PT1687610E - Processo de análise por hibridação molecular de ácidos nucleicos, e estojo para a aplicação deste processo - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PROCESSO DE ANÁLISE POR HIBRIDAÇÃO MOLECULAR DE ÁCIDOS NUCLEICOS, E ESTOJO PARA A APLICAÇÃO DESTE PROCESSO" A invenção presente diz respeito a um processo de análise por hibridação molecular para detectar na amostra a presença de ácidos nucleicos, e a um estojo para a aplicação destes processo.

Entre os processos de análise de ácidos nucleicos por hibridação molecular, a PCR (reacção da polimerase em cadeia) é utilizada cada vez mais frequentemente. Ela é preferida a métodos imunológicos de análise, tais como o ELISA, e isto porque apresenta uma sensibilidade muito superior.

Por outro lado, a PCR permite o desenvolvimento, consoante a finalidade do processo analítico, dos métodos pretendidos, que têm uma especificidade muito elevada.

No entanto, existem determinadas limitações específicas ligadas à utilização da PCR. Uma parte importante dessas limitações diz respeito aos protocolos de obtenção das amostras que se vão analisar.

Com efeito, os materiais biológicos podem conter substâncias que são susceptíveis de interferir com os processos de amplificação da PCR. 2

Os tecidos frescos são susceptíveis de conter quantidades importantes de tais inibidores. Para além disto, os fenómenos de oxidação que ocorrem após a colheita desses tecidos contribuem para aumentar o efeito inibidor dessas substâncias.

Para evitar tanto quanto possível a oxidação dos tecidos e a presença de inibidores durante as análises por PCR, utilizam-se habitualmente técnicas de extracção e a purificação dos ácidos nucleicos alvo que permite garantir uma reacção óptima por PCR.

Deste modo, podem extrair-se os ácidos nucleicos e purificar-se em seguida por diferentes técnicas, como por exemplo, uma purificação por afinidade, uma filtração sobre gel ou uma precipitação por isopropanol/etanol.

Estas técnicas de extracção e de purificação podem durar até diversos dias, e são caras.

Por estas razões alterámos a nossa atenção progressivamente para a consideração de protocolos de análise mais simples que não necessitassem de purificação ulterior dos ácidos nucleicos.

Num método incluído no estado da técnica, a análise de ácidos nucleicos é efectuada sobre um extracto do material biológico em bruto, após moenda. A amostragem inclui a recolha de amostras de tecido a analisar a partir de material fresco ou estabilizado (quer por liofilização, 3 quer por congelação) e em quantidade suficientemente importante (200 - 400 mg) . As amostras de tecidos que se obtiveram devem ser rapidamente colocadas em presença de um tampão de moenda. É igualmente obrigatório mantê-las tanto quanto possível a baixas temperaturas. Mói-se o tecido num aparelho de moenda manual ou automatizado, obtendo-se assim o extracto bruto, moído. Centrifuga-se este extracto bruto e recupera-se para análise o sobrenadante. Pode deste modo levar-se a cabo esta análise por hibridação molecular de ácidos nucleicos a partir de um extracto representativo da totalidade dos ácidos nucleicos do material biológico amostrado.

Infelizmente, esta técnica tem o inconveniente de que quando os tecidos são fragmentados na ausência do tampão e antes da moenda, a oxidação dos inibidores que se encontram largamente dispersos através dos tecidos (por exemplo os compostos fenólicos no caso de os tecidos serem vegetais), aumenta de forma considerável as propriedades inibitórias da PCR no extracto em bruto que se obtém. Isto é sobretudo muito prejudicial porque não está previsto incluir-se um passo de purificação dos ácidos nucleicos, uma vez que o trabalho é levado a cabo a partir do referido extracto em bruto. Para além disto, as reacções enzimáticas das ARNases e das ADNases que intervêm também podem interferir prejudicando a reacção de PCR por deteriorarem os ácidos nucleicos que são o seu alvo.

Para utilizar esta técnica é necessário trabalhar rapidamente com uma grande quantidade de material biológico 4 fresco, ou em alternativa, recorrer a meios pesados em termos de consumo energético tal como a liofilização ou a congelação, para a conservação das amostras.

Foi proposto, por exemplo na EP-A-0 444.649, que se obtivesse uma amostra de material vegetal sobre uma membrana adsorvente que se comprimisse sobre um tecido fresco. Uma tal membrana pode ser por exemplo em nitrocelulose, em nylon ou em nylon modificado. Os ácidos nucleicos devem ficar fixados sobre a membrana. No entanto, esta técnica permanece marginal e pouco utilizada, porque pões problemas em termos de fiabilidade.

Encontrar um processo simples de análise ácidos nucleicos por hibridação continua portanto a ser um objectivo actual, permitindo obter resultados tão fiáveis como quando se utiliza o estado actual da técnica, mesmo não sendo necessário purificar os ácidos nucleicos. É igualmente desejável propor um tal procedimento que permita trabalhar com amostras de material biológico em pequena quantidade em relação às quantidades tradicionalmente utilizadas, obtendo-se uma boa conservação das amostras sem ter que recorrer a medidas mais complicadas.

