ES2320899T3 - Peptidos biologicamente activos que comprenden isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina (ivtntt). - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado o purificado que consta del péptido isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina, que incluye opcionalmente hasta 4 aminoácidos situados en los extremos carboxilo y/o amino terminales.

Description

Péptidos biológicamente activos que comprenden isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina (IVTNTT).

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos cortos y el uso de los mismos. En particular, la presente invención se refiere a péptidos cortos con actividades biológicas.

Descripción de la técnica relacionada

Los péptidos se conocen en la técnica para el tratamiento de enfermedades y como composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.191.113 describe un péptido que tiene actividad inhibidora para el crecimiento de las células del músculo liso y por lo tanto es útil para prevenir y tratar afecciones patológicas asociadas con el crecimiento de las células del músculo liso tales como arteriosclerosis, reestenosis después de angioplastia, estenosis luminal después de injertar vaso sanguíneo y sarcoma de músculo liso. El documento US 6.184.208 describe otro péptido que se ha descubierto que modula los procesos fisiológicos tales como la actividad de ganancia de peso de la zona de crecimiento epitelial y crecimiento del cabello. Además, la publicación PCT Nº WO 03/006492 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/237.405 sugerían que ciertos péptidos y sus composiciones farmacéuticas son biológicamente activos y capaces de modular las respuestas inmunes.

Por lo tanto un objeto de la presente invención es proporcionar un péptido o péptidos cortos que tienen actividad biológica.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere al hexapéptido CMS017, isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina (IVTNTT), que se ha descubierto que contiene actividad biológica. Para propósitos de ensayo, se ha usado el péptido L-isoleucil-L-valil-L-treonil-L-asparaginil-L-treonil-L-treonina. Aspectos adicionales de la presente invención incluyen un péptido aislado o purificado, que consta esencialmente de, o que consta de isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina. Otro aspecto se refiere a péptidos IVTNTT (CMS017) sustancialmente puros.

Un aspecto adicional de la presente invención comprende un péptido aislado o purificado compuesto por el péptido IVTNTT (CMS017). En una realización específica, el péptido tiene actividad inmuno-reguladora y anti-viral.

Aspectos adicionales de la presente invención incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden, que constan esencialmente de, o que constan del péptido IVTNTT (CMS017). Otros aspectos de la presente invención se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden, constan esencialmente de o constan de un derivado funcional del IVTNTT (CMS017).

La invención también se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica que comprende proporcionar el péptido IVTNTT (CMS017) y mezclar dicho péptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describe un método para reducir los efectos de inmuno-supresión o enfermedad viral que comprende administrar una dosis farmacéuticamente eficaz del péptido IVTNTT (CMS017) a un ser humano. En aspectos adicionales de la presente invención, la enfermedad viral es infección por hepatitis B.

También se describe el uso del péptido IVTNTT (CMS017) en forma de una composición farmacéutica. Además, el hexapéptido puede usarse para tratar un trastorno inmunológico o enfermedad viral. En algunos aspectos particulares, se tratar una infección por hepatitis B.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición nutritiva que contiene el péptido IVTNTT (CMS017) y el uso del mismo para la fabricación de un suplemento nutritivo.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan derivados potenciados del péptido CMS017 (IVTNTT) y derivados funcionales del mismo. Los derivados potenciados del péptido IVTNTT (CMS017) comprenden una molécula de potenciación unida de forma funcional al péptido IVTNTT (CMS017) de tal modo que se mejore o aumente la eficacia terapéutica del péptido. El efecto de potenciación puede ser el de un efecto prolongado, un efecto acortado, una aparición retardada del efecto, una aparición adelantada del efecto, una intensidad aumentada del efecto, una intensidad disminuida del efecto, una reducción en los efectos secundarios, la creación de uno o más efectos, una disminución retardada del efecto, una disminución adelantada del efecto y un direccionamiento del péptido a una localización concreta dentro de un individuo. A continuación se describen ejemplos de dichas moléculas de potenciación y derivados potenciados. En algunos aspectos de la invención, las moléculas potenciadas pueden tratar o prevenir, aunque sin limitación a tratar o prevenir, infecciones virales y trastornos inmunológicos. Aspectos adicionales de la presente invención incluyen métodos para potenciar los efectos terapéuticos de un péptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y sus derivados (como se define en las reivindicaciones) que comprenden unir de forma funcional dicho péptido a una molécula que potencia el efecto terapéutico. En algunos aspectos de la invención, dicha molécula unidad de forma funcional que potencia el efecto terapéutico no es un péptido que está adyacente a un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y sus derivados en un péptido de origen natural. Aspectos adicionales de la presente invención incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden, que constan esencialmente de o que constan de derivados potenciados de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y sus derivados funcionales.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un péptido sustancialmente puro seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y sus derivados funcionales descrito anteriormente unido de forma funcional a una molécula que potencia su eficacia terapéutica, también conocida en este documento como "moléculas de potenciación". Dichas moléculas pueden prepararse y usarse de cualquiera de los modos descritos en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nº 60/435.796, titulada "Biologically active peptide conjugates" (Conjugados peptídicos biológicamente activos), y presentada el 18 de diciembre de 2002.

Las moléculas candidatas a unir de forma funcional a los péptidos y los medios para realizar dichas uniones son familiares para los especialistas en la técnica. Algunas moléculas que podrían unirse de forma funcional a un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y sus derivados funcionales incluyen, aunque sin limitación, un compuesto orgánico, un carbohidrato, un azúcar, un polisacárido, un aminoácido, un polímero aminoacídico, un péptido, un esteroide, una proteína, un dominio aislado de una proteína, un hapteno, un antígeno, una molécula lipídica, un ácido graso, un ácido biliar, una poliamina, un inhibidor de proteasa, un silicato y una combinación de cualquiera de las moléculas precedentes. La invención también se refiere a un péptido sustancialmente puro seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) descrito anteriormente y derivados funcionales del mismo unido de forma funcional a una molécula que potencia su eficacia terapéutica, donde dicha molécula unida de forma funcional no es un péptido que está adyacente al péptido descrito anteriormente en un péptido de origen natural. En otro aspecto de la invención, un péptido sustancialmente puro seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo puede tratar y/o prevenir, aunque sin limitación a tratar y/o prevenir, trastornos inmunológicos o infecciones virales, tales como infección por hepatitis B. La molécula puede unirse de forma funcional al péptido de la invención con un enlace covalente o una interacción no covalente.

En realizaciones específicas, las moléculas biológicamente eficaces, cuando se unen de forma funcional a un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo, pueden alterar la farmacocinética del péptido confiriendo propiedades al péptido como parte de una molécula unida. Algunas de las propiedades que las moléculas unidas de forma funcional pueden conferir en los péptidos incluyen, aunque sin limitación: suministro de un péptido a una localización concreta dentro del cuerpo; concentración de la actividad de un péptido en una localización deseada en el cuerpo y reducción de sus efectos en otra parte; reducción de los efectos secundarios del tratamiento con un péptido; cambio de la permeabilidad de un péptido; cambio de la biodisponibilidad o la velocidad de suministro al cuerpo de un péptido; cambio de la duración del efecto de tratamiento con un péptido; alteración de la estabilidad del péptido; alteración de la velocidad de aparición y declinación de los efectos de un péptido; dotación de una acción permisiva permitiendo que un péptido tenga un efecto.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a péptidos sustancialmente puros que comprenden, que constan esencialmente de o que constan de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo unido de forma funcional a una molécula que potencia su eficacia terapéutica, donde dicha molécula unida de forma funcional no es un péptido que está adyacente a un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y sus derivados en un péptido de origen natural. Algunas moléculas que podrían unirse de forma funcional a un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo incluyen, aunque sin limitación, un compuesto orgánico, un carbohidrato, un azúcar, un polisacárido, un aminoácido, un polímero aminoacídico, un péptido, un esteroide, una proteína, un dominio aislado de una proteína, un hapteno, un antígeno, una molécula lipídica, un ácido graso, un ácido biliar, una poliamina, un inhibidor de proteasa, un silicato y una combinación de cualquiera de las moléculas precedentes. Aspectos adicionales de la invención incluyen péptidos sustancialmente puros que comprenden, que constan esencialmente de o que constan de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo unido de forma funcional a una molécula que potencia su eficacia terapéutica que puede tratar y/o prevenir, aunque sin limitación a tratar y/o prevenir, trastornos inmunológicos o infecciones virales, tales como infecciones por hepatitis B. La molécula puede unirse de forma funcional al péptido de la invención con un enlace covalente o una interacción no covalente. Los efectos de la unión funcional entre los péptidos sustancialmente puros y la molécula que potencia su eficacia terapéutica pueden incluir, aunque sin limitación: suministro de un péptido a una localización concreta dentro del cuerpo; concentración de la actividad de un péptido en una localización deseada en el cuerpo y reducción de sus efectos en otra parte; reducción de los efectos secundarios del tratamiento con un péptido; cambio de la permeabilidad de un péptido; cambio de la biodisponibilidad o la velocidad de suministro al cuerpo de un péptido; cambio de la duración del efecto de tratamiento con un péptido; alteración de la estabilidad del péptido; alteración de la velocidad de aparición y declinación de los efectos de un péptido; dotación de una acción permisiva permitiendo que un péptido tenga un efecto.

Otro aspecto descrito en esta solicitud se refiere a péptidos híbridos que contienen el péptido que comprende un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo con una secuencia peptídica adicional unida, donde dicha secuencia adicional unida no es una secuencia encontrada adyacente al péptido descrito anteriormente en un péptido de origen natural. En realizaciones específicas, los péptidos híbridos anteriores pueden tratar y/o prevenir, aunque sin limitación a tratar y/o prevenir, trastornos inmunológicos o infecciones virales tales como infecciones por hepatitis B. En realizaciones específicas, estas secuencias peptídicas adicionales unidas, no encontradas adyacentes a un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y sus derivados en un péptido de origen natural, pueden alterar la farmacocinética de los péptidos de las realizaciones descritas anteriormente de la invención en virtud de conferir propiedades al péptido como parte de una molécula híbrida. Algunas de las propiedades que las moléculas unidas de forma funcional pueden conferir en un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo incluyen, aunque sin limitación: suministro de un péptido a una localización concreta dentro del cuerpo; concentración de la actividad de un péptido en una localización deseada en el cuerpo y reducción de sus efectos en otra parte; reducción de los efectos secundarios del tratamiento con un péptido; cambio de la permeabilidad de un péptido; cambio de la biodisponibilidad o la velocidad de suministro al cuerpo de un péptido; cambio de la duración del efecto de tratamiento con un péptido; alteración de la estabilidad del péptido; alteración de la velocidad de aparición y declinación de los efectos de un péptido; dotación de una acción permisiva permitiendo que un péptido tenga un efecto.

