ES2320777T3 - Procedimiento de analisis mediante hibridacion molecular de acidos nucleicos y kit para la aplicacion de este procedimiento. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de análisis mediante hibridación molecular de ácidos nucleicos, que comprende las siguientes etapas: - extracción de muestras de material de origen vegetal sobre tejidos profundos mediante un dispositivo de extracción (1, 13) - secado de las muestras cargadas sobre los medios de extracción, - extracción de los ácidos nucleicos, que comprende una etapa de inmersión en un tampón de extracción de los medios de extracción (2, 15, 16) cargados con sus muestras respectivas de material de origen vegetal, caracterizado porque los medios de extracción comprenden una superficie externa abrasiva con asperezas aptas para hacer una incisión en la superficie de dicho material y para retener células procedentes de tejidos profundos de dicho material, los medios de extracción abrasivos comprenden una materia sólida seleccionada del grupo que consiste en sílice, vidrio, metales, fibras de carbono y materias plásticas.
Description
Procedimiento de análisis mediante hibridación
molecular de ácidos nucleicos y kit para la aplicación de este
procedimiento.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de análisis mediante hibridación molecular para
detectar la presencia de ácidos nucleicos y a un kit para la
aplicación de este procedimiento.
Entre los procedimientos de análisis mediante
hibridación molecular de ácidos nucleicos, la PCR (reacción en
cadena de la polimerasa) se utiliza cada vez más. Se prefiere a
métodos de análisis inmunológicos, tales como ELISA, y ello debido a
su mayor sensibilidad.
Además, la PCR permite desarrollar, en función
del objetivo buscado por el análisis, métodos dirigidos, de una
especificidad muy grande.
No obstante, hay ciertas limitaciones
específicas relacionadas con el uso de la PCR. Una parte importante
de estas limitaciones se refiere a los protocolos de preparación de
las muestras que van a analizarse.
En efecto, los materiales biológicos pueden
contener sustancias que son susceptibles de interferir con los
procesos de amplificación de la PCR.
Entre las sustancias que tienen un efecto
inhibidor de la PCR, se pueden citar por ejemplo, la hemoglobina
(bien procedente de ser humano o animal), y los polisacáridos y
compuestos fenólicos de los vegetales.
Los tejidos frescos son susceptibles de contener
cantidades importantes de tales inhibidores. Además, los fenómenos
de oxidación que se producen tras la extracción de esos tejidos
aumentan el efecto inhibidor de esas sustancias.
Para evitar lo más posible la oxidación de los
tejidos y la presencia de inhibidores durante los análisis de PCR,
habitualmente se usan técnicas de extracción y de purificación de
los ácidos nucleicos diana que permiten garantizar una reacción de
PCR óptima.
Así, pueden extraerse los ácidos nucleicos y
purificarlos a continuación mediante diferentes técnicas, tales como
por ejemplo, purificación por afinidad, filtración sobre gel o
precipitación mediante isopropanol/etanol.
Estas técnicas de extracción y de purificación
pueden durar hasta varios días y son costosas.
Por tanto, se vuelve progresivamente hacia
protocolos de análisis más sencillos que no necesitan una
purificación posterior de los ácidos nucleicos.
En un método del estado de la técnica, el
análisis de ácidos nucleicos se realiza sobre un extracto bruto de
material biológico triturado. La toma de muestras comprende una
extracción de tejido que va a analizarse sobre material fresco o
estabilizado (o bien mediante liofilización o bien mediante
congelación) y en cantidad bastante importante
(200-400 mg). Las muestras de tejidos extraídas
deben colocarse rápidamente en presencia del tampón de triturado.
Resulta igualmente imperativo mantenerlas lo más posible a baja
temperatura. Se tritura el tejido en una trituradora manual o
automática, lo que proporciona el extracto bruto, triturado. Se
centrifuga este extracto bruto y se recupera el sobrenadante para el
análisis. Por tanto puede realizarse este análisis mediante
hibridación molecular de ácidos nucleicos a partir de un extracto
representativo de la totalidad de los ácidos nucleicos del material
biológico extraído.
Desgraciadamente, esta técnica presenta el
inconveniente de que cuando se fragmentan los tejidos fuera del
tampón antes de la trituración, la oxidación de los inhibidores, muy
esparcidos en los tejidos (por ejemplo los compuestos fenólicos en
el caso de tejidos vegetales), aumenta considerablemente las
propiedades inhibidoras de la PCR del extracto bruto obtenido. Ésto
es tanto más molesto cuanto que no se prevé una etapa de
purificación de los ácidos nucleicos, ya que el trabajo se realiza
directamente a partir de este extracto bruto. Además, las reacciones
enzimáticas de las ARNasas y las ADNasas que intervienen pueden
perjudicar igualmente a la reacción de PCR deteriorando los ácidos
nucleicos diana.