Verificou-se agora de forma surpreendente que era possível, de acordo com a invenção, obter este tipo de resultado utilizando um processo de análise por hibridação molecular de ácidos nucleicos, tal como o que se descreve na reivindicação 1, que inclui um passo de obtenção de amostras de tecidos profundos de material biológico com 5 origem vegetal, por um dispositivo de amostragem que inclui meios de obtenção abrasivos que são capazes de reter material biológico sob a forma de células. A invenção presente diz portanto respeito a um processo de análise de ácidos nucleicos por hibridação molecular, que inclui os seguintes passos: • obtenção de amostras de material com origem vegetal a partir de tecidos profundos recorrendo a um dispositivo de amostragem (1, 13) , • secagem das amostras carregadas sobre meios de amostragem, • um passo de extracção dos ácidos nucleicos, que inclua um passo de imersão das amostras carregadas sobre os seus meios num tampão de extracção (2, 15, 16), contendo as respectivas amostras de materiais com origem vegetal, caracterizado por os meios de amostragem incluírem uma superfície externa abrasiva com asperezas próprias para provocarem incisões na superfície do material vegetal referido e apta para reter células provenientes de tecidos profundos do material referido, incluindo ainda os meios de amostragem referidos um material sólido seleccionado de entre o conjunto constituído por sílica, vidro, metais, fibras de carbono e materiais plásticos. São 6 descritos nas reivindicações 2 a 13 modos de realizaçao específicos. A expressão "meios de amostragem abrasivos" pretende designar meios aptos para penetrar, sob o efeito de uma pressão, através da superfície do material biológico com origem vegetal praticando nela uma incisão de modo que seja retido nos meios referidos material biológico sob a forma de células dos tecidos profundos.

Tal como se ilustrará adiante neste documento, a constatou-se que as amostras obtidas por esses meios de amostragem abrasivos se desidratam muito rapidamente ao ar ambiente, não se oxidam, e podem conservar-se durante diversas semanas. Também se constatou que os resultados das análises obtidas são fiáveis durante diversas semanas após a obtenção apenas quando a análise é feita imediatamente após a sua obtenção.

Por "hibridação molecular" pretende significar-se no quadro do texto presente toda e qualquer reacção de emparelhamento de duas moléculas de ácido nucleico de cadeia simples cujas sequências são complementares, para formar uma molécula estável com dupla cadeia.

Por "PCR" ou "reacção de polimerase em cadeia" entende designar-se no quadro do documento presente qualquer técnica de hibridação molecular que permita produzir um grande número de sequências de ADN específicas a partir de um genoma complexo. A PCR permite amplificar 7 ADN alvo e revelá-lo por técnicas de coloração, de marcação com sondas fluorescentes, ou radioactivas. Como exemplos não limitativos, podem citar-se a PCR de IC, a RT-PCR, e a PCR em tempo real.

Por “material biológico", entende-se designar no quadro do texto presente qualquer material com origem vegetal.

De preferência, a colheita de amostras de material biológico do processo de acordo com a invenção é levada a cabo ao ar ambiente. Trabalha-se numa atmosfera não saturada em humidade, preferivelmente uma atmosfera seca.

Podem deixar-se simplesmente os meios abrasivos já carregados com as suas amostras respectivas à acção do ar ambiente, o que permitirá às mostras de material biológico secar, e sofrer desidratação. Esta metodologia é suficiente para assegurar uma boa conservação das amostras. Isto é muito vantajoso, porque não é obrigatório levar-se a cabo a análise por hibridação de ácidos nucleicos imediatamente a seguir.

Pode também acentuar-se o processo de secagem ou acelerá-lo utilizando meios de secagem suplementares tais como, por exemplo, um dispositivo de circulação forçada de ar quente ou frio (secador de cabelos ou outro dispositivo), ou um aumento da temperatura (por exemplo passagem por um radiador).

Graças ao processo de acordo com a invenção, a obtenção de amostras pode ser levada a cabo fora do laboratório aonde ocorrerá a análise. Neste caso, o processo inclui um passo de transporte dos meios de amostragem abrasivos carregados com as amostras respectivas de material biológico, para o laboratório referido.

Para a colheita de amostras de material biológico com origem vegetal, pode portanto trabalhar-se no campo sem preocupação quanto à possibilidade de degradação das amostras, o que não é o caso para outros métodos que integram o estado da técnica, que obrigam a medidas de conservação caras, tais como a congelação ou a liofilização das amostras.

