KR20060103508A

KR20060103508A - 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌(ｉｖｔｎｔｔ)을 포함하는 생물학적으로 활성인 펩티드

Info

Publication number: KR20060103508A
Application number: KR1020067009629A
Authority: KR
Inventors: 콩 람
Original assignee: 씨엠에스 펩티드 패턴트 홀딩 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2003-11-19
Filing date: 2004-11-18
Publication date: 2006-10-02
Also published as: JP2008500272A; ATE420890T1; ES2320899T3; CN1875032A; CN100434437C; EP1689771B1; EP1689771A1; DE602004019141D1; WO2005051981A1; US20060234943A1; KR101258128B1; US7396817B2; HK1092162A1; JP4614966B2

Abstract

펩티드 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌은 약학 조성물로서 이의 용도와 함께 개시된다. 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드를 제공하는 단계 및 상기 펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법이 또한 개시된다.

Description

이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌(ＩＶＴＮＴＴ)을 포함하는 생물학적으로 활성인 펩티드{Biologically active peptides comprising isoleucyl-valyl-threonyl-asparaginyl-threonyl-threonine(IVTNTT)}

본 발명은 짧은 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생물학적 활성을 갖는 짧은 펩티드에 관한 것이다.

펩티드는 질환의 치료 및 약학 조성물로서 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 미국특허 제6,191,113호는 평활근세포의 성장에 대해 저해 활성을 가지므로, 평활근세포의 성장과 관련된 병리학적 증상, 예를 들면, 동맥경화증, 혈관성형술 후의 재협착, 혈관 이식 후의 관 협착 및 평활근 육종의 예방 및 치료에 유용한 펩티드를 개시한다. 미국특허 제6,184,208호는 상피 성장 지역의 체중증가 활성 및 모발 성장과 같은 생리학적 과정을 조절하는 것으로 밝혀진 또 다른 펩티드를 개시한다. 더욱이, PCT 공개공보 WO 03/006492 및 미국특허 출원 제10/237,405호는 특정 펩티드 및 이의 약학 조성물이 생물학적으로 활성이며, 면역반응을 조절할 수 있다고 제안하였다.

그러므로, 본 발명의 목적은 생물학적 활성을 갖는 짧은 펩티드(들)을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 하나의 양태는 생물학적 활성을 포함하는 것으로 밝혀진 헥사펩티드 CMS017, 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 (IVTNTT)에 관한 것이다. 시험 목적을 위해, 펩티드 L-이소류실-L-발릴-L-트레오닐-L-아스파라기닐-L-트레오닐-L-트레오닌을 이용하였다. 본 발명의 추가의 양태는 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 분리된 또는 정제된 펩티드를 포함한다. 또 다른 양태는 실질적으로 순수한 IVTNTT (CMS017) 펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 부가적인 양태는 본질적으로 펩티드 IVTNTT (CMS017)로 이루어진 분리된 또는 정제된 펩티드를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 펩티드는 면역조절 및 항바이러스 활성을 가진다.

본 발명의 부가적인 양태는 펩티드 IVTNTT (CMS017)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 약학 조성물을 포함한다. 본 발명의 기타 양태는 IVTNTT (CMS017)의 기능성 유도체를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 펩티드 IVTNTT (CMS017)를 제공하는 단계 및 상기 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 인간에게 약학적 유효량의 펩티드 IVTNTT (CMS017)를 투여하는 단계를 포함하는 면역 억제 또는 바이러스 질환의 효과를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 부가적인 양태에서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염 감염이다.

본 발명의 또 다른 양태는 약학 조성물로서 펩티드 IVTNTT (CMS017)의 용도에 관한 것이다. 더욱이, 헥사펩티드는 면역 질환 또는 바이러스 질환을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, B형 간염 감염을 치료한다.

본 발명의 추가의 양태는 펩티드 IVTNTT (CMS017)를 포함하는 영양학적 조성물 및 영양보조제의 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양태에서, CMS017 펩티드 (IVTNTT)의 증진된 유도체 및 이의 기능성 유도체가 제공된다. 펩티드 IVTNTT (CMS017)의 증진된 유도체는 상기 펩티드의 치료학적 유효성을 개선 또는 증가하는 방식으로 펩티드 IVTNTT (CMS017)과 작동가능하게 연결된 증진 분자를 포함한다. 증진 효과는 연장된 효과, 단축된 효과, 효과의 지연된 개시, 효과의 촉진된 개시, 효과의 증가된 강도, 효과의 감소된 강도, 부작용의 감소, 하나 이상의 효과의 생성, 효과의 지연된 침강, 효과의 촉진된 침강 및 개인 내의 위치를 구분하기 위한 펩티드의 표적화의 것일 수 있다. 상기 증진 분자 및 증진된 유도체의 예는 하기에 기재된다. 본 발명의 특정 양태에서, 상기 증진된 분자는 바이러스 감염 및 면역 질환을 치료 또는 예방할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 부가적인 양태는 치료 효과를 증진시키는 분자에 펩티드를 작동가능하게 연결하는 것을 포함하는, IVTNTT(CMS017) 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 펩티드의 치료 효과를 증진시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 치료 효과를 증진시키는 상기 작동가능하게 연결된 분자는 천연적으로 발생하는 펩티드에서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드에 인접하는 펩티드가 아니다. 본 발명의 부가적인 양태는 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드의 증진된 유도체를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 하나의 양태는 또한 "증진 분자"로서 알려진, 이의 치료학적 유효성을 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된 개시된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 실질적으로 순수한 펩티드에 관한 것이다. 상기 분자는 발명의 명칭이 "Biolologically active peptide conjugates"이며, 2002년 12월 18일에 출원되고, 이의 개시가 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 가특허출원 제60/435,796호에 기재된 임의의 방식으로 제조되며, 이용될 수 있다. 상기 펩티드에 작동가능하게 연결되는 후보 분자 및 상기 연결을 수행하는 수단은 당업자에게 친숙하다. IVTNTT(CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 특정 분자는 유기 화합물, 탄수화물, 당, 다당류, 아미노산, 아미노산 중합체, 펩티드, 스테로이드, 단백질, 단백질의 분리된 도메인, 합텐, 항원, 지질 분자, 지방산, 담즙산, 폴리아민, 프로테아제 저해제, 규산염 및 상기 분자의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 이의 치료학적 유효성을 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된 상기 개시된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 실질적으로 순수한 펩티드에 관한 것으로서, 상기 작동가능하게 연결된 분자는 천연적으로 발생하는 펩티드에서 상기 개시된 펩티드에 인접한 펩티드가 아니다. 본 발명의 또 다른 양태에서, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 실질적으로 순수한 펩티드는 면역 질환 또는 B형 간염 감염과 같은 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 분자는 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 이용하여 본 발명의 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있다.

특정 구현예에서, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드에 작동가능하게 연결될 때, 생물학적으로 유효한 분자는 연결된 분자의 부분으로서 펩티드에 특성을 부여함으로써 상기 펩티드의 약동학을 변경할 수 있다. 상기 작동가능하게 연결된 분자가 펩티드에 부여할 수 있는 특성의 일부는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 신체 내에 위치를 구별하기 위한 펩티드의 전달; 신체에서 원하는 위치에 펩티드의 활성을 집중하고, 다른 곳에서 이의 효과를 감소시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 부작용을 감소시키는 것; 펩티드의 투과성을 변화시키는 것; 펩티드의 생체이용율 또는 신체로 전달 속도를 변화시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 효과의 길이를 변화시키는 것; 펩티드의 안정성을 변경하는 것; 펩티드의 효과의 개시 및 붕괴 속도를 변경하는 것; 펩티드가 효과를 가지도록 허용작용(permissive action)을 제공하는 것.

본 발명의 또 다른 양태는 이의 치료학적 유효성을 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 실질적으로 순수한 펩티드에 관한 것으로서, 상기 작동가능하게 연결된 분자는 천연적으로 발생하는 펩티드에서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드에 인접한 펩티드가 아니다. IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 일부 분자는 유기 화합물, 탄수화물, 당, 다당류, 아미노산, 아미노산 중합체, 펩티드, 스테로이드, 단백질, 단백질의 분리된 도메인, 합텐, 항원, 지질 분자, 지방산, 담즙산, 폴리아민, 프로테아제 저해제, 규산염 및 상기 분자의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 부가적인 양태는 면역 질환 또는 B형 간염 감염과 같은 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방할 수 있으나, 이에 제한되지 않는 이의 치료학적 유효성을 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 실질적으로 순수한 펩티드를 포함한다. 상기 분자는 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 이용하여 본 발명의 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 실질적으로 순수한 펩티드 및 이의 치료학적 유효성을 증진시키는 분자 사이의 작동가능한 연결의 효과는 하기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: 신체 내에 위치를 구별하기 위한 펩티드의 전달; 신체에서 원하는 위치에 펩티드의 활성을 집중하고, 다른 곳에서 이의 효과를 감소시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 부작용을 감소시키는 것; 펩티드의 투과성을 변화시키는 것; 펩티드의 생체이용율 또는 신체로 전달 속도를 변화시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 효과의 길이를 변화시키는 것; 펩티드의 안정성을 변경하는 것; 펩티드의 효과의 개시 및 붕괴 속도를 변경하는 것; 펩티드가 효과를 가지도록 허용작용(permissive action)을 제공하는 것.

본 발명의 또 다른 양태는 부착된 부가적인 펩티드 서열을 갖는 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 펩티드를 포함하는 하이브리드 펩티드에 관한 것으로서, 상기 부착된 부가적인 서열은 천연적으로 발생하는 펩티드에서 상기 개시된 펩티드에 인접하여 발견되는 서열이 아니다. 특정 구현예에서, 상기 하이브리드 펩티드는 면역 질환 또는 B형 간염 감염과 같은 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 천연적으로 발생하는 펩티드에서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드에 인접하여 발견되지 않는 상기 부착된 부가적인 펩티드 서열은 하이브리드 분자의 부분으로서 펩티드에 특성을 부여함으로써 본 발명의 전술한 구현예의 펩티드의 약동학을 변경할 수 있다. 작동가능하게 연결된 분자가 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드에 부여할 수 있는 특성의 일부는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 신체 내에 위치를 구별하기 위한 펩티드의 전달; 신체에서 원하는 위치에 펩티드의 활성을 집중하고, 다른 곳에서 이의 효과를 감소시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 부작용을 감소시키는 것; 펩티드의 투과성을 변화시키는 것; 펩티드의 생체이용율 또는 신체로 전달 속도를 변화시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 효과의 길이를 변화시키는 것; 펩티드의 안정성을 변경하는 것; 펩티드의 효과의 개시 및 붕괴 속도를 변경하는 것; 펩티드가 효과를 가지도록 허용작용(permissive action)을 제공하는 것.

본 발명의 또 다른 양태는 천연적으로 발생하는 펩티드에서 IVTNTT (CMS017) 또는 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드에 인접하지 않고, 전술한 펩티드의 치료학적 유효성을 증진시키는 펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열과 인 프레임(in frame)으로 융합된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 유전자 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 천연적으로 발생하는 펩티드에서 IVTNTT (CMS017) 또는 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드에 인접하지 않고, 전술한 펩티드의 치료학적 유효성을 증진시키는 펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열과 인 프레임(in frame)으로 융합된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드로 본질적으로 이루어진 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 유전자 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 천연적으로 발생하는 펩티드에서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드에 인접하지 않고, 전술한 펩티드의 치료학적 유효성을 증진시키는 펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열과 인 프레임(in frame)으로 융합된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 유전자 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 상기 펩티드는 면역 질환 또는 B형 간염 감염과 같은 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 작동가능하게 연결된 분자가 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 상기 펩티드에 부여할 수 있는 특성의 일부는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 신체 내에 위치를 구별하기 위한 펩티드의 전달; 신체에서 원하는 위치에 펩티드의 활성을 집중하고, 다른 곳에서 이의 효과를 감소시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 부작용을 감소시키는 것; 펩티드의 투과성을 변화시키는 것; 펩티드의 생체이용율 또는 신체로 전달 속도를 변화시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 효과의 길이를 변화시키는 것; 펩티드의 안정성을 변경하는 것; 펩티드의 효과의 개시 및 붕괴 속도를 변경하는 것; 펩티드가 효과를 가지도록 허용작용(permissive action)을 제공하는 것. 본 발명의 또 다른 양태는 하기로 구성된 리스트로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 미생물에 관한 것이다: 전술한 벡터의 뉴클레오티드 서열; 및 천연적으로 발생하는 펩티드에서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드에 인접하지 않는 펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열과 인 프레임(in frame)으로 융합된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.