Según esta técnica, debe trabajarse rápidamente
sobre una gran cantidad de material biológico fresco, o
alternativamente, tomar medidas pesadas y que consumen energía tales
como la liofilización o la congelación para la conservación de las
muestras.
Se ha propuesto, por ejemplo en el documento
EP-A-0 444 649, extraer una muestra
de material vegetal sobre una membrana adsorbente que se prensa
sobre un tejido fresco. Una membrana de este tipo puede ser por
ejemplo de nitrocelulosa, de nailon o de nailon modificado. Los
ácidos nucleicos deben fijarse sobre la membrana. No obstante, esta
técnica sigue siendo marginal y poco usada, ya que presenta
problemas en cuanto a la fiabilidad.
Por tanto, sigue siendo deseable encontrar un
procedimiento sencillo de análisis mediante hibridación de ácidos
nucleicos, que permita obtener resultados tan fiables como con el
estado de la técnica, aunque no haya purificación de ácidos
nucleicos. Es igualmente deseable proponer un procedimiento de este
tipo que permita trabajar con muestras de material biológico en poca
cantidad con respecto a las usadas tradicionalmente, y obtener una
buena conservación de las muestras sin tomar medidas
complicadas.
Ahora se ha encontrado sorprendentemente que,
según la invención, puede obtenerse un resultado de este tipo usando
un procedimiento de análisis mediante hibridación molecular de
ácidos nucleicos, tal como se describe en la reivindicación 1 que
comprende una etapa de extracción de muestras de tejidos profundos
de material biológico de origen vegetal mediante un dispositivo de
extracción que comprende medios de extracción abrasivos aptos para
retener material biológico en forma de células.
La presente invención se refiere por tanto a un
procedimiento de análisis mediante hibridación molecular de ácidos
nucleicos, que comprende las siguientes etapas:
- extracción de muestras de material de origen
vegetal sobre tejidos profundos mediante un dispositivo de
extracción (1, 13),
- secado de las muestras cargadas sobre los
medios de extracción,
- una etapa de extracción de los ácidos
nucleicos, que comprende una etapa de inmersión en un tampón de
extracción de los medios de extracción (2, 15, 16) cargados con sus
muestras respectivas de material de origen vegetal,
caracterizado porque los medios de extracción
comprenden una superficie externa abrasiva con asperezas aptas para
hacer una incisión en la superficie de dicho material y para retener
células procedentes de tejidos profundos de dicho material,
comprendiendo los medios de extracción abrasivos una materia sólida
seleccionada del grupo que consiste en sílice, vidrio, metales,
fibras de carbono y materias plásticas. En las reivindicaciones 2 a
13 se describen modos de realización particulares.
Por "medios de extracción abrasivos" se
entiende que se designan medios aptos para penetrar, bajo el efecto
de una presión, en la superficie del material biológico de origen
vegetal y para hacer una incisión en el mismo de manera que se
retiene material biológico en forma de células de los tejidos
profundos sobre dichos medios.
Tal como se ilustrará a continuación, se ha
constatado que las muestras extraídas por estos medios de extracción
abrasivos se deshidratan muy rápidamente al aire ambiental, no se
oxidan y pueden conservarse durante varias semanas. Igualmente se ha
constatado que los resultados de análisis obtenidos son tan fiables
varias semanas tras la extracción como si se realiza el análisis
inmediatamente.
Por "hibridación molecular" se entiende que
se designa, en el marco del presente texto, cualquier reacción de
apareamiento de dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla
cuyas secuencias son complementarias para formar una molécula de
cadena doble estable.
Por "PCR" o "reacción en cadena de la
polimerasa" se entiende que se designa, en el marco del presente
texto, cualquier técnica de hibridación molecular que permite
producir un número elevado de secuencias de ADN específicas a partir
de un genoma complejo. La PCR permite amplificar ADN o ARN diana y
revelarlo mediante técnicas de tinción, de marcaje mediante sondas
fluorescentes o radiactivas. Como ejemplos no limitativos, pueden
mencionarse la ICPCR, la RT-PCR y la PCR en tiempo
real.
Por "material biológico" se entiende que
designa, en el marco del presente texto, cualquier material de
origen vegetal.
Preferiblemente, la extracción de muestras de
material biológico del procedimiento según la invención se realiza
al aire ambiental. Se trabaja en una atmósfera no saturada en
humedad, preferiblemente una atmósfera seca.
