ES2318264T3 - Procedimiento para la regulacion in vivo de la contractilidad del musculo cardiaco. - Google Patents

Abstract

Uso de un vector de expresión recombinante constituido por un vector viral adenoasociado (AAV) que codifica SERCA2, en la fabricación de un medicamento para transducir miocitos cardiacos para mejorar la contractilidad cardiaca para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, induciendo un aumento en la velocidad de la contracción sistólica o de la relajación diastólica en el corazón de un paciente de los niveles previos a la transducción a lo largo de un periodo de al menos 4 semanas.

Description

Procedimiento para la regulación in vivo de la contractilidad del músculo cardiaco.

Referencia cruzada con solicitud de patente relacionada

Esta es una continuación en parte de la solicitud de Estados Unidos de Nº de serie 08/420.306, presentada el 11/04/95, todavía en trámite.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos para regular la contractilidad del músculo cardiaco. Más específicamente, la invención se refiere a procedimientos para aumentar los niveles in vivo de ATPasa del calcio ^{2++} del retículo sarcoplásmico (RS) cardiaco (SERCA2) por suministro in vivo de un gen que codifica operativamente la proteína SERCA2.

2. Historia de la técnica anterior

La insuficiencia cardiaca congestiva es una de las causas principales de muerte entre adultos en los Estados Unidos. En comparación con la isquemia cardiaca (un acontecimiento agudo que se produce por obstrucción o pérdida de suministro de sangre al corazón), la insuficiencia cardiaca congestiva es un acontecimiento relativamente progresivo asociado con la pérdida gradual de la contractilidad del músculo cardiaco y la adaptabilidad del corazón al estrés. Finalmente, en ausencia de un tratamiento eficaz, el corazón con ICC pierde su capacidad de bombear sangre a una velocidad suficiente para cumplir los requerimientos metabólicos del cuerpo.

Aunque las anomalías en la función cardiaca que acompañan a la insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) varían, la liberación disminuida desde el RS de los iones de calcio^{2++} necesarios para la activación de proteínas contráctiles es una característica común del síndrome de ICC. La importancia de esta pérdida se puede comprender mejor en el contexto del papel que desempeña el transporte de calcio en el funcionamiento normal del corazón.

En resumen, el RS es una estructura membranosa que rodea cada miofibrilla del músculo cardiaco. La SERCA2 está contenida en el interior de las membranas del RS y sirve para transportar activamente del 70 al 80% de los iones de calcio libres al interior del espacio intracelular del RS durante la relajación diastólica del músculo cardiaco. Gran parte de los iones de calcio restantes disponibles para el transporte se retiran del citoplasma por un sistema de intercambio de transporte de sodio/calcio del RS así como, en menor grado, por un transporte dirigido por la hidrólisis de ATP CATALIZADA por la ATPasa del ión calcio del sarcolema y mediante la captación de calcio mitocondrial (Bassani, y col., J. Physiol. 453: 591-608, 1992 y Carafoli, E., Ann. Rev. Biochem., 56: 395-433, 1987).

Dado que tanto la actividad hidrolítica de ATP de SERCA2 como los niveles absolutos de ARNm de SERCA2 están disminuidos en el corazón con ICC (Hasenfuss, y col., Circ. Res., 75: 434-442, 1994 y Studer, y col., Circ. Res., 75: 443-453, 1994), se ha postulado ampliamente que la alteración de la capacidad del corazón con ICC para recibir sangre a bajas presiones está directamente relacionada con retrasos en el transporte mediado por SERCA2 de iones de calcio activadores de la contracción al interior del RS que, a su vez, da como resultado una ralentización de la relajación diastólica del corazón (véase, por ejemplo, Grossman, W., N. Engl. J. Med., 325: 1557-1564, 1991; Lorell, BH, Ann. Rev. Med., 42: 411-436, 1991; y Arai y col., Circ. Res., 74: 555-564, 1994). Estas observaciones, particularmente con respecto a reducciones en los niveles de ARNm que codifican SERCA2, se han confirmado en seres humanos, así como en otras especies de mamíferos (véanse los niveles de ARNm de SERCA2 humana re, Arai, y col., anteriormente y Mercadier, y col., J. Clin. Invest., 85: 305-309, 1990; también, disminución de los niveles de ARNm de SERCA2 re en tejido cardiaco hipertrofiado de otras especies de mamíferos, véase, por ejemplo, Wang, y col., Am. J. Physiol., 267: H918-H924, 1994 [hurones]; Afzal y Dhella, Am. J. Physiol., 262: H868-H874, 1992 [roedores]; y Feldman, y col., Circ. Res., 73: 184-192, 1993 [roedores]).

A pesar del interés en los últimos años con respecto al papel del transporte de calcio en la ICC, la base molecular de la alteración de la actividad de transporte de calcio de SERCA2 apenas se conoce y todavía no se ha aprovechado en un protocolo para el tratamiento de la ICC. En su lugar, las modalidades terapéuticas actuales para el síndrome de ICC son en gran medida inespecíficas en el sentido de que no se dirigen directamente a los acontecimientos bioquímicos y moleculares que se piensa que acompañan, si no causan, las anomalías de función que conducen a la insuficiencia del corazón con ICC. Por ejemplo, el tratamiento farmacéutico de la ICC mediante administración de fármacos similares a adrenalina estimula la contracción del músculo cardiaco pero no corrige la afección subyacente que causó la disminución en la contractilidad del músculo.

Por tanto, la sustitución y/o el aumento de los niveles in vivo de proteínas cardiacas es una alternativa fascinante para el tratamiento y el control de la progresión de la ICC en seres humanos. Sin embargo, es poco probable que la consecución de este objetivo mediante la introducción de proteínas o péptidos cardiacos en tejido cardiaco tenga éxito. La preocupación primaria es el riesgo de toxicidades potenciales, particularmente a dosificaciones suficientes para producir una respuesta biológica a la proteína. Desde una perspectiva práctica, también existe el problema del coste asociado con el aislamiento y la purificación o la síntesis de proteínas. Además, el impacto clínico de las proteínas también estaría limitado por su semivida relativamente corta in vivo, debido a la degradación por cualquier proteasa presente en el tejido diana.

Por estos motivos, la introducción de una proteína en un paciente por suministro de un gen que expresará la proteína es una alternativa fascinante para administrar la propia proteína. Con este fin se han desarrollado una diversidad de estrategias para la introducción de genes exógenos en células diana. La mayoría de los protocolos de terapia génica propuestos hasta la fecha para el uso en seres humanos se han centrado en la transferencia de genes ex vivo; por ejemplo, mediante transfección retroviral de células para el implante en tejido diana (véase, por ejemplo, Anderson, WF, Science, 256: 808-813, 1992 y Miller, AD, Nature, 357: 455-460, 1992 [tratamiento de deficiencia de adenosina desaminasa]). Sin embargo, se ha demostrado que la utilidad de tales protocolos es limitada por su relativa ineficacia de expresión de proteína, así como la accesibilidad limitada de órganos y tejidos diana.

Por lo tanto, los procedimientos de suministro de genes in vivo son un tópico de gran interés en la técnica. Con este fin se han desarrollado varios sistemas para conseguir este objetivo, incluyendo la introducción de polinucleótidos "desnudos" (plásmidos), plásmidos ligados a virus, plásmidos cointernalizados con virus, así como encapsulación y suministro de construcciones génicas dentro de liposomas.

Por ejemplo, en 1984 se describió un trabajo en el NIH que demostró que la inyección intrahepática de ADN plasmídico desnudo clonado para la hepatitis de la ardilla en ardillas produjo tanto infección vírica como la formación de anticuerpos antivirales en las ardillas (Seeger y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA, 81: 5849-5852, 1984). Varios años después, Felgner, y col describieron que obtuvieron la expresión de proteína a partir de polinucleótidos "desnudos" (es decir, ADN o ARN no asociado con liposomas o un vector de expresión viral) inyectados en tejido muscular esquelético (Felgner, y col., Science, 247: 1465, 1990; véase también la solicitud PCT WO 90/11092). Felgner y col. supusieron que las células musculares captan y expresan eficazmente polinucleótidos debido a la estructura única del tejido muscular, que está compuesto por células multinucleadas, retículo sarcoplásmico y un sistema tubular transverso que se extiende profundamente hacia el interior de la célula muscular.

Se han descrito sistemas similares para el suministro de genes directamente en el tejido diana por Stribling, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11277-11281, 1992 (expresión de proteína detectada después del suministro en aerosol de un gen encapsulado en liposomas); y Tang y col., Nature, 356: 152-154, 1992 (la inyección con una "pistola" de vacunación de un plásmido de hGH acoplado a perlas de oro coloidal en la piel de ratones dio como resultado la expresión de la proteína hGH sin suscitar una respuesta inmune contra el gen inyectado). Aunque generalmente es eficaz para producir altos niveles de expresión de proteína dentro de células musculares, la inyección directa de ADN o ARN en tejido muscular para terapias a largo plazo requiere el uso de inyecciones repetidas para compensar la pérdida de expresión por degradación génica. Esta estrategia no soló puede requerir mucho tiempo y ser costosa, sino que también puede ser poco práctica para la terapia a largo plazo debido a la inflamación causada en o cerca del sitio de inyección. Por lo tanto, aunque útil en terapias a corto plazo o de emergencia, generalmente se preferirán medios menos invasivos para la introducción de genes que se pueden expresar en tejido diana sobre la inyección directa en el tejido diana.

Además, la mayoría de los procedimientos para el suministro de genes in vivo libres de un vector de expresión recombinante experimentan una transfección de células diana ineficaz y una expresión de proteína relativamente baja. Por tanto, actualmente los vectores de expresión recombinantes (especialmente vectores no replicables) continúan siendo el vehículo preferido para el suministro de genes in vivo.

Se ha demostrado que los miocitos cardiacos son dianas adecuadas para el suministro de genes in vivo. Por ejemplo, una propuesta reciente para el tratamiento de la ICC sustituiría y/o aumentaría el número de receptores \beta_{2}-adrenérgicos activos en los miocitos del corazón con ICC. Los estudios en ratones indican que han indicado que el uso de técnicas de trasplante directo para introducir genes que codifican tales receptores conduce a una contractilidad in vivo aumentada del músculo cardiaco incluso en ausencia de una fuente de adrenalina exógena (Lefkowiz, y col., Science, 264: 582-586, 1994). En particular, se ha demostrado que los vectores virales adenoasociados son vehículos de éxito para el suministro de genes a miocitos cardiacos (véase, por ejemplo, Guzman, y col., Circ. Res., 73: 1202-1207, 1993 y Muhlhauser, y col., Circulation, 88 (Parte 2): 1-475, 1993).

Sumario de la invención

Los detalles de la realización preferida de la presente invención se indican en los dibujos adjuntos y en la siguiente descripción.

La invención es un procedimiento para aumentar el transporte de calcio hacia el interior del RS de músculo cardiaco elevando la expresión in vivo de SERCA2 catalíticamente activa mediante la introducción de un polinucleótido que codifica operativamente SERCA2 en dicho tejido. Para su eficacia de transfección de células diana, el polinucleótido que codifica SERCA2 se suministra en el interior del tejido cardiaco mediante un vector de expresión recombinante viral no replicable, una construcción de vector viral adenoasociado (AAV).

El suministro del gen de SERCA2 se puede realizar quirúrgicamente (es decir, por introducción directa del vector o de células transfectadas en el tejido diana) o mediante infusión intracoronaria.

El aumento del transporte de iones de calcio al RS proporcionado por la actividad aumentada de SERCA2 en el RS moderará la activación de contracciones de miofibrillas en el corazón. Por tanto, una ventaja particular del procedimiento de la invención es la ayuda que proporcionará al corazón en el ajuste de las anomalías asociadas con la ICC, especialmente por acortamiento de la fase temprana de relajación diastólica del músculo cardiaco.