As amostras de material biológico recebidas no laboratório sobre os meios de colheita abrasivos podem ser tratadas a partir da sua recepção, ou consoante os imperativos e as preferências da pessoa que vai efectuar a análise. 0 processo de acordo com a invenção comporta um passo de extracção dos ácidos nucleicos, que inclui um passo de imersão num tampão de extracção dos meios de colheita abrasivos carregados com as suas amostras respectivas de material biológico, um passo de agitação no tampão de extracção, um passo de separação, e um passo de recuperação do extracto clarificado que contém os ácidos nucleicos. Este passo de separação consiste de preferência 9 numa centrifugação, cujo sobrenadante constitui o extracto clarificado.

De preferência, a análise por hibridação molecular faz-se por reacção em cadeia com polimerase (PCR). A análise dos ácidos nucleicos por hibridação molecular do processo de acordo com a invenção pode ser levada a cabo para se determinar a presença de um agente patogénico no material biológico. 0 material biológico consiste em material de origem vegetal. A invenção tem portanto uma das suas aplicações no domínio do diagnóstico das doenças das plantas. 0 processo de acordo com a invenção também pode recorrer a um estojo para se levar a cabo este processo de análise da invenção. Este estojo contém um dispositivo de colheita gue inclui meios de colheita abrasivos aptos para reter material biológico sob a forma de células.

As escovas com pelos duros sao

Estes meios de colheita podem incluir um material sólido que apresente uma superfície externa abrasiva, por exemplo, a sílica, o vidro, os metais, as fibras de carbono e os materiais plásticos bem como qualquer outro material adequado, bem como as misturas destes materiais. A superfície abrasiva externa inclui asperezas aptas para reter células de material biológico, por exemplo pontas, anzóis, ou pelos. 10 convenientes a título de meios de colheita abrasivos, no sentido que se pretende no texto presente.

Os meios de colheita abrasivos do dispositivo de colheita de amostras de material biológico do estojo podem ser rígidos ou flexíveis (papel de vidro), ou alternativamente o dispositivo de colheita pode incluir um suporte apto para suportar os meios abrasivos de colheita de amostras. O estojo inclui meios para transportar os meios abrasivos de colheita de amostras, por exemplo um bolso no qual existam pequenas cavidades nas quais se possam colocar individualmente as amostras secas de acordo com a invenção sobre os meios de colheita abrasivos. O estojo inclui preferivelmente meios de identificação que permitam assegurar a traceabilidade das amostras. Estes meios podem ter qualquer forma adequada (inscrições, código de barras), e podem ser colocados sobre o meio de transporte ou sobre o suporte ou ainda em determinados casos mesmo sobre os meios de colheita abrasivos (por exemplo na parte de trás de um papel de vidro).

Os estojos tais como os descritos acima destinam-se às pessoas que colhem as amostras, que não são forçosamente as pessoas que depois vão fazer as análises de ácidos nucleicos por hibridação molecular. O processo utiliza igualmente estojos para as pessoas que farão uma 11 tal análise. Este estojo inclui então os diferentes reagentes necessários para esta análise, no caso vertente tampão de extracção para análise de ácidos nucleicos por hibridação, e qualquer outro reagente necessário, por exemplo reagentes específicos para as reacções por PCR.

Deste modo, por exemplo o estojo pode incluir também os reagentes necessários para as análises universais por RT-PCR tais como: o estojo 'Kit Titan One Tube RT-PCR' (Roche) bem como as regras a seguir para definir os iniciadores de amplificação e as sondas específicas a incluir consoante as necessidades neste protocolo optimizado.

Ele pode incluir também os reagentes necessários para análises específicas por PCR para a detecção de um ou mais agentes patogénicos em material vegetal, a saber: conjuntos de iniciadores que tenham como alvo um agente patogénico ou uma associação de agentes patogénicos tais como: PNRSV 10F e PNRSV 10R para a detecção do Vírus Necrótico de Mancha Anelar em Prunus, ASGV 5F e ASGV 5R para a detecção de Vírus Escavante do Pedúnculo da Maçã, PDV 17F e PDV 12R para a detecção do Vírus Anão da Ameixa, 12 ASPV 4F e ASPV 4R para a detecção de Vírus Perfurante do Pedúnculo da Maçã,

ApMV 1 F e ApMV 1 R para a detecção de Vírus mosaico da Maçã, ACLSV 5F e ACLSV 8R para a detecção de Vírus de Folha Clorótica da Macieira. A invenção será ilustrada adiante pela descrição de exemplos de execução, com referência às figuras anexas, nas quais: A figura 1 é uma vista de um corte transversal de uma primeira forma de execução de um dispositivo de colheita concebido para se levar a cabo um processo de acordo com a invenção; as figuras 2 e 3 ilustram um modo de classificar e de transportar amostras colhidas graças ao dispositivo de colheita ilustrado na Figura 1, e a figura 4 ilustra uma segunda forma de execução de um dispositivo de colheita concebido para levar a cabo um processo de acordo com a invenção. 13

Exemplos

Exemplo 1

Detecção do vírus PNRSV (Vírus necrótico de mancha em anel em Prunus) em diversos ramos de cerejeiras infectadas por uma RT-PCR de um extracto em bruto

Leva-se a cabo uma análise de ácidos nucleicos por hibridação de acordo com a invenção obtendo-se em dias secos amostras de ramos de árvores de fruta para os enviar para o laboratório a fim de detectar a presença de um agente fitopatogénico por análise de RT-PCR.