Pueden dejarse sencillamente los medios
abrasivos cargados con sus muestras respectivas bajo el efecto de
este aire ambiental, lo que permitirá secarse la muestra de material
biológico y deshidratarse. Esta medida es suficiente para garantizar
una buena conservación de las muestras. Esto es muy ventajoso, ya
que no es obligatorio proceder sin interrupción al análisis mediante
hibridación de ácidos nucleicos.
También puede acentuarse el proceso de secado o
acelerarlo usando medios de secado complementarios tales como por
ejemplo, un dispositivo de ventilación de aire frío o caliente
(secador u otro) o aumentando la temperatura (paso sobre un
radiador, por ejemplo).
Gracias al procedimiento según la invención, la
extracción de muestras puede realizarse fuera de un laboratorio en
el que tendrá lugar el análisis. En este caso, el procedimiento
comprende una etapa de transporte de los medios de extracción
abrasivos cargados con sus muestras respectivas de material
biológico hacia dicho laboratorio.
Por tanto, para la extracción de muestras de
material biológico de origen vegetal, puede trabajarse en el campo
sin preocuparse por la posible degradación de las muestras, lo que
no sucede en el caso de otros métodos del estado de la técnica, que
necesitan medidas de conservación pesadas tales como la congelación
o la liofilización de las muestras.
Las muestras de material biológico recibidas en
el laboratorio sobre los medios de extracción abrasivos pueden
tratarse desde que se reciben, o según los imperativos y deseos de
la persona que realiza el análisis.
El procedimiento según la invención comprende
una etapa de extracción de los ácidos nucleicos, que comprende una
etapa de inmersión en un tampón de extracción de los medios de
extracción abrasivos cargados con sus muestras respectivas de
material biológico, una etapa de agitación en el tampón de
extracción, una etapa de separación y una etapa de recuperación de
jugo clarificado que contiene los ácidos nucleicos. Esta etapa de
separación consiste preferiblemente en una centrifugación, cuyo
sobrenadante constituye el jugo clarificado.
Preferiblemente, el análisis mediante
hibridación molecular se realiza mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
El análisis mediante hibridación molecular de
ácidos nucleicos del procedimiento según la invención puede
realizarse con vistas a determinar la presencia de un agente
patógeno en el material biológico. El material biológico consiste en
material de origen vegetal. La invención encuentra por tanto una de
sus aplicaciones en el campo del diagnóstico de enfermedades de las
plantas.
El procedimiento según la invención también
puede usar un kit para la puesta en práctica del procedimiento de
análisis de la invención. Este kit comprende un dispositivo de
extracción que comprende medios de extracción abrasivos aptos para
retener material biológico en forma de células.
Estos medios de extracción pueden comprender una
materia sólida que presenta una superficie externa abrasiva, por
ejemplo, sílice, vidrio, metales, fibras de carbono y materias
plásticas y cualquier otra materia apropiada, así como las mezclas
de estas materias. La superficie externa abrasiva comprende
asperezas aptas para retener células de material biológico, por
ejemplo puntas, ganchos o cerdas. Los cepillos con cerdas duras son
convenientes como medio de extracción abrasivo en el sentido del
presente texto.
Los medios de extracción abrasivos del
dispositivo de extracción de muestras de material biológico del kit
pueden ser rígidos o flexibles (papel de vidrio), o alternativamente
el dispositivo de extracción puede comprender un soporte apto para
soportar los medios de extracción abrasivos.
El kit comprende medios de transporte de los
medios de extracción abrasivos, por ejemplo una bolsa que comprende
de pequeños envases para colocar individualmente las muestras
secadas según la invención sobre los medios de extracción
abrasivos.
El kit comprende preferiblemente medios de
identificación que permiten la trazabilidad de las muestras. Estos
medios pueden tomar cualquier forma adecuada (inscripciones, código
de barras) y colocarse sobre el medio de transporte o sobre el
soporte o en ciertos casos incluso los medios de extracción
abrasivos (por ejemplo en el reverso de un papel de vidrio).
Los kits tal como se describieron anteriormente
están destinados a muestreadores, que no realizan necesariamente
ellos mismos el análisis mediante hibridación molecular de ácidos
nucleicos. El procedimiento usa igualmente kits para las personas
que hacen un análisis de este tipo. El kit comprende entonces
diferentes reactivos necesarios para este análisis, dado el caso
tampón de extracción para el análisis mediante hibridación de ácidos
nucleicos y cualquier reactivo necesario, por ejemplo reactivos
específicos de las reacciones de PCR.
