ES2315327T4 - Procedimientos y composiciones para determinar los perfiles de respuesta celular. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar un perfil de respuesta celular para una diana, que comprende: i) introducir una diana en una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido de Beta-lactamasa sin promotor que codifica una Beta-lactamasa, ii) inducir la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o poner en contacto dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana, iii) separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de dicha Beta-lactamasa en respuesta a la etapa (ii), iv) identificar una pluralidad de polinucleótidos genómicos que presentan un incremento o una disminución en la expresión presente en dicha segunda pluralidad de células, en el que un incremento o una disminución en la expresión de cada uno de dichos polinucleótidos genómicos de dicha pluralidad de polinucleótidos proporciona un perfil de respuesta celular relacionado con dicha diana, en el que dicho polinucleótido de Beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector vírico.
Description
Procedimientos y composiciones para determinar
los perfiles de respuesta celular.
La presente solicitud se refiere en general a
procedimientos y a composiciones para la identificación de porciones
útiles y funcionales del genoma y de compuestos para modular dichas
porciones del genoma, en particular la identificación de proteínas
que son reguladas directamente o indirectamente de manera
transposicional y de compuestos para regular dichas proteínas, ya
sea directamente o indirectamente.
La identificación y aislamiento de porciones
útiles del genoma requiere un extenso gasto de tiempo y de recursos
financieros. En la actualidad, muchos proyectos genómicos utilizan
diversas estrategias para reducir los tiempos de clonación y
secuenciación. Aunque los proyectos genómicos expanden rápidamente
la base de datos de material genético, dichos proyectos carecen con
frecuencia de la capacidad de integrar la información con la
biología de la célula u organismo a partir del cual se aislaron los
genes. En algunos casos, las regiones codificantes de genes recién
aislados revelan una homología de secuencias con otros genes de
función conocida. Este tipo de análisis puede proporcionar, en el
mejor de los casos, claves en cuanto a la posible interrelación
entre diferentes genes y proteínas. Los proyectos genómicos en
general, sin embargo, adolecen de la incapacidad de aislar e
identificar rápidamente y directamente genes específicos, todavía
desconocidos, asociados con un proceso o con procesos biológicos
particulares.
La evaluación de la función de genes
identificados a partir de proyectos de secuenciación genómicos
requiere la clonación del gen descubierto en un sistema de
expresión adecuado para un rastreo funcional. La transferencia del
gen descubierto a un sistema de rastreo funcional requiere un gasto
adicional de tiempo y de recursos sin la garantía de que se
seleccionó el sistema de rastreo correcto. Puesto que la función del
gen descubierto es con frecuencia desconocido o únicamente se
conjetura por deducción con respecto a genes estructuralmente
relacionados, el sistema de rastreo seleccionado puede que no
presente ninguna correlación con la función biológica del gen. Por
ejemplo, un gen puede codificar una proteína que es estructuralmente
homóloga al receptor beta-adrenérgico y presentar
una función diferente. Además, si se obtienen resultados negativos
en el rastreo, no se puede determinar fácilmente 1) si el gen o
producto génico no está funcionando apropiadamente en el ensayo de
rastreo o 2) si el gen o producto génico está implicado directamente
o indirectamente en el proceso biológico que se está ensayando
mediante el sistema de rastreo.
Por consiguiente, existe la necesidad de
proporcionar procedimientos y composiciones para aislar rápidamente
porciones de genomas asociadas con un proceso biológico conocido y
de rastrear dichas porciones de genomas para determinar la
actividad sin la necesidad de transferir el gen de interés a un
sistema de rastreo adicional.
La Figura 1 muestra una comparación entre una
aplicación de un gen informador de la técnica anterior con
procedimientos que se describen en la presente memoria, y una forma
de realización de la invención. La técnica anterior utiliza el
informador b-gal y requiere el establecimiento de
clones antes del análisis de expresión. Una forma de realización de
la presente invención hace posible la identificación rápida de
clones de células vivas a partir de grandes poblaciones
multiclonales de células integradas en BLEC (construcciones de
expresión de beta-lactamasa). Esto constituye un
avance importante sobre la técnica anterior, que requiere el
análisis de clones individuales seguido de la recuperación de un
clon seleccionado a partir de una cepa clonal duplicada de células
vivas.
La Figura 2 muestra una representación de la
manera en que una forma de realización de la invención informa la
expresión de una vía en el interior de una célula y se puede
utilizar para un rastreo.
La Figura 3 muestra un mapa plasmídico
esquemático de la BLEC-1.