Un uso para el procedimiento de la invención es para la mejoría a corto plazo de la ICC en pacientes que están esperando terapia intervencionista (por ejemplo, trasplantes) y/o que ya están sometiéndose a un tratamiento para la ICC. También se espera que el uso del procedimiento de la invención beneficie a pacientes que estén en riesgo de y que hayan comenzado a padecer las anomalías en la función cardiaca asociadas con la ICC.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una transferencia de Western que muestra la expresión de transgén de SERCA2 en ratones (desarrollada mediante el uso de una construcción adenoviral de SERCA2, para propósitos ilustrativos). Los carriles 1-2 representan expresión de actina \alpha-sarcomérica; el carril 3 es un marcador de peso molecular; y los carriles 4-5 representan expresión de SERCA2.

La Figura 2 es una transferencia de Northern que muestra la presencia de ARNm de SERCA2 de rata en miocitos cardiacos de ratones transfectados con uno de varios adenovirus que codifican SERCA2; es decir, vectores bajo el control de un promotor de CMV (HH-1, HH-2 y SAI-3) o del promotor de TK (TK), para propósitos ilustrativos. Una construcción de control no contenía ningún polinucleótido de SERCA2 (ctrl.). Los números entre paréntesis indican el número de unidades formadores de placas (ufp) de cada construcción y se determinaron por infección de células L6 con construcciones de adenovirus durante 48 horas, extracción y resolución del ARN celular total en geles, y después hibridación de un ADNc de SERCA2 con el ARN en un análisis de Northern.

La Figura 3 muestra, con propósitos ilustrativos, las oscilaciones transitorias de calcio detectadas en miocitos neonatales transfectados con un vector de adenovirus (los valores promedio se representan mediante la célula nº 27) y en miocitos neonatales no transfectados (los valores promedio se representan mediante la célula nº 42). Las oscilaciones transitorias de calcio se miden fluorométricamente y se expresan en función del tiempo (eje x).

La Figura 4 muestra, con propósitos ilustrativos, un esquema de clonación y sitios de restricción apropiados para la inserción de una secuencia de SERCA2a en un vector. En particular, la SERCA2a de rata fusionada en el extremo 3' con un péptido señal flag SERCA2a-Flag se inserta bajo un promotor de CMV humano entre los sitios de restricción Xba I/Bam HI y Bgl II/Kpn I.

La Figura 5 muestra la expresión de \beta-gal codificado nuclear mediante la inyección en la pared libre del ventrículo izquierdo del corazón de ratón de AAV o virus adenoasociado después de 2, 4, 6 y 8 semanas de inyección.

La Figura 6 ilustra un efecto de la expresión de SERCA2a-Flag sobre mediciones funcionales de corazones prefundidos aislados frente a controles de GFP en ratones hipotiroideos 4 semanas después del suministro de gen de rAAV. *indica significativo; (p < 0,05) diferente de ratones tratados con AAV-GFP. Obsérvese que los ratones tratados con rAAV-SERCA-flag tienen una función mejorada sobre los tratados con AAV-GFP.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

Las siguientes definiciones se proporcionan para simplificar la discusión de la invención. No obstante, los especialistas en la técnica reconocerán que estas definiciones se pueden ampliar para incluir equivalentes sin apartarse del alcance o espíritu legítimo de la invención. Por este motivo, estas definiciones no se deben considerar como limitantes de la invención.

1. "Polinucleótido de SERCA2" se refiere a ADN o ARN y puede incluir cadenas con sentido y antisentido según sea apropiado para los objetivos de la terapia llevada a la práctica de acuerdo con la invención. Como se usa en este documento, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de mayor tamaño. Se puede deducir una secuencia polinucleotídica a partir del código genético, sin embargo, se tiene que tener en cuenta la degeneración del código. Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias que están degeneradas como resultado del código genético, pudiendo los especialistas en la técnica determinar fácilmente dichas secuencias.

2. "Codificar operativamente" se refiere a un polinucleótido que se ha modificado para incluir secuencias promotoras y otras necesarias para la expresión y, cuando se desee, la secreción del producto de traducción deseado; por ejemplo, un péptido o una proteína. Todas las realizaciones de la invención se pueden llevar a la práctica usando vectores de expresión recombinantes conocidos. Preferiblemente, estos vectores incluirán ADNc que codifiquen el producto de traducción deseado. Por lo tanto, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se asumirá que el término "polinucleótido" se refiere a secuencias operativamente codificantes contenidas en un vector de expresión recombinante adecuado, proporcionándose en este documento ejemplos de los mismos.

3. "Síntesis" se refiere a medios bien conocidos para sintetizar secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas y puede incluir aislamiento y purificación de polinucleótidos y proteínas nativas.

4. "Péptido" se refiere a péptidos pequeños, polipéptidos, oligopéptidos y proteínas que tienen un efecto biológico deseado in vivo.

5. "Suministro" se refiere a medios conocidos para introducir polinucleótidos operativamente codificantes en un huésped. Los especialistas en la técnica estarán familiarizados con, o pueden identificar fácilmente, tales medios de suministro; sin embargo, se puede hacer referencia con respecto a medios particularmente útiles de suministro en "Novel Drug Delivery Systems", (Marcel Dekker, 1992), cuyas descripciones pertinentes se incorporan en este documento como referencia con el propósito de ilustrar el estado de conocimiento en la técnica en lo que se refiere a técnicas para el suministro de fármacos.

6. "Huésped" se refiere al destinatario de la terapia que se va a practicar de acuerdo con la invención. El huésped puede ser cualquier vertebrado, pero preferiblemente será un mamífero. Si es un mamífero, el huésped será preferiblemente un ser humano, pero también puede ser un animal de ganado doméstico o mascota.

7. "Tejido diana" se refiere al tejido del huésped en el que se busca la expresión del polinucleótido operativamente codificante.

8. "Anticuerpo" se refiere a la inmunoglobulina completa de cualquier clase, anticuerpos quiméricos, anticuerpos híbridos con especificidades de antígeno dobles o múltiples y fragmentos que incluyen fragmentos híbridos. También se incluyen dentro del significado de "anticuerpo" conjugados de tales fragmentos y las denominadas proteínas de unión a antígeno (anticuerpos de cadena sencilla) como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 4.704.692 y anticuerpos antiidiotípicos (anticuerpos que se unen a otros anticuerpos) como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 4.699.880.

9. "Vector de expresión recombinante" se refiere a sistemas de un polinucleótido o polinucleótidos que codifican operativamente polipéptidos que se pueden expresar en eucariotas o procariotas. Los procedimientos para expresar secuencias de ADN que tienen secuencias eucariotas o virales en procariotas se conocen bien en la técnica. También se conocen bien en la técnica vectores de ADN viral y plasmídico biológicamente funcionales capaces de la expresión y replicación en un huésped. Los huéspedes pueden incluir organismos microbianos, de levadura, de insecto y de mamífero.

B. Construcciones polinucleotídicas para el uso en el procedimiento de la invención

La secuencia de nucleótidos para un clon genómico de SERCA2 de rata (véase también Rohrer, y col., J. Biol. Chem., 263: 6941-6944, 1988 [ARNm de SERCA2 de rata], cuya secuencia descrita se incorpora en este documento con propósito de referencia). El clon se obtuvo mediante técnicas de hibridación convencionales como se describe en Rohrer y col., J. Biol. Chem., 266: 8638-8646, 1991 (cuya descripción se incorpora en este documento con propósito de
referencia), que también indica los codones de inicio y terminación para la transcripción del clon (véase el

\hbox{Ejemplo
1).}

La secuencia de nucleótidos de la isoforma SERCA2 de la ATPasa del calcio (es decir, la isoforma "lenta" del músculo esquelético en comparación con la isoforma "rápida" del músculo estriado) está conservada en más del 90% entre especies de mamíferos. Por lo tanto, SERCA2 se ha identificado y secuenciado bastante fácilmente a partir de tejido muscular esquelético en especies de mamíferos no roedores, incluyendo seres humanos (GENBANK nº J4025; véase también GENBANK M23114-23116, M23277-23279 y Lytton y MacLennan, J. Biol. Chem., 263: 15024-15031, 1988); y conejos (MacLennan, DH, Nature, 316: 697-700, 1985 y GENBANK M33834). Aunque los especialistas en la técnica reconocerán que el uso del polinucleótido de SERCA2 humano se preferiría en gran medida en terapias humanas, el polinucleótido de SERCA2 de rata era más sencillo de usar y se prefiere para los propósitos de los experimentos descritos en los Ejemplos.

También se entenderá por los especialistas en la técnica que el procedimiento de la invención, que se describe en este documento específicamente con referencia a SERCA2, se puede adaptar ventajosamente al uso para el suministro de otras proteínas cardiacas cuya expresión y actividad están alteradas en el corazón con ICC. En particular, el gen que codifica el intercambiador de calcio/sodio de mamíferos es un sujeto particularmente atractivo para el suministro al corazón de acuerdo con el procedimiento de la invención, de la misma forma que la que se describe en este documento para el suministro de un polinucleótido de SERCA2.

Para obtener y usar las secuencias de SERCA2 incluidas en esta descripción y las conocidas en la técnica, también se pueden sintetizar ADN y ARN usando un equipamiento automático de síntesis de ácidos nucleicos bien conocido en la técnica. El uso de la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se prefiere particularmente para generar mezclas de polinucleótidos. Se pueden preparar ácidos nucleicos genómicos por medios bien conocidos en la técnica, tales como los protocolos descritos en Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Cap. 2 y 4 (Wiley Interscience, 1989). Se puede sintetizar ADNc de acuerdo con medios bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Maniatis y col., Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab, Nueva York, 1982). También se puede explorar una genoteca de expresión de ADNc que contenga polinucleótidos de interés por medios bien conocidos en la técnica.

Por ejemplo, estos medios incluyen, pero sin limitación: 1) hibridación de sondas con genotecas genómicas o de ADNc para detectar secuencias de nucleótidos compartidas; 2) exploración con anticuerpos de genotecas de expresión para detectar características estructurales compartidas y 3) síntesis mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El desarrollo de secuencias de ADN específicas codificantes o fragmentos de las mismas también puede obtenerse por: 1) aislamiento de secuencias de ADN bicatenario del ADN genómico; 2) fabricación química de una secuencia de ADN para proporcionar los codones necesarios para el polipéptido de interés; y 3) síntesis in vitro de una secuencia de ADN bicatenaria por transcripción inversa de ARNm aislado a partir de una célula donante eucariota. En el último caso, finalmente se forma un complemento de ADN bicatenario del ARNm que se denomina generalmente ADNc.

Los procedimientos de hibridación son útiles para la exploración de clones recombinantes mediante el uso de sondas oligonucleotídicas sintéticas mixtas marcadas, donde cada sonda es potencialmente el complemento completo de una secuencia de ADN específica en la muestra de hibridación que incluye una mezcla heterogénea de ADN bicatenario desnaturalizado. Para dicha exploración, la hibridación se realiza preferiblemente sobre ADN monocatenario o bien ADN bicatenario desnaturalizado. La hibridación es particularmente útil en la detección de clones de ADNc obtenidos de fuentes en las que está presente una cantidad extremadamente baja de secuencias de ARNm relacionadas con el polipéptido de interés. En otras palabras, mediante el uso de condiciones de hibridación rigurosas dirigidas para evitar la unión inespecífica es posible, por ejemplo, permitir la visualización autorradiográfica de un clon de ADNc específico mediante la hibridación del ADN diana con esa sonda única en la mezcla.

Se puede explorar una genoteca de ADNc que se crea que contiene un polinucleótido de interés inyectando diversos ARNm obtenidos de ADNc en ovocitos, dejando tiempo suficiente para que tenga lugar la expresión de los productos génicos de ADNc y ensayando para determinar la presencia del producto de expresión de ADNc deseado, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo específico para un péptido codificado por el polinucleótido de interés o mediante el uso de sondas para los motivos repetidos y un patrón de expresión tisular característico de un péptido codificado por el polinucleótido de interés. Alternativamente, una genoteca de ADNc puede explorarse indirectamente para la expresión de péptidos terapéuticos y/o inmunogénicos que tengan al menos un epítope usando anticuerpos específicos para los péptidos. Tales anticuerpos pueden obtenerse de forma policlonal o monoclonal y usarse para detectar producto de expresión indicativo de la presencia del ADNc de interés.