Por tanto, por ejemplo el kit puede comprender
además los reactivos necesarios para análisis universales mediante
RT-PCR tales como: el Kit Titan One Tube
RT-PCR (Roche) así como las normas que deben seguir
para definir los cebadores de amplificación y sondas específicas que
van a incluirse según las necesidades en este protocolo
optimizado.
Puede comprender además los reactivos necesarios
para análisis específicos mediante PCR para la detección de uno o
varios agentes patógenos en material vegetal, es decir: los pares de
cebadores que seleccionan como diana un patógeno o una asociación de
patógenos tales como:
PNRSV 10F y PNRSV 10R para la detección del
virus de la mancha anular necrótica del ciruelo,
ASGV 5F y ASGV 5R para la detección del virus de
la madera asurcada del manzano,
PDV 17F y PDV 12R para la detección del virus de
la degeneración del ciruelo,
ASPV 4F y ASPV 4R para la detección del virus de
la madera estriada del manzano,
ApMV 1F y ApMV 1R para la detección del virus
del mosaico del manzano,
ACLSV 5F y ACLSV 8R para la detección del virus
de la mancha clorótica de la hoja del manzano.
\newpage
La invención se ilustrará a continuación
mediante la descripción de ejemplos de realización, con referencia a
las figuras adjuntas, en las que:
la figura 1 es una vista en corte transversal de
una primera forma de realización de un dispositivo de extracción
concebido para la puesta en práctica de un procedimiento según la
invención;
las figuras 2 y 3 ilustran un medio de
clasificación y de transporte de muestras extraídas gracias al
dispositivo de extracción ilustrado en la figura 1, y
la figura 4 ilustra una segunda forma de
realización de un dispositivo de extracción concebido para la puesta
en práctica de un procedimiento según la invención.
Se realiza un análisis mediante hibridación de
ácidos nucleicos según la invención extrayendo con tiempo seco
muestras de ramas de árboles frutales que van a enviarse al
laboratorio con vistas a detectar la presencia de un agente
fitopatógeno mediante análisis de RT-PCR.
En este ejemplo de realización, se usa un
dispositivo de extracción 1 representado en la figura 1. El papel de
vidrio 2 comercializado con la denominación S.A.M. Corindon Extra
Grain 60 está integrado en una caja 3 que puede sujetarse fácilmente
con la mano y que presenta una superficie plana 4 sobre la que se
fija el papel de vidrio 2 por medio de un dispositivo de fijación 5,
que puede ser una banda adhesiva, un papel Velcro o cualquier otro
sistema de fijación. La caja 3 contiene una devanadera 6 que permite
liberar a medida que se realiza la toma de muestras de nuevas
superficies de papel de vidrio virgen, después de que la cuchilla 7
ha cortado el papel de vidrio cargado de la muestra de material
biológico. El papel de vidrio virgen se deposita sobre una zona de
extracción de muestras 8. Se prevé una zona 9 que no se cubre de
muestra de material biológico en el extremo del papel de vidrio. El
usuario puede coger esta zona 9 entre los dedos lo que permite
despegar el papel de vidrio que está cubierto por material biológico
en su zona 8 y obtener su corte por la cuchilla 7.
Se realizan tres extracciones en un huerto sobre
ramas de un cerezo infectado por el PNRSV. Se realiza una extracción
sobre una rama de un año, mediante un movimiento rectilíneo apoyado,
aplicado transversalmente con respecto al sentido de las fibras
vegetales. El movimiento de rozamiento contra la rama debe
continuarse hasta que aparece la madera del núcleo de la rama. En
este momento, están retenidos fragmentos de tejidos vasculares sobre
el papel de vidrio (también denominado papel de lija o papel
abrasivo).
Tras cada extracción, se desprende el papel de
vidrio 2 cargado con tejido de cerezo de la caja 3 por medio de la
cuchilla 7 tal como se describió anteriormente.
Es suficiente con dejar este papel de vidrio
cargado algunos instantes al aire ambiental para que se constate la
deshidratación. Los fragmentos de tejidos subcorticales extraídos
sobre la rama de cerezo se secan rápidamente sobre el papel de
vidrio y permanecen totalmente verdes.
El usuario puede entonces tomar cada muestra
recogida por la zona 9 prevista sobre el papel de vidrio 2 y
colocarla, tal como se ilustra en la figura 3, en uno de los envases
10 de una bolsa de transporte 11 prevista para ello. Una vez llenas
de muestras, se cierran las bolsas 11 plegando su parte superior,
que está dotada de un papel adhesivo 12, protegido por una banda de
papel no representada, que se retira justo antes de cerrar la
bolsa.