임의의 전술한 핵산 서열과 관련하여, 상기 핵산 서열로부터 발현된 펩티드 및/또는 하이브리드 펩티드는 면역 질환 또는 B형 간염 감염과 같은 바이러스 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 추가의 양태는 이의 치료 효과를 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 제공하는 단계; 및 상기 분자와 작동가능하게 연결된 상기 펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화하는 단계를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 펩티드가 면역 질환 또는 B형 간염 감염과 같은 바이러스 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있으나, 이에 제한되지 않는 상기 방법에 관한 것이다. IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 상기 펩티드에 부착될 수 있는 생물학적으로 유효한 분자의 특정 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 유기 화합물, 탄수화물, 당, 다당류, 아미노산, 아미노산 중합체, 펩티드, 스테로이드, 단백질, 단백질의 분리된 도메인, 합텐, 항원, 지질 분자, 지방산, 담즙산, 폴리아민, 프로테아제 저해제, 규산염 및 상기 분자의 임의의 조합. 본 발명은 또한 치료 효과를 증진시키는 분자에 펩티드를 작동가능하게 연결하는 것을 포함하는 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 상기 펩티드를 포함하는 펩티드를 포함하는 약물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 분자는 천연적으로 발생하는 펩티드에서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 상기 펩티드에 인접한 펩티드가 아니다. 상기 분자는 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 이용하여 본 발명의 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 연결된 분자가 이의 치료 효과를 증진시키기 위해 상기 펩티드에 부여할 수 있는 특성은 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 신체 내에 위치를 구별하기 위한 펩티드의 전달; 신체에서 원하는 위치에 펩티드의 활성을 집중하고, 다른 곳에서 이의 효과를 감소시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 부작용을 감소시키는 것; 펩티드의 투과성을 변화시키는 것; 펩티드의 생체이용율 또는 신체로 전달 속도를 변화시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 효과의 길이를 변화시키는 것; 펩티드의 안정성을 변경하는 것; 펩티드의 효과의 개시 및 붕괴 속도를 변경하는 것; 펩티드가 효과를 가지도록 허용작용(permissive action)을 제공하는 것. 본 발명은 또한 이의 치료 효과를 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진 실질적으로 순수한 펩티드를 제공하는 단계; 및 상기 분자와 작동가능하게 연결된 상기 펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화하는 단계를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이의 치료 효과를 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드로 이루어진 실질적으로 순수한 펩티드를 제공하는 단계; 및 상기 분자와 작동가능하게 연결된 상기 펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화하는 단계를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

여전히 본 발명의 추가의 양태는 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 약학적 유효량의 실질적으로 순수한 펩티드를 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 인간의 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 이의 치료학적 유효성을 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된다. IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 상기 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 생물학적으로 유효한 분자의 특정 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 유기 화합물, 탄수화물, 당, 다당류, 아미노산, 아미노산 중합체, 펩티드, 스테로이드, 단백질, 단백질의 분리된 도메인, 합텐, 항원, 지질 분자, 지방산, 담즙산, 폴리아민, 프로테아제 저해제, 규산염 및 상기 분자의 임의의 조합. 특정 구현예에서, 상기 작동가능하게 연결된 분자가 이의 치료 효과를 증진시키기 위해 상기 펩티드에 부여할 수 있는 특성은 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 신체 내에 위치를 구별하기 위한 펩티드의 전달; 신체에서 원하는 위치에 펩티드의 활성을 집중하고, 다른 곳에서 이의 효과를 감소시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 부작용을 감소시키는 것; 펩티드의 투과성을 변화시키는 것; 펩티드의 생체이용율 또는 신체로 전달 속도를 변화시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 효과의 길이를 변화시키는 것; 펩티드의 안정성을 변경하는 것; 펩티드의 효과의 개시 및 붕괴 속도를 변경하는 것; 펩티드가 효과를 가지도록 허용작용(permissive action)을 제공하는 것.

특정 구현예에서, 전술한 인간의 치료에 이용되는 펩티드는 면역 질환 또는 B형 간염 감염과 같은 바이러스 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 추가의 양태는 이의 치료 효과를 증진시키는 분자에 작동가능하게 연결된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 약학 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 펩티드가 면역 질환 또는 B형 간염 감염과 같은 바이러스 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있으나, 이에 제한되지 않는, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 상기 증진된 펩티드에 관한 것이다. IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 상기 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 생물학적으로 유효한 분자의 특정 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 유기 화합물, 탄수화물, 당, 다당류, 아미노산, 아미노산 중합체, 펩티드, 스테로이드, 단백질, 단백질의 분리된 도메인, 합텐, 항원, 지질 분자, 지방산, 담즙산, 폴리아민, 프로테아제 저해제, 규산염 및 상기 분자의 임의의 조합. 특정 구현예에서, 상기 작동가능하게 연결된 분자가 이의 치료 효과를 증진시키기 위해 상기 펩티드에 부여할 수 있는 특성은 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 신체 내에 위치를 구별하기 위한 펩티드의 전달; 신체에서 원하는 위치에 펩티드의 활성을 집중하고, 다른 곳에서 이의 효과를 감소시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 부작용을 감소시키는 것; 펩티드의 투과성을 변화시키는 것; 펩티드의 생체이용율 또는 신체로 전달 속도를 변화시키는 것; 펩티드를 이용하여 치료의 효과의 길이를 변화시키는 것; 펩티드의 안정성을 변경하는 것; 펩티드의 효과의 개시 및 붕괴 속도를 변경하는 것; 펩티드가 효과를 가지도록 허용작용(permissive action)을 제공하는 것.

발명의 상세한 설명

돼지 비장 펩티드 추출액은 이전에 인간 B형 간염 감염에 치료 효과를 갖는 것으로 보고되었다 (Jurin, M., et al. Effects of low molecular weight glycoproteins in chronic hepatitis B. Hepatogastroenterology. 1996; 43(10): 882-886). 그러나, 활성 성분(들)의 분자 성질 및 이의 약리학 양자는 미지이다. 원래 추출액은 글리코펩티드의 혼합물로 보고되었으며, 항-HBV 활성은 면역계의 자극을 통해 매개되는 것으로 가정되었다. 밝혀지지 않은 분자 조성의 혼합물이므로, 혼합물에서 개개의 활성 성분의 치료 작용을 최적화하는 것은 가능하지 않다. 또한, 추출액은 동물 기원이므로, 알려지지 않은 동물 질환의 인간으로의 전이 가능성은 배제할 수 없다. 활성 성분을 선발하고, 이의 치료 작용을 최적화하기 위해, 개개의 활성 성분을 화학적으로 합성할 목적으로, 상기 추출액의 분자 조성을 분석하고, 각 성분의 치료 활성을 시험하였다. 상기 추출액 중의 펩티드의 많은 것은 항-HBV 활성을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 하기 실시예 1에 보고된 바와 같이, CMS017 이 시험관 내에서 가장 강한 HBV 저해제이었다. CMS017은 또한 하기 실시예 2에 보고된 바와 같이 면역 촉진 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. CMS017은 서열 IVTNTT을 가지며, L-아미노산을 이용하여 합성되었다. CMS017이 항바이러스 및 면역 촉진 특성을 가진다는 발견은 IVTNTT 분자, 더 큰 펩티드 및 이의 서열 내에 상기 펩티드의 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 상기 분자를 포함하는 더 큰 분자, 및 IVTNTT의 기능성 유도체가 면역계를 부스팅(boosting)하는 화합물, 항바이러스제, 약제 및 식품보조제로서 유용할 수 있다는 것을 제시한다.

본 발명을 수행하는 또 다른 방법으로서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 부가적인 아미노산을 첨가하는 것이 가능할 수 있다는 것을 이해한다. 상기 구현예에서, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드는 본원에 기재된 하나 이상의 치료 또는 기능적 특성을 유지한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 하나 또는 2개의 아미노산이 이의 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 개시된 펩티드에 첨가될 수 있다. 추가의 구현예에서, 또한 3개 또는 4개의 아미노산을 첨가하는 것이 가능할 수 있으며, 여전히 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 기능을 보유한다. 이는 모두 동일한 펩티드의 변이체로서 언급된다.

더욱이, 동일한 기능적 클래스 내에 하나의 아미노산의 또 다른 것으로의 보존적 치환과 같은 펩티드의 유도체는 본 발명의 또 다른 양태를 수행하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 비극성 또는 소수성 측쇄를 갖는 펩티드는 생물학적 활성을 감소시키지 않고 하나의 측면 기를 또 다른 것으로 치환하는 것이 가능할 수 있다. 추가의 예로서, 링커/스페이서가 변이체를 형성하기 위해 펩티드 내로 삽입될 수 있으나, 변이체는 여전히 본 연구에 이용된 원래의 펩티드로서 이의 활성 모이어티를 보유한다. 이는 또한 펩티드의 변이체로 고려된다. 본원에 이용된 펩티드 유사체는 천연 아미노산의 구조를 모방하는 아미노산 분자를 갖는 펩티드, 예를 들면, 상이한 골격 구조, 또는 D-아미노산 치환을 갖는 유사체를 포함한다. 추가의 예로서, 펩티드를 합성하는데 이용되는 아미노산이 이의 L 광학 이성질체 형태이지만, D-형태로 치환된 서열에서 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드는 유사한 생물학적 활성을 가질 수 있다. 청구범위에 이용된 용어 "기능성 유도체"는 펩티드의 단편, 변이체, 유사체 또는 화학 유도체를 포함할 의미이다.

"실질적으로 순수한 펩티드"는 10% 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 20% 이상, 더 더욱 바람직하게는 40% 이상, 더 더욱 바람직하게는 60% 이상, 현저하게 더욱 바람직하게는 90 이상 순수한 펩티드를 말한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 순도는 99% 이상이다. 상기 실질적으로 순수한 펩티드는 하기 기재된 복잡한 혼합물일 수 있는 약학적 및 영양학적 제형물을 제조하기 위해 이용될 수 있다.

약학적 제형물에서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 용도는 면역 질환 또는 바이러스 질환에 대한 가능한 치료로서 이용될 수 있다. 상기 제형물은 기타 펩티드를 포함하는 기타 활성 또는 불활성 성분과 혼합된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 가질 수 있으며, 예를 들면, 2개 내지 수 개(예를 들면, 3 내지 5) 펩티드가 기타 성분의 존재 또는 부재하에 동일한 제형물에 첨가될 수 있다. 대안적으로, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드는 여기에 열거되지 않은 펩티드와 함께 제형물을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 이는 정맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 진피내 형태로 투여될 수 있다. 투여 방식은 또한 문제의 기관으로 직접 안내하는 동맥 내 주사일 수 있다. 기타 투여 방식은 경피, 분말 또는 분무로서 흡입 및 당업자에게 알려진 기타 전달 형태이다. 상기 제형물은 또한 경구로 섭취될 수 있으며, 경구 흡수 후에 펩티드의 위 소화를 막기 위해 이용될 수 있는 담체 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 담체(경피 전달용 담체, 예를 들면, 리포좀)를 포함할 수 있다.

본원에 이용된, 용어 "하이브리드 펩티드"는 상기 지정된 서열을 갖는 원래의 생물학적으로 활성인 펩티드 또는 이의 기능성 유도체 내에 삽입된 부가적인 펩티드를 포함하나, 여전히 실질적으로 유사한 활성을 보유하는 펩티드를 말하기 위해 이용된다. 상기 부가적인 펩티드는 예를 들면, 외부 또는 세포 내로 하이브리드 단백질의 분비에 대한 신호로서 하나 이상의 원핵 또는 진핵 세포에 의해 인지되는 아미노산 서열을 포함하는 리더 펩티드를 포함한다. 상기 분비는 직접적인 분비 또는 분비 소낭을 통한 간접적일 수 있다.