Los procedimientos de exploración que dependen de la hibridación de ácido nucleico hacen posible aislar cualquier secuencia génica de cualquier organismo, suponiendo que esté disponible la sonda apropiada. Las sondas oligonucleotídicas que se corresponden con una parte de la secuencia que codifica la proteína en cuestión, se pueden sintetizar químicamente. Esto requiere que se conozcan extensiones cortas de oligopéptidos de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ADN que codifica la proteína se puede deducir a partir del código genético, sin embargo, se debe tener en cuenta la degeneración del código. Es posible realizar una reacción de adición mixta cuando la secuencia está degenerada. Esto incluye una mezcla heterogénea de ADN bicatenario desnaturalizado. Para tal exploración, la hibridación se realiza preferiblemente sobre ADN monocatenario o ADN bicatenario desnaturalizado.

El polinucleótido de SERCA2 a usar en la invención puede ser ADN o ARN, pero será preferiblemente una secuencia de ADN complementario (ADNc). Las secuencias polinucleotídicas usadas en la invención deben (a) poder expresarse y (b) ser no replicantes o estar modificadas por ingeniería genética por medios bien conocidos en la técnica para que no se repliquen en el genoma del huésped. Preferiblemente, se usará en la invención un polinucleótido que codifica operativamente una proteína SERCA2 como parte de un vector de expresión recombinante, más preferiblemente una construcción de adenovirus.

Siguen ilustraciones de la preparación de polinucleótidos adecuados para el uso en la invención y a continuación se proporcionan ejemplos específicos que muestran cómo se prepararon composiciones de polinucleótidos particulares. Sin embargo, será evidente para los especialistas en la técnica que también pueden ser adecuados otros medios conocidos para preparar polinucleótidos que no se replican.

Los polinucleótidos de la invención incluyen derivados funcionales de polinucleótidos conocidos que codifican operativamente proteína SERCA2. Por "derivado funcional" se entiende un polinucleótido que codificará "fragmentos", "variantes", "análogos" o "derivados químicos" de SERCA2. Un "fragmento" de una molécula incluye cualquier subconjunto de péptidos de la molécula. Una "variante" de dicha molécula se refiere a una molécula de origen natural sustancialmente similar a la molécula completa o a un fragmento de la misma. Un "análogo" de una molécula se refiere a una molécula no natural sustancialmente similar a la molécula completa o a un fragmento de la misma.

Como se usa en este documento, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que normalmente no son parte de la molécula. Tales restos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, etc. de la molécula. Como alternativa, los restos pueden disminuir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Se describen restos que se conoce en la técnica que son capaces de mediar dichos efectos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Los polinucleótidos de SERCA2 se pueden conjugar con o usar en asociación con otros polinucleótidos que codifican operativamente proteínas reguladoras que controlan la expresión de estos polipéptidos o pueden contener secuencias de reconocimiento, promotoras y de secreción. Los especialistas en la técnica serán capaces de seleccionar polinucleótidos reguladores e incorporarlos en polinucleótidos de SERCA2 de la invención sin una experimentación innecesaria. Por ejemplo, se describen promotores adecuados para el uso en sistemas murinos o humanos y su uso en Current Protocols in Molecular Biology, anteriormente en el Cap. 1.

Una forma particularmente preferida de un polinucleótido de SERCA2 para el uso en la invención será una que se haya incorporado en un vector de expresión recombinante. El uso de un vector de expresión recombinante prolongará la expresión del gen en el tejido diana.

Los vectores de expresión recombinantes adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen los vectores descritos en Current Protocols in Molecular Biology, anteriormente en el Cap. 1. Dos vectores promotores plasmídicos particularmente preferidos son los vectores promotores pRSV (del virus del sarcoma de Rous) y pCMV (de citomegalovirus), particularmente el último. Esta preferencia se basa en observaciones de que se consiguen mayores niveles de expresión en este contexto cuando se emplea el promotor de CMV.

Se describe un protocolo adecuado para el aislamiento del promotor de RSV y su uso en la construcción de un vector plasmídico en Gorman, y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79: 6777, (1982). Otros vectores plasmídicos preferidos son pREP7 y pREV que están disponibles en el mercado en Invitrogen de San Diego, California. Para la clonación de polinucleótidos, un plásmido particularmente adecuado para la producción de ARNm es el vector de clonación pSP64T descrito por Kreig, y col., Nucleic Acids Res., 12: 7057-7070, (1984). Se puede introducir cualquier ADNc que contenga un codón de inicio en este plásmido y ARNm preparado a partir de los moldes de ADN expresados usando técnicas convencionales.

Un interruptor de "activación/desactivación" bien caracterizado para el uso en un vector de expresión recombinante es el sistema promotor regulado por antibiótico (tetraciclina). Los medios para la construcción de un sistema de este tipo se conocen bien en la técnica; para revisión a este respecto, los especialistas en la técnica pueden consultar Furth, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9302-9306, 1994 (control regulado por tetraciclina de la expresión génica en ratones transgénicos); Fishman, y col., J. Clin. Invest., 93: 1864-1868, 1993 (control por tetraciclina de la expresión génica cardiaca); y Niwa y col., Gene, 108: 193-200, 1991 (uso del sistema promotor para transfectantes de alta expresión). Se describe un plásmido que codifica SERCA2 bajo el control de un sistema promotor de tetraciclina en el Ejemplo 4.

La invención hace uso del virus adenoasociado (AAV). Este vector puede transferir o incorporar un gen para un marcador de selección de tal forma que se pueden identificar y generar células transducidas.

Se usan vectores de AAV en la presente invención debido a su eficacia de transfección (hasta del 70% en miocitos cardiacos). Dichos vectores también se usan en la presente invención debido a su capacidad para aceptar segmentos de ADN exógeno relativamente grandes, así como a su susceptibilidad para la producción a títulos elevados, a baja inmunogenicidad. Ventajosamente, los vectores de AAV sobreviven bien a la inyección intracoronaria (en comparación, por ejemplo, con conjugados de polilisina de polinucleótidos de SERCA2).

El virus adenoasociado (AAV) es un virus simple no patógeno de ADN monocatenario. Sus genes cap y rep que contienen la secuencia de empaquetamiento están intercalados entre las repeticiones terminales invertidas que definen el comienzo y el final del virus. El gen cap codifica las proteínas de cápside viral (envuelta) y el producto del gen rep está implicado en la replicación e integración viral. El AAV necesita un gen adicional proporcionado por un virus auxiliar, por ejemplo, adenovirus o virus herpes simple, para la replicación. El AAV infecta una diversidad de tipos celulares. Su ADN viral puede integrarse preferentemente en el cromosoma 19 humano.

Se puede producir un vector de AAV por sustitución de los genes rep y cap con un transgén y se puede usar como vector de terapia génica. Los vectores de AAV que contienen ADNc de factor IX humano se han construido y usado para infectar células hepáticas y musculares en ratones inmunocompetentes. Estos ratones fueron capaces de producir cantidades terapéuticas de proteína de factores IX en su sangre durante más de seis meses. En la patente de Estados Unidos Nº 6.416.992 se divulgan una composición y procedimientos para una producción a gran escala de vectores de AAV.

Una construcción de AAV particularmente preferida para el uso en la invención se muestra en el Ejemplo 1. La construcción se forma por clonación del polinucleótido de SERCA2 en un vector lanzadera que contiene un promotor, poliengarce y otros. El vector lanzadera adenoasociado particular empleado en la muestra se obtuvo del plásmido pSub201 descrito por Samulski y col. (Journal of Virology 63 (9): 3822-3828, 1989). Un fragmento Xba I de este plásmido se ligó con un fragmento de potenciador/promotor de CMV humano de 572 pb seguido de un sitio de clonación múltiple y una señal de poliadenilación. El plásmido se denominó AAV-Lanzadera y tiene un tamaño aproximado de 5000 pb.

Se ha descrito la secuencia codificante para la SERCA2a de rata fusionada en el extremo 3' con un péptido señal flag (He y col., J. Clin. Invest 100: 974-980, 1999). La proteína verde fluorescente (GFP) se puede clonar convenientemente en el AAV-Lanzadera usando las enzimas Kpn I/Xba I o Hind III/Xba (He y col., J. Clin. Invest 100: 974-980, 1999). Los clones recombinantes se verificaron por secuenciación de ADN y se han descrito y purificado grandes cantidades de plásmido pDG mediante un protocolo de maxipreparaciones de CsCl (Grimm y col., Human Gene Therapy 9: 2745-2760, 1998).

Para producir partículas de virus infeccioso puras, tanto el plásmido AAV-Lanzadera con el ADNc insertado como el plásmido pDG se introducen por transfección en células usando el procedimiento de coprecipitación con CaPO4. Después de la transfección, las células se cultivan con un medio recién preparado y, después, las partículas de virus se recogen y purifican. En la Figura 4 se muestra una ilustración esquemática del esquema de clonación y los sitios de restricción apropiados.

La encapsulación de SERCA2 para la administración liposomal (como se describe a continuación en la Sección C) también debería limitar la destrucción inmune del virus, como lo haría el uso de una construcción de AAV replicable. Sin embargo, dados los riesgos que pueden estar asociados con la integración de ADN viral en el genoma huésped, el uso de tales vectores se limitaría probablemente a situaciones en las que la expresión a largo plazo del producto del vector sea crítica para la supervivencia del paciente.

Mediante la inserción de una o más secuencias de interés en el vector de AAV viral junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector puede hacerse específico de diana.

Preferiblemente, se conseguirá evitar la transfección inespecífica de los vectores de expresión de AAV recombinantes de la invención en células miocárdicas distintas de miocitos diana mediante el uso de promotores específicos del corazón. Se conocen actualmente varios de dichos promotores e incluyen \beta-actina aviar (véase el Ejemplo 1). Los especialistas en la técnica conocerán, o podrán determinar fácilmente sin una experimentación excesiva otras secuencias polinucleotídicas específicas que se pueden insertar en el genoma viral para permitir el suministro específico de diana del vector viral que contiene los polinucleótidos de SERCA2 de interés.

La ventaja del uso de vectores de AAV para el suministro del transgén de SERCA2 en tejido cardiaco es que no se desarrolla ninguna respuesta inmune contra este vector y se obtiene persistencia de la expresión del transgén durante hasta siete meses. La descripción detallada del uso de vectores de AAV para el suministro del transgén de SERCA2 en el tejido cardiaco se presenta en el siguiente Ejemplo 1.

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C. Preparaciones farmacéuticas de polinucleótidos de SERCA2

Las composiciones de polinucleótidos de SERCA2 y mezclas de polinucleótidos de SERCA2 se pueden poner en una suspensión, solución o emulsión farmacéuticamente aceptable. Los medios adecuados incluyen solución salina y, para las realizaciones que no dependen de células presentadoras de antígenos para el suministro de los polinucleótidos de SERCA2 en tejido diana, pueden ser preparaciones liposomales.

Más específicamente, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen soluciones de reposición de líquidos y nutrientes, soluciones de reposición de electrolitos (tales como las basadas en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, una composición de polinucleótidos de SERCA2 puede liofilizarse usando medios bien conocidos en la técnica, para su posterior reconstitución y uso de acuerdo con la invención.

Además de los sistemas de suministro de vector dirigido que se han discutido anteriormente, también se puede usar un sistema de dispersión coloidal para el suministro dirigido. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma.

Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de suministro in vitro e in vivo. Se ha demostrado que vesículas unilaminares grandes (LUV), que varían en tamaño de 0,2-4,0 m, pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contiene macromoléculas grandes. Se puede encapsular ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y se pueden suministrar a células de una forma biológicamente activa (Fraley, y col., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). Además de células de mamífero, los liposomas se han usado para el suministro de polinucleótidos operativamente codificantes en células vegetales, de levadura y bacterianas. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia de genes eficaz, debe presentar las siguientes características: (1) encapsulación de los genes que codifican los polinucleótidos antisentido con alta eficacia aunque sin comprometer su actividad biológica; (2) unión preferente y sustancial a una célula diana en comparación con células no diana; (3) suministro del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con alta eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética (Mannino, y col., Biotechniques, 6: 682, 1988).

Habitualmente, la composición del liposoma es una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de temperatura de transición de fase elevada, habitualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También se pueden usar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de liposomas dependen de pH, fuerza iónica y presencia de cationes divalentes.

Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, donde el resto lipídico contiene 14-18 átomos de carbono, particularmente 16-18 átomos de carbono y está saturado. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.

La dirección de liposomas se puede clasificar en base a factores anatómicos y mecánicos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específica de órgano, específica de célula y específica de orgánulo. La dirección mecánica puede diferenciarse en base a si es pasiva o activa. La dirección pasiva utiliza la tendencia natural de los liposomas de distribuirse a células del sistema reticuloendotelial (SRE) en órganos que contienen capilares sinusoidales. Por otro lado, la dirección activa implica la alteración del liposoma por acoplamiento del liposoma con un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o proteína o por cambio de la composición o tamaño del liposoma para conseguir la dirección a órganos y tipos celulares distintos de los sitios de localización de origen natural.

La superficie del sistema de suministro dirigido se puede modificar de una diversidad de formas. En el caso de un sistema de suministro dirigido liposomal, se pueden incorporar grupos lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma para mantener el ligando de dirección en asociación estable con la bicapa liposomal. Se pueden usar diversos grupos de enlace para unir las cadenas lipídicas con el ligando de dirección.

Se espera que estas técnicas (y otras que se usan convencionalmente para facilitar el suministro de fármacos) se puedan adaptar a la preparación de polinucleótidos de SERCA2 para el uso en los procedimientos de la invención por los especialistas en la técnica sin una experimentación excesiva. En particular, aunque las estrategias que se han discutido en los párrafos anteriores no se han usado previamente, hasta donde saben los inventores, para el suministro de polinucleótidos de SERCA2 a miocitos in vivo, se piensa que son adecuados para el uso con ese fin. Por esta razón, las referencias que se han identificado anteriormente, aunque no son esenciales para los procedimientos de la invención, se incorporan en este documento como referencia. A continuación se exponen ejemplos específicos que ilustran esta idoneidad.

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D. Procedimiento para aumento in vivo de la actividad de SERCA2 cardiaca

Para los propósitos de la invención, es suficiente que los polinucleótidos de SERCA2 se suministren a una dosificación suficiente para causar la expresión del péptido biológicamente activo codificado por el polinucleótido. Preferiblemente, el nivel de expresión conseguido será suficiente para reemplazar sustancialmente la actividad de SERCA2 endógena "normal". Ventajosamente, los polinucleótidos SERCA2 estarán contenidos en un vector de expresión recombinante, preferiblemente un vector de AAV, y se formularán en una composición farmacéuticamente aceptable (como se ha descrito en la Sección C, anteriormente).

Los niveles y la actividad de SERCA2 "normales" variarán entre individuos y, por lo tanto, no se pueden cuantificar de forma absoluta para una especie particular. Sin embargo, un nivel de expresión de SERCA2 deseado para conseguir fines terapéuticos específicos (una "cantidad terapéuticamente beneficiosa") puede determinarse y mantenerse dentro de límites clínicos aceptables controlando los niveles previos y posteriores al tratamiento de proteína SERCA2, así como los signos clínicos de contractilidad y rendimiento cardiaco aumentados en un corazón con ICC. Se describen medios para controlar los niveles de SERCA2 a continuación en la sección F.

Los signos clínicos de aumento del rendimiento cardiaco y adaptación a estreses asociados con la ICC se conocen bien por los especialistas en la técnica cardiológica y se pueden determinar, por ejemplo, controlando el flujo sanguíneo, el volumen de bombeo cardiaco y la presión ventricular (mediante, por ejemplo, angiografía y ecocardiografía), índice de transporte de calcio (mediante evaluación in vitro de muestras de líquido cardiaco), estudios de tolerancia (mediante, por ejemplo, control de la frecuencia cardiaca en respuesta a un estrés de sobrecarga de presión en el corazón) y signos clínicos generales de una disminución de síntomas de ICC (por ejemplo, mayor resistencia del huésped y mayor facilidad de respiración). Las dosificaciones administradas se pueden modificar para conseguir fines terapéuticos particulares (por ejemplo, sobreexpresión de SERCA2 para estimular el transporte de calcio en huéspedes que padecen afecciones de ICC aguda). También se definirán los intervalos máximos y mínimos por extrapolación de los resultados a partir de datos de animales no humanos, tal como a partir del uso de los modelos que se han descrito anteriormente y de especies de mamíferos de mayor tamaño.

El suministro de polinucleótido de SERCA2 se realizará preferiblemente por infusión intravenosa o intracoronaria (preferiblemente mediante el uso de cateterización para minimizar el reflujo de polinucleótido hacia el interior de la raíz aórtica). Como alternativa, para conseguir una expresión de SERCA2 mayor y más inmediata, los polinucleótidos de SERCA2 pueden inyectarse en la pared intraventricular (mediante, por ejemplo, una técnica de toracotomía quirúrgica) o introducirse directamente en un ventrículo (mediante, por ejemplo, cateterización angiográfica). A partir de entonces, la expresión de SERCA2 se controlará y se repetirá el suministro cuando sea necesario. Los huéspedes tratados también deberían controlarse cuidadosamente para reacciones adversas, tales como respuestas inmunes contra los polinucleótidos o SERCA2, así como para la expresión excesiva de SERCA2 (como indica, por ejemplo, una prolongación excesiva de la diástole).

Sin embargo, en general, basándose en los resultados expuestos en los Ejemplos a continuación, el riesgo de efectos citopáticos u otros efectos adversos relacionados con el suministro por AAV de polinucleótidos de SERCA2 en miocitos in vivo parece ser bajo y se puede minimizar con la eliminación de contaminantes de vector de tipo silvestre y otra reducción en la inmunogenicidad del vector (tal como por encapsulación liposomal de vectores).

E. Modelos animales para ensayar el procedimiento de la invención

Se ha demostrado que la rata es un modelo experimental reproducible de insuficiencia cardiaca congestiva que, a pesar de la carencia de circulación colateral en el corazón de rata, predice aceptablemente las afecciones de ICC humanas. En particular, las ratas que se han sometido a un ligamiento quirúrgico de la arteria coronaria son modelos particularmente buenos de ICC después del infarto de miocardio en seres humanos. Los protocolos experimentales para la producción y el uso de ratas como modelos animales de ICC se han descrito bien en la técnica; como referencia, se puede remitir a los especialistas en la técnica a Pfieffer, y col., Am. J. Med., 76: 99-103, 1984; Johns y Olsen, Ann. Surg., 140: 675-682, 1954; y Selye, y col., Angiology, 11: 398-407, 1960 (cuyas descripciones se incorporan por esta referencia para ilustrar el conocimiento en la técnica en lo que se refiere al desarrollo y uso de modelos animales de ICC). Además, también se pueden usar ratones con un estado tiroideo disminuido o ratones hipotiroideos que tengan contractilidad cardiaca disminuida y una oscilación transitoria de calcio retrasada como un modelo experimental reproducible.

Además, se ha desarrollado un modelo animal transgénico que predice especialmente el impacto sobre el rendimiento cardiaco en el corazón con ICC en el que se ha aumentado la actividad de SERCA2 de acuerdo con el procedimiento de la invención. A continuación se describe un protocolo útil para reproducir estos animales transgénicos (que expresan un transgén de SERCA2) y se expone en el Ejemplo 1. Generalmente, el protocolo sigue técnicas convencionales para la introducción de transgenes expresables en mamíferos. Los especialistas en la técnica estarán familiarizados con estas aplicaciones y serán capaces de aplicar las técnicas en el contexto de la presente invención sin una experimentación excesiva.

Por ejemplo, se pueden usar células diana embrionarias en diversas fases de desarrollo para introducir transgenes. Se usan diferentes procedimientos dependiendo de la fase de desarrollo de la célula diana embrionaria. El cigoto es la mejor diana para la microinyección. En el ratón, el pronúcleo masculino alcanza el tamaño de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro, lo que permite una inyección reproducible de 1-2 pl de solución de ADN. El uso de cigotos como una diana para la transferencia de genes tiene una ventaja fundamental por el hecho de que, en la mayoría de los casos, el ADN inyectado se incorporará en el gen huésped antes de la primera escisión (Brinster, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985). Como consecuencia, todas las células del animal no humano transgénico llevarán el transgén incorporado. En general, esto también se reflejará en la transmisión eficaz del transgén a la descendencia del fundador puesto que el 50% de las células germinales llevarán el transgén. La microinyección de cigotos es el procedimiento preferido para incorporar transgenes en la práctica de la invención.

También se puede usar una infección retroviral para introducir el transgén en un animal no humano. El embrión no humano en desarrollo se puede cultivar in vitro hasta la fase de blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser dianas para la infección retroviral (Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci USA 73: 1260-1264, 1976). La infección eficaz de los blastómeros se obtiene por tratamiento enzimático para eliminar la zona pelúcida (Hogan, y col., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986). El sistema de vector viral usado para introducir el transgén típicamente es un retrovirus sin capacidad de replicación que lleva el transgén (Jahner, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6927-6931, 1985; Van der Putten, y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 6148-6152). La transfección se obtiene de forma sencilla y eficaz cultivando los blastómeros en una monocapa de células productoras de virus (Van der Putten, anteriormente; Steward, y col., EMBO J., 6: 383-388, 1987).

Como alternativa, la infección se puede realizar en una fase posterior. Se pueden inyectar virus o células productoras de virus en el blastocele (Jahner, y col., Natures, 298: 623-628, 1982). La mayoría de los fundadores serán mosaicos para el transgén ya que la incorporación se produce solamente en un subconjunto de las células que forman el animal transgénico no humano. Además, el fundador puede contener diversas inserciones retrovirales del transgén en diferentes posiciones en el genoma, que generalmente se segregarán en la descendencia. Además, también es posible introducir transgenes en la línea germinal, aunque con baja eficacia, mediante infección retroviral intrauterina del embrión en la mitad de la gestación. (Jahner, y col., anteriormente, 1982).

Un tercer tipo de célula diana para la introducción del transgén es la célula madre embrionaria (ES). Se obtienen células ES a partir de embriones de preimplantación cultivados in vitro y fusionados con embriones (Evans, y col., Nature, 292: 154-156, 1981; Bradley, y col., Nature, 309: 255-258, 1984; Gossler, y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 83: 9065-9069, 1986; y Roberston, y col., Nature, 322: 445-448, 1986). Los transgenes se pueden introducir de forma eficaz en las células ES por transfección de ADN o por transducción mediada por retrovirus. Después de esto, estas células ES transformadas se pueden combinar con blastocistos de un animal no humano. Después de esto, las células ES colonizarán el embrión y contribuirán a la línea germinal del animal quimérico resultante (véase para una revisión, Jaenisch, Science, 240: 1468-1474, 1988).

Preferiblemente, para el uso como un modelo animal en el contexto de la invención, el transgén de elección será uno que incluye un promotor capaz de conducir a un nivel de expresión relativamente elevado de SERCA2. Un promotor preferido para el uso a este respecto es el potenciador de CMV humano ligado a un promotor de \beta-actina (por ejemplo, de una especie aviar) que incluye un intrón de \beta-actina. Para la detección de la actividad de expresión del transgén, se incluyó una región codificante para el epítope antigénico Flag, que se ha descrito en otra parte anteriormente, en la región del transgén que codifica la región C-terminal de SERCA2. Como se describe en el Ejemplo 1, la progenie que expresa el transgén de los animales fundadores viven hasta la edad adulta; se puede esperar que al menos aproximadamente el 15% de la progenie de una línea fundadora lleve el transgén.

F. Procedimientos para controlar la expresión in vivo de SERCA2

Para los propósitos de controlar la expresión de SERCA2, los polinucleótidos de SERCA2 a introducir en un huésped de acuerdo con la invención se pueden modificar para incluir genes indicadores conocidos. Por ejemplo, el vector de ADN pRSV lac-Z descrito en Norton, y col., Mol. Cell. Biol., 5: 281, 1985, puede producir \beta-galactosidasa con expresión de proteína. También se pueden usar la luciferasa y la cloranfenicol acetiltransferasa ("CAT"; véase, por ejemplo, Gorman, y col., anteriormente, construcción re de un plásmido pRSV-CAT). Otra molécula indicadora útil es el péptido antigénico Flag, que se puede detectar fácilmente mediante inmunoensayo. La secuencia de 8 aminoácidos para el péptido antigénico Flag y las regiones codificantes para el mismo se conocen en la técnica; como referencia a este respecto, los especialistas en la técnica pueden consultar Chiang, y col., Peptide Res., 6: 62-64, 1993. La inserción de un gen indicador para la codificación en el extremo C-terminal de la proteína SERCA2 (por ejemplo, por inserción del gen a aproximadamente 15 pb del codón de inicio) no interferirá con la actividad catalítica de SERCA2. Los medios para la detección de la expresión de tales genes indicadores se conocen bien en la técnica y no se describirán en detalle, pero se resumen a continuación.