Tal como se observa en la figura 3, una vez
cerrada la bolsa 11, la cara girada hacia el usuario comprende zonas
que permiten una identificación precisa de las muestras gracias a
signos distintivos que pueden ser indicaciones manuscritas
referentes a la fecha de extracción, el solicitante del análisis, el
tipo de análisis, el origen y el número de las muestras, o incluso
un código de barras. De esta manera, se garantiza la trazabilidad de
la muestra. Entonces puede insertarse la bolsa en un sobre postal
para un envío al laboratorio por correo.
Tras la recepción en el laboratorio, se retiran
delicadamente los papeles de vidrio 2 cargados con el material
vegetal que va a analizarse de la bolsa 11 por su zona 9 y se
colocan individualmente en el fondo de un tubo de vidrio de 15 ml
con tapón roscado que contiene 1,5 ml de tampón de extracción SCPAP
(descrito en Minsavage et al., 1994. Development of a
polymerase chain reaction protocol for detection of Xylella
fastidiosa in plant tissue. Phytopathology 84:
138-142).
Se agita cada tubo con vórtex durante 30
segundos para liberar los fragmentos de tejidos presentes sobre el
papel de vidrio y a continuación se deja en incubación a 4ºC durante
10 minutos. Se recuperan 500 \mul de jugo en un tubo Eppendorf de
1,5 ml y se centrifugan a 10.000 RPM durante 5 minutos. Se recuperan
10 \mul del jugo clarificado (o sobrenadante) y se diluyen en 990
\mul de agua destilada.
Se añaden 2 \mul del jugo diluido a los 23
\mul de la mezcla de RT-PCR compuesta basándose en
el Kit TITAN One tube RT-PCR (Roche) y siguiendo las
recomendaciones del fabricante a la que se añadieron los 0,5 \mul
de cada cebador PNRSV 10F (TTC TTG AAG GAC CAA CCG AGA GG) y PNRSV
10R (GCT AAC GCA GGT AAG ATT TCC AAG C) a 20 \muM. A continuación
se someten los tubos a la reacción de RT-PCR en un
termociclador Mastercycler (Eppendorf) según el ciclo de 30 minutos
a 50ºC, 5 minutos a 94ºC, 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC, 1
minuto a 72ºC (estas tres últimas etapas se repiten 35 veces)
después 10 minutos a 72ºC.
Se revelan los productos de amplificación sobre
un gel de agarosa al 1,5% con tinción con bromuro de etidio. Las
bandas específicas a 348 pb están presentes para las 3 extracciones
realizadas.
Las muestras pueden analizarse directamente tras
su llegada al laboratorio, o conservarse en su bolsa 11 a
temperatura ambiente para un análisis posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza la extracción de las muestras de la
misma manera que en el ejemplo 1 anterior.
Por el contrario, se aplica un protocolo de
extracción y de purificación de los ácidos nucleicos totales según
el protocolo de S. Spiegel, S.W. Scott, V.
Bowman-Vance, Y. Tam, N.N. Galiakparov y A. Rosner
1996. Improved detection of Prunus necrotic ringspot virus by the
polymerase chain reaction. Eur. J. PI. Pathol. 102:
681-685. Se colocan los papeles de vidrio cargados
con material vegetal en un tubo Falcon de 15 ml que contiene 2 ml
del tampón de extracción descrito. Tras agitación vigorosa durante 1
minuto a 4ºC, se recuperan 500 \mul del jugo extraído con vistas a
una extracción según el protocolo descrito por Spiegel et
al., 1996.
A modo de comparación, se realiza igualmente una
extracción idéntica de ácidos nucleicos totales según un protocolo
clásico de extracción de muestras, es decir; la poda con podadora,
en el campo, de ramas.
Para garantizar la validez de la prueba, se
seleccionan las mismas ramas que sobre las que ya se ha realizado la
toma de muestras gracias al dispositivo de extracción 1 de la
invención.
Se llevan estas ramas al laboratorio en el que
se realiza un descortezado superficial de cada una de ellas sobre
aproximadamente 5 cm de longitud con ayuda de una cuchilla de
escalpelo nº 3 para eliminar la corteza. Sobre la misma zona, con
ayuda de una cuchilla de escalpelo nº 4, se raspan los tejidos
vasculares hasta la madera del núcleo para obtener aproximadamente
400 mg de estos tejidos. Se recogen, se pesan y se colocan en una
bolsa de trituración de plástico dotada en el interior de una red de
nailon, con adición de 10 veces el volumen de tampón de extracción
descrito por Spiegel et al., 1996 (es decir 4 ml para 400 mg
de tejidos). Se realiza la trituración por medio de un
homogeneizador de bolas de tipo Holmex hasta la obtención de una
desestructuración completa de los tejidos. Se recuperan 500 \mul
del macerado con vistas a una extracción según el protocolo
descrito. Todas estas operaciones de descortezado, raspado,
recogida, pesado y triturado deben desarrollarse lo más rápidamente
posible dejando permanentemente los tejidos extraídos a baja
temperatura (de 1 a 2ºC).
