ES2319070B1 - Nanoesferas de esteres alquilicos del acido poli (y-glutamico). - Google Patents
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Abstract
Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico).
Nanoesferas constituidas por ácido
poli(\gamma-glutámico) de biosíntesis
esterificado con grupos metilo al 100%, o con grupos etilo al 75% o
con grupos hexilo, dodecilo u octadecilo al 50%, todos ellos
insolubles en agua. Las partículas se obtienen, de forma
controlable y reproducible, por el método de
precipitación-diálisis. Son hidrolizables en
condiciones fisiológicas y permiten la encapsulación homogénea de
principios activos, tales como fármacos o proteínas, produciéndose
la liberación completa de los mismos en el rango de días.
Description
Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Partículas de tamaño nanométrico fabricadas con
ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) de biosíntesis,
útiles para el encapsulamiento de fármacos. El método de
preparación es reproducible, obteniéndose partículas esféricas en
las que el agente terapéutico se distribuye de forma homogénea.
Para estas partículas se prevén aplicaciones biomédicas en la
vectorización y liberación controlada de fármacos.
Las nanopartículas biodegradables son sistemas
de gran interés por sus aplicaciones biomédicas como dispensadores
de agentes terapéuticos ya sean de bajo peso molecular o
macromoleculares. (Panyam, J., Labhasetwar, V., Adv. Drug Del.
Rev., 55, 329, 2003). Diversos polímeros, tanto
sintéticos como naturales, han sido utilizados en la preparación de
sistemas de liberación y vectorización de compuestos bioactivos,
entre estos se encuentran las poliamidas, las cuales son
susceptibles de hidrolizarse en condiciones fisiológicas. Los
poliglutamatos son biopolímeros que han sido ampliamente utilizados
en aplicaciones farmacéuticas (Buescher J. et al. Critical
Reviews in Biotechnology, 27, 1, 2007). Sin embargo, son
necesarias nuevas formulaciones tecnológicas capaces de producir
partículas nanométricas biodegradables y biocompatibles.
El ácido
poli(\gamma-glutámico), (PGGA) es un
poli(aminoácido) cuyos enlaces amida en la cadena principal
están formados a partir del grupo \alpha-amino y
del grupo \gamma-carboxilo. A nivel industrial es
producido por varias especies del genero Bacillus. Es
soluble en agua, biodegradable, y biocompatible, es decir, que se
metaboliza en productos no tóxicos para el organismo. La
esterificación de su grupo carboxilo lateral puede conducir a la
obtención de polímeros tipo peine, no solubles en agua con
propiedades radicalmente diferentes a las del biopolímero de partida
(Morillo M. et al., Macromolecules, 34, 7868,
2001).
En concreto, los copolímeros anfifílicos o
polímeros hidrofóbicamente modificados están siendo ampliamente
investigados en el campo de la biotecnología y la farmacología.
Dichos sistemas bajo condiciones adecuadas tienden a constituir
estructuras que protegen los agentes terapéuticos de la degradación
enzimática, especialmente en el caso de proteínas y péptidos
(Takami et al., J. Biomater. Sci., Polymer Edn. 17,
875, 2006). Diferentes estudios muestran que el método de
precipitación-diálisis es adecuado para obtener
partículas en el rango nanométrico de forma reproducible
(Brannon-Peppas L. et al., Advanced drug
delivery reviews, 56, 1649, 2004.) Sin embargo según el
dispositivo en concreto de que se trate, deben seleccionarse
cuidadosamente las condiciones de encapsulación para que se
garantice la homogeneidad de la partícula y para que se mantenga la
eficiencia del agente terapéutico una vez liberado.
Las nanoesferas de PAAG-Me,
coPAAG-(Et_{75}H_{25}),
coPAAG-(Hex_{50}H_{50}),
coPAAG-(Dod_{50}H_{50}) y
coPAAG-(Octd_{50}
H_{50}) (Figura 1) se obtienen mediante el método de precipitación-diálisis. Se ha constatado la reproducibilidad en la obtención de estos nuevos dispositivos, así como, la eficiencia en la nanoencapsulación de compuestos y su posterior liberación controlada. En concreto, la presente invención se refiere a la nanoencapsulación de eritromicina y \alpha-quimotripsina.