Neste exemplo de execução, utiliza-se um dispositivo de amostragem 1 representado na Fig. 1. 0 papel de vidro 2 comercializado sob a designação S.A.M. Corindon Extra Grain 60 é colocado dentro de um receptáculo 3 que se pode facilmente segurar numa mão e que apresenta uma superfície plana 4 sobre a qual se vem fixar o papel de vidro 2 por intermédio de um dispositivo de fixação 5, que pode ser uma banda adesiva, um papel Velcro ou qualquer outro sistema de fixação. A caixa 3 contêm uma saída 6 que permite libertarem-se à medida da amostragem de novas superfícies novas folhas virgens de papel de vidro, depois de a lâmina 7 ter cortado o papel de vidro já com a carga de amostra de material biológico. 0 papel de vidro virgem vem depositar-se sobre uma zona de colheita de amostras 8.

Prevê-se uma zona 9 que não se recobre de amostra de material biológico na extremidade do papel de vidro. 0 14 utilizador pode segurar esta zona 9 entre os dedos, o que permite retirar o papel de vidro que se recobriu com material biológico na zona 8 e obter o seu corte por intermédio da lâmina 7.

Fazem-se três colheitas num pomar, sobre ramos de uma cerejeira infectada pelo PNRSV. Uma colheita é efectuada sobre um ramo com um ano, por um movimento rectilineo apoiado, aplicado transversalmente em relação ao sentido das fibras vegetais. Deve prosseguir-se o movimento de esfrega contra o ramo até aparecer a madeira do núcleo do ramo. Neste momento, estão retidos fragmentos de tecidos vasculares no papel de vidro (também denominado papel de esmeril ou papel areado).

Após cada amostragem, separa-se o papel de vidro 2 carregado com tecido da cerejeira da caixa 3 utilizando a esse efeito a lâmina tal como se descreveu acima. É suficiente deixar esse papel de vidro carregado ao ar ambiente durante alguns instantes para se constatar a sua desidratação. Os fragmentos de tecidos sub-cortiçais colhidos sobre os ramos de cerejeira secam rapidamente sobre o papel de vidro e ficam bem verdes. 0 utilizador pode neste momento colocar cada uma das amostras colhida pegando pela zona 9 prevista no papel de vidro, tal como se ilustra na Fig. 3, numa das bolsas 10 de um dispositivo de transporte previsto para esta finalidade. As bolsas 11, uma vez cheias com amostras, são 15 fechadas dobrando a sua parte superior, que dispõe de um papel adesivo 12, protegido por uma pequena banda de papel de protecção que não se representa e que se retira imediatamente antes de fechar a bolsinha.

Tal como se pode ver na Fig. 3, uma vez fechada a bolsa 11, a face virada para o utilizador inclui zonas que permitem uma identificação precisa das amostras graças a sinais distintivos que podem ser indicações manuscritas a respeito da data de colheita, da entidade que solicitou a análise, do tipo de análise, da origem e do número das amostras, ou ainda um código de barras. Deste modo, a traceabilidade da amostra está garantida. Pode então inserir-se a bolsa 11 num envelope postal para envio ao laboratório pelo correio.

Depois de serem recebidos no laboratório, os papéis em vidro 2 carregados com material vegetal que se pretende analisar são cuidadosamente retirados da bolsa 11 pela sua zona 9 e individualmente colocados no fundo de um tubo em vidro com 15 mL, com rolha de enroscar, contendo 1,5 mL de tampão de extracção SCPAP (descrito em Minsavage et ai., 1994. Development of a polymerase chain reaction protocol for detection of Xylella fastidiosa in plant tissue. Phytopathology 84:138-142).

Passa-se cada tubo pela agitação de um vortex durante 30 segundos para libertar os fragmentos de tecidos presentes sobre o papel de vidro e em seguida deixa-se incubar durante 10 minutos a 4°C. Recuperam-se 500 pL de 16 líquido num tubo de Eppendorf de 1,5 mL e centrifuga-se a 10.000 RPM durante 5 minutos. Recuperam-se 10 pL do líquido clarificado (ou sobrenadante) e dilui-se com 990 pL de água destilada.

