ES2315366T3 - Deteccion especifica de enzimas proteoliticas mediante un proteina hibrida. - Google Patents
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Abstract
Un péptido con las siguientes propiedades: a) el péptido contiene una secuencia de identificación de una endopeptidasa (enzima) y puede actuar por lo tanto como substrato para la enzima, en el cual se produce un sitio de escisión entre dos aminoácidos mediante la secuencia de reconocimiento en dicho péptido; b) el péptido contiene por lo menos un extintor y por lo menos una fluoróforo; c) el extintor es el aminoácido triptófano; d) el fluoróforo es un colorante fluorescente; e) el colorante fluorescente es un péptido o una proteína covalentemente copulable; f) la fluorescencia del colorante fluorescente puede ser extinguida por el triptófano mediante una transferencia de electrones fotoinducidos, en donde el triptófano actúa como dador de electrones; g) la secuencia del péptido está formada como sigue: h) el extintor está colocado a un lado del sitio de escisión; i) el fluoróforo está colocado sobre el otro lado del sitio de escisión; j) se obtiene una proximidad espacial suficiente, entre el extintor y el fluoróforo, en tanto el substrato no ha sido extinguido todavía mediante la enzima en el sitio de escisión entre el extintor y el fluoróforo, para garantizar la posibilidad de una extinción por lo menos parcialmente de la emisión del fluoróforo; k) después de la escisión del substrato mediante la enzima en el sitio de escisión entre el extintor y el fluoróforo, es posible un claro aumento de la emisión del fluoróforo.
Description
Detección específica de enzimas proteolíticas
mediante una proteína híbrida.
Las enzimas proteolíticas son proteasas o
peptidasas, a saber, enzimas que pueden cortar o respectivamente
lisar los péptidos o respectivamente las proteínas. La palabra
"péptido" designa por regla general una secuencia corta de
aminoácidos, mientras que con la palabra "proteína", se
designa por regla general una molécula mayor compuesta de una
secuencia de aminoácidos. Ambos conceptos se emplean en adelante,
como sinónimos.
Las peptidasas y proteasas juegan un papel
decisivo en la activación de las proteínas, la regulación celular,
y la transmisión de una señal. Su detección con el máximo posible
de sensibilidad es por lo tanto de una gran importancia para la
comprensión de como funciona una célula y su comunicación, así como
el control del curso de enfermedades.
Además, el exacto conocimiento de la
concentración de peptidasas o respectivamente de proteasas, permite
el desarrollo del objetivo de nuevos agentes terapéuticos para la
inhibición, por ejemplo de la HIV-proteasa. La
HIV-proteasa descompone en primer lugar la
HIV-proteína, muy larga después de su
multiplicación en una célula, en proteínas individuales
funcionales, que sólo entonces permiten la posterior actividad y
crecimiento del HIV-virus. En consecuencia se
originan dos puntos adicionales. En primer lugar: Si se bloquea la
HIV-proteasa, el virus HIV no puede multiplicarse,
y su propagación no es posible. Por otra parte, la infección con el
virus HIV puede detectarse por medio de la detección de la
HIV-proteasa. La detección específica de la
HIV-proteasa puede servir por lo tanto como ensayo
del SIDA.
También los ensayos de proteasas ganan un
creciente interés en la investigación médica, dado que cada vez
más, se descubre que ciertas enfermedades, entre otras el cáncer,
están conectadas con las enzimas. Las proteasas asociadas a los
tumores son en creciente medida, objeto de la investigación
oncológica-bioquímica. Estas proteasas actúan en la
degradación de las proteínas del estroma tumoral y de la membrana
basal y hacen así posible la invasión de células tumorales. Por
ello, en el diagnóstico de tumores, las investigaciones de sistemas
de proteasas, las cuales se superexpresan en las células tumorales,
están entre los nuevos factores de prognosis.
Es importante también el empleo de ensayos de
proteasas para el control de calidad de los productos bioquímicos.
Si se venden por ejemplo, proteínas, enzimas, péptidos, etc., debe
tenerse la seguridad de que los productos vendidos están libres de
proteasas, con el fin de que el producto vendido no se descomponga
por si mismo. El mismo ensayo puede emplearse también para el
ensayo de la actividad específica de las proteasas, p. ej., después
de un almacenamiento prolongado, con respecto a la cuestión de si
las enzimas están todavía activas.
Las enzimas proteolíticas se dividen, según el
punto de ataque en el substrato, en endopeptidasas (proteasas) y
exopeptidasas. Las endopeptidasas escinden las uniones amino en el
interior de los péptidos. La exopeptidasas digieren los aminoácidos
de los péptidos en aminoácidos a partir de sus extremos, es decir,
escinden los aminoácidos terminales. Las exopeptidasas pueden
subdividirse además, en aminopeptidasas y carboxipeptidasas en
correspondencia a su actividad en el término -amino ó -N ó
respectivamente en el término -carboxilo ó -C del péptido.
Para la determinación de la concentración o la
actividad de diferentes peptidasas y proteasas han sido
desarrollados hasta la fecha diferentes ensayos basados en la
fluorescencia, cuyos principios funcionales y sensibilidades se
describen brevemente a continuación.
Una posibilidad para la detección de enzimas
proteolíticas, lo ofrece el llamado "EnzChek Protease Assay
Kit" de la empresa Molecular Probes (Eugene, USA). Este kit
emplea para la detección de proteasas, derivados de caseína, a los
cuales se han copulando muchos colorantes BODIPy, insensibles al
pH, verdes o rojos fluorescentes (Karolin J, Johansson BA,
Strandberg L, Ny T; J. Am. Chem. Soc. 1994, 116,
7801-7806). Debido al muy alto grado de marcado de
la proteína, las distancias intermoleculares entre los fluoróforos
son muy pequeñas (típicamente del orden de los nanómetros). Por
este motivo, los colorantes se extinguen recíprocamente, entre
otros, mediante la formación de dímeros. La caseína es una enzima
grande, que contiene muchos sitios de unión para las proteasas
puesto que presenta muchos diferentes segmentos secuenciales.