La Figura 4 muestra el análisis FACS de una
población de clones genómicamente integrados en BLEC. Se representan
gráficamente células individualmente mediante propiedades de
emisión fluorescente a una excitación de 400 nm. El eje x
representa una emisión verde (530 nm). El eje y representa una
emisión azul (465 nm). Las células con una alta relación azul/verde
aparecerán de color azul y las células con una baja relación
azul/verde aparecerán de color verde. A) Población multiclonal no
seleccionada de clones de células RBL-1 integradas
en BLEC. B) Población de clones seleccionados a partir de 3A (R1)
que se cultivaron durante 7 días adicionales y se volvieron a
seleccionar. C) Población procedente de 3B con adición de ionomicina
luM durante 12 horas antes de la selección.
La presente solicitud reconoce que se pueden
utilizar eficazmente polinucleótidos de
\beta-lactamasa en células eucarióticas vivas
para identificar funcionalmente porciones activas de un genoma
asociadas directamente o indirectamente con un proceso biológico.
La presente solicitud reconoce asimismo por primera vez que se
puede medir la actividad de \beta-lactamasa
utilizando sustratos penetrantes de membranas en células vivas
incubadas con un producto químico de ensayo que interacciona
directamente o indirectamente con una porción del genoma que
presenta un polinucleótido de \beta-lactamasa
integrado. La presente solicitud, por tanto, hace posible la
identificación y el aislamiento rápidos de polinucleótidos genómicos
indirectamente o directamente asociados con un proceso biológico
definido y la identificación de compuestos que modulan dichos
procesos y regiones del genoma. Han sido asimismo descritos en el
documento WO 97/06277 procedimientos y composiciones para estimar
la especificidad fisiológica de los fármacos candidatos. Debido a
que se hace posible la identificación de polinucleótidos genómicos
activos en células vivas, se puede llevar a cabo una caracterización
funcional adicional utilizando las mismas células, y opcionalmente,
el mismo ensayo de rastreo. La capacidad de rastrear funcionalmente
inmediatamente después de la rápida identificación de una porción
funcionalmente activa de un genoma, sin necesidad de transferir la
porción identificada del genoma a un sistema de rastreo secundario,
representa, entre otras cosas, una ventaja clara sobre una
aplicación de un gen informador de la técnica anterior con los
procedimientos que se describen en la presente memoria, tal como se
representa en la Figura 1.
La solicitud proporciona un procedimiento para
identificar porciones de un genoma, por ejemplo, polinucleótidos
genómicos, en una célula viva utilizando un polinucleótido que
codifica una proteína con actividad de
\beta-lactamasa que se puede detectar con un
sustrato de \beta-lactamasa penetrante de
membranas. El procedimiento consiste en insertar un polinucleótido
que codifica una proteína con actividad de
\beta-lactamasa en el genoma de un organismo
utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que se
desarrolle en el futuro o descrito en la presente memoria. Se
utilizará habitualmente una construcción de expresión de
\beta-lactamasa para integrar un nucleótido de
\beta-lactamasa en un genoma eucariótico, como se
describe en la presente memoria. La célula, tal como una célula
eucariótica, se pone en contacto usualmente con una concentración
predeterminada de un modulador, ya sea antes o después de la
integración del polinucleótido de \beta-lactamasa.
La actividad de \beta-lactamasa se mide a
continuación usualmente en el interior de la célula viva,
preferentemente con sustratos fluorescentes de
\beta-lactamasa penetrantes de membranas que son
transformados por la célula en sustratos de
\beta-lactamasa no penetrantes de membranas como
se describe en la presente memoria.
La solicitud proporciona asimismo un
procedimiento para identificar proteínas o compuestos que modulan
directamente o indirectamente un polinucleótido genómico.
Generalmente, el procedimiento comprende insertar una construcción
de expresión de \beta-lactamasa en un genoma
eucariótico, habitualmente no de levadura, contenido en por lo
menos una célula viva, poner en contacto la célula con una
concentración predeterminada de un modulador, y detectar la
actividad de \beta-lactamasa en la célula.