Otro aspecto descrito en la solicitud se refiere a un vector genético que comprende, que consta esencialmente de, o que consta de una primera secuencia de nucleótidos que codifica un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo fusionada en fase con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que potencia la eficacia terapéutica del péptido mencionado anteriormente y que no está adyacente a dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) o sus derivados funcionales del mismo en un péptido de origen natural. También se refiere a un vector genético que comprende, que consta esencialmente de, o que consta de una primera secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que consta esencialmente de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo fusionada en fase con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que potencia la eficacia terapéutica del péptido mencionado anteriormente y que no está adyacente a dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) o sus derivados funcionales del mismo en un péptido de origen natural. Adicionalmente se refiere a un vector genético que comprende, que consta esencialmente de, o que consta de una primera secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo fusionada en fase con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que potencia la eficacia terapéutica del péptido mencionado anteriormente y que no está adyacente a dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo en un péptido de origen natural. En realizaciones específicas, dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo puede tratar y/o prevenir, aunque sin limitación a tratar y/o prevenir, trastornos inmunológicos o infecciones virales, tales como infecciones por hepatitis B. Algunas de las propiedades que las moléculas unidas de forma funcional pueden conferir en dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo incluyen, aunque sin limitación: suministro de un péptido a una localización concreta dentro del cuerpo; concentración de la actividad de un péptido en una localización deseada en el cuerpo y reducción de sus efectos en otra parte; reducción de los efectos secundarios del tratamiento con un péptido; cambio de la permeabilidad de un péptido; cambio de la biodisponibilidad o la velocidad de suministro al cuerpo de un péptido; cambio de la duración del efecto de tratamiento con un péptido; alteración de la estabilidad del péptido; alteración de la velocidad de aparición y declinación de los efectos de un péptido; dotación de una acción permisiva permitiendo que un péptido tenga un efecto. Otro aspecto se refiere a microorganismos que comprenden secuencias de ácido nucleico seleccionadas entre la lista compuesta por: las secuencias de nucleótidos de los vectores descritos anteriormente; y una secuencia de nucleótidos que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo fusionada en fase con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que no está adyacente a dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo en un péptido de origen natural.

En relación con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente, los péptidos y/o péptidos híbridos expresados a partir de estas secuencias de ácido nucleico pueden tratar y/o prevenir, aunque sin limitación a tratar y/o prevenir, trastornos inmunológicos o enfermedades virales, tales como infección por hepatitis B.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo unido de forma funcional a una molécula que potencia su efecto terapéutico; y formular dicho péptido unido de forma funcional con dicha molécula con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también se refiere a dicho método donde dicho péptido puede tratar y/o prevenir, aunque sin limitación a tratar y/o prevenir, trastornos inmunológicos o enfermedades virales, tales como infección por hepatitis B. Algunos ejemplos de moléculas biológicamente eficaces que podrían unirse a dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo incluyen, aunque sin limitación, un compuesto orgánico, un carbohidrato, un azúcar, un polisacárido, un aminoácido, un polímero aminoacídico, un péptido, un esteroide, una proteína, un dominio aislado de una proteína, un hapteno, un antígeno, una molécula lipídica, un ácido graso, un ácido biliar, una poliamina, un inhibidor de proteasa, un silicato y una combinación de cualquiera de las moléculas precedentes. La solicitud también describe un método para preparar una composición farmacéutica que comprende un péptido que comprende dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo que comprende unir de forma funcional dicho péptido a una molécula que potencia dicho efecto terapéutico, donde dicha molécula no es un péptido que está adyacente a dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo en un péptido de origen natural. La molécula puede unirse de forma funcional a un péptido de la invención con un enlace covalente o una interacción no covalente. En una realización específica, las propiedades que dicha molécula unida puede conferir en dichos péptidos para potenciar sus efectos terapéuticos incluyen, aunque sin limitación: suministro de un péptido a una localización concreta dentro del cuerpo; concentración de la actividad de un péptido en una localización deseada en el cuerpo y reducción de sus efectos en otra parte; reducción de los efectos secundarios del tratamiento con un péptido; cambio de la permeabilidad de un péptido; cambio de la biodisponibilidad o la velocidad de suministro al cuerpo de un péptido; cambio de la duración del efecto de tratamiento con un péptido; alteración de la estabilidad del péptido; alteración de la velocidad de aparición y declinación de los efectos de un péptido; dotación de una acción permisiva permitiendo que un péptido tenga un efecto. También describe un método para preparar una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido sustancialmente puro que consta esencialmente de la secuencia de aminoácidos de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo unido de forma funcional a una molécula que potencia su efecto terapéutico; y formular dicho péptido unido de forma funcional con dicha molécula con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Adicionalmente se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica que comprende proporciona un péptido sustancialmente puro que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo unido de forma funcional a una molécula que potencia su efecto terapéutico; y formular dicho péptido unido de forma funcional con dicha molécula con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto adicional más descrito en esta solicitud se refiere a un método de tratamiento de un ser humano que comprende administrar una dosis farmacéuticamente eficaz de un péptido sustancialmente puro seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo a un ser humano, estando unido dicho péptido de forma funcional a una molécula que potencia su eficacia terapéutica. Algunos ejemplos de moléculas biológicamente eficaces que podrían unirse de forma funcional a dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo incluyen, aunque sin limitación, un compuesto orgánico, un carbohidrato, un azúcar, un polisacárido, un aminoácido, un polímero aminoacídico, un péptido, un esteroide, una proteína, un dominio aislado de una proteína, un hapteno, un antígeno, una molécula lipídica, un ácido graso, un ácido biliar, una poliamina, un inhibidor de proteasa, un silicato y una combinación de cualquiera de las moléculas precedentes. En algunas realizaciones, las propiedades que dicha molécula unida de forma funcional puede conferir en dichos péptidos para potenciar sus efectos terapéuticos incluyen, aunque sin limitación: suministro de un péptido a una localización concreta dentro del cuerpo; concentración de la actividad de un péptido en una localización deseada en el cuerpo y reducción de sus efectos en otra parte; reducción de los efectos secundarios del tratamiento con un péptido; cambio de la permeabilidad de un péptido; cambio de la biodisponibilidad o la velocidad de suministro al cuerpo de un péptido; cambio de la duración del efecto de tratamiento con un péptido; alteración de la estabilidad del péptido; alteración de la velocidad de aparición y declinación de los efectos de un péptido; dotación de una acción permisiva permitiendo que un péptido tenga un efecto.

En realizaciones particulares, los péptidos usados para el tratamiento de un ser humano descritos anteriormente pueden usarse para tratar y/o prevenir, aunque sin limitación a tratar y/o prevenir, trastornos inmunológicos o enfermedades virales, tales como infección por hepatitis B.

Aspectos adicionales descritos en la solicitud incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden, que constan esencialmente de, o que constan de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo unido de forma funcional a una molécula que potencia su efecto terapéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también se refiere a dicho péptido potenciado seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo donde el péptido puede tratar y/o prevenir, aunque sin limitación a tratar y/o prevenir, trastornos inmunológicos o enfermedades virales, tales como infección por hepatitis B. Algunos ejemplos de moléculas biológicamente eficaces que podrían unirse de forma funcional a dicho péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo incluyen, aunque sin limitación, un compuesto orgánico, un carbohidrato, un azúcar, un polisacárido, un aminoácido, un polímero aminoacídico, un péptido, un esteroide, una proteína, un dominio aislado de una proteína, un hapteno, un antígeno, una molécula lipídica, un ácido graso, un ácido biliar, una poliamina, un inhibidor de proteasa, un silicato y una combinación de cualquiera de las moléculas precedentes. En algunas realizaciones, las propiedades que dicha molécula unida de forma funcional puede conferir en dichos péptidos para potenciar sus efectos terapéuticos incluyen, aunque sin limitación: suministro de un péptido a una localización concreta dentro del cuerpo; concentración de la actividad de un péptido en una localización deseada en el cuerpo y reducción de sus efectos en otra parte; reducción de los efectos secundarios del tratamiento con un péptido; cambio de la permeabilidad de un péptido; cambio de la biodisponibilidad o la velocidad de suministro al cuerpo de un péptido; cambio de la duración del efecto de tratamiento con un péptido; alteración de la estabilidad del péptido; alteración de la velocidad de aparición y declinación de los efectos de un péptido; dotación de una acción permisiva permitiendo que un péptido tenga un efecto.

Breve descripción de los dibujos

Cada una de las cinco figuras demuestra reacciones químicas ejemplares para unir péptidos a moléculas esteroides.

La Figura 1 muestra una serie de reacciones químicas para unir un péptido a una molécula de estrona con un enlace covalente.

La Figura 2 muestra una segunda serie alternativa de reacciones para crear el mismo enlace que en la Figura 1.

La Figura 3 contiene una serie de reacciones químicas diseñadas para unir un péptido a una molécula de estradiol con un enlace covalente.

La Figura 4 contiene una segunda serie de reacciones químicas para crear el mismo enlace que en la Figura 3.

La Figura 5 demuestra un método para unir un péptido mediante un enlace covalente a una molécula de hidrocortisona.

Descripción detallada de la realización preferida

Se ha informado previamente de que el extracto peptídico de bazo porcino tiene efectos terapéuticos sobre infecciones humanas por hepatitis B (Jurin, M., et al. Effects of low molecular weight glycoproteins in chronic hepatitis B. Hepatogastroenterology. 1996; 43(10):882-886). Sin embargo, tanto la naturaleza molecular del(de los) ingrediente(s) activo(s) y su farmacología son desconocidos. Se informó de que el extracto original era una mezcla de glicopéptidos, y se postuló que la actividad anti-HBV estaba mediada a través de la estimulación del sistema inmune. Siendo una mezcla de composición molecular indefinida, no es posible optimizar la acción terapéutica de los componentes activos individuales en la mezcla. Además, como el extracto es de origen animal, no puede descartarse la posibilidad de transmisión de una enfermedad animal desconocida a un ser humano. Para distinguir el ingrediente activo y optimizar su acción terapéutica, con el objetivo final de sintetizar los ingredientes activos individuales químicamente, se analizó la composición molecular del extracto y se ensayó la actividad terapéutica de cada uno de los componentes. Se descubrió que muchos de los péptidos del extracto tenían actividad anti-HBV, siendo CMS017 el inhibidor de HBV más fuerte in vitro, como se informa a continuación en el Ejemplo 1. También se descubrió que CMS017 tenía propiedades inmuno-estimuladoras como se informa a continuación en el Ejemplo 2. CMS017 tiene la secuencia IVTNTT y se sintetizó usando L-aminoácidos. El descubrimiento de que CMS017 tiene propiedades anti-virales e inmuno-estimuladoras sugiere que la molécula IVTNTT, moléculas más grandes que contienen esta molécula, incluyendo péptidos más grandes y péptidos que contienen dentro de su secuencia la secuencia de este péptido, y derivados funcionales de IVTNTT, pueden ser útiles como compuestos para reforzar el sistema inmune, agentes antivirales, agentes farmacéuticos y suplementos alimenticios.

Se entiende que puede ser posible añadir aminoácidos adicionales al extremo amino o carboxilo de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo como otro método para practicar la presente invención. En dichas realizaciones, un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo mantiene una o más de las propiedades terapéuticas o funcionales descritas en este documento. Por ejemplo, en algunas reas, puede añadirse uno o dos aminoácidos a un péptido descrito sin afectar a su función biológica. En otras realizaciones, puede ser posible añadir tres o cuatro aminoácidos y aún mantener la función de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. Todo esto se conoce como variantes del mismo péptido. Además, también se describen en este documento derivados de un péptido, tales como el reemplazo conservativo de un aminoácido por otro dentro de la misma clase funcional.