Adiciona-se 2 pL deste extracto diluído aos 23 pL da mistura para RT-PCR composta com base no 'Kit TITAN One tube RT-PCR' (Roche) e seguindo as indicações do fabricante, aos quais se adicionaram os 0,5 pL de cada iniciador, PNRSV 10F (TTC TTG AAG GAC CAA CCG AGA GG) , e PNRSV 10R (GCT AAC GCA GGT AAG ATT TCC AAG C), a 2 0 pM. Submetem-se em seguida os tubos à reacção de RT-PCR sobre um Thermocycleur Mastercycler (Eppendorf) seguindo um ciclo de 30 minutos a 50°C, 5 minutos a 94°C, 30 segundos a 94 °C, 45 segundos a 55°C, 1 minuto a 72°C (estes três últimos passos são repetidos 35 vezes) e em seguida 10 minutos a 72 0C.

Revelam-se os produtos de amplificação sobre um gel de agarose a 1,5 %, corando-os com brometo de etídio. Estão presentes as bandas específicas a 348 pb para as 3 amostras obtidas.

Podem analisar-se as amostras directamente após a sua chegada ao laboratório, ou podem conservar-se dentro das suas bolsas 11 à temperatura ambiente para uma análise ulterior.

Exemplo 2 17

Detecção do vírus PNRSV (vírus necrótico de mancha anelar de Prunus) em diferentes ramos d de cerejeira infectados, por uma RT-PCR dos ácidos nucleicos totais (ANT) purificados A colheita de amostras é levada a cabo do mesmo modo que no exemplo 1 acima.

Por outro lado, aplica-se um protocolo de extracção e purificação dos ácidos nucleicos totais de acordo com o processo de S. Spiegel, S.W. Scott, V. Bowman-Vance, Y. Tam, N.N. Galiakparov, e A. Rosner 1996. Improved detection of Prunus necrotic ringspot virus by the polymerase chain reaction. Eur. J. PI. Pathol. 102: 681-685. Colocam-se os papéis em vidro carregados com material vegetal num tubo Falcon de 15 ml contendo 2 mL do tampão de extracção descrito. Depois de uma agitação vigorosa durante 1 minuto a 4°C, recuperam-se 500 pL do extracto com o objectivo de uma extracção de acordo com o protocolo descrito por Spiegel et al.r 1996. A titulo de comparação, leva-se a acabo uma extracção idêntica de ácidos nucleicos totais a seguir a um protocolo clássico de colheita de amostras, a saber; as dimensões do secador, no campo, dos ramos.

Para garantir a validez do teste, seleccionam-se os mesmos ramos do que aqueles cuja amostragem já foi efectuado graças ao dispositivo de colheita 1 da invenção. 18

Levam-se estes ramos para o laboratório, aonde se descasca superficialmente cada um deles em cerca de 5 cm de comprimento, por intermédio de uma lâmina de bisturi n°3, para se eliminar a casca. Sobre esta mesma zona, por intermédio de uma lâmina de bisturi n° 4, arranham-se os tecidos vasculares até ao núcleo da madeira para se obterem cerca de 400 mg destes tecidos. Recolhem-se estes tecidos, pesam-se e colocam-se numa pequena bolsa para aparas munida no seu interior de uma rede em nylon, adicionando-se cerca de 10 vezes o volume do tampão de extracção descrito por Spiegel et al., 1996 (ou seja 4 mL para 400 mg de tecidos). Leva-se a cabo a moenda por intermédio de um homogeneizador de bolas do tipo Holmex até se obter uma des-estruturação completa dos tecidos. Recuperam-se 500 pL do macerado que se destinam a uma extracção de acordo com o protocolo descrito. Todas estas operações de descasque, de arranhamento, de colheita, de avaliação da massa e de moenda devem ser levadas a cabo o mais depressa possivel mantendo-se os tecidos colhidos sempre a uma temperatura baixa (1 a 2 °C).

Depois dos passos de extracção, mede-se a densidade óptica das soluções de ácidos nucleicos provenientes de dois modos de colheita com um espectrofotómetro (LKB Biochrom Ultrospec II, UK) a 260 nm e a 280 nm para se determinar a concentração das soluções e o seu grau de pureza.

Tal como se vê na Tabela 1 adiante, as colheitas levadas a cabo com o dispositivo de colheita 1 da invenção 19 dão concentrações de ácidos nucleicos totais (ANT) de 215 pg/mL, 72 pg/mL e 222 pg/mL, com graus de pureza de correspondentes de 1,34, 1,55 e 1,34. As colheitas efectuadas pelo modo clássico dão concentrações em ácidos nucleicos totais de 138 pg/mL, 119 pg/mL e 86 pg/mL com graus de pureza correspondentes de 1,56, 1,36 e 1,48.