La solicitud proporciona asimismo un
procedimiento para rastrear compuestos con un polinucleótido
genómico activo que comprende: 1) poner en contacto opcionalmente
una población multiclonal de células con un primer compuesto
químico de ensayo antes de separar dichas células mediante un FACS,
2) separar mediante un FACS dicha población multiclonal de células,
en células que expresan \beta-lactamasa y células
que no expresan \beta-lactamasa, en que dichas
células que expresan \beta-lactamasa presentan una
diferencia detectable de propiedades de fluorescencia celular en
comparación con células que no expresan
\beta-lactamasa, 3) poner en contacto cualquier
población de células con el mismo producto químico de ensayo o con
un producto químico de ensayo diferente, y 4) repetir opcionalmente
la etapa (2), en que dicha población multiclonal de células
comprende células eucarióticas que presentan una construcción de
expresión de \beta-lactamasa integrada en un
genoma de dichas células eucarióticas y un sustrato de
\beta-lactamasa penetrante de membranas
transformado en el interior de dichas células en un sustrato de
\beta-lactamasa no penetrante de membranas. Las
etapas de este procedimiento se pueden repetir para hacer posible
una caracterización adicional de clones identificados.
La solicitud incluye asimismo procedimientos
poderosos y composiciones para identificar vías celulares
fisiológicamente relevantes y proteínas de interés de función
conocida, desconocida o parcialmente conocida. Como se muestra en
la FIGURA 2, una vía puede presentar más de una señal intracelular
importante. Se representan dos vías intracelulares importantes
("A" y "B"). Cada vía de señales intracelular puede
presentar asimismo múltiples ramas. Se muestra cada brazo que
presenta tres vías de señalización (A1, A2, y A3; y B1, B2 y B3).
Mediante la generación de una biblioteca de clones con una
construcción de expresión de \beta-lactamasa, se
pueden identificar o informar polinucleótidos genómicos para cada
vía de señales mediante la expresión de
\beta-lactamasa. Las vías no afectadas por el
modulador (mostradas como C1, C2 y C3) son identificadas también con
una construcción de expresión de \beta-lactamasa.
Debido a que el modulador modula únicamente la expresión de las vías
A1, A2, A3, B1, B2 y B3, únicamente se identifican clones que
corresponden a dichos sitios de integración genómicos que son
sensibles al modulador. Los clones que corresponden a los sitios C1,
C2 y C3 permanecen inalterados y no son sensibles al modulador.
Cualquier clon modulado individual se puede aislar inmediatamente,
si no está ya aislado, y se puede utilizar para una prueba de
descubrimiento de fármacos con el fin de rastrear productos
químicos de ensayo para determinar la actividad para modular la vía
informada, como se describe en la presente memoria.
La solicitud comprende asimismo herramientas
para la identificación de vías y el descubrimiento de fármacos que
se pueden aplicar a cierto número de dianas de interés y a áreas
terapéuticas que incluyen proteínas de interés, respuestas
fisiológicas incluso en ausencia de un diana determinada (por
ejemplo respuesta inmunitaria, transducción de señales, función
neuronal y función endocrina), dianas víricas y proteínas
huérfanas.
A menos que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente
memoria tienen el mismo significado que el normalmente entendido por
un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención.
Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los
procedimientos de laboratorio en cultivo de células, genética
molecular, y química de ácidos nucleicos e hibridación que se
describen a continuación son aquéllos que son bien conocidos y que
se emplean normalmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar
para procedimientos de ácidos nucleicos recombinantes, síntesis de
polinucleótidos, y cultivo microbiano y transformación (por
ejemplo, electroporación y lipofección). En general, las reacciones
enzimáticas y las etapas de purificación se realizan según las
especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se
realizan generalmente según procedimientos convencionales de la
técnica y diversas referencias generales (véase en general,
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.), que se proporcionan a lo largo de todo este documento. La
nomenclatura que se utiliza en la presente memoria y los
procedimientos de laboratorio en química analítica, química de
síntesis orgánica, y formulación farmacéutica que se describen a
continuación son aquéllos que son bien conocidos y que se emplean
normalmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para
síntesis químicas, análisis químicos, formulación farmacéutica y
administración, y tratamiento de pacientes. Tal como se emplean a
los largo de la descripción, se entenderá que los siguientes
términos y expresiones, a menos que se indique otra cosa, tendrán
los siguientes significados:
"Resto donador fluorescente" se refiere a
un compuesto o parte de un compuesto fluorogénico (incluyendo un
radical) que puede absorber energía y es capaz de transferir la
energía a otra molécula o parte de un compuesto fluorogénico. Las
moléculas fluorogénicas donadoras adecuadas incluyen, pero sin
limitarse a ellas, cumarinas y colorantes relacionados, colorantes
de xanteno tales como fluoresceínas, rodoles y rodaminas,
resorufinas, colorantes de cianina, bimanes, acridinas, isoindoles,
colorantes de dansilo, hidrazidas aminoftálicas tales como
derivados de isoluminol, aminoftalimidas, aminonaftalimidas,
aminobenzofuranos, aminoquinolinas, dicianohidroquinonas y
complejos de europio y terbio y compuestos relacionados.