Por ejemplo, en péptidos que tienen cadenas laterales no polares o hidrófobas puede ser posible sustituir un grupo lateral por otro sin reducir la actividad biológica. Como ejemplo adicional, puede insertarse un enlazador/espaciador en el péptido para formar variantes, pero las variantes aún retienen su resto activo como el péptido original usado en este estudio. Éstas también son variantes consideradas de los péptidos. Un análogo peptídico, como se usa en este documento, incluye péptidos que tienen moléculas aminoacídicas que imitan la estructura del aminoácido natural, por ejemplo un análogo con una estructura principal diferente, o sustitución de D-aminoácido. Como ejemplo adicional, aunque los aminoácidos usados para sintetizar los péptidos están en su forma isomérica óptica L, péptidos con uno o más de los aminoácidos en la secuencia sustituidos con la forma D pueden tener actividades biológicas similares. "Péptido sustancialmente puro" se refiere un péptidos que tienen una pureza de al menos el 10% p/p, más preferiblemente el 20%, incluso más preferiblemente el 40% y mucho más preferiblemente el 60% y aún más preferiblemente más del 90% de pureza. En la realización más preferida, la pureza es mayor del 99%. El péptido sustancialmente puro puede usarse para preparar formulaciones farmacéuticas y nutritivas que pueden ser mezclas complejas como se describe a continuación.

El uso de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo en formulaciones farmacéuticas puede emplearse como posible tratamiento para trastornos inmunológicos o enfermedad viral. Las formulaciones pueden tener un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo mezclado con otros constituyentes activos o inactivos, incluyendo otros péptidos, por ejemplo pueden añadirse de dos a varios (por ejemplo, 3-5) péptidos a la misma formulación con o sin otros ingredientes. Como alternativa, puede usarse un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo para preparar la formulación junto con péptidos no enumerados en este documento. Pueden administrarse en forma intravenosa, intramuscular, intracutánea, subcutánea o intradérmica. El modo de administración también puede ser inyección intraarterial que conduce directamente al órgano del problema. Otros modos de administración son transdérmica, por inhalación en forma de polvo o pulverización, y otras formas de suministro conocidas por los especialistas en la técnica. La formulación también puede tomarse por vía oral, y puede contener vehículos que pueden usarse para prevenir la digestión gástrica del péptido después de la ingesta oral o cualquier otro vehículo conocido en la técnica (un vehículo para el suministro transdérmico, tal como liposomas, por ejemplo).

Como se usa en este documento, la expresión "péptido híbrido" se usa para hacer referencia a péptidos que contienen péptidos adicionales insertados en el péptido activo biológicamente original que tiene la secuencia especificada anteriormente o sus derivados funcionales, pero que aún retienen actividad sustancialmente similar. Los péptidos adicionales incluyen péptidos líder que contienen, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos reconocida por una o más células procariotas o eucariotas como una señal para la secreción de la proteína híbrida en el exterior o la célula. La secreción puede ser una secreción directa, o indirecta a través de vesículas secretoras.

Como se usa en este documento, la terminología "que consta esencialmente de" se refiere a un péptido o polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo junto con aminoácidos adicionales en los extremos carboxilo y/o amino terminal y que mantiene la actividad de dichos péptidos proporcionados en este documento. Por tanto, como ejemplo no limitante, donde la actividad de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo es tratar y/o prevenir trastornos inmunológicos o una infección viral, un péptido o polipéptido "que consta esencialmente de" el péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo tendrá la actividad de tratar y/o prevenir la infección como se proporciona en este documento con respecto a ese péptido y no tendrá ninguna característica en y propia (es decir antes de la modificación por la unión a una o más moléculas biológicamente activas) que reduzca materialmente la capacidad del péptido o polipéptido de tratar trastornos inmunológicos y/o prevenir la infección viral o que constituya un cambio material a la características básicas y nuevas del péptido como un tratamiento para y/o preventivo del trastorno o enfermedad anterior. Por tanto, en el ejemplo anterior, un polipéptido de origen natural de longitud completa que tenga una actividad principal diferente a tratar y/o prevenir infección viral y que contenga la secuencia de aminoácidos de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo en alguna parte del mismo no constituiría un péptido o polipéptido "que consta esencialmente de" el péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo cuya secuencia está contenida en el polipéptido de origen natural de longitud completa. Asimismo, en el ejemplo anterior, un péptido o polipéptido modificado genéticamente que tiene una actividad principal diferente a tratar trastornos inmunológicos y/o prevenir la infección viral pero que incluye la secuencia de aminoácidos de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo en alguna parte del mismo no constituiría un péptido o polipéptido "que consta esencialmente de" el péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo cuya secuencia está contenida en el péptido o polipéptido modificado genéticamente.

Los especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente si un péptido o polipéptido consta esencialmente de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo según las definiciones anteriores midiendo la actividad del péptido o polipéptido usando los ensayos para tratar trastornos inmunológicos y/o prevenir la infección viral, que se proporcionan en este documento con respecto al péptido IVTNTT (CMS017).

En la realización preferida, la terminología "que consta esencialmente de" también puede hacer referencia a péptidos o polipéptidos que tienen menos de 5 restos aminoacídicos además de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. En una realización más preferida, la misma terminología se refiere a un péptido con 2 restos aminoacídicos además de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. En una realización incluso más preferida, la misma terminología se refiere a un péptido con un resto aminoacídico además de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo.

La formulación farmacéutica puede incluir cualquiera de los vehículos farmacéuticos conocidos. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptados convencionales conocidos para los especialistas en la técnica. Éstos incluyen, aunque sin limitación, solución salina fisiológica, agua, emulsiones que incluyen mezclas de aceite y agua o emulsiones de triglicéridos, y otros tipos de agentes, cargas, comprimidos recubiertos y cápsulas. El vehículo apropiado puede seleccionarse en base al modo de administración de la composición farmacéutica.

Un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo puede administrarse por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, e implante subcutáneo. El péptido también puede administrarse en cualquier forma de administración oral como comprimido, cápsula, suspensión, solución etc., en la forma habitual sin modificación o en forma de liberación lenta, o con o sin protección gastro-entérica. El péptido puede aplicarse adicionalmente en cualquier forma de aplicación tópica como pomada, crema, gel etc. con o sin un dispositivo de facilitación transdérmica. El péptido también puede interpretarse en su secuencia genética y clonarse en un sistema de expresión, en sí mismo o en combinación con otras secuencias peptídicas, para generar una molécula peptídica resultante para hacer uso de la actividad del péptido que se describe en este documento.

La dosis de cada péptido puede ser de 1 ng - 10 g por kg de peso corporal. Una dosis preferida es de 10 ng - 10 mg por kg, y más preferiblemente de 1 \mug - 1 mg por kg para un modo de administración por inyección. Sin embargo, la dosis eficaz puede ser tan baja como 1 ng por kg de peso corporal, ya que uno o más de los péptidos pueden funcionar a través de receptores que inducirán a una cascada de respuesta fisiológica normal. Como alternativa, uno o más de los péptidos puede ser justo un iniciador para una cascada completa de reacción. Para un ingesta oral, la cantidad puede ser de 1 ng - 10 g por día por kg de peso corporal, más preferiblemente de 0,1 \mug - 1 g por día por kg de peso corporal e incluso más preferiblemente de 1 \mug - 10 mg por día.

II. Terapia génica y método de tratamiento

La solicitud también describe la terapia génica basada en las secuencias peptídicas descubiertas se realiza diseñando una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido. El ácido nucleico puede sintetizarse químicamente y ligarse de forma funcional a un promotor, y clonarse en un vector de expresión. El vector de expresión después se administra en el cuerpo humano como forma de terapia génica para la expresión en la célula humana. La expresión "vectores genéticos" como se usa en este documento incluye estos vectores de expresión. Los vectores que pueden usarse para terapia génica incluyen virus adeno-asociados (Mizuno, M. et al. (1998). Jpn J Cancer Res 89, 76-80), vectores LNSX (Miller, A.D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) y lentivirus (Goldman, M.J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268).

Otros vehículos para el suministro del péptido incluyen vectores de expresión que codifican el péptido deseado que puede transferirse en un organismo que puede replicarse en el organismo hospedador al que se desea administrar el péptido sin efectos perjudiciales significativos sobre la salud del organismo hospedador. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden transferirse en un organismo que no es patogénico para el organismo hospedador al que se desea administrar el péptido. El vector de expresión produce el péptido deseado en un organismo bacteriano o fúngico que no tiene efectos perjudiciales significativos sobre la salud del organismo hospedador al que se tiene que administrar el péptido. Por ejemplo, el vector de expresión que codifica el péptido deseado puede ser un vector de expresión que produce el péptido deseado en un organismo tal como bacterias ácido lácticas, E. coli, o levaduras. En un aspecto descrito en este documento el vector de expresión produce el péptido deseado en un microbio normalmente encontrado en el intestino de mamíferos o un microbio tolerado por el tracto digestivo de mamíferos. Algunas de las especies microbianas en que puede expresarse el péptido deseado incluyen, aunque sin limitación especies de Lactobacillus, tales como L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus u otros; especies de Bifidobacterium, tales como B. adolescentis, B. animalus, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum u otros; Enterococcus faecalis o Ent. facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus subtilis o Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibacterium freudenreichii; o Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces boulardii.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido usado en la presente invención, sintetizadas químicamente o producidas por otros medios, incluyendo, aunque sin limitación, la transcripción inversa de ARNm para producir moléculas de ADNc, se incorporan en vectores de expresión para la transferencia génica en los organismos deseados por métodos de ingeniería genética familiares para los especialistas en la técnica. Los vectores de expresión pueden ser vectores ADN o vectores ARN. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden basarse en elementos genéticos plasmídicos o virales. Los vectores de expresión pueden ser vectores que se replican extra-cromosómicamente o vectores que se integran en el cromosoma.

Los vectores de expresión comprenden un promotor unido funcionalmente a un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención. El promotor puede ser un promotor regulable, tal como un promotor inducible, o un promotor constitutivo. En algunas realizaciones, el promotor puede seleccionarse para proporcionar un nivel deseado de expresión peptídica. Además, si se desea, los vectores de expresión pueden comprender otras secuencias para promover la producción, presentación y/o secreción de péptidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un péptido usado en la presente invención está unido de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico que dirige la secreción del péptido. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención puede estar unido de forma funcional a un ácido nucleico que codifica un péptido señal.

En algunas realizaciones, los vectores de expresión que están modificados para codificar el péptido de la presente invención pueden ser vectores de expresión que están adaptados para expresar el péptido de la presente invención en una especie bacteriana que compone la flora intestinal normal de mamíferos, tal como especies de Lactobacillus y Bacillus subtilis. Pueden encontrarse ejemplos de dichos vectores de expresión en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.100.388, de Casas, y Nº 5.728.571, de Bellini, respectivamente. Se apreciará que puede usarse cualquier vector de expresión que facilite la expresión de un péptido usado en la presente invención en un organismo que no es perjudicial para la salud del organismo hospedador al que tiene que administrarse el péptido.

En algunas realizaciones, los vectores de expresión que están modificados para codificar los péptidos de la presente invención pueden ser vectores de expresión que están adaptados para expresar el péptido de la presente invención en una especie de levadura que se tolera bien por el intestino de mamíferos, tal como Saccharomyces cerevisiae; o, preferiblemente, Saccharomyces boulardii, que puede colonizar el intestino humano y se usa para tratar ciertas formas de diarrea. Pueden usarse vectores de expresión de levaduras que expresan constitutivamente proteínas y péptidos heterólogos, son altamente estables, por tanto se transmiten bien a las células descendientes durante la mitosis y meiosis y pueden comprender la secuencia codificante para un péptido o péptidos señal que dirigen elevados niveles de secreción de proteína recombinante. Un ejemplo de dicho vector de levaduras se da en la Patente de Estados Unidos Nº 6.391.585, de Jang et al.