Tabela 1

VtSSSSSSSSSSSSSSSSSSSVt VVV.SSSSSSSSSSSSJ^SSSSV' WVSSSSSSSSVV*,' ^ Ramo 1

Ramo 3 |ant I (pg/mL)

Ramo 2 jjANT |Grau de | (pg/mL) |pureza .sssssssssssssvvvvvvvvvvvvs^.vvvvvvvvvvvvvvvvvsisssssssssssvy.ssssssv^ ^ANT |Grau de !(pg/mL) |pureza

VtSSSSSSSSSSWV |Grau de| Ipureza | |lnvençao ^215 i 1,34 ^72 !l, 55 ^222 PO i—1 |Processo |l38 ! 1,56 |l 19 ! 1,36 |86 I1'48 1

Iclássico

Os resultados obtidos mostram que a colheita efectuada de acordo com a invenção permite obter uma concentração em ácidos nucleicos totais comparável à obtida pela técnica clássica, e que em termos de grau de pureza, a qualidade dos ácidos nucleicos totais que se extraíram é semelhante.

Para a reacção de amplificação, adicionam-se 2 pL dos ácidos nucleicos totais diluídos 100 x aos 23 pL da mistura para RT-PCR composta com base no 'Kit TITAN One tube RT-PCR' (Roche), e seguindo-se as instruções do fabricante adicionaram-se lhe os 0,5 pL de cada iniciador, PNRSV 10F (TTC TTG AAG GAC CAA CCG AGA GG) e PNRSV 10R (GCT 20 AAC GCA GGT AAG ATT TCC AAG C) , a 20 μΜ. Submetem-se em seguida os tubos à reacção de RT-PCR num Thermocycleur Mastercycler (Eppendorf) seguindo o ciclo durante 30 minutos a 50°C, 5 minutos a 94°C, 30 segundos a 94 °C, 45 segundos a 55°C, 1 minuto a 72°C (estes três últimos passos são repetidos 35 vezes) e em seguida 10 minutos a 72°C.

Revelam-se os produtos da amplificação sobre um gel de agarose a 1,5 % corando com brometo de etidio. As bandas especificas a 348 pb estão presentes tanto para as três amostras colhidas de acordo com a invenção como para as r amostras colhidas pela metodologia clássica.

Exemplo 3

Detecção do vírus BSV presente em bananeira por PCR em Tempo Real a partir de amostras colhidas na nervura principal de uma folha

Tal como se pode ver na Fig. 4, utilizou-se neste exemplo de execução da invenção um dispositivo de colheita 13 mais especificamente adaptado para a colheita de amostras dos tecidos profundos. 0 dispositivo 13 é constituído por um ponteiro 14 em plástico rígido ou em metal, com um comprimento de 4 cm e com um diâmetro de 3 mm, sendo uma das suas extremidades constituída por um cone 15 com um diâmetro de 0,5 cm na sua base e um comprimento de 1 cm. O cone 15 está munido de 21 asperezas 16 com a forma de colheres pontiagudas com uma altura de 1 mm, repartidas à sua superfície. 0 ponteiro 14 está encastrado ao mandril de um micro furador 15. A amostragem faz-se por rotação a uma velocidade muito pequena (500 RPM) do ponteiro 14 que penetra na nervura principal 18 da folha da bananeira 19. A rotação é mantida durante cerca de 1 a 2 segundos. 0 ponteiro 14 carregado de material vegetal é em seguida recuperado, livre de tecidos excedentários, deixou-se secar alguns instantes ao ar ambiente. Faz-se uma segunda colheita do mesmo modo, com um segundo ponteiro. Colocam-se os ponteiros numa bolsa do tipo da bolsa 11 que se ilustra na Fig. 3 e deixa-se à temperatura ambiente antes do seu transporte para o laboratório.

Em paralelo e a título de comparação, corta-se um pedaço com 5 cm de comprimento com um bisturi na nervura principal da mesma folha 19 e congela-se imediatamente até se transportar para o laboratório. A partir da sua recepção no laboratório, coloca-se um dos dois ponteiros carregados com material num tubo Falcon de 15 mL contendo 3 mL de tampão de extracção (137 mM em NaCl, 8 mM em Na2HPC>4, 1,5 mM em KH2PO4, 2,7 mM em KC1, 3 mM em NaN3, com 0,05 % de Tween 20, e 80 mM em Na2S03, com pH entre 7,2 e 7,4) . 22

Conserva-se o segundo ponteiro na bolsa à temperatura ambiente durante quatro semanas para uma análise ulterior.

Passa-se o tubo Falcon pelo agitador vortex durante 1 minuto para se libertar os fragmentos de tecidos, e em seguida deixa-se em incubação a 4°C durante 5 minutos. Recuperam-se 500 pL de extracto num tubo de Eppendorf de 1,5 mL e centrifuga-se a 7.000 RPM durante 10 minutos. Recupera-se 100 pL do sobrenadante clarificado e dilui-se em 900 pL de água destilada.