Por ejemplo, la SERCA2 expresada in vivo después de la introducción de un polinucleótido de SERCA2 de acuerdo con la invención se puede detectar por inmunoensayos en los que se puede utilizar la proteína SERCA2 en fase líquida o unida a un soporte en fase sólida. Además, la proteína SERCA2a que se va a utilizar en estos ensayos se puede marcar de forma detectable de diversas formas. Además, se pueden utilizar anticuerpos contra SERCA2 o un producto génico indicador para detectar la expresión de polinucleótido de SERCA2 en muestras de ensayo, tales como sangre o suero.

En resumen, dichos anticuerpos pueden producirse por medios que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos que sean específicos para SERCA2 o productos génicos indicadores por inmunización de un animal no humano con SERCA2 antigénica o péptidos de genes indicadores. Dichos péptidos pueden aislarse de fuentes nativas (véase, por ejemplo, el procedimiento usado para aislar SERCA2 de rata, descrito en Popovich, y col., Am. J. Physiol., 261: E377-E381, 1991, cuya descripción se incorpora en este documento con propósito de revisión) o se pueden sintetizar sin una experimentación excesiva mediante procedimientos usados comúnmente tales como protección con t-BOC o FMOC de grupos alfa-amino.

Los últimos procedimientos implican síntesis por etapas por la que se añade un solo aminoácido en cada etapa partiendo del extremo C-terminal del péptido (véase, Coligan, y col., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 991, Unidad 9). También se pueden sintetizar péptidos para el uso a este respecto mediante diversos procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida bien conocidos, tales como los descritos por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149, 1962, y Stewart y Young, Solid Phase Peptides Synthesis, (Freeman, San Francisco, 27-62, 1969), usando un copoli(estireno-divinilbenceno) que contiene 0,1-1,0 mM de aminas/g de polímero.

Tras la finalización de la síntesis química, los péptidos pueden desprotegerse y escindir del polímero por tratamiento con HF líquido con anisol al 10% durante aproximadamente 1/4-1 horas a 0ºC. Después de la evaporación de los reactivos, los péptidos se extraen del polímero con solución de ácido acético al 1% que después se liofiliza para producir el material en bruto. Normalmente, éste puede purificarse mediante técnicas tales como filtración en gel en Sephadex G-15 usando ácido acético al 5% como disolvente. La liofilización de las fracciones apropiadas de la columna proporcionará el péptido homogéneo o derivados del péptido, que después pueden caracterizarse mediante técnicas convencionales tales como análisis de aminoácidos, cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alto rendimiento, espectroscopía de absorción de ultravioleta, rotación molar, solubilidad y cuantificarse mediante la degradación de Edman en fase sólida. La antigenicidad de péptidos de interés puede determinarse mediante técnicas convencionales para determinar la magnitud de la respuesta de anticuerpos de un animal que se ha inmunizado con el péptido.

Una vez que se preparan péptidos SERCA2 antigénicos, se producen anticuerpos contra el péptido de inmunización por introducción del péptido en un mamífero (tal como un conejo, ratón o rata). Se prefiere un protocolo de inmunización de inyecciones múltiples para el uso en la inmunización de animales con los péptidos antigénicos (véase, por ejemplo, Langone, y col., eds., "Production of Antisera with Small Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections", Methods of Enzymology (Acad. Press. 1981)). Por ejemplo, habitualmente se puede obtener una buena respuesta de anticuerpos en conejos mediante inyección intradérmica de 1 mg de péptido antigénico emulsionado en adyuvante completo de Freund, seguida varias semanas después de uno o más refuerzos del mismo antígeno en adyuvante incompleto de Freund.

Si se desea, el péptido inmunizante puede acoplarse con una proteína transportadora por conjugación usando técnicas que se conocen bien en la técnica. Tales vehículos usados comúnmente que están químicamente acoplados con el péptido incluyen hemocianina de lapa californiana (KLH), tiroglobulina, albúmina sérica bovina (BSA) y toxoide tetánico. Después, el péptido acoplado se usa para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón o un conejo). Debido a que actualmente se piensa que SERCA2 está bastante bien conservada entre especies de mamíferos, se prefiere el uso de una proteína transportadora para potenciar la inmunogenicidad de proteínas SERCA2.

Los anticuerpos policlonales producidos por los animales pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, por unión a y elución de una matriz a la que está unida el péptido contra el que se generaron los anticuerpos. Los especialistas en la técnica conocerán diversas técnicas comunes en la técnica de la inmunología para la purificación y/o concentración de anticuerpos policlonales, así como de anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Coligan, y col., Unidad 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).

Por su especificidad y facilidad de producción, se prefieren anticuerpos monoclonales para el uso en la detección de la expresión de SERCA2. Para la preparación de anticuerpos monoclonales se prefiere la inmunización de un ratón o rata. El término "anticuerpo", como se usa en esta invención, también pretende incluir moléculas intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}, que son capaces de unirse al determinante epitópico. Además, en este contexto, la expresión "mAb de la invención" se refiere a anticuerpos monoclonales con especificidad por SERCA2 o productos de genes indicadores.

El procedimiento general usado para la producción de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales ("mAb") se conoce bien (Kohler y Milstein, Nature, 256: 495, 1975). En resumen, como se describe por Kohler y Milstein, la técnica comprendía linfocitos aislados de ganglios linfáticos de drenaje regional de cinco pacientes con cáncer diferentes con melanoma, teratocarcinoma o cáncer de cuello uterino, glioma o de pulmón, que se obtuvieron de muestras quirúrgicas, se combinaron y después se fusionaron con SHFP-1. Los hibridomas se exploraron para determinar producción de anticuerpo que se unía a líneas celulares de cáncer.

Se puede conseguir la confirmación de especificidad de antígeno entre mAb usando técnicas de exploración relativamente rutinarias (tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o "ELISA") para determinar el patrón de reacción elemental del mAb de interés. También es posible evaluar un mAb para determinar si tiene la misma especificidad que un mAb de la invención sin una experimentación excesiva, determinando si el mAb que se está ensayando impide que un mAb de la invención se una al antígeno de interés aislado como se ha descrito anteriormente. Si el mAb que se está ensayando compite con el mAb de la invención, como se muestra por una disminución en la unión por el mAb de la invención, entonces es probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo epítope o a uno estrechamente relacionado.

Otra forma más de determinar si un mAb tiene la especificidad de un mAb de la invención es preincubar el mAb de la invención con un antígeno con el que normalmente sea reactivo y determinar si el mAb que se está ensayando está inhibido en su capacidad para unirse al antígeno. Si el mAb que se está ensayando está inhibido, entonces, con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica, o una estrechamente relacionada, que el mAb de la
invención.

Los anticuerpos monoclonales de SERCA2 que reconocen un epítope compartido por MHC\alpha y MHC\beta serán particularmente útiles para determinar que la SERCA2 detectada está estructuralmente esencialmente inalterada. Tales mAb se describen con suficiente detalle para ser reproducidos por Dorn, y col., Am. J. Physiol., 267: H400-H405, 1994, cuya descripción se incorpora en este documento para el uso como una revisión y como referencia.

Los ejemplos de inmunoensayos que se pueden usar para detectar la expresión de SERCA2 son inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto. Los ejemplos de tales inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA), el de tipo sándwich (ensayo inmunométrico) y el ensayo de transferencia de Western. La detección de anticuerpos que se unen a SERCA2 o a un producto de gen indicador se puede realizar utilizando inmunoensayos que se procesan del modo directo, inverso o simultáneo, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos sobre muestras fisiológicas. Para el uso a este aspecto se prefieren particularmente los kits de ensayo disponibles en el mercado para la detección de productos de genes indicadores tales como lac-Z o \beta-gal (por ejemplo, \beta-galactosidasa).

La concentración de antígeno o anticuerpo a usar variará dependiendo del tipo de inmunoensayo y de la naturaleza del marcador detectable que se use. Sin embargo, independientemente del tipo de inmunoensayo que se use, la concentración de antígeno o anticuerpo a utilizar puede determinarse fácilmente por un especialista en la técnica usando una experimentación rutinaria.

Dicho antígeno o anticuerpos pueden unirse a muchos vehículos diferentes y usarse para detectar la presencia de anticuerpo o antígeno específicamente reactivo con los mismos. Los ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los especialistas en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para usar a este respecto o serán capaces de determinarlos usando una experimentación rutinaria.

Existen muchos marcadores y procedimientos de marcaje diferentes conocidos por los especialistas en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden usar en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes.

Como alternativa, se pueden detectar polinucleótidos de SERCA2 (preferiblemente en muestras de células diana obtenidas mediante el uso de técnicas de biopsia de tejido cardiaco convencionales) usando protocolos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa conocidos en la técnica, resumiéndose a continuación las técnicas generales para los mismos.

El ácido nucleico de cualquier muestra de tejido histológica, en forma purificada o no purificada, se puede utilizar como el ácido o ácidos nucleicos de partida, suponiendo que contenga o se sospeche que contiene la secuencia de ácido nucleico específica que contiene el ácido nucleico diana. Por tanto, el procedimiento puede emplear, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN mensajero (ARNm), donde al ADN o ARN puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. En el caso que el que se vaya a usar ARN como molde, se utilizarán enzimas y/o condiciones óptimas para la transcripción inversa del molde en ADN. Además, se puede utilizar un híbrido de ADN-ARN que contenga una cadena de cada uno. También se puede emplear una mezcla de ácidos nucleicos o los ácidos nucleicos producidos en una reacción de amplificación previa en este documento, usando los mismos o diferentes cebadores. La secuencia de nucleótidos a amplificar puede ser una fracción de una molécula de mayor tamaño o puede estar presente inicialmente como una molécula separada, de modo que la secuencia específica constituya el ácido nucleico completo. No es necesario que la secuencia a amplificar esté presente inicialmente en una forma pura; puede ser una fracción minoritaria de una mezcla compleja, tal como contenida en el ADN humano completo.

Cuando la secuencia de nucleótidos diana de la muestra contiene dos cadenas, es necesario separar las cadenas del ácido nucleico antes de que pueda usarse como molde. La separación de las cadenas se puede realizar como una etapa separada o simultáneamente con la síntesis de los productos de extensión de cebadores. Esta separación de cadenas se puede conseguir usando diversas condiciones desnaturalizantes adecuadas, incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos; la palabra "desnaturalizante" incluye todos dichos medios. Un procedimiento físico para separar cadenas de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que se desnaturalice. La desnaturalización por calor típica puede implicar temperaturas que varían de aproximadamente 80 a 105ºC durante tiempos que varían de aproximadamente 1 a 10 minutos. La separación de cadenas también se puede inducir por una enzima de la clase de enzimas conocidas como helicasas o por la enzima RecA, que tiene actividad helicasa, y en presencia de riboATP que se sabe que desnaturaliza el ADN. Las condiciones de reacción adecuadas para la separación de cadenas de ácidos nucleicos con helicasas se describen por Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43: 63, 1978) y las técnicas para el uso de RecA se revisan en C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16: 405-437, 1982).

Si el ácido nucleico que contiene el ácido nucleico diana a amplificar es de cadena sencilla, su complementario se sintetiza añadiendo uno o dos cebadores oligonucleotídicos. Si se utiliza un único cebador, se sintetiza un producto de extensión del cebador en presencia del cebador, un agente para la polimerización y los cuatro nucleósidos trifosfato que se describen a continuación. El producto será complementario al ácido nucleico de cadena sencilla e hibridará con un ácido nucleico de cadena sencilla para forma un dúplex de cadenas de distinta longitud que después se pueden separar en cadenas sencillas para producir dos cadenas sencillas complementarias separadas. Como alternativa, pueden añadirse dos cebadores al ácido nucleico de cadena sencilla y llevarse a cabo la reacción como se ha descrito.