Los vectores de expresión que codifican el péptido útil en la presente invención pueden introducirse en el organismo en que se pretende que exprese los péptidos a través de técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas incluyen métodos tradicionales para transformar bacterias, levaduras, u otros microbios, a través del uso de electroporación con células bacterianas químicamente competentes o transformación con acetato de litio (para levaduras), por ejemplo, así como avances recientes en la transformación de especies bacterianas recalcitrantes a estos procedimientos. En algunas realizaciones, los vectores de expresión se introducen en bacterias ácido lácticas que se sabe que son recalcitrantes a la transformación usando el método descrito por Leer et al. (documento WO 95/35389).

Las secuencias introducidas pueden incorporarse en ADN cromosómico microbiano o pueden permanecer como elementos de ADN extracromosómicos.

Este microbio modificado genéticamente que contiene el vector de expresión después puede inocularse en el conducto alimentario, la vagina, la tráquea etc. para conseguir inmunoterapia sostenida. En algunas realizaciones, los organismos que expresan los péptidos de la presente invención se ingieren en una forma inactiva o, preferiblemente, en forma viva. En el intestino estos microorganismos producen dichos péptidos, los liberan en la luz por secreción o por lisis del microorganismo o presentan de otro modo los péptidos al hospedador, por lo cual los péptidos producen su efecto pretendido sobre el organismo hospedador. En otras realizaciones, los péptidos se presentan al hospedador en la membrana mucosa de los conductos nasales, la vagina o el intestino delgado.

Otro método de tratamiento es el uso de liposomas como un medio para suministrar el ácido nucleico específico a las células en el cuerpo humano. El ácido nucleico (tal como un vector de expresión que contiene una secuencia nucleica que codifica un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo) se suministra en un entorno que fomenta la captación celular y la incorporación cromosómica como se describe en Gao, X. y Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 y el documento US 6.207.456. Como alternativa, el propio péptido puede encapsularse en el liposoma y suministrarse directamente, usando un método descrito en el documento US 6.245.427. Todas las publicaciones científicas y patentes indicadas anteriormente se incorporan es este documento por referencia en sus totalidades.

Las secuencias de ácido nucleico útiles para la terapia génica mencionada anteriormente y el método de tratamiento incluyen secuencias que codifican estos péptidos y derivados funcionales de los mismos. Puede usarse una cualquiera de las numerosas secuencias de ácido nucleico para codificar estos péptidos y sus derivados en base al sistema de codones degenerados.

1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:134-135. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234

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9. Jiatai Li, clinical pharmacology (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 1338-1339.

III. Conjugaciones de péptidos y formulaciones con IVTNTT (CMS017) y derivados del mismo

Los péptidos biológicamente activos de la presente invención pueden conjugarse con otras moléculas biológicamente eficaces o útiles para proporcionar un efecto o uso adicional o para potenciar su eficacia terapéutica. Muchas moléculas de conjugación potenciales, sus efectos biológicos y los métodos para la conjugación de las moléculas con péptidos son conocidos en la técnica. Para otros compañeros de conjugación candidatos, los especialistas en la técnica pueden deducir las reacciones químicas para conjugar los presentes péptidos con los mismos sin experimentación excesiva. Las moléculas eficaces se describen a continuación. Se describen ejemplos específicos de cómo pueden conjugarse diversos péptidos de acuerdo con la presente invención con sus moléculas eficaces y las propiedades biológicas del producto de conjugación resultante. Se entiende que también pueden conjugarse otros péptidos de la presente invención en reacciones similares.

El péptido IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo pueden tener efectos terapéuticos distintos sobre células o tipos tisulares particulares. Un objetivo importante de conjugar moléculas con fármacos peptídicos es dirigir el péptido a una localización o compartimiento particular dentro del cuerpo de un individuo que se está tratando. De este modo, el fármaco peptídico y sus efectos pueden concentrarse en la localización de la célula o tipo tisular sobre el que tiene el efecto terapéutico pretendido. Esto puede aumentar el efecto que tendría una cantidad molar similar del péptido sin conjugar, libre. A la inversa, la dosificación de un fármaco peptídico conjugado que está dirigido a su sitio activo terapéutico puede ser significativamente inferior que la dosificación requerida para obtener el mismo efecto terapéutico a partir de la forma sin conjugar libre del fármaco.

Otro efecto beneficioso de dirigir un fármaco peptídico al sitio donde se desea más su actividad es la reducción de los efectos secundarios indeseados. Un fármaco peptídico que se administra para realizar un cambio en una célula o tipo tisular particular también puede funcionar en otras localizaciones dentro de un individuo, a veces con resultados prejudiciales. Dirigiendo el péptido a la localización deseada de actividad mediante conjugación con una molécula de dirección, puede reducirse la concentración del péptido en otra parte en el individuo y los posteriores efectos secundarios.

Los péptidos que comprenden, que constan esencialmente de, o que constan de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo pueden conjugarse con una diversidad de moléculas para dirigirlos a diferentes localizaciones en todo el cuerpo de un individuo. Puede emplearse cualquiera de las tecnologías de conjugación descritas a continuación para dirigir un péptido a una localización deseada, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los especialistas en la técnica, con cualquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, se ha demostrado el suministro selectivo de un fármaco anti-hepatitis B a células hepáticas (Fiume et al., Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3):275, 1997). En este estudio, los investigadores conjugaron arabinósido monofosfato de adenina (ara-AMP), un análogo nucleosídico fosforilado activo contra el virus de la hepatitis B, con albúmina humana lactosaminada, una macromolécula terminada en galactosilo. Los hepatocitos expresan una proteína receptora que interacciona con restos galactosilo terminales con elevada afinidad. A través de la unión a este receptor, los hepatocitos captarán selectivamente el fármaco conjugado. Después de la absorción, el fármaco conjugado se suministra a los lisosomas, donde el enlace entre los dos componentes del fármaco conjugado se escinde, liberando ara-AMP en su forma activa. En el estudio citado anteriormente, el fármaco conjugado era tan eficaz como ara-AMP libre en el tratamiento de pacientes con infecciones crónicas por hepatitis B, pero no causaba los efectos secundarios clínicos, tales como neurotoxicidad, que causa la administración de ara-AMP libre. Dicha aproximación puede usarse con cualquiera de los péptidos de la presente invención.

En un estudio relacionado con el anterior, por el mismo equipo de investigación (Di Stefano et al., Biochem. Pharmacol., 61 (4):459, 2001), se conjugó un agente quimioterapéutico anti-cáncer, 5-fluoro 2-desoxiuridina (FUdR), con poli-L-lisina lactosaminada para dirigir el compuesto al hígado y tratar la micrometástasis hepática. Las células hepáticas captan selectivamente el fármaco, que escinden el enlace entre FUdR y la molécula de direccionamiento. Una parte del FUdR libre después saldrá de las células hepáticas y se crea una concentración terapéutica localizada del agente anti-cáncer. Esta concentración es suficiente para la actividad farmacológica sobre las células metastásicas que se han infiltrado en el hígado. Como el fármaco se concentra selectivamente en el hígado, la dosificación del fármaco conjugado puede ser significativamente menor que la dosificación activa farmacológicamente más pequeña del compuesto sin conjugar, libre. Esta estrategia puede utilizarse con cualquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, la conjugación de poli-L-lisina lactosaminada con un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo podría reducir significativamente la dosificación necesaria para tratar una infección viral que implique tejidos hepáticos.

El direccionamiento de compuestos a tejidos o tipos celulares particulares dentro del cuerpo se ha conseguido para varios tejidos o tipos celulares diferentes. Por ejemplo, las células tumorales a menudo expresan niveles anormalmente elevados de receptores de hormonas peptídicas sobre sus superficies, tales como la bombesina, la hormona liberadora de la hormona luteinizante, y la somatostatina. En un estudio, el compuesto anti-cáncer paclitaxel (taxol) se ha dirigido selectivamente a células tumorales que secretan hormonas que expresan receptores de somatostatina a una elevada densidad conjugando el fármaco con octreótida, un análogo de la somatostatina. El taxol conjugado con octreótida era exactamente tan eficaz como el taxol libre pero con toxicidad reducida para las células normales (Huang et al., Chem. Biol., 7(7):453,2000). Usando las técnicas de Huang et al. para conjugar los péptidos de la presente invención con análogos de agonistas de receptores de hormonas peptídicas se crearía un tratamiento dirigido específicamente a células que expresan elevados niveles de ese receptor de hormonas peptídicas particular. Este enfoque puede adaptarse para dirigirse a células que sobre-expresan cualquiera de varios receptores de hormonas peptídicas. En otro ejemplo para dirigir un fármaco a un tipo tisular específico, se usó poli(L-ácido aspártico) como molécula vehículo para dirigir el suministro de fármaco a células del colon específicamente (Leopold et al., J. Pharmacokinet. Biopharm., 23(4):397,1995).

Más allá del direccionamiento específico de un fármaco peptídico a una célula o tipo tisular particular, la conjugación de péptidos que comprenden, que constan esencialmente de, o que constan de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo con moléculas vehículo puede proporcionar otros medios para potenciar el suministro de fármacos peptídicos, aumentando de este modo o mejorando de otro modo sus efectos terapéuticos. Puede usarse cualquiera de las tecnologías de conjugación descritas a continuación con cualquiera de los péptidos de la presente invención, como con otras tecnologías familiares para los especialistas en la técnica. La eficacia de cualquier fármaco se verá impedida si el compuesto no puede suministrarse a su diana de forma eficaz. Un fármaco debe transportarse, de forma activa o de otro modo, al sitio de su actividad sin pérdida sustancial de la actividad debida al procesamiento metabólico o a la degradación. Los fármacos peptídicos están sometidos a la actividad de las peptidasas y, como moléculas altamente cargadas, pueden ser refractarias al transporte a través de membranas celulares lipídicas y membranas celulares endoteliales, tales como la barrera hemato-encefálica. La conjugación con otras moléculas proporciona un modo para proteger los péptidos de la degradación y para potenciar la absorción de fármacos peptídicos en células o compartimientos anatómicos que normalmente excluirían los compuestos.

Permitiendo que los péptidos accedan a localizaciones dentro del cuerpo de las que normalmente se excluirían, las técnicas de conjugación pueden abrir nuevas vías de administración del fármaco. En Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3):434, 1997, cuya química se detalla en el siguiente Ejemplo 5, los investigadores conjugaron un fármaco peptídico conocido como un potente analgésico, el heptapéptido deltorfina, con una molécula orgánica que se diseñó específicamente para permitir que el péptido cruce la barrera hemato-encefálica. Esto permite que el fármaco se administre de forma intravenosa en lugar de por inyección intracerebroventricular.