Tras las etapas de extracción, se mide la
densidad óptica de las disoluciones de ácidos nucleicos procedentes
de los dos modos de extracción con un espectrofotómetro (LKB
Biochrom Ultrospec II, UK) a 260 nm y 280 nm con el fin de
determinar la concentración de las disoluciones y el grado de
pureza.
Tal como se observa en la tabla 1 a
continuación, las extracciones realizadas con el dispositivo de
extracción 1 de la invención proporcionan concentraciones en ácidos
nucleicos totales (ANT) de 215 \mug/ml, 72 \mug/ml y 222
\mug/ml con grados de pureza respectivos de 1,34, 1,55 y 1,34. Las
extracciones realizadas de manera clásica proporcionan
concentraciones en ácidos nucleicos totales de 138 \mug/ml, 119
\mug/ml y 86 \mug/ml con grados de pureza respectivos de 1,56,
1,36 y 1,48.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos muestran que la
extracción realizada según la invención permite obtener una
concentración en ácidos nucleicos totales comparable a la de la
técnica clásica, y que en cuanto al grado de pureza, la calidad de
los ácidos nucleicos totales extraídos es similar.
Para la reacción de amplificación, se añaden 2
\mul de los ácidos nucleicos totales diluidos 100 x a los 23
\mul de la mezcla de RT-PCR compuesta basándose en
el Kit TITAN One tube RT-PCR (Roche) y siguiendo la
recomendación del fabricante a la que se han añadido los 0,5 \mul
de cada cebador PNRSV 10F (TTC TTG AAG GAC CAA CCG AGA GG) y PNRSV
10R (GCT AAC GCA GGT AAG ATT TCC AAG C) a 20 \muM. A continuación
se someten los tubos a la reacción de RT-PCR en un
termociclador Mastercycler (Eppendorf) según el ciclo de 30 minutos
a 50ºC, 5 minutos a 94ºC, 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC, 1
minuto a 72ºC (estas tres últimas etapas se repiten 35 veces)
después 10 minutos a 72ºC.
Se revelan los productos de amplificación sobre
un gel de agarosa al 1,5% con tinción con bromuro de etidio. Las
bandas específicas a 348 pb están presentes tanto para las 3
extracciones realizadas según la invención como para las 3
extracciones clásicas.
Tal como se observa en la figura 4, en este
ejemplo de realización de la invención se ha usado un dispositivo de
extracción 13 más particularmente adaptado para la extracción de
muestras sobre tejidos profundos.
El dispositivo 13 está constituido por un
estilete 14 de plástico rígido o de metal de 4 cm de longitud y de 3
mm de diámetro en el que uno de sus extremos está constituido por un
cono 15 de 0,5 cm de diámetro en la base y de 1 cm de longitud. El
cono 15 está dotado de asperezas 16 en forma de cucharas puntiagudas
de 1 mm de altura, repartidas en la superficie del mismo.
El estilete 14 está fijado en el mandril de una
microtaladradora 15. Se realiza la extracción mediante rotación a
velocidad muy baja (500 RPM) del estilete 14 que penetra en el
nervio principal 18 de la hoja del platanero 19. La rotación dura
aproximadamente de 1 a 2 segundos.
A continuación se recupera el estilete 14
cargado de material vegetal, se desprende de los tejidos sobrantes,
se deja secar algunos instantes al aire ambiental. Se realiza una
segunda extracción de la misma manera con un segundo estilete. Se
colocan los estiletes en una bolsa del tipo de la bolsa 11 mostrada
en la figura 3 y se dejan a temperatura ambiente antes de su
transporte hacia el laboratorio.
En paralelo y a modo de comparación, se corta un
trozo de 5 cm de longitud con un escalpelo en el nervio principal de
la misma hoja 19 y se congela inmediatamente a la espera de su
transporte hacia el laboratorio.
Desde la recepción en el laboratorio, se coloca
uno de los dos estiletes cargado con material vegetal en un tubo
Falcon de 15 ml que contiene 3 ml de tampón de extracción (NaCl 137
mM, Na_{2}HPO_{4} 8 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, KCl 2,7 mM,
NaN_{3} 3 mM, Tween 20 al 0,05% y Na_{2}SO_{3} 80 mM, pH de
7,2 a 7,4).
Se conserva el segundo estilete en la bolsa a
temperatura ambiente durante cuatro semanas para un análisis
posterior.
