con forma de bastón orientadas en perpendicular a la
superficie. Normalmente, las moléculas de ADNcs son moléculas muy
flexibles cuya orientación respecto a la superficie depende, entre
otras cosas, del procedimiento de inmovilización, de la longitud de
las moléculas y de la carga de la superficie. Las moléculas pueden
estar dispuestas en perpendicular, pero también pueden encontrarse
tumbadas sobre la superficie del sensor o formar un cierto ángulo
con la superficie. Después de la hibridación, los fragmentos cortos
de ADNcd se comportan más como bastones que como rollos.
Las moléculas sonda de ADNcs se disponen sobre
la superficie del sensor de tal manera que estén separadas entre sí
por una distancia intermolecular media de centro a centro a_{s}.
Los espacios 4 entre las moléculas de ADNcs individuales están
rellenos de solución de analito de manera que la superficie 5 no
cubierta de la capa 2 sensible a iones está en contacto directo con
la solución de analito.
Las distancias medias entre las cadenas de ADN
individuales se encuentran en el intervalo de 2,5 nm a 11 nm, lo que
equivale a una densidad de moléculas de aproximadamente 2,0 x
10^{13} moléculas/cm^{2} a 1,0 x 10^{12}
moléculas/cm^{2}.
En principio, el sensor 1 sensible a iones
registra el cambio en la composición del electrolito, es decir, la
concentración o actividad de iones, mediante la medición de, por
ejemplo, el potencial interfacial en la interfase entre la solución
de analito y la capa 2 sensible a iones o la conductividad de la
capa sensible a iones.
En ausencia de moléculas sonda inmovilizadas se
forma primero una doble capa electroquímica en perpendicular a la
superficie de la capa sensible a iones (no representada). Esta
situación cambia significativamente después de la inmovilización o
hibridación de macromoléculas cargadas. Puesto que las moléculas de
ADNcs y de ADNcd están cargadas negativamente en un amplio intervalo
de pH (pH 4 a pH 11), estas macromoléculas cargadas negativamente
atraerán contraiones cargados positivamente, incluidos los protones,
o repelerán los co-iones. Como resultado, la carga
del ADN es compensada o neutralizada eficazmente por contraiones
pequeños. Este proceso se denomina apantallamiento por contraiones o
efecto de condensación de contraiones.
Esto conduce a una redistribución local de los
iones en los espacios intermoleculares, es decir, a un aumento de la
concentración de cationes o a una disminución de la concentración de
aniones que difiere de la concentración de iones en el electrolito
masivo.
Para las aplicaciones de sensor resulta de gran
interés el grado del cambio provocado por una hibridación en la
concentración media de iones en los espacios intermoleculares.
La fig. 2 muestra la relación
(<n_{cd}>/<n_{cs}>) entre las concentraciones medias
de cationes y aniones en los espacios intermoleculares después
<n_{cd}> y antes <n_{cs}> de la hibridación en
función de la distancia intermolecular de centro a centro a_{s}
entre las moléculas sonda de ADNcs inmovilizadas y en soluciones
salinas 1:1 con diferentes concentraciones de iones masivos de
n_{0} = 0,005, 0,05, 0,15 (solución fisiológica) y 0,5 M. Los
cálculos se realizaron con la ayuda de un modelo electrostático del
efecto de condensación de contraiones. El ADNcs y el ADNcd forman un
retículo con cilindros infinitamente largos de carga negativa
homogénea con un radio r_{ADNcs} = 0,5 nm y r_{ADNcd} = 1
nanómetro, respectivamente. El radio del retículo es igual a R_{s}
= a_{s}/2. Los cilindros están orientados en perpendicular a la
superficie, con una distancia intermolecular de centro a centro
a_{s} de \sim2,5 nm a aproximadamente \sim10 nm, lo que
equivale a una densidad de moléculas sonda de ADNcs de
aproximadamente 2,0 x 10^{13} moléculas/cm^{2} a 1,3 x
10^{12} moléculas/cm^{2}. La proporción de cargas de ADNcs y de
ADNcd que es compensada por cationes condensados asociados asciende
a
\theta = 0,7, lo que es una buena aproximación a una solución salina 1:1.
\theta = 0,7, lo que es una buena aproximación a una solución salina 1:1.