"Extintor" se refiere a una molécula
cromófora o parte de un compuesto cromóforo que es capaz de reducir
la emisión procedente de un donador fluorescente cuando está unido
al donador. La extinción puede tener lugar mediante cualquiera de
los varios mecanismos que incluyen transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia, transferencia de electrones
fotoinducida, aumento paramagnético de cruzamiento entre sistemas,
acoplamiento de intercambio Dexter y acoplamiento de excitones tal
como la formación de complejos oscuros.
"Aceptor" se refiere a un extintor que
opera por medio de transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia. Muchos aceptores pueden reemitir la energía
transferida en formas de fluorescencia. Entre los ejemplos se
incluyen cumarinas y fluoróforos relacionados, xantenos tales como
fluoresceínas, rodoles y rodaminas, resorufinas, cianinas,
difluoroboradiazaindacenos y ftalocianinas. Otras clases de
productos químicos de aceptores no reemiten generalmente la energía
transferida. Entre los ejemplos se incluyen índigos, benzoquinonas,
antraquinonas, compuestos azoicos, compuestos nitrados,
indoanilinas, di y trifenilmetanos.
"Colorante" se refiere a una molécula o
parte de un compuesto que absorbe frecuencias específicas de luz,
que incluye, pero sin limitarse a ella, luz ultravioleta. Los
términos "colorante" y "cromóforo" son sinónimos.
"Fluoróforo" se refiere a un cromóforo que
fluoresce.
"Derivado penetrante de membranas" se
refiere a un derivado químico de un compuesto que aumenta la
permeabilidad de membrana del compuesto. A dichos derivados se les
hace más capaces de atravesar las membranas celulares, es decir
penetrantes de membranas, debido a que los grupos hidrófilos se
enmascaran para proporcionar derivados más hidrófobos. Asimismo,
los grupos enmascarantes están destinados a ser escindidos del
sustrato fluorogénico dentro de la célula para generar el sustrato
derivado en el interior de la célula. Debido a que el sustrato es
más hidrófilo que el derivado penetrante de membranas, éste queda
atrapado ahora dentro de las células.
"Polinucleótido aislado" se refiere a un
polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o sintético o alguna
combinación de los mismos, que en virtud de su origen el
"polinucleótido aislado" (1) no está asociado con la célula en
la que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la
naturaleza, o (2) está unido de manera operable a un polinucleótido
al que no está unido en la naturaleza.
"Proteína aislada" se refiere a una
proteína de origen de ADNc, de ARN recombinante o sintético o alguna
combinación de los mismos, que en virtud de su origen la
"proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas con las
que se encuentra en la naturaleza, o (2) está aislada de la célula
en la se encuentra normalmente o (3) está aislada exenta de otras
proteínas procedentes de la misma fuente celular, por ejemplo,
exenta de proteínas humanas, o (4) es expresada por una célula
procedente de una especie diferente, o (5) no se presenta en la
naturaleza.
"Polipéptido" tal como se utiliza en la
presente memoria como término genérico se refiere a una proteína
nativa, a fragmentos, o a análogos de una secuencia polipeptídica.
Por lo tanto, proteína nativa, fragmentos y análogos son especies
del género polipéptido. Los polipéptidos de
\beta-lactamasa preferidos incluyen aquéllos con
la secuencia polipeptídica representada en la relación de SECUENCIAS
ID. y cualquier otro polipéptido o proteína que presenta una
actividad de \beta-lactamasa similar tal como se
mide mediante uno o más de los ensayos que se describen en la
presente memoria. Polipéptido o proteínas de
\beta-lactamasa pueden incluir cualquier proteína
que presente una actividad suficiente para la detección en los
ensayos que se describen en la presente memoria.
"De origen natural" tal como se utiliza en
la presente memoria, aplicada a un objeto, se refiere al hecho de
que dicho objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo,
un polipéptido o una secuencia polinucleotídica que está presente
en un organismo (incluyendo los virus) que se puede aislar a partir
de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado
intencionadamente por el hombre en el laboratorio, es de origen
natural.
"Unido de manera operable" se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes así descritos se encuentran
en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida.
Una secuencia de control "unida de manera operable" a una
secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de
la secuencia codificante se puede conseguir en condiciones
compatibles con las secuencias de control.
