ES2308776T3 - Metodo para la regulacion in vivo de la contractibilidad del musculo cardiaco. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN METODO PARA LA REGULACION DEL TRANSPORTE IN VIVO DE CALCIO EN EL MUSCULO CARDIACO DE ANIMALES QUE SUFREN DE INSUFICIENCIA CARDIACA CONGESTIVA. DE CONFORMIDAD CON EL METODO, LA ACTIVIDAD DE LA ATPASA DE CALCIO (QUE DISMINUYE A MEDIDA QUE SE DESARROLLA LA INSUFICIENCIA CARDIACA CONGESTIVA) Y LA CONTRACTIBILIDAD DEL MUSCULO CARDIACO AUMENTAN MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE UN GEN QUE CODIFICA OPERATIVAMENTE EL ENZIMA EN EL CORAZON. SE PROPORCIONAN LOS SISTEMAS DE ADMINISTRACION (INCLUYENDO VECTORES DE EXPRESION RECOMBINANTES), ASI COMO METODOS PARA CONTROLAR LA EXPRESION Y EL EFECTO DEL PRODUCTO GENICO EN EL RENDIMIENTO CARDIACO.
Description
Método para la regulación in vivo de la
contractibilidad del músculo cardiaco.
La invención se refiere a métodos para regular
la contractilidad del músculo cardiaco. Más específicamente, la
invención se refiere a métodos para incrementar in vivo los
niveles de calcio ^{2++} ATPasa (SERCA2) del retículo
sarcoplásmico (RS) mediante el transporte in vivo de un gen
que codifica operativamente la proteína SERCA2.
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La insuficiencia cardiaca congestiva es una de
las principales causas de muerte entre los adultos de Estados
Unidos. Si se compara con la isquemia cardiaca (un evento agudo
resultante de la obstrucción o pérdida del aporte sanguíneo al
corazón), la insuficiencia cardiaca congestiva es un evento
relativamente insidioso asociado con la pérdida gradual de la
contractilidad del músculo cardiaco y la adaptabilidad del corazón
al estrés. En última instancia, ante la ausencia de un tratamiento
efectivo, el corazón con ICC pierde su habilidad de bombear sangre
a una tasa suficiente para satisfacer los requerimientos metabólicos
del cuerpo.
Aunque las anormalidades en la función cardiaca
que acompañan a la insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) varían,
la liberación disminuida de iones calcio ^{2++} desde el RS,
requerida para la activación de las proteínas contráctiles, es una
característica común del síndrome de la ICC. La importancia de esta
pérdida puede comprenderse mejor en el contexto del papel que juega
el transportador de calcio en el funcionamiento normal del
corazón.
Brevemente, el RS es una estructura membranosa
que rodea cada miofibrilla de músculo cardiaco. SERCA2 está
contenida dentro de las membranas del RS y sirve para el transporte
activo del 70 al 80% de los iones de calcio libres al interior del
espacio intracelular del RS durante la relajación diastólica del
músculo cardiaco. Muchos de los iones de calcio restantes
disponibles para el transporte se sacan del citoplasma mediante un
sistema de transporte de intercambio de sodio/calcio del RS así
como, en menor medida, el transporte conducido por la hidrólisis
del ATP CATALIZADA por la ión calcio ATPasa del sarcolema y a través
de la absorción mitocondrial de calcio (Bassani, et al.,
J.Physiol. 453:591-608, 1992 y Carafoli, E.,
Ann.Rev.Biochem., 56:395-433, 1987).
Dado que tanto la actividad hidrolítica del ATP
de SERCA2 como los niveles absolutos de ARNm de SERCA2 disminuyen
en la ICC (Hasenfuss, et al., Circ.Res.,
75:434-442, 1994 y Studer, et al.,
Circ.Res., 75:443-453, 1994), se ha
postulado ampliamente que la alteración de la habilidad del corazón
con ICC para recibir sangre a baja presión está directamente
relacionada con retrasos en el transporte mediado por SERCA2 de
iones calcio activadores de la contracción en el interior del RS,
lo que da lugar a un enlentecimiento de la relajación diastólica
del corazón (ver, p. ej., Grossman, W., N.Engl.J.Med.,
325:1557-1564, 1991; Lorell, BH.,
Ann.Rev.Med., 42:411-436, 1991; y, Arai,
et al., Circ.Res., 74:555-564, 1994).
Estas observaciones, particularmente con respecto a la reducción de
los niveles de ARNm que codifica para SERCA2, han sido confirmadas
en humanos, así como en otras especies de mamíferos (ver,
revisión sobre los niveles de ARNm de SERCA2 en humanos, Arai,
et al., ver más arriba y Mercadier, et al.,
J.Clin.Invest., 85:305-309, 1990; también,
revisión sobre la disminución de los niveles de ARNm de SERCA2 en
tejido cardiaco hipertrófico en otras especies de mamíferos,
ver, p. ej., Wang, et al., Am.J.Physiol.,
267:H918-H924, 1994 [hurones]; Afzal and Dhella,
Am.J.Physiol., 262:H868-H874, 1992
[roedores]; y, Feldman, et al., Circ.Res.,
73:184-192, 1993 [roedores]).
La referencia Giordano et al. (1995) se
refiere a la sobreexpresión in vitro de SERCA2 seguida de la
transfección de miocitos cardiacos en cultivo con un vector que
codifica SERCA2. No se ha divulgado ningún resultado respecto a la
respuesta funcional por la sobreexpresión de SERCA2, excepto los
obtenidos a través de la invención.
A pesar del interés en los últimos años sobre el
papel del transporte de calcio en la ICC, las bases moleculares de
la alteración de la actividad del transporte de calcio mediante
SERCA2 se comprenden mal y no han sido todavía explotadas en un
régimen para el tratamiento de la ICC. En cambio, las actuales
modalidades terapéuticas para el síndrome de la ICC son altamente
inespecíficas en el sentido de que no se dirigen directamente hacia
los eventos bioquímicos y moleculares que se cree que acompañan, si
no causan, las anormalidades en la función que conducen al fallo
del corazón con ICC. Por ejemplo, el tratamiento farmacéutico de la
ICC mediante la administración de fármacos análogos a la
adrenalina, estimulan la contracción del músculo cardiaco, pero no
corrigen el estado subyacente que causa la reducción en la
contractilidad del músculo.
Además, la sustitución y/o incremento de los
niveles in vivo de proteínas cardiacas es una alternativa
interesante para el tratamiento y control de la progresión de la ICC
en humanos. Sin embargo, lograr este objetivo mediante la
introducción de proteínas o péptidos cardiacos dentro del tejido
cardiaco es poco probable que tenga éxito. La cuestión principal es
el riesgo de toxicidades potenciales, especialmente a dosis
suficientes para producir una respuesta biológica a la proteína.
Desde un punto de vista práctico, existe también el problema del
coste asociado con el aislamiento y la purificación o síntesis de
las proteínas. Además, el impacto clínico de las proteínas podría
estar limitado por su relativamente corta vida media in vivo
debido a la degradación por alguna proteasa presente el en tejido
diana.
Por estos motivos, la introducción de una
proteína dentro de un paciente mediante el transporte de un gen que
expresará la proteína es una alternativa interesante para
administrar la proteína en sí. Con este fin, se ha desarrollado una
variedad de estrategias para la introducción de genes exógenos en
células diana. La mayoría de los protocolos de terapias génicas
propuestos hasta la fecha para usarse en humanos se han centrado en
la transferencia génica ex vivo; p. ej., mediante la
transfección retroviral de células para la implantación dentro del
tejido diana (ver, p. ej., Anderson, WF, Science,
256:808-813, 1992 y Miller, AD, Nature,
357:455-460, 1992 [tratamiento de la deficiencia de
adenosina deaminasa]). Sin embargo, se ha probado que la utilidad
de tales protocolos es limitada por su relativa ineficiencia en la
expresión proteica así como la accesibilidad limitada de los
órganos y tejidos diana.
Los métodos de transporte de genes in
vivo son, por lo tanto, un tema de gran interés en el estado de
la técnica. Con este fin, se han desarrollado varios sistemas para
alcanzar este objetivo, incluyendo la introducción de
polinucleótidos "desnudos" (plásmidos), plásmidos unidos a
virus, plásmidos que cointeriorizan con virus, así como la
encapsulación y transporte de construcciones de genes dentro de
liposomas.
Por ejemplo, un trabajo en el NIH publicado en
1984 que mostraba la inyección intrahepática de ADN desnudo de
hepatitis de la ardilla clonado en un plásmido en ardillas producía
tanto infección viral como formación de anticuerpos antivirales en
las ardillas (Seeger, et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA,
81:5849-5852, 1984). Varios años más tarde,
Felgner, et al., publicaron que obtuvieron expresión de la
proteína desde polinucleótidos "desnudos" (es decir, ADN o ARN
no asociado con liposomas o un vector de expresión viral)
inyectados dentro del tejido muscular óseo (Felgner, et al.,
Science, 247:1465, 1990; ver también, PCT
application WO 90/11092). Felgner, et al., supusieron que las
células musculares aceptarían y expresarían polinucleótidos
eficientemente por la estructura única del tejido muscular, que está
compuesto por células multinucleadas, retículo sarcoplásmico y un
sistema tubular transversal que se extiende profundamente dentro de
las células musculares.
Se han publicado otros sistemas similares para
el transporte de genes directamente al interior del tejido diana
por Stribling, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:11277-11281, 1992 (expresión proteica
detectada tras el transporte por aerosol de un gen encapsulado en un
liposoma); y, Tang, et al., Nature,
356:152-154, 1992 (inyección con una
"pistola" de genes de un plásmido con el gen de la hGH unido a
microesferas de oro en el interior de la piel de un ratón, dando
lugar a la expresión de la proteína hGH sin provocar una respuesta
inmune al gen inyectado). Aunque generalmente es efectiva para la
producción de altos niveles de expresión proteica dentro de las
células musculares, la inyección directa del ADN o ARN en el
interior del tejido muscular para tratamientos a largo plazo
requiere el uso de inyecciones repetidas para compensar la pérdida
de expresión por la degradación de los genes. Este enfoque podría no
sólo llevar mucho tiempo y ser caro, sino que también podría ser
poco práctico para el tratamiento a largo plazo debido a la
inflamación causada en el lugar de la inyección y cerca del mismo.
Por consiguiente, aunque práctica a corto plazo o en tratamientos
de emergencia, los medios menos invasivos para la introducción de
genes expresables dentro de tejidos diana se preferirán
generalmente a la inyección directa en el interior del tejido
diana.
Además, la mayoría de los métodos para el
transporte de genes in vivo libre de un vector de expresión
recombinante, sufren de transfección ineficiente de la célula diana
y de una expresión proteica relativamente baja. Por lo tanto, los
vectores de expresión recombinantes (especialmente, los vectores no
replicables) actualmente siguen siendo el vehículo preferido para
el transporte de genes in vivo.
Los miocitos cardiacos se han mostrado como
dianas apropiadas para el transporte de genes in vivo. Por
ejemplo, una propuesta reciente para el tratamiento de la ICC podría
ser remplazar y/o mejorar el número de receptores
\beta_{2}-adrenérgicos activos en los miocitos
del corazón con ICC. Estudios en ratón indican que el uso de
técnicas de trasplante directas para introducir genes que codifican
esos receptores conduce a un aumento in vivo de la
contractilidad del músculo cardiaco incluso en ausencia de una
fuente de adrenalina exógena (Lefkowitz, et al.,
Science, 264:582-586, 1994). Se ha
demostrado que los vectores de adenovirus en particular, son
vehículos exitosos para el transporte de genes a los miocitos
cardiacos (ver, p. ej., Guzman, et al.,
Circ.Res., 73:1202-1207, 1993 y
Muhlhauser, et al., Circulation, 88 (Part
2):1-475, 1993).
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Los detalles de la realización preferida de la
presente invención son los que se disponen en los dibujos adjuntos
y en la descripción de más abajo. Una vez se conozcan los detalles
de la invención, numerosas innovaciones adicionales y cambios se
volverán obvios para un experto medio en el estado de la
técnica.
La invención es un método para aumentar el
transporte de calcio al interior del RS del músculo cardiaco
mediante el incremento in vivo de la expresión de SERCA2
catalíticamente activa mediante la introducción de un
polinucleótido que codifica operativamente SERCA2 dentro de ese
tejido. La invención se especifica en las reivindicaciones
adjuntas. En la realización preferida por su eficacia en la
transfección de las células diana, el polinucleótido que codifica
SERCA2 es transportado al interior del tejido cardiaco mediante un
vector de expresión recombinante viral y no replicable,
preferiblemente, una construcción de adenovirus. Como alternativa,
el gen que codifica SERCA2 puede proporcionarse mediante la
encapsulación en liposomas o mediante la administración de
nucleótidos "desnudos". El transporte del gen de SERCA2 puede
hacerse quirúrgicamente (p. ej., por la introducción directa del
vector o de las células transfectadas en el interior del tejido
diana) o mediante infusión intracoronaria.
La mejora del transporte de iones de calcio al
RS proporcionada por el aumento de la actividad de SERCA2 en el RS
regulará la activación de las contracciones miofibrilares en el
corazón. De este modo, una ventaja particular del método de la
invención es la ayuda que le proporcionará al corazón en el ajuste
de las anomalías asociadas a la ICC, especialmente por el
acortamiento de la fase temprana de la relajación diastólica del
músculo cardiaco.
Un uso para el método de la invención es para la
mejora a corto plazo de la ICC en pacientes que están esperando un
tratamiento intervencionista (p. ej. trasplante) y/o los que están
ya sometidos a un tratamiento para la ICC. Se espera también que el
uso del método de la invención beneficie a pacientes con riesgo de,
y que han comenzado a padecer, anomalías en la función cardiaca
asociadas a la ICC.
Las especificaciones también describen que
podrían generarse animales transgénicos para utilizarlos en el
desarrollo de vectores que se emplearan y evaluaran su aplicación en
los métodos aquí descritos. Se describen también métodos para
controlar la eficacia de los métodos a emplear para el tratamiento
de la ICC.
La Figura 1 es una mapa de un plásmido
codificante para SERCA2 bajo el control de un operador de
tetraciclina.
La Figura 2 es un mapa de un vector de expresión
recombinante derivado de adenovirus que codifica para SERCA2.
La Figura 3 es un mapa de plásmido codificante
para SERCA2 bajo el control de un enhancer (elemento
potenciador) del CMV humano/ promotor de
\beta-actina de pollo.
La Figura 4 es un Southern blot que
muestra la presencia de ADN transgénico de SERCA2 de rata en
muestras de tejido de ratón. Los Carriles 1-3
representan diferentes líneas de ratón transgénico fundador; el
Carril 4 representa un ratón de control transgénico negativo; y el
Carril 5 representa 1 ng de plásmido cortado con Ap1.