La concentración media de iones en los espacios
intermoleculares después de la hibridación difiere tan notablemente
de la presente antes de la hibridación, que se puede detectar una
señal suficiente en el sensor incluso en soluciones con una fuerza
iónica elevada (0,5 M). Cuando la fuerza iónica es elevada, la
hibridación es más rápida y la eficacia de la hibridación es alta.
La redistribución de la concentración de iones inducida por la
hibridación de ADN se puede registrar cualitativa y
cuantitativamente. Cuando la densidad del ADNcs inmovilizado es
elevada, de aproximadamente 2 x 10^{13} moléculas/cm^{2}
(a_{s} = 2R_{s}\sim2,5 nm), y suponiendo una eficacia de
hibridación del 100%, la concentración media de iones en los
espacios intermoleculares después de la hibridación es, dependiendo
de la fuerza iónica de la solución de analito, aproximadamente 3 a 4
veces mayor (cationes) o menor (aniones) que antes de la
hibridación. Si se usa un sensor sensible a iones con una
sensibilidad teórica de Nernst de 59 mV/dec. para iones
monovalentes, el cambio en la concentración de iones inducido por la
hibridación provoca una señal en el sensor de aproximadamente 28 a
35 mV. A medida que la densidad de las moléculas de ADNcs
inmovilizadas baja, la relación <n_{cd}>/<n_{cs}>
disminuye tanto más cuanto más aumenta la fuerza iónica. Por lo
tanto, para obtener una señal de hibridación elevada a una densidad
baja del ADNcs inmovilizado es necesario usar soluciones con una
fuerza iónica baja. No obstante, en principio se puede lograr un
aumento de la amplitud de la señal de medida de aproximadamente 2
veces si los sensores sensibles a cationes y a aniones están
dispuestos en un circuito diferencial.
Unos efectos similares de redistribución de
iones se observan también cuando las moléculas de ADNcs se
encuentran tumbadas sobre la superficie de la capa sensible a iones
o forman un cierto ángulo con ella, incluso cuando estas moléculas
están inmovilizadas sobre la superficie mediante moléculas
conectoras relativamente cortas.
Por estos motivos se puede aprovechar en la
presente invención, al contrario que en el estado de la técnica, el
efecto de apantallamiento o de condensación de los contraiones para
obtener una señal útil. Además, mediante la formación de una doble
capa adicional inducida por ADN, que es paralela a la superficie del
sensor, puede crecer el grosor efectivo de la doble capa
electroquímica en perpendicular a la superficie del sensor. Esto
significa que el dispositivo de la presente invención se puede usar
incluso para la detección del acontecimiento de hibridación en
soluciones de analito con una fuerza iónica elevada.
Adicionalmente al efecto de la redistribución de
la concentración de iones en los espacios intermoleculares, la
sensibilidad a iones de la capa sensible a iones puede cambiar
debido a la variación inducida por la hibridación de ADN en los
procesos de unión de iones y/o de intercambio iónico, así como en el
número efectivo de grupos superficiales activos de la capa sensible
a iones. Si las moléculas de ADNcs inmovilizadas se encuentran, por
ejemplo, preferentemente tumbadas sobre la capa sensible a iones,
éstas pueden cubrir o apantallar los grupos superficiales o alterar
el proceso de generación de potencial para iones pequeños o también
impedir que los iones determinantes del potencial alcancen la
superficie. Como consecuencia cambia el número efectivo de grupos
superficiales disponibles para una interacción (enlace iónico,
intercambio iónico) con iones pequeños y por lo tanto también la
sensibilidad a iones de la capa sensible a iones. Por el contrario,
las moléculas de ADNcd en forma de bastones generadas durante el
acontecimiento de hibridación pueden liberar los grupos
superficiales activos para interacciones con iones, lo que de nuevo
puede conducir a una modulación adicional de la sensibilidad a iones
de la capa sensible a iones y a un cambio en la señal del sensor. De
este modo también es posible, por ejemplo, distinguir entre la
coincidencia y no coincidencia de la interacción.
Ambos mecanismos, la redistribución de los iones
en los espacios intermoleculares y el cambio en la sensibilidad a
iones de la capa selectiva de iones, pueden provocar un cambio en la
señal de medida (por ejemplo, respuesta eléctrica) del dispositivo
cuya amplitud está correlacionada con el grado de interacción entre
las moléculas diana y sonda. Al contrario que en el estado de la
técnica, el dispositivo de la presente invención presenta una mayor
sensibilidad, funciona en soluciones con una concentración de iones
tanto baja como alta, no requiere una monocapa de ADNcs compacta,
puede controlar de forma continua los acontecimientos de hibridación
y se puede usar para el análisis en tiempo real. Adicionalmente
también se puede controlar de forma continua el proceso de
inmovilización.
