ES2316382T3 - Secuencias gst del frijol de soja y su uso en la produccion de plantas resistentes a los herbicidas. - Google Patents
Secuencias gst del frijol de soja y su uso en la produccion de plantas resistentes a los herbicidas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2316382T3 ES2316382T3 ES00960838T ES00960838T ES2316382T3 ES 2316382 T3 ES2316382 T3 ES 2316382T3 ES 00960838 T ES00960838 T ES 00960838T ES 00960838 T ES00960838 T ES 00960838T ES 2316382 T3 ES2316382 T3 ES 2316382T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- plants
- seq
- gst
- variant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims description 102
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 11
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims abstract description 40
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N fomesafen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)NS(=O)(=O)C)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- NUFNQYOELLVIPL-UHFFFAOYSA-N acifluorfen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 NUFNQYOELLVIPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 37
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 37
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 9
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 claims description 4
- 108010068906 gamma-glutamylcysteine Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 2
- 231100000208 phytotoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 claims 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 claims 1
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 claims 1
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N phenylbenzene Natural products C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- RITKHVBHSGLULN-CRCLSJGQSA-N γ-glutamylcysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](CS)C(O)=O RITKHVBHSGLULN-CRCLSJGQSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 41
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 34
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 30
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 20
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 19
- 108010068584 homoglutathione synthase Proteins 0.000 description 19
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- HKBNQXMLSMKLJV-BQBZGAKWSA-N L-gamma-glutamyl-L-cysteinyl-beta-alanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCCC(O)=O HKBNQXMLSMKLJV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- HKBNQXMLSMKLJV-UHFFFAOYSA-N gamma-L-glutamyl-L-cysteinyl-beta-alanine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(CS)C(=O)NCCC(O)=O HKBNQXMLSMKLJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 9
- 108700020537 homoglutathione Proteins 0.000 description 9
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VONWPEXRCLHKRJ-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-phenylacetamide Chemical compound ClCC(=O)NC1=CC=CC=C1 VONWPEXRCLHKRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTNQPKFIQCLBDU-UHFFFAOYSA-N Acetochlor Chemical compound CCOCN(C(=O)CCl)C1=C(C)C=CC=C1CC VTNQPKFIQCLBDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- -1 Ethyl Chlorimuron Chemical compound 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- RITKHVBHSGLULN-WHFBIAKZSA-N L-gamma-glutamyl-L-cysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O RITKHVBHSGLULN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- WVQBLGZPHOPPFO-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-N-(2-ethyl-6-methylphenyl)-N-(1-methoxypropan-2-yl)acetamide Chemical compound CCC1=CC=CC(C)=C1N(C(C)COC)C(=O)CCl WVQBLGZPHOPPFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241001136782 Alca Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 101000622007 Crotalus adamanteus Snake venom metalloproteinase adamalysin-2 Proteins 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N Dinitrochlorobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C([N+]([O-])=O)=C1 VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100434659 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) alcR gene Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHMCAJWVGYGUEF-UHFFFAOYSA-N Fluorodifen Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O HHMCAJWVGYGUEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-UHFFFAOYSA-N L-Glutathione (reduced) Chemical compound OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000219828 Medicago truncatula Species 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710091688 Patatin Proteins 0.000 description 1
- 241001442654 Percnon planissimum Species 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 240000005809 Prunus persica Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- HXJDWCWJDCOHDG-RYUDHWBXSA-N S-hexylglutathione Chemical compound CCCCCCSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O HXJDWCWJDCOHDG-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000862632 Soja Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- GNVMUORYQLCPJZ-UHFFFAOYSA-M Thiocarbamate Chemical compound NC([S-])=O GNVMUORYQLCPJZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000500606 Xenorhabdus sp. Species 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 108700017835 hexylglutathione Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010003007 mannose isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001069 nematicidal effect Effects 0.000 description 1
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Una Glutatión-S-transferasa (GST) que comprende la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 10 o una variante de GST que tiene al menos 80% de identidad con la misma cuando se calcula sobre la longitud completa de la SEQ ID NO. 10 con la condición de que dicha variante de GST no comprenda la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 36, y en la cual la GST o variante de GST sea capaz de conferir resistencia y/o tolerancia a un herbicida el cual comprende fomesafen y/o acifluorfen.
Description
Secuencias GST del fríjol de soja y su uso en la
producción de plantas resistentes a los herbicidas.
La presente invención se relaciona entre otras,
con secuencias de
Glutatión-S-transferasa (GST) y su
uso en métodos para la producción de plantas resistentes a los
herbicidas. En particular los polinucleótidos según la invención
pueden ser usados en métodos para la producción de plantas que son
resistentes a los herbicidas que comprenden fomesafen y/o
acifluorfen.
Las plantas que son sustancialmente
"tolerantes" a un herbicida cuando son sometidas a éstos
proporcionan una curva de dosis/respuesta que se desplaza a la
derecha cuando se compara con aquella proporcionada por plantas
parecidas no tolerantes similarmente sometidas. Tales curvas
dosis/respuesta tienen puesto en el eje x del gráfico "dosis"
y en el eje y "porcentaje de muerte", "efecto herbicida"
etc. Las plantas tolerantes típicamente requerirán por lo menos dos
veces más herbicida que las plantas parecidas no tolerantes para
producir un determinado efecto herbicida. Las plantas que son
sustancialmente "resistentes" al herbicida presentan pocas, o
ningunas, lesiones necróticas, líticas, cloróticas u otras cuando
son sometidas al herbicida a concentraciones e índices que son
empleados típicamente por la comunidad agroquímica para matar malas
hierbas en el campo. De aquí en lo adelante cuando sean usadas
individualmente las palabras (i) "tolerante" y (ii)
"resistente" significan "tolerante y/o
resistente".
Las plantas resistentes a los herbicidas ya
están disponibles en el arte por ejemplo, la ROUNDUP READY^{TM}
Soja que es resistente a los herbicidas que tienen como sitio de
acción la enzima
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa, tal como aquellos agroquímicos que contienen glifosato.
Una de las ventajas de estas plantas es que el granjero puede
aplicar los herbicidas a los campos que contienen los cultivos de
plantas y malas hierbas usando "aplicación over the top", para
matar las malas hierbas.