"Secuencia de control" se refiere a
secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la
expresión de secuencias codificantes y no codificantes a las cuales
están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control son
diferentes dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas
secuencias de control comprenden generalmente el promotor, el sitio
de unión ribosómica, y la secuencia de terminación de transcripción;
en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen
promotores y una secuencia de terminación de transcripción. La
expresión "secuencias de control" se pretende que incluya, como
mínimo, componentes cuya presencia puede influir sobre la
expresión, y pueden incluir asimismo componentes adicionales cuya
presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias
de parejas de fusión.
"Polinucleótido" se refiere a una forma
polimérica de nucleótidos con una longitud de por lo menos 10 bases,
ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada
de cualquiera de estos tipos de nucleótido. El término incluye
formas monocatenarias y bicatenarias de ADN. "Polinucleótido
genómico" se refiere a una porción de un genoma.
"Polinucleótido genómico activo" o "porción activa de un
genoma" se refiere a regiones de un genoma cuya regulación se
puede aumentar, disminuir o ambas cosas, ya sea directamente o
indirectamente mediante un proceso biológico. "Directamente",
en el contexto de un proceso o procesos biológicos, se refiere a
una causación directa de un proceso que no requiere etapas
intermedias, causada normalmente por una molécula que se pone en
contacto o se une a otra molécula (del mismo tipo o de diferente
tipo de molécula). Por ejemplo, la molécula A se pone en contacto
con la molécula B, lo cual hace que la molécula B ejerza un efecto X
que forma parte de un proceso biológico. "Indirectamente", en
el contexto de un proceso o procesos biológicos, se refiere a una
causación indirecta que requiere etapas intermedias, causada
normalmente por dos o más etapas directas. Por ejemplo, la molécula
A se pone en contacto con la molécula B para ejercer un efecto X que
a su vez causa un efecto Y.
"Polinucleótido de
\beta-lactamasa" se refiere a un polinucleótido
que codifica una proteína con actividad de
\beta-lactamasa. Preferentemente, la proteína con
actividad de \beta-lactamasa se puede medir en un
FACS a una temperatura de 22º Celsius utilizando un sustrato de
\beta-lactamasa CCF2-AM a un nivel
de aproximadamente 1.000 moléculas de dicha proteína o menos por
cada célula. Más preferentemente, la proteína con actividad de
\beta-lactamasa se puede medir en un FACS a una
temperatura de 22º Celsius utilizando un sustrato de
\beta-lactamasa CCF2-AM a un nivel
de aproximadamente 300 a 1.000 moléculas de dicha proteína por cada
célula. Más preferentemente, la proteína con actividad de
\beta-lactamasa se puede medir en un FACS a una
temperatura de 22º Celsius utilizando un sustrato de
\beta-lactamasa CCF2-AM a un nivel
de aproximadamente 25 a 300 moléculas de dicha proteína por cada
célula. Se pueden utilizar proteínas con actividad de
\beta-lactamasa que requieren más de 1.000
moléculas de dicha proteína por cada célula para la detección con un
FACS a una temperatura de 22º Celsius utilizando un sustrato de
\beta-lactamasa CCF2-AM y que
presentan preferentemente por lo menos el 5% de la actividad de la
proteína con la SEC. ID. nº 1.
"Homología de secuencias" se refiere a la
proporción de coincidencias de bases entre dos secuencias de ácidos
nucleicos o a la proporción de coincidencias de aminoácidos entre
dos secuencias de aminoácidos. Cuando la homología de secuencias se
expresa en forma de un porcentaje, por ejemplo, el 50%, el
porcentaje designa la proporción de coincidencias a lo largo de la
longitud de la secuencia de una secuencia deseada (por ejemplo,
secuencias de \beta-lactamasa, tales como la SEC.
ID. nº 1) que se compara con alguna otra secuencia. Se permiten
lagunas (en cualquiera de las dos secuencias) para maximizar la
coincidencia; se utilizan normalmente longitudes de lagunas de 15
bases o menos, se prefieren 6 bases o menos siendo más preferidas 2
bases o menos. Cuando se utilizan oligonucleótidos como sondas o
tratamientos, la homología de secuencias entre el ácido nucleico
diana y la secuencia oligonucleotídica es generalmente no inferior a
17 coincidencias de bases diana de 20 coincidencias de pares de
bases oligonucleotídicas posibles (85%); preferentemente no inferior
a 9 coincidencias de 10 coincidencias de pares de bases posibles
(90%), y muy preferentemente no inferior a 19 coincidencias de 20
coincidencias de pares de pases
posibles (95%).
posibles (95%).