H_{50}) (Figura 1) se obtienen mediante el método de precipitación-diálisis. Se ha constatado la reproducibilidad en la obtención de estos nuevos dispositivos, así como, la eficiencia en la nanoencapsulación de compuestos y su posterior liberación controlada. En concreto, la presente invención se refiere a la nanoencapsulación de eritromicina y \alpha-quimotripsina.
El poli(\gamma,
DL-glutamato) sódico con una proporción
enantiomérica de 59:41 y un peso molecular promedio en peso de
aproximadamente 300,000 KD fue biosintetizado por B.
subtilis y suministrado por Meiji Co. (Japón). El polímero se
llevo a su forma ácida mediante acidificación con HCI y
precipitación en 2-propanol. La metilación del PGGA
con diazometano (Pérez-Camero G. et al., J Appl
Polym Sci., 82, 2027, 2001) permite obtener el PGGA
completamente metilado. El resto de las alquilaciones se llevaron a
cabo con bromuros de alquilo ajustando las condiciones de reacción
para alcanzar los grados de esterificación que se desean (Morillo
M. et al., Macromolecules, 34, 7868, 2001. Kubota H.
et al. J. Polym. Sci. Part A. Polym. Chem. 33, 85,
1995. Bobérly M. et al. Polym. Bull. 32, 127,
1994).
La eritromicina, ensayo 95%, fue suministrada
por Fluka, y la \alpha-quimotripsina de páncreas
bovino (EC 3.421.1, Tipo II, 50 unidades mg^{-1}) y los bromuros
de alquilo fueron suministrados por Sigma. Se utilizaron solventes
orgánicos de grado analítico y se emplearon sin posterior
purificación. El agua utilizada en la preparación de las soluciones
amortiguadoras fue desionizada en un equipo
"Milli-Q".
Para obtener el éster metílico se añade una
solución de diazometano en éter (0.25 M) a una disolución de
poli(\gamma-glutámico) de biosíntesis, de
peso molecular M_{w} = 300,000 en acetona anhidra y se agita la
muestra a temperatura ambiente durante 2 h. Se evapora el solvente
a presión reducida obteniéndose el compuesto metilado como un polvo
blanco, el cual se disuelve en N-metilpirrolidona (NMP) y se
precipita en éter dietílico frío. Dicho polímero se filtra, se lava
con éter frío, y se seca a presión reducida.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para obtener los esteres de grupos alquilo mas
largos (etilo, hexadecilo, dodecilo y octadecilo) se emplea la
esterificación con los correspondientes bromuros de alquilo. Los
copolímeros se obtienen de la siguiente manera: 200 mg (1.55 mmol)
de PGGA se disuelve en NMP (20 mL) y se agita a 80ºC por 30 minutos,
la mezcla se enfría hasta 60ºC y se añade NaHCO_{3} (525 mg, 6.25
mmol) y 8 mmol del correspondiente bromuro de alquilo y se deja
reaccionar el tiempo necesario para alcanzar el porcentaje de
alquilación deseado, monitoreando la reacción por RMN de protón en
un equipo Bruker AMX-300.
El NaBr generado en la reacción se separa por
decantación y la mezcla de reacción se vierte en: dietil éter para
el coPAAG-(Et_{75}H_{25}), agua acidificada (pH 1.5) para
coPAAG-(Hex_{50}H_{50}), hexano para
coPAAG-(Dodc_{50}H_{50}) y
coPAAG-(Octd_{50}H_{50}), para precipitar el
copolímero.
El siguiente paso es la centrifugación para
recuperar los copolímeros que se obtienen como polvo fino y
finalmente se secan al vacío a 50ºC.
En la Tabla 1 se indican las características de
los polímeros utilizados en la preparación de nanoesferas, así como
del PGGA de partida.
Las nanoesferas se obtienen por precipitación y
diálisis. A una disolución de copolímero en
N-metilpirrolidona, se adiciona el mismo volumen de agua
destilada obteniéndose una solución translúcida. Esta disolución se
dializa frente a agua destilada, formándose las nanopartículas.