Otros ejemplos de productos para uso en métodos
para la producción de plantas resistentes a los herbicidas son
proporcionados en la Solicitud Internacional de Patente Número de
Publicación WO 93/01294 y WO 99/14337. Aquí la resistencia se logra
insertando en la planta un polinucleótido que proporciona la
producción de una enzima
glutatión-S-transferasa (GST) que
está involucrada en la detoxificación del herbicida. En este
contexto McGonigle y otros. (1998 Pesticide Biochemistry and
Physiology. 62 pp15-25) describe plantas
transgénicas que comprenden genes que codifican para GST de soja
que son tolerantes a los herbicidas de cloroacetanilida y
tiocarbamato. Se ha demostrado que las enzimas
Glutatión-S-transferasas existen en
varios organismos tales como bacterias, hongos, levaduras, plantas,
mamíferos y peces y pueden existir como homo o heterodímeros con
subunidades típicamente entre 24 y 30 kDa. Un ejemplo de una enzima
Glutatión-S-transferasa conocida es
el clon de ADNc Glicina max con el número de acceso EMBL
A1440996. Sin embargo, para esta enzima no se conoce ningún dato en
lo que se refiere a su actividad así como el herbicida sobre el cual
actúa. Se ha demostrado que la detoxificación del herbicida se
logra por la conjugación del herbicida con el glutatión (GSH) de
tiol libre, un tripéptido
(gamma-glutamil-cisteinil-glicina)
dentro de la planta (Cole D.J. 1994 Pesticide Science. 42
pp209-222). Tal conjugación es catalizada por la
GST. También se ha demostrado que la detoxificación de los
herbicidas ocurre siguiendo la conjugación del herbicida con
homoglutatión, el cual es el tiol predominante en algunas especies
de leguminosas. El homoglutatión (hGSH) es también un tripéptido
(gamma-glutamil-cisteinil-Beta-alanina)
pero difiere de la GSH en la adición de
Beta-alanina en vez de una glicina a la parte
gamma-glutamil-cisteinil. La
síntesis del homoglutatión (hGSH) es catalizada por la actividad de
la enzima homoglutatión sintasa (hGSHS). La secuencia parcial de un
hGSHS de Medicago truncatula ha sido publicada (Frendo y
otros. 1999 Plant Journal. 17 pp215-219).
De este modo, la presente invención busca
proporcionar entre otros, nuevos polinucleótidos que codifiquen
para proteínas que puedan ser usadas en métodos para proporcionar
plantas con altos niveles de resistencia a los herbicidas que
comprenden fomesafen y/o acifluorfen.
Según la presente invención aquí se proporciona
una Glutatión-S-transferasa (GST)
que comprende la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID No.
10 o una variante de GST que tenga al menos 80% de identidad con la
condición de que dicha variante de GST no comprenda la secuencia de
aminoácidos descrita como SEQ ID No. 36. (la cual corresponde a la
secuencia del clon SE3.03B09 listada como SEQ ID No. 8 en la
Solicitud Internacional de Patente Número de Publicación WO
00/18936). En una nueva realización de la presente invención dicha
variante de GST tiene al menos 85% de identidad con la secuencia
descrita como SEQ ID No. 10. En aún una realización adicional de la
presente invención dicha variante de GST tiene al menos 90% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 10. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de GST
tiene al menos 91% de identidad con la secuencia descrita como SEQ
ID No. 10. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de GST tiene al menos 92% de identidad con
la secuencia descrita como SEQ ID No. 10. En aún una realización
adicional de la presente invención dicha variante de GST tiene al
menos 93% de identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No.
10. En aún una realización adicional de la presente invención dicha
variante de GST tiene al menos 94% de identidad con la secuencia
descrita como SEQ ID No. 10. En aún una realización adicional de la
presente invención dicha variante de GST tiene al menos 95% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 10. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de
GST tiene al menos 96% de identidad con la secuencia descrita como
SEQ ID No. 10. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de GST tiene al menos 97% de identidad con
la secuencia descrita como SEQ ID No. 10. En aún una realización
adicional de la presente invención dicha variante de GST tiene al
menos 98% de identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 10.
En aún una realización adicional de la presente invención dicha
variante de GST tiene al menos 99% de identidad con la secuencia
descrita como SEQ ID No. 10.
El porcentaje de identidad de secuencia para
proteínas se determina comparando dos secuencias óptimamente
alineadas sobre una ventana de comparación, en la cual la porción de
secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede
comprender adiciones o deleciones (por ejemplo brechas) en
comparación con la secuencia inicial de referencia (que no
comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las
dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de
posiciones en las que se encuentra el residuo de aminoácido
idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones
coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre
el número total de posiciones en la ventana de comparación y
multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de
identidad de secuencia. Cuando se calcula el porcentaje de identidad
de secuencia las secuencias pueden alinearse permitiendo hasta 3
brechas con la condición de que en lo que respecta a las brechas,
un total de no más de 15 residuos de aminoácidos sean afectados. La
alineación óptima de secuencias para la comparación también puede
conducirse por implementaciones computarizadas de algoritmos
conocidos. En una realización particular de la presente invención
la identidad de la secuencia se calcula usando el algoritmo FASTA
versión 3 que usa el método de Pearson y Lipman (Lipman, D.J. y
Pearson, W.R. (1985) Rapid and Sensitive Protein Similarity
Searches and Science. 227:1435-1441 y Pearson, W.R.
y Lipman, D.J. (1988) Improved tools for biological sequence
comparison. PNAS, 852444-2448) para buscar las
similitudes entre la secuencia de referencia (también llamada la
secuencia consultada) y cualquier grupo de secuencias (llamadas
secuencias extensas). Los métodos que existen también en el arte
que permiten calcular el porcentaje de identidad de secuencia entre
las secuencias de polinucleótidos.
La proteína de puede diferir de la secuencia
básica de la proteína GST (SEQ ID No. 10) por sustituciones
conservativas o no-conservativas de aminoácidos.
Una sustitución conservativa será entendida que significa que el
aminoácido se reemplaza con un aminoácido con propiedades químicas
ampliamente similares. En particular pueden hacerse sustituciones
conservativas entre los aminoácidos dentro de los siguientes
grupos:
(i) Alanina y Glicina;
(ii) Serina y Treonina;
(ii) Ácido Glutámico y Ácido Aspártico;
(iii) Arginina y Lisina;
(iv) Asparagina y Glutamina;
(v) Isoleucina y Leucina,
(vi) Valina y Metionina;
(vii) Fenilalanina y Triptófano.
En general, más sustituciones conservativas que
no-conservativas serán posibles sin destruir las
propiedades GST de las proteínas. Las variantes adecuadas de las
proteínas de acuerdo con la presente invención pueden ser
determinadas probando las propiedades de GST de la proteína usando
métodos de rutina los cuales son bien conocidos por la persona
experimentada en el arte. Tales variantes de proteínas también
pueden sintetizarse químicamente usando técnicas estándares.
La presente invención además proporciona una GST
o una variante como se describe anteriormente en la cuál dicha GST
o la variante es capaz de conferir resistencia y/o tolerancia a un
herbicida que comprende fomesafen y/o acifluorfen. El herbicida
también puede comprender otros Difenil éteres o Sulfonilureas como
el Clorimuron Etilo y/o Cloroacetanilidas como el acetoclor.
La invención presente todavía llega más allá
proporcionando un polinucleótido que comprende una región que
codifica para una GST o una variante de GST como se describió
anteriormente. En una realización particular de la presente
invención dicho polinucleótido comprende la secuencia descrita como
SEQ ID No. 14.