La Figura 5 es un Northern blot que
muestra la presencia de ARNm transgénico de SERCA2 en miocitos
cardiacos provenientes de ratón. Los Carriles 1-2
representan el ratón de control transgénico negativo; y los Carriles
3-4 representan un ratón transgénico positivo.
La Figura 6 es un Western blot que
muestra la expresión del transgen de SERCA2 en ratón. Los Carriles
1-2 representan la expresión de
\alpha-actina sarcomérica; el Carril 3 es un
marcador de peso molecular; y los Carriles 4-6
representan la expresión de SERCA2.
La Figura 7 es un Northern blot que
muestra la presencia de ARNm de SERCA2 de rata en miocitos cardiacos
provenientes de ratón transfectado con uno de varios adenovirus que
codifican para SERCA2; es decir, vectores bajo el control de un
promotor de CMV (HH-1; hh-2 y
SAI-3) o el promotor de TK (TK). Una construcción
control no contenía polinucleótidos de SERCA2 (ctrl). Los números
entre paréntesis indican el número de unidades formadoras de
colonias (ufc) de cada construcción y se determinaron mediante la
infección de células L6 con construcciones de adenovirus durante 48
horas, se extrajo y se determinó el ARN celular total en geles,
después se hibridó un ADNc de SERCA2 al ARN en el análisis
Northern.
La Figura 8 representa la detección de los
flujos de calcio en miocitos neonatales transfectados con el vector
de adenovirus de la Figura 2 (se representan los valores medios con
la Célula #27) y en miocitos neonatales no transfectados (se
representan los valores medios con la Célula #42). Los flujos de
calcio se midieron fluorométricamente y se expresaron en función
del tiempo (eje de las x).
A lo largo de esta descripción, la realización
preferida y los ejemplos mostrados deben considerarse como
ejemplos, más que como limitaciones de la presente invención.
Se proporcionan las siguientes definiciones para
simplificar la discusión de la invención. Los expertos medios en el
estado de la técnica reconocerán, sin embargo, que estas
definiciones podrían ampliarse para incluir equivalentes sin
desviarse del ámbito u origen legítimo de la invención. Por esta
razón, estas definiciones no deben ser interpretadas como
limitantes de la invención.
- 1.
- "Polinucleótido de SERCA2" se refiere a ADN o ARN y puede incluir cadenas codificantes y antisentido, según sea apropiado para los objetivos del tratamiento aplicado de acuerdo a la invención. Como se usa aquí, "polinucleótido" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción mayor. Una secuencia de polinucleótidos puede deducirse a partir del código genético, no obstante, se debe tener en cuenta la degeneración del código. Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias que están degeneradas como resultado del código genético, estas secuencias podrían determinarse fácilmente por un experto medio en la materia.
- 2.
- "Codificación operativa" se refiere a un polinucleótido que ha sido modificado para incluir un promotor y otras secuencias necesarias para la expresión y, donde se desee, la secreción del producto de traducción deseado; p. ej., un péptido o proteína. Todos los aspectos de la invención pueden llevarse a cabo empleando vectores de expresión recombinantes conocidos. Preferiblemente, estos vectores incluirán ADNc que codifique los productos de traducción deseados. Por lo tanto, a no ser que el contexto lo requiera de otra manera, se asumirá que "polinucleótido" se refiere a secuencias que codifican operativamente que están contenidas en un vector de expresión recombinante adecuado, del cual se proporcionan aquí ejemplos.
- 3.
- "Síntesis" se refiere al significado bien conocido de sintetizar secuencias de polinucleótidos y polipéptidos y puede incluir aislamiento y purificación de polinucleótidos y proteínas nativas.
- 4.
- "Péptido" se refiere a pequeños péptidos, polipéptidos, oligopéptidos y proteínas que tienen un efecto biológico deseado in vivo.
- 5.
- "Transporte" se refiere a medios conocidos de introducir polinucleótidos que codifican operativamente en un hospedador. Los expertos medios en la materia estarán familiarizados con, o podrán identificar fácilmente, estos medios de transporte; sin embargo, en cuanto a los medios de transporte particularmente útiles, podrían referirse como "Nuevos Sistemas de Transporte de Fármacos" (Marcel Dekker, 1992).
- 6.
- "Hospedador" se refiere al receptor del tratamiento que se va a administrar de acuerdo con la invención. El hospedador puede ser cualquier vertebrado, aunque será preferiblemente un mamífero. Si es un mamífero, el hospedador será preferiblemente un humano, pero podría ser también ganado o un animal de compañía.
- 7.
- "Tejido diana" se refiere al tejido del hospedador en el que se busca la expresión del polinucleótido que codifica operativamente.
- 8.
- "Anticuerpo" se refiere a toda inmunoglobulina de cualquier clase, anticuerpos quiméricos, anticuerpos híbridos con doble o múltiple especificidad antigénica y fragmentos incluyendo fragmentos híbridos. También están incluidos dentro del significado de "anticuerpo" los conjugados de dichos fragmentos, y las llamadas proteínas de unión a antígenos (anticuerpos de cadena simple), como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 4,704,692, y anticuerpos anti-idiopáticos (anticuerpos que se unen a otros anticuerpos) como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 4,699,880.
- 9.
- "Vector de expresión recombinante" se refiere a sistemas de polinucleótido(s) que codifican operativamente polipéptidos que se expresan en eucariotas o procariotas. Los métodos de expresión de secuencias de ADN que contengan secuencias eucariotas o virales en procariotas se conocen bien en el estado de la técnica. Como hospedadores pueden incluirse microorganismos, levaduras, insectos y mamíferos.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos para el ARNm de rata
que codifica para SERCA2 se describe en Rohrer, et al.,
J.Biol.Chem., 263:6941-6944, 1988 (ARNm de rata
que codifica para SERCA2) citando MacLennan, DH, Nature,
ver más abajo (ADNc). El clon se obtiene mediante técnicas
convencionales de hibridación como las descritas en Rohrer, et
al., J.Biol.Chem., 266:8638-8646, 1991, que
también expone los codones de iniciación y de terminaciónpara la
transcripción del clon (ver Ejemplo 1).
La secuencia de nucleótidos de la isoforma de
SERCA2 de la calcio ATPasa (es decir, la isoforma "lenta" del
músculo esquelético si se compara con la isoforma "rápida" del
músculo estriado) se conserva más del 90% entre las especies de
mamíferos. Por lo tanto, SERCA2 ha sido bastante fácilmente
identificada y secuenciada a partir de tejido muscular esquelético
en especies de mamíferos no roedores, incluyendo humanos (GENBANK
#J4025; ver también, GENBANK M23114-23116,
M23277-23279, y Lytton and MacLennan, J. Biol.
Chem., 263:15024-15031, 1998); así como
en ratas y conejos (MacLennan, DH, Nature,
316:697-700, 1985, y GENBANK M33834, ver
también, Lompre, et al., FEBS Lett.,
249:35-41, 1989, y GENBANK X15635). Aunque un
experto medio en la materia reconocerá que el uso del
polinucleótido de SERCA2 humano sería mucho más preferible en
tratamientos en humanos, el polinucleótido de SERCA2 de rata era
más fácil de utilizar y se prefirió para los propósitos de los
experimentos descritos en los ejemplos.
Se apreciará también por un experto medio en la
materia que el método, el cual se describe aquí específicamente en
relación con SERCA2, podría ser adaptado ventajosamente para
utilizarse para el transporte de otras proteínas cardiacas cuya
expresión y actividad estén dañadas en el corazón con ICC. En
concreto, el gen que codifica el intercambiador de calcio/sodio en
mamíferos es un candidato particularmente atractivo para el
transporte al corazón, de la misma manera que se describe aquí para
el transporte del polinucleótido de SERCA2.
Para obtener y utilizar las secuencias de SERCA2
que se incluyen en esta divulgación y aquellas conocidas en el
estado de la técnica, el ADN y el ARN podrían sintetizarse también
empleando un equipo de síntesis automática de ácidos nucleicos,
bien conocido en el estado de la técnica. El uso de la conocida
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se prefiere
particularmente para generar mezclas de polinucleótidos. Los ácidos
nucleicos genómicos podrían prepararse por medios conocidos en el
estado de la técnica como los protocolos descritos en Ausubel,
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Cap. 2
y 4 (Wiley Interscience, 1989). El ADNc puede sintetizarse según
los medios conocidos en el estado de la técnica (ver, p. ej.
Maniatis, et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual.
(Cold Spring Harbor Lab, New York, 1982). Una librería de ADNc que
contenga polinucleótidos de interés puede también cribarse por
medios conocidos en el estado de la técnica.
Por ejemplo, estos medios incluyen, pero no se
limitan a: 1) hibridación de sondas en las librerías genómicas o de
ADNc para detectar secuencias de nucleótidos compartidas; 2) cribado
de anticuerpos en librerías de expresión para detectar
características estructurales compartidas y 3) síntesis mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El desarrollo de
secuencias específicas de ADN codificante o fragmentos de las
mismas, puede obtenerse mediante: 1) aislamiento de secuencias de
ADN de doble cadena a partir del ADN genómico; 2) elaboración
química de una secuencia de ADN que proporcione los codones
necesarios para el polipéptido de interés; y 3) síntesis in
vitro de una secuencia de ADN de doble cadena mediante
transcripción inversa de un ARNm aislado de una célula donante
eucariota. En este último caso, se forma finalmente una doble cadena
de ADN complementaria a un ARNm lo que se denomina generalmente
como ADNc.
Los procedimientos de hibridación son útiles
para el cribado de clones recombinantes mediante el uso de una
mezcla de sondas de oligonucleótidos marcadas donde cada sonda es
potencialmente el complemento completo de una secuencia específica
de ADN en la muestra de hibridación la cual incluye una mezcla
heterogénea de dobles cadenas de ADN desnaturalizadas. Para este
cribado, es preferible llevar a cabo la hibridación sobre cada
cadena simple de ADN o sobre la cadena doble de ADN desnaturalizada.
La hibridación es especialmente útil en la detección de clones de
ADNc derivados de fuentes donde está presente una cantidad
extremadamente baja de secuencias de ARNm relacionadas con el
polipéptido de interés. En otras palabras, mediante el uso de
condiciones restringidas de hibridación dirigidas a evitar uniones
no específicas es posible, por ejemplo, permitir la visualización
autorradiográfica de un clon específico de ADNc mediante la
hibridación del ADN diana a esa única sonda en la mezcla.
Una librería de ADNc que se cree que contiene un
polinucleótido de interés puede cribarse mediante la inyección de
varios ARNm derivados de ADNc en el interior de oocitos, permitiendo
que pase el tiempo suficiente para que ocurra la expresión de los
productos del gen de ADNc, y evaluando la presencia del producto de
expresión del ADNc deseado, por ejemplo, mediante el uso de
anticuerpos específicos para un péptido codificado por el
polinucleótido de interés o mediante el uso de sondas para los
motivos repetidos y un patrón de expresión de tejido característico
de un péptido codificado por el polinucleótido de interés. Como
alternativa, una librería de ADNc puede cribarse indirectamente
mediante la expresión de péptidos terapéuticos y/o inmunogénicos
que tengan al menos un epítopo utilizando anticuerpos específicos
contra los péptidos. Tales anticuerpos pueden ser tanto
policlonales como monoclonales y son empleados para detectar los
productos de expresión indicativos de la presencia del ADNc de
interés.
Los procedimientos de cribado que dependen de la
hibridación de ácidos nucleicos hacen posible el aislar cualquier
secuencia génica de cualquier organismo, siempre que se disponga de
la sonda adecuada. Las sondas de oligonucleótidos, que se
corresponden con una parte de la secuencia que codifica la proteína
en cuestión, pueden sintetizarse químicamente. Esto requiere que se
conozca la secuencia de aminoácidos de tramos cortos de
oligopéptidos. La secuencia de ADN que codifica la proteína puede
deducirse del código genético, sin embargo, debe tenerse en cuenta
la degeneración del código. Es posible llevar a cabo una reacción de
adición con una mezcla cuando la secuencia está degenerada. Esto
incluye una mezcla heterogénea de ADN de doble cadena
desnaturalizado. Para tal cribado, la hibridación se realiza
preferentemente sobre cada cadena simple de ADN o sobre el ADN de
doble cadena desnaturalizado.
El polinucleótido de SERCA2 que se usa en la
invención puede ser ADN o ARN, pero será preferiblemente una
secuencia de ADN complementario (ADNc). Las secuencias del
polinucleótido que se usan en la invención deben ser (a)
expresables y (b) o bien no replicables o bien manipuladas por
medios conocidos en el estado de la técnica para que no se
repliquen dentro del genoma del hospedador. Preferiblemente, un
polinucleótido que codifica operativamente para la proteína SERCA2
se empleará en la invención como parte de un vector de expresión
recombinante, más preferentemente en una construcción de
adenovirus.
Las ilustraciones de la preparación de
polinucleótidos adecuados para usar en la siguiente invención y los
ejemplos específicos mostrando como se realizan composiciones
específicas de polinucleótidos se proporcionan más abajo. Será, no
obstante, evidente para un experto medio en la materia que otros
medios conocidos para preparar polinucleótidos no replicables
pueden ser adecuados.
Los polinucleótidos incluyen derivados
funcionales de polinucleótidos conocidos que codifican
operativamente para la proteína SERCA2. Por "derivado
funcional" se entiende un polinucleótido que codificará
"fragmentos", "variantes", "análogos", o
"derivados químicos" de SERCA2. Un "fragmento" de una
molécula incluye cualquier péptido contenido en la molécula. Una
"variante" de esa molécula se refiere una molécula que se
produzca de forma natural substancialmente similar o bien a la
molécula completa o bien a un fragmento de la misma. Un
"análogo" de una molécula se refiere a una molécula no natural
substancialmente similar o bien a la molécula completa o bien a un
fragmento de la misma.
Como se emplea aquí, se dice que una molécula es
un "derivado químico" de otra molécula cuando ésta contiene
residuos químicos adicionales que no forman parte normalmente de la
molécula. Tales residuos pueden mejorar la solubilidad, la
absorción, la vida media biológica de la molécula, etc. Los residuos
que se conocen en el estado de la técnica por ser capaces de mediar
estos efectos se detallan, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack Publishing Co., Easton,
Penn. (1980).