본원에 이용된, 용어 "본질적으로 이루어진"은 카르복실 및/또는 아미노 말단에 부가적인 아미노산과 함께 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 포함하며, 본원에 제공된 상기 펩티드의 활성을 유지하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 그리하여, 비제한적인 예로서, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 활성이 면역 질환 또는 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 경우에, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드로 "본질적으로 이루어진" 펩티드 또는 폴리펩티드는 상기 펩티드에 대해 본원에 제공된 감염을 치료 및/또는 예방하는 활성을 가질 것이며, 면역 질환을 치료 및/또는 바이러스 감염을 예방하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 능력을 실질적으로 감소시키거나 또는 상기 질병 또는 질환에 대한 치료 및/또는 예방제로서 펩티드의 기본적인 및 신규 특성으로 실질적인 변화를 구성하는 자체로 및 저절로 임의의 특성을 가지지 않을 것이다 (즉, 하나 이상의 생물학적으로 활성 분자에 대한 부착에 의한 변형 전에). 그리하여, 이전의 예에서, 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 것 이외의 주요 활성을 가지며, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 어딘가에 포함하는 전장 천연적으로 발생하는 폴리펩티드는 이의 서열이 전장 천연적으로 발생하는 폴리펩티드에 포함된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드로 "본질적으로 이루어진" 펩티드 또는 폴리펩티드를 구성하지 않을 것이다. 마찬가지로, 이전의 예에서, 면역 질환을 치료 및/또는 바이러스 감염을 예방하는 것 이외의 주요 활성을 가지나, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 어딘가에 포함하는 유전자 조작된 펩티드 또는 폴리펩티드는 이의 서열이 유전자 조작된 펩티드 또는 폴리펩티드에 포함된 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드로 "본질적으로 이루어진" 펩티드 또는 폴리펩티드를 구성하지 않을 것이다.

당업자는 IVTNTT(CMS017) 펩티드에 대해 본원에 제공된, 면역 질환을 치료 및/또는 바이러스 감염을 예방하기 위한 분석법을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드의 활성을 측정함으로써, 이전 정의하에 펩티드 또는 폴리펩티드가 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드로 본질적으로 이루지는지를 용이하게 결정할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 용어 "본질적으로 이루어지는"은 또한 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 외에 5개 아미노산 잔기 미만을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 말할 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 동일한 용어는 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 외에 2개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 말한다. 더 더욱 바람직한 구현예에서, 동일한 용어는 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 외에 1개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 말한다.

상기 약학 제형물은 임의의 알려진 약학 담체를 포함할 수 있다. 적당한 담체의 예는 당업자에게 알려진 임의의 표준 약학적으로 허용된 담체를 포함한다. 상기는 생리학적 염수 용액, 물, 오일 및 물 혼합물 또는 트리글리세리드 에멀션을 포함하는 에멀션, 및 기타 유형의 물질, 충전제, 코팅된 정제 및 캡슐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적당한 담체는 약학 조성물의 투여 방식에 의존하여 선택될 수 있다.

IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 및 피하 이식을 통해 투여될 수 있다. 상기 펩티드는 또한 정제, 캡슐, 현탁액, 용액 등과 같은 경구 투여의 임의의 형태, 변형이 없는 통상적인 형태 또는 서방성 형태, 또는 위장 보호의 존재 또는 부재하에 투여될 수 있다. 상기 펩티드는 또한 경피 촉진 장치의 존재 또는 부재하에 연고, 크림, 겔 등과 같은 국부 적용의 임의의 형태로 적용될 수 있다. 상기 펩티드는 또한 이의 유전자 서열로 해석될 수 있으며, 본원에 기재된 펩티드의 활성을 이용하기 위해 생성된 펩티드 분자를 생성하기 위해 기타 펩티드 서열과 조합하여 또는 단독으로 발현 시스템으로 클로닝될 수 있다.

각각의 펩티드의 투여량은 체중 kg 당 1ng-lOg일 수 있다. 바람직한 투여량은 주사 투여 방식에 대해 kg 당 lOng-lOmg, 더욱 바람직하게는 l㎍-lmg이다. 그러나, 유효 투여량은 체중 kg 당 1ng 만큼 낮을 것인데, 이는 하나 이상의 펩티드가 일련의 단계적인 정상적인 생리학적 반응을 유도할 수용체를 통해 작용할 수 있기 때문이다. 대안적으로, 하나 이상의 펩티드는 전체 일련의 반응에 대한 개시자일 수 있다. 경구 흡수에 대해, 상기 양은 체중 kg 당 1일 1ng-lOg, 더욱 바람직하게는 체중 kg 당 1일 0.1㎍-lg, 더 더욱 바람직하게는 1일 1㎍-10mg 일 수 있다.

II. 유전자 요법 및 치료 방법

상기 펩티드 서열에 기초한 유전자 요법은 상기 펩티드 중의 하나를 코딩하는 핵산 서열을 디자인함으로써 수행된다. 상기 핵산은 화학적으로 합성되어, 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 상기 발현 벡터는 이어서 인간 세포에서 발현을 위해 유전자 요법의 형태로서 인체 내로 투여될 수 있다. 본원에 이용된 용어 "유전자 벡터"는 상기 발현 벡터를 포함한다. 유전자 요법에 이용될 수 있는 벡터는 아데노-관련 바이러스 (Mizuno, M. et al. (1998). Jpn J Cancer Res 89, 76-80), LNSX 벡터 (Miller, A. D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) 및 렌티바이러스 (Goldman, M. J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268)를 포함한다.

펩티드 전달을 위한 기타 운반체는 숙주 생물의 건강에 현저한 유해 효과 없이 펩티드를 투여하기를 원하는 숙주 생물에서 복제할 수 있는 생물체 내로 전달될 수 있는 원하는 펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 포함한다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 펩티드를 투여하기를 원하는 숙주 생물체에 병원성이 아닌 생물체 내로 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 발현 벡터는 펩티드를 투여하고자 하는 숙주 생물체의 건강에 현저한 유해 효과를 갖지 않는 박테리아 또는 진균 생물체에서 원하는 펩티드를 생산한다. 예를 들면, 원하는 펩티드를 코딩하는 상기 발현 벡터는 젖산 박테리아, 대장균, 또는 효모와 같은 생물체에서 원하는 펩티드를 생산하는 발현 벡터일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 발현 벡터는 포유동물 장에서 통상적으로 발견되는 미생물 또는 포유동물 소화관에 의해 내성을 갖는 미생물에서 원하는 펩티드를 생산한다. 원하는 펩티드를 발현할 수 있는 미생물 종의 일부는 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 예를 들면, 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 아밀로보루스(L. amylovorus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus), 락토바실러스 갈리나룸(L. gallinarum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 존소니아이(L. johnsonii), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 류테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus) 또는 기타; 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종, 예를 들면, 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis), 비피도박테리움 아니말루스(B. animalus), 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum), 비피도박테리움 브레베(B. breve), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 락티스(B. lactis), 비피도박테리움 론굼(B. longum) 또는 기타; 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 엔테로코커스 파시움(Ent. facium); 스포로락토바실러스 이눌리누스(Sporolactobacillus inulinus); 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli); 프로피오니박테리움 프루덴레이키아이(Propionibacterium freudenreichii); 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 사카로마이세스 불라디아이(Saccharomyces boulardii)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

cDNA 분자를 생성하기 위해 mRNA의 역전사를 포함하나 이에 제한되지 않는, 화학적으로 합성되거나 또는 기타 수단에 의해 생성된, 본 발명의 임의의 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 당업자에게 친숙한 유전 공학 방법에 의해 원하는 생물체 내로 유전자 전달을 위한 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 상기 발현 벡터는 DNA 벡터 또는 RNA 벡터일 수 있다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 유전자 성분에 기초할 수 있다. 상기 발현 벡터는 염색체 외에서 복제하는 벡터 또는 염색체 내로 통합되는 벡터일 수 있다.

상기 발현 벡터는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 조절성 프로모터, 예를 들면, 유도성 프로모터, 또는 구성적(constitutive) 프로모터일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 원하는 수준의 펩티드 발현을 제공하기 위해 선발될 수 있다. 또한, 원한다면, 상기 발현 벡터는 펩티드의 생성, 발현(presentation) 및/또는 분비를 촉진하기 위해 기타 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산은 펩티드의 분비를 유도하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 코딩하도록 조작된 상기 발현 벡터는 포유동물의 정상적인 장내 균총을 구성하는 박테리아 종, 예를 들면, 락토바실러스 종 및 바실러스 서브틸리스에서 본 발명의 펩티드를 발현하도록 변형된 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터의 예는 미국특허 제6,100,388호(Casas에게 허여), 및 제5,728,571호(Bellini에게 허여)에서 각각 발견될 수 있다. 상기 문헌은 전체적으로 본원에 명백히 참고로 포함된다. 펩티드를 투여하고자 하는 숙주 생물체의 건강에 유해하지 않은 생물체에서 본 발명의 펩티드의 발현을 촉진하는 임의의 발현 벡터가 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 코딩하도록 조작된 상기 발현 벡터는 포유동물 장에 의해 잘 내성을 갖는 효모 종, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae); 또는, 바람직하게는 인간 장을 집락화할 수 있으며, 설사의 특정 형태를 치료하기 위해 이용되는 사카로마이세스 불라디아이(Saccharomyces boulardii)에서 본 발명의 펩티드를 발현하도록 변형된 발현 벡터일 수 있다. 구성적으로 이종 단백질 및 펩티드를 발현하고, 매우 안정하여, 유사분열 및 감수분열 동안 손자 세포에 잘 전달되며, 재조합 단백질 분비의 높은 수준을 유도하는 신호 펩티드(들)에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있는 효모 발현 벡터가 이용될 수 있다. 상기 효모 벡터의 예는 본원에 명백히 전체적으로 참고로 포함된 미국특허 제6,391,585호(Jang 등에게 허여)에서 제공된다.

본 발명의 펩티드를 코딩하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 기술을 통해 펩티드를 발현하도록 의도된 생물체 내로 도입될 수 있다. 상기 기술은 화학적으로 적격인 박테리아 세포, 전기천공법 또는 리튬 아세테이트 형질전환(효모에 대해)의 이용뿐만 아니라, 상기 절차에 저항하는 박테리아 종의 형질전환에서 최근 진전을 통해 박테리아, 효모, 또는 기타 미생물을 형질전환하는 전통적인 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 발현 벡터는 이의 개시가 전체적으로 본원에 참고로 포함된, Leer 등(WO 95/35389)에 의해 개시된 방법을 이용하여 형질전환에 저항하는 것으로 알려진 젖산 박테리아 내로 도입된다. 상기 도입된 서열은 미생물 염색체 DNA 내로 혼입될 수 있거나 또는 염색체외 DNA 성분으로서 존재할 수 있다.

상기 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 미생물은 이어서 지속된 면역요법을 달성하기 위해 소화관, 질, 기관 등으로 접종될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 발현하는 생물체는 불활성 형태 또는, 바람직하게는 생존 형태로 섭취된다. 장에서 상기 미생물은 상기 펩티드를 생성하고, 이를 분비 또는 미생물의 용해(lysis)에 의해 루멘 내로 방출하거나, 또는 그렇지 않으면 상기 펩티드를 숙주에게 제공하여, 이로 인해 상기 펩티드는 숙주 생물체에 대해 원하는 효과를 생성한다. 기타 구현예에서, 펩티드는 코 통로, 질 또는 소장의 점막에서 숙주에게 제공된다.

또 다른 치료 방법은 인체에서 세포에게 특정 핵산을 전달하는 수단으로서 리포좀의 이용이다. 상기 핵산(예를 들면, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터)은 [Gao, X. 및 Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722] 및 미국특허 제6,207,456호에 기재된 바와 같이, 세포 흡수 및 염색체 혼입을 증가시키는 환경에서 전달된다. 대안적으로, 펩티드 자체는 미국특허 제6,245,427호에 기재된 방법을 이용하여 리포좀으로 캡슐화될 수 있으며, 직접 전달될 수 있다. 상기 나타낸 모든 과학 공개물 및 특허는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.

전술한 유전자 요법 및 치료 방법에 유용한 핵산 서열은 상기 펩티드 및 이의 기능성 유도체를 코딩하는 서열을 포함한다. 임의의 수많은 핵산 서열이 축퇴 코돈 시스템에 기초하여 상기 펩티드 및 이의 유도체를 코딩하기 위해 이용될 수 있다.

하기 참고문헌은 본원에 전체적으로 참고로 포함된다.