Cuando el derivado de caseína marcado con un colorante entra en
contacto con las proteasas, por ejemplo con la tripsina, la cual
hidroliza las uniones peptídicas de los aminoácidos básicos
arginina y lisina en el lado del carboxilo, éstas dividen el
derivado de caseína en péptidos más pequeños, con lo cual la
distancia entre los colorantes por regla general, aumenta. Por este
motivo no tiene lugar la extinción y se observa un aumento de la
fluorescencia, lo cual indica la presencia de enzimas
proteolíticas. La sensibilidad de detección de este kit es para la
tripsina por ejemplo, de pocos ng/ml. Para estas pequeñas
cantidades de proteasas, el tiempo de detección o respectivamente
el tiempo de la medición es de más de 10 horas. Este ensayo detecta
muchas enzimas proteolíticas no específicas, puesto que la caseína
es digerida por la elastasa, pepsina, termolisina, papaína,
tripsina, etc.
Un ensayo enzimático basado en la rodamina 110
para diferentes proteasas y peptidasas, (Leytus SP, Melhado LL,
Mangel WF: Rhodamine-based compounds as fluorogenic
substrates for serine protease ("Compuestos basados en la
rodamina como substratos fluorogénicos para la serina proteasa"
(1983) Biochem. J. 209 (2) 299-307, Leytus SP,
Patterson WL., Mangel WF: New class of sensitive and selective
fluorogenic substrates for serine proteinases. Amino acid and
dipeptide derivatives of rhodamine ("Nueva clase de substratos
fluorógenos sensibles y selectivos para las serina proteinasas. El
aminoácido y los derivados dipéptidos de la rodamina", (1983)
Biochem, J. 215(2): 253-260, se comercializa
también para la detección de las serina proteasas. A este respecto
se une covalentemente por lo menos uno de los grupos amino de la
rodamina 110, con un aminoácido (la mayor parte de las veces
arginina), con lo cual la fluorescencia del fluoróforo se distingue
fuertemente. Después de la digestión de los compuestos peptídicos
la fluorescencia de la rodamina 110 aumenta drásticamente. La
sensibilidad del ensayo es para la caspasa-3 de
pocos ng de cantidad absoluta de enzima. Es desventajoso que el
principio no es aplicable en general, trabaja parcialmente como no
específico y es relativamente insensible.
También puede efectuarse un ensayo de proteasa o
de peptidasa, con ayuda de la transferencia
energía-resonancia- fluorescencia Forster (FRET)
(Forster Th: Zwischwenmolekulare Energiewanderung und Fluorescenz
("Transferencia de energía intermolecular y fluorescencia"),
(1948) Annalen der Physik ("Anales de Física"),
2:55-75). A ese respecto se marca covalentemente la
secuencia específica de identificación de una endopeptidasa en
ambos extremos, cada vez con un colorante dador o respectivamente
con un colorante receptor. Debido al solapado espectral de la
emisión del dador con la absorción del receptor, la fluorescencia
del dador se extingue en distancias pequeñas. Cuando el péptido es
escindido mediante la endopeptidasa, se pierde el contacto próximo
en el espacio, entre el dador y el receptor, con lo que resulta un
aumento de la fluorescencia. Como ejemplo puede citarse aquí
brevemente la detección de la HIV- proteasa. A este respecto, la
secuencia específica de escisión de la
HIV-proteasa, se une en cada caso cerca del sitio
de escisión con un colorante EDANS (dador) y un colorante DABCYL
(receptor). La secuencia peptídica es entonces:
Arg-Glu(EDANS)-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-
Lys(DABCYL)-Arg, en donde se utiliza el
código abreviado de 3 letras para los aminoácidos. Después de la
escisión mediante la HIV-proteasa, se obtienen dos
partes: Arg-Glu(EDANS)-Ser-
Gln-Asn-Tyr-OH y
Pro-Ile-Val-Gln-Lys(DABCYL)-Arg.
El principio es aplicable en general, aunque debe garantizarse una
distancia apropiadamente pequeña entre los dos colorantes. La
sensibilidad es del orden de soluciones nanomolares de HIV-
proteasa. Es desventajosa la costosa síntesis del substrato con la
específica copulación de un dador y un receptor. Cuando el
substrato está en parte marcado sólo incompletamente, por ejemplo
solamente con un dador, se obtiene como resultado una pobre
sensibilidad del ensayo.
Un ensayo de peptidasa basado en el FRET, en el
cual se emplea el aminoácido triptófano como fluoróforo y el Dansyl
como extintor, es descrito por Ng et al. (Ng M, Auld DS: A
Fluorescent Oligopeptide Energy Transfer Assay with Broad
Applications for Neutral Proteases ("Un ensayo de transferencia
de energía de un oligopéptido fluorescente con amplias aplicaciones
para proteasas neutras") (1989) Anal. Biochem.
183:50-56).
El objetivo de la invención es el de mejorar las
posibilidades para una detección específica de las enzimas
proteolíticas.
Este objetivo se resuelve mediante las
reivindicaciones independientes según la invención. En las
reivindicaciones secundarias se describen ventajosos desarrollos de
la misma.
Un primer procedimiento de detección
(abreviadamente "ensayo") se emplea para la detección de
endopeptidasas (en adelante abreviadamente enzimas) mediante
péptidos especiales.