En un aspecto adicional de la presente invención
se proporciona una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos descrita como SEQ ID No. 1, o una variante de la
proteína que tiene al menos 80% de identidad con la cuál dicha
proteína o variante es capaz de catalizar la adición de
Beta-alanina sobre gamma glutamilcisteína. En una
nueva realización de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene al menos 75% de identidad con la secuencia descrita
como SEQ ID No. 1. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de la proteína tiene al menos 85% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 1. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene al menos 90% de identidad con la secuencia descrita
como SEQ ID No. 1. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de la proteína tiene al menos 95% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 1. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene al menos 96% de identidad con la secuencia descrita
como SEQ ID No. 1. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de la proteína tiene al menos 97% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 1. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene al menos 98% de identidad con la secuencia descrita
como SEQ ID No. 1. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de la proteína tiene al menos 99% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 1. La identidad
de secuencia puede calcularse y las variantes de proteína
creadas/identificadas de una manera análoga a la descrita
anteriormente.
La presente invención aún proporciona
adicionalmente una variante de la proteína como se describió en el
párrafo precedente que tiene una Km para
Beta-alanina la cual es menor que dichas variantes
de Km para glicina cuando se calcula usando el mismo método. En una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene una Km para Beta-alanina que es menor
o igual a alrededor de 1 mM y una Km para glicina que es mayor que
1 mM cuando se calcula usando el mismo método. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene una Km para Beta-alanina la cual es
menor o igual a alrededor de 0.8 mM y una Km para glicina que es
mayor que 0.8 mM cuando se calcula usando el mismo método. La Km o
la "Constante de Michaelis-Menten" es un
parámetro cinético que indica la concentración del sustrato a la que
la velocidad inicial de la reacción (Vo) es la mitad de la máxima.
Los métodos para el cálculo de la Km son bien conocidos por las
personas experimentadas en el arte.
La presente invención proporciona además una
variante de proteína como se describió anteriormente que comprende
una secuencia que contiene al menos la secuencia de una de las
regiones de aminoácidos descritas en el grupo descrito como SEQ ID
No. 2 (KKIQQELAKP); SEQ ID No. 3 (CFAGLWSL); SEQ ID No. 4
(VMKPQREGGGNNIYG) y SEQ ID No. 5 (AAYILMQRIFP). En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína comprende una secuencia la cual contiene al menos la
secuencia de dos regiones de aminoácidos seleccionados del grupo
descrito como SEQ ID No. 2, 3, 4 ó 5. En aún una realización
adicional de la presente invención dicha variante de la proteína
comprende una secuencia que contiene las secuencias de todas las
regiones de aminoácidos descritas como SEQ ID No. 2, 3, 4 ó 5.
La presente invención aún proporciona
adicionalmente un polinucleótido que comprende una región que
codifica para la proteína o variante de la proteína como se
describió anteriormente. En una realización adicional de la
presente invención dicho polinucleótido comprende la secuencia
descrita como SEQ ID No. 6.
La presente aún proporciona adicionalmente un
polinucleótido que comprende una primera región que comprende un
polinucleótido que codifica para una GST o variante de GST según la
presente invención y una segunda región que comprende un
polinucleótido que codifica para una proteína o variante de la
proteína de acuerdo a la presente invención. En una realización
adicional de la presente invención dicha primera región comprende un
polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos
descrita como SEQ ID No. 10 y dicha segunda región comprende un
polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos
descrita como SEQ ID No. 1. Las regiones pueden estar separadas por
una región que proporciona un polipéptido para el autoprocesamiento
que es capaz de separar tal como el polipéptido de
autoprocesamiento descrito en US 5,846,767 o cualquier elemento que
funcione similarmente. Como alternativa las regiones pueden
separarse por una secuencia la cual actúa como un sitio diana para
un elemento externo que es capaz de separar las secuencias de
proteína. Como alternativa el polinucleótido puede proporcionar un
poliproteína que comprende una pluralidad de funciones de proteína
tales como una GST y una homoglutatión sintetasa según la
invención. En una nueva realización de la presente invención las
proteínas de la poliproteína pueden colocarse en tándem. En aún una
realización adicional de la presente invención la poliproteína
comprende una pluralidad de funciones de proteína que están
separadas por secuencias enlazadoras.
La presente invención proporciona aún
adicionalmente una construcción de ADN que comprende la secuencia de
un promotor operable de planta operablemente enlazado a un
polinucleótido operablemente enlazados a una región de terminación
de la transcripción según la presente invención. En una realización
adicional de la presente invención la construcción de ADN además
comprende una región o una pluralidad de regiones que proporcionan
el blanco del producto o de los productos de la proteína para una
localización o localizaciones particulares. La construcción de ADN
puede además comprender una región que proporciona para la
producción de una proteína que actúa como un marcador de selección.
El marcador de selección puede, en particular, conferir resistencia
a la kanamicina; higromicina o gentamicina. Los marcadores de
selección más apropiados incluyen genes que confieren resistencia a
otros herbicidas como los herbicidas basados en glifosfato o
resistencia a toxinas como la eutipina. Otras formas de selección
también se encuentran disponibles como los sistemas de selección
basados en hormona como el sistema de Multi Auto Transformación
(MAT) de Hiroyrasu Ebinuma y otros. 1997. PNAS Vol. 94
pp2117-2121; sistemas de selección visual que usan
la conocida proteína de fluorescencia verde, la \beta
glucoronidasa y cualquier otro sistema de selección tal como el de
manosa isomerasa, el de xilosa isomerasa y el de
2-deoxiglucosa (2-DOG). El promotor
operable de planta de la construcción de ADN puede seleccionarse
del grupo que consiste en Agrobacterium rhizogenes
RolD; RolD/Fd; el inhibidor de proteasa de papa II; CaMV35S;
CamV35S doble potenciado; FMV35S; NOS; OCS; Patatin; E9; el
interruptor alcA/alcR.; el interruptor GST; el interruptor RMS; el
oleosin; el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa
bisfosfato carboxilasa-oxigenasa. Los terminadores
que pueden usarse en las construcciones de acuerdo a la presente
invención incluyen Nos, inhibidor de proteinasa II y el terminador
del gen de la alfa-tubulina (EP-A
652,286). Es igualmente posible usar, en asociación con la
secuencia de regulación del promotor, otras secuencias de regulación
las cuales se sitúan entre el promotor y la secuencia que codifica
para la proteína según la presente invención, tales como
potenciadores transcripcionales o traduccionales, por ejemplo, el
activador de traducción del virus del grabado del tabaco (TEV)
descrito en la Solicitud Internacional de Patente, PCT número de
publicación W0 87/07644 o la secuencia líder de la Glucanasa II. El
polinucleótido que codifica para la proteína según la invención
también puede ser codón-optimizado, o alterado por
otra parte para potenciar por ejemplo, la transcripción una vez que
es incorporado en el material de la planta. Tal optimización de
codón también puede usarse para alterar la estructura secundaria
predicha del transcripto de ARN producido en cualquier célula
transformada, o para destruir la inestabilidad de los elementos
crípticos de ARN presentes en el transcripto inalterado, de este
modo aumentando la estabilidad y/o disponibilidad del transcripto en
la célula transformada (Abler and Green. 1996. Plant Molecular
Biology (32) pp63-78).