La molécula vehículo en Patel et al. se diseñó para dirigirse específicamente a aquellas células endoteliales que comprenden la barrera hemato-encefálica además de permitir que el péptido cruce la barrera. Las membranas celulares endoteliales en todo el cuerpo, incluyendo la barrera hemato-encefálica, son heterogéneas con respecto a la especificidad de secuencia y concentración de las endopeptidasas unidas a la membrana que se presentan en sus superficies. El diseño de la molécula explota esta característica para posibilitar el direccionamiento de la molécula vehículo y su carga. La molécula contiene tres cadenas de ácido graso cuyos extremos libres están recubiertos con el dipéptido Arg-Pro, que interaccionará preferentemente con las endopeptidasas de la barrera hemato-encefálica. El transporte de la molécula de fármaco peptídico cargada entonces está posibilitado por las cadenas de ácido graso lipófilas. Por tanto, la molécula de triglicérido recubierta con el dipéptido permite tanto el direccionamiento como el transporte a través de la barrera hemato-encefálica.

Los métodos de conjugación también pueden potenciar la cinética de la actividad de un fármaco peptídico. Puede emplearse cualquiera de las tecnologías de conjugación descritas a continuación para potenciar la cinética de la actividad de un péptido así como otras tecnologías de conjugación familiares para los especialistas en la técnica con un péptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. Patel et al. descubrieron que la forma conjugada del péptido analgésico no solamente era capaz de entrar en el cerebro desde el torrente sanguíneo, sino que tenía una acción sostenida en comparación con el péptido libre también. El fármaco administrado por vía intravenosa tardaba más en tener efecto terapéutico, pero el efecto duraba más y disminuía más lentamente que el efecto del péptido libre inyectado por vía intracraneal. Los investigadores descubrieron que la molécula peptídica conjugada es remarcadamente estable en suero, pero no tenía efecto cuando se inyectaba por vía intracerebroventricular, lo que indica que la molécula vehículo probablemente se degrada y se retira durante su transporte desde el torrente sanguíneo al cerebro. Se sospecha que el tiempo requerido para transportar el conjugado y degradar la molécula vehículo es la causa de la cinética alterada. Independientemente de la mecánica del retardo, en una situación clínica, la estabilidad intravenosa de la molécula peptídica conjugada y la aparición y actividad prolongadas de los efectos del fármaco significarían que podría administrarse de forma menos frecuente. Un programa de dosificación menos frecuente y por tanto más conveniente potencia el valor práctico del fármaco como opción de tratamiento.

Como sería evidente para los especialistas en la técnica, las técnicas y procedimientos de Patel et al. son fácilmente adaptables al suministro de cualquier péptido que esté dentro de un intervalo de tamaño limitado, incluyendo cualquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, un péptido de la presente invención que trata y/o previene trastornos inmunológicos o infección viral, tal como IVTNTT (CMS017), podría conjugarse con la misma molécula usada por Patel et al. En el tratamiento de un individuo con una infección que afecta al cerebro, la molécula conjugada permitiría que IVTNTT (CMS017) accediera al cerebro desde el torrente sanguíneo y permitiría que IVTNTT (CMS017) ejerciera sus efectos sobre células o tejidos en el cerebro. También serían evidentes para dichas personas modificaciones para alterar el direccionamiento de la molécula vehículo. La característica de direccionamiento de la molécula vehículo es una función de la identidad de los dos aminoácidos que comprende la máscara dipeptídica en el extremo de las cadenas de ácido graso. El dipéptido Arg-Pro interacciona preferentemente con la serie de endopeptidasas unidas a membrana encontradas sobre la superficie de la membrana endotelial de la barrera hemato-encefálica. Otras células endoteliales y membranas podrían abordarse potencialmente por otras combinaciones dipeptídicas.

Los investigadores también han usado la conjugación para crear fármacos peptídicos que puedan absorberse de forma eficaz a través del tracto digestivo o por vía transdérmica. Puede usarse cualquiera de las tecnologías de conjugación para potenciar la absorción descritas a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los especialistas en la técnica, para potenciar la absorción de un péptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. Kramer et al. describen un procedimiento para el acoplamiento de fármacos peptídicos con ácidos biliares. La velocidad de absorción para la molécula conjugada después del suministro oral del compuesto está significativamente potenciada en comparación con el péptido solo (J. Biol. Chem., 269(14): 10621, 1994). Toth et al. (J. Med. Chem., 42(19): 4010, 1999) describen la conjugación de un fármaco peptídico con propiedades anti-tumorales con lipoaminoácidos (LAA) o liposacáridos (LS), para aumentar la velocidad de absorción y potenciar el suministro del péptido anti-cáncer a su sitio activo. En su estudio, se conjuga un derivado de somatostatina que muestra fuertes propiedades anti-proliferativas, pero que tiene farmacocinética alterada, con LAA o LS. El fármaco conjugado resultante tiene perfiles de absorción mejorados a través de la piel y el epitelio intestinal y resistencia aumentada a la degradación mientras sigue siendo activo contra células tumorales. Estas técnicas serían muy útiles junto con cualquiera de los péptidos de la presente invención. Aumentando la velocidad de absorción de la molécula a través del epitelio intestinal, puede suministrarse más péptido al torrente sanguíneo y ejercer su efecto sobre el individuo que se está tratando.

La conjugación también puede usarse para proporcionar liberación sostenida de un fármaco peptídico. Puede usarse cualquiera de las tecnologías de conjugación para proporcionar liberación sostenida, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los especialistas en la técnica, para proporcionar liberación sostenida de un péptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. Como se ha observado anteriormente en el trabajo de Patel et al., el suministro sostenido de un fármaco peptídico puede conjugarse con métodos de conjugación. Otro ejemplo es el trabajo de Kim et al. (Biomaterials, 23:2311, 2002), donde se conjugó el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (rhEGF) con polietilenglicol (PEG) antes de su microencapsulación en microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) biodegradables. La microencapsulación en PLGA se ha usado por varios grupos para suministrar diversos factores de crecimiento y proteínas morfogénicas (Meinel et al., J. Controlled Rel., 70:193, 2001). A través de la conjugación con PEG, el rhEGF llega a ser resistente a la formación de agregados insolubles en agua y a la adsorción a la superficie de contacto agua-fase orgánica durante la formación de micelas con PLGA en comparación con el rhEGF libre, sin conjugar. La farmacocinética de la formulación con la hormona conjugada se mejoraba, mostrando una actividad del fármaco más duradera, más constante y mayor global que con la hormona libre, que los investigadores especulan que se debe a la estabilidad física potenciada de la hormona conjugada con PEG. Podría emplearse una estrategia similar para crear formulaciones de liberación sostenida de cualquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, como se observa en el siguiente Ejemplo 1, IVTNTT (CMS017) muestra potentes efectos anti-virales. Conjugando PEG con este péptido e incorporando el fármaco conjugado en microesferas de PLGA, los efectos antivirales de IVTNTT (CMS017) pueden ser más duraderos y más estables, ya que la dosificación del fármaco, que se está liberando desde su conjugado PEG, es más uniforme y asegura un suministro más constante del fármaco peptídico al sitio de infección.

La liberación prolongada de un fármaco peptídico puede potenciar significativamente su actividad. Puede usarse cualquiera de las tecnologías de conjugación para proporcionar liberación prolongada de un péptido descritas a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los especialistas en la técnica, para proporcionar liberación prolongada de un péptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. Oldham et al. (Int. J. Oncology, 16:125, 2000) compara el agente anti-cáncer paclitaxel frente a una nueva forma del fármaco, paclitaxel conjugado con poli(L-ácido glutámico) (PG-TXL). Parece que PG-TXL tiene actividad anti-tumoral superior en comparación con paclitaxel libre, lo que sugiere que el fármaco tiene propiedades farmacocinéticas superiores o puede ser incluso un método de acción superior. Sin embargo, los investigadores descubrieron que PG-TXL ejercía sus efectos por el mismo mecanismo de acción que el fármaco libre, induciendo la detención del ciclo celular alterando la polimerización de las subunidades de microtúbulos. Las evidencias sugieren que la actividad anti-tumoral superior del fármaco conjugado surge de una liberación continua y constante del fármaco libre desde el conjugado, manteniendo su concentración terapéutica durante un periodo más largo en comparación con la administración del péptido libre. La adición de una cola poli(L-ácido glutámico) a un péptido de la invención con propiedades de defensa contra infecciones podría potenciar también esas propiedades.

La degradación enzimática de los péptidos puede, en algunos casos, reducir la eficacia de los péptidos como fármacos. Puede usarse cualquiera de las tecnologías de conjugación para reducir la degradación enzimática de un péptido descritas a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los especialistas en la técnica, para reducir la degradación enzimática de un péptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. Los investigadores han desarrollado numerosos enfoques para proteger los péptidos de proteasas secretadas de forma luminal en el intestino así como peptidasas unidas a membrana. Las últimas se encuentran sobre la superficie de todos los tejidos mucosos, que cruzarlos es a menudo la vía de entrada para fármacos peptídicos. Bemkop-Schurch et al. (J. Drug Target, 7: 55, 1999) informan de la creación de formulaciones de fármacos peptídicos que contienen inhibidores de pepsina. Se unión covalentemente un análogo de pepstatina a polímeros mucoadhesivos; este nuevo inhibidor de pepsina se incluyó en comprimidos que contienen insulina. Después de incubación en condiciones de laboratorio simulando la digestión, se metabolizó toda la insulina de los comprimidos de control, mientras que casi el 50% de la insulina de los comprimidos que contienen el inhibidor estaba protegido de la degradación. En otro estudio, el mismo grupo utilizó inhibidores de proteasa a dosificaciones que normalmente causarían efectos secundarios tóxicos para inhibir la degradación de péptidos biológicamente activos (Bernkop-Schnurch et al., Adv. Drug Del. Rev., 52:127, 2001). Este enfoque utiliza quitosana, un aminopolisacárido relacionado con la celulosa que se extrae de la quitina, un polisacárido estructural principal encontrado en crustáceos y otros organismos. Conjugando los inhibidores de proteasa con quitosana e incluyendo esta molécula conjugada en la formulación del fármaco peptídico, se observó inhibición significativa de las proteasas del tracto digestivo, aumentando la biodisponibilidad del péptido, sin los efectos secundarios que se esperarían con la administración de inhibidores de proteasa libres. En el estudio, se utilizó una diversidad de inhibidores de proteasa solos y en combinación para la conjugación con el vehículo quitosana. Un conjugado quitosana-EDTA también inhibía las proteasas endógenas, uniendo co-factores minerales requeridos por ciertas proteasas para su actividad. Como sería fácilmente evidente para los especialistas en la técnica, podría crearse una gran cantidad de combinaciones posibles entre moléculas vehículo y restos efectores para proporcionar propiedades beneficiosas a formulaciones peptídicas, cualquiera de las cuales podría adaptarse fácilmente para su uso con un péptido de la presente invención. Creando una formulación para suministro oral del péptido usando inhibidores de proteasa unidos a quitosana, podría usarse el suministro oral de un péptido de la invención en lugar de inyecciones intramusculares. Este enfoque no descarta usar la versión más absorbible, conjugada de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo (analizada en el párrafo anterior) en esta formulación, para crear un nivel incluso mayor de biodisponibilidad para este péptido y sus derivados.