Para ello, se prepara un péptido con las
propiedades que se enumeran a continuación. El péptido contiene una
secuencia de identificación de la endopeptidasa que hay que
detectar, y puede por lo tanto hacer las veces de substrato para la
enzima, con lo que resulta un sitio de escisión entre dos
aminoácidos en la secuencia de identificación en el péptido.
El péptido contiene por lo menos un extintor y
por lo menos un fluoróforo. Con el término "extinción" se
designa la reducción de la emisión del fluoróforo basada en la
interacción con el citado extintor. Como fluoróforo se emplea un
colorante fluorescente. El extintor ocasiona una disminución en el
rendimiento de los quantum de fluorescencia. En lugar de
"extinción" y "extintor" se emplean como sinónimos
también los términos "apagado" y "molécula extintora" o
respectivamente "molécula de extinción".
Como extintor se emplea el aminoácido
triptófano. Otros aminoácidos como la tirosina o la histidina
muestran también una ligera extinción de la fluorescencia pero sin
embargo no tienen la fuerte acción extintora del triptófano.
El colorante fluorescente se selecciona sobre la
base de que su fluorescencia pueda extinguirse mediante
transferencia de electrones fotoinducida de triptófano, en donde el
triptófano actúa como dador de electrones. Además el colorante
fluorescente puede ser copulado covalentemente con péptidos o
proteínas. El fluoróforo se copula por regla general con un
aminoácido.
Para lograr una alta sensibilidad del ensayo,
debe seleccionarse la secuencia del péptido como diana. Es decir,
el extintor debe estar colocado a un lado del sitio de escisión y
el fluoróforo en el otro lado del sitio de escisión. La secuencia
debe seleccionarse de manera que exista una suficiente proximidad
espacial entre el extintor y el fluoróforo, en tanto el substrato
todavía no ha sido extinguido por la enzima en el sitio de escisión
entre el extintor y el fluoróforo, para garantizar la posibilidad,
por lo menos parcial, de extinción de la emisión del fluoróforo.
Después de la escisión del substrato por la enzima en el sitio de
escisión entre el extintor y el fluoróforo debe ser posible un
claro aumento de la emisión del fluoróforo.
El marcado del péptido o respectivamente de la
proteína, con el colorante de fluorescencia, no tiene lugar por lo
tanto en el propio triptófano, sino en otro aminoácido, el cual se
separa del triptófano mediante el sitio de escisión. Además, se
escoge un aminoácido distinto del triptófano para copular el
colorante fluorescente, por ejemplo, la lisina, arginina o
cisteína. El colorante fluorescente puede también copularse a un
extremo del péptido o respectivamente de la proteína.
El mayor aumento de la fluorescencia se obtiene
cuando el triptófano y el aminoácido marcado con colorante se
encuentran directamente colocados a ambos lados del sitio de
escisión. Para el colorante MR 121 por ejemplo, puede observarse
después de la escisión del péptido mediante la enzima, un aumento de
la fluorescencia alrededor de un factor 10.
Además, ningún triptófano puede colocarse en
posiciones adyacentes sobre el mismo lado del sitio de escisión de
la secuencia del péptido, como el colorante, y en particular no en
posiciones inmediatamente adyacentes, a fin de que el colorante no
sea extinguido por este otro triptófano adicional.
La elección apropiada de la secuencia del
substrato, hace posible que el substrato se marque solamente con un
colorante fluorescente y no sean por lo menos dos como hasta ahora
era necesario. Esto hace más fácil la síntesis del substrato.
También, la unión de la enzima al substrato es menos dificultada
por los colorantes copulados, por lo cual, la especificidad de la
unión entre el substrato y la enzima, aumenta.
Finalmente, se mezclan en una solución, el
péptido preparado de esta forma y la enzima que hay que detectar.
Cuando tiene lugar una unión entre el péptido y la peptidasa, el
péptido es escindido en los sitios de escisión. El fluoróforo se
aleja por este motivo espacialmente del extintor y la emisión del
fluorófero, aumenta. Este aumento de la emisión se determina y
sirve para la detección de aquellas péptidasas o proteasas que se
unen a la secuencia de identificación y allí pueden escindir el
péptido. La reacción de detección es también específica. Puede
ajustarse mediante la variación de la secuencia peptídica para la
detección de enzimas específicas.
En particular, el ensayo puede detectar también
específicamente las enzimas, cuando otros tipos de enzima están
presentes en la solución. Así por ejemplo, la enzima tripsina puede
ser detectada en una solución que también contiene elastasa y
quimotripsina.
Cuando se persigue un aumento de la emisión en
el transcurso del tiempo, puede determinarse cuantitativamente la
concentración de la enzima. Con ayuda del ensayo según la invención
se pueden detectar también proteasas o respectivamente peptidasas en
una concentración de 10^-15 moles/litro.
Como colorantes, entran en cuestión todos los
colorantes fluorescentes, que se extinguen, de forma medible, en su
fluorescencia mediante el aminoácido triptófano. Son
particularmente apropiados los colorantes de la clase de los
derivados de oxacina (p. ej., MR 121, JA 242, JA 243) y rodamina
(p. ej., JA 165, JA 167, JA 169), los cuales en la zona roja del
espectro de la luz visible absorben y emiten (ver p. ej., Müller R,
Zander C, Sauer M, Deimel M, Ko DS, Siebert S,
Arden-Jacob J, Deltau G, Marx NJ, Drexhage KH,
Wolfrum J. Chem. Phys. Let. 1996, 262, 716-722).
Estos colorantes rojos son extinguidos por el triptófano alrededor
de uno a dos órdenes de magnitud más que otros colorantes.