"Hibridar selectivamente" se refiere a unir
de manera detectable y específica. Los polinucleótidos,
oligonucleótidos y fragmentos de los mismos se hibridan
selectivamente con cadenas de ácidos nucleicos diana, en condiciones
de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de
unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden
utilizar condiciones muy restrictivas para conseguir condiciones de
hibridación selectivas tal como es conocido en la técnica y que se
exponen en la presente memoria. Generalmente, la homología de
secuencias de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos,
oligonucleótidos y fragmentos de los mismos y la secuencia de ácido
nucleico de interés será por lo menos del 30%, y más típicamente con
homologías preferiblemente crecientes de por lo menos
aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70% y 90%.
Típicamente, las condiciones de hibridación y
lavado se realizan con una alta severidad según procedimientos de
hibridación convencionales. Los clones positivos se aíslan y se
secuencian. Para ilustración, y no para limitación, un
polinucleótido de longitud completa que corresponde a la secuencia
de ácido nucleico de SEC. ID. nº 1 se puede marcar y utilizar como
una sonda de hibridación para aislar clones genómicos procedentes
de una biblioteca de dianas apropiada en \lambdaEMBL4 o
\lambdaGEM11 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin);
condiciones de hibridación típicas para rastrear levantamientos de
placas (Benton y Davis (1978) Science 196: 180) pueden ser:
formamida al 50%, 5 x SSC o SSPE, 1-5 x solución de
Denhardt, SDS al 0,1-1%, 100-200
\mug de ADN o ARNt heterólogo sometido a cizallamiento, sulfato
de dextrano al 0-10%, 1 x 10^{5} a 1 x 10^{7}
cpm/ml de una sonda desnaturalizada con una actividad específica de
aproximadamente 1 x 10^{8} cpm/\mug, e incubación a una
temperatura de 42ºC durante aproximadamente 6-36
horas. Las condiciones de prehibridación son esencialmente
idénticas, excepto en que la sonda no está incluida y el tiempo de
incubación se reduce típicamente. Las condiciones de lavado son
típicamente 1-3 x SSC, SDS al
0,1-1%, 50-70ºC con cambio de
solución de lavado a aproximadamente 5-30 minutos.
Se pueden obtener de esta manera secuencias cognadas, incluyendo
secuencias alélicas.
Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si
existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por
ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los
aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para
determinar la coincidencia máxima. Se permiten lagunas (en
cualquiera de las dos secuencias que se están comparando) para
maximizar la coincidencia; se prefieren lagunas de 5 o menos, siendo
más preferidas 2 o menos. Alternativamente y preferentemente, dos
secuencias de proteínas (o secuencias polipeptídicas derivadas de
las mismas con una longitud de por lo menos 30 aminoácidos) son
homólogas, tal como este término se utiliza en la presente memoria,
si presentan una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades
de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz
de datos de mutación y una penalidad por lagunas de 6 o mayor.
Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure,
1972, volumen 5, National Biomedical Research Foundation, páginas
101-110, y el Suplemento 2 a este volumen, páginas
1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son
más preferentemente homólogas si sus aminoácidos son idénticos en
una proporción igual o mayor que el 30% cuando se alinean
óptimamente utilizando el programa ALIGN.
"Corresponde a" se refiere a una secuencia
polinucleotídica que es homóloga (es decir, es idéntica, no
estrictamente relacionada de manera evolutiva) a toda o a una
porción de una secuencia polinucleotídica de referencia, o que una
secuencia polipeptídica es idéntica a toda o a una porción de la
secuencia polipeptídica de referencia. A diferencia de ello, la
expresión "complementario a" se utiliza en la presente memoria
para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda
o a una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia.
Para ilustración, la secuencia nucleotídica "TATAC" corresponde
a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a
una secuencia de referencia "GTATA".
Los siguientes términos y expresiones se
utilizan para describir las correlaciones de secuencias entre dos o
más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de
comparación", "identidad de secuencias", "porcentaje de
identidad de secuencias" e "identidad sustancial". Una
"secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada
como una base para una comparación de secuencias; una secuencia de
referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por
ejemplo, tal como un segmento de una secuencia de ADNc o génica de
longitud completa dada en una relación de secuencias tal como una
SEC. ID. nº 1, o puede comprender una secuencia de ADNc o génica
completa. Generalmente, una secuencia de referencia presenta una
longitud de por lo menos 20 nucleótidos, frecuentemente una
longitud de por lo menos 25 nucleótidos, y con frecuencia unas
longitud de por lo menos 50 nucleótidos. Puesto que dos
polinucleótidos (1) pueden comprender cada uno una secuencia (es
decir, una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que
es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) pueden comprender
además una secuencia que es divergente entre los dos
polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más)
polinucleótidos se realizan típicamente comparando secuencias de los
dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para
identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias.
Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la
presente memoria, se refiere a un segmento conceptual de por lo
menos 20 posiciones de nucleótidos contiguas en la que una secuencia
polinucleotídica se puede comparar con una secuencia de referencia
de por lo menos 20 nucleótidos contiguos y en la que la porción de
la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede
comprender adiciones o deleciones (es decir, lagunas) del 20 por
ciento o inferior en comparación con la secuencia de referencia (que
no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de
las dos secuencias. Se puede llevar a cabo una alineación óptima de
secuencias para alinear una ventana de comparación mediante el
algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl.
Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de
Needleman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la
búsqueda para el procedimiento de similitud de Pearson y Lipman
(1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, mediante
implementaciones informatizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT,
FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release,
7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o
mediante inspección y se selecciona la mejor alineación (es decir,
laque da como resultado el porcentaje más alto de homología sobre
la ventana de comparación) generada mediante los diversos
procedimientos. La expresión "identidad de secuencias"
significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es
decir, sobre una base de nucleótidos a nucleótido) sobre la ventana
de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de
secuencias" se calcula comparando dos secuencias óptimamente
alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número
de posiciones en las cuales se encuentra la base de ácido nucleico
idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para
proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el
número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones
en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y
multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje
de identidad de secuencias. La expresión "identidad
sustancial" tal como se utiliza en la presente memoria designa
una característica de una secuencia polinucleotídica, en la que el
polinucleótido comprende una secuencia que presenta una identidad
de secuencias de por lo menos el 30 por ciento, preferentemente una
identidad de secuencias de por lo menos del 50 al 60 por ciento,
más usualmente una identidad de secuencias de por lo menos el 60
por ciento en comparación con una secuencia de referencia sobre una
ventana de comparación de por lo menos 20 posiciones de
nucleótidos, frecuentemente sobre una ventana de por lo menos 25 a
50 nucleótidos, en el que el porcentaje de identidad de secuencias
se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia
polinucleotídica que puede incluir deleciones o adiciones que
totalizan el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia
sobre la ventana de comparación.
Tal como se aplica para polipéptidos, la
expresión "identidad sustancial" significa que las dos
secuencias peptídicas, cuando son alineadas óptimamente, tal como
mediante el programa GAP o BESTFIT utilizando falta de pesos por
lagunas, comparten una identidad de secuencias de por lo menos el 30
por ciento, preferentemente una identidad de secuencias de por lo
menos el 40 por ciento, más preferentemente una identidad de
secuencias de por lo menos el 50 por ciento, y muy preferentemente
una identidad de secuencias de por lo menos el 60 por ciento.
Preferentemente, las posiciones de restos, que no son idénticas, se
diferencian por sustituciones de aminoácidos conservadores. La
expresión sustituciones de aminoácidos conservadores se refiere a la
intercambiabilidad de restos que presentan cadenas laterales
similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que presentan
cadenas laterales alifáticas está constituido por glicina, alanina,
valina. leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que presentan
cadenas laterales de hidroxilo alifático está constituido por serina
y treonina; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales
que contienen amida está constituido por asparagina y glutamina; un
grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales aromáticas está
constituido por fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de
aminoácidos que presentan cadenas laterales básicas está constituido
por lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que
presentan cadenas laterales que contienen azufre está constituido
por cisteína y metionina. Los principales grupos de sustitución de
aminoácidos conservadores preferidos son:
valina-leucina-isoleucina,
fenilanilina-tirosina,
lisina-arginina, alanina-valina,
ácido glutámico-ácidoaspártico y
asparagina-glutamina.
"Fragmento de polipéptido" se refiere a un
polipéptido que presenta una deleción de terminal amino y/o de
terminal carboxi, pero en el que la secuencia de aminoácidos
restante es normalmente idéntica a las correspondientes posiciones
en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una
secuencia de ADNc de longitud completa (por ejemplo, la secuencia
mostrada en SEC. ID. nº 1). "Fragmento de polipéptidos de
\beta-lactamasa" se refiere a un polipéptido
que está constituido por un segmento de por lo menos 25 aminoácidos
que presenta una identidad sustancial con una porción de la
secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la SEC. ID. nº 1 y
que presenta por lo menos una de las siguiente propiedades: (1)
unión específica a un sustrato de \beta-lactamasa,
preferentemente cefalosporina, en condiciones de unión adecuadas, o
(2) la capacidad de efectuar una actividad enzimática,
preferentemente una actividad de escisión de la cadena principal de
cefalosporina, cuando se expresa en una célula de mamífero.