Además de dirigirse a una localización por otra molécula, los propios péptidos pueden servir como la molécula que dirige. Puede usarse cualquiera de las tecnologías de conjugación para usar un péptido para dirigir una molécula a una localización deseada descritas a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los especialistas en la técnica, con un péptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. Por ejemplo, los investigadores han tomado el fármaco anti-cáncer difluorometilornitina (DFMO) y lo han conjugado con un péptido para propósitos de direccionamiento. La DFMO es un agente altamente tóxico que es eficaz para eliminar una diversidad de tipos celulares tumorales. Sin embargo, como se elimina rápidamente del cuerpo, su valor terapéutico es limitado. En este estudio, la DFMO se ha conjugado con un fragmento particular de una melanotropina y un análogo del fragmento que contiene dos sustituciones de aminoácidos que demostró que se unía preferentemente a los receptores de melanotropina en una línea celular de melanoma humano (Suli-Vargha et al., J. Pharm. Sci., 86:997, 1997). Para facilitar la liberación de DFMO desde los fragmentos peptídicos por las aminopeptidasas, el fármaco se conjugó con los extremos N-terminales de los péptidos. Los investigadores descubrieron que los fármacos conjugados eran más eficaces en la eliminación de células de melanoma que el fármaco conjugado solo.

Los efectos de los péptidos de la presente invención pueden deberse en parte a una capacidad de direccionamiento inherente en los propios péptidos. Por ejemplo, como el fragmento de melanotropina \alpha, un péptido particular de la invención puede unirse a un cierto receptor encontrado sobre la superficie de un tipo distinto de célula. Usando ese péptido como conjugante, podría dirigirse un fármaco a la localización de esas células dentro del cuerpo de un individuo que se está tratando con el fármaco.

Los péptidos como conjugados pueden servir para funciones diferentes del direccionamiento. Puede usarse cualquiera de las tecnologías de conjugación para potenciar la eficacia terapéutica de un péptido descritas a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los especialistas en la técnica, para potenciar la eficacia terapéutica de un péptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo. Fitzpatrick et al. han perfeccionado un agente anti-cáncer conjugado usando un espaciador peptídico entre las dos moléculas (Anticancer Drug Design, 10:1, 1995). El metotrexato ya se había conjugado con albúmina de suero humano (HSA) para aumentar su captación por y la actividad contra células tumorales. Una vez captado por una célula, algo del metotrexato se libera del conjugado por enzimas en el lisosoma y después puede ejercer sus efectos citotóxicos. Insertando un péptido enlazador de cuatro aminoácidos entre el metotrexato y la HSA que se digiere fácilmente por las enzimas lisosomales, se aumentaba la cantidad de metotrexato activo generada dentro de las células a partir de la molécula de conjugado. Los péptidos de la presente invención pueden estar ejerciendo sus efectos a través de interacción específica con enzimas particulares. Incorporando un péptido de la invención en una molécula conjugada como un segmento enlazador entre un fármaco y su molécula vehículo, o además de otro segmento enlazador, puede alterarse la farmacocinética. Esto puede crear un pro-fármaco que es más resistente o más susceptible a la actividad de las proteasas, que posteriormente disminuye o aumenta la velocidad de liberación de la molécula de fármaco a partir del conjugado. Como se observa en los ejemplos de agentes de quimioterapia conjugados anteriores, alterar la velocidad de suministro de una molécula de fármaco puede potenciar enormemente la eficacia de un fármaco.

Los efectos de un fármaco sobre una célula particular pueden alterarse dependiendo de otros factores tales como el estado de activación de una célula o la presencia de otras señales moleculares cerca o dentro de la célula. En algunos casos, para que un fármaco tenga un efecto, tiene que estar presente otra molécula o señal. Damjancic et al. (Exp. Clin. Endocrin., 95:315, 1990) estudiaron los efectos del péptido natriurético atrial humano (hANP) sobre pacientes con síntesis deficiente de glucocorticoides endógenos. Se dio el péptido a los pacientes durante una retirada de la terapia de glucocorticoides o durante la posterior reanudación de la terapia usando dexametasona. Los pacientes respondieron a hANP con un aumento en la diuresis y la excreción de sodio solamente cuando se daba la hormona peptídica durante el tratamiento concomitante con dexametasona. El tratamiento con hANP durante la retirada de la terapia de glucocorticoides no tenía efecto. El efecto de la administración simultánea de hormonas esteroides también puede potenciar la actividad de un péptido. En un informe de Zhu et al. (Acta Pharm. Sinica, 28:166, 1993), se potenciaba significativamente la actividad del péptido analgésico kiotorfina (KTP) por conjugación con hidrocortisona mediante un corto segmento enlazador, en comparación con la acción del péptido solo. No se observó efecto con la administración de hidrocortisona sola.

Los resultados de estos estudios ilustran que la capacidad de hormonas esteroides como moléculas conjugadas o como ingredientes en formulaciones puede permitir o potenciar la actividad de péptidos biológicamente activos. También puede modularse o activarse cualquiera de los péptidos de la presente invención por conjugación con o por co-aplicación de hormonas esteroides. Las técnicas de Zhu et al. pueden adaptarse fácilmente para la conjugación de moléculas esteroides con un péptido de la presente invención. Las Figuras 1 a 5 también proporcionan reacciones de síntesis por etapas ejemplares para unir hormonas esteroides con cualquiera de los péptidos de la presente
invención.

Los ejemplos presentados anteriormente proporcionan modos ejemplares para aumentar la utilidad y las actividades de cualquiera de los péptidos de la invención. Desarrollos adicionales en este campo ayudarán a superar las barreras para crear tratamientos clínicos pasados en péptidos eficaces. Como sería evidente para los especialistas en la técnica, las técnicas, reactivos y protocolos desarrollados para su uso en bioquímica peptídica, investigación farmacéutica y ensayo clínico son todos fácilmente aplicables para cualquiera de los péptidos de la presente invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Estudio In Vitro de CMS017

CMS017 tiene la secuencia IVTNTT y se sintetizó usando L-aminoácidos. En este experimento se examinó el efecto del tratamiento con CMS017 sobre células transfectadas con virus de la hepatitis B.

1. Materiales

CMS017 se sintetizó a petición del cliente (usando L-aminoácidos) por la American Peptide Company, Inc., USA, y se diluyó a la concentración deseada con solución salina normal.

La línea celular hepG 2 2,2.15, transfectada por el virus de la hepatitis B (HBV), se suministro por el National Center for Drug Screening (Shanghai, China) y el Department of Infectious Diseases of the First Hospital afiliado a la Beijing University.

El medio de cultivo celular (MEM) se fabricó por GIBCO Company.

Los kits ELISA para HBsAg y HBeAg se adquirieron de Shanghai Shiye Kehua Biotech. Company.

Los kits de PCR cuantitativa fluorescente para la determinación del ADN de HBV se adquirieron de Da-An gene company de Zhongshan Medical University.

2. Métodos a. Efecto inhibidor de CMS017 sobre HBsAg y HBeAg a concentración no tóxica máxima in vitro

Se recogieron células 2.2.15, cultivadas a fase logarítmica, y se resuspendieron en medio de cultivo MEM (que contenía suero de ternera al 10%, 100 mg/ml de penicilina, y 100 U/ml de estreptomicina) en forma de una suspensión celular de 2 x 10^{6}/ml. La suspensión se inoculó en una placa de cultivo celular de 24 pocillos con 1,5 ml por pocillo, y se incubó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 48 horas. La sustancia de ensayo CMS017 se diluyó y se añadió a los cultivos de 2.2.15 cultures a concentraciones finales de 0, 50, 100, 200, 400, 800 \mug/ml, con 3 muestras paralelas por concentración. Las células después se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5%. El sobrenadante se repuso en los días 3 y 6. Después se observó la citotoxicidad de CMS017 sobre los cultivos de células 2.2.15 con tinción con MTT en el día 8, y se determinó la concentración no tóxica máxima de CMS017.

La preparación e incubación de las suspensiones celulares se repitió como anteriormente con la concentración no tóxica máxima determinada de CMS017, y con controles negativos y positivos paralelos (se usó lamivudina con la misma concentración que CMS017 como control positivo). En el día 8, se determinaron los títulos de HBsAg y HBeAg en los sobrenadantes de cultivo celular por ELISA^{[1,2]}, usando las condiciones descritas por el proveedor del kit. Se calculó el porcentaje de inhibición de cada sustancia de ensayo como se muestra a continuación.

Porcentaje inhibidor (%)=(control blanco - muestra)/control blanco x 100

Porcentaje de supervivencia celular (%)=muestra (A_{595}-A_{650})/control blanco (A_{595}-A_{650}) x 100

b. Efecto inhibidor de CMS017 sobre el ADN de HBV in vitro

Se prepararon e incubaron suspensiones celulares como se ha descrito en el Método 1 anterior. En este experimento, se usó vidarabina monofosfato (Ara-AMP) como la sustancia de control positivo. Las sustancias de ensayo, CMS017 o Ara-AMP, se diluyeron y se añadieron a los cultivos celulares activados a concentraciones finales de 0, 20, 40, 80, 160, 320 \mug/ml, con 3 muestras paralelas por concentración. El medio de cultivo, con la sustancia de ensayo añadida, se intercambió en los días 3 y 6. En el día 8, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares para la determinación de las concentraciones de ADN de HBV por PCR cuantitativa fluorescente ^{[3,4]}, usando el método descrito por el proveedor del kit. Las células cultivadas se tomaron para el análisis de la citotoxicidad de cada sustancia de ensayo. Se calculó el porcentaje inhibidor del fármaco del siguiente modo:

Porcentaje inhibido (%)=(control blanco - muestra)/control blanco x 100

Porcentaje de supervivencia celular (%)=muestra (A_{595}-A_{650})/control blanco (A_{595}-A_{650}) x 100

Se definición la TC_{50} como la concentración de sustancia de ensayo a la que el porcentaje de células supervivientes en el grupo de ensayo es el 50% del porcentaje del grupo de control. La IC_{50} era la concentración de sustancia de ensayo a la que el porcentaje de reducción de la concentración de ADN de HBV es del 50% en comparación con el control. Estos se determinaron representando el porcentaje correspondiente frente a las concentraciones de sustancia de ensayo. El índice de selección (SI) se calculó como TC_{50}/IC_{50}. Cuanto mayor es el valor de SI, mayor es la actividad de inhibición de la sustancia de ensayo y menor es el efecto citotóxico.

La significancia estadística se analizó por el ensayo t, usando el software SPSS.

3. Resultados a. El efecto inhibidor de CMS017 sobre HBsAg y HBeAg

Se descubrió que la concentración no tóxica máxima de CMS017 era 400 \mug/ml. La Tabla 1 muestra el porcentaje inhibidor calculado a esta concentración no tóxica máxima.

TABLA 1 Efecto inhibidor de CMS017 sobre HBsAg y HBeAg a 400 \mug/ml

1

b. El efecto inhibidor de CMS017 sobre el ADN de HBV

La Tabla 2 muestra la TC_{50}, la IC_{50}, y el SI de las sustancias de ensayo, y la Tabla 3 muestra el porcentaje inhibidor de las mismas.

TABLA 2 Efecto inhibidor de los fármacos sobre el ADN de HBV

2

TABLA 3 Proporción inhibidora de los fármacos para el ADN de HBV sobrenadante, a la concentración de 160 \mug/ml

3

4. Conclusión

Se ha informado de que los glicopéptidos de bazo porcino tienen efectos terapéuticos sobre infección humana por hepatitis B. Sin embargo, la naturaleza molecular del(de los) ingrediente(s) activo(s) singue sin estar clara. Para identificar el ingrediente activo afectado, con el objetivo final de sintetizarlo químicamente, optimizar su administración terapéutica, y eliminar los efectos secundarios indeseados causados por otros componentes contaminantes co-existentes, se analizó el extracto de bazo porcino a un nivel molecular (usando la instalación Keck de la Yale University). Después se sintetizaron químicamente los componentes peptídicos individuales y cada uno de estos péptidos se exploró para la actividad anti-viral. Se observó que una gran cantidad de los péptidos tenían diversos niveles de actividad anti-viral in vitro. Entre estos, CMS017 es uno de los péptidos con la actividad anti-viral más fuerte in vitro.