III. IVTNTT ( CMS017 ) 및 이의 유도체에 펩티드 접합 및 IVTNTT ( CMS017 ) 및 이의 유도체를 포함하는 제형물

본 발명의 생물학적으로 활성인 펩티드는 부가적인 효과 또는 용도를 제공하거나 또는 이의 치료학적 유효성을 증진시키기 위해 기타 생물학적으로 유효한 또는 유용한 분자에 접합될 수 있다. 많은 잠재적인 접합 분자, 이의 생물학적 효과 및 펩티드에 대한 분자의 접합 방법은 당업계에 공지되어 있다. 기타 후보 접합 파트너에 대해, 본 발명의 펩티드를 거기에 접합하는 화학 반응은 무리한 실험화 없이 당업자에 의해 추리될 수 있다. 유효한 분자는 하기에 기재된다. 본 발명에 따른 다양한 펩티드가 이의 유효한 분자에 접합될 수 있는 방법의 특정 예 및 생성된 접합 산물의 생물학적 특성이 기재된다. 본 발명의 기타 펩티드가 또한 유사한 반응으로 접합될 수 있다는 것을 이해한다.

상기 펩티드 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체는 특정 세포 또는 조직 유형에 독특한 치료 효과를 가질 수 있다. 펩티드 약물에 분자를 접합하는 하나의 중요한 목적은 치료되는 개인의 신체 내의 특정 위치 또는 구획에 펩티드의 표적화이다. 상기 방식으로, 펩티드 약물 및 이의 효과는 의도한 치료 효과를 갖는 세포 또는 조직 유형의 위치에서 집중될 수 있다. 이는 유사한 몰량의 유리의, 접합되지 않은 펩티드가 가질 수 있는 효과를 확대할 수 있다. 역으로, 이의 치료학적 활성 자리에 표적화된 접합된 펩티드 약물의 투여량은 상기 약물의 유리의, 접합되지 않은 형태로부터 동일한 치료 효과를 얻기 위해 요구되는 투여량보다 현저하게 낮을 수 있다.

이의 활성을 가장 원하는 자리로 펩티드 약물을 표적화하는 또 다른 유리한 효과는 원하지않는 부작용의 감소이다. 특정 세포 또는 조직 유형에서 변화를 생성하기 위해 투여되는 펩티드 약물은 또한 종종 유해 결과를 가지면서, 개인 내의 기타 위치에서 작용할 수 있다. 표적화 분자에 접합을 통해 활성의 원하는 위치에 상기 펩티드를 표적화함으로써, 개인에서 다른 위치에서 펩티드의 농도 및 이은 부작용이 감소될 수 있다.

IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 펩티드는 개인의 신체를 통해 상이한 위치에 표적화를 위해 다양한 분자에 접합될 수 있다. 원하는 위치에 펩티드를 표적화하기 위한 하기 기재된 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 본 발명의 임의의 펩티드에 이용될 수 있다. 예를 들면, 간 세포에 항-B형 간염 약물의 선택적인 전달이 증명되었다 (Fiume et al., Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3): 275, 1997, 전체적으로 본원에 참고로 포함됨). 본 연구에서, 연구자들은 B형 간염 바이러스에 활성인 인산화된 뉴클레오시드 유사체인 아데닌 아라비노시드 모노포스페이트(ara-AMP)를 갈락토실 말단의 거대분자인 락토사민화된 인간 알부민에 접합시켰다. 간세포는 고 친화성으로 말단 갈락토실 잔기와 상호작용하는 수용체 단백질을 발현한다. 상기 수용체에 결합을 통해, 접합된 약물은 선택적으로 간세포에 의해 흡수될 것이다. 흡수 후에, 상기 접합된 약물은 리소좀으로 전달되며, 거기에서 접합된 약물의 2가지 성분 사이의 결합이 절단되어, 이의 활성 형태로 ara-AMP를 방출한다. 상기 인용된 연구에서, 접합된 약물은 만성 B형 간염 감염을 갖는 환자를 치료할 때 유리 ara-AMP 만큼 효과적이었으나, 유리 ara-AMP의 투여가 야기하는 신경독성과 같은 임상적인 부작용을 야기하지 않았다. 상기 접근은 본 발명의 임의의 펩티드에 대해 이용될 수 있다.

동일한 연구 팀에 의한 상기와 관련된 연구에서(Di Stefano et al., Biochem. Pharmacol., 61(4): 459, 2001), 항암 화학요법제인 5-플루오로 2-데옥시우리딘(FUdR)을 락토사민화된 폴리-L-라이신에 접합시켜 간에 상기 화합물을 표적화하고, 간 미소한 전이를 치료하였다. 상기 약물은 FUdR 및 표적화 분자 사이의 결합을 절단하는 간세포에 의해 선택적으로 흡수된다. 유리 FUdR의 부분은 이어서 간세포를 빠져나가고, 항암제의 국부화된 치료학적 농도가 생성된다. 상기 농도는 간에 스며드는 전이 세포에 대한 약리학적 활성에 충분하다. 상기 약물은 간에 선택적으로 농축되기 때문에, 상기 접합된 약물의 투여량은 유리의, 비접합된 화합물의 가장 적은 약리학적으로 활성인 투여량보다 현저하게 적을 수 있다. 상기 전략은 본 발명의 임의의 펩티드에 대해 이용될 수 있다. 예를 들면, IVTNTT(CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드에 락토사민화된 폴리-L-라이신의 접합은 간 조직을 포함하는 바이러스 감염을 치료하기 위해 필요한 투여량을 현저하게 감소시킬 수 있었다.

신체 내의 특정 조직 또는 세포 유형에 화합물의 표적화는 수많은 상이한 조직 또는 세포 유형에 대해 달성되어 왔다. 예를 들면, 종양 세포는 종종 이의 표면에 비정상적으로 높은 수준의 펩티드 호르몬 수용체, 예를 들면, 봄베신, 황체화 호르몬을 방출하는 호르몬, 및 소마토스타틴을 발현한다. 하나의 연구에서, 항암 화합물 파클리탁셀(탁솔)은 소마토스타틴의 유사체인 오스트레오티드와 상기 약물을 접합시킴으로써 고밀도로 소마토스타틴 수용체를 발현하는 호르몬 분비 종양 세포에 선택적으로 표적화되었다. 상기 오스트레오티드 접합된 탁솔은 단지 유리 탁솔만큼 효과적이었으나, 정상 세포에 대해 감소된 독성을 가졌다 (Huang et al., Chem. Biol., 7(7): 453, 2000). 펩티드 호르몬 수용체 작용제의 유사체에 본 발명의 펩티드를 접합시키기 위해 Huang 등의 기술을 이용하는 것은 상기 특정 펩티드 호르몬 수용체의 높은 수준을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 치료를 생성할 수 있다. 상기 접근은 임의의 수의 펩티드 호르몬 수용체를 과발현하는 표적 세포에 적응될 수 있다. 특정 조직 유형에 약물을 표적화하는 또 다른 예에서, 폴리(L-아스파르트산)이 결장 세포에 특이적으로 약물 전달을 표적화하기 위한 담체 분자로서 이용되었다 (Leopold et al., J. Pharmacokinet. Biopharm., 23(4): 397, 1995).

특정 세포 또는 조직 유형에 펩티드 약물의 특정 표적화 외에, 담체 분자에 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 펩티드의 접합은 펩티드 약물의 전달을 증진하는 기타 방식을 제공할 수 있으므로, 이의 치료 효과를 확대시키거나 또는 그렇지 않으면 개선시킨다. 하기 기재된 임의의 접합 기술은 당업자에게 친숙한 기타 기술에서처럼, 본 발명의 임의의 펩티드에 대해 이용될 수 있다. 임의의 약물의 유효성은 화합물이 이의 표적에 효율적으로 전달될 수 없다면 방해될 것이다. 약물은 대사 프로세싱 또는 분해로 인한 활성의 실질적인 손실 없이 이의 활성 자리에 능동적으로 또는 다른 방법으로 수송되어야 한다. 펩티드 약물은 펩티다아제의 활성에 좌우되며, 매우 하전된 분자로서, 지질 세포막 및 내피 세포막, 예를 들면, 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 수송에 저항성일 수 있다. 기타 분자에 대한 접합은 분해로부터 펩티드를 보호하고, 세포 또는 상기 화합물을 정상적으로 배제할 수 있는 해부학적 구획으로 펩티드 약물의 흡수를 증진시키는 방식을 제공한다.

정상적으로 배제될 수 있는 신체 내의 위치에 펩티드 접근을 허용함으로써, 접합 기술은 약물의 투여를 위한 신규 경로를 열 수 있다. 이의 화학이 하기 실시예 5에서 상술되며, 본원에 참고로 전체적으로 포함된 [Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3): 434, 1997]에서, 연구자들은 강력한 진통제로 알려진 펩티드 약물인 헵타펩티드 델토르핀을, 펩티드를 혈액-뇌 장벽을 횡단하도록 허용기 위해 특이적으로 고안된 유기 분자에 접합시켰다. 이는 약물을 대뇌뇌실내 주사 대신에 정맥내로 투여되게 한다.

Patel 등에서 담체 분자는 펩티드를 장벽을 횡단하도록 허용하는 것 외에 혈액-뇌 장벽을 포함하는 내피 세포를 특이적으로 표적화하도록 고안되었다. 혈액 뇌 장벽을 포함하는 신체를 통한 내피 세포막은 서열 특이성 및 이의 표면상에 나타나는 막 결합된 엔도펩티다아제의 농도에 대해 불균일하다. 분자의 디자인은 담체 분자 및 이의 짐의 표적화를 가능하게 하기 위해 이의 특성을 이용한다. 상기 분자는 이의 유리 말단이 혈액 뇌 장벽의 엔도펩티다아제와 우선적으로 상호작용할 디펩티드 Arg-Pro로 캡핑된 3개의 지방산 사슬을 포함한다. 하전된 펩티드 약물 분자의 수송은 이어서 친유성 지방산 사슬에 의해 가능해진다. 그리하여, 디펩티드 캡핑된 트리글리세리드 분자는 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 표적화 및 수송을 허용한다.

접합 방법은 또한 펩티드 약물의 활성의 동력학을 증진시킬 수 있다. 펩티드의 활성의 동력학을 증진시키기 위해 하기 기재된 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타의 접합 기술이 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드에 대해 이용될 수 있다. Patel 등은 진통제 펩티드의 접합된 형태는 혈류로부터 뇌로 들어갈 수 있을 뿐만 아니라, 또한 유리 펩티드와 비교하여 지속된 작용을 가진다는 것을 발견하였다. 정맥내로 투여된 약물은 치료 효과를 가지는데 더 오래 소요되었으나, 두개내로 주사된 유리 펩티드의 효과보다 효과가 더 오래 지속되었으며, 더 천천히 감소되었다. 연구자들은 상기 접합된 펩티드 분자가 혈청에서 현저하게 안정하나, 대뇌뇌실내로 주사될 경우에 효과가 없었는데, 이는 담체 분자가 혈류에서 뇌로 수송 동안 분해되어 제거된다는 것을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이들은 접합체를 수송하고 담체 분자를 분해하는데 요구되는 시간은 변경된 동력학의 원인이라는 것을 의심한다. 임상 세팅에서 지연의 역학과 무관하게, 상기 접합된 펩티드 분자의 정맥내 안정성 및 상기 약물의 효과의 연장된 개시 및 활성은 덜 자주 투여될 수 있다는 것을 의미하였다. 덜 자주 및 더욱 편리한 투여 계획은 치료 선택으로서 약물의 실질적인 가치를 증진시킨다.

당업자에게 명백한 바와 같이, Patel 등의 기술 및 절차는 본 발명의 임의의 펩티드를 포함하는, 제한된 크기 범위 내에 해당하는 임의의 펩티드의 전달에 용이하게 적용가능하다. 예를 들면, 면역 질환 또는 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 본 발명의 펩티드, 예를 들면, IVTNTT(CMS017)는 Patel 등이 이용한 동일한 분자에 접합될 수 있다. 뇌에 영향을 주는 감염을 갖는 개인의 치료에서, 상기 접합된 분자는 혈류로부터 뇌에 대한 IVTNTT (CMS017) 접근을 허용할 수 있으며, IVTNTT (CMS017)이 뇌에서 세포 또는 조직에 이의 효과를 발하도록 허용한다. 담체 분자의 표적화를 변경하는 변형은 또한 당업자에게 명백할 수 있다. 담체 분자의 표적화 특징은 지방산 사슬의 말단에서 디펩티드 마스크를 포함하는 2개의 아미노산의 실체의 기능이다. Arg-Pro 디펩티드는 혈액 뇌 장벽의 내피막의 표면에서 발견되는 막 결합된 엔도펩티다아제의 세트와 우선적으로 상호작용한다. 기타 내피 세포 및 막은 기타 디펩티드 조합에 의해 잠재적으로 표적화도리 수 있었다.