Cuando se separan cadenas complementarias de un ácido o ácidos nucleicos, independientemente de si el ácido nucleico era originariamente de cadena doble o sencilla, las cadenas separadas están listas para usarse como molde para la síntesis de cadenas de ácido nucleico adicionales. Esta síntesis se realiza en condiciones que permiten la hibridación de cebadores con moldes. La síntesis tiene lugar generalmente en una solución acuosa tamponada, preferiblemente a pH de 7-9, más preferiblemente de aproximadamente 8. Preferiblemente se añade un exceso molar (para ácido nucleico genómico, habitualmente aproximadamente cebador:molde 10^{8}:1) de los dos cebadores oligonucleotídicos al tampón que contiene las cadenas de molde separadas. Sin embargo, se entiende que la cantidad de cadena complementaria puede desconocerse si el procedimiento de la invención se usa para aplicaciones de diagnóstico, de modo que la cantidad de cebador con respecto a la cantidad de cadena complementaria no puede determinarse con seguridad. Sin embargo, como una cuestión práctica, la cantidad de cebador añadido estará generalmente en exceso molar con respecto a la cantidad de cadena complementaria (molde) cuando la secuencia a amplificar esté contenida en una mezcla de cadenas de ácido nucleico de cadena larga complicadas. Se prefiere un gran exceso molar para mejorar la eficacia del procedimiento.

En algunas realizaciones de amplificación, los sustratos, por ejemplo, los desoxirribonucleótidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP y dTTP se añaden a la mezcla de síntesis, por separado o junto con los cebadores, en cantidades adecuadas, y la solución resultante se calienta hasta aproximadamente 90-100ºC durante aproximadamente 1 a 10 minutos, preferiblemente de 1 a 4 minutos. Después de este periodo de calentamiento, se deja enfriar la solución hasta la temperatura ambiente, que es preferible para la hibridación del cebador. A la mezcla enfriada se añade un agente apropiado para realizar la reacción de extensión de cebadores (denominado en este documento "agente para la polimerización") y se deja que se produzca la reacción en condiciones conocidas en la técnica. El agente para la polimerización también se puede añadir junto con los otros reactivos si es termoestable. Esta reacción de síntesis (o amplificación) puede tener lugar a temperatura ambiente hasta una temperatura por encima de la cual el agente para la polimerización deja de funcionar. Por tanto, por ejemplo, si se usa una ADN polimerasa como agente, la temperatura generalmente no es superior a aproximadamente 40ºC.

El agente para la polimerización puede ser cualquier compuesto o sistema que funcione para conseguir la síntesis de productos de extensión de cebadores, incluyendo enzimas. Las enzimas adecuadas para este propósito incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, polimerasa Taq, fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa T4, otras ADN polimerasas disponibles, muteínas de polimerasa, transcriptasa inversa, ligasa y otras enzimas, incluyendo enzimas termoestables (es decir, las enzimas que realizan la extensión de cebadores después de someterse a temperaturas suficientemente elevadas para causar la desnaturalización). Las enzimas adecuadas facilitarán la combinación de los nucleótidos de la forma apropiada para formar los productos de extensión de cebadores que son complementarios a cada cadena de nucleótidos mutante. Generalmente, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada cebador y avanzará en la dirección 5' a lo largo de la cadena de molde, hasta que la síntesis termine, produciendo moléculas de diferentes longitudes. Sin embargo, puede haber agentes para la polimerización que inicien la síntesis en el extremo 5' y avanzan en la otra dirección, usando el mismo procedimiento que se ha descrito anterior-
mente.

La cadena de nucleótidos mutante recién sintetizada y su cadena de ácido nucleico complementaria formarán una molécula de doble cadena en las condiciones de hibridación que se han descrito anteriormente, y este híbrido se usa en las etapas posteriores del procedimiento. En la siguiente etapa, la molécula de doble cadena recién sintetizada se somete a condiciones desnaturalizantes usando cualquiera de los procedimientos que se han descrito anteriormente para proporcionar moléculas de cadena sencilla.

El procedimiento anterior se repite sobre las moléculas de cadena sencilla. Si es necesario, se puede añadir agente para la polimerización, nucleósidos y cebadores adicionales, para que la reacción se desarrolle en las condiciones que se han establecido anteriormente. De nuevo, la síntesis se iniciará en un extremo de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos y avanzará a lo largo de las cadenas sencillas del molde para producir un ácido nucleico adicional. Después de esta etapa, la mitad del producto de extensión estará constituido por la secuencia de ácido nucleico específica unida por los dos cebadores.

Las etapas de desnaturalización y síntesis de producto de extensión se pueden repetir tan a menudo como sea necesario para amplificar la secuencia de nucleótidos mutante diana en el grado necesario para la detección. La cantidad de la secuencia de nucleótidos mutante producida se acumulará de un modo exponencial.

El producto amplificado se puede detectar por análisis de transferencia de Southern, sin usar sondas radiactivas. En un procedimiento de este tipo, por ejemplo, se amplifica una muestra pequeña de ADN que contiene un nivel muy bajo de secuencia de nucleótidos diana y se analiza mediante una técnica de transferencia de Southern. El uso de sondas o marcadores no radiactivos se favorece por el alto nivel de la señal amplificada.

Un procedimiento preferido para la realización de una PCR cuantitativa es una técnica de PCR competitiva realizada usando un molde competidor que contiene una mutación inducida de uno o más pares de bases que da como resultado que el competidor difiera en secuencia o tamaño del molde del gen diana. Uno de los cebadores está biotinilado o, preferiblemente, aminado de modo que una cadena (habitualmente la cadena antisentido) del producto de PCR resultante puede inmovilizarse mediante un enlace amino-carboxilo, amino-amino, biotina-estreptavidina u otro enlace fuerte adecuado en un soporte de fase sólida que se ha unido firmemente a un reactivo apropiado. Más preferiblemente, los enlaces entre el producto de PCR, el soporte en fase sólida y el reactivo serán covalentes, haciendo de este modo a los enlaces resistentes con cierta precisión al desacoplamiento en condiciones desnaturalizantes.

Una vez que las cadenas aminadas o biotiniladas de los productos de PCR están inmovilizadas, las cadenas complementarias no unidas se separan en un lavado desnaturalizante alcalino y se eliminan del entorno de reacción. Los oligonucleótidos específicos de secuencia ("SSO") que se corresponden con los ácidos nucleicos diana y competidor se marcan con un marcador de detección. Después, los SSO hibridan con las cadenas antisentido en ausencia de competición por parte de las cadenas con sentido no unidas eliminadas. Se añaden reactivos de ensayo apropiados y se mide el grado de hibridación por medios de medición por ELISA apropiados para el marcador de detección y los medios de soporte en fase sólida usados, preferiblemente un lector de microplacas de ELISA. Los valores medidos se comparan con el contenido de ácido nucleico diana obtenido usando una curva patrón obtenida por separado a partir de reacciones de PCR que amplifican moldes, incluyendo moldes de diana y competidor.

Este procedimiento es ventajoso por el hecho de ser cuantitativo, no depende del número de ciclos de PCR y no está influenciado por la competición entre la sonda SSO y la cadena complementaria en el producto de PCR.

Como alternativa, parte de la etapa de polimerización y toda la etapa de hibridación se pueden realizar sobre un soporte en fase sólida. En este procedimiento, se captura un cebador de polimerización de nucleótidos (preferiblemente un oligonucleótido) sobre un soporte en fase sólida en vez de una cadena de los productos de PCR. Después, los productos de PCR de ácido nucleico diana y competidor se añaden en solución al soporte en fase sólida y se realiza una etapa de polimerización. Las cadenas con sentido no unidas del producto de polimerización se eliminan en las condiciones desnaturalizantes que se han descrito anteriormente.

Se puede determinar una proporción de ácido nucleico diana con respecto a competidor por detección de sondas SSO oligonucleotídicas marcadas usando medios de medición apropiados (preferiblemente lectores de ELISA). La eficacia de este procedimiento puede ser tan elevada que puede ser innecesaria una reacción en cadena en la etapa de polimerización, acortando de este modo, el tiempo necesario para realizar el procedimiento. La precisión del procedimiento también se aumenta debido a que los productos de polimerización finales no tienen que transferirse desde un tubo de reacción a un soporte en fase sólida para la hibridación, limitando de este modo el potencial de su pérdida o daño. Sin embargo, si es necesario para una muestra particular, puede usarse la PCR para amplificar los ácidos nucleicos diana y competidor en un tubo de reacción separado, seguido de una polimerización final realizada sobre el soporte en fase sólida.

Las moléculas capaces de proporcionar diferentes señales detectables indicativas de la formación de productos de PCR unidos conocidas por los especialistas en la técnica (tales como cromóforos de nucleótidos marcados que formarán diferentes colores indicativos de la formación de productos de PCR diana y competidor) se pueden añadir a la solución de reacción durante los últimos pocos ciclos de la reacción. La proporción entre los ácidos nucleicos diana y competidor también se puede determinar por ELISA u otro medio de medición apropiado y reactivos que reaccionan con marcadores de detección acoplados en el extremo 3' de los cebadores de hibridación inmovilizados. Este procedimiento también se puede adaptar para detectar si un gen particular está presente en la muestra (sin cuantificarlo) realizando un protocolo de PCR no competitiva convencional.

Los especialistas en la técnica conocerán, o pueden determinar fácilmente, como seleccionar cebadores adecuados para el uso en los procedimientos anteriores. Para detalles adicionales con respecto a las técnicas que se han descrito anteriormente se puede hacer referencia a las descripciones en Kohsaka, y col., Nuc. Acids. Res., 21: 3469-3472, 1993; Bunn, y col., patente de Estados Unidos Nº 5.213.961; y a Innis, y col., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Acad. Press, 1990, cuyas descripciones se incorporan en este documento solamente con el propósito de ilustrar el estado de la técnica en lo que se refiere a protocolos de PCR cuantitativa.

Los polinucleótidos de SERCA2 detectados como se ha descrito anteriormente pueden evaluarse, detectarse, clonarse, secuenciarse y similares adicionalmente, en solución o después de unirse a un soporte sólido, mediante cualquier procedimiento aplicado habitualmente para la detección de una secuencia de ADN específica tal como PCR, restricción de oligómeros (Saiki, y col., Bio/Technology, 3: 1008-1012, 1985), análisis de sonda oligonucleotídica específica de alelo (ASO) (Conner, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 278, 1983), ensayos de ligación de oligonucleótidos (OLA) (Landegren, y col., Science, 24: 1077, 1988) y similares. Se han revisado técnicas moleculares para el análisis de ADN y se conocen bien en la técnica (Landegren, y col., Science, 242: 229-237, 1988).

Habiéndose descrito la invención completamente, se exponen a continuación ejemplos que ilustran su puesta en práctica. Sin embargo, estos ejemplos no deben considerarse limitantes del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.

En los ejemplo, la abreviatura "min" se refiere a minutos, "h" se refiere a horas y se hace referencia a unidades de medición (tales como "ml") mediante las abreviaturas convencionales.

Ejemplo 1 Clonación y expresión de SERCA2 con un vector de AAV y evaluación de función de miocitos cardiacos en miocardio de ratón

El ADNc de SERCA2 se clonó en un vector viral adenoasociado usando técnicas de clonación convencionales. Básicamente, la construcción de un virus adenoasociado que expresa SERCA2 o una secuencia indicadora de GFP se realizó del siguiente modo:

El vector lanzadera adenoasociado se obtuvo del plásmido pSub201 descrito por Samulski y col., Journal of Virology 63: 3822-3828, 1989). Un fragmento Xba I de este plásmido se ligó en un fragmento de potenciador/promotor de CMV humano de 572 pb seguido de un sitio de clonación múltiple y una señal de poliadenilación. Este plásmido se denominó AAV-Lanzadera y tiene un tamaño aproximado de 5.000 pb.