Los polinucleótidos de SERCA2 pueden conjugarse
para usarse en asociación con otros polinucleótidos que codifiquen
operativamente para proteínas reguladoras que controlen la expresión
de estos polipéptidos o pueden contener secuencias de
reconocimiento, promotoras o de secreción. Los expertos medios en el
estado de la técnica serán capaces de seleccionar polinucleótidos
reguladores e incorporarlos dentro de los polinucleótidos de SERCA2
de la invención sin demasiada experimentación. Por ejemplo,
promotores adecuados para emplearse en sistemas roedores o humanos
y su utilización se describen en Current Protocols in Molecular
Biology, ver más arriba en Cap. 1.
Una forma preferida especialmente de un
polinucleótido de SERCA2 para usarse en la invención será aquella
que se haya incorporado dentro de un vector de expresión
recombinante. El uso de un vector de expresión recombinante
prolongará la expresión del gen en el tejido diana.
Vectores de expresión recombinantes que sean
adecuados se conocen bien en el estado de la técnica e incluyen los
vectores descritos en Current Protocols in Molecular Biology,
ver más arriba en Cap. 1. Dos vectores con promotor
derivados de plásmidos preferidos especialmente son los vectores con
el promotor pRSV (virus del sarcoma de Rous) y pCMV
(citomegalovirus), especialmente el último. Esta preferencia se basa
en la observación de que los mayores niveles de expresión se
alcanzan en este contexto cuando se emplea el promotor de CMV.
Un protocolo adecuado para el aislamiento del
promotor de RSV y su empleo en la construcción de un vector
derivado de plásmido se describen en Gorman, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci, USA, 79:6777, (1982). Otros vectores
preferidos derivados de plásmidos son pREP7 y pREV que están
comercialmente disponibles en Invitrogen de San diego, California.
Para la clonación de polinucleótidos, un plásmido especialmente
adecuado para la producción de ARNm es el vector de clonación
pSP64T descrito por Kreig, et al., Nucleic Acids Res.,
12:7057-7070, (1984). Cualquier ADNc que
contenga un codón de iniciación puede introducirse dentro de este
plásmido y preparar ARNm a partir de los moldes de ADN expresado
utilizando técnicas convencionales.
Los vectores particularmente útiles para la
administración de cualquier polinucleótido de SERCA2 según la
invención, son aquellos que contienen un promotor que puede ser
"encendido" o "apagado" después de que el vector haya
sido administrado al paciente.
Ejemplos especialmente eficaces de estos
promotores son los promotores inducibles por antibióticos y los
activados por receptores nucleares inducibles por ligando. Con
respecto a los últimos, los receptores nucleares representan una
familia de factores activadores de la transcripción que actúan
uniéndose a secuencias específicas de ADN localizadas en los
promotores diana conocidas como elementos respondedores. Miembros
específicos de la familia de receptores nucleares incluyen las
principales dianas intracelulares para pequeños ligandos
lípido-solubles, como la vitamina D, y retinoides,
así como hormonas esteroideas y tiroideas ("ligandos
activadores"). Se han identificado los elementos respondedores
específicos de las proteínas reguladoras del transporte de calcio,
incluyendo los elementos respondedores a la hormona tiroidea (TREs),
CAM quinasa y otros, que están también presentes en la región
reguladora de SERCA2. Estos elementos respondedores específicos
pueden usarse para controlar la transcripción de SERCA2 in
vivo como se describe debajo. En concreto, la expresión del gen
SERCA2 es especialmente sensible a la hormona tiroidea (Rohrer,
et al., J. Biol. Chem., 266:8638-8646,
1991).
Los receptores nucleares activados por ligandos
activadores específicos son muy apropiados para utilizarse como
promotores en vectores de expresión en eucariotas ya que la
expresión de los genes puede regularse simplemente mediante el
control de la concentración de ligando disponible para el receptor.
Por ejemplo, los promotores inducibles por glucocorticoides como
los de la repetición terminal larga del virus del tumor mamario de
ratón se han utilizado ampliamente en este aspecto porque los
elementos respondedores a glucocorticoides se expresan en una
amplia variedad de tipos celulares. Un sistema de expresión que
aprovecha los elementos respondedores a glucocorticoides sensible a
una amplia variedad de hormonas esteroideas (p. ej., dexametasona y
progesterona) es un plásmido pGREtk (contiene uno o más elementos
respondedores a glucocorticoides estimulantes de la tirosina amino
transferasa de rata situados antes del promotor timidina quinasa del
virus herpes simple en pBLCAT8+), transfectado en células HeLa
(ver, Mader and White, Proc.Natl.Acad.Sci USA,
90:5603-5607, 1993 [pGRE2tk]; y,
Klein-Hitpass, et al., Cell,
46:1053-1061, 1986 [pBLCAT8+]).
Otro promotor derivado de elementos
respondedores a receptores nucleares (ERRN) especialmente adecuado
para su uso en la invención es uno que es inducible por un
compuesto de vitamina D_{3},
1,25-dihidroxivitamina D_{3} y análogos no
hipercalcémicos de la misma (colectivamente, "ligandos activadores
de vitamina D_{3}"). Los promotores ERRN inducibles por los
ligandos activadores de vitamina D_{3} contienen el receptor de la
vitamina D_{3} (RVD) y elementos respondedores
PurG(G/T)TCA que reconocen repeticiones directas
separadas por tres pares de bases. Los elementos respondedores a la
vitamina D_{3} se encuentran situados antes de los genes de
osteocalcina humana y osteopontina de ratón; la transcripción de
estos genes se activa con la unión del RVD (ver, p. ej.,
Morrison and Eximan, J.Bone Miner.Res.,
6:893-899, 1991; y, Ferrara, et al.,
J.Biol.Chem., 269:2971-2981, 1994).
Resultados experimentales recientes de la evaluación de un vector
de expresión recombinante que contiene el RVD activador del gen de
la osteopontina de ratón situado antes de un promotor de timidina
quinasa (tk) de virus herpes simple truncado, sugieren que el ácido
9-cis-retinóico puede aumentar la
respuesta del RVD a 1,25-hidroxivitamina D_{3}
(ver, Carlberg, et al., Nature,
361:657-660, 1993).
Ferrara, et al. también describen
promotores inducibles por vitamina D_{3} en vectores de expresión
recombinantes utilizando múltiples copias de un RVD fuerte; en
concreto, el RVD activador del gen de la osteopontina de ratón
(compuesto por repeticiones directas de motivos de PurGTTCA
separados por 3 pares de bases). Este RVD se ajusta a los motivos
de consenso de PurGG/TTCA de los que se ha comprobado previamente
que responden no sólo a la vitamina D_{3} sino también a la
hormona tiroidea y/o al ácido retinóico. Se han insertado 3 copias
del RVD de ratón dentro de pBLCAT8+; inmediatamente antes del
promotor tk del virus herpes simple. La transfección del vector
resultante VDREtk dentro de las células COS (produciendo un
"sistema de expresión RVD") se ha comprobado que es
particularmente útil en aquellas células COS que contienen el
receptor nuclear de retinoide X (RXR) que se ha demostrado que
actúa como un factor auxiliar para la unión de RDV a su elemento
respondedor. Convenientemente, la
1,25-hidroxivitamina D3 y los análogos no
hipercalcémicos de la misma se han aprobado para utilizarse en
preparaciones tópicas por la United States Food and Drug
Administration para el tratamiento de la soriasis y están
disponibles comercialmente.
Las evaluaciones in vivo de los
promotores ERRN indican que son inducibles en exposición sistémica a
sus correspondientes elementos respondedores (ver, Tsou, et al.,
Exp.Cell.Res., 214:27-34, 1994). De este modo,
el uso de un vector de expresión recombinante con un promotor ERRN
para la administración y expresión de polinucleótidos de SERCA2 de
acuerdo con la invención permite controlar la expresión, por
ejemplo, activando la expresión cuando se necesite una dosis o
inactivando la expresión en el caso de que ocurra una reacción
adversa a la proteína o péptido expresados.
Otro "interruptor de encendido/apagado"
bien caracterizado para su uso en vectores de expresión
recombinantes es el sistema promotor regulado por antibióticos
(tetraciclina). Los medios para la construcción de este sistema se
conocen bien en el estado de la técnica; para revisar este aspecto,
los expertos medios en el estado de la técnica que lo deseen pueden
consultar Furth, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA,
91:9302-9306, 1994 (control regulado por
tetraciclina de la expresión génica en ratón transgénico); Fishman,
et al., J.Clin.Invest., 93:1864-1868,
1993 (control con tetraciclina de la expresión génica cardiaca); y,
Niwa, et al., Gene, 108:193-200, 1991
(uso del sistema promotor para transfectantes con una alta
expresión). Un plásmido que codifica para SERCA2 bajo el control de
un sistema promotor de tetraciclina se describe en el Ejemplo 4 y se
muestra en la Figura 1.
Los diferentes vectores virales que pueden
utilizarse en la invención incluyen adenovirus, virus herpes,
vaccinia, o un virus ARN como un retrovirus. Los ejemplos de
vectores retrovirales en los que puede insertarse un gen externo
incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de
Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV),
virus del tumor mamario de ratón (MuMTV), y virus del sarcoma de
Rous (RSV). Varios vectores retrovirales adicionales pueden incluir
múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incluir
un gen para un marcador seleccionable de manera que las células
transducidas puedan ser identificadas y generadas.
Ya que los retrovirus recombinantes son
defectivos, requieren ayuda para producir partículas de vector
infecciosas. Esta ayuda puede proporcionarse, por ejemplo, mediante
el uso de líneas celulares auxiliares que contienen plásmidos que
codifican para todos los genes estructurales del retrovirus bajo el
control de secuencias reguladoras dentro de LTR. Estos plásmidos
han perdido una secuencia de nucleótidos que permite el mecanismo de
empaquetamiento para reconocer un transcrito de ARN para la
encapsulación. Las líneas celulares auxiliares que tienen deleciones
de la señal de empaquetamiento incluyen, pero no se limitan a:
\Psi2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen
viriones vacíos, ya que no se empaqueta ningún genoma. Si un vector
retroviral se introduce dentro de estas células auxiliares en las
que la señal de empaquetamiento está intacta, pero los genes
estructurales se han remplazado por otros genes de interés, el
vector puede empaquetarse y se produce un virión vector.
De los vectores de expresión de ADN, se
prefieren los vectores de adenovirus por su eficiencia de
transfección (hasta un 70% en miocitos cardiacos). Estos vectores
se prefieren también por su habilidad para aceptar ADN exógeno de
hasta 7.5 kb de tamaño, así como su susceptibilidad para la
producción a títulos altos. Ventajosamente, los vectores de
adenovirus sobreviven bien a la inyección intracoronaria (comparado,
por ejemplo, con conjugados de polilisina de polinucleótidos de
SERCA2).
Los adenovirus son virus de ADN lineal, de doble
cadena, y se conocen al menos 42 serotipos diferentes. El serotipo
5 es el más frecuentemente usado como vector de expresión
recombinante, normalmente con la mayoría de las regiones
codificantes de las proteínas de fase temprana E1a y E1b eliminadas
para prevenir la replicación (para una revisión en relación a la
construcción de vectores de adenovirus con replicación deficiente,
los expertos medios en la materia pueden dirigirse a Brody and
Crystal, Annals NY Acad.Sci., 716:90-101,
1994. Se suele emplear la señal de poliadenilación del virus 40 de
simio (SV40), con propagación en células 293 (una línea celular
transformada derivada de células embrionarias de riñón humano).
Estos vectores pueden producirse en títulos de hasta 10^{12}
unidades formadoras de placas/ml.
Se muestra una construcción de adenovirus
especialmente preferida para utilizar en la invención en la Figura
2. Como se detalla más adelante en el Ejemplo 4, la construcción se
forma mediante la clonación del polinucleótido de SERCA2 dentro de
un vector lanzadera que contiene un promotor, un polylinker
(región de clonación) y secuencias parciales flanqueantes de
adenovirus de las cuales se han eliminado las regiones que codifican
para E1a y E1b. El plásmido resultante es entonces
co-transfectado (mediante técnicas convencionales de
precipitación de calcio/fosfato) dentro de células 293 con el
plásmido JM17, un plásmido que contiene el genoma completo del
adenovirus humano tipo 5 con un inserto adicional de 4.3 kb (el
producto de construcción es demasiado grande para ser encapsulado).
La recombinación homóloga de rescate da lugar a vectores
adenovirales que codifican SERCA2 pero propagados en células 293
que han sido transformadas con proteínas de la fase temprana E1a y
E1b. Preferentemente, los recombinantes producidos con éxito se
purifican por placas previamente a la propagación, después se
purifican aún más en gradiente de CsCl por doble
ultracentrifugación. (ver, Ejemplo 4) para eliminar al
máximo la contaminación de la cepa salvaje.
La operabilidad esperada in vivo de la
construcción adenoviral mostrada en la Figura 2 no es mayor de 7
meses. Sin embargo, con la reconstitución de la función de la región
codificante de E3 (que codifica para proteínas que proporcionan al
virus una protección frente a la vigilancia inmunológica del
hospedador), esta duración debería verse incrementada. La
encapsulación de SERCA2 para el transporte con liposomas (como se
describe en la Sección C más abajo) debería también limitar la
destrucción inmunológica del virus, como si se utilizara una
construcción de adenovirus replicable. Sin embargo, dados los
riesgos que pueden estar asociados con la integración de ADN viral
dentro del genoma del hospedador, el uso de esto vectores estará
probablemente limitado a situaciones en la que la expresión a largo
plazo de los productos del vector sea crítica para la supervivencia
del paciente.
Mediante la inserción de una o más secuencias de
interés dentro del vector viral, junto con otro gen que codifique
el ligando para un receptor en una célula diana específica, por
ejemplo, el vector puede volverse específico de diana. Los vectores
retrovirales pueden hacerse específicos de diana mediante la
inserción, por ejemplo, de un polinucleótido que codifica un
azúcar, un glicolípido o una proteína.
Preferiblemente, la acción de evitar la
transfección no específica de los vectores de expresión
recombinantes de la invención en células miocardiacas aparte de los
miocitos diana se logrará con el uso de promotores específicos
cardiacos. Varios de estos promotores se conocen actualmente e
incluyen la \beta-actina de ave (ver, el
mapa del plásmido que codifica para SERCA2 en la Figura 3 y el
Ejemplo 1). Los expertos medios en la materia sabrán, o podrán
establecer fácilmente sin excesiva investigación, que otras
secuencias específicas de polinucleótidos pueden insertarse dentro
del genoma viral para permitir el transporte específico de diana del
vector viral que contiene los polinucleótidos de SERCA2 de
interés.
\vskip1.000000\baselineskip
Las composiciones de polinucleótidos de SERCA2 y
las mezclas de polinucleótidos de SERCA2 pueden colocarse dentro de
una suspensión, solución o emulsión farmacéuticamente aceptable. Los
medios adecuados incluyen el medio salino y, para aquellos aspectos
que no estén basados en células presentadoras de antígeno para el
transporte de polinucleótidos de SERCA2 dentro del tejido diana,
podrían emplearse preparaciones liposomales.