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente un método para proporcionar plantas que son
resistentes y/o tolerantes a un herbicida difenil éter que
comprende: (a) insertar en el material del genoma de la planta un
polinucleótido o secuencia de polinucleótido que proporciona una GST
o variante de GST como se describió anteriormente o una
construcción de ADN como se describió anteriormente; y (b) regenerar
plantas o partes de plantas de allí; y (c) aplicar a dichas plantas
o partes de plantas una cantidad de dicho herbicida difenil éter
que es fitotóxico a las plantas tipo control y seleccionar estas
plantas o partes de plantas que son resistentes a dicho herbicida
difenil éter. En una nueva realización de la presente invención el
polinucleótido insertado en el material de la planta de acuerdo con
el método de la oración precedente codifica para una secuencia de
aminoácidos descrita como SEQ ID No. 10.
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente métodos como los descritos en el párrafo precedente
en los cuáles dicho herbicida difenil éter comprende fomesafen y/o
acifluorfen. La construcción polinucleótido/ADN puede ser
incorporada en el material del genoma de la planta de acuerdo con la
presente invención por técnicas de transformación de plantas las
cuáles son bien conocidas por las personas experimentadas en el
arte. Tales técnicas incluyen pero no se limitan a la
transformación por partículas mediada por biolística. La
transformación mediada por Agrobacterium, transformación de
protoplastos (opcionalmente en presencia de polietilenglicoles);
sonicación de tejidos de plantas, células o protoplastos en un medio
que comprende el polinucleótido o vector; microinserción del
polinucleótido o vector en el material totipotente de la planta
(opcionalmente empleando la conocida técnica de "pelos" de
carburo de silicio), electroporación y similares. Las técnicas que
son específicamente optimizadas para un cultivo particular pueden
ser empleadas para los propósitos de transformar un cultivo
particular de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, cuando
se transforma la soja puede ser preferible usar un método basado en
uno descrito por Christou y otros (1990). Dan y otros
(1999). Williams y otros (2000) y Hinchee y otros
(1999). El método de transformación per se no es pertinente a
la presente invención y la persona experta puede emplear cualquier
método funcional apropiado para el cultivo diana.
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente plantas o partes de plantas resistentes a los
herbicidas obtenidas de acuerdo a los métodos descritos
anteriormente. Tales plantas o partes de planta pueden seleccionarse
del grupo que consiste de: melones; mangos; soja; algodón; tabaco;
remolacha azucarera; colza oleaginosa; canola; lino; girasol; papa;
tomate; alfalfa; lechuga; maíz; trigo; sorgo; centeno; bananos;
cebada; avena; césped de hierba; césped de forraje; caña de azúcar;
guisante; haba; arroz; pino; álamo; manzana; melocotones; uva;
fresas; zanahoria; lechuga; berza; cebolla; cítrico; cereal; plantas
de nuez u otros cultivos de horticultura. En una realización
particular de la presente invención dichas plantas o partes de
planta son las plantas o partes de la planta de soja (Glicina
sp.).
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente un método de proporcionar una planta con una
característica agronómica deseada adicional que comprende: (a)
insertar en el material del genoma de la planta o parte de una
planta como es descrito anteriormente un polinucleótido que
proporciona la característica agronómica deseada; y regenerar
plantas o partes de planta de dicho material; o (a) cruzar una
primera planta o parte de planta como se describió anteriormente
con una segunda planta que proporciona dicha característica
agronómica deseada; y (b) seleccionar aquellas plantas resultantes
que contienen dicha característica agronómica deseada adicional.
Sería apreciado que la planta resultante de tal método contenga las
características de las GSTs y/o homoglutatión sintetasa según la
presente invención como se describió anteriormente junto con las
características asociadas con dichas características agronómicas.
En una realización adicional de la presente invención dicha
característica agronómica deseada adicional proporciona la
resistencia a un herbicida que comprende glifosato o una sal del
mismo. La característica agronómica deseada adicional también puede
ser seleccionada del grupo que consiste de: mayor resistencia al
herbicida; resistencia al insecto; resistencia al nematodo;
tolerancia al stress; rendimiento alterado; valor de nutricional
alterado; cualidad alterada o cualquier otra característica
agronómica deseable. En aún una realización adicional de la
invención dicha característica agronómica adicional comprende la
resistencia y/o tolerancia a insectos lograda por la producción de
proteínas insecticidas tales como las lectinas o proteínas
derivadas de Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp. y
de Photorabdus sp en la planta. En aún una realización
adicional de la invención dicha característica agronómica adicional
comprende la resistencia y/o tolerancia a nemátodos lograda por
medio de la producción de proteínas nematicidas tales como los
inhibidores de enzima, en la planta.
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente un método para controlar selectivamente las malas
hierbas en un campo dicho campo comprendiendo la cosecha de las
plantas y las malas hierbas dicho método comprende la aplicación a
dicho de campo de una formulación agrícolamente aceptable de un
agroquímico que comprende fomesafen y/o acifluorfen en la cual
dicho cultivo de plantas son las plantas según la invención.
La invención será ahora descrita por vía de los
siguientes ejemplos no limitantes con referencia a las figuras y
secuencias enumeradas en las que:
La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del
vector de clonaje pMJB2.
La Figura 2 muestra un diagrama esquemático del
vector de clonaje pMOG1051
La Figura 3 muestra un diagrama esquemático del
vector binario pMOG800
La Figura 4 muestra un diagrama esquemático del
vector pFT2 usado, para la transformación por medio de
Agrobacterium, para transformar las plantas para dar la
resistencia a los herbicidas.
- SEQ ID No.1.
- Homoglutatión sintetasa de Glicina max.
- SEQ ID Nos. 2 a 5.
- Regiones de la proteína Homoglutatión sintetasa.
- SEQ ID No. 6.
- Secuencia polinucleotídica que codifica para la Homoglutatión sintetasa de Glicina max.
- SEQ ID Nos. 7 a 10.
- Glutatión-S-transferasas 2.6, 3.1, 3.2 y 3.3 respectivamente.
- SEQ ID No. 11 a 14.
- Polinucleótidos que codifican para las GSTs 2.6, 3.1, 3.2 y 3.3 respectivamente. (GST 3.3 también puede estar referida como GST 3.6).
- SEQ ID Nos. 15 a 24.
- Los cebadores.
- SEQ ID Nos. 25 a 34.
- La secuencia de soja derivada de la secuencia de ácidos nucleicos P32110; la secuencia de Fríjol Mungo U20809; la secuencia de Tabaco Q03663; la secuencia de papa derivada de la secuencia de ácidos nucleicos P32111; la secuencia de Arabidopsis P46421; la secuencia (genómica) de Arabidopsis P46421; la secuencia de Papaya AJ000923; la secuencia de Abeto AF051214; la secuencia de trigo AF004358; la secuencia de Abeto AF051238 respectivamente.
- SEQ ID No. 35.
- El cebador.
- SEQ ID Nos 36 a 43.
- Las secuencia de clones enumeradas como SEQ ID Nos. 8, 22, 7,21, 31, 15, 23 y 25 en la Solicitud Internacional de Patente Número de Publicación WO 00/18936.