Se agita el tubo Falcon con vórtex durante 1
minuto para liberar los fragmentos de tejidos y a continuación se
deja en incubación a 4ºC durante 5 minutos. Se recuperan 500 \mul
de jugo en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugan a 7000 RPM
durante 10 minutos. Se recuperan 100 \mul del sobrenadante
clarificado y se diluyen en 900 \mul de agua destilada.
Se añade 1 \mul del jugo diluido a los 49
\mul de la mezcla PCR compuesta por 0,2 mM de cada dNTP, 1 unidad
de Taq ADN polimerasa (Roche), 1,4 x tampón de PCR, MgCl_{2} 2 mM
(concentración final), 0,28 \muM de cada cebador y 0,1 \muM de
las sondas de MGB tal como se definen en M. Delanoy, M. Salmon, y J.
Kummert, 2003. Development of Real-Time PCR for
the Rapid Detection of Episomal Banana streak virus (BSV). Plant
disease 87: 33-38. A continuación se someten los
tubos a la reacción de PCR con detección en tiempo real en un
termociclador GeneAmp 5700 Sequence Detection (Applied Biosystems)
según el ciclo de 1 minuto a 95ºC, 30 segundos a 95ºC, 20 segundos a
53ºC, 1 minuto a 60ºC (estas tres últimas etapas se repiten 50
veces).
Se convierte la intensidad de fluorescencia
medida en el transcurso de los ciclos en una gráfica y se determina
el valor del Ct (ciclo a partir del cual la intensidad de
fluorescencia pasa por encima del umbral).
Se llevan a cabo ensayos comparativos entre una
extracción clásica (trituración de 400 mg de nervios congelados de
hoja de platanero en 4 ml del mismo tampón de extracción por medio
de un homogeneizador Holmex) y el ejemplo 2 de la invención tal como
se describió anteriormente.
Además, cuatro semanas tras este primer análisis
se realizó una nueva preparación del extracto bruto de la misma
manera con el segundo estilete que se había conservado a temperatura
ambiente en la bolsa y con 400 mg de nervio congelado.
Tal como se indica en la tabla 2 a continuación,
los resultados para la preparación clásica y la invención se
facilitan respectivamente mediante valores de Ct (ciclo umbral que
corresponde a un umbral de 0,025) de 35 y de 30 el día de la
extracción y de 35 y 31, cuatro semanas tras la extracción. Los
valores finales de fluorescencia son respectivamente de 0,21 y 0,30
el día de la extracción y de 0,19 y 0,28 cuatro semanas tras la
extracción.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, se constata que la invención permite
obtener una señal de fluorescencia más precoz y un valor final más
elevado que con la técnica clásica. Además los resultados obtenidos
con el material preparado cuatro semanas antes son tan buenos como
los obtenidos el día de la extracción.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra de qué manera puede
aplicarse concretamente el procedimiento de análisis mediante
hibridación molecular de ácidos nucleicos según la invención para un
laboratorio de diagnóstico de fitopatología. El dispositivo de
extracción empleado aquí está constituido por un rectángulo sencillo
de 1,5 x 3 cm cortado en papel de vidrio GUMIC P 100.
En efecto, las condiciones de trabajo son tales
que no es necesario disponer de un distribuidor, ni penetrar en
capas profundas de tejidos. Por tanto, una forma simplificada de
dispositivo de extracción según la invención es suficiente.
Se deposita la rama sobre un plano de trabajo
delante del operario que sujeta el extremo, se mantiene el papel de
vidrio bajo el índice de la mano libre del operario que aplica, con
una ligera presión, un rozamiento transversal con respecto al eje
longitudinal de la rama. Se continúa el rozamiento hasta que se
alcanza la madera del núcleo. Esta extracción corresponde a
aproximadamente 30 mg de tejidos. A continuación se coloca el papel
de vidrio cargado de los tejidos vegetales en el fondo de un tubo de
vidrio de 15 ml con tapón roscado que contiene 1 ml de tampón de
extracción TE a 4ºC (Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM). Se preparan
todas las ramas de la misma forma.
Se agita el tubo con vórtex durante 30 segundos
para liberar los fragmentos de tejidos y a continuación se deja en
incubación a 4ºC durante 10 minutos. Se recuperan 500 \mul de jugo
en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugan a 10.000 RPM durante
5 minutos. Se recuperan 10 \mul del sobrenadante clarificado y se
diluyen en 990 \mul de agua destilada.