Finalmente, la solución dializada se liofiliza.
Mediante dispersión láser/PIDS, usando un
Beckman Coulter LS 1332, se midió la distribución de tamaño de
partícula. Los resultados se muestran en la Figura 2.
La morfología se estudió realizando micrografías
de SEM en un instrumento JEOL SSM-6400. Las
fotografías se muestran en la Figura 3. a)
coPAAG-(Et_{75}H_{25}) b)
coPAAG-(Hex_{50}H_{50}) c)
coPAAG-(Dod_{50}H_{50}) d)
coPAAG-(Octd_{50}H_{50}).
Para encapsular el fármaco en las nanoesferas,
se disuelven los copolímeros (30 mg) y la eritromicina (30 mg) en
NMP (5 mL) y se lleva a cabo el método de
precipitación-diálisis explicado anteriormente. La
cantidad de eritromicina encapsulada se mide por espectroscopia
UV-vis.
El fármaco se distribuye homogéneamente en la
matriz de polímero tal como indican los estudios de calorimetría
diferencial de barrido, realizados en un calorímetro DSC
Perkin-Elmer Pyris calibrado con indio. La
espectroscopia UV- visible realizada con un espectrómetro Cecil
CE2021, ha revelado que las nanoesferas presentan, en condiciones
fisiológicas, un perfil adecuado de liberación de fármaco frente al
tiempo, y cada perfil es dependiente del tipo de copolímero
empleado en la fabricación de nanoesferas pudiendo controlar los
tiempos de liberación con el porcentaje de esterificación y el tipo
de éster alquílico que se incorpore en el PGGA, tal como se muestra
en la Figura 4.
Se ha evaluado la eficacia de estas
nanopartículas como dispensadores de proteínas tomando como modelo
la \alpha-quimotripsina. Para preparar las
nanopartículas con la enzima encapsulada, se disuelve la
\alpha-quimotripsina (10 mg) en 1 mL de PBS pH
7,4 y los copolímeros (10 mg) se disuelven en 1 mL de NMP. Las dos
soluciones se mezclan y las nanopartículas precipitadas se colectan
por centrifugación. El contenido de proteína encapsulada se
determina por el método de Lowry, situándose entre los valores del
3 al 25%.
Estas nanoesferas presentan, en condiciones
fisiológicas, un perfil adecuado de liberación de la proteína
frente al tiempo, y cada perfil es dependiente del tipo de
copolímero empleado en la fabricación de nanoesferas pudiendo
controlar los tiempos de liberación con el porcentaje de
esterificación y el tipo de éster alquílico que se incorpore en el
PGGA, tal como se muestra en la Figura 5.
La eficiencia en la encapsulación de
eritromicina y \alpha-quimotripsina, así como
algunas características de las nanoesferas se muestran en la Tabla
2.
Las propiedades de estas nanopartículas indican
que son sistemas con un gran interés potencial en farmacia y
medicina. Debido al origen natural del polímero de partida, el
ácido poli(\gamma-glutámico), los procesos
de hidrólisis de la matriz polimérica conducirán a unidades
compatibles y metabolizables por el cuerpo humano. Por otro lado,
los resultados obtenidos en la encapsulación, tanto de moléculas de
bajo peso molecular como de proteínas, confirman la posibilidad de
utilizar estos nanosomas como matrices para la estabilización y
protección de un fármaco de su entorno. En concreto, se prevé una
interesante utilidad como sistemas para la distribución de
compuestos encapsulados con aplicación intracelular (nanosomas),
especialmente, en la vectorización de principios activos.
Se disuelven 10 mg de
coPAAG-(Et_{75}H_{25}) en 1 mL de NMP, se adiciona el
mismo volumen de agua formándose una solución translúcida. Para
aislar las nanopartículas y eliminar el solvente orgánico, se
dializa la disolución frente a agua destilada usando una membrana
tubular de celulosa (peso molecular de corte 8.000) a temperatura
ambiente. El agua destilada se intercambia a intervalos de 72 h.