1.1 Se obtuvieron ADNcs parciales que codifican
para GSTs de soja usando la reacción en cadena de la polimerasa
reverso-transcriptasa (RT-PCR) con
oligonucleótidos cebadores degenerados diseñados para las regiones
conservadas dentro de las conocidas GSTs clase tau usando métodos
de alineamiento conocidos en el arte. El ARN total se obtuvo de
cultivos celulares de soja (Glicina max cv. Mandarin) usando
el reactivo TRIZOL^{TM} (Life Technologies^{TM}) según las
pautas de los fabricantes. La primera cadena de ADNc se obtuvo de 5
\mug de ARN total usando el oligonucleótido OG2 (SEQ ID No. 35)
en conjunto con la reverso transcriptasa
Superscript-II (Life Technologies^{TM}) usando
los protocolos estándares proporcionados por el fabricante. Los
oligonucleótidos cebadores degenerados CON2 (SEQ ID No. 17) y CON3
(SEQ ID No. 18) se usaron entonces en las reacciones de PCR
independientes con el oligonucleótido cebador OG9 (SEQ ID No. 16)
para amplificar parcialmente los genes que codifican para la GST a
partir de la primera cadena de ADNc. 2 \mul de la primera cadena
de ADNc sintetizada se usaron como plantilla en la reacción. Las
condiciones de PCR usadas son (94ºC, 45 s; 51ºC, 30 s y 72ºC, 60 s)
35 ciclos usando la Taq ADN polimerasa suministrada por Life
Technologies y un termociclador Techne. Los productos amplificados
fueron ligados en el vector pCR2.1 (Invitrogen^{TM}) y
transformados en células de E. coli INV F'.
1.2 Las colonias transformadas se seleccionaron
en medio LB que contiene 100 ug ml-l de ampicilina y
40 ug ml de X-GAL. Los plásmidos se recuperaron a
partir de cultivos de toda la noche de 5 ml, iniciado cada uno de
90 colonias blancas individuales (45 de cada reacción de RT
inicial). Los diferentes plásmidos fueron sometidos entonces a
análisis de restricción (EcoRI, SspI, SspI: SphI y RsaI) permitiendo
agrupar los clones similares. Los distintos ADNcs fueron
identificados por secuencia automatizada de ADN con los cebadores
M13, usando un secuenciador automático de ADN ABI 377, y analizados
por similitud con las secuencias de GST conocidas mediante la
realización de búsquedas en bases de datos usando el algoritmo BLAST
(Altschul S.F y otros, 1990).
\vskip1.000000\baselineskip
2.1 Un ADNc de longitud parcial que codifica
para la homoglutatión sintetasa fue obtenido por
RT-PCR. Los oligonucleótidos cebadores degenerados
MS-3 (el SEQ ID No.15) y OG9 (SEQ ID No. 16) se
usaron para amplificar específicamente el clon deseado de primera
cadena de ADNc, producido por cultivos celulares de soja como se
describe anteriormente.
2.2 El producto de PCR obtenido se clonó en el
vector pCR2.1 y fue secuenciado usando un secuenciador automático
de ADN AB1377^{TM}. Los productos que exhiben homología con
glutatión sintetasas relacionadas fueron identificados buscando en
las bases de datos usando el algoritmo BLAST.
\vskip1.000000\baselineskip
3.1 Se construyó una biblioteca de ADNc usando
el sistema lambda ZAP-II (Stratagene). El ARN total
se aisló de una suspensión celular de cultivos de 5 días de células
soja (cv. Mandarin) usando reactivo TRIZOL^{TM}. El ARNm Poli A+
se aisló a partir de ARN total usando PolyATtract (Promega^{TM})
según los protocolos estándares suministrados. La biblioteca de
ADNc se construyó según los siguientes protocolos estándares
proporcionados por Stratagene^{TM}.
La tabla 1 más abajo muestra las características
de la biblioteca de ADNc construida de una suspensión celular de
cultivos de 5 días de células soja (cv. Mandarin).
3.2 Las secuencias parciales de ADNc
identificadas en los ejemplos anteriores fueron marcadas con
P^{32} usando el kit de marcaje
Ready-to-go (Pharmacia^{TM}) y
usadas para muestrear la biblioteca de ADNc de soja por ADNcs de
longitud completa. Fueron muestreados 160,000 pfu y las colonias
supuestas hibridaron de forma cruzada con las sondas sometidas a un
muestreo secundario y terciario hasta que se observó pureza en la
placa. El ADN de los plásmidos se recuperó de las reservas de
placas puras usando protocolos de escisión in vivo
suministrados por Stratagene^{TM}. Fueron identificados los ADNcs
de longitud completa que codifican para GSTs y los ADNcs de
longitud completa que codifican para la homoglutatión sintetasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNcs de longitud completa que codifican
para homoglutatión sintetasa y glutatión
S-transferasa se expresaron de forma independiente
en E.coli usando el sistema de expresión pET
(Novagen^{TM}).
4.2 Los sitios NdeI o NcoI fueron
introducidos de forma apropiada en el extremo 5' de los ADNcs que
codifican para la glutatión S-transferasa y
BamHI en el extremo 3' usando PCR. El ADNc se clonó entonces
en el pET-24a o pET-24d como es
apropiado. Los plásmidos resultantes se introdujeron en
E.coli BL21 (DE3) usando procedimientos estándares de
transformación bacteriana conocidos por aquellos expertos en el
arte. La expresión y purificación de la GST recombinante se realizó
usando cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de
afinidad S-Hexil-glutatión según los
métodos conocidos en el arte (por ejemplo, Skipsey y otros,
1997). La actividad GST de la proteína recombinante purificada hacia
CDNB, acetoclor, acifluorfen, etil clorimuron, fluorodifen,
fomesafen y metolaclor en presencia de ambas glutatión y
homoglutatión se realizó por medio de ensayos que se describen en
Andrews y otros, 1997 y Skipsey y otros, 1997.
4.3 La tabla 2 más abajo muestra la actividad de
enzimas recombinantes. \pmSE, n=2, ND = No detectable, *Actividad
nkat mg-1, **Actividad pkat mg-1
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr \cr
\cr}
\newpage
Sitios de enzimas de restricción 5' NcoI
y 3' XhoI fueron introducidos en el ADNc de homoglutatión
sintetasa por medio de PCR usando los cebadores MS4-Nco (SEQ
ID No. 20). Además, el uso del cebador
MS-4-HIS proporciona una cola de
HIS C-terminal para ayudar a la purificación de la
enzima.
5.2 El fragmento resultante de la PCR fue
digerido con NcoI y XhoI y ligado en el
pET-24d similarmente digerido. Este vector fue
llamado pET-MS4-His. La purificación
de la homoglutatión sintetasa se realizó usando el siguiente
método. Las E.coli BL21 (DE3) que portaban el plásmido
pET-MS4-His (sección 1.3) fueron
crecidas a 30ºC hasta una DO_{600} = 0.5, luego se añadió
isopropil-\beta-tiogalactósido
(IPTG) a una concentración final de 0.1 mM. Posterior a una
incubación de 3 horas las bacterias fueron colectadas por
centrifugación, resuspendidas en tampón A (20 mM. Tris, 0.5 M NaCl,
5 mM. imidazol pH 8.0) y lisadas. Los restos celulares fueron
removidos por centrifugación (10,000 g, 10 min) y el sobrenadante
aplicado a una columna de 5 ml de ácido iminidiaceico
(Sigma^{TM}), previamente cargado con NiSO_{4} y equilibrado en
tampón A. La columna fue lavada con tampón A que contiene 20 mM de
imidazol, seguido por tampón A que contiene 300 mM de imidazol para
remover las proteínas unidas por afinidad.