Se añaden 2 \mul del jugo diluido a los 23
\mul de la mezcla de RT-PCR compuesta basándose en
el Kit TITAN One tube RT-PCR (Roche) y siguiendo la
recomendación del fabricante a la que se añadieron los 0,5 \mul de
cada cebador a 20 \muM (ASGV5F y ASGV5R) tal como se definió en J.
Kummert, M. Vendrame, S. Steyer y P. Lepoivre, 2000. Development
of routine RT-PCR tests for certification of fruit
tree multiplication material. EPPO Bulletin 30:
441-448.
A continuación se someten los tubos a la
reacción de RT-PCR en un termociclador Mastercycler
(Eppendorf) según el ciclo de 30 minutos a 50ºC, 5 minutos a 94ºC,
30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC, 1 minuto a 72ºC
(repitiéndose estas tres últimas etapas 35 veces) y después 10
minutos a 72ºC.
Se revelan los productos de amplificación sobre
un gel de agarosa al 1,5% con tinción con bromuro de etidio. La
banda específica se sitúa a una altura de 344 pb.
Se constata que estos resultados son tan
convincentes como los realizados con un método clásico a partir de
un material vegetal fresco.
Tal como puede constatarse tras la lectura de lo
anterior, el procedimiento de análisis según la invención, gracias a
la etapa de extracción de muestras de material biológico mediante
medios de extracción abrasivos limita muy eficazmente los fenómenos
de oxidación. Los ácidos nucleicos diana presentes en los tejidos
vegetales de los que se toman muestras no deben colocarse
directamente en presencia de medio líquido tamponado (al contrario
que el trabajo con tejidos frescos).
El procedimiento según la invención sólo
necesita la extracción de 20 a 40 mg de material biológico, es decir
de 5 a 10 veces menos que la técnica clásica.
Debe observarse que, aunque el procedimiento de
la invención permite un trabajo en laboratorio sobre un extracto
bruto, evidentemente no se saldrá del marco de la misma si se
realizan etapas de purificación complementarias.
En lo que se refiere a las muestras, pueden
analizarse una a una o agrupadas para un análisis común, en función
de las finalidades buscadas.
Claims (13)
1. Procedimiento de análisis mediante
hibridación molecular de ácidos nucleicos, que comprende las
siguientes etapas:
- -
- extracción de muestras de material de origen vegetal sobre tejidos profundos mediante un dispositivo de extracción (1, 13)
- -
- secado de las muestras cargadas sobre los medios de extracción,
- -
- extracción de los ácidos nucleicos, que comprende una etapa de inmersión en un tampón de extracción de los medios de extracción (2, 15, 16) cargados con sus muestras respectivas de material de origen vegetal,
caracterizado porque los
medios de extracción comprenden una superficie externa abrasiva con
asperezas aptas para hacer una incisión en la superficie de dicho
material y para retener células procedentes de tejidos profundos de
dicho material, los medios de extracción abrasivos comprenden una
materia sólida seleccionada del grupo que consiste en sílice,
vidrio, metales, fibras de carbono y materias
plásticas.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la extracción de muestras de material de
origen vegetal se realiza al aire ambiental.
3. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la extracción de
muestras se realiza fuera de un laboratorio en el que tendrá lugar
el análisis, y porque el procedimiento comprende una etapa de
transporte de los medios de extracción abrasivos (2, 15, 16)
cargados con sus muestras respectivas de material de origen vegetal
hacia dicho laboratorio.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de
extracción de los ácidos nucleicos, comprende
- -
- una etapa de agitación en el tampón de extracción
- -
- una etapa de separación, y
- -
- una etapa de recuperación de jugo clarificado que contiene los ácidos nucleicos.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque la etapa de separación consiste en una
centrifugación, cuyo sobrenadante constituye el jugo
clarificado.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el análisis
mediante hibridación molecular se realiza mediante reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el análisis
mediante hibridación molecular de ácidos nucleicos se realiza con
vistas a determinar la presencia de un agente patógeno en el
material de origen vegetal.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de un
kit para la puesta en práctica del procedimiento, comprendiendo el
kit un dispositivo de extracción (1, 12) que comprende dichos medios
de extracción abrasivos (2, 14, 15) aptos para retener material de
origen vegetal en forma de células.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque el dispositivo de extracción (2, 13)
comprende un soporte (3, 5, 6, 14, 17) apto para soportar los medios
de extracción abrasivos (2, 15, 16).
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 9, caracterizado porque el kit comprende
medios de transporte (11) de los medios de extracción abrasivos (2,
15, 16).
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque el kit
comprende medios de identificación de los medios de extracción
abrasivos.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque el kit
comprende tampón de extracción para el análisis mediante hibridación
de ácidos nucleicos.
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque el kit
comprende reactivos específicos de las reacciones de PCR.
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