La amplitud de la señal de medida está
correlacionada con el grado de interacción entre las moléculas diana
y sonda. La disposición de medida registra, por ejemplo, un cambio
provocado por la hibridación en la capacitancia, la corriente, la
corriente fotoeléctrica, el voltaje, la conductividad o la
impedancia como magnitud a medir.
Naturalmente también es concebible unir y
detectar en lugar del ADN otras macromoléculas, por ejemplo ARN.
Claims (27)
1. Dispositivo para la detección de
macromoléculas, que comprende un sensor (1,2) sensible a iones con
una capa (2) sensible a iones en cuya superficie están inmovilizadas
moléculas sonda (3) que son capaces de efectuar una unión específica
con moléculas diana que se han de detectar, caracterizado
porque las moléculas sonda están dispuestas inmovilizadas sobre la
capa sensible a iones a una distancia mínima a_{s} entre sí de tal
manera que durante una unión con las moléculas diana se induzca una
redistribución de los iones en los espacios intermoleculares (4) de
las moléculas sonda.
2. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque como molécula sonda está
dispuesta inmovilizada sobre la capa sensible a iones una molécula
de al menos un tipo de ácido nucleico.
3. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque las moléculas sonda están
dispuestas inmovilizadas a una distancia de centro a centro de 2,5 a
11 nanómetros entre sí.
4. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la capa sensible a iones
comprende una membrana de intercambio iónico, una membrana portadora
neutra, una membrana portadora cargada, una membrana basada en
polímeros, una membrana basada en la coextracción iónica, una
membrana sólida y/o una membrana de vidrio.
5. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la capa sensible a iones
comprende una capa inorgánica cuya superficie está modificada por
implantación de iones, difusión de iones o moléculas complejantes de
iones.
6. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la capa sensible a iones
presenta grupos superficiales tanto para la interacción con iones de
una solución de analito como para la inmovilización de las moléculas
sonda.
7. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la capa sensible a iones es
sensible a un potencial interfacial mixto.
8. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque las moléculas sonda están
dispuestas inmovilizadas sobre la capa sensible a iones por
complejamiento de biotina/avidina.
9. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque las moléculas sonda se han
sintetizado directamente sobre la capa sensible a iones.
10. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sensor
sensible a iones es un sensor de efecto de campo capacitivo basado
en semiconductores (EIS, EMIS).
11. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sensor
sensible a iones es un sensor LAPS basado en semiconductores.
12. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sensor
sensible a iones es un transistor de efecto de campo basado en
semiconductores.
13. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado por un electrodo
de referencia o un elemento de referencia.
14. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
electrodo de referencia o el elemento de referencia está integrado
en el sensor sensible a iones.
15. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
aislante de la compuerta forma una capa sensible a iones.
16. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sensor
sensible a iones es un sensor conductométrico o impedimétrico.
17. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
dispositivo presenta un segundo sensor sensible a iones con
moléculas sonda inmovilizadas que no son complementarias a las
moléculas diana que se han de detectar.
18. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado por un sensor
sensible a cationes y uno sensible a aniones.
19. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado por un metal
noble como electrodo de pseudorreferencia.
20. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende
una electrónica de medición para el registro de la señal del
sensor.
21. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende
una disposición diferencial.
22. Dispositivo según una de las
reivindicaciones precedentes, con una matriz de dispositivos según
una de las reivindicaciones 1 a 21.
23. Procedimiento para la detección de la unión
de macromoléculas cargadas con un dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 22 precedentes.
24. Procedimiento según la reivindicación 23,
con una redistribución de los iones en los espacios intermoleculares
inducida por una unión.
25. Procedimiento según la reivindicación 23 ó
24 precedente, caracterizado porque la señal de medida se
registra primero en una solución sin moléculas diana y después en
una solución que contiene las moléculas diana que se han de
detectar.
26. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 23 a 25 precedentes, caracterizado porque
para la unión se sumerge el dispositivo en una solución de analito
con una fuerza iónica cualquiera, comprendida preferentemente en el
intervalo de 5 mM a 0,5 M.
27. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 23 a 26 precedentes, caracterizado porque la
unión entre una molécula sonda y una molécula diana provoca una
señal de medida detectable que está correlacionada con el grado de
unión.
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