5.3 La proteína eluida fue concentrada usando
una columna de centrifugación Centriplus 30 (Amicon^{TM}) y
resuspendida en tampón A previo a su aplicación a una columna
quelante HiTrap de 1 ml (Pharmacia^{TM}),
pre-cargada con NiSO_{4} y equilibrada como se
describió anteriormente. La proteína unida por afinidad es
recobrada entonces usando una concentración creciente de imidazol de
20-200 mM y la presencia de la homoglutatión
sintetasa recombinante con cola de Histidina fue detectada usando
anticuerpos para colas de Histidina de acuerdo a procedimientos
conocidos. Las fracciones que contenían la homoglutatión sintetasa
recombinante fueron agrupadas, concentradas usando columnas de
centrifugación Centricon 30 y resuspendidas en 20 mM
Tris-HCl pH 8.0, 1 mM DTT.
5.4 Se ensayó la actividad de la homoglutatión
sintetasa en 250 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM KCl, 20
mM MgCl_{2}, 5 mM DTT, 10 mM ATP, 1 mM
\gamma-glutamilcisteína y 50 mM glicina o 10 mM
\beta-alanina en un total de 100 \mul. Los
controles experimentales no contenían la enzima o glicina/
\beta-alanina. Los ensayos se realizaron a 30ºC
por 60 minutos, con alícuotas de 20 \mul removidas a intervalos de
tiempo regulares. Entonces se realizó una derivatización
monobromobimana en las alícuotas para determinar la presencia de o
glutatión o homoglutatión de acuerdo con los métodos descritos por
Cummins y otros, 1997.
6.1 Las plantas con tolerancia incrementada a
los herbicidas acifluorfen y fomesafen fueron obtenidas por
expresión en la planta hospedero de ambos la GST 3.3 activa de soja
y la homoglutatión sintetasa para incrementar además los niveles de
homoglutatión, requeridos para potenciar la eficiencia de la función
de GST 3.3.
6.2 La PCR, usando los oligonucleótidos
cebadores hGSH-NcoI (SEQ ID No. 21) y
hGSH-KpnI (SEQ ID No. 22) se usó para introducir un
sitio 5' NcoI y un sitio 3' KpnI en el ADNc GST 3.6.
El producto resultante de la PCR fue purificado, secuenciado,
digerido con NcoI y KpnI y ligado en el vector pMJB2
(Figura 1). El cassette de expresión, que comprende el promotor
doble potenciado CaMV35S: Glucanasa II líder, ADNc de hGSH
sintetasa y terminador nos fue escindido entonces de pMJB2
usando HindIII/EcoRI y ligado en el vector binario
pMOG800 similarmente digerido (Figura 3).
6.3 Los oligonucleótidos cebadores
3.6-BglII (SEQ ID No. 23) y 3.6 NcoI (SEQ ID
N. 24) fueron usados para introducir los sitios NcoI y
BglII en los extremos 5' y 3' del ADNc GST 3.6
respectivamente. El producto resultante de la PCR fue purificado,
secuenciado y digerido con NcoI y BglII y
sub-clonado en el vector pMOG1051 (Figura 2). El
cassette de expresión que comprende el promotor RolD/Fd, ADNc de GST
3.3 y el terminador PI-II de papa fue escindido
entonces de pMOG1051 usando BamHI y ligado en el único sitio
BamHI en el vector binario pMOG800 (Figura 3) que porta el
cassette de expresión de la homoglutatión sintetasa (ver adelante).
La orientación del inserto fue determinada por PCR. El vector
binario resultante, llamado pFT2 (Figura 4) fue secuenciado
íntegramente para confirmar su autenticidad.
\vskip1.000000\baselineskip
7.1 El vector binario pFT2 fue transformado en
Agrobacterium tumefaciens cepa LBA 4404 usando el método de
transformación de congelación descongelación proporcionado por
Holsters y otros, 1978. La transformación de tabaco y
regeneración de la planta entera fue realizada usando Nicotiana
tabacum var. Samsun según los protocolos estándares detallados
por Bevan, 1984. Los eventos de transformación se seleccionaron en
medio MS que contiene kanamicina. Pueden ser empleados otros
métodos de transformación para la transformación de otros cultivos,
tales como la soja. Ejemplos de tales métodos son referidos a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras de hojas de líneas
transformadas y se extrajo ADNc según los métodos descritos por
Edwards y otros, 1991. Los pares de oligonucleótidos
cebadores SEQ ID No. 21 y SEQ ID No. 22 y SEQ ID. No. 23 SEQ ID No.
24 fueron usados para amplificar regiones específicas dentro de la
homoglutatión sintetasa y GST 3.3 para permitir la detección de
ambos transgenes dentro del material putativo de la planta
transformada.
Los análisis siguientes fueron realizados en
material positivo a PCR para confirmar la funcionalidad de los
genes introducidos.
La actividad GST hacia el fomesafen en líneas
transgénicas fue realizado de acuerdo a los métodos descritos en la
publicación de Andrews y otros, 1997.
Las actividades glutatión y homoglutatión
sintetasa fueron determinadas en las líneas transgénicas usando el
ensayo descrito anteriormente.
La presencia de tiol libre en las plantas
transgénicas fue determinada usando el método de derivatización
monobromobimana. El tejido (1 g) fue pesado con precisión, congelado
en nitrógeno líquido, triturado a polvo fino y transferido a un
tubo limpio que contiene 3 ml de HCl 0.1 M. Después de una
incubación en hielo por 30 minutos con mezcla ocasional, la mezcla
fue transferida a un tubo eppendorf y centrifugada (13,000 g, 3
min). Dos alícuotas de 100 \mul de sobrenadante fueron
transferidas a tubos eppendorfs limpios, y se añadió 10 \mul de
agua a uno y al otro se le añadió 1 mM de glutatión o homoglutatión
(10 \mul). El tiol libre presente fue reducido por la adición de
10 \mul de NaOH 1M seguido por 10 \mul de NaOH que contenía 20
mg/ml NaBH_{4} y la solución fue incubada por 10 minutos a
temperatura ambiente.
8.4.1 La reacción fue detenida por la adición de
120 \mul de HCl 3.6 M y las muestras centrifugadas (13,000 g, 5
min). El sobrenadante (100 \mul) fue transferido a un tubo fresco
y 10 \mul de 5 mg ml de monobromobimana disueltos en acetonitrilo
añadidos, seguido por 5 \mul de N-etilmorfolina al
35% v/v. Las muestras fueron puestas en la oscuridad por un período
de 20 min, y la reacción fue parada por la adición de 880 \mul de
ácido acético al 5% (5 \mul v/v). Una curva estándar fue preparada
derivatizando glutatión o homoglutatión (0-20
mmol), y los conjugados S-bimana analizados por HPLC
usando metodología conocida en el arte (Cummins y otros,
1997).