Mediante el empleo de colorantes rojos la
sensibilidad aumenta claramente, puesto que por otra parte la auto
fluorescencia existente en su mayor parte en la zona espectral
verde de la luz visible, dificulta la sensible detección de
muestras biológicamente importantes, como por ejemplo sueros
sanguíneos y ascites. Con el procedimiento según la invención puede
también realizarse en estas muestras biológicamente importantes un
ensayo sensible, e incluso en sueros sanguíneos sin diluir.
El objetivo se consigue también mediante un
segundo ensayo para la detección de exopeptidasas (enzima).
De nuevo se prepara un péptido. Esta vez el
péptido contiene por lo menos un grupo que contiene un extintor y
un fluoróforo en diferentes aminoácidos. Como extintor se emplea
de nuevo el aminoácido triptófano. Como fluoróforo se emplea de
nuevo un colorante fluorescente. El colorante fluorescente se
escoge de forma que pueda copularse covalentemente como un péptido
o una proteína. Además la fluorescencia del colorante puede
extinguirse mediante el triptófano.
La secuencia del péptido se escoge de manera que
exista una suficiente proximidad espacial entre el extintor y el
fluoróforo, en tanto que los aminoácidos que llevan el extintor o
respectivamente el colorante fluorescente, no han sido separados
todavía por la enzima, para garantizar la posibilidad de una
extinción de la emisión del fluoróforo por lo menos parcialmente.
Además, después de la separación por la enzima, de los aminoácidos
que llevan el extintor o respectivamente el colorante fluorescente,
debe garantizarse un suficiente alejamiento espacial entre
eventualmente otro extintor y el fluoróforo, para lograr por lo
menos parcialmente un aumento de la emisión del fluoróforo.
El péptido preparado de esta manera se mezcla
con la enzima que hay que detectar, en una solución. Se determina
la fuerza de la emisión del fluoróforo en la solución.
En muchos aspectos corresponde este ensayo al ya
descrito para la detección de una endopeptidasa. De todas formas,
la detección de una exopeptidasa es más fácil.
\newpage
La exopeptidasa digiere la proteína o el péptido
a partir de su extremo. A este respecto separa un aminoácido
después de otro. Entre otros se separa también un triptófano. El
colorante copulado a un aminoácido en la vecindad, ya no se
extingue más y tiene lugar un aumento de la fluorescencia. Lo mismo
sirve cuando el aminoácido con el colorante se separa en primer
lugar.
Cuando el substrato contiene una multiplicidad
de grupos triptófano-colorante, entonces puede
observarse repetidamente un aumento de la fluorescencia. En efecto,
tiene lugar entonces un aumento múltiple de la fluorescencia.
También aquí pueden de nuevo emplearse
ventajosamente todos los colorantes rojos citados.
El objetivo se resuelve finalmente mediante un
tercer ensayo para la detección de las endopeptidasas (enzima).
Este ensayo tiene de nuevo muchas similitudes y algunas
diferencias decisivas.
En primer lugar se prepara un péptido. En un
extremo del péptido se coloca un grupo, el cual inhibe el que una
exopeptidasa digiera el péptido. El grupo en el extremo del péptido
el cual impide la digestión del péptido por una exopeptidasa, se
designa también como grupo de interrupción o molécula de
interrupción. A este respecto puede tratarse por ejemplo de
D-aminoácidos, ADN o PNA, los cuales no son
escindidos por la exopeptidasa.
Otra posibilidad de crear un grupo de
interrupción, consiste en colocar, mediante la apropiada selección
de la secuencia del péptido, en el extremo del péptido un
aminoácido o una secuencia de aminoácidos, los cuales no son
escindidos por la exopeptidasa. La carboxipeptidasa A como
exopeptidasa, por ejemplo, no escinde más allá del aminoácido
prolina en el extremo de un péptido. La colocación de un aminoácido
corriente como grupo de interrupción facilita la síntesis del
péptido.
La exopeptidasa puede encontrarse también con el
péptido o la proteína en solución, sin atacarlos.
El péptido contiene además una secuencia de
identificación de la endopéptidasa que hay que detectar y por lo
tanto puede hacer las veces de substrato para la enzima,
produciéndose un sitio de escisión entre dos aminoácidos en la
secuencia de identificación en el péptido.
El péptido contiene a partir del grupo de
interrupción considerado en la secuencia del péptido en el otro
lado del sitio de escisión, por lo menos un grupo, el cual contiene
un extintor y un fluoróforo en diferentes aminoácidos.
La secuencia del péptido se escoge de tal
manera, que exista una suficiente proximidad espacial entre el
extintor y el fluoróforo, en tanto que los aminoácidos que llevan
el extintor o respectivamente el colorante fluorescente no hayan
sido separados todavía mediante una exopeptidasa, para garantizar
la posibilidad de una extinción por lo menos parcialmente, de la
emisión del fluoróforo.
Además debe garantizarse que después de la
separación de los aminoácidos que llevan el extintor o
respectivamente el colorante fluorescente, se garantiza mediante
una exopeptidasa un alejamiento espacial suficiente entre uno o
eventualmente otro extintor y el fluoróforo, para lograr por lo
menos parcialmente un aumento de la emisión del fluoróforo.
Finalmente, se mezcla el péptido preparado de
esta manera, por lo menos con una exopeptidasa y la endopeptidasa
que hay que detectar, en una solución. Con ello tiene lugar una
unión entre el péptido como substrato y la endopeptidasa como
enzima. El péptido es escindido en el sitio de escisión en el
interior de la molécula. Con ello se separa el grupo protector de
interrupción en el extremo del substrato, del resto del substrato.
El resto sobrante que queda ya no presenta ningún grupo protector
de interrupción más, y una exopeptidasa puede digerir el resto del
substrato.
Dicha exopeptidasa puede añadirse a la solución
en cantidad suficiente, juntamente con el substrato. Puede
emplearse también como un kit juntamente con el substrato.