접합은 또한 소화관을 통해 또는 경피로 효과적으로 흡수될 수 있는 펩티드 약물을 생성하기 위해 연구자들에 의해 이용되어 왔다. 하기 기재된 흡수를 증진시키는 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타의 접합 기술이 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 펩티드의 흡수를 증진시키기 위해 이용될 수 있다. Kramer 등은 담즙산에 펩티드 약물의 커플링에 대한 절차를 기재한다. 상기 화합물의 경구 전달에 따른 접합된 분자의 흡수 속도는 펩티드 단독과 비교하여 현저하게 증진된다 (J. Biol. Chem., 269(14): 10621, 1994). Toth 등 (J. Med. Chem., 42(19): 4010, 1999)은 이의 활성 자리에 항암 펩티드의 흡수 속도를 증가시키고, 전달을 증진시키기 위해, 리포아미노산 (LAA) 또는 리포사카라이드 (LS)에 항종양 특성을 갖는 펩티드 약물의 접합을 기재한다. 이의 연구에서, 강한 항증식 특성을 보여주나, 손상된 약동학을 갖는 소마토스타틴의 유도체는 LAA 또는 LS에 접합된다. 생성된 접합체 약물은 종양 세포에 대해 여전히 활성이면서 피부 및 장 내피를 횡단하여 개선된 흡수 프로필 및 분해에 대한 증가된 내성을 가진다. 상기 기술은 본 발명의 임의의 펩티드와 함께 매우 유용할 수 있다. 장 내피를 횡단하여 분자의 흡수 속도를 증가시킴으로써, 펩티드의 많은 것이 혈류로 전달될 수 있으며, 치료를 받는 개인에 이의 효과를 가진다.

접합은 또한 펩티드 약물의 지속된 방출을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 지속된 방출을 제공하기 위한 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 펩티드의 지속된 방출을 제공하기 위해 이용될 수 있다. Patel 등의 연구에서 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 약물의 지속된 전달은 접합 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 또 다른 예는 Kim 등(Biomaterials, 23: 2311, 2002)의 연구인데, 여기에서 재조합 인간 표피성장인자 (rhEGF)가 생분해성 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA) 미세구에서 미세캡슐화 전에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합되었다. PLGA에서 미세캡슐화는 다양한 성장인자 및 형태형성 단백질을 전달하기 위해 수개의 그룹에 의해 이용되었다 (Meinel et al., J. Controlled Rel., 70: 193, 2001). PEG에 접합을 통해, rhEGF는 비접합된, 유리의 rhEGF와 비교하여 PLGA와 함께 미셀 형성 동안 수불용성 응집체의 형성 및 물-유기상 경계면에 대한 흡착에 저항성이 되었다. 접합된 호르몬을 포함하는 제형물의 약동학은 유리 호르몬을 이용한 것보다 더 장기간 지속되며, 안정하며, 전반적으로 더 큰 약물 활성을 보이면서 개선되었는데, 이는 연구자들은 PEG에 접합된 호르몬의 증진된 물리적 안정성에 기인한다고 생각한다. 유사한 전략이 본 발명의 임의의 펩티드의 지속된 방출 제형물을 생성하기 위해 이용될 수 있었다. 예를 들면, 하기 실시예 1에서 알 수 있는 바와 같이, IVTNTT (CMS017)는 강력한 항바이러스 효과를 나타낸다. 상기 펩티드에 PEG를 접합하고, PLGA 미세구에 상기 접합된 약물을 혼입함으로써, IVTNTT (CMS017)의 항바이러스 효과는 더 오래 지속되고, 더 안정할 수 있는데, 이는 이의 PEG 접합체로부터 방출되기 때문에, 약물의 투여가 더욱 균일하고, 감염 자리로 펩티드 약물의 더욱 일정한 전달을 보장하기 때문이다.

펩티드 약물의 연장된 방출은 이의 활성을 현저하게 증진시킨다. 하기 기재된 펩티드의 연장된 방출을 제공하는 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 펩티드의 연장된 방출을 제공하기 위해 이용될 수 있다. Oldham 등(Int. J. Oncology, 16: 125, 2000)은 약물의 신규 형태인 폴리(L-글루탐산)에 접합된 파클리탁셀(PG-TXL)에 대한 항암제 파클리탁셀을 비교한다. PG-TXL은 유리 파클리탁셀과 비교하여 우수한 항종양 활성을 가지는 것 같은데, 이는 상기 약물이 우수한 약동학 특성 또는 아마도 더욱 우수한 작용 방식을 가진다는 것을 제안한다. 그러나, 연구자들은 PG-TXL이 유리 약물과 동일한 작용 기작에 의해 이의 효과를 발하여, 미세소관 서브유닛의 중합을 방해함으로써 세포 주기 정지를 유도한다는 것을 발견하였다. 증거는 상기 접합된 약물의 우수한 항종양 활성이 접합체로부터 유리 약물의 연속적이고 안정한 방출로부터 발생하여, 유리 펩티드의 투여와 비교하여 장기간 동안 이의 치료학적 농도를 유지한다는 것을 제안한다. 감염과 싸우는 특성을 갖는 본 발명의 펩티드에 폴리(L-글루탐산) 꼬리의 첨가는 또한 상기 특성을 증진시킬 수 있었다.

특정 경우에, 펩티드의 효소 분해는 약물로서 펩티드의 유효성을 감소시킬 수 있다. 하기 기재된 펩티드의 효소 분해를 감소시키는 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 펩티드의 효소 분해를 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 연구자들은 장에서 루멘으로 분비된 프로테아제뿐만 아니라 막 결합된 펩티다아제로부터 펩티드를 보호하기 위해 수많은 접근법을 개발하였다. 후자는 모든 점액 조직의 표면상에서 발견되며, 이의 교차(crossing)는 종종 펩티드 약물의 도입의 경로이다. Bernkop-Schurch 등(J. Drug Target., 7: 55, 1999)은 펩신 저해제를 포함하는 펩티드 약물 제형물의 생성을 보고한다. 펩스타틴의 유사체는 점막점착성 중합체에 공유적으로 부착되었으며; 상기 신규 펩신 저해제는 인슐린을 포함하는 정제에 포함되었다. 소화를 모방하는 실험실 조건하에 인큐베이션 후에, 대조군 정제로부터의 모든 인슐린은 대사된 반면, 저해제를 포함하는 정제로부터의 인슐린의 거의 50%는 분해로부터 보호되었다. 또 다른 연구에서, 동일한 그룹은 독성 부작용이 생물학적으로 활성인 펩티드의 분해를 저해하도록 하는 투여랑의 프로테아제 저해제를 이용하였다 (Bernkop-Schnurch et al., Adv. Drug Del. Rev., 52: 127, 2001). 상기 접근은 갑각류 및 기타 생물체에서 발견된 주요한 구조적 다당류인 키틴으로부터 추출된 셀룰로오스와 관련된 아미노폴리사카라이드인 키토산을 이용한다. 키토산에 프로테아제 저해제를 접합시키고, 펩티드 약물의 제형물에 상기 접합된 분자를 포함함으로써, 소화관 프로테아제의 현저한 저해가 관찰되었으며, 유리 프로테아제 저해제의 투여시 예상될 수 있는 부작용 없이 상기 펩티드의 생체이용율을 증가시킨다. 상기 연구에서, 다양한 프로테아제 저해제 단독 ㅁ및 조합이 키토산 담체에 대한 접합에 이용되었다. 키토산-EDTA 접합체는 활성을 위해 특정 프로테아제에 의해 요구되는 무기 보조인자에 결합함으로써, 내재하는 프로테아제를 또한 저해하였다. 당업자에게 용이하게 명백한 바와 같이, 담체 분자 및 효과기(effector) 모이어티 사이의 수많은 가능한 조합이 펩티드 제형물에 유리한 특성을 제공하기 위해 생성될 수 있었으며, 어느 것도 본 발명의 펩티드에 대한 이용에 용이하게 적용될 수 있었다. 키토산에 결합된 프로테아제 저해제를 용하여 펩티드의 경구 전달용 제형물을 생성함으로써, 본 발명의 펩티드의 경구 전달은 근육내 주사 대신에 이용될 수 있었다. 상기 접근은 펩티드 및 이의 유도체에 대한 더 큰 수준의 생체이용율을 생성하기 위해, 상기 제형물에서 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드(상기 절에서 논의됨)의 더욱 흡수가능한, 접합된 버전을 이용하는 것을 배제하지 않는다.

또 다른 분자에 의한 위치에 표적화되는 것 외에, 펩티드 자체는 표적화하는 분자로서 이용될 수 있다. 하기 기재된 원하는 위치에 분자를 표적화하기 위해 펩티드를 이용하는 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 펩티드에 대해 이용될 수 있다. 예를 들면, 연구자들은 항암 약물인 디플루오로메틸오르니틴 (DFMO)을 선택하고, 이를 표적화 목적으로 펩티드에 접합시켰다. DFMO는 다양한 종양 세포 유형을 사멸하는데 유효한 매우 세포독성 물질이다. 그러나, 신체로부터 신속하게 제거되므로, 이의 치료학적 가치는 제한된다. 본 연구에서, DFMO는 멜라노트로핀의 특정 단편 및 인간 흑색종 세포주 상의 멜라노트로핀 수용체에 우선적으로 결합하는 것으로 밝혀진 2개의 아미노산 치환을 포함하는 단편의 유사체에 접합되었다(Suli-Vargha et al., J. Pharm. Sci., 86: 997, 1997). 아미노펩티다아제에 의한 펩티드 단편으로부터 DFMO의 방출을 촉진하기 위해, 상기 약물은 펩티드의 N-말단에 접합되었다. 연구자들은 상기 접합된 약물이 비접합된 약물 단독보다 흑색종 세포를 사멸하는데 더욱 효과적이라는 것을 발견하였다.

본 발명의 펩티드의 효과는 펩티드 자체에 본질적인 표적화 능력에 부분적으로 기인할 수 있다. 예를 들면, α 멜라노트로핀 단편처럼, 본 발명의 특정 펩티드는 세포의 독특한 유형의 표면상에서 발견되는 특정 수용체에 결합할 수 있다. 접합제로서 상기 펩티드를 이용함으로써, 약물은 상기 약물로 치료받는 개인의 체내의 상기 세포의 위치에 표적화될 수 있었다.

접합체로서 펩티드는 표적화 이외의 기능에 이용될 수 있다. 하기 기재된 펩티드의 치료학적 유효성을 증진시키는 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 펩티드의 치료학적 유효성을 증진하기 위해 이용될 수 있다. Fitzpatrick 등은 2 분자 사이의 펩티드 스페이서를 이용함으로써 접합된 항암제에 관하여 개선하였다 (Anticancer Drug Design, 10: 1, 1995). 메토트렉세이트는 종양 세포에 의한 이의 흡수 및 종양 세포에 대한 활성을 증가시키기 위해 인간혈청알부민(HSA)에 이미 접합되었다. 일단 세포에 의해 흡수되면, 메토트렉세이트의 일부는 리소좀에서 효소에 의해 접합체로부터 해리되며, 이의 세포독성 효과를 발할 수 있다. 메토트렉세이트 및 리조솜 효소에 의해 용이하게 분해되는 HSA 사이의 4개의 아미노산 링커 펩티드를 삽입함으로써, 접합체 분자로부터 세포 내에 생성된 활성 메토트렉세이트의 양은 증가되었다. 본 발명의 펩티드는 특정 효소와 특이적인 상호작용을 통해 이의 효과를 발할 수 있다. 본 발명의 펩티드를 약물 및 이의 담체 분자 사이의 링커 절편으로서, 또는 또 다른 링커 절편 외에 접합된 분자에 혼입함으로써, 약동학은 변경될 수 있다. 이는 프로테아제의 활성에 더욱 내성 또는 더욱 민감한 약물 전구체를 생성할 수 있는데, 이는 이어서 접합체로부터 약물 분자 방출의 속도를 감소 또는 증가시킨다. 상기 접합된 화학요법제의 예에서 알 수 있는 바와 같이, 약물 분자 전달의 속도를 변경하는 것은 약물의 유효성을 매우 증진시킬 수 있다.