\vskip1.000000\baselineskip
9.1 A continuación del cultivo de tejidos, las
plántulas resistentes a la kanamicina fueron transferidas a
recipientes de 5 pulgadas que contienen abono para recipientes John
Innes no. 3. Se les permitió a las plantas desarrollarse hasta
aproximadamente un estadío 10 de hoja y se aplicó fomesafen a 10 g
ai ha^{-1}, formulado con surfactante no iónico, al tejido aéreo
usando un atomizador de pista. La evaluación visual de la
fitotoxicidad/necrosis de la planta se realiza a los 5 días
posteriores a la aplicación.
10.1 Las líneas transgénicas de planta de una
sola copia fueron identificadas por análisis con Southern blot
según los métodos descritos por Sambrook, 1989 usando sondas
apropiadas radiomarcadas. El análisis de segregación fue realizado
en plantas que contenían un solo evento de inserción por germinación
en medio MS que contiene kanamicina. La confirmación posterior de
líneas homocigóticas puede ser realizada por retro cruzamiento de
líneas transgénicas con tabaco tipo salvaje y análisis de
segregación genética seguido por selección en kanamicina.
Altschul S.F., Gish W.,
Miller W., Myers E.U y Lipman D.J
(1990). Basic local alignment tool. Journal of Molecular
Biology 215 403-410.
Andrews C.J., Skipsey M.,
Townson J.K., Morris C., Jepson I. y
Edwards R (1997) Glutathione transferase activities
toward herbicides used selectively in soybean. Pesticide
Science 51 2 13-222.
Bevan M.M (1984) Binary
Agrobacterium vectors used for plant transformation.
Nucleic Acids Research 12 871
1-8721.
Cummins I., Moss S., Cole
D.J y Edwards R (1997) Glutathione Transferases in
Herbicide-resistant and
Herbicide-Susceptible Black-grass
(Alopecurus myosuroides). Pesticide Science 51
244-250.
Edwards K., Johnstone C y
Thompson C (1991) A simple and rapid method for the
preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids
Research 19 1349.
Holsters M., de Waele D.,
Depicker A., Messens E., van Montagu M y
Schell J (1978) Transfection and transformation of
Agrobacterium tumefaciens. Molecular and General Genetics
163 181-187.
Skipsey M., Andrews C.J.,
Townson J.K., Jepson I y Edwards R
(1997) Substrate and thiol specificity of a
stress-inducible glutathione transferase from
soybean. FEBS Letters 409 370-374.
Christou, Paul. Physiol. Plant.
(1990), 79(1), 2 10-12. Soybean
transformation by electric discharge particle acceleration.
Dan, Yinghui; Reichert, Nancy A.
(1999), Patente US No. 5968830 Soybean transformation and
regeneration methods.
Williams, Edward J.; Emler, Card
A.; Julson, Lori S.; Martinell, Brian J.;
Mccabe, Dennis E.; Huang, Yong. (2000)
Solicitud Internacional de Patente Número de Publicación. W0/0042207
Soybean transformation method omitting callus culture.
Hinchee, Maud Ann Wrightson;
Clemente, Thomas Elmo; Connor-Ward,
Dannette Vaudrilyn; Fedele, Mary Jacqueline; Fry.
Joyce Ellen; Howe, Arlene R.; Rozman, Renee Jean.
Patente US No. 5959179. Method for transforming soybeans.
<110> ZENECA LIMITED
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SECUENCIAS DE GST DE SOJA Y SU USO
EN LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS RESISTENTES A LOS HERBICIDAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CASO ZENECA PPD50449/WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB9922346.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-09-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 499
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Fragmento de Proteína.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Fragmento de Proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Fragmento de Proteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Fragmento de Proteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1854
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 899
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 840
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 918
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16, 24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2763
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ácidos nucleicos derivada de SOJA P32110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Fríjol mungo U20809
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2038
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Tabaco Q03663
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2796
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ácidos nucleicos derivada de Papa P32111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Arabidopsis P46421
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia genómica de Arabidopsis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 968
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Papaya AJ000923
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1040
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Abeto AF051214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 902
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Trigo AF004358
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1127
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Abeto AF051238
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 895
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 895
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 977
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1006
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 991
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
Claims (13)
1. Una
Glutatión-S-transferasa (GST) que
comprende la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 10 o
una variante de GST que tiene al menos 80% de identidad con la misma
cuando se calcula sobre la longitud completa de la SEQ ID NO. 10
con la condición de que dicha variante de GST no comprenda la
secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 36, y en la cual
la GST o variante de GST sea capaz de conferir resistencia y/o
tolerancia a un herbicida el cual comprende fomesafen y/o
acifluorfen.
2. Un polinucleótido que comprende la región que
codifica para una GST o variante de GST de acuerdo a la
reivindicación 1.
3. Un polinucleótido de acuerdo a la
reivindicación 2 que comprende la secuencia descrita como SEQ ID NO.
14.
4. Una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 1 o una variante de proteína
que tiene al menos un 80% de identidad con la misma cuando se
calcula sobre la longitud completa de la SEQ ID NO. 1, donde dicha
proteína o variante es capaz de catalizar la adición de
Beta-alanina sobre gamma glutamilcisteína y donde
la variante tiene una Km para Beta-alanina la cual
es menor que dichas variantes de Km para glicina cuando se calcula
usando el mismo método.
5. Una variante de proteína de acuerdo a la
reivindicación 4 cuya variante comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo descrito como SEQ ID NOs. 2, 3,
4 ó 5.
6. Un polinucleótido que comprende una región
que codifica para una proteína o variante de proteína según las
reivindicaciones 4 ó 5.
7. Un polinucleótido de acuerdo a la
reivindicación 6 que comprende la secuencia descrita como SEQ ID NO.
6.
8. Un polinucleótido que comprende la primera
región que comprende un polinucleótido según las reivindicaciones 2
ó 3 y una segunda región que comprende un polinucleótido según las
reivindicaciones 6 ó 7.
9. Un polinucleótido de acuerdo a la
reivindicación 8 donde dicha primera región comprende un
polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos
descrita como SEQ ID NO. 10 y dicha segunda región comprende un
polinucleótido que codifica para un aminoácido descrito como SEQ ID
NO. 1.
10. Un método de proporcionar plantas que sean
resistentes y/o tolerantes a un herbicida difenil éter que
comprende:
- (a)
- insertar en el material del genoma de la planta un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 8 ó 9;
- (b)
- regenerar plantas o partes de plantas de la misma; y
- (c)
- aplicar a dichas plantas o partes de plantas una cantidad de dicho herbicida difenil éter el cual es fitotóxico a las plantas tipo control y seleccionar aquellas plantas o partes de plantas las cuales son resistentes a dicho herbicida difenil éter.