Más específicamente, los transportadores
farmacéuticamente aceptables podrían incluir soluciones,
suspensiones o emulsiones estériles acuosas y no acuosas. Ejemplos
de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol,
aceites vegetales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos
inyectables como el etil oleato. Los transportadores acuosos
incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas o
acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos
parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa en
Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer lactato o aceites
fijadores. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de
líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (como los
basados en dextrosa en Ringer), y otros similares. Además, una
composición de polinucleótidos de SERCA2 puede liofilizarse
utilizando medios bien conocidos en el estado de la técnica, para
la posterior reconstitución y uso de acuerdo con la invención.
Además de los sistemas de transporte con
vectores dirigidos discutidos más arriba, un sistema de dispersión
coloidal puede utilizarse también para el transporte dirigido. Los
sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de
macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, micropartículas y
sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en
agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal
preferido de esta invención es un liposoma.
Los liposomas son vesículas artificiales de
membrana que son útiles como vehículos de transporte in vitro
e in vivo. Se ha observado que las vesículas unilamelares
grandes (LUV), cuyo rango de tamaño de 0,2-4 \mum
puede encapsular un porcentaje substancial de un tampón acuoso que
contenga grandes macromoléculas. El ARN, ADN y viriones intactos
pueden encapsularse dentro del interior acuoso y transportarse a las
células en forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends
Biochem. Sci., 6:77, 1981). Además de las células de
mamíferos, los liposomas se han utilizado para el transporte de
polinucleótidos que codifican operativamente en células de plantas,
levaduras y bacterias. Para que un liposoma sea un vehículo
eficiente de transferencia de genes, deben estar presentes las
siguientes características: (1) encapsulación de los genes que
codifican los polinucleótidos antisentido con una alta eficacia
siempre que no comprometa su actividad biológica; (2) número
sustancial de lugares de unión de forma preferente a la célula diana
en comparación con las células no diana; (3) transporte del
contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con
una alta eficiencia; y (4) expresión precisa y eficaz de la
información genética (Mannino, et al., Biotechniques,
6:682, 1988).
La composición del liposoma es normalmente una
combinación de fosfolípidos, en particular fosfolípidos con una
alta temperatura de transición de fase, normalmente en combinación
con esteroides, especialmente colesterol. Pueden emplearse otros
fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los
liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes
divalentes.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción
de liposomas incluyen compuestos de fosfatidil, como
fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina,
esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Son particularmente
útiles los diacilfosfatidilgliceroles, donde la porción lipídica
contiene de 14 a 18 átomos de carbono, en particular de 16 a 18
átomos de carbono, y está saturada. Fosfolípidos ilustrativos serían
fosfatidilcolina de huevo, fosfatidilcolina con dos ácidos
palmíticos y fosfatidilcolina con dos ácidos esteáricos.
La forma de dirigir los liposomas puede
clasificarse basándose en factores anatómicos y mecánicos. La
clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por
ejemplo, específico de órgano, específico de célula y específico de
orgánulo. El dirigir de forma mecánica puede diferenciarse según si
es de forma pasiva o activa. El dirigir de forma pasiva utiliza la
tendencia natural de los liposomas para distribuirse a células del
retículo endotelial (SRE) en órganos que contienen capilares
sinusoidales. El dirigir de forma activa, por otro lado, incluye la
alteración del liposoma mediante el acoplamiento del liposoma a un
ligando específico como un anticuerpo monoclonal, azúcar, un
glicolípido o una proteína, o mediante un cambio en la composición o
tamaño del liposoma para lograr que se dirija a tipos de órganos o
células diferentes de los lugares de localización a los que se
uniría naturalmente.
La superficie del sistema de transporte dirigido
puede modificarse de varias formas. En el caso de un sistema de
transporte dirigido liposomal, grupos lipídicos pueden incorporarse
dentro de la bicapa lipídica del liposoma para mantener el ligando
diana en una asociación estable con la bicapa lipídica. Se pueden
usar varios grupos de unión para unir las cadenas lipídicas al
ligando diana.
Se espera que estas técnicas (y otras que se
emplean convencionalmente para facilitar el transporte de fármacos)
puedan adaptarse para la preparación de polinucleótidos de SERCA2
para su uso en los métodos de la invención por los expertos medios
en la materia sin excesiva experimentación. En particular, aunque
las propuestas discutidas en los párrafos precedentes, según el
conocimiento de los inventores, no hayan sido previamente utilizadas
para el transporte de polinucleótidos de SERCA2 a miocitos in
vivo, se cree que son adecuadas para utilizarlas para ese fin.
Se exponen más abajo ejemplos específicos que ilustran esta
idoneidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los objetivos de la invención, es
suficiente que los polinucleótidos de SERCA2 se suministren a dosis
suficiente para causar la expresión del péptido biológicamente
activo codificado por el polinucleótido. Preferentemente, el nivel
de expresión alcanzado será suficiente para remplazar
sustancialmente la actividad endógena "normal" de SERCA2. De
forma ventajosa, los polinucleótidos de SERCA2 estarán contenidos en
un vector de expresión recombinante y formulados en una composición
farmacéuticamente aceptable (como se describió en la Sección C, más
arriba).
Los niveles y actividad "normales" de
SERCA2 variarán entre individuos y no pueden, por lo tanto, ser
cuantificados de forma absoluta para cada especie en particular.
Sin embargo, se puede establecer y mantener un nivel de expresión
deseado de SERCA2 para lograr fines terapéuticos específicos (una
"cantidad terapéuticamente beneficiosa") dentro de unos
límites clínicos aceptables mediante el seguimiento de los niveles
de proteína SERCA2 pre y postratamiento, así como de los signos
clínicos de la mejora de la contractilidad y función cardiaca en un
corazón con ICC. Se describen los medios para el control de los
niveles de SERCA2 más abajo en la Sección F.
Los signos clínicos de la mejora de la función
cardiaca y del ajuste de la tensión cardiaca asociada a la ICC son
conocidos para los expertos medios en el estado de la técnica
relacionada con la cardiología y se pueden determinar, por ejemplo,
mediante el control del flujo sanguíneo, el volumen de bombeo
cardiaco y la presión ventricular (mediante, por ejemplo, una
angiografía y una ecocardiografía), las tasas de transporte de
calcio (mediante la evaluación in vitro de muestras de fluido
cardiaco), estudios de tolerancia (mediante, por ejemplo, el
control de la tasa cardiaca en respuesta a un estrés de sobrecarga
de presión sobre el corazón) y signos clínicos generales de una
reducción en los síntomas de la ICC (por ejemplo, mayor resistencia
del hospedador y respiración más fácil). Las dosis administradas
pueden modificarse para lograr fines terapéuticos particulares (p.
ej., sobreexpresión de SERCA2 para estimular el transporte de calcio
en hospedadores que presenten un estado de ICC aguda). Los rangos
máximos y mínimos se definirán también mediante la extrapolación de
los resultados de datos procedentes de animales no humanos, como los
usados en los modelos descritos más arriba y en especies de grandes
mamíferos.
El transporte del polinucleótido de SERCA2 se
logrará, preferiblemente, mediante infusión intravenosa o
intracoronaria (preferiblemente utilizando cateterización para
minimizar el reflujo del polinucleótido en la raíz aórtica. De
forma alternativa, para lograr una mayor expresión de SERCA2 de
forma inmediata, se pueden inyectar los polinucleótidos de SERCA2
dentro de la pared intraventricular (a través, por ejemplo, de una
técnica quirúrgica como la toracotomía) o se pueden introducir
directamente dentro de un ventrículo (mediante, por ejemplo,
cateterización angiográfica). Se controlará la expresión de SERCA2
a partir de ese momento y se repetirá el transporte si es
necesario. Los hospedadores tratados deben también controlarse
cuidadosamente por las reacciones adversas, como las respuestas
inmunes a los polinucleótidos o a SERCA2, así como por la expresión
excesiva de SERCA2 (como se indica, por ejemplo, mediante una
excesiva prolongación de la diástole).
En general, sin embargo, basándose en los
resultados expuestos en los Ejemplos de abajo, el riesgo de efectos
citopáticos o de otros efectos adversos relacionados con el
transporte de vectores de expresión recombinantes (adenovirus) con
polinucleótidos de SERCA2 a miocitos in vivo parece ser bajo
y puede minimizarse con la eliminación de los vectores de tipo
salvaje contaminantes y otras reducciones en la inmunogenicidad del
vector (como la encapsulación liposomal de los vectores).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha probado que la rata es un modelo
experimental reproducible de la insuficiencia cardiaca congestiva el
cual, a pesar de la falta de circulación colateral en el corazón de
la rata, es aceptablemente predictivo de las condiciones de la ICC
humana. En particular, las ratas que han sufrido una ligación
quirúrgica de la arteria coronaria son particularmente buenos
modelos de ICC tras infarto de miocardio en humanos. Los protocolos
de experimentación para la producción y uso de ratas como modelos
animales de ICC se han descrito en el estado de la técnica; como
referencia, los expertos medios en la materia pueden remitirse a
Pfieffer, et al., Am.J.Med.,
76:99-103, 1984; Johns and Olsen,
Ann.Surg., 140:675-682, 1954; y,
Selye, et al., Angiology, 11:398-407,
1960.
Además, se ha desarrollado un modelo de animal
transgénico que es especialmente predictivo del impacto sobre la
función cardiaca en el corazón con ICC en el cual la actividad de
SERCA2 se ha incrementado de acuerdo con el método de la invención.
Un protocolo útil para reproducir estos animales transgénicos (que
expresan un transgen de SERCA2) es descrito más abajo y se expone
en el Ejemplo 1. El protocolo generalmente sigue técnicas
convencionales para la introducción de transgenes expresables en
mamíferos. los expertos medios en la materia estarán familiarizados
con estas aplicaciones y serán capaces de aplicar las técnicas en el
contexto de la presente invención sin excesiva experimentación.
Por ejemplo, las células diana embrionarias no
humanas en varias etapas de desarrollo pueden usarse para introducir
transgenes. Diferentes métodos son empleados dependiendo de la
etapa de desarrollo de las células diana embrionarias no humanas.
El zigoto es la mejor diana para la microinyección. En el ratón, los
pronúcleos masculinos alcanzan el tamaño de aproximadamente 20
micrómetros de diámetro lo que permite la inyección reproducible de
1-2 pl de solución de ADN. El uso de zigotos como
diana para la transferencia de genes tiene una importante ventaja
ya que en la mayoría de los casos el ADN inyectado se incorporará
dentro del gen del hospedador antes de su primera segmentación
(Brinster, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:4438-4442, 1985). Como consecuencia,
todas las células del animal transgénico no humano portarán el
transgen incorporado. Esto, en general, se reflejará también en la
transmisión eficiente del transgen a la descendencia del fundador ya
que el 50% de las células germinales contendrán el transgen. La
microinyección de zigotos es el método preferido para incorporar
transgenes en la práctica de la invención.
La infección retroviral puede emplearse también
para introducir un transgen dentro de un animal no humano. El
embrión no humano en desarrollo puede cultivarse in vitro
hasta la etapa de blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros
pueden ser dianas para la infección retroviral (Jaenisch, Proc.
Natl. Acad. Sci USA 73:1260-1264,
1976). La infección eficiente de los blastómeros se obtiene mediante
el tratamiento enzimático para eliminar la zona pelúcida (Hogan,
et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). El sistema de
vector viral usado para introducir el transgen es típicamente un
retrovirus defectivo para la replicación que porta el transgen
(Jahner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82:6927-6931, 1985; Van der Putten, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:6148-6152). La transfección es fácil y
eficientemente lograda mediante el cultivo de blastómeros sobre una
monocapa de células productoras de virus (Van der Putten, ver
más arriba; Steward, et al., EMBO J.,
6:383-388, 1987).
Alternativamente, la infección se puede llevar a
cabo en una etapa más tardía. Las células productoras o no de virus
pueden inyectarse dentro del blastocele (Jahner, et al.,
Nature, 298:623-628, 1982). La mayoría de los
fundadores serán mosaicos para el transgen ya que la incorporación
del transgen ocurre sólo en un subconjunto de las células que
forman el animal transgénico no humano. Además, el fundador puede
contener varias inserciones retrovirales del transgen en diferentes
posiciones del genoma las cuales segregarán en la descendencia.
Asimismo, también es posible introducir transgenes dentro de la
línea germinal, aunque con baja eficiencia, mediante la infección
retroviral intrauterina del embrión a la mitad de la gestación
(Jahner, et al., ver más arriba, 1982).
Un tercer tipo de célula diana para la
introducción del transgen es la célula madre embrionaria (CME) no
humana. Las CME se obtienen de la preimplantación de embriones no
humanos cultivados in vitro y fusionados con embriones no
humanos (Evans, et al., Nature,
292:154-156, 1981; Bradley, et al.,
Nature, 309:255-258, 1984; Gossler,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA,
83:9065-9069, 1986; y Robertson, et al.,
Nature, 322:445-448, 1986). Los
transgenes pueden introducirse eficientemente dentro de las CME no
humanas mediante la transfección del ADN o mediante transducción
mediada por retrovirus. Estas CME transformadas pueden a partir de
entonces combinarse con blastocistos procedentes de un animal no
humano. Las CME a partir de ese momento colonizarán el embrión y
contribuirán a la línea germinal del resultante animal quimérico
(ver para revisión, Jaenisch, Science,
240:1468-1474, 1988).
Preferentemente, para su uso como modelo animal
en el contexto aquí descrito, el transgen de elección será uno que
incluya un promotor capaz de conducir a una expresión relativamente
alta del nivel de SERCA2. Un promotor preferido para su uso en este
aspecto es el enhancer de CMV humano unido a un promotor de
\beta-actina (p. ej., de una especie aviar) que
incluya un intrón de \beta-actina. Para la
detección de la actividad de la expresión del transgen, una región
codificante para el epítopo antigénico Flag descrito en otra parte
más arriba se incluyó en la región del transgen que codifica para la
región C-terminal de SERCA2. Como se describe en el
Ejemplo 1, la progenie que expresa el transgen de los animales
fundadores vive hasta la edad adulta; el transgen se espera que sea
portado por, al menos, alrededor del 15% de la progenie de la línea
fundadora.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el objetivo de evaluar la expresión de
SERCA2, los polinucleótidos de SERCA2 que se van a introducir en
un hospedador de acuerdo con la invención pueden ser modificados
para incluir genes marcadores conocidos. Por ejemplo, el vector de
ADN pRSV lac-Z descrito en Norton, et al., Mol.