특정 세포에 대한 약물의 효과는 세포의 활성화 상태 또는 세포 근처 또는 세포 내의 기타 분자 신호의 존재와 같은 기타 인자에 의존하여 변경될 수 있다. 특정 경우에, 약물이 효과를 갖기 위해서는, 또 다른 분자 또는 신호가 존재할 필요가 있다. Damjancic 등(Exp. Clin. Endocrin., 95: 315, 1990)은 결핍된 내재하는 글루코코르티코이드 합성을 갖는 환자에 대한 심방나트륨이뇨펩티드(hANP)의 효과를 연구하였다. 상기 펩티드는 글루코코르티코이드 요법의 철회 동안 또는 덱사메타손을 이용한 요법의 이은 재개 동안 환자에게 제공되었다.

펩티드 호르몬이 부수적인 덱사메타손 치료 동안 제공될 때, 단지 나트륨 배출 및 이뇨에서 증가와 함께 환자는 hANP에 반응하였다. 글루코코르티코이드 요법의 철회 동안 hANP를 이용한 치료는 효과가 없었다. 동시의 스테로이드 호르몬 투여의 효과는 또한 펩티드의 활성을 증가시킬 수 있다. Zhu 등 (Acta Pharm. Sinica, 28: 166, 1993)의 보고에서, 진통제 펩티드 키오토르핀 (KTP)의 활성은 펩티드 단독의 작용과 비교하여, 짧은 링커 절편을 통해 히드로코르티손에 접합에 의해 현저하게 증진되었다. 히드로코르티손 단독의 투여에 대해 어떤 효과도 관찰되지 않았다.

상기 연구의 결과는 제형물에서 접합된 분자 또는 성분으로서 스테로이드 호르몬의 능력이 생물학적으로 활성인 펩티드의 활성을 허용 또는 증진할 수 있다는 것을 예시한다. 본 발명의 임의의 펩티드는 또한 스테로이드 호르몬에 접합 또는 스테로이드 호르몬의 동시 적용에 의해 조절 또는 활성화될 수 있다. Zhu 등의 기술은 본 발명의 펩티드에 대한 스테로이드 분자의 접합에 용이하게 적용될 수 있다. 도 1 내지 5는 또한 본 발명의 임의의 펩티드에 스테로이드 호르몬을 연결하는 전형적인 단계적인 합성 반응을 제공한다.

상기 제시된 예는 본 발명의 임의의 펩티드의 유용성 및 활성을 확장하기 위한 전형적인 방식을 제공한다. 상기 분야에서 추가의 개발은 유효한 펩티드 기재 임상 치료를 생성하는데 대한 장벽을 극복하는 것을 도울 것이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 펩티드 생화학, 약학 연구 및 임상 세팅에 이용하기 위해 개발된 기술, 시약 및 절차는 모두 본 발명의 임의의 펩티드에 용이하게 적용가능하다.

5개 도면의 각각은 스테로이드 분자에 펩티드를 연결하는 전형적인 화학 반응을 나타낸다.

도 1은 공유 결합을 이용하여 에스트론 분자에 펩티드를 연결하는 일련의 화학 반응을 보여준다.

도 2는 도 1과 동일한 연결을 생성하는 제2의 대안적인 세트의 반응을 보여준다.

도 3은 공유결합을 이용하여 에스트라디올 분자에 펩티드를 연결하도록 디자인된 일련의 화학 반응을 포함한다.

도 4는 도 3과 동일한 연결을 생성하는 제2의 일련의 화학 반응을 포함한다.

도 5는 히드로코르디손 분자에 공유 결합을 통해 펩티드를 연결하는 방법을 나타낸다.

실시예 1

CMS017 의 시험관 내 연구

CMS017은 서열 IVTNTT를 가지며, L-아미노산을 이용하여 합성되었다. B형 간염 바이러스로 트랜스펙션된 세포에 대한 CMS017 치료의 효과는 본 실험에서 조사되었다.

1. 재료

CMS017은 American Peptide Company, Inc.(미국)에 의해 (L-아미노산을 이용하여) 통상적으로 합성되었으며, 통상의 염수를 이용하여 원하는 농도로 희석되었다.

B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 트랜스펙션된 hepG 2 2.2.15 세포주는 약물 스크리닝 국립 센터(상하이, 중국) 및 북경대와 제휴한 제일병원의 감염성 질환부에 의해 제공되었다.

세포 배양 배지(MEM)는 GIBCO 사에 의해 제조되었다.

HBsAg 및 HBeAg에 대한 ELISA 키트는 Shanghai Shiye Kehua Biotech. 회사로부터 구입하였다.

HBV-DNA의 측정을 위한 형광 정량 PCR 키트는 Zhongshan 의대의 Da-An 유전자 회사로부터 구입하였다.

2. 방법

a. 시험관 내 최대 비독성 농도에서 HBsAg 및 HBeAg에 대한 CMS017의 저해 효과

대수기에서 성장하는 2.2.15 세포를 수확하고, MEM 배양 배지(10% 소혈청, 100mg/ml 페닐실린, 및 100U/ml 스트렙토마이신 함유)에서 2xl0⁶/ml 세포 현탁액으로서 재현탁하였다. 상기 현탁액을 웰당 1.5ml로 24-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고, 48시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 시험 물질 CMS017을 희석하고, 2.2.15 배양물에 농도당 3개의 시료로 0, 50, 100, 200, 400, 800㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 이어서, 상기 세포를 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 상층액을 3일 및 6일에 보충하였다. 2.2.15 세포 배양물에 대한 CMS017의 세포독성을 이어서 8일에 MTT 염색으로 관찰하고, CMS017의 최대 비독성 농도를 측정하였다.

세포 현탁액의 제조 및 인큐베이션을 비교 음성 및 양성 대조군과 함께, CMS017의 측정된 최대 비독성 농도를 이용하여 상기와 같이 반복하였다(CMS017와 동일한 농도의 라미부딘을 양성 대조군으로서 사용하였다). 8일째에, 세포 배양물 상층액에서 HBsAg 및 HBeAg의 역가를 키트 공급자에 의해 기재된 조건을 이용하여, ELISA^[1,2]에 의해 측정하였다. 각각의 시험 물질의 저해율을 하기에 보여준 바와 같이 계산하였다.

저해율(%) = (대조군-시료)/대조군 x 100

세포 생존율(%) = 시료(A₅₉₅-A₆₅₀)/대조군(A₅₉₅-A₆₅₀) x lO0

b. 시험관 내 HBV-DNA에 대한 CMS017의 저해 효과

세포 현탁액을 상기 방법 1에 기재된 바와 같이 제조하고 인큐베이션하였다. 본 실험에서, 비다라빈 모노포스페이트 (Ara-AMP)를 양성 대조군 물질로서 이용하였다. 시험 물질 CMS017 또는 Ara-AMP를 희석하고, 활성화된 세포 배양물에 농도당 3개의 시료로, 0, 20, 40, 80, 160, 320㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 첨가된 시험 물질을 갖는 배양 배지를 3일 및 6일에 교환하였다. 8일째에, 세포 배양물의 상층액을 키트 공급자에 의해 기재된 방법을 이용하여, 형광 정량 PCR^[3,4]에 의한 HBV-DNA 농도의 측정을 위해 수확하였다. 배양된 세포를 각 시험 물질의 세포독성 분석을 위해 취하였다. 상기 약물의 저해율을 하기 방식으로 계산하였다:

저해율(%) = (대조군-시료)/대조군 x 100

세포 생존율 (%) =시료(A₅₉₅-A₆₅₀)/대조군(A₅₉₅-A₆₅₀) x 100

TC₅₀은 시험군에서 생존하는 세포의 백분율이 대조군의 것의 50%인 시험 물질 농도로서 정의되었다. IC₅₀은 HBV-DNA 농도의 감소율이 대조군과 비교하여 50%인 시험 물질 농도이었다. 상기를 시험 물질 농도에 대한 해당하는 백분율을 플롯팅함으로써 측정하였다. 선발지수(SI)를 TC₅₀/IC₅₀으로서 계산하였다. SI의 값이 클수록, 시험 물질의 저해 활성은 커지며, 세포독성은 적어진다.

통계학적 유의성은 소프트웨어 SPSS를 이용하여 t-시험에 의해 분석하였다.

3. 결과

a. HBsAg 및 HBeAg에 대한 CMS017의 저해 효과

CMS017의 최대 비독성 농도는 400㎍/ml인 것으로 밝혀졌다. 표 1은 상기 최 대 비독성 농도에서 계산된 저해율을 보여주었다.

400㎍/ml에서 HBsAg 및 HBeAg에 대한 CMS017의 저해 효과

시험 물질	HBsAg의 저해율	HBeAg의 저해율
CMS017	68.6%*	62.2%*
라미부딘	29.6%*	35.4%*
* 음성 대조군과 비교할 때 p<0.01

b. HBV-DNA에 대한 CMS017의 저해 효과

표 2는 시험 물질의 TC₅₀, IC₅₀ 및 SI를 보여주었으며, 표 3은 상기의 저해율을 보여주었다.

HBV-DNA에 대한 약물의 저해 효과

약물	TC₅₀(㎍/ml)	IC₅₀(㎍/ml)	SI
CMS017	1332.5	2.3	577.7
Ara-AMP	64.2	11.4	5.6

160㎍/ml의 농도에서, 상층액 HBV-DNA에 대한 약물의 저해율

	CMS017	Ara-AMP
저해율	90.8%*	89.1%*
* 음성 대조군과 비교할 때 p<0.01

4. 결론

돼지 비장 글리코펩티드는 인간 B형 간염 감염에 치료 효과를 가지는 것으로 보고되었다. 그러나, 활성 성분(들)의 분자적 성질은 명확하지 않았다. 관련된 활성 성분을 화학적으로 합성하고, 이의 치료학적 투여를 최적화하고, 기타 공존하는 오염 성분에 의해 야기되는 원하지 않는 부작용을 제거하는 최종 목적으로, 관련된 활성 성분을 확인하기 위해, 돼지 비장 추출액을 분자 수준에서 분석하였다 (예일대학교의 Keck 교수단을 이용함). 개개의 펩티드 성분을 이어서 화학적으로 합성하고, 상기 펩티드의 각각을 항바이러스 활성에 대해 스크리닝하였다. 수많은 펩티드가 시험관 내에서 다양한 수준의 항바이러스 활성을 갖는 것으로 관찰되었다. 상기 중에서, CMS017은 시험관 내에서 가장 강한 항바이러스 활성을 갖는 펩티드 중의 하나이다.

본 연구에서, CMS017은 통계학적 유의성을 가지고서, 시험관 내에서 HBV-DNA의 수준을 저해할 수 있었다. 50% 저해 농도(IC₅₀)는 2.3㎍/ml 이었으며, HBV-DNA 저해율은 160㎍/ml의 농도에서 90.8% 이었다. CMS017이 시험관 내에서 항바이러스 물질이며, B형 간염과 같은 바이러스 감염의 치료를 위한 항바이러스 치료 약제로 개발을 위한 후보물질이라고 결론지었다.

5. 참고문헌

1. Wu Qing, et al. The inhibition of hepatitis B viral gene expression by antisense oligo deoxynucleotides. Journal of Anhui University of Medical Science. 2001; 36(6): 434-437

2. Gao Yong, et al. A study of hepatitis B virus (HBV) anti-genome and its inhibitory effect on HBV replication. Zhong Hua Nei Ke Za Zhi. 2001; 40(4): 243-246.

3. Ausubel F. M, et al. Short Protocols in Molecular Biology. Science Publishing House. Beijing, 1998, the first edition (translation). P596-598

4. Tian Hua, et al. Determination of the serum HBV-DNA of the patients with hepatitis B by FQ-PCR. Journal of Shanghai Medical Laboratory. 2001; 16(6): 363-364

실시예 2

CMS017 의 생체 내 연구

ConA에 의해 유도된 마우스의 T 림프구 형질전환에 대한 CMS017의 효과를 조사하기 위해 하기 동물 연구를 수행하였다.