Las secuencias codificantes para la SERCA2a de rata fusionada en el extremo 3' con un péptido señal flag y para la proteína verde fluorescente (GFP) clonada en el AAV-Lanzadera usando las enzimas Kpn I/Xba I o las enzimas Hind III/Xba, respectivamente, se han descrito (He y col., J. Clin. Invest 100: 974-980, 1999). Los clones recombinantes se verificaron por secuenciación de ADN y se purificaron grandes cantidades de plásmido mediante un protocolo de maxipreparaciones de CsCl. El plásmido pDG se describió por Grimm y col., (Human Gene Therapy 9: 2745-2760, 1998) y también se purificó con CsCl.

Para la producción de partículas de virus infeccioso puras, tanto el plásmido AAV-Lanzadera con el ADNc insertado como el plásmido pDG se introdujeron por transfección con el procedimiento de coprecipitación con CaPO4 en células 293T. Para cada preparación de virus se usaron 50 placas de cultivo celular con un diámetro de 15 cm, sembradas con células 293T subconfluentes. Para cada placa de 15 cm, se introdujeron por transfección 18 microgramos de plásmido lanzadera y 70 microgramos del plásmido pDG. Después de la transfección, al día siguiente se cambió el medio a DMEM recién preparado que contenía suero fetal bovino al 10% y las células se incubaron durante 2 días más a 37 grados centígrados y CO_{2} al 5%.

La recogida de partículas de virus se realizó mediante retirada por raspado de las células 293T de cada placa en 2,5 ml de DMEM. Después, las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en 25 ml de DMEM y se congelaron a -80 grados centígrados. Después de dos ciclos más de congelación-descongelación se añadieron 100 microgramos de ADNasa I y ARNasa H y la suspensión se incubó a 37 grados centígrados durante 30 min. Después de otra centrifugación a 3000 g, el sobrenadante se llevó a desoxicolato al 0,5% y se incubó durante 30 min a 37 grados centígrados. Después, esta solución se filtró secuencialmente a través de un filtro de jeringa de 5 micrómetros y 0,8 micrómetros y se hizo girar en una rueda a temperatura ambiente durante una hora con 3 ml de una suspensión de heparina-agarosa. Después, la suspensión se cargó en una columna de vidrio y la resina de heparina-agarosa se lavó con 25 ml de PBS que contenía NaCl 0,254 M. Después del lavado, las partículas de virus se eluyeron con PBS que contenía NaCl 0,554 M y se mantuvieron en fracciones pequeñas para la evaluación del título. Las fracciones con mayor título se combinaron y dializaron contra PBS y se almacenaron a 4 grados centígrados. En la Figura 4 se muestra una ilustración esquemática del esquema de clonación y los sitios de restricción apropiados.

Después, el vector viral se administró en la pared ventricular izquierda de ratones hipotiroideos. Los ratones con un estado tiroideo disminuido o ratones hipotiroideos tienen una contractilidad cardiaca disminuida y una oscilación transitoria de calcio retrasada. El vector adenoviral se suministró en alícuotas de 5-10 \mul y se inyectó en la pared ventricular izquierda en cinco regiones diferentes.

La eficacia de expresión del AAV con transgenes diana es uniforme y se conoce bien en la técnica. Esto conduce a la expresión del transgén en aproximadamente el 50% de los miocitos cardiacos. También se ha obtenido un resultado similar inyectando en la pared libre del ventrículo izquierdo del corazón de ratón AAV o virus adenoasociado que expresa \beta-Gal codificada nuclear (Figura 5). En este caso, los animales se sacrificaron a las 2, 4, 6 u 8 semanas después de la inyección de adenovirus o AAV. Los datos de los corazones de ratón indican que la expresión robusta de AAV persiste después de 6 u 8 semanas desde la inyección, mientras que la expresión de adenovirus había disminuido significativamente.

Cuatro semanas después de la inyección del vector de AAV que expresaba SERCA2, se determinó el rendimiento contráctil del corazón en una denominada preparación de Langendorff perfundida aislada. Se insertó un globo en el ventrículo izquierdo a través de la vena pulmonar y se determinó la función contráctil, especialmente el desarrollo de presión durante la sístole o dP/dt máx, el descenso de presión durante la diástole o dP/dt min y la presión sistólica total en corazones en los que se inyectó AAV que expresaba GFP CRE como control. Se obtuvieron aumentos muy significativos en todos los perímetros contráctiles en corazones de ratones hipotiroideos devolviendo la función contráctil al intervalo normal. La Figura 6 presenta datos del rendimiento contráctil de corazones de ratón que se aislaron de ratones hipotiroideos a los que se había inyectado AAV que expresaba una SERCA2 marcada con Flag. La velocidad de contracción sistólica dP/dt máx estaba significativamente aumentada en comparación con ratones a los que se había inyectado AAV que expresaba GFP. De forma similar, la velocidad de relajación diastólica o -dP/dt estaba significativamente aumentada en ratones hipotiroideos a los que se había inyectado AAV SERCA y, además, el desarrollo de presión sistólica estaba significativamente aumentado en corazones de ratón a los que se había inyectado AAV que expresaba SERCA2a.

Ejemplo 2 Modelos de sobrecarga de presión e hipertrofia cardiaca en animales transgénicos que expresan SERCA2 y animales de control

Para ensayar el impacto de la expresión de SERCA2 adicional en animales transgénicos positivos en condiciones que imitan las de corazones con ICC, grupos de animales del mismo sexo, edad y peso se trataron para inducir estenosis cardiaca, para desarrollar una constricción aórtica abdominal y para experimentar carga salina. En tales condiciones, dichos animales desarrollan hipertrofia cardiaca (HC) y anomalías cardiacas asociadas con sobrecarga de presión en el corazón (PO), afecciones que predominan en el corazón con ICC. Para la especificidad de tejido cardiaco de la expresión de transgenes, se usaron animales transgénicos con SERCA2 CMV/\beta-actina.

En resumen, para desarrollar dichos animales, animales transgénicos (ratas de aproximadamente 200-250 g de peso corporal) desarrollados usando la construcción del vector SERCA2/AAV descritos en el Ejemplo 1 y animales de control se anestesiaron para el aislamiento de la aorta abdominal a nivel de la arteria celiaca y, en los animales transgénicos, para la constricción quirúrgica de la aorta por encima de la arteria renal usando un hemoclip de acero inoxidable (Edward Weck & Co., Carolina del Norte). El último procedimiento da como resultado una reducción del tamaño de la luz aórtica de aproximadamente el 50%.

Aproximadamente 2 días después de la cirugía, a los animales transgénicos con constricción aórtica se les inyecta dos veces por semana por vía intramuscular desoxicorticosterona suspendida en aceite de sésamo (25 mg/g de peso corporal) y reciben cloruro sódico al 1% en el agua de bebida. Todos los animales se controlan con ultrasonidos cardiacos (ecocardiografía) para el desarrollo de HC, que generalmente aparecerá en el intervalo de 1-2 semanas después de la cirugía. Además, los animales experimentan una fase de lesión aguda tras la imposición de la sobrecarga de presión.

Ejemplo 3 Respuestas adaptativas en animales transgénicos a condiciones de ICC

Los animales transgénicos desarrollados usando una construcción de AAV/SERCA2 ensayados a las 6 semanas después de la cirugía experimentaron un descenso significativo en la transcripción del gen de SERCA2 (determinado por detección de los niveles de ARNm para SERCA2) y típicamente comienzan a padecer insuficiencia cardiaca a las 10-12 semanas. Los niveles de ARNm y proteína SERCA2 se determinaron por transferencia de Northern y Western como se ha descrito anteriormente o mediante otras técnicas de ensayo (por ejemplo, PCR, también descrita anteriormente). Los niveles de actividad enzimática (en relación con oscilaciones transitorias de calcio del RS) y la función ventricular izquierda se midieron en los animales transgénicos y de control como se describe a continuación. Se pueden medir los mismos parámetros para rendimiento cardiaco de acuerdo con los protocolos que se describen a continuación en otros modelos animales de ICC, así como en seres humanos que se someten a un tratamiento de acuerdo con el procedimiento de la invención.

Evaluación de la Función Contráctil Cardiaca A. Protocolo para Ecocardiografía Para Determinar la Funcionalidad Ventricular (in vivo)

Se realiza la formación de imágenes ecocardiográficas en un modelo animal adecuado con un transductor de serie de fases de frecuencia dual que funciona a 7 Mhz y una consola de ultrasonidos ACCUSON^{TM} 128 equipada con capacidad doppler integrada. El momento de los acontecimientos ecocardiográficos se correlaciona con los registros electrocardiográficos simultáneos obtenidos a partir de electrodos subcutáneos. La profundidad de la formación de imágenes se ajusta a 2 cm y el ángulo de sector a 60, lo que da una frecuencia de imágenes de 50/s. El ajuste de potencia es de 75 db. Se pueden usar imágenes 2D para seleccionar la colocación apropiada del cursor para registros en modo M (que se capturan a 1000 líneas/s).

Se ponen en posición prona animales ligeramente anestesiados y se realiza la formación de imágenes a través de los espacios intercostales izquierdos cerca del esternón. Se captan vistas de eje largo y corto paraesternal y se registran en cinta de video y, como se ha indicado anteriormente, se usan vistas 2D para guiar la colocación de cursor para registros en modo M que se realizan a nivel ventricular medio. Todas las mediciones pertinentes se realizan a partir de los registros en modo M guiados por 2D usando criterios clínicas convencionales recomendadas por la Sociedad Americana de Ecocardiografía. Se mide el grosor de la pared septal desde el borde delantero al borde trasero al final de la diástole.

El endocardio de la pared posterior, identificado como la línea con la pendiente sistólica más pronunciada, se mide desde el borde delantero de la pared posterior al borde delantero del margen epicárdico al final de la diástole. La dimensión ventricular izquierda al final de la diástole (LVEDD) se mide desde el borde trasero del septo intraventricular hasta el borde delantero de la pared posterior en el punto de máximo diámetro ventricular. Se mide la dimensión VI al final de la sístole (LVESD) usando los mismos criterios en el punto de mínimo diámetro ventricular. Se calcula el acortamiento fraccional (FS) como una indicación de función sistólica como [(LVEDD-LVESD)/(LVEDD0)]º100.

B. Protocolo para Cateterización con Micromanómetro para Extraer Líquido de Muestra y para Determinar Parámetros Hemodinámicos en el Corazón (in vivo)

Como se ilustra en ratones, se anestesian ratones adultos (de control y transgénicos, con o sin PO) que pesan 20-30 g con una mezcla de ketamina (100 mg/kg, IP) y xilacina (5 mg/kg, IP). Bajo un microscopio de disección, los animales se colocan en posición supina y se realiza una incisión cervical en la línea media para exponer la tráquea y las arterias carótidas. Después se pasa una aguja de calibre 20 roma hacia el interior de la tráquea para servir como cánula traqueal que se conecta a un ventilador de roedor ciclado por volumen (Harvard Apparatus) con un volumen corriente de 0,2 ml y una frecuencia respiratoria de 100/min. La idoneidad de la ventilación se determina mediante inspección visual de la expansión del tórax. Después de la intubación, se canula una arteria carótida con un catéter lleno de líquido (PE estirado a la llama para la formación de un tubo) para medir la presión aórtica. Después, se abre el tórax y se coloca un micromanómetro de alta fidelidad 2F (Millar) a través de la válvula mitral y se fija en el VI.

Los parámetros hemodinámicas se controlan al tiempo que se mide de forma continua la presión sistólica y diastólica del VI, dP/dt máx y mín y la presión aórtica (usando, por ejemplo, un aparato de detección en línea). Se toman datos a 1500 muestras/s y la respuesta de frecuencia del catéter de alta fidelidad es plana hasta más de 10.000 Hz. Estas altas velocidades de muestra son necesarias para la medición precisa de dP/dt en ratones debido a su rápida frecuencia cardiaca (que varía entre 300-500/min).

El análisis fuera de línea de los parámetros hemodinámicos puede incluir la medición de presión del VI y aórtica mínima y máxima además del cálculo de la constante temporal de la disminución de presión en el VI (tau). La determinación del valor tau, que refleja especialmente la fase isovolumétrica inicial de relajación diastólica, está estrechamente relacionada con la función de SERCA2.