Mediante la digestión por medio de la
exopeptidasa se separan el extintor y el fluoróforo. Tiene lugar de
nuevo un aumento de la fluorescencia.
Entre el grupo de interrupción y la zona del
péptido o de la proteína que lleva los grupos
extintor-y-fluoróforo, puede estar
cualquier secuencia larga de aminoácidos, sin que se vea afectada
la sensibilidad de la detección. Con ello pueden detectarse también
enzimas, las cuales poseen una larga secuencia de identificación,
como por ejemplo la HIV- proteasa.
Cuando como exopeptidasa se emplea una
carboxipeptidasa, entonces el grupo de interrupción está colocado
en el extremo terminal -C del péptido, con el fin de que pueda
lograrse la subsiguiente digestión mediante la carboxipeptidasa.
Cuando por lo contrario, como exopeptidasa se emplea una
aminopeptidasa, entonces el grupo de interrupción está colocado en
el extremo terminal -N del péptido.
Cuando el substrato contiene una multiplicidad
de grupos extintor-y-fluoróforo,
entonces puede observarse de nuevo un aumento múltiple de la
fluorescencia. Por este motivo la duración de la medición puede
acortarse considerablemente. Al mismo tiempo la señal aumenta
claramente. La gran ventaja de un marcado múltiple consiste en que
mediante una sola escisión y por lo tanto mediante la única
endopeptidasa que hay que detectar, no solamente se activa un
fluoróforo sino que se activan muchos. Se obtiene con ello un claro
aumento de la señal en un tiempo esencialmente corto. Por este
motivo el aumento de la señal puede también medirse aún en aparatos
de poca sensibilidad. También el límite de detección se desplaza
con ello hacia valores más bajos.
Este ensayo detecta también específicamente las
endopeptidasas, con otras ventajas, que ya han sido citadas.
Como fluoróforo pueden escogerse diferentes
colorantes, los cuales están unidos covalentemente a un aminoácido.
Un extintor puede también estar unido covalentemente a un
aminoácido. Como combinación de los mismos puede citarse por
ejemplo, el extintor DABCYL ó guanosina y como fluoróforo por
ejemplo los colorantes fluoresceína, cumarina o eosina.
También para este tercer ensayo puede utilizarse
de nuevo como extintor el aminoácido triptófano, juntamente con un
colorante fluorescente como fluoróforo. El colorante fluorescente
debe poderse copular covalentemente a un péptido o a una proteína,
y su fluorescencia debe poder ser extinguida mediante el
triptófano. Las ventajas de esta elección ya han sido
descritas.
De nuevo, pueden emplearse también colorantes
rojos.
Entre otras cosas, existen todavía para este
tercer ensayo, otras posibilidades para producir el par compuesto
de extintor y fluoróforo. El extintor puede ser por lo menos un
primer colorante fluorescente y el fluoróforo por lo menos un
segundo colorante fluorescente, en tanto ambos sean copulables
covalentemente a péptidos o proteínas. Es importante, que ambos
colorantes puedan extinguirse recíprocamente cuando están
espacialmente próximos. Este puede ser el caso mediante formación
de dímeros u otros mecanismos, por ejemplo transferencia de
energía. Después de la eliminación del grupo de interrupción
mediante la endopeptidasa que hay que detectar, la exopeptidasa
digiere el resto de la cadena peptídica, de manera que los
colorantes se alejan entre sí, y con ello ya no es posible la
extinción. Se mide el aumento resultante de la intensidad de la
fluorescencia.
Como colorantes para ello, son apropiados los
anteriormente citados, rodamina y oxazina. Además, derivados de la
cianina (por ejemplo Cy 3, Cy 5, Cy 7, que pueden adquirirse en
Amersham Biosciences), todos los colorantes BODIPY, todas las
cumarinas, la fluoresceína y el rojo Texas.
A continuación la invención se aclara con más
detalle a la vista de los ejemplos de ejecución, que están
representados esquemáticamente en las figuras. Las mismas cifras de
referencia en las figuras individuales designan los mismos
elementos. En detalle son:
Figura 1 una representación esquemática del
principio fundamental de la reacción de detección;
Figura 2 una representación esquemática del
transcurso de la transferencia fotoinducida de electrones;
Figura 3 una representación esquemática del
principio fundamental de alguna variante de la reacción de
detección;
Figura 4 una representación esquemática de la
reacción de detección según la figura 4 con un marcado múltiple;
y
Figura 5 fórmulas estructurales de los
colorantes citados.
Primer
ensayo
La figura 1 muestra esquemáticamente el
principio de la detección de una endopeptidasa, la cual está
representada en la figura 1 mediante el símbolo de unas tijeras.
Como substrato sirve el péptido que consta de cuatro aminoácidos
(AS) y triptófano (Trp).
En el segundo aminoácido de la izquierda está
copulada una molécula de colorante (colorante), de preferencia el
MR 121. Las posibilidades de copulación están descritas en
[Bodansky M: "Peptide Chemistry: A Practical Textbook"
("Química de los péptidos: un libro de texto práctico"),
editorial Springer 1986] [Anderson GW, Zimmerman JE, Callahlan FM:
"The use of esters of N-hidroxysuccinimide in
Peptide Síntesis" ("Empleo de ésteres de la N-
hidroxisuccinimida en la síntesis de peptidos"), J. Am. Chem.
Soc. 1964, 86, 1839-1842].
Cuando se desea detectar por ejemplo la
endopeptidasa tripsina, la cual hidroliza la unión peptídica entre
dos argininas, entonces se puede sintetizar el siguiente péptido
como sustrato: Gln-Lys(MR
121)-Arg-Arg-Trp,
como se muestra esquemáticamente en la figura 1.