1. 재료

a. 실험 동물

BALB/c 마우스, 18-22g, 웅성, [VITAL RIVER, Inc., Beijing, PR China] 제공.

b. 시약

CMS017: [CS Bio, USA]에 의해 통상적으로 합성

소태아혈청, 및 RPMI-1640 세포 배양 배지: Gibco, USA

MTT 및 ConA: Sigma, USA

rhIL-2: Shanghai Huaxin Biotech Inc., China

2. 방법

a. 그룹핑 및 투여

BALB/c 마우스를 CMS017 투여 I 그룹(200㎍/kg/일), CMS017 투여 II 그룹(50㎍/kg/일), 재조합 인간 IL (rhIL)-2 그룹(3×lO⁵IU/kg/일), 및 염수 그룹(0.5ml/일)으로 무작위로 나누었다. 그룹 당 12마리의 마우스.

시험 물질을 모두 염수에 용해하고, 하루에 1회 28일 동안 연속하여 (i.p.)0.5ml/일로 복강내로 주사하였다.

b. 세포 면역에 대한 펩티드의 효과

i. 비장 세포 현탁액의 제조^{[1, 2]}

최종 시험 물질 투여 다음 날에, 마우스를 경추 탈골에 의해 희생하였다. 비장을 무균적으로 분리하고, 주사 바늘을 이용하여 냉 D-Hank's 용액에 수작업으로 분산하였다. 분산된 세포 현탁액을 100 게이지 150㎛ 직경 스테인레스강 체를 통해 추가로 걸렀다. 10분 동안 200g에서 원심분리 후에, 상층액을 버렸다. 세포 펠렛을 10 부피의 Tris-NH₄Cl 완충액에 재현탁한 후, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 현탁된 세포를 10분 동안 150g에서 원심분리에 의해 수합하였다. 세포를 전술한 바와 같이 재현탁 및 원심분리에 의한 수합에 의해 냉 D-Hank's 용액을 이용하여 2-4회 세정하였다. 세정된 세포를 이어서 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI-1640 배양 배지에서 원하는 세포 밀도로 희석하였다.

ii. T 림프구 형질전환에 대한 펩티드의 효과^[1,2]

4xl0⁶/ml 밀도의 비장 세포를 96 웰 세포 배양 플레이트(100㎕/웰)에 위치하고, 마우스 당 분석 시료 및 대조군 시료 양자의 3개의 비교 웰. 각각의 분석 웰에, RPMI-1640 중의 5㎍/ml의 ConA의 100㎕/웰을 첨가하고, 보통의 RPMI-1640의 100㎕/웰을 대조군 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% C0₂에서 68시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 이어서 10분 동안 150g에서 원심분리에 의해 펠렛화하였다. RPMI-1640 중의 0.5mg/ml의 MTT의 100㎕/웰을 세포 펠렛에 첨가하고, 상기 세포를 2분 동안 교반에 의해 재현탁하였다. 인큐베이션을 4시간 동안 계속하였다. 상층액을 10분 동안 150g에서 원심분리 후에 제거하였다. 100㎕ HCI-2-프로판올(1:1)을 세포 펠렛에 첨가하고, 상기 펠렛을 3분 동안 교반하였다. 630nm에서 기준값을 갖는 ELISA 해독기를 이용하여 각 웰의 OD_570nm을 수득하였다.

2. 계산

각 마우스에 대해 3개의 분석 및 3개의 대조군 웰이 있었다. 각 마우스의 자극 지수(SI)는 3개의 비교 웰의 평균 OD를 먼저 유도한 후, 분석 웰의 평균 값을 대조군 웰의 평균 값으로 나눔으로써 수득하였다.

3. 결과

50㎍/kg/일에서, CMS017은 하기 표에서 보여준 바와 같이, 염수 대조군과 비교하여 통계학적 유의차를 보여주면서(P < 0.05), T 림프구 형질전환을 증진시키는 것으로 밝혀졌다.

T 림프구 형질전환에 대한 CMS017의 효과

그룹	투여량	N	X±SD(자극지수)
CMS017	200㎍/kg/일	12	2.65±0.51
CMS017	50㎍/kg/일	12	2.82±0.41*
IL-2	3×10⁵IU/kg/일	11	2.71±0.35*
염수	0.5ml/일	11	2.50±0.23
* 염수 대조군과 비교하여 P≤0.05

4. 결론

펩티드 CMS017은 시험관 내에서 T 림프구 형질전환을 증진시킬 수 있는 것으로 밝혀졌는데, 이는 CMS017이 동물에 대한 면역 자극 특성을 가질 수 있음을 암시한다.

5. 참고문헌

1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 134-135

2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234

실시예 3

유전자 조작된 락토바실러스 박테리아 종을 통한 펩티드 전달

전술한 바와 같이 숙주에 본 발명의 펩티드를 전달하는 하나의 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 화학적 수단에 의해 합성하고, 상기 DNA 서열을 당업자에게 친숙한 유전 공학의 표준 기술을 이용하여 발현 벡터 내로 삽입한다. 상기 선택된 발현 벡터는 락토바실러스에서 기능하는 구성적 프로모터, 특정 5'에서 3' 방향으로 DNA 서열의 도입을 위한 다중 클로닝 자리뿐만 아니라 (클로닝 절차를 돕기 위해) 항생제에 내성을 부여하는 선택성 마커 유전자를 포함하며, 신호 펩티드 서열과 같은 펩티드의 생성 및/또는 분비를 돕기 위한 기타 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터의 예는 본원에 전체적으로 참고로 포함된 미국특허 제5,592,908호(Pavla에게 허여)에 의해 제공된다. 간단하게, 상기 특허는 락토바실러스 종에서 기능하는 몇 가지 공지된 프로모터뿐만 아니라, 상기 박테리아에서 신규 프로모터를 발견하는 방법을 논의하는데, 상기 임의의 프로모터는 락토바실러스에서 펩티드를 발현하기 위해 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 인용된 미국특허 제5,529,908호에 기재된 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis)에서 활성인 16 내지 35개의 대부분 소수성 아미노산으로 구성된 펩티드와 같은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산을 프로모터 및 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 끼워 넣어 신호 펩티드를 코딩하는 핵산이 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산과 인 프레임이 되게 한다.

상기 펩티드의 코딩 서열 외에, 합성된 DNA 서열은 발현 벡터 내로 상기 DNA의 연결 및 클로닝을 도울 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 벡터의 다중 클로닝 자리에서 발견되는 것에 해당하는 제한효소 인식 자리는 상기 서열의 5' 및 3' 말단에서 합성된 DNA 내로 혼입될 수 있으므로, 상기 서열은 벡터 내에서 올바른 방향으로 클로닝될 수 있다. 벡터 및 합성된 DNA 양자는 특정 제한효소로 절단된 후, 정제된다. 벡터 및 합성된 DNA를 이용한 연결 반응에 이어 대장균의 적당한 균주 내로 형질전환이 뒤따른다. 형질전환된 박테리아를 벡터가 내성을 부여하는 항생제를 포함하는 배지 상에 도말한다. 형질전환된 박테리아의 콜로니를 성장 배지 및 플라스미드 제조 절차에 대해 선발하고; 올바른 방향으로 합성된 DNA의 존재를 확인한다.

이어서 상기 발현 벡터를 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus)와 같은 락토바실러스 종의 박테리아 숙주 세포 내로 형질전환한다. 형질전환된 세포를 벡터 서열 내에 존재하는 선택성 마커를 통해 선발하고, 펩티드의 분비를 웨스턴 블롯을 수행하고, 성장 배지에 존재하는 펩티드의 겔 전기영동 또는 기타 표준 기술을 수행함으로써 확인할 수 있다. 박테리아의 형질전환된 콜로니를 선발하고, 유전자 조작된 박테리아의 대규모 배양물을 제조하기 위해 이용한다. 원하는 펩티드를 발현하는 유전자 조작된 박테리아의 배양물을 키우고, 적어도 이의 부분을 박테리아가 증식할 수 있는 숙주 생물체의 소화관, 질, 기관 또는 기타 영역에 투여한다. 원한다면, 상기 박테리아 배양물은 숙주에 의한 장 소비를 위한 보조제를 생산하기 위해 다양한 방식으로 처리될 수 있다. 상기 처리는 박테리아와 담체 물질, 예를 들면, 용액, 용매, 분산 배지, 지연제, 에멀션 등을 조합하는 것 외에, 동결건조 또는 박테리아를 보존하는 기타 방법을 포함한다. 보조제를 제조하기 위한 상기 물질의 이용은 당업계에 주지된다. 예를 들면, 상기 박테리아는 펩티드를 발현하는 생물체가 숙주 생물체의 장을 집락하도록, 인간 소비를 위한 배양된 유제품 또는 기타 식품을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 식품, 예를 들면, 요구르트, 김치, 치즈 및 버터에 젖산 박테리아의 특정 균주를 혼입하는 수많은 상이한 방법이 본원에 전체적으로 참고로 포함된 미국특허 제6,036,952호(Oh에게 허여)에 기재된다. 임의의 수의 경로 중의 하나를 통해 상기 박테리아를 소비시, 조작된 생물체는 장을 집락할 수 있으며, 장의 점액층을 통해 본 발명의 펩티드의 발현 및/또는 흡수를 허용한다.

실시예 4

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 유전자 조작된 형태를 통한 펩티드 전달

전술한 바와 같이 숙주에 본 발명의 펩티드를 전달하는 하나의 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 화학적 수단에 의해 합성하고, 상기 DNA 서열을 당업계에 공지된 모든 기술인 유전 공학 기술을 통해 발현 벡터 내로 삽입한다. 상기 선택된 발현 벡터는 대장균 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 양자에서 증식할 수 있으며, 형질전환된 박테리아의 콜로니를 선발하기 위한 항생제 내성 유전자를 포함하는 pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ)와 같은 셔틀 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 바실러스 서브틸리스에서 활성인 구성적 프로모터, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스의 Sac B 유전자로부터 유도된 프로모터뿐만 아니라, 박테리아 세포로부터 발현된 이종 단백질의 효율적인 배출을 유도하는 바실러스 서브틸리스에서 활성인 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터의 예는 이의 개시가 본원에 전체적으로 참고로 포함된 미국특허 제6,268,169호(Fahnestock에게 허여)에 개시된다. 간단하게, 상기에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA는 당업자에게 친숙한 기술을 통해 DNA의 클로닝을 용이하게 하는 제한효소 자리 및/또는 기타 서열과 함께 합성될 것이다. 플라스미드 스톡을 생성하기 위해 대장균으로 형질전환, 도말, 플라스미드의 선발 및 증식 후에, 상기 플라스미드는 바실러스 서브틸리스 내로 형질전환될 수 있으며, 형질전환체를 도말 배지에서 항생제에 대한 내성을 통해 선발된다.

유전자 조작된 바실러스 서브틸리스에서 펩티드 제조 및 펩티드 분비는 당업자에게 주지된 기술, 예를 들면, SDS-PAGE 분석 후에 자기방사기록 검출 또는 웨스턴 블롯팅을 위한 펩티드의 방사선표지를 이용하여 확인한다.

유전자 조작된 박테리아의 배양물을 키우고, 적어도 이의 부분을 박테리아가 증식할 수 있는 숙주 생물체의 소화관, 질, 기관 또는 기타 영역에 투여한다.

실시예 5

유전자 조작된 사카로마이세스 효모 종을 통한 펩티드 전달

전술한 바와 같이 숙주에 본 발명의 펩티드를 전달하는 하나의 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 화학적 수단에 의해 합성하고, 상기 DNA 서열을 당업계에 공지된 모든 기술인 유전 공학 기술을 통해 발현 벡터 내로 삽입한다. 상기 선발된 발현 벡터는 pADHl과 같은 구성적 효모 프로모터, 효모 및 대장균 양자에서 벡터의 복제를 위한 자리, 선발 목적을 위해 영양요구체 효모 돌연변이체에 대한 기본영양체(prototrophy)을 부여하는 유전자(들), 다중 클로닝 자리(MCS) 및 원한다면, 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 안정하게 유지되는 효모 단백질 발현 벡터를 포함한다. 상기와 같은 벡터는 시판되며, 당업계에 주지되거나 또는 표준 기술을 이용하여 용이하게 구축될 수 있다. 효모 벡터 내로 합성된 DNA의 삽입, 대장균에 형질전환, 형질전환된 대장균의 선발 배지에 도말, 형질전환된 박테리아 콜로니의 선발 및 상기 콜로니로부터 박테리아의 성장 배양으로부터 플라스미드 DNA의 제조 후에, 상기 벡터는 리튬 아세테이트 형질전환 또는 전기천공법과 같은 주지된 기술을 통해 사카로마이세스 세레비지애(Sacchararrayces cerevisiae) 내로 형질전환된다. 형질전환에 대해 선발된 사카로마이세스 세레비지애 균주는 최소 배지 플레이스 상에서 성장하기 위해 플라스미드 상에 유전자를 요구할 돌연변이 영양요구체 균주이다.