Finalmente, la solución dializada se liofiliza.
Se disuelven 30 mg de eritromicina y 30 mg de
coPAAG-(Et_{75}H_{25}) en 5 mL de NMP. La solución
resultante es translúcida y para obtener las nanopartículas y
eliminar el solvente orgánico, se dializa la disolución frente a
agua destilada usando una membrana tubular de celulosa (peso
molecular de corte 8.000) a temperatura ambiente. El agua destilada
se intercambia a intervalos de 12 h. Finalmente, la solución
dializada se liofiliza. 10 mg de nanopartículas con fármaco
encapsulado se disuelven en cloroformo (10 mg), y se determina el
contenido de eritromicina cargado por espectroscopia
UV-vis.
Se disuelve 10 mg de quimotripsina en 1 mL de
tampón fosfato (PBS) y se adiciona 1 mL de
coPAAG-(Et_{75}H_{25}) (10 mg/mL en NMP) a la solución de
proteína. La solución resultante se centrifuga y se lava repetidas
veces con agua destilada.
A un volumen de nanopartículas con proteína
encapsulada en agua, se añade el mismo volumen de una solución
acuosa de dodecil sulfato sódico al 4% para disolver las
nanopartículas, y se determina el contenido de proteína cargada por
el método de Lowry.
Claims (9)
1. Nanoesferas caracterizadas por estar
constituidas por ésteres alquílicos derivados del ácido
poli(\gamma-glutámico) de origen natural
con un 100% de esterificación en el caso del éster metílico, un 75%
para el éster etílico y un 50% de esterificación en el caso de
ésteres hexilicos, dodecílicos y octadecílicos.
2. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) según
reivindicación 1, caracterizadas por formarse
espontáneamente, mediante el método de
precipitación-diálisis.
3. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) según
reivindicación 1, caracterizadas por obtenerse de forma
controlable y reproducible mediante el ajuste de la proporción de
polímero, de la naturaleza del disolvente, del tiempo de diálisis y
del proceso de aislamiento y purificación.
4. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) según
reivindicación 1, caracterizadas por ser degradables
hidrolíticamente en condiciones fisiológicas.
5. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) según
reivindicación 1, caracterizadas por ser susceptibles de
modular su hidrodegradabilidad en función de la proporción y la
naturaleza de los grupos éster alquílicos.
6. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) según
reivindicación 1, caracterizadas por poder encapsular agentes
terapéuticos constituyendo sistemas homogéneos.
7. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) según
reivindicación 1, caracterizadas porque para una carga de
eritromicina del 100% w/w presentan una capacidad de encapsulación
del 43 al 80% w/w, siendo la liberación total de eritromicina entre
10 y 35 días en condiciones fisiológicas, con un perfil sigmoidal
muy conveniente para su aplicación biomédica.
8. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) según
reivindicación 1, caracterizadas por inmovilizar cantidades
de \alpha-quimotripsina entre un 3 y un 25%
w/w.
9. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido
poli(\gamma-glutámico) según
reivindicación 1, caracterizadas porque para una carga de
\alpha-quimotripsina del 100% w/w presentan una
capacidad de encapsulación del 3 al 18% w/w, siendo la liberación
total de \alpha-quimotripsina entre 15 y 40 días
en condiciones fisiológicas, con un perfil sigmoidal muy
conveniente para su aplicación biomédica.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
ES200702918A ES2319070B1 (es) | 2007-10-26 | 2007-10-26 | Nanoesferas de esteres alquilicos del acido poli (y-glutamico). |
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ES2319070A1 ES2319070A1 (es) | 2009-05-01 |
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- 2007-10-26 ES ES200702918A patent/ES2319070B1/es active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
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OKAMOTO, S. et al. "{}Influenza hemagglutinin vaccine with poly(gamma-glutamic acid) nanoparticles enhances the protection against influenza virus infection through both humoral and cell- mediated immunity"{}. Vaccine, 2007, volumen 25, páginas 8270-8278. Ver resumen; página 8271, apartado 2.2. * |
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