El triptófano actúa como extintor sobre el
colorante. El mecanismo de la extinción es una extinción estática
al contrario de una extinción dinámica de choque. El colorante
forma con el triptófano un complejo, llamado complejo de estado
fundamental, el cual apenas tiene fluorescencia. En este complejo
de estado fundamental tiene lugar una transferencia de electrones
del triptófano a la molécula de colorante excitada.
A continuación se aclara brevemente la
transferencia de electrones a la vista de la figura 2. En ella se
representa la extinción de la fluorescencia de la molécula excitada
de colorante F* por un radical triptófano W. los círculos negros
representan electrones. Están representados cada vez el HOMO
(highest occupied molecular orbital) ("orbital molecular ocupada
al máximo") y el LUMO (lowest unoccupied molecular orbital)
("orbital molecular ocupada al mínimo"). El HOMO es el orbital
molecular ocupado, energéticamente más alto, en un estado
electrónico fundamental. El LUMO es el orbital molecular no
ocupado, energéticamente más bajo, en un estado electrónico
fundamental; es decir, por regla general es el orbital molecular
que es ocupado en el primer estado excitado.
Principalmente existen dos posibilidades de
extinción de la fluorescencia mediante transferencia fotoinducida
de electrones. En el caso representado a la izquierda de la figura
2, el radical triptófano W actúa como expendedor de electrones
(dador). Después de la excitación del fluoróforo F*, un electrón
pasa desde el doblemente ocupado HOMO del radical triptófano W al
HOMO del fluoróforo F* ocupado una sola vez (ruta 1). Tiene lugar
una reducción del fluoróforo F* excitado por él radical triptófano
W. El electrón en el LUMO del fluoróforo F* puede pasar a
continuación al HOMO ocupado ahora una sola vez del radical
triptófano W (ruta 2). Este caso se presenta entre los colorantes
rojos como el MR 12 y el triptófano.
En el caso representado en la figura 2, el
radical triptófano W actúa como receptor de electrones (receptor).
A partir del LUMO fácilmente ocupado del fluoróforo F* excitado,
pasa el electrón que allí se encuentra, al LUMO no ocupado del
radical triptófano W (ruta 3). Tiene lugar una oxidación del
fluoróforo F* excitado por el radical triptófano W. El electrón en
el LUMO del radical triptófano W puede regresar a continuación al
HOMO del fluoróforo (ruta 4).
En ambos casos, el electrón, después de la
transferencia de electrones ya no puede regresar más a partir del
LUMO del fluorófero F* excitado, mediante la emisión de un fotón en
el HOMO. El primer estado excitado fue desactivado sin radiación.
La fluorescencia está extinguida.
En el caso de los colorantes rojos en
consideración, el triptófano actúa siempre como un dador de
electrones. Éste conocimiento hace posible, por ejemplo, la
elección de los colorantes adecuados sobre la base de sus
determinados potenciales electroquímicos.
Las señales de fluorescencia se detectan de
preferencia en solución en una cubeta en espectrómetros de
fluorescencia convencionales. Este último se llama generalmente
"ensayo homogéneo". Pueden efectuarse mediciones más sensibles
empleando la espectroscopia confocal.
En lugar de la intensidad de la fluorescencia,
es posible emplear el tiempo de vida de la fluorescencia para la
detección. El tiempo de vida de la fluorescencia es más corto en el
estado extinguido que en el estado libre sin extinguir.
Otra posibilidad para detectar un estado
extinguido o sin extinguir, es la medición de los cambios de la
polarización. También las propiedades de polarización de las
emisiones, por ejemplo las señales de fluorescencia, pueden variar
entre un estado extinguido y un estado sin extinguir.
En el segundo y tercer ensayo es también posible
emplear los sistemas FRET, es decir, pares de colorantes que se
extinguen entre sí mediante la energía de transferencia. Estos
muestran a menudo diferentes longitudes de onda en los estados
extinguido y sin extinguir, lo cual puede emplearse para la
detección.
Como fuentes de luz de excitación se prefiere
emplear láser de diodos, o de lo contrario, cualesquiera otros
láseres o lámparas con una longitud de onda adecuada.
Para la determinación del tiempo de extinción de
los fluoróforos se emplean de preferencia láseres de diodos
pulsados.
Similarmente al ensayo llamado homogéneo, existe
también un llamado ensayo heterogéneo. Este indica generalmente la
detección sobre una superficie. Los péptidos o proteínas marcados
con un colorante pueden unirse covalentemente a una superficie en
un extremo -C, un extremo -N, ó mediante residuos de aminoácidos
(por ejemplo cisteína o lisina). Posibles superficies son por
ejemplo superficies de vidrio modificadas (a saber, chips o
biochips) u oscilaciones (eventualmente magnéticas). Para esta
finalidad, las superficies pueden estar recubiertas, por ejemplo,
con polietilenglicoles lineales y/o reticulados, o ácido
hialurónico, para prevenir la adsorción de las moléculas.
Si un aminoácido, mediante el cual el péptido
está unido a la superficie, está localizado en el mismo lado del
sitio de escisión como el colorante, la escisión a través de la
enzima que hay que detectar, tiene el efecto de que el colorante
unido covalentemente a la superficie, permanece rezagado y su
fluorescencia no puede extinguirse allí por más tiempo. La
fluorescencia puede entonces detectarse evanescentemente o por
medio de screenings de la superficie.
También es posible, inmovilizar el péptido sobre
la superficie de tal forma que la enzima mediante la escisión,
rompa justamente la unión entre el colorante y la superficie. La
fluorescencia del colorante no extinguido, puede detectarse entonces
en la solución.
Segundo
ensayo
El segundo ensayo descrito al principio para la
detección de una exopeptidasa, se efectúa completamente de forma
similar al primer ensayo. Las diferencias fueron descritas al
principio.