Cell. Biol., 5:281, 1985, puede producir
\beta-galactosidasa con la expresión de la
proteína. La luciferasa y la cloranfenicol acetil transferasa
("CAT"; ver, p. ej., Gorman, et al., más
arriba, revisión de la construcción de un plásmido
pRSV-CAT) pueden emplearse también. Otra molécula
marcadora útil es el péptido antigénico Flag, el cual puede
detectarse fácilmente mediante un inmunoensayo. La secuencia de 8
aminoácidos para el péptido antigénico Flag y por lo tanto las
regiones codificantes son conocidas en el estado de la técnica; para
referencias en este aspecto, los expertos medios en la materia
pueden consultar Chiang, et al., Peptide Res.,
6:62-64, 1993. La inserción de un gen marcador que
codifique en el extremo C de la proteína SERCA2 (p. ej., mediante la
inserción de un gen a unas 25 pb desde el codón de inicio) no
interferirá con la actividad catalítica de SERCA2. Los medios para
la detección de la expresión de estos genes marcadores se conocen en
el estado de la técnica y no se describirán en detalle, aunque son
resumidos más abajo.
Por ejemplo, SERCA2 expresada in vivo
tras la introducción de un polinucleótido de SERCA2 de acuerdo con
la invención puede ser detectada mediante inmunoensayos en los que
la proteína SERCA2 puede utilizarse en una fase líquida o unida a
un transportador en fase sólida. Además, la proteína SERCA2 que se
utiliza en estos ensayos puede ser marcada para que sea detectable
de varias formas. Asimismo, los anticuerpos para SERCA2 o un
producto de un gen marcador pueden emplearse para detectar la
expresión del polinucleótido de SERCA2 en muestras de análisis,
como sangre o suero.
En resumen, esos anticuerpos pueden producirse
mediante medios que son conocidos en el estado de la técnica. Por
ejemplo, los anticuerpos que son específicos para SERCA2 o los
productos de un gen marcador pueden producirse mediante
inmunización de un no humano con SERCA2 antigénico o péptidos de
genes marcadores. Tales péptidos pueden aislarse de fuentes nativas
(ver, p. ej., el método empleado para aislar SERCA2 de rata
publicado en Popovich, et al., Am.J.Physiol.,
261:E377-E381, 1991) o pueden sintetizarse
sin excesiva experimentación por métodos frecuentemente usados como
protección t-BOC o FMOC de los grupos
alfa-aminos.
Los métodos posteriores incluyen síntesis
paulatina a través de la cual un único aminoácido se añade en cada
paso comenzando en la terminación C del péptido (ver,
Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley
Interscience, 991, Unit 9). Los péptidos que se emplean en este
sentido pueden también sintetizarse por varios métodos conocidos de
síntesis de péptidos en fase sólida, como los descritos por
Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1962, y
Steward and Young, Solid Phase Peptides Synthesis (Freeman,
San Francisco, 27-62, 1969), usando un
copoli(estireno-divinilbenceno) que contiene
0.1-1.0 mMol de aminas/g polímero.
Al terminarse la síntesis química, los péptidos
pueden ser desprotegidos y segmentados a partir del polímero
mediante tratamiento con anisol HF líquido al 10% durante
aproximadamente 1/4-1 hora a 0ºC. Tras la
evaporación de los reactivos, los péptidos se extraen a partir del
polímero con una solución de ácido acético al 1% la cual es
entonces liofilizada para extraer el material sin purificar. Éste
puede ser normalmente purificado por técnicas como la filtración en
gel Sephadex G-15 usando como disolvente ácido
acético al 5%. La liofilización de fracciones apropiadas de la
columna producirán el péptido homogéneo o los derivados del péptido,
los cuales pueden entonces ser caracterizados mediante técnicas
estándar como el análisis de aminoácidos, la cromatografía en capa
fina, cromatografía líquida de alta resolución, espectroscopia de
absorción ultravioleta, rotación molar, solubilidad, y
cuantificados mediante la degradación de Edman en fase sólida. La
capacidad antigénica de los péptidos de interés puede determinarse
por técnicas convencionales para determinar la magnitud de la
repuesta del anticuerpo de un animal que ha sido inmunizado con el
péptido.
Una vez que se preparan los péptidos antigénicos
SERCA2, los anticuerpos para el péptido inmunizante se producen
mediante la introducción del péptido en un mamífero (como un conejo,
ratón o rata). Se prefiere un protocolo de inmunización por
inyección múltiple para su uso en animales inmunizados con el
péptido antigénico (ver, p. ej., Langone, et al.,
eds., "Production of Antisera with Small Doses of Immunogen:
Multiple Intradermal Injections", Methods of Enzymology
(Acad. Press, 1981). Por ejemplo, una buena respuesta del anticuerpo
puede obtenerse normalmente en conejos mediante inyección
intradérmica de 1 mg de péptido antigénico emulsificado en el
Adyuvante Completo de Freund seguido varias semanas después de una o
más inyecciones del mismo antígeno en el Adyuvante Incompleto de
Freund.
Si se desea, el péptido inmunogénico puede
unirse a una proteína transportadora mediante conjugación empleando
técnicas conocidas en el estado de la técnica. Estos transportadores
comúnmente usados que están químicamente unidos a los péptidos
incluyen la hemocianina de Megathura crenulata (KLH),
tiroglobulina, albúmina sérica bovina (ASB) y toxina tetánica. El
péptido unido se emplea entonces para inmunizar al animal (p. ej.,
un ratón o un conejo). Debido a que en este momento se considera
que SERCA2 está ampliamente conservada entre especies de mamíferos,
se prefiere el uso de una proteína transportadora para mejorar la
inmunogenicidad de las proteínas SERCA2.
Los anticuerpos policlonales producidos por los
animales pueden purificarse posteriormente, por ejemplo, mediante
la unión y elución a partir de una matriz a la cual se une el
péptido al cual se ha unido el anticuerpo. Los expertos medios en
la materia conocen varias técnicas comunes en inmunología para
purificar y/o concentrar anticuerpos policlonales, así como
anticuerpos monoclonales (ver, por ejemplo, Coligan, et
al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley
Interscience, 1991).
Por su especificidad y facilidad de producción,
se prefiere el uso de anticuerpos monoclonales para la detección de
la expresión de SERCA2. Para la preparación de anticuerpos
monoclonales, se prefiere la inmunización de un ratón o una rata.
El término "anticuerpo" como se usa en esta invención se
entiende que incluye también moléculas intactas así como fragmentos
de las mismas, como por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}, las
cuales son capaces de unirse al epítopo. También, en este contexto,
el término "AcM de la invención" se refiere a anticuerpos
monoclonales con especificidad para SERCA2 o productos de genes
marcadores.
El método general empleado para la producción de
hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales ("AcM") es ya
conocido (Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975).
Brevemente, como lo describen Kohler y Milstein, la técnica
comprende linfocitos aislados a partir del drenaje regional de
ganglios linfáticos de cinco pacientes diferentes con cáncer,
respectivamente con melanoma, teratocarcinoma, cáncer de cérvix,
glioma y cáncer de pulmón, que se obtuvieron a partir de muestras
quirúrgicas, se mezclaron y posteriormente se fusionaron con
SHFP-1. Los hibridomas se cribaron para la
producción de anticuerpos que se unieran a líneas celulares
cancerígenas.
La confirmación de la especificidad antigénica
entre AcM puede lograrse utilizando técnicas de cribado
relativamente rutinarias (como el ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas o "ELISA") para determinar el modelo de reacción
básico del AcM de interés. También es posible evaluar un AcM para
determinar si tiene la misma especificidad que un AcM específico
para SERCA2 sin excesiva investigación determinando si el AcM que
está siendo evaluado evita que un AcM de la invención se una al
antígeno de interés aislado como se describió anteriormente. Si el
AcM que se está evaluando compite con el AcM de la invención, como
se demuestra por un descenso de la unión del AcM de la invención,
entonces es probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al
mismo epítopo o a uno muy similar.
Existe otra forma más de determinar si un AcM
tiene la especificidad del AcM dirigido contra SERCA2 que consiste
en preincubar el AcM de la invención con un antígeno con el cual
reacciona normalmente, y determinar si la capacidad de unirse al
antígeno del AcM que está siendo evaluado se inhibe. Si el AcM que
está siendo evaluado se inhibe, entonces, con toda probabilidad,
tiene la misma o muy similar especificidad de epítopo que el AcM
específico para SERCA2.
Los anticuerpos monoclonales de SERCA2 que
reconocen un epítopo compartido por MHC\alpha y MHC\beta serán
particularmente útiles en determinar que la proteína SERCA2
detectada está, en lo esencial, inalterada estructuralmente. Tales
AcM son descritos con suficiente detalle como para ser reproducidos
por Dorn, et al., Am.J.Physiol.,
267:H400-H405, 1994.
Los ejemplos de inmunoensayos que pueden
emplearse para detectar la expresión de SERCA2 son los inmunoensayos
competitivos y los no competitivos tanto en formato directo como
indirecto. Ejemplos de estos inmunoensayos son el radioinmunoensayo
(RIA), el ensayo tipo sándwich (ensayo inmunométrico) y el ensayo de
Western blot. La detección de anticuerpos que se unen a SERCA2 o a
un producto de un gen marcador puede realizarse utilizando
inmunoensayos que se lleven a acabo de forma directa, indirecta o
simultánea, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos sobre muestras
fisiológicas. Para su uso en este aspecto se prefieren especialmente
los kits de ensayo que se encuentran comercialmente disponibles
para la detección de productos de genes marcadores tales como
lac-Z o \beta-gal (p. ej.,
\beta-galactosidasa).
La concentración de antígeno o anticuerpo que se
va a utilizar variará dependiendo del tipo de inmunoensayo y de la
naturaleza del marcador que se vaya a emplear. Sin embargo, a pesar
del tipo de inmunoensayo que se vaya a usar, la concentración de
antígeno o anticuerpo a emplear puede ser fácilmente determinada por
un experto medio en la materia utilizando una experimentación
rutinaria.
Tales antígenos o anticuerpos pueden unirse a
muchos transportadores o vehículos diferentes y emplearse para
detectar la presencia del anticuerpo o antígeno específicamente
reactivo a estos. Ejemplos de conocidos transportadores incluyen
cristal, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno,
polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilasas, celulosas
naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La
naturaleza del transportador para los objetivos aquí descritos
puede ser bien soluble o insoluble. Los expertos medios en la
materia conocerán otros transportadores adecuados para emplearse en
este aspecto, o serán capaces de establecer cuáles son mediante una
investigación rutinaria.
Existen muchos marcadores y métodos diferentes
para el marcaje ya conocidos para un experto medio en la materia.
Ejemplos de tipos de marcadores que pueden usarse en la presente
invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales,
compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y
compuestos bioluminiscentes.
De forma alternativa, los polinucleótidos de
SERCA2 pueden detectarse (preferentemente en muestras de células
diana obtenidas a través de técnicas convencionales para la
extracción de biopsias de tejido cardiaco) mediante el uso de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, ya conocida
en el estado de la técnica y cuya técnica general se resume a
continuación.
El ácido nucleico procedente de una muestra
histológica de tejido, en forma purificada o no purificada, puede
utilizarse como el ácido o ácidos nucleicos de inicio, dado que
contiene, o se sospecha que contiene, la secuencia específica de
ácido nucleico que incluye el ácido nucleico diana. De esta manera,
el proceso puede emplear, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN
mensajero (ARNm), donde el ADN o ARN puede ser de cadena simple o
doble. En el caso de que se emplee como molde ARN, se utilizarán
las enzimas y/o las condiciones óptimas para la transcripción
inversa del molde a ADN. Además, se puede emplear un híbrido de
ADN-ARN que contenga un cadena de cada uno. También
se puede utilizar una mezcla de ácidos nucleicos, o los ácidos
nucleicos producidos en una reacción de amplificación previa,
pudiendo emplearse los mismos o diferentes cebadores. La secuencia
de nucleótidos que se va a amplificar puede ser una fracción de una
molécula mayor o puede presentarse inicialmente como una molécula
diferenciada, de manera que la secuencia específica constituye el
ácido nucleico entero. No es necesario que la secuencia que se va a
amplificar esté presente al comienzo en forma purificada; puede ser
una fracción minoritaria dentro de una compleja mezcla, como la
contenida dentro de todo el ADN humano.
En el caso de que la secuencia de nucleótidos
diana de la muestra contenga dos cadenas, es necesario separar las
cadenas del ácido nucleico antes de que puedan usarse como molde. La
separación de las cadenas puede efectuarse bien como un paso de
separación o bien simultáneamente con la síntesis de los productos
de extensión que surgen a partir del cebador. Esta separación de
cadenas puede llevarse a cabo empleando unas condiciones de
desnaturalización adecuadas, con la ayuda de medios físicos,
químicos o enzimáticos; la palabra "desnaturalización" incluye
todos estos medios. Un método físico para separar las cadenas de los
ácidos nucleicos consiste en calentar el ácido nucleico hasta que
éste se desnaturalice. Una desnaturalización por calor típica puede
implicar temperaturas que varían entre los 80º y los 105ºC durante
tiempos que varían entre 1 y 10 minutos. La separación de cadenas
puede inducirse también mediante una enzima del tipo de las
conocidas como helicasas o por una enzima RecA, que tiene actividad
helicasa, y que en presencia de riboATP se sabe que desnaturaliza el
ADN. Las condiciones adecuadas para la reacción de separación de
cadenas de ácidos nucleicos con helicasas se describen en Kuhn
Hoffmann-Berling
(CSH-Quantitative Biology, 43:63,
1978) y las técnicas para el uso de RecA se revisan en C. Radding
(Ann. Rev. Genetics, 16:405-437,
1982).
Si el ácido nucleico que contiene el ácido
nucleico diana que se va a amplificar es de cadena simple, su cadena
complementaria se sintetiza mediante la adición de uno o dos
oligonucleótidos cebadores. Si se utiliza un único cebador, el
producto de extensión a partir del cebador se sintetiza en presencia
del cebador, un agente para la polimerización y los cuatro
nucleósidos trifosfato descritos más abajo. Este producto será
complementario al ácido nucleico de cadena simple e hibridará con
un ácido nucleico de cadena simple para formar una doble cadena con
hebras de diferente longitud que pueden separarse en cadenas simples
para producir dos cadenas simples complementarias y separadas. De
forma alternativa, se pueden añadir dos cebadores al ácido nucleico
de cadena simple y la reacción se llevará a cabo como se
describe.