En este estudio, CMS017 era capaz de inhibir el nivel de ADN de HBV in vitro, con significancia estadística. La concentración de inhibición al 50% (IC_{50}) era 2,3 \mug/ml, y el porcentaje inhibidor del ADN de HBV era del 90,8% a una concentración de 160 \mug/ml. Se concluye que CMS017 es un agente anti-viral in vitro, y es un candidato para el desarrollo en un fármaco terapéutico anti-viral para el tratamiento de infecciones virales tales como hepatitis B.

5. Referencias

1. Wu Qing, et al. The inhibition of hepatitis B viral gene expression by antisense oligo deoxinucleotides. Journal of Anhui University of Medical Science. 2001; 36(6): 434-437

2. Gao Yong, et al. A study of hepatitis B virus (HBV) anti-genome and its inhibitory effect on HBV replication. Zhong Hua Nei Ke Za Zhi. 2001; 40(4): 243-246.

3. Ausubel F.M, et al. Short Protocols in Molecular Biology. Science Publishing House. Beijing, 1998, the first edition (translation). P596-598

4. Tian Hua, et al. Determination of the serum HBV-DNA of the patients with hepatitis B by FQ-PCR. Journal of Shanghai Medical Laboratory. 2001; 16(6): 363-364

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Ejemplo 2

Estudio In Vivo de CMS017

El siguiente estudio animal se realizó para investigar el efecto de CMS017 sobre la transformación de linfocitos T de ratones inducida por ConA.

1. Materiales a. Animales experimentales

Ratones BALB/c, 18-22 g, macho, proporcionados por VITAL RIVER, Inc., Beijing, PR China.

b. Reactivos

CMS017: sintetizado a petición del cliente por CS Bio, USA

Suero bovino fetal, y medio de cultivo celular RPMI-1640: Gibco, USA

MTT y ConA: Sigma, USA

rhlL-2: Shanghai Huaxin Biotech Inc., China

2. Método a. Agrupamiento y Administración

Los ratones BALB/c se dividieron aleatoriamente en el grupo de dosis I de CMS017 (200 \mug/kg/día), grupo de dosis II de CMS017 (50 \mug/kg/día), grupo de IL humana recombinante (rhlL)-2 (3 x 10^{5} IU/kg/día), y grupos de solución salina (0,5 ml/día). Doce ratones por grupo.

Las sustancias de ensayo se disolvieron todas en solución salina y se inyectaron por vía intraperitoneal a (i.p.) 0,5 ml/día durante 28 días continuos, una vez al día.

b. El efecto de los péptidos sobre la inmunidad celular i. Preparación de suspensión celular esplénica ^{[1,2]}

El día después de la última administración de sustancia de ensayo, se sacrificó a los ratones por dislocación cervical. Se aisló el bazo asépticamente y se dispersó manualmente en solución de D-Hank fría usando una aguja de inyección. La suspensión celular dispersada se tamizó adicionalmente a través de un tamiz de acero inoxidable de 150 \mum de diámetro calibre 100. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante. Se resuspendió el sedimento celular en 10 volúmenes de tampón Tris-NH_{4}Cl y después se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células suspendidas se recogieron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Las células se lavaron 2-4 veces con solución de D-Hank fría resuspendiendo y recogiendo por centrifugación como se ha descrito anteriormente. Después las células lavadas se diluyeron a las densidades celulares deseadas en medio de cultivo RPMI-1640, que contenía suero bovino fetal al 10%.

ii. El efecto de los péptidos sobre la transformación de linfocitos T ^{[1,2]}

Se colocaron células esplénicas de densidad 4 x 10^{6}/ml en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, 100 \mul/pocillo, tres pocillos paralelos tanto de la muestra de ensayo como de la muestra de control por ratón. A los pocillos de ensayo se añadieron 100 \mul/pocillo de ConA a 5 \mug/ml en RPMI-1640, y se añadió 100 \mul/pocillo de RPMI-1640 sencillo a los pocillos de control. Las células se incubaron durante 68 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después las células se sedimentaron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 100 \mul/pocillo de MTT a 0,5 mg/ml en RPMI-1640 a los sedimentos celulares y las células se re-suspendieron agitando durante 2 minutos. La incubación se continuó durante 4 horas. Se desecharon los sobrenadantes después de la centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 100 \mul de HCl-2-propanol (1:1) a los sedimentos celulares y se agitaron los sedimentos durante 3 minutos. Se usó un lector ELISA con referencia a 630 nm para obtener la OD_{570} nm de cada pocillo.

2. Cálculo

Había tres pocillos de ensayo y tres pocillos de control por cada ratón. El Índice de Estimulación (SI) de cada ratón se obtuvo derivando primero la OD promedio de los tres pocillos paralelos, después dividiendo el valor promedio de los pocillos de ensayo por el de los pocillos de control.

3. Resultado

A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS017 potenciaba la transformación de linfocitos T, mostrando una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo de control de solución salina (P<0,05), como se muestra en la siguiente tabla.

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El efecto de CMS017 sobre la transformación de linfocitos T

4

5

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4. Conclusión

Se descubrió que los péptidos CMS017 eran capaces de potenciar la transformación de linfocitos T in vitro, deduciendo que CMS017 puede tener propiedades inmunoestimuladoras sobre animales.

5. Referencias

1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:134-135

2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234

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Ejemplo 3

Suministro de péptidos a través de especies bacterianas de Lactobacillus modificadas genéticamente

Lo siguiente se proporciona como un método ejemplar para suministrar péptidos de esta invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuencia de ADN que codifica un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión usando técnicas convencionales de ingeniería genética familiares para los especialistas en la técnica. El vector de expresión seleccionado contiene un promotor constitutivo funcional en Lactobacilli, un sitio de clonación múltiple para la introducción de secuencias de ADN en una orientación 5' a 3' específica así como un gen marcador de selección que confiere resistencia a un antibiótico (para ayudar en procedimientos de clonación) y puede comprender otras secuencias para ayudar en la producción y/o secreción de los péptidos, tales como secuencias peptídicas señal. Un ejemplo de dicho vector se proporciona por la Patente de Estados Unidos Nº 5.592.908, de Pavla. En resumen, esta patente analiza varios promotores conocidos que funcionan en especies de Lactobacillus, así como un método para descubrir nuevos promotores en dichas bacterias, cualquiera de los cuales puede unirse de forma funcional a un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención para expresar el péptido en Lactobacilli. Un ácido nucleico que codifica un péptido señal, tal como péptidos que comprenden de 16 a 35 aminoácidos principalmente hidrófobos que son activos en Lactobacillus lactis descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.529.908, citados anteriormente se intercala entre el promotor y el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención de modo que el ácido nucleico que codifica el péptido señal está en fase con el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención.

Además de la secuencia codificante del péptido, la secuenciad e ADN sintetizada puede comprender secuencias para ayudar en el ligamiento y clonación de dicho ADN en el vector de expresión. Por ejemplo, pueden incorporarse sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que corresponden con los encontrados en el sitio de clonación múltiple del vector en el ADN sintetizado en los extremos 5' y 3' de la secuencia, de modo que la secuencia pueda clonarse en la orientación apropiada dentro del vector. Tanto el vector como el ADN sintetizado se digieren con las enzimas de restricción particulares, después se purifican. Las reacciones de ligamiento con el vector y el ADN sintetizado están seguidas de la introducción por transformación en una cepa adecuada de E. coli. Las bacterias transformadas se siembran en placas en medios que contienen el antibiótico al que el vector confiere resistencia. Se selecciona una colonia de bacterias transformadas para procedimientos de cultivo de crecimiento y preparación de plásmidos; se confirma la presencia del ADN sintetizado en la orientación correcta.

Este vector de expresión después se introduce por transformación en una célula hospedadora bacteriana de una especie de Lactobacillus, tal como L. acidophilus. Las células transformadas se seleccionan en virtud del marcador de selección encontrado dentro de la secuencia del vector y la secreción del péptido puede verificarse realizando una transferencia de western, realizando electroforesis en gel de los péptidos presentes en el medio de cultivo u otras técnicas convencionales. Se elige una colonia transformada de bacterias y se usa para preparar cultivos a gran escala de las bacterias modificadas genéticamente. Se hace crecer un cultivo de las bacterias modificadas genéticamente que expresan el péptido deseado y al menos una parte del mismo se administra en el conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse. Si se desea, los cultivos bacterianos pueden tratarse en una diversidad de modos para producir un suplemento para el consumo entérico por el hospedador. Estos tratamientos incluyen liofilización u otros métodos para conservar las bacterias, además de combinar las bacterias con agentes portadores, tales como soluciones, disolventes, medios de dispersión, agentes de retardo, emulsiones y similares. El uso de estos agentes para preparar suplementos es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, las bacterias pueden usarse para preparar productos lácteos cultivados u otros productos alimenticios para consumo humano, de modo que el organismo que expresa el péptido colonice el intestino del organismo hospedador. Se describen varios métodos diferentes para incorporar cepas específicas de bacterias ácido lácticas en productos alimenticios tales como yogurt, kimchi, queso y mantequilla en la Patente de Estados Unidos Nº 6.036.952, de Oh. Tras el consumo de las bacterias a través de una de cualquiera de las vías, los organismos modificados pueden colonizar el intestino y permitir la presentación y/o absorción de los péptidos de esta invención mediante la capa mucosa del intestino.

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Ejemplo 4

Suministro de péptidos a través de una forma modificada genéticamente de Bacillus subtilis

Lo siguiente se proporciona como otro método ejemplar para suministrar péptidos de esta invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuencia de ADN que codifica el péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión mediante técnicas de ingeniería genética, siendo todas las técnicas conocidas en la técnica. El vector de expresión seleccionado comprende un vector lanzadera, tal como pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), capaz de propagarse tanto en E. coli como en B. subtilis y que contiene un gen de resistencia a antibióticos para seleccionar colonias de bacterias transformadas. Este vector puede contener un promotor constitutivo activo en B. subtilis, tal como un promotor derivado del gen Sac B de B. subtilis así como una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal activo en B. subtilis que dirige la exportación eficaz de proteínas heterólogas expresadas desde la célula bacteriana. Un ejemplo de dicho vector se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.268.169, de Fahnestock. En resumen, como se ha detallado anteriormente, se sintetizará el ADN que codifica un péptido de esta invención con sitios de enzimas de restricción y/u otras secuencias para facilitar la clonación del ADN a través de técnicas familiares para los especialistas en la técnica. Después de la introducción por transformación en E. coli., la siembra en placa, la selección y la propagación del plásmido para crear una reserva de plásmido, después el plásmido se introduce por transformación en B. subtilis y los transformantes se seleccionan en virtud de su resistencia a un antibiótico en el medio de siembra.

La producción de péptido y la secreción desde B. subtilis modificado genéticamente se verifica usando técnicas bien conocidas para los especialistas en la técnica, tales como radiomarcaje de péptidos para la detección auto-radiográfica después de análisis por SDS-PAGE o transferencia de Western.