Tercer
ensayo
La figura 3 es una representación esquemática
del principio de detección de una endopeptidasa como se ha
reivindicado en el tercer ensayo. La endopeptidasa que hay que
detectar está representada en la figura 3A con el símbolo de las
tijeras 10. Como substrato, sirve el péptido, que consta de un
grupo de interrupción (interrupción), dos aminoácidos (AS),
triptófano (Trp) y otro aminoácido (AS), al cual está copulada una
molécula de colorante (colorante), de preferencia MR 121.
La endopeptidasa que hay que detectar 10,
escinde el péptido entre los dos aminoácidos adyacentes AS. Este
separa el grupo de interrupción (interrupción) juntamente con un
aminoácido AS (ver figura 3B). Esto hace posible que la
exopeptidasa 12, la cual está también presente en la solución y que
hasta ahora había sido inhibida para la digestión por el grupo de
interrupción (interrupción), digiera ahora el péptido residual.
La exopeptidasa 12 divide sucesivamente en
primer lugar un aminoácido AS y a continuación el triptófano (Trp).
Esto tiene como consecuencia, que el colorante (colorante) en el
aminoácido remanente (AS) ya no está por más tiempo localizado
espacialmente próximo al triptófano, debido a que el triptófano se
ha difundido por toda la solución. Por esta razón el colorante ya
no es extinguido por más tiempo por el triptófano. Su fluorescencia
puede detectarse como un aumento de la señal en el
espectrómetro.
Para la detección de la HIV proteasa, puede
emplearse el siguiente péptido: (terminal N)Lys(MR
121)-Trp-Ser-Gln-Asn-Tyr-
Pro-Ile-Val-Gln-Pro-Pro
(terminal C). Este péptido contiene la secuencia de identificación
para la escisión mediante la HIV proteasa. Este péptido puede ser
empleado en combinación con la carboxipeptidasa A, la cual no
escinde más allá de la prolina. Por lo tanto los dos residuos de
prolina en el terminal C del péptido de más arriba, sirve como un
grupo de interrupción. La HIV proteasa escinde entre la tirosina y
la prolina. Se obtienen dos fragmentos: Lys(MR
121)-Trp-Ser-Gln-
Asn-Tyr-OH y
Pro-Ile-Val-Gln-Pro-Pro.
El grupo de interrupción se elimina de este modo, y la
carboxipeptidasa A puede digerir el primer fragmento a partir del
terminal C. Con ello, se separan también la lisina marcada con
colorante, y el triptófano. Puede detectarse un aumento de la
fluorescencia.
La figura 4 muestra el tercer ensayo con la
intensificación de la señal mediante un marcado múltiple.
La figura 4A muestra el péptido, como en la
figura 3A, pero con una sucesión alternante de triptófano (Trp) y
un aminoácido marcado con colorante (As + colorante). Si la
endopeptidasa que hay que determinar 10 divide el grupo de
interrupción (interrupción) (ver figura 4B), la exopeptidasa 12
puede digerir el péptido sucesivamente. Con ello, se liberan
sucesivamente (ver figura 4C), el triptófano y el aminoácido libre,
con el colorante unido (AS+colorante). De esta manera, con una
escisión de la endopeptidasa, se libera un gran número de
colorantes, cuya emisión no se extingue por más tiempo. Se produce
por consiguiente, un aumento fuerte y rápido de la señal. Esto
acorta el tiempo de medición incluso para mediciones altamente
sensibles, a minutos o segundos.
Finalmente, la figura 5 muestra la estructura de
los colorantes preferidos empleados, como se mencionaron al
principio.
Claims (20)
1. Un péptido con las siguientes
propiedades:
a) el péptido contiene una secuencia de
identificación de una endopeptidasa (enzima) y puede actuar por lo
tanto como substrato para la enzima, en el cual se produce un sitio
de escisión entre dos aminoácidos mediante la secuencia de
reconocimiento en dicho péptido;
b) el péptido contiene por lo menos un extintor
y por lo menos una fluoróforo;
c) el extintor es el aminoácido triptófano;
d) el fluoróforo es un colorante
fluorescente;
e) el colorante fluorescente es un péptido o una
proteína covalentemente copulable;
f) la fluorescencia del colorante fluorescente
puede ser extinguida por el triptófano mediante una transferencia
de electrones fotoinducidos, en donde el triptófano actúa como
dador de electrones;
g) la secuencia del péptido está formada como
sigue:
h) el extintor está colocado a un lado del sitio
de escisión;
i) el fluoróforo está colocado sobre el otro
lado del sitio de escisión;
j) se obtiene una proximidad espacial
suficiente, entre el extintor y el fluoróforo, en tanto el
substrato no ha sido extinguido todavía mediante la enzima en el
sitio de escisión entre el extintor y el fluoróforo, para
garantizar la posibilidad de una extinción por lo menos
parcialmente de la emisión del fluoróforo;
k) después de la escisión del substrato mediante
la enzima en el sitio de escisión entre el extintor y el
fluoróforo, es posible un claro aumento de la emisión del
fluoróforo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Péptido según la precedente reivindicación,
caracterizado porque el colorante fluorescente es un derivado
de oxazina o un derivado de rodamina.
3. Procedimiento para la detección de una
endopeptidasa (enzima) con los siguientes pasos:
mezclado de un péptido según una de las
reivindicaciones precedentes y la enzima que hay que detectar en
una solución; y
determinación de la fuerza de la emisión del
fluoróforo en la solución.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Dispositivo sobre el cual está inmovilizado
un péptido según la reivindicación 1 ó 2.