Cuando las cadenas complementarias del ácido o
ácidos nucleicos se separan, a pesar de si el ácido nucleico
original era de cadena simple o doble, las cadenas separadas están
listas para utilizarse como molde para la síntesis de cadenas de
ácido nucleico adicionales. Esta síntesis se realiza bajo
condiciones que permiten la hibridación de los cebadores a las
cadenas molde. Generalmente, la síntesis tiene lugar en una solución
acuosa tamponada, preferiblemente a un pH de 7-9,
más preferiblemente sobre 8. Preferentemente, se añade un exceso
molar (para ácidos nucleicos genómicos, normalmente sobre 10^{8}:1
cebador:molde) de los dos oligonucleótidos cebadores al tampón que
contiene las cadenas molde separadas. Se entiende, sin embargo, que
la cantidad de cadena complementaria puede no ser conocida si el
proceso de la invención se utiliza para aplicaciones diagnósticas,
de manera que la cantidad de cebador en comparación con la cantidad
de cadena complementaria no puede determinarse con certeza. En la
práctica, sin embargo, la cantidad de cebador que se añade
generalmente estará en exceso molar sobre la cantidad de cadena
complementaria (molde) cuando la secuencia que se va a amplificar
está contenida en una mezcla de complicadas cadenas largas de
ácidos nucleicos. Se prefiere un gran exceso molar para mejorar la
eficiencia del proceso.
En algunos métodos de amplificación, los
sustratos, por ejemplo, los desoxirribonucleótidos trifosfato dATP,
dCTP, dGTP y dTTP, se añaden a la mezcla de síntesis, bien de forma
separada o bien junto con los cebadores, en cantidades adecuadas y
se calienta la solución resultante alrededor de
90-100ºC durante 1 a 10 minutos, preferentemente de
1 a 4 minutos. Tras este periodo de calentamiento, se deja enfriar
la solución hasta temperatura ambiente, que es preferible para la
hibridación del cebador. A la mezcla ya enfriada se le añade un
agente adecuado para que ocurra una reacción efectiva de extensión
a partir del cebador (llamado aquí "agente para la
polimerización"), y se deja que se produzca la reacción bajo
condiciones conocidas en el estado de la técnica. El agente para la
polimerización puede añadirse también junto con los otros reactivos
si es estable al calor. Esta reacción de síntesis (o amplificación)
puede darse una temperatura ambiente hasta una temperatura por
encima de la cual el agente para la polimerización deja de
funcionar. Así, por ejemplo, si se emplea ADN polimerasa como
agente, la temperatura generalmente no es mayor de 40ºC.
El agente para la polimerización puede ser
cualquier compuesto o sistema con el que se logrará la síntesis de
productos de extensión a partir del cebador, incluyendo enzimas.
Enzimas adecuadas para este objetivo son, por ejemplo, la ADN
polimerasa I de E. coli, la Taq polimerasa, el fragmento
Klenow de la ADN polimerasa I de E. Coli, la ADN polimerasa
T4, otras ADN polimerasas disponibles, muteinas de polimerasas,
transcriptasa inversa, ligasa, y otras enzimas, incluyendo enzimas
estables al calor (es decir, aquellas enzimas que realizan la
extensión del cebador tras estar sometidas a temperaturas
suficientemente elevadas como para causar la desnaturalización).
Las enzimas adecuadas facilitarán la combinación de los nucleótidos
de manera apropiada para formar los productos de extensión a partir
del cebador que son complementarios a cada cadena de nucleótidos
mutante. Generalmente, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de
cada cebador y avanzará en dirección 5' a lo largo de la cadena
molde, hasta que la síntesis termine, produciendo moléculas de
diferente longitud. Existen sin embargo agentes para la
polimerización que inician la síntesis en el extremo 5' y avanzan en
la otra dirección, empleando el mismo proceso descrito arriba.
La nueva cadena de nucleótidos mutante
sintetizada y su cadena de ácido nucleico complementaria formarán
una molécula de doble cadena bajo las condiciones de hibridación
descritas arriba y este hibrido se usará en los siguientes pasos
del proceso. En el siguiente paso, esta nueva molécula de doble
cadena sintetizada se somete a condiciones de desnaturalización
utilizando alguno de los procedimientos descritos anteriormente para
dar lugar a moléculas de cadena simple.
El proceso anterior se repite con las moléculas
de cadena simple. Si es necesario, se puede añadir un agente para
la polimerización adicional, nucleósidos y cebadores, para que la
reacción tenga lugar bajo las condiciones descritas más arriba. De
nuevo, la síntesis se iniciará en un extremo de cada uno de los
oligonucleótidos cebadores y avanzará a lo largo de las cadenas
simples del molde para producir ácidos nucleicos adicionales. Tras
este paso, la mitad de los productos de extensión consistirán en la
secuencia del ácido nucleico específico limitada por los dos
cebadores.
Los pasos de desnaturalización y síntesis de los
productos de extensión pueden repetirse tantas veces como sea
necesario para amplificar la secuencia de nucleótidos mutante diana
hasta donde se requiera para su detección. La cantidad de secuencia
de nucleótidos mutante producida se acumulará de manera
exponencial.
El producto amplificado puede detectarse
mediante análisis de Southern blot, sin usar sondas radioactivas.
En este proceso, por ejemplo, se amplifica una pequeña muestra de
ADN que contenga a un nivel muy bajo la secuencia de nucleótidos
diana, y se analiza mediante la técnica de Southern blot. El uso de
sondas o marcadores no radioactivos es facilitado por el alto nivel
de la señal amplificada.
Un método preferido para la realización de la
PCR cuantitativa es una técnica de PCR competitiva que se lleva a
cabo utilizando un molde competidor que contiene una mutación
inducida de una o más pares de bases, lo que da lugar a un
competidor que se diferencia en la secuencia o en el tamaño del
molde del gen diana. Uno de los cebadores esta biotinilado o,
preferentemente, aminado de manera que una cadena (normalmente, la
cadena antisentido) de los productos resultantes de la PCR puede
inmovilizarse mediante uniones de tipo fuerte como
amino-carboxil, amino-amino,
biotina-estreptavidina, u otras uniones de este
tipo, a un soporte de fase sólida que haya sido unido fuertemente a
un reactivo apropiado. Más preferentemente, las uniones entre los
productos de la PCR, el soporte de fase sólida y el reactivo serán
de tipo covalente, así se volverán resistentes las uniones a la
separación bajo condiciones desnaturalizantes.
Una vez que las cadenas aminadas o biotiniladas
de los productos de la PCR se han inmovilizado, las cadenas
complementarias que no se hayan unido se separan en un lavado
alcalino desnaturalizante y se eliminan del medio de reacción. Los
oligonucleótidos de secuencia específica ("SSO")
correspondientes a la diana y los ácidos nucleicos competidores se
marcan con un marcador de detección. Los SSO son entonces hibridados
con las cadenas complementarias en ausencia de competición por la
eliminación de las cadenas que no se unieron. Se añaden los
reactivos adecuados para el ensayo y se mide el grado de hibridación
mediante técnicas de ELISA apropiadas para el marcador de detección
y medios de soporte de fase sólida utilizando preferentemente, un
lector de microplacas de ELISA. Los valores medidos se comparan con
los obtenidos del contenido del ácido nucleico diana, utilizando
una curva estándar por separado derivada de las reacciones de PCR
que amplifican los moldes incluyendo los moldes diana y los moldes
competidores.
Este método tiene la ventaja de que es
cuantitativo, no depende del número de ciclos de PCR y no está
influenciado por la competencia entre las sondas SSO y la cadena
complementaria en los productos de la PCR.
De forma alternativa, parte del paso de
polimerización y toda la fase de hibridación pueden llevarse a cabo
en un soporte de fase sólida. En este método, existe un cebador
obtenido por la polimerización de nucleótidos (preferiblemente, un
oligonucleótido) que es más capturado sobre una fase sólida que una
cadena producto de la PCR. Los ácidos nucleicos diana y
competidores producidos en la PCR se añaden entonces en solución a
la fase sólida y se lleva a cabo una fase de polimerización. Las
cadenas no unidas de los productos de polimerización se eliminan
bajo las condiciones de desnaturalización descritas
anteriormente.
El objetivo de determinar la proporción de
ácido nucleido competidor puede lograrse mediante la detección de
sondas marcadas de SSO utilizando métodos de medida apropiados
(preferentemente, lectores de ELISA). La eficiencia de este método
puede ser tan grande que la reacción en cadena en la fase de
polimerización puede llegar a ser innecesaria, acortándose así el
tiempo necesario para llevar a cabo el método. La exactitud del
método se ve también incrementada porque los productos finales de la
polimerización no tienen que transferirse de un tubo de reacción a
un soporte de fase sólida para la hibridación, limitando así la
pérdida o el daño de estos productos. Si es necesario para una
muestra en particular, sin embargo, la PCR se puede emplear para
amplificar los ácidos nucleicos diana y competidores en tubos de
reacción separados, seguido de una polimerización final realizada
sobre el soporte de fase sólida.
Las moléculas capaces de proporcionar señales
diferentes y detectables indicativas de la formación de productos
de la PCR unidos son conocidas para un experto medio en la materia
(como los nucleótidos marcados con cromóforos que forman diferentes
colores indicativos de la formación de productos de la PCR diana o
competidores) y se pueden añadir a la solución de la reacción
durante los últimos ciclos. La proporción de ácidos nucleicos diana
y competidor puede determinarse mediante ELISA u otro método de
medida apropiado y con reactivos que reaccionen con los marcadores
de detección unidos al extremo 3' de los cebadores de hibridación
inmovilizados. Este método puede adaptarse también para detectar si
un gen particular está presente en la muestra (sin cuantificarlo)
mediante la realización de un protocolo convencional de PCR no
competitiva.
Los expertos medios en la materia conocerán, o
podrán averiguar fácilmente, cómo seleccionar los cebadores
adecuados para su uso en los métodos anteriormente descritos. Para
más detalles respecto a las técnicas descritas anteriormente, se
puede remitir a las publicaciones de Kohsaka, et al.,
Nuc.Acid.Res., 21:3469-3472, 1993; Bunn,
et al., la patente estadounidense No. 5,213,961; y a Innis,
et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications, Acad.Press, 1990.
Los polinucleótidos de SERCA2 detectados como se
describe más arriba pueden ser más ampliamente evaluados,
detectados, clonados, secuenciados, etc., bien en solución o tras
unirlos a un soporte sólido, por cualquier método normalmente
aplicado para la detección de una secuencia específica de ADN como
la PCR, la restricción oligomérica (Saiki, et al.,
Biol.Technology, 3:1008-1012, 1985), el
análisis con sondas de oligonucleótidos
alelo-específicos (ASO) (Conner, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 80:278, 1983), los ensayos de
ligación de oligonucleótidos (OLA) (Landegren, et al.,
Science, 241:1077, 1988), y otros similares. Las técnicas
moleculares para el análisis del ADN han sido revisadas y se
conocen en el estado de la técnica (Landegren, et al.,
Science, 242:229-237, 1988).
Habiéndose descrito completamente la invención,
se exponen más abajo ejemplos que ilustran su uso. Estos ejemplos,
sin embargo, no deberían considerarse como limitantes del campo de
la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.
En los ejemplos, la abreviatura "min." se
refiere a minutos, "hrs" y "h" se refiere a horas, y las
unidades de medida (como "ml") se indican con las abreviaturas
habituales.
\vskip1.000000\baselineskip
Un mapa de una construcción de adenovirus bajo
el control de un enhancer del citomegalovirus humano (CMV) y
del promotor de la \beta-actina de pollo que
codifica SERCA2 se muestra en la Figura 3. En resumen, la
construcción se ha hecho utilizando un plásmido pCAGGS como material
de inicio (descrito en Niwa, et al., Gene,
108:193-200, 1993). El plásmido contiene el sistema
enhancer CMV/promotor \beta-actina.
La transcripción en el plásmido pCAGGS comienza
en el primer exón \beta de pollo (longitud de 200 pb), seguido
por el primer intrón y 92 pb del segundo exón \beta de pollo. A
este fragmento, un clon genómico modificado del polinucleótido de
SERCA2 de rata, modificado por el acortamiento del primer exón desde
la posición 218 pb hasta la 398 pb seguido por el codón de
iniciación en la posición 500, seguido por el primer intrón de
SERCA2, el segundo exón, el segundo intrón y parte del tercer exón,
se unió al extremo 3' del segundo exón de la
\beta-actina de pollo. La parte restante del
tercer exón de SERCA2 y las regiones codificantes se unieron en un
marco de lectura al tercer exón unido. La construcción resultante
por lo tanto contiene 1.8 kb del promotor
CMV/\beta-actina, 4.0 kb de la secuencia
codificadora de SERCA2 y 0.6 kb de la secuencia de los intrones. A
través de la transfección del vector en miocitos neonatales, se
confirmó que la construcción codificaba para SERCA2 de forma
específica de tejido (cardiaco).
Para el control de la expresión transgénica, la
construcción se modifica aún más para incluir un operador de
tetraciclina (tetO). En este sentido, un transactivador quimérico
denominado transactivador controlado por tetraciclina (tTA) el cual
está constituido por la secuencia que codifica para los dominios de
unión a tetraciclina (tet) del inhibidor bacteriano de tet,
fusionado al dominio de transactivación de la proteína 16 del virus
herpes simple (VP16), puede estimular considerablemente la
transcripción de muy pocos promotores que contienen las secuencias
de tetO. Debido a la alta afinidad a tTA y al hecho de que el tTA
ocupado con tet no se une a tetO, la tetraciclina inhibe la
transactivación dependiente de tTA. Así, en animales que tienen un
transgen expresable bajo el control del sistema tetO, la exposición
a la tetraciclina inhibe la expresión del transgen (ver, p.
ej., los resultados publicados en Chiang and Roedor, Peptide
Res., 6:62-64, 1993). La exposición a
tetraciclina a niveles suficientes como para regular la actividad
del transgen no conduce a alteraciones en la función cardiaca.
Con este fin, un plásmido (p. ej.,
p10-03) que contenga el sistema tetO se usará como
una fuente de tetO (para ser liberada mediante digestión). El
fragmento tetO se aísla sobre un gel de agarosa y se purifica. El
fragmento tetO es entonces insertado en el extremo 5' del transgen
de SERCA2 en lugar del promotor de
CMV/\beta-actina. Se muestra un mapa del plásmido
resultante en la Figura 1.
Los animales que expresan el transgen para la
proteína VP16 y los animales que expresan el transgen de
tetO/
SERCA2 se producen como se describe más arriba. Los animales se cruzan entonces para producir descendientes en los que la expresión de SERCA2 se regula mediante la exposición a tetraciclina (p. ej., a partir de un fluido fuente que contenga hidrocloruro de tet en una concentración de alrededor de 0.1 g/ml). Mediante el empleo de ratas como receptores del transgen y el mantenimiento de la línea fundadora en ratas Sprague-Dawley, se espera que la transmisión del transgen ocurra en al menos el 15% de la descendencia transgénica.