C. Protocolo para la Determinación del Acortamiento de Miocitos en Tejido de Biopsia de Músculo Aislado (in vitro)

Como se ilustra en el protocolo en ratas, se extirpa el músculo papilar ventricular izquierdo, evitando el estiramiento pasivo, en solución de Tyrode oxigenada que contiene BDM 25 mM para minimizar la lesión por corte y evitar la contractura. Los extremos se unen atando longitudes cortas de sutura de seda 5-0 a la pared ventricular y los extremos valvulares de la preparación evitando el sobreestiramiento. Un extremo del músculo se unirá a la barra de vidrio de un transductor de fuerza isométrico Cambridge 400 (5 g de escala completa, 100 \mug de resolución) y el otro extremo se unirá a un pequeño gancho de acero inoxidable en una fase de traslación (Newport 423, \pm 1 \mum) para el control de la longitud del músculo. Para una visualización práctica, el baño de ensayo de 1 ml estará en el campo de visión de un estereomicroscopio Olympus SZ45. La temperatura se mantiene en el baño a 33ºC.

Después, el músculo se ajustará a longitud de inactividad a la que se registra primero la fuerza en reposo en el canal del transductor, la BDM se eliminará por lavado y los electrodos de estimulación bipolar se descenderán hacia el interior del baño (usando, por ejemplo, un aparato estimulador Gras). Los músculos se estimularán a 0,2 Hz (el 20% por encima del umbral) y, después de 30 minutos, el medio de superfusión se cambiará de [Ca2+] 0,5 a 2,0 mM. Todos los medios de perfusión se burbujearon con O_{2} al 100%.

El desarrollo de tensión isométrica en estado estacionario se medirá a incrementos de longitud muscular y se expresará como fracciones de Lmáx a las que la tensión desarrollada se hace máxima. Para corregir por la corta longitud de muestra de músculo usada (al extrapolar los resultados al rendimiento del tejido muscular in vivo), la deformación de acortamiento en el momento de máxima tensión se mide usando pares de microesferas superficiales colocadas sobre el músculo y se registra con una cámara de video.

Las posiciones de marcador se detectan preferiblemente y se digitalizan usando NIH Image 1.47 en un Macintosh Centris 650 con una tarjeta de captura de imágenes de video Data Translation. Se ha demostrado que la corrección de la escala de longitud mediante el uso de la deformación con respecto a cualquier longitud de referencia fijada elimina la rama descendente de la curva de longitud-tensión.

La contractilidad se expresa como la pendiente de la relación isométrica de esfuerzo-deformación, en la que el esfuerzo se calcula a partir de la tensión desarrollada (en reposo total) dividida por el área de sección transversal del músculo. El área de sección transversal se estima después de los ensayos mecánicos dividiendo el volumen de la muestra (determinada a partir de su peso) por la longitud del músculo sin carga entre los extremos. La repetición de estos protocolos en función de la concentración de Ca^{2+} extracelular entre 0,5 y 2,5 mM permitirá caracterizar la sensibilidad de Ca^{2+} subyacente de estas preparaciones.

Para caracterizar la función de SERCA2 y acoplar el EC en estos experimentos adicionalmente, la función de la bomba de SERCA2 se estudia midiendo el tiempo de relajación cuando se bloquea el intercambio de Na/Ca con Tyrode sin Na y cuando se bloquea la acumulación de calcio en el retículo sarcoplásmico mediante cafeína 10 mM. Cuando el intercambio de Na/Ca está bloqueado, el tiempo de relajación se ralentiza en aproximadamente el 30%. Las propiedades de relajación de los músculos de ensayo se determinarán en función de la longitud muscular y del calcio a partir de seguimientos de la tensión isométrica registrada en el registrador gráfico (por ejemplo, el registrador Gould 2200) y sistema de adquisición microinformático (disponible en el mercado, por ejemplo, en Strawberry Tree) a alta velocidad (40 mm/s). Los parámetros medidos incluirán el tiempo desde la tensión máxima hasta el 90% de recuperación y la constante temporal exponencial de la disminución de la fuerza isométrica. Estas mediciones también estarán sometidas a, y se pueden corregir por, el artefacto descrito anteriormente, puesto que hay estudios que han demostrado que la relajación isométrica se prolonga significativamente cuando la longitud del músculo se controla para mantener la longitud de los sarcómeros en la constante muscular central no dañada.

Mediante el uso de la misma estrategia que se ha descrito anteriormente, también se pueden realizar estudios contráctiles usando trabéculas largas, delgadas y uniformes aisladas bajo un microscopio de disección del ventrículo izquierdo de ratas. Los estudios que usan trabéculas proporcionarán una información más específica sobre alteraciones absolutas en mecanismos contráctiles diastólicos independientemente de los artefactos debidos a series de elastancia del músculo no disponibles a partir de preparaciones de músculo papilar convencionales. Se pueden usar otras regiones de la pared ventricular izquierda para aislar miocitos cardiacos para la detección de bordes y estudios de oscilación transitoria de Ca2+ intracelular.

D. Protocolo para el Aislamiento de Miocitos Cardiacos y Evaluación de Niveles Transitorios de Calcio (in vitro)

Se pueden preparar miocitos cardiacos a partir de corazones de rata adulta usando un procedimiento de perfusión con colagenasa. Los miocitos pueden mantenerse en ausencia o presencia de suero fetal de ternero al 4% durante al menos 4 días y mantener características morfológicas y metabólicas de miocitos cardiacos adultos. Se pueden obtener 9-10 x 10^{6} miocitos viables del corazón de una rata adulta.

Los miocitos cardiacos también se pueden preparar a partir de fragmentos de la pared ventricular. Esto permitirá determinar la función del miocito, la función del músculo papilar y parámetros relacionados con la expresión del gen de SERCA2 y la función de SERCA2 obtenida del mismo corazón. Con este fin, el tejido ventricular se pica y se lava en medio esencial mínimo (MEM) de Joklik modificado sin Ca^{2+} suplementado con NaHCO_{3} 25 mM; MgCl_{2} 3,4 mM; taurina 30 mM y carnitina 2 mM. Después, el tejido se digiere con MEM que contiene colagenasa de tipo II al 0,1% (Worthington); fracción V de BSA al 0,1% y CaCl_{2} 25 \muM. La digestión enzimática se continúa durante 30-40 minutos mientras que se agita suavemente el tejido a 32ºC con oxigenación continua. Finalmente se consigue la dispersión completa de las células por trituración suave con una pipeta serológica de orificio amplio.

Después, las células se filtran a través de un tamiz de nylon de 300 \mum y se lavan. Después, los niveles de calcio se aumentan gradualmente hasta una concentración de campo de 1 \muM. Este procedimiento puede producir hasta 2 x 10^{6} células/corazón de las que el 60-70% son miocitos viables en forma de bastón que se pueden usar en los estudios que se describen a continuación.

Se suspenden miocitos cardiacos de rata adulta aislados (no sembrados) en 10 ml de una solución que contiene NaCl 118 M; KCl 4,8 mM; NaH_{2}PO_{4} 1,2 mM; MgSO_{4} 1,2 mM; CaCl_{2} 1 mM; glucosa 11 mM y ácido Na-N-2-hidroxietilpiperacina-N-2-etanosulfónico 25 mM, se añaden 500 \mul de la suspensión celular a 1,5 ml de solución Tyrode normal y se añaden 5 \mul de una solución 1 mM del derivado del éster de acetoximetilo de Indo l en DMSO. Las células se incuban a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Después, las células se seleccionan para el estudio en base a la uniformidad de carga de Indo I y a la morfología celular en forma de bastón con una buena estriación. Las células se transfieren a una pequeña cámara de perfusión montada sobre la platina de un microscopio Nikon Diaphot equipado con óptica de cuarzo. Se deja que las células sedimenten en el fondo de la cámara de perfusión y se perfunden de forma continua a 5 ml/min con solución de Tyrode con gas O_{2} al 90%-CO_{2} al 5% y se mantienen a 37ºC. Las células se impulsan a 0,2, 0,33, 1,0, 2,0 y 5,0 Hz con un electrodo de platino externo y se miden fluorométricamente las oscilaciones transitorias de Ca2+. También pueden realizarse estudios similares usando miocitos de rata o ratón neonatales. La infección de miocitos neonatales con ADV SERCA2 disminuye notablemente las oscilaciones transitorias de calcio.

Con respecto a los niveles transitorios de calcio, el tiempo hasta obtener una disminución máxima de las oscilaciones transitorias de calcio^{2++} se acortó significativamente en miocitos positivos a transgén de SERCA2 en un grado similar al observado in vitro (Ejemplo 4; Figura 3; p < 0,05). Con respecto a las presiones ventriculares, la presión máxima conseguida en el ventrículo izquierdo (LV dP/dt, máx) era significativamente mayor en los animales transgénicos, mientras que a niveles mínimos, los músculos ventriculares mostraron una tendencia hacia una relajación diastólica más rápida en animales transgénicos (n = 3; en comparación con controles en los que n = 5). Los niveles de ARNm y proteína SERCA2 detectados en los animales se muestran en las figuras 1 y 2. Estos datos demuestran el principio de que el transporte de calcio y la relajación diastólica del músculo cardiaco se ven afectados beneficiosamente por la aplicación del procedimiento de la invención en un modelo animal predictivo.

Ejemplo 4 Evaluación in vitro de la función de miocitos cardiacos después de la transfección con un vector de adenovirus que expresa SERCA2

En resumen, se transfectaron miocitos cardiacos neonatales con el vector adenoviral de SERCA2 y se midieron las oscilaciones transitorias de calcio como se describe en el Ejemplo 3 y se compararon con células de control (no transfectadas). En la Figura 3, la célula nº 42 es representativa del comportamiento promedio de los miocitos cardiacos neonatales de control, mientras que la célula nº 27 es representativa del comportamiento promedio de los miocitos cardiacos neonatales transfectados (ADV). Como se muestra en la Figura 3, el tiempo hasta la mitad de la disminución máxima en las oscilaciones transitorias de calcio se acortó en el 33 \pm 19% (n = 4; p \leq 0,01) en células transfectadas en comparación con células de control. Estos datos proporcionan una prueba del principio de que las oscilaciones transitorias de calcio están aumentadas en miocitos transfectados con SERCA2 ADV, un resultado que, si se mide in vivo, fomentaría una relajación diastólica más rápida en el músculo cardiaco.

Claims (6)

1. Uso de un vector de expresión recombinante constituido por un vector viral adenoasociado (AAV) que codifica SERCA2, en la fabricación de un medicamento para transducir miocitos cardiacos para mejorar la contractilidad cardiaca para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, induciendo un aumento en la velocidad de la contracción sistólica o de la relajación diastólica en el corazón de un paciente de los niveles previos a la transducción a lo largo de un periodo de al menos 4 semanas.

2. Un vector de expresión recombinante constituido por un vector viral adenoasociado (AAV) que codifica SERCA2, para el uso en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, por transducción de miocitos cardiacos para aumentar la contractilidad cardiaca para inducir un aumento en la velocidad de contracción sistólica o de relajación diastólica en el corazón de un paciente de los niveles previos a la transducción a lo largo de un periodo de al menos 4 semanas.

3. Uso de un vector de expresión recombinante constituido por un vector viral adenoasociado (AAV) que codifica SERCA2, en la fabricación de un medicamento para transducir miocitos cardiacos para aumentar la contractilidad cardiaca para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, en el que el transporte de ión calcio mediado por SERCA2 al interior del retículo sarcoplásmico (RS) está aumentado en miocitos cardiacos transducidos a lo largo de un periodo de al menos 4 semanas.

4. Un vector de expresión recombinante constituido por un vector viral adenoasociado (AAV) que codifica SERCA2, para el uso en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, por transducción de miocitos cardiacos para mejorar la contractilidad cardiaca, en el que el transporte de ión calcio mediado por SERCA2 al interior del retículo sarcoplásmico (RE) está aumentado en miocitos cardiacos transducidos a lo largo de un periodo de al menos 4 semanas.

5. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 3 o el vector recombinante para el uso de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 4, en el que el vector de AAV está contenido en un sistema de dispersión coloidal.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se ha diagnosticado que el huésped padece una insuficiencia cardiaca congestiva.