11. Plantas o partes de plantas, donde dichas
plantas o partes de plantas son resistentes a los herbicidas
difenil éter debido a la expresión de una GST de acuerdo a la
reivindicación 1 codificada por una construcción de ADN que
comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones
2, 3, 8 ó 9.
12. Un método para proporcionar una planta con
una característica agronómica deseada adicional que comprende:
- (a)
- insertar en el material del genoma de la planta de una planta o parte de una planta de acuerdo a la reivindicación 11 un polinucleótido el cual proporciona una característica agronómica deseada adicional y regenerar plantas o partes de plantas de dicho material; o
- (b)
- el método de la reivindicación 10, seguido por el cruzamiento de la primera planta o parte de planta proporcionada por el paso (c) del método de la reivindicación 10 con una segunda planta la cual proporciona dicha característica agronómica deseada y seleccionar dichas plantas resultantes las cuáles contienen dicha característica agronómica deseada adicional.
13. Un método de controlar selectivamente las
malas hierbas en un campo dicho campo comprendiendo plantas de
cultivo y malas hierbas, dicho método comprendiendo aplicar a dicho
campo una formulación agrícolamente aceptable de un agroquímico que
comprende fomesafen y/o acifluorfen, donde dichas plantas de cosecha
son las plantas de acuerdo a la reivindicación 11.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9922346 | 1999-09-21 | ||
| GBGB9922346.3A GB9922346D0 (en) | 1999-09-21 | 1999-09-21 | Improvements in or relating to organic compounds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2316382T3 true ES2316382T3 (es) | 2009-04-16 |
Family
ID=10861340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00960838T Expired - Lifetime ES2316382T3 (es) | 1999-09-21 | 2000-09-18 | Secuencias gst del frijol de soja y su uso en la produccion de plantas resistentes a los herbicidas. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7056715B1 (es) |
| EP (1) | EP1218517B1 (es) |
| AR (1) | AR025736A1 (es) |
| AT (1) | ATE413457T1 (es) |
| AU (1) | AU7300900A (es) |
| DE (1) | DE60040752D1 (es) |
| ES (1) | ES2316382T3 (es) |
| GB (1) | GB9922346D0 (es) |
| WO (1) | WO2001021770A2 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020079846A1 (en) * | 2000-01-18 | 2002-06-27 | Facchini Peter James | Novel glutathione-S-transferase nucleic acids and polypeptides and methods of use thereof |
| GB0220038D0 (en) * | 2002-08-29 | 2002-10-09 | Univ Durham | Novel Protein Design |
| GB0920891D0 (en) | 2009-11-27 | 2010-01-13 | Syngenta Participations Ag | Herbicidal compositions |
| TWI667347B (zh) | 2010-12-15 | 2019-08-01 | 瑞士商先正達合夥公司 | 大豆品種ｓｙｈｔ０ｈ２及偵測其之組合物及方法 |
| GB201109239D0 (en) | 2011-06-01 | 2011-07-13 | Syngenta Participations Ag | Herbicidal compositions |
| CN109852597B (zh) * | 2019-03-21 | 2022-11-18 | 云南师范大学 | 一种β-半乳糖苷酶galRBM20_1及其制备方法和应用 |
| CN111269896B (zh) * | 2020-01-30 | 2022-04-19 | 吉林农业大学 | 氯嘧磺隆降解酶Kj-GST、其编码基因Kj-gst及应用 |
| CN113481185B (zh) * | 2021-08-05 | 2022-12-02 | 云南师范大学 | 一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9114259D0 (en) * | 1991-07-02 | 1991-08-21 | Ici Plc | Plant derived enzyme and dna sequences |
| US6168954B1 (en) | 1997-09-05 | 2001-01-02 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Soybean glutathione-S-transferase enzymes |
| US6063570A (en) | 1997-09-05 | 2000-05-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Soybean glutathione-S-transferase enzymes |
| GB9719727D0 (en) | 1997-09-16 | 1997-11-19 | Rhone Poulenc Agriculture | New plant genes |
| EP1117811A1 (en) | 1998-09-30 | 2001-07-25 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Soybean glutathione-s-transferase enzymes |
-
1999
- 1999-09-21 GB GBGB9922346.3A patent/GB9922346D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-09-18 ES ES00960838T patent/ES2316382T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-18 AU AU73009/00A patent/AU7300900A/en not_active Abandoned
- 2000-09-18 EP EP00960838A patent/EP1218517B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-18 WO PCT/GB2000/003573 patent/WO2001021770A2/en active Application Filing
- 2000-09-18 US US10/088,945 patent/US7056715B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-18 DE DE60040752T patent/DE60040752D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-18 AT AT00960838T patent/ATE413457T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-21 AR ARP000104957A patent/AR025736A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7300900A (en) | 2001-04-24 |
| EP1218517B1 (en) | 2008-11-05 |
| US7056715B1 (en) | 2006-06-06 |
| AR025736A1 (es) | 2002-12-11 |
| DE60040752D1 (de) | 2008-12-18 |
| WO2001021770A3 (en) | 2001-09-07 |
| ATE413457T1 (de) | 2008-11-15 |
| EP1218517A2 (en) | 2002-07-03 |
| GB9922346D0 (en) | 1999-11-24 |
| WO2001021770A2 (en) | 2001-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7169970B2 (en) | Herbicide resistant plants | |
| CN1863914B (zh) | 新的草甘膦-n-乙酰转移酶(gat)基因 | |
| ES2417012T3 (es) | Plantas de trigo que exhiben resistencia aumentada a los herbicidas de imidazolinona | |
| US6245968B1 (en) | Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides | |
| JP5907657B2 (ja) | 新規な除草剤抵抗性遺伝子 | |
| ES2379553T3 (es) | Plantas de arroz que tienen tolerancia aumentada a herbicidas de imidazolinona | |
| CZ20013859A3 (cs) | Herbicidně rezistentní rostliny | |
| AU2001287862A1 (en) | Herbicide resistant plants | |
| CZ20013860A3 (cs) | Herbicidně rezistentní rostliny | |
| CN110577933A (zh) | 草甘膦抗性植物和相关方法 | |
| CZ20013856A3 (cs) | Herbicidně rezistentní rostliny | |
| JP2003528571A6 (ja) | 除草剤抵抗性植物 | |
| JP2010142234A (ja) | 新規のグリホセートｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｇａｔ）遺伝子 | |
| ES2316382T3 (es) | Secuencias gst del frijol de soja y su uso en la produccion de plantas resistentes a los herbicidas. | |
| AU2005267423B2 (en) | Microbial glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases | |
| AU2017370528B2 (en) | Methods for improving transformation frequency | |
| CA2318522A1 (en) | Riboflavin biosynthesis genes from plants and uses thereof | |
| US6168954B1 (en) | Soybean glutathione-S-transferase enzymes | |
| ES2364988T3 (es) | Grg23 epsp sintasas mejoradas: composiciones y métodos de uso. | |
| ZA200302168B (en) | Herbicide resistant plants. | |
| CN101665795A (zh) | 新的草甘膦-n-乙酰转移酶(gat)基因 |