SERCA2 se producen como se describe más arriba. Los animales se cruzan entonces para producir descendientes en los que la expresión de SERCA2 se regula mediante la exposición a tetraciclina (p. ej., a partir de un fluido fuente que contenga hidrocloruro de tet en una concentración de alrededor de 0.1 g/ml). Mediante el empleo de ratas como receptores del transgen y el mantenimiento de la línea fundadora en ratas Sprague-Dawley, se espera que la transmisión del transgen ocurra en al menos el 15% de la descendencia transgénica.
Como se detalla más abajo, la expresión del
transgen de SERCA2 en los animales receptores y su descendencia se
confirmó mediante la detección del ARNm de SERCA2 y los niveles de
proteína en muestras histológicas y de fluidos tomadas de los
animales que son positivos para el transgen de SERCA2 con el
promotor CMV/\beta-actina o bien para el transgen
de SERCA2 con el tetO. En general, la expresión de cualquiera de los
transgenes alcanza su máximo a los 10-14 días tras
la activación de la transcripción, disminuyendo después.
Confirmando la presencia del transgen de ADN en
los animales transgénicos, se muestran los resultados de un
análisis de Southern blot del ADN genómico procedente de células de
tejido obtenidas de la cola de los animales transgénicos en la
Figura 4. En el análisis se utilizó como sonda un fragmento Ap1 de
800 pb (compuesto de 900 pb de la secuencia de la
\beta-actina de pollo y 300 pb de la secuencia de
SERCA2) derivado del plásmido pCMV- \beta-actina
(Figura 3). Los Carriles 1-3 representan los
resultados obtenidos de animales fundadores positivos para el
transgen mostrando la presencia del polinucleótido de SERCA2; el
Carril 4 representa los resultados obtenidos de un animal control;
y, el Carril 5 muestra los resultados obtenidos de analizar 1 ng de
plásmido SERCA2 con CMV/\beta-actina cortado con
Ap1.
Confirmando la presencia del transgen de ARN en
los animales transgénicos, se muestran los resultados de un
análisis de Northern blot de ARN cardiaco obtenido de animales
transgénicos con SERCA2 y animales control. En el análisis se
utilizó como sonda fragmentos que se extienden entre los puntos de
unión, en el plásmido de la Figura 3, entre la región codificante
de \beta-actina y la región codificante de SERCA2
(comprendiendo 100 pb del primero y 126 pb del último). Las sondas
comprenden la región codificante de SERCA2, empleándose también el
ARN 28S y la cHSP (proteína de choque térmico) 70. Los Carriles 1 y
2 representan los resultados obtenidos de los animales control,
mostrando una señal para SERCA2 pero no para el transgen; los
Carriles 3 y 4 representan los resultados obtenidos de animales
transgénicos que muestran señales para el polinucleótido de SERCA2
y para el transgen. En los animales transgénicos, el ARNm del
transgen de SERCA2 se detecta sobre el 30% del nivel endógeno de
ARNm de SERCA2, lo que es equivalente a los niveles de ARNm de
SERCA2 en los animales control.
Confirmando la expresión de la proteína SERCA2 a
través del transgen en los animales transgénicos, se muestran los
resultados de un análisis de Western blot en la Figura 6. Los dos
primeros carriles ilustran los patrones de unión observados cuando
en el análisis se utilizó como sonda suero preinmune procedente de
los animales y un AcM
anti-\alpha-actina sarcomérica. El
carril del medio contiene marcadores del peso molecular; la
proteína de alrededor de 110,000 en cualquier otro carril representa
SERCA2, con un carril no específico en los 70,000 MW y un carril de
actina sobre los 43,000 MW. Los dos últimos carriles muestran el
patrón observado cuando en el análisis se utilizó como sonda un AcM
frente a SERCA2 de rata en una dilución 1:500. De esta forma, se
obtiene un exceso de expresión de SERCA2 en estos animales
transgénicos.
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Para evaluar el impacto de la expresión
adicional de SERCA2 en animales transgénicos positivos bajo
condiciones que simulan las de los corazones con ICC, se trataron
los animales según grupos de sexo, edad y peso para inducir
estenosis cardiaca, para desarrollar constricción aórtico abdominal
y para sufrir sobrecarga salina. Bajo tales condiciones, estos
animales desarrollan hipertrofia cardiaca (HC) y anormalidades
cardiacas asociadas con la sobrecarga de presión del corazón (OP),
condiciones que predominan en el corazón con ICC. Para la
especificidad de tejido cardiaco en la expresión del transgen, se
emplearon animales transgénicos SERCA2 con
CMV/\beta-actina.
En resumen, para desarrollar estos animales, los
animales transgénicos (ratas con alrededor de
200-250 g de peso corporal), desarrollados como se
describió en el Ejemplo 1, y los animales control se anestesian
mediante el aislamiento de la aorta abdominal al nivel de la
arteria celiaca y, en los animales transgénicos, por constricción
quirúrgica de la aorta por encima de la arteria renal empleando un
hemoclip de acero inoxidable (Edgard Weck & Co., North
Carolina). Este último procedimiento da lugar a una reducción de la
luz aórtica de aproximadamente el 50%.
Unos dos días después de la cirugía, se inyecta
intramuscularmente a los animales transgénicos con la constricción
aórtica dos veces a la semana con desoxicortisona suspendida en
aceite de sésamo (25 mg/g de peso corporal) y se les administra un
1% de cloruro sódico en el agua de beber. Todos los animales son
controlados mediante ultrasonidos cardiacos (ecocardiografía) para
el desarrollo de HC, que generalmente aparece en 1-2
semanas tras la operación. Además, los animales sufren una fase de
daño aguda por la imposición de la sobrecarga de presión.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales transgénicos evaluados a las 6
semanas de la cirugía sufrieron una disminución significativa en la
transcripción del gen de SERCA2 (como se determinó mediante la
detección de los niveles de ARNm para SERCA2), y típicamente
comienzan a sufrir fallo cardiaco a las 10-12
semanas. Los niveles de ARNm y de proteína SERCA2 se determinaron
por Northern y Western blot como se describió anteriormente o por
otras técnicas de análisis (p.ej., la PCR, también descrita
anteriormente). Los niveles de actividad enzimática (como los
relacionados con los flujos de calcio del RS) y la función
ventricular izquierda en los animales transgénicos y en los
animales control pueden medirse como se describe más abajo. Los
mismos parámetros para la función cardiaca pueden medirse de
acuerdo con los protocolos descritos más abajo en otros modelos
animales de ICC así como en humanos que reciben tratamiento de
acuerdo con el método de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las imágenes de ecocardiografía se realizan en
un modelo animal adecuado con un transductor de arreglo en fase y
frecuencia dual que funciona a 7 Mhz y un equipo de ultrasonidos
ACCUSON® 128 equipado con un sistema doppler integrado. El tiempo
de las pruebas ecocardiográficas se relaciona con los registros
electrocardiográficos simultáneos que se obtienen de los electrodos
subcutáneos. La profundidad de la imagen se fija en 2 cm y el
ángulo del sector en 60º lo que da una frecuencia de reproducción de
imágenes de 50 imágenes/seg. La fuente de alimentación es de 75
dB. Las imágenes en 2D se pueden usar para seleccionar la posición
adecuada del cursor para el registro en el modo M (que se obtiene a
1000 líneas/seg).
Los animales ligeramente anestesiados se colocan
boca abajo y se toma la imagen a través del espacio intercostal
izquierdo cerca del esternón. Las vistas del eje paraesternal largo
y corto se obtienen y se graban en cinta de vídeo, y como se indicó
anteriormente, las vistas 2D se emplean para guiar la posición del
cursor para los registros en el modo M que se realizan a nivel
ventricular medio. Todas las medidas relevantes se hacen a partir
del registro en modo M guiado por 2D utilizando los criterios
clínicos recomendados por la Sociedad Americana de Ecocardiografía.
El grosor de la pared septal se mide a partir del borde anterior
hasta el borde de salida al final de la diástole.
El endocardio de la pared posterior,
identificado como la línea con la máxima curva sistólica, se mide
desde el borde anterior de la pared posterior hasta el borde
anterior del límite epicardial al final de la diástole. El tamaño
del ventrículo izquierdo al final de la diástole (LVEDD) se mide a
partir del borde de salida del septo intraventricular hasta el
borde anterior de la pared posterior en el punto de máximo diámetro
ventricular. El tamaño del ventrículo izquierdo al final de la
sístole (LVESD) se mide empleando el mismo criterio en el punto de
mínimo diámetro ventricular. El acortamiento fraccional (FS) como
indicador de la función sistólica se calcula como
[(LVEDD-LVESD)/(LVEDD)]º100.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ilustra en ratón, los ratones adultos
(controles y transgénicos, con o sin PO) con peso entre
20-30 g se anestesian con una mezcla de ketamina
(100 mg/kg, IP) y xilacina (5 mg/kg, IP). Bajo el microscopio de
disección se colocan los ratones en posición supina y se realiza una
incisión en la línea media cervical para dejar expuestas la tráquea
y las arterias carótidas.
Se hace pasar por la tráquea una aguja de punta
roma y calibre 20 para que sirva como cánula traqueal que se
conecta a un ventilador de volumen cíclico para roedores (Harvard
Apparatus) con un volumen total de 0.2 ml y una tasa respiratoria
de 100/min. Se determina la ventilación más adecuada a través de una
inspección visual de la expansión del pecho. Tras la intubación, se
canula una arteria carótida con un catéter relleno de un fluido (PE
dilatado para intubar) para medir la presión aórtica. Se abre
entonces el pecho y se coloca un micromanómetro 2F de alta
fidelidad (Millar) a través de la válvula mitral y se asegura dentro
del ventrículo izquierdo (VI).
Los parámetros hemodinámicos de controlan
continuamente mientras que se mide la presión sistólica y diastólica
del VI, la dP/dt máxima y mínima y la presión aórtica (utilizando,
por ejemplo, un equipo de detección en línea). Los datos se
obtienen a una tasa de 1500 muestras/seg y la respuesta de
frecuencia del catéter de alta fidelidad es plana sobre los 10,000
Hz. Estas altas tasas de obtención de muestras se requieren para la
medida precisa de dP/dt en ratón por su rápida frecuencia cardiaca
(que varía entre 300-500/min).
El análisis fuera de línea de los parámetros
hemodinámicos puede incluir la medida de la presión mínima y máxima
del VI y de la presión aórtica, además del cálculo de la constante
de tiempo de la declinación de la presión del VI (tau). La
determinación del valor de tau, el cual refleja especialmente la
fase inicial isovolumétrica de la relajación diastólica, está
estrechamente relacionada con la función de SERCA2.
Como se indica en el protocolo en ratas, se
extirpa el músculo papilar del ventrículo izquierdo, evitando la
dilatación pasiva, en solución oxigenada de Tyrode que contiene 25
mM de BDM para minimizar la lesión por el corte y prevenir la
contractura. Los extremos son unidos mediante puntos cortos de
sutura de seda 5-0 a la pared ventricular y a los
extremos de las válvulas evitando que queden demasiado forzados. Un
extremo del músculo debe unirse a una varilla de cristal de un
transductor de fuerza Isométrico Cambridge 400 (5 g de escala
completa, 100 \mug de resolución) y el otro extremo unirlo al
pequeño gancho de acero inoxidable en una etapa de traslación
(Newport 423 \pm 1 \mum) para controlar la longitud muscular.
Para una visualización conveniente, se colocará 1 ml del lecho a
evaluar en el campo de visión del un microscopio estéreo Olympus
SZ45. Se mantiene la temperatura del lecho a 33ºC.
El músculo estará entonces ajustado a una
longitud no muy tensa a la cual la fuerza restante se registra en
el canal del transductor, se elimina por lavado el BDM y los
electrodos de estimulación bipolar se bajan hasta el lecho
(utilizando, por ejemplo, un equipo estimulador de Gras). Los
músculos se estimulan a 0.2 Hz (20% del umbral superior), y tras 30
minutos, el superfusato se cambiará de 0.5 a 2.0 mM [Ca^{2+}].
Todos los perfusatos se trataran con O_{2} al 100%. El desarrollo
de la tensión isométrica de estado estable se medirá en los
incrementos de la longitud muscular y se expresarán como fracciones
de L_{máx} en las cuales el desarrollo de la tensión es máximo.
Para corregir la corta longitud de las muestras de músculo empleadas
(en la extrapolación de resultados al rendimiento del tejido
muscular in vivo), la tensión de acortamiento en el momento
de máxima tensión se mide usando pares de microesferas
superficiales localizadas en el músculo y grabadas con una cámara
de vídeo.
La posición de los marcadores se detecta y
digitaliza preferentemente utilizando un NIH Image 1.47 en un
Macintosh Centris 650 con un tablero para la captura de imágenes de
vídeo. Corregir la escala de la longitud mediante el uso de tensión
con respecto a cualquier longitud fija de referencia se ha
demostrado que elimina el descenso del miembro de la curva de
tensión-longitud.
La contractilidad se expresa como la pendiente
de la relación isométrica presión/tensión, en la que la presión se
calcula a partir de la tensión desarrollada (reposo total) dividida
por el área del corte transversal del músculo. El área del corte
transversal se estima tras evaluaciones mecánicas mediante la
división del volumen del espécimen (determinado a partir de su
peso) por la longitud de músculo descargado entre los extremos. La
repetición de estos protocolos como una función de la concentración
de Ca^{2+} extracelular entre 0.5 y 2.5 mM permitirá caracterizar
la sensibilidad subyacente al Ca^{2+} de estas preparaciones.
Para caracterizar más profundamente la función
de SERCA2 y el acoplamiento EC en estos experimentos, se estudia la
función del bombeo mediante la medida del tiempo de relajación
cuando el intercambio de Na/Ca se bloquea con solución Tyrode libre
de Na y cuando la acumulación de calcio del retículo sarcoplásmico
se bloquea con 10mM de cafeína. Cuando el intercambio de Na/Ca se
cronometra, el tiempo de relajación se hace más lento en un 30%.