Adiciona-se 1 pL do concentrado diluído aos 49 pL da mistura para PCR composta por 0,2 mM de cada dNTP, 1 unidade de polimerase de ADN Taq (Roche), 1,4 x tampão para PCR, 2 mM em MgCl2 (concentração final), 0,28 pM de cada iniciador e 0,1 pM das sondas com MGB ais como foram definidas em M. Delanoy, M. Salmon, e J. Kummert, 2003. Development of Real-Time PCR for the Rapid Detection of Episomal Banana streak virus (BSV). Plant disease 87:33-38. Submetem-se em seguida os tubos à reacção de PCR com detecção em tempo real num Thermocycleur GeneAmp 5700 Sequence Detection (Applied Biosystems) seguindo o ciclo de 1 minuto a 95°C, 30 segundos a 95 °C, 20 segundos a 53°C, 1 minuto a 60°C (estes três últimos passos são repetidos 50 vezes) .

Transforma-se a intensidade da fluorescência medida ao longo dos ciclos num gráfico e determina-se o 23 valor do Ct (ciclo a partir do qual a intensidade da fluorescência ultrapassa a do limiar).

Levam-se a cabo ensaios comparativos entre uma colheita clássica (moenda de 400 mg de nervuras congeladas de folha de bananeira em 4 mL do mesmo tampão de extracção, com um homogeneizador Holmer) e o exemplo 2 da invenção tal como se descreveu acima.

Para além disto, quatro semanas depois desta primeira análise obteve-se uma nova preparação do extracto em bruto do mesmo modo a partir do segundo ponteiro que se havia conservado à temperatura ambiente dentro da bolsa, e sobre 400 mg de nervura congelada.

Tal como se indica na Tabela 2 adiante, os resultados para a preparação clássica e para a da invenção são dados respectivamente pelos seus valores de Ct (Cycle threshold correspondente a um limiar de 0, 025) de 35 e de 30 no dia da colheita e de 35 e 31, quatro semanas depois da colheita. Os valores finais de fluorescência são respectivamente de 0,21 e de 0,30 no dia da colheita, e de 0,19 e 0,28 quatro semanas após a colheita.

Tabela 2

Invenção | Preparaçao clássica 24 | Ct |Fluorescência | (limiar | final | 0,025) | | ct ^ (limiar | 0,025) ^\\\\\\\\\\\\\x\\x\\x\\x\\x\\\\\\\\\^^^ |Fluorescência| | final | |Análise no |dia da |amostragem | 35 1 0,21 ^\\v\\x\\\\\\\\\\\\\\\\\\v\x\\xx 1 30 vxLxLxLxLxXxxxvxxxxxxxxxxxxxxx^xLxLxLxLxLxLxLxLxLxLxLxLxLxLvxxxxxxxxxxxx·; 1 o, 3 ° 1 |Análise 4 Isemanas após |a amostragem 1 35 1 °'19 1 31 ^xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx>X>LxLxLxLxLxLxLxLxLxLxLxLxLxSSSSSSSSX;^ 1 0,28 |

Constata -se portanto que a invenção permite obter- -se um sinal de fluorescência mais precoce e com um valor final maior do que a utilização da técnica clássica. Para além disto os resultados obtidos com o material preparado quatro semanas antes sao tão bons como os obtidos no dia da colheita.

Exemplo 4

Detecgão por RT-PCR do virus ASGV (Vírus Escavante do Pedúnculo da Maçã) sobre ramos de macieira recebidos no laboratório como material fresco

Este exemplo mostra de que modo o processo de análise de ácidos nucleicos por hibridação molecular de acordo com a invenção é concretamente aplicável para um laboratório de diagnóstico em fitopatologia. 0 dispositivo de colheita que se empregou aqui é constituído por um 25 simples rectângulo com 1,5 x 3 cm cortado em papel de vidro GUMIC P 100.

Com efeito, as condições de trabalho são tais que não é necessário dispor de um distribuidor, nem penetrar nas camadas profundas dos tecidos. Uma forma simplificada de dispositivo de colheita de acordo com a invenção é portanto suficiente.

Deposita-se o ramo sobre uma mesa de trabalho em frente do operador que segura a sua extremidade, mantém-se o papel de vidro sob o index da mão livre do operador que aplica, com uma pressão ligeira, um movimento transversal de esfrega em relação ao eixo longitudinal do ramo. Prossegue-se este movimento até se atingir o cerne da madeira. Esta amostra colhida corresponde a cerca de 30 mg de tecidos. Coloca-se em seguida o papel de vidro carregado com os tecidos vegetais no fundo de um tubo em vidro de 15 mL com rolha de enroscar, contendo 1 mL de tampão de extracção TE a 4°C (50mM em Tris, pH 8,0, 10 mM em EDTA) . Todos os ramos são preparados da mesma maneira.

Passa-se o tubo durante 30 segundos por um agitador vortex para libertar os fragmentos de tecidos, e em seguida deixa-se incubar a 4°C durante 10 minutos. Recuperam-se 500 pL de extracto num tubo de Eppendorf de 1,5 mL e centrifuga-se a 10.000 RPM durante 5 minutos. Recupera-se 10 pL do sobrenadante clarificado e dilui-se em 990 pL de água destilada. 26

Adicionam-se 2 pL do extracto diluído aos 23 pL da mistura para RT-PCR composta com base no 'Kit TITAN One tube RT-PCR' (Roche) e seguindo as instruções do fabricante adicionam-se os 0,5 pL de cada iniciador a 20 pM (ASGV5F e ASGV5R) tais como se definiram em J. Kummert, M. Vendrame, S. Steyer, e P. Lepoivre, 2000. Development of routine RT-PCR tests for certification of fruit tree multiplication material. EPPO Bulletin 30: 441-448.