형질전환된 효모 콜로니는 벡터 상에 제공된 유전자가 결핍된 성장 배지 상에서 효모를 도말함으로써 분리된다. 상기 벡터 및 이의 선발 유전자를 받은 효모만이 유전자 산물을 발현할 수 있으며, 최소 배지에서 콜로니로 성장할 수 있다. 펩티드 분비의 확인은 웨스턴 블롯의 수행, 성장 배지에 존재하는 펩티드의 겔 전기영동 또는 기타 표준 기술을 수행함으로써 수득될 수 있다.

효모의 형질전환된 콜로니를 선발하고, 대규모 배양물을 제조하기 위해 이용한다. 원하는 펩티드를 발현하는 유전자 조작된 효모 배양물을 키우고, 적어도 이의 부분을 박테리아가 증식할 수 있는 숙주 생물체의 소화관, 질, 기관 또는 기타 영역에 투여한다. 원한다면, 효모 배양물은 숙주에 의한 장 소비를 위한 보조제를 생산하기 위한 다양한 방식으로 처리될 수 있다. 상기 처리는 박테리아와 담체 물질, 예를 들면, 용액, 용매, 분산 배지, 지연제, 에멀션 등을 조합하는 것 외에, 동결건조 또는 효모를 보존하는 기타 방법을 포함한다. 보조제를 제조하기 위한 상기 물질의 이용은 당업계에 주지된다. 또 다른 구현예에서, 형질전환된 효모는 당업자에게 공지된 기술에 의해, 식품, 예를 들면, 요구르트 및 케피어(kefir)와 같은 발효 유제품의 생성에 이용된다. 상기 식품에서 생 젖산 박테리아 배양물에서처럼, 형질전환된 효모는 적어도 일시적으로 장을 집락하고, 장 루멘을 통해 숙주에 펩티드를 제공하기 위해 이용된다.

실시예 6

특정 위치에 펩티드의 표적화

신체 내의 특정 구획, 기관, 세포 유형 또는 위치에 본 발명의 펩티드를 선택적으로 전달하기 위한 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. 이 경우에, 감염은 IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 개인의 신장 조직에 표적화함으로써 처리된다. 예를 들면, IVTNTT (CMS017)은 당업계에 공지된 화학 반응을 통해 공유 결합에 의해 신장 조직에 특이적으로 농축되는 시판되는 단백질 모이어티인 저분자량(LMW) 리소자임에 연결된다. LMW 리소자임에 분자의 접합을 수행하는 기술이 기재된다 (Folgert et al., Br. J. Pharmcology, 136: 1107, 2002). 단백질 또는 펩티드를 서로 접합하는 일반적인 기술은 또한 해당 분야의 문헌에 교시된다 (Fischer et al., Bioconj. Chem., 12: 825, 2001). 신규로 생성된 접합된 펩티드 시료는 이어서 양이온 교환 FPLC와 같은 크로마토그래피 방법 및/또는 구배 원심분리에 의해 연결 방법에 이용된 화학 시약으로부터 정제된다. 일단 정제되면, 상기 접합된 펩티드는 바이러스 신장염에 대한 치료를 요하는 개인에게 투여된다. 이의 항바이러스 활성을 위해, IVTNTT (CMS017)은 IVTNTT (CMS017) 및 신장의 근위세관의 세포에 대한 LMW 리소자임의 친화성을 통해 신장 조직에 선택적으로 농축된 LMW 리소자임 사이의 연결을 통해 우선적으로 신장 조직에 표적화된다. 상기 우선적인 전달은 단독으로 몰 당량의 IVTNTT (CMS017)의 것과 비교하여 더 큰 항-신장염 효과를 허용한다. 역으로, 이는 특정 수준의 항-신장염 활성을 달성하기 위해 필요한 펩티드 약물의 양을 감소시킬 수 있다.

실시예 7

이의 활성 자리로 펩티드 전달의 증진

뇌로 신경활성 펩티드의 전달을 증가시키기 위한 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. 뇌의 뉴런에 의해 발현된 수용체에 이의 효과를 발하는 본 발명의 펩티드는 당업자에게 공지된 화학적인 방법에 의해 합성된다. 대안적으로, 상기 실시예에서 상술한 바와 같이, 이는 조작된 미생물에 의해 발현될 수 있으며, 상기 생물체의 배양물로부터 회수될 수 있다. 정제된 형태로 수득된다면, 상기 펩티드는 펩티드에 부착된 트리글리세리드 에스테르 접합된 모이어티를 생성하기 위해 일련의 유기 화학 반응에 이용된다. 상기 접합된 모이어티는 펩티드의 말단 카르복실 탄소와 아미드 결합을 통해 본 발명의 펩티드에 연결된 4차 치환된 탄소 중심으로 이루어진다. 4차 탄소 중심에 부착된 기타 3개의 작용기는 16개의 탄소 지방산 사슬에 탄소 에스테르 연결로 이루어진다. 상기 지방산 사슬은 스스로 펩티드 마스크로서 알려진 말단 디펩티드 그룹에서 끝나며, 이는 사슬을 더욱 친수성으로 만들며, 이를 혈액-뇌 장벽의 내피 세포막으로 특이적으로 표적화시킨다. 상기 합성 절차는 [Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3): 434, 1997]에서 상세히 설명되며, 당업자에게 친숙한 통상적인 시약 및 장치를 이용한다.

말초 위치에서 개인에게 도입되면, 상기 화합물은 순환계를 통해 신체를 여행하며, 혈액 뇌 장벽의 내피막과 상호작용한다. 혈액-뇌 장벽의 상피층을 횡단하여 분자의 수송 동안 디펩티드 마스크 및 지질 사슬의 단계적인 분해는 본 발명의 펩티드의 뇌 구획으로 방출을 초래한다. 상기 펩티드는 뇌 기능에 이의 효과를 발하기 위해 뉴런의 표면상의 수용체와 상호작용할 수 있다. 약물이 혈액 뇌 장벽에 도달하여 담체 모이어티의 동시 분해와 함께 뇌에 수송되는데 요구되는 시간은 약물 활성의 동력학을 변경하며, 유리 펩티드의 뇌실내 주사와 비교하여 더욱 안정하고, 장기간 지속되는 효과를 생성한다.

실시예 8

효소 분해에 저항성인 펩티드 제형물의 생성

소화관의 표면에서 및 표면을 따라 발견되는 프로테아제 및 펩티다아제의 활성에 저항성인 경구 투여용 생물학적으로 활성인 펩티드 제형물을 생성하기 위한 전형적인 방법으로 하기를 제공한다. 본 실시예에서, IVTNTT (CMS017) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드가 환자에게 경구 투여를 위한 약학 제형물의 제조에 이용된다. Larionova 등 (Int. J. Pharma., 189: 171, 1999)에 기재된 바와 같이, 상기 펩티드는 가용성 전분 및 다양한 루멘으로 분비되며, 솔 가장자리(brush border) 막 결합된 프로테아제의 강한 저해제인 프로테아제 저해제 아프로티닌을 갖는 미세입자의 생성에 이용된다. 간단하게, 가용성 전분, 프로테아제 저해제 아프로티닌 및 본 발명의 펩티드는 수성 완충액에 용해된다. 가용성 전분, 아프로티닌, 및 펩티드의 비율은 당업자에게 친숙한 실험적인 방법에 의해 결정되며; 예를 들면, Larionova 등은 이의 연구에 이용된 단백질에 대해 가장 효과적인 비율 및 제조 조건을 결정하기 위해 시험관 내 가장된 절단(digestion) 분석을 이용하였다. 상기 수용액은 비이온성 계면활성제인 5% Span-80을 포함하는 시클로헥산(1:3 비율, v/v)에서 기계적 교반하에 유화된다. 클로로포름 중의 테레프탈로일 클로라이드 용액을 에멀션에 첨가하고, 교반을 30분 동안 계속하고, 그 동안 전분 분자를 아프로티닌 및 펩티드와 가교시킨다. 상기 과정에서 생성된 미세입자를 시클로헥산, 2% v/v Tween 85 세제를 갖는 95% 에탄올 용액, 95% 에탄올 및 물로 연속적으로 세정한다. 미세입자를 물에 재현탁하고, 동결건조한다. 상기 동결건조된 화합물은 치료를 요하는 개인에게 경구 전달을 위한 젤라틴 캡슐 내로 위치할 수 있다.

일단 섭취되면, 상기 화합물은 용해된 젤라틴 캡슐로서 방출된다. 상기 미세입자는 전분 분자에 대해 α아밀라아제의 작용에 의해 소장에서 분해되며, 아프로티닌 및 본 발명의 펩티드의 점차적인 방출을 초래한다. 상기 펩티드의 동일한 시간 및 위치에서 강력한 프로테아제 저해제 아프로티닌의 동시의 방출은 상기 펩티드의 효소 분해를 감소시키며, 장 막을 통한 흡수에 유용한 본래의 펩티드의 비율을 증가시킨다.

본 발명은 전술한 방법 및 데이타 및 특정 경우에 CMS017 펩티드 (IVTNTT)의 특정 예를 이용하여 기재되지만, 이는 단지 예이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해한다. 또한, IVTNTT (CMS017)은 본 발명의 하나의 구현예를 나타내며, 본 발명의 동일한 원리는 또한 IVTNTT (CMS017)의 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 변형된 기타 기능적으로 동등한 펩티드에 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, IVTNTT (CMS017)의 동등물은 보존적인 아미노산 치환을 갖는 것을 포함한다 (즉, 소수성, 친수성, 양전하 또는 음전하기와 같은 동일한 생화학적 유형 내의 잔기를 갖는 또 다른 아미노산에 의해 치환된, I, V, N 또는 임의의 T 중의 하나). IVTNTT (CMS017)에 대한 동등한 펩티드의 또 다른 예는 동일한 생물학적 활성을 보유하는 하나 또는 2개의 아미노산 더 긴 것과 같은 약간 더 긴 펩티드이다. 더욱이, IVTNTT의 의학 적용에 대해 상기 기재된 질환 또는 질병이 구체적으로 면역 질환 및/또는 바이러스 감염을 인용하지만, 상기 의학 적용은 단지 비제한적인 예로서 이용되며, 특허청구범위를 제한하기 위해 이용되어서는 안 된다. IVTNTT 및 이의 기능성 유도체의 기타 가능한/의도된 용도, 예를 들면, 정상인 또는 임의의 감염을 갖는 환자의 면역계를 증진 또는 부스팅하기 위한 건강 식품 보조제로서의 용도가 존재한다는 것은 명백하다. 임의의 상기 용도가 또한 본 발명의 범위 내에 해당한다.

Claims

이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드를 포함하는 분리된 또는 정제된 펩티드.
제 1 항에 있어서, 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드로 본질적으로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리된 또는 정제된 펩티드.
제 2 항에 있어서, 상기 펩티드는 바이러스 질환의 증상을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 3 항에 있어서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염 감염인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩티드는 면역 자극 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 L-이소류실-L-발릴-L-트레오닐-L-아스파라기닐-L-트레오닐-L-트레오닌인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 실질적으로 순수한 형태인 것을 특징으로 하는 펩티드.
이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드를 포함하는 약학 조성물.
제 8 항에 있어서, L-이소류실-L-발릴-L-트레오닐-L-아스파라기닐-L-트레오닐-L-트레오닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드를 제공하는 단계 및 상기 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.
약학적 유효량의 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 인간 질환의 효과를 감소시키는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 인간은 바이러스 질환으로 고생하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
약학적 유효량의 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 개인의 면역계를 자극하는 방법.
약학적 화합물로서 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드의 용도.
제 15 항에 있어서, 상기 화합물은 바이러스 질환을 치료하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 16 항에 있어서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염 감염인 것을 특징으로 하는 용도.
면역 자극제로서 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드의 용도.
영양보조제로서 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드의 용도.
이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드의 증진된(enhanced) 유도체를 포함하는 분자로서, 상기 증진된 유도체는 상기 이소류실-발릴-트레오닐-아스파라기닐-트레오닐-트레오닌 펩티드에 작동가능하게 연결된 증진 분자를 포함하며, 상기 증진 분자는 상기 펩티드의 치료학적 유효성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 분자.