Se hace crecer un cultivo de bacterias modificadas genéticamente y se administra al menos una parte del mismo al conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse.

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Ejemplo 5

Suministro de péptidos a través de especies de levaduras Saccharomyces modificadas genéticamente

Lo siguiente se proporciona como otro método ejemplar para suministrar péptidos de esta invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuencia de ADN que codifica un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión mediante técnicas de ingeniería genética, siendo todas las técnicas conocidas en la técnica. El vector de expresión seleccionado comprende un vector de expresión de proteínas de levaduras mantenido estable, que comprende un promotor de levaduras constitutivo tal como pADH1, sitios para la replicación del vector tanto en levaduras como en E. coli, un gen o genes que confieren prototrofia a un mutante de levadura auxotrófico para propósitos de selección, un sitio de clonación múltiple (MCS) y, si se desea, secuencias que codifican un péptido señal. Los vectores tales como éste están disponibles en el mercado y son bien conocidos en la técnica o pueden construirse fácilmente usando técnicas convencionales. Después de la inserción del ADN sintetizado en el vector de levaduras, la introducción por transformación en E. coli, la siembra en placa de E. coli transformada en medios selectivos, la selección de una colonia bacteriana transformada y la preparación de ADN plasmídico a partir de un cultivo de crecimiento de las bacterias a partir de dicha colonia, el vector se introduce por transformación en Saccharomyces cerevisiae mediante técnicas bien conocidas tales como transformación con acetato de litio o electroporación. La cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada para la transformación es una cepa auxotrófica mutante que requerirá un gene en el plásmido para crecer en placas de medio mínimo. Las colonias de levadura transformadas se aíslan sembrando en placa la levadura en medios de cultivo que carecen del gen proporcionado en el vector. Solamente aquellas levaduras que han recibido el vector y su gen de selección y que expresen ese producto génico serán capaces de crecer en colonias en el medio mínimo. La verificación de la secreción del péptido puede obtenerse realizando una transferencia de Western, realizando electroforesis en gel de los péptidos presentes en el medio de cultivo u otras técnicas convencionales.

Se elige una colonia transformada de levaduras y se usa para preparar cultivos a escala mayor. Se hace crecer un cultivo de la levadura modificada genéticamente que expresa el péptido deseado y se administra al menos una parte del mismo al conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse. Si se desea, los cultivos de levaduras pueden tratarse en una diversidad de modos para producir un suplemento para el consumo entérico por el hospedador. Estos tratamientos incluyen liofilización u otros métodos para conservar las levaduras, además de combinar las bacterias con agentes portadores, tales como soluciones, disolventes, medios de dispersión, agentes de retardo, emulsiones y similares. El uso de estos agentes para preparar suplementos es bien conocido en la técnica. En otra realización, la levadura transformada se usa en la creación de productos alimenticios, tales como productos lácteos fermentados como yogurt y kefir, por técnicas conocidas para los especialistas en la técnica. Como con cultivos de bacterias ácido lácticas vivas en estos productos alimenticios, la levadura transformada coloniza el intestino de forma al menos transitoria y sirve para presentar los péptidos al hospedador mediante la luz del intestino.

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Ejemplo 6

Direccionamiento de un péptido a una localización particular

Lo siguiente se proporciona como un método ejemplar para suministrar de forma selectiva un péptido de esta invención a un compartimiento, órgano, tipo celular o localización particular dentro del cuerpo. En este caso, se trata una infección dirigiendo un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo a tejidos en el riñón de un individuo. Por ejemplo, se une IVTNTT (CMS017) por enlaces covalentes mediante reacciones químicas conocidas en la técnica a lisozima de bajo peso molecular (LMW), un resto proteico disponible en el mercado que se concentra específicamente en el tejido renal. Las técnicas para conseguir la conjugación de moléculas a lisozima LMW están documentadas (Folgert et al., Br. J. Pharmcology, 136:1107, 2002). También se muestran técnicas generales para conjugar proteínas o péptidos a otro en la bibliografía del campo (Fischer et al., Bioconj. Chem., 12:825, 2001). La muestra peptídica conjugada recién creada después se purifica de los reactivos químicos usados en el proceso de unión por métodos de cromatografía tales como FPLC de intercambio catiónico y/o centrifugación en gradiente. Una vez purificado, el péptido conjugado se administra a un individuo en necesidad de terapia para nefritis viral. Para su actividad anti-viral, IVTNTT (CMS017) se dirige preferentemente al tejido renal en virtud del enlace entre el mismo y la lisozima LMW, que se concentra selectivamente en el tejido renal en virtud de la afinidad de la lisozima LMW por las células de los túbulos proximales del riñón. Este suministro preferente permite un mayor efecto anti-nefrítico en comparación con el de una cantidad molar equivalente de IVTNTT (CMS017) en sí mismo. A la inversa, puede reducir la cantidad de fármaco peptídico necesaria para conseguir un cierto nivel de actividad anti-nefrítica.

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Ejemplo 7

Potenciación del suministro de un péptido a su sitio activo

Lo siguiente se presenta como un método ejemplar para aumentar el suministro de un péptido neuroactivo al cerebro. Se sintetiza un péptido de la presente invención que ejerce sus efectos sobre receptores expresados por las neuronas del cerebro por métodos químicos conocidos por los especialistas en la técnica. Como alternativa, puede expresarse por un microorganismo modificado y recuperarse de un cultivo de dichos organismos, como se ha detallado en los ejemplos anteriores. Una vez obtenido en una forma purificada, el péptido se utiliza en una serie de reacciones químicas orgánicas para crear un resto conjugado de éster triglicérido, unido al péptido. El resto conjugado consta de un carbono central cuaternario sustituido unido al péptido de la invención a través de un enlace amida con el carbono carboxilo terminal del péptido. Los otros tres grupos unidos al carbono central cuaternario constan de enlaces éster de carbono a 16 cadenas de ácidos grasos de carbono. Las propias cadenas de ácido graso acaban en un grupo dipéptido terminal, conocido como máscara peptídica, que hace a las cadenas más hidrófilas y las dirige a la membrana celular endotelial de la barrera hemato-encefálica específicamente. El procedimiento para esta síntesis se explica detenidamente en Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3):434, 1997, y utiliza reactivos comunes y un equipo familiar para los especialistas en la técnica.

Una vez introducido en un individuo en una localización periférica, el compuesto viaja por todo el cuerpo mediante el sistema circulatorio, interaccionando con la membrana endotelial de la barrera hemato-encefálica. La degradación por etapas de la máscara dipeptídica y las cadenas lipídicas durante el transporte de la molécula a través de la capa endotelial de la barrera hemato-encefálica provoca la liberación del péptido de la invención en el compartimiento cerebral. Allí, el péptido puede interaccionar con receptores sobre la superficie de las neuronas para ejercer su efecto sobre la función cerebral. El tiempo requerido para que el fármaco alcance la barrera hemato-encefálica y se transporte al cerebro, con la degradación concomitante del resto de vehículo, altera la cinética de la actividad del fármaco, creando un efecto más estable y más duradero en comparación con la inyección intracerebroventricular del péptido libre.

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Ejemplo 8

Creación de formulaciones peptídicas que son resistentes a degradación enzimática

Lo siguiente se proporciona como un método ejemplar para crear una formulación de un péptido biológicamente activo para administración oral que sea resistente a la actividad de las proteasas y peptidasas encontradas en y a lo largo de la superficie del tracto digestivo. En este ejemplo, se utiliza un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por IVTNTT (CMS017) y derivados funcionales del mismo para preparar una formulación farmacéutica para administración oral a un paciente. Como se describe en Larionova et al. (Int. J. Pharma., 189:171, 1999), el péptido se usa en la creación de micropartículas con almidón soluble y un inhibidor de proteasa, aprotinina, que es un fuerte inhibidor de una diversidad de proteasas secretadas de forma luminal y unidas a la membrana del ribete estriado. En resumen, se disuelven el almidón soluble, el inhibidor de proteasa aprotinina y el péptido de la invención en un tampón acuoso. Las proporciones de almidón soluble, aprotinina, y péptido se determinan por métodos experimentales familiares para los especialistas en la técnica; por ejemplo Larionova et al. utilizaron ensayos de digestión simulada in vitro para determinar las proporciones y condiciones de preparación más eficaces para la proteína usada en su estudio. La solución acuosa se emulsiona en agitación mecánica en ciclohexano (proporción 1:3, v/v) que contiene Span-80 al 5%, un tensioactivo no iónico. Se añade una solución de cloruro de tereftaloílo en cloroformo a la emulsión y se continúa la agitación 30 minutos, durante lo cual las moléculas de almidón se reticulan con la aprotinina y el péptido. Las micropartículas creadas en ese proceso se lavan secuencialmente con ciclohexano, una solución de etanol al 95% con detergente Tween 85 al 2% v/v, etanol al 95% y agua. Las micropartículas se resuspenden en agua y se liofilizan. El compuesto liofilizado puede colocarse en cápsulas de gelatina para suministro oral al individuo en necesidad de tratamiento.

Una vez ingerido, el compuesto se libera según se disuelve la cápsula de gelatina. Las micropartículas se descomponen en el intestino delgado por la acción de la \alpha amilasa sobre las moléculas de almidón, conduciendo a la liberación gradual de la aprotinina y el péptido de la invención. La liberación simultánea del potente inhibidor de proteasa aprotinina al mismo tiempo y la localización del péptido disminuye la degradación enzimática del péptido y aumenta la proporción de péptido intacto disponible para la absorción a través de la membrana intestinal.

Debe entenderse que IVTNTT (CMS017) representa una realización de la presente invención y que también puede aplicarse el mismo principio de la presente invención para otros péptidos funcionalmente equivalentes como se define en las reivindicaciones.

Un ejemplo de un péptido equivalente a IVTNTT (CMS017) es un péptido ligeramente más largo, tal como uno o dos aminoácidos más largo, que retiene las mismas actividades biológicas.

Claims (16)

1. Un péptido aislado o purificado que consta del péptido isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina, que incluye opcionalmente hasta 4 aminoácidos situados en los extremos carboxilo y/o amino terminales.

2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido contiene 1 ó 2 aminoácidos adicionales.

3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido consta del péptido isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina.

4. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho péptido es L-isoleucil-L-valil-L-treonil-L-asparaginil-L-treonil-L-treonina (SEC ID Nº 1).

5. El péptido de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho péptido reduce los síntomas de una enfermedad viral.

6. El péptido de la reivindicación 5, donde dicha enfermedad viral es infección por hepatitis B.

7. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho péptido tiene propiedades inmunoestimuladoras.

8. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho péptido está en una forma sustancialmente pura.

9. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende L-isoleucil-L-valil-L-treonil-L-asparaginil-L-treonil-L-treonina.

11. Un método para preparar una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y mezclar dicho péptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 de uso en terapia.

13. El uso de un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad viral o para la fabricación de un medicamento para estimular el sistema inmune.

14. El uso de la reivindicación 13, donde dicha enfermedad viral es infección por hepatitis B.

15. El uso de un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como suplemento nutritivo.

16. Una molécula que comprende un derivado potenciado del péptido isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina, comprendiendo dicho derivado potenciado una molécula de potenciación unida de forma funcional a dicho péptido isoleucil-valil-treonil-asparaginil-treonil-treonina, potenciado dicha molécula de potenciación la eficacia terapéutica de dicho péptido.