Submetem-se em seguida os tubos à reacção de RT-PCR num Thermocycleur Mastercycler (Eppendorf) seguindo o ciclo com 30 minutos a 50°C, 5 minutos a 94°C, 30 segundos a 94 °C, 45 segundos a 55°C, 1 minuto a 72°C (estes três últimos passos são repetidos 35 vezes) e depois 10 minutos a 72 °C.

Revelam-se os produtos de amplificação sobre um gel de agarose a 1,5 % com coloração por brometo de etídio. A banda específica situa-se a uma altura de 344 pb.

Constata-se que estes resultados são tão significativos como os obtidos com um método clássico a partir de um material vegetal fresco.

Tal como se pode constatar lendo quanto precede, o processo de análise de acordo com a invenção, graças ao passo de colheita de amostras de material biológico pelos meios abrasivos limita muito eficazmente os fenómenos de oxidação. Os ácidos nucleicos alvo presentes nos tecidos vegetais amostrados não devem ser directamente postos em 27 presença do meio líquido tamponizado (ao contrário do trabalho com tecidos frescos). 0 processo de acordo com a invenção não necessita senão de amostras de 20 a 40 mg de material biológico, ou seja, 5 a 10 vezes menos do que a técnica clássica.

Deve anotar-se que, se o processo da invenção permite um trabalho de laboratório sobre um extracto em bruto, não é bem entendido algo que esteja fora do seu âmbito efectuarem-se passos de purificação suplementares.

No que toca às amostras, elas podem ser analisadas uma a uma ou agrupadas para uma análise em comum, em função das finalidades pretendidas.

Lisboa, 5 de Março de 2009 1

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de análise de ácidos nucleicos por hibridação molecular, que inclua os seguintes passos: • colheita de amostras de material com origem vegetal a partir de tecidos profundos recorrendo a um dispositivo de amostragem (1, 13) , • secagem das amostras carregadas sobre meios de amostragem, • extracção dos ácidos nucleicos, incluindo um passo de imersão das amostras carregadas sobre os seus meios num tampão de extracção (2, 15, 16), contendo as respectivas amostras de materiais com origem vegetal, caracterizado por os meios de colheita incluírem uma superfície externa abrasiva com asperezas próprias para provocarem incisões na superfície do material vegetal referido e apta para reter células provenientes de tecidos profundos do material referido, incluindo ainda os meios de amostragem referidos um material sólido seleccionado de entre o conjunto constituído por sílica, vidro, metais, fibras de carbono e materiais plásticos. 2

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a colheita de amostras de material com origem vegetal se fazer ao ar ambiente.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por a colheita de amostras ser levada a cabo fora de um laboratório no qual venha a ser levada a cabo a análise, e também por o processo incluir um passo de transporte dos meios de colheita abrasivos (2, 15, 16) carregados com as suas amostras respectivas de material com origem vegetal, até ao laboratório referido.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o passo de extracção dos ácidos nucleicos incluir - um passo de agitação no tampão de extracção - um passo de separação, e - um passo de recuperação do liquido clarificado que contém os ácidos nucleicos.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o passo de separação consistir numa centrifugação, cujo sobrenadante corresponde ao liquido clarificado.

6. Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a análise por 3 hibridação molecular ser feita por reacçao em cadeia com polimerase (PCR).

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a análise por hibridação molecular de ácidos nucleicos ser levada a cabo com o objectivo de determinar a presença de um agente patogénico no material com origem vegetal.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se utilizar um estojo para se levar a cabo o processo, estojo este que inclua um dispositivo de colheita (1, 12) incluindo os referidos meios de colheita abrasivos (2, 14, 15) aptos para reter material com origem vegetal e sob a forma de células.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o dispositivo de colheita (2, 13) incluir um suporte (3, 5, 6, 14, 17) apto para suportar os meios de colheita abrasivos (2, 15, 16).

10. Processo de acordo qualquer uma das reivindicações 8 e 9, caracterizado por o estojo incluir os meios (11) de transporte do meios de colheita abrasivos (2, 15, 16).

11. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 10, caracterizado por o estojo incluir meios de identificação dos meios de colheita abrasivos.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado por o estojo incluir tampão de extracção para análise de ácidos nucleicos por hibridaçao. uma das incluir

13. Processo de acordo com qualquer reivindicações 8 a 12, caracterizado por o estoj reagentes específicos para as reacções de PCR. Lisboa, 5 de Março de 2009 1