Las propiedades de relajación de los músculos evaluados se
determinarán en función de la longitud del músculo y del calcio a
partir del rastreo de la tensión isométrica registrada en el gráfico
de registro (p. ej., registrador Gould 2200) y el sistema de
adquisición de datos microcomputerizado (disponible comercialmente
en, por ejemplo, Strawberry Tree) a alta velocidad (40 mm/seg). Los
parámetros medidos incluirán el tiempo hasta el momento máximo de
tensión hasta el 90% de recuperación y la constante exponencial de
tiempo del decrecimiento de la fuerza isométrica. Estas mediciones
estarán también sujetas, y son corregibles, al artefacto descrito
más arriba, ya que los estudios han demostrado que la relajación
isométrica se prolonga significativamente cuando la longitud del
músculo se controla para mantener la longitud del sarcómero en la
constante del músculo central intacto.
Utilizando el mismo enfoque descrito
anteriormente, los estudios de contractilidad pueden llevarse a cabo
también empleando trabéculas, largas, finas y uniformes, asiladas
bajo un microscopio de disección del ventrículo izquierdo de ratas.
Los estudios que han usado trabéculas proporcionarán más información
sobre las alteraciones absolutas en el mecanismo de contracción
diastólica independiente de artefacto debido a las series de
elastancia del músculo no disponibles a partir de preparaciones
convencionales de músculo papilar. Otras zonas de la pared del
ventrículo izquierdo pueden usarse para aislar miocitos cardiacos
para los estudios de detección del umbral y del flujo de Ca^{2+}
intracelular.
\vskip1.000000\baselineskip
Los miocitos cardiacos pueden prepararse a
partir de corazones de ratas adultas utilizando un método de
perfusión de colagenasa. Los miocitos pueden mantenerse en ausencia
o en presencia de suero fetal de ternero al 4% durante al menos 4
días y mantener las características morfológicas y metabólicas de
los miocitos cardiacos adultos. A partir del corazón de una rata
adulta, se pueden obtener 9-10x10^{6} miocitos
viables.
Los miocitos cardiacos también pueden prepararse
a partir de fragmentos de pared ventricular. Esto permitirá
determinar la función miocítica, la función del músculo papilar y
los parámetros relacionados con la expresión del gen de SERCA2 y la
función de SERCA2, obtenido todo del mismo corazón. Con este fin, el
tejido ventricular se tritura y se lava en un medio mínimo esencial
(MEM) de Joklik modificado y libre de Ca^{2+} complementado con
25 mM de NaHCO_{3}; 3.4 mM de MgCl_{2}; 30 mM de taurina, y 2 mM
de carnitina. El tejido se digiere entonces con un MEM que contiene
0.1% de colagenasa tipo II (Wortington); 0.1% de la fracción V de la
BSA, y 25 \muM de CaCl_{2}. La digestión enzimática se continúa
durante 30-40 minutos mientras se agita suavemente
el tejido a 32ºC bajo oxigenación continua. La completa dispersión
de las células se logra finalmente mediante una trituración suave
con una pipeta serológica de calibre ancho.
Se filtran entonces las células con una malla de
nylon de 300 \muM y se lavan. Los niveles de calcio se
incrementan entonces de forma gradual hasta una concentración de
campo de 1 \muM. Este procedimiento puede producir hasta
2x10^{6} células/corazón de las cuales el 60-70%
son miocitos viables con forma de varilla que pueden emplearse en
los estudios descritos más abajo.
Los miocitos cardiacos aislados de ratas adultas
(no recubiertos) se suspenden en 10 ml de una solución que contiene
118 mM NaCl; 4.8 mM KCl; 1.2 mM de NaH_{2}PO_{4}; 1.2 mM de
SO_{4}; 1 mN de CaCl_{2}; 11 mM de glucosa y 25 mM de ácido
Na-N-2-hidroxietilpiperacina-N-2-etanosulfónico;
500 \mul de la suspensión celular se añaden a 1.5 ml de solución
de Tyrode normal y se añaden 5 \mul de una solución 1 mM de
acetometoximetil éster derivado de Indo I en DMSO. Las células se
incuban a temperatura ambiente durante 15-20
minutos. Se seleccionan entonces las células para su estudio
basándose en la uniformidad de la carga de Indo I y en la
morfología celular con células con forma de varilla y buenas
estriaciones. Se transfieren las células a una cámara pequeña de
perfusión montada sobre la base de un microscopio Nikon Diaphot
equipado con lentes de cuarzo. Se deja que las células se depositen
en la base de la cámara de perfusión y se perfunde de forma continua
a 5 ml/min con solución Tyrode a la que se le aplica una
composición gaseosa de O_{2} al 90% y CO_{2} al 5% y se
mantiene a 37ºC. Se lleva a las células a 0.2, 0.33, 1.0, 2.0 y 5.0
Hz con un electrodo externo de platino y se miden los flujos de
calcio fluorométricamente. Se pueden llevar a cabo también estudios
similares usando miocitos de ratas neonatales o de ratón. La
infección de los miocitos neonatales con Adv SERCA2 reduce
considerablemente el flujo de calcio.
Con respecto a los niveles de los flujos de
calcio, el tiempo para tener una reducción máxima en los flujos de
calcio ^{2+} se acortó significativamente en los miocitos
transgénicos positivos para SERCA2 hasta un grado similar al
observado in vitro (Ejemplo 5; Figura 8: p<0.05). Con
respecto a las presiones ventriculares, la máxima presión
conseguida en el ventrículo izquierdo (LVdP/dt máx) se incrementó
significativamente en los animales transgénicos, mientras que a
niveles mínimos, los músculos ventriculares mostraron una tendencia
hacia una relajación diastólica más rápida en los animales
transgénicos (n=3; si se compara con los controles donde n=5). Los
niveles de ARNm y de proteína SERCA2 detectados en los animales se
describen en el Ejemplo 1 y se muestran en las Figuras 5 y 6. Estos
datos prueban el principio de que el transporte de calcio y la
relajación diastólica del músculo cardiaco se ven afectados de forma
beneficiosa por la aplicación del método de la invención en un
modelo animal predictivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción se formó mediante la clonación
del polinucleótido de SERCA2 dentro de un vector lanzadera que
contiene un promotor, un polylinker y unas secuencias
adenovirales parciales flanqueantes de las que las regiones
codificantes para E1a y E1b han sido eliminadas, el plásmido
resultante se cotransfecta entonces (mediante técnicas
convencionales de precipitación de calcio/fosfato) dentro de células
293 con el plásmido JM17, un plásmido que contiene el genoma del
adenovirus tipo 5 humano completo con un inserto adicional de 4.3
kb (el producto de la construcción es demasiado grande para ser
encapsulado; ver, Figura 2 [mapa del vector]). La recombinación
homóloga de rescate da lugar a vectores de adenovirus que codifican
para SERCA2 pero propagados en células 293 que han sido
transformadas con las proteínas de fase temprana E1a y E1b.
Más específicamente, se construyó un vector de
adenovirus defectivo para la replicación como se describe en
Graham, EMBO J., 3:2917-2922, 1984. El vector
tiene un límite de inserción de unas 5 kb. El transgen se clona
dentro de un lugar XbaI de un plásmido lanzadera pAC1, que contiene
secuencias 5' de adenovirus flanqueando un lugar XbaI. En este
caso, el transgen incluye enhancers de SV40, un minigen que
codifica para SERCA2 y o bien un promotor TK o bien un promotor
CMV, siendo preferido este último. Cada enhancer de SV40
contiene 70 pb. Un promotor de CMV útil que contiene una fuente de
plásmidos es pACCMVpLPA, donde 670 pb del promotor de CMV incluyen
secuencias más allá del inicio de la transcripción seguidas de un
lugar de clonación múltiple que facilita considerablemente el
proceso de clonación (ver, para un descripción del plásmido
pACCMVpLPA, McPhaul, et al., J.Biol.Chem.,
268:26063-26066, 1993). En cada caso, el inicio de
la transcripción estará en el promotor, cuyo tamaño total variará
en función del promotor usado.
El promotor se une mediante la unión de extremos
romos al clon de ADNc de SERCA2 de rata. El clon de SERCA2 contiene
la secuencia codificante completa incluyendo las señales de
terminación y de poliadenilación. El primer exón transcrito y no
traducido del gen de SERCA2 se acortó por las primeras 232 pb. El
extremo 5' del ARNm de SERCA2 que se corresponde con el primer exón
contiene, por lo tanto, 268 pb 5'desde el inicio de traducción en
lugar del primer exón de longitud completa. Un fragmento
correspondiente con el exón de longitud completa contendría 500 pb
5' desde el punto de inicio de la traducción. El transgen de SERCA2
que se usa es, por lo tanto, 181 pb más corto que el ARNm de SERCA2
transcrito a partir de clon genómico.
Las células transfectadas se controlan por la
evidencia de efectos citopáticos durante 10-14 días
tras la transfección. Para identificar a los recombinantes
exitosos, el sobrenadante de las placas que muestran un efecto
citopático se trata con proteinasa k (50 mg/ml con dodecil sulfato
de sodio al 0.5% y 20 mM de EDTA) a 56ºC durante 60 min., después
de extraen con fenol/cloroformo y se precipitan con etanol. Los
recombinantes exitosos se identifican con una PCR que usa cebadores
complementarios al promotor del CMV y a las secuencias de
poliadenilación del SV40 o al promotor TH para amplificar el
inserto. Los cebadores se diseñan también para amplificar
concomitantemente las secuencias adenovirales. La presencia del ARNm
de SERCA2 en los transfectantes se confirma por análisis Northern
como se muestra en la Figura 7; "HH-1",
"HH-2" y "SA1-SA3" son las
construcciones de CMV/SV40, mientras que "TK" es la
construcción del promotor TK y "ctrl" indica una construcción
control sin el polinucleótido de SERCA2.
Los recombinantes exitosos se someten entonces a
dos rondas de purificación en placa. Las reservas virales se
propagaron en células 293 hasta títulos que varían entre 10^{10} y
10^{12} partículas virales, después se purificaron mediante
centrifugación en doble gradiente de CsCl de forma previa a su uso.
Las células se infectaron con una confluencia del 80% y se
recogieron a las 36-48 horas. Tras varios ciclos de
congelación-descongelación, los restos celulares se
separaron mediante centrifugación estándar y el virus se purificó
aún más mediante ultracentrifugación en doble gradiente de CsCl
(gradiente discontinuo de CsCl 1.33/1.45; cesio preparado en Tris 5
mM, EDTA 1 mM (pH 7.8) a 90,000x g durante 2 hrs., después a
105,000x g durante 18 hrs.).
Previamente a su uso in vivo, las
reservas virales se desalinizaron mediante filtración en gel a
través de columnas de SEPHAROSA® (es decir, G25 SEPHADEX®). Las
reservas virales resultantes tenían un título viral final en el
rango de 10^{10} a 10^{12} partículas virales. La construcción
adenoviral fue altamente purificada; esto es, con ninguna
contaminación detectable de partículas replicativas (cepa
salvaje).
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron los flujos intracelulares de calcio
en miocitos cardiacos aislados como se describió en el Ejemplo 3 y
se transfectaron con construcciones de vectores de adenovirus hechos
como se describe en el Ejemplo 4. En resumen, los miocitos
cardiacos neonatales se transfectan con el vector adenoviral de
SERCA2 y se midieron los flujos de calcio de la forma descrita en
el Ejemplo 3 y se compararon con células control (sin transfectar).
En la Figura 8, la célula #42 es representativa del comportamiento
medio de los miocitos cardiacos neonatales transfectados (ADV).
Como se muestra en la Figura 8, el tiempo hasta la reducción máxima
en los flujos de calcio se acortó en un 33\pm19% (n=4;
p\leq0.01) en las células transfectadas en comparación con las
células control. Estos datos proporcionan la prueba de que los
flujos de calcio mejoran en miocitos transfectados con SERCA2 ADV,
un resultado que, si se midiera in vivo, promovería la
relajación diastólica de forma más rápida en el músculo cardiaco
(ver, Ejemplo 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se modificó el vector SERCA2/ADV descrito en el
Ejemplo 4 para incluir un gen que codifica operativamente para la
\beta-galactosidasa como molécula marcadora. Un
cerdo sin anestesiar, ventilado, de 40 kg, se sometió a una
toracotomía y aislamiento de las arterias coronarias descendente
anterior izquierda y circunfleja izquierda. Se insertó una aguja
mariposa de calibre 26 dentro de la mitad izquierda anterior
descendente (LAD) de la arteria coronaria y el vector (1.5 x
10^{5} partículas virales) se inyectó en un volumen de 2 ml. Se
cerró entonces la caja torácica y se permitió al animal que se
recuperara del procedimiento.
Cuatro días después de la operación, el animal
fue sacrificado por medios humanos. Se sacó el corazón y se fijó
con glutaraldehído perfundido, se seccionó y se incubó con
X-gal durante 16,5 horas. Después de ser embebido y
seccionado, el tejido se tiñó con eosina.
El análisis microscópico de las secciones de
tejido (sección transmural de un lecho de LAD 72 horas después de
la inyección intracoronaria del vector) confirmó que el
50-60% de las células fueron marcadas positivamente
por la presencia de la molécula marcadora
\beta-gal. El control negativo proveniente de
áreas de miocardio lejanas del lugar de la inyección, donde el
marcaje con \beta-gal no se observó. En este
estudio, así como en repeticiones sucesivas del mismo mostrando la
expresión génica tras 14 días (n=5), no se observó ninguna
evidencia de inflamación o necrosis en los lugares de
transfección.
Se han descrito diferentes realizaciones de la
presente invención. Sin embargo, se comprenderá que varias
modificaciones pueden ser introducidas sin salirse del origen y
campo de la invención. De acuerdo a esto, se entiende que la
invención no está limitada por las realizaciones específicas que
ilustran la invención, sino sólo por el ámbito de protección
ofrecido por las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citadas por el
solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma
parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran
cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u
omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
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Claims (7)
1. Uso de un polinucleótido que codifica
operativamente para SERCA2 o un vector de expresión recombinante que
contiene un polinucleótido que codifica operativamente para SERCA2,
para la preparación de una composición farmacéutica adecuada para
el transporte in vivo de los mismos a los miocitos cardiacos
de un hospedador, en el tratamiento de la insuficiencia congestiva
cardiaca, proporcionando una cantidad terapéuticamente beneficiosa
de SERCA2 la cual se expresa de forma suficiente como para restaurar
substancialmente la actividad normal de SERCA2 en los miocitos
tratados.
2. Uso según la reivindicación 1 donde el vector
de expresión recombinante es un virus de ADN.
3. Uso según la reivindicación 2 donde el virus
de ADN es un adenovirus.
4. Uso según la reivindicación 3 donde el
adenovirus es no replicativo.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4 donde el vector de expresión recombinante o el polinucleótido
está contenido en un sistema de dispersión coloidal.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5 donde el hospedador es humano.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6 donde el vector de expresión recombinante está diseñado para
el transporte al interior del músculo cardiaco del hospedador.
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