5. Dispositivo según la reivindicación
precedente, caracterizado porque
el péptido está inmovilizado sobre el
dispositivo de tal manera que
el fluoróforo después de una escisión mediante
la enzima que hay que detectar sobre la superficie, permanece
inmovilizado, mientras que el extintor ya no está inmovilizado
sobre la superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Péptido con las siguientes propiedades:
a) el péptido contiene por lo menos un grupo que
contiene un extintor y unos fluoróforo en diferentes
aminoácidos;
b) el extintor es el aminoácido triptófano;
c) el fluoróforo es un colorante
fluorescente;
d) el colorante fluorescente es un péptido o una
proteína covalentemente copulable;
e) la fluorescencia del colorante fluorescente
puede ser extinguida mediante el triptófano;
f) la secuencia del péptido está formada como
sigue:
g) se obtiene una suficiente proximidad espacial
entre el extintor y el fluoróforo, en tanto que los aminoácidos que
llevan el extintor o respectivamente el colorante fluorescente no
están todavía separados mediante una exopeptidasa (enzima), para
garantizar la posibilidad de una extinción por lo menos parcial de
la emisión del fluoróforo;
l) después de la separación de los aminoácidos
que llevan el extintor o respectivamente el colorante fluorescente,
mediante la enzima, se garantiza un suficiente alejamiento espacial
entre eventualmente otro extintor y el fluoróforo, para garantizar
por lo menos parcialmente el aumento de la emisión del
fluoróforo.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Péptido según la reivindicación precedente
caracterizada porque el colorante fluorescente es un derivado
de oxazina o un derivado de rodamina.
8. Péptido según una de las dos reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque el extintor es por lo menos
un primer colorante fluorescente; porque el fluoróforo es por lo
menos un segundo colorante fluorescente; porque por lo menos el
primer y segundo colorante fluorescente son covalentemente
copulables al péptido o a la proteína; y
porque por lo menos el primer y el segundo
colorante fluorescente puede extinguirse recíprocamente.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento para la detección de una
exopeptidasa (enzima) con los siguientes pasos:
mezclado de un péptido según una de las tres
precedentes reivindicaciones y la enzima a detectar en una
solu-
ción; y
ción; y
determinación de la fuerza de emisión del
fluoróforo en la solución.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Dispositivo, sobre el cual está inmovilizado
un péptido según una de las reivindicaciones 6 a 8.
11. Dispositivo según la precedente
reivindicación, caracterizado porque el péptido está
inmovilizado sobre el dispositivo de tal manera que
el fluoróforo, después de la escisión mediante
la enzima que hay que detectar, permanece inmovilizado sobre la
superficie, mientras que el extintor ya no está más inmovilizado
sobre la superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Péptido con las siguientes propiedades:
a) en un extremo del péptido está colocado un
grupo el cual inhibe que una exopeptidasa digiera el péptido (grupo
de interrupción);
b) el péptido contiene una secuencia de
identificación de una endopeptidasa (enzima) y la enzima puede por
lo tanto hacer las veces de substrato, en el cual se produce un
sitio de escisión entre dos aminoácidos en la secuencia de
identificación en el péptido;
c) el péptido contiene, considerado a partir del
grupo de interrupción, en la secuencia del péptido en el lado del
sitio de escisión, por lo menos un grupo, el cual contiene un
extintor y un fluoróforo en diferentes aminoácidos;
d) la secuencia del péptido está formada como
sigue:
e) se logra una suficiente proximidad espacial
entre el extintor y el fluoróforo, en tanto los aminoácidos que
llevan el extintor o respectivamente los colorantes fluorescentes
no están todavía separados mediante la exopeptidasa, para
garantizar la posibilidad por lo menos parcialmente de una
extinción de la emisión del fluoróforo;
f) después de la separación de los aminoácidos
que llevan el extintor o respectivamente el colorante fluorescente,
mediante una exopeptidasa, se garantiza un suficiente alejamiento
espacial entre eventualmente otro extintor y el fluoróforo, para
garantizar por lo menos parcialmente un aumento de la emisión del
fluoróforo.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Péptido según la reivindicación precedente,
caracterizado
porque el extintor es el aminoácido
triptófano;
porque el fluoróforo es un colorante
fluorescente;
porque el colorante fluorescente es un péptido o
una proteína covalentemente copulable; y
porque la fluorescencia del colorante
fluorescente puede ser extinguida mediante el triptófano.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Un péptido según la reivindicación
precedente, caracterizado,
porque el colorante fluorescente es un derivado
de oxazina o un derivado de rodamina.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Péptido según la reivindicación 12,
caracterizado
porque el extintor por lo menos es un primer
colorante fluorescente;
porque el fluoróforo por lo menos es un segundo
colorante fluorescente;
porque por lo menos un primer y segundo
colorante fluorescente son covalentemente copulables al péptido o a
la proteína; y
porque se pueden extinguir recíprocamente por lo
menos un primer y un segundo colorante fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un péptido según la precedente
reivindicación, caracterizado,
porque el colorante fluorescente es un derivado
de oxazina o un derivado de rodamina o un derivado de cianina.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Kit
con un péptido según una de las cinco
reivindicaciones precedentes y con por lo menos una
exopeptidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Procedimiento para la detección de una
endopeptidasa con los siguientes pasos:
mezclado de un péptido según una de las
reivindicaciones 12 a 16, por lo menos una exopeptidasa, y la
endopeptidasa que hay que detectar, en una solución; y
determinación de la fuerza de la emisión del
fluoróforo en la solución.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Dispositivo sobre el cual está inmovilizado
un péptido según una de las reivindicaciones 12 ó 16.
20. Dispositivo según la precedente
reivindicación, caracterizado,
porque el péptido está inmovilizado sobre el
dispositivo de tal manera que el fluoróforo después de la escisión
mediante la enzima que hay que determinar permanece inmovilizado
sobre la superficie, mientras que el extintor ya no está más
inmovilizado sobre la superficie.
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