Típicamente, los polipéptidos análogos comprenden una sustitución de
aminoácido conservador (o adición o deleción) con respecto a la
secuencia de origen natural. Los análogos presentan típicamente una
longitud de por lo menos 300 aminoácidos, preferentemente una
longitud de por lo menos 500 aminoácidos o superior, presentando
muy usualmente una longitud tan grande como un polipéptido de origen
natural de longitud completa.
"Modulación" se refiere a la capacidad para
aumentar o inhibir una propiedad funcional de una actividad o
proceso biológico (por ejemplo, actividad enzimática o unión a
receptores). Dicho aumento o inhibición puede depender de la
incidencia de un suceso específico, tal como la activación de una
vía de transducción de señales, y/o se puede manifestar únicamente
en tipos de células particulares.
El término "modulador" se refiere a un
producto químico (de origen natural o de origen no natural), tal
como una macromolécula biológica (por ejemplo, ácido nucleico,
proteína, un no péptido o una molécula orgánica), o un extracto
preparado a partir de materiales biológicos tales como bacterias,
plantas, hongos, o células o tejidos de animales (en particular de
mamíferos). Los moduladores se evalúan típicamente para determinar
su actividad potencial como inhibidores o activadores (directamente
o indirectamente) de un proceso o procesos biológicos (por ejemplo,
agonista, antagonista parcial, agonista parcial, antagonista, agente
antineoplásico, agente citotóxico, inhibidores de transformación
neoplásica o de proliferación celular, agentes promotores de
proliferación celular y otros similares) mediante inclusión en
ensayos que se describen en la presente memoria. La actividad de un
modulador puede ser conocida, desconocida o parcialmente
conocida.
La expresión "producto químico de ensayo"
se refiere a un producto químico que se ha de ensayar mediante uno
o más procedimientos de la invención como modulador supuesto. No es
conocido normalmente que un producto químico de ensayo se una a una
diana de interés. La expresión "producto químico de control" se
refiere a un producto químico que es conocido que se une a la diana
(por ejemplo, un conocido agonista, antagonista, agonista parcial o
agonista inverso). Dichos productos químicos de control incluyen
productos químicos que 1) disgregan no específicamente o
sustancialmente la estructura de la proteína (por ejemplo, agentes
desnaturalizantes (por ejemplo urea o guanidio), agentes
carotrópicos, reactivos con sulfhidrilo (por ejemplo, ditiotritol y
\beta-mecaptoetanol) y proteasas), 2) inhiben
generalmente el metabolismo celular (por ejemplo, desacopladores
mitocondriales) y 3) interrumpen no específicamente interacciones
electrostáticas o hidrófobas de una proteína (por ejemplo, altas
concentraciones salinas, o detergentes en concentraciones
suficientes para interrumpir no específicamente interacciones
hidrófobas). Preferentemente, un "producto químico de ensayo"
no es un producto que es conocido que son inadecuados para un uso
terapéutico para una indicación particular debido a la toxicidad al
sujeto. Normalmente, se utilizan diversas concentraciones
predeterminadas de productos químicos de ensayo para rastrear,
tales como 0,01 \muM, 0,1 \muM, 1,0 \muM y 10,0 \muM.
El término "diana" se refiere a una entidad
bioquímica implicada en un proceso biológico. Preferentemente, las
dianas son proteínas que desempeñan un papel útil en la fisiología o
biología de un organismo. Un producto químico terapéutico se une a
la diana para modificar o modular su función. Tal como se utiliza en
la presente memoria, las dianas pueden incluir receptores de
superficies celulares, Proteínas G, quinasas, canales de iones,
fosfolipasas y otras proteínas que se mencionan en la presente
memoria.
El término "marca" o "marcado" se
refiere a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo,
mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión
a un polipéptido de restos biotinilados que se pueden detectar
mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene
un marcador fluorescente o una actividad enzimática que se puede
detectar por procedimientos ópticos o colorimétricos). Son conocidos
en la técnica, y se pueden utilizar diversos procedimientos para
marcar polipéptidos y glicoproteínas. Ejemplos de marcadores para
polipéptidos incluyen, pero sin limitarse a ellos, los siguientes:
radioisótopos (por ejemplo, ^{3}H, ^{14}C, ^{35}S, ^{125}I,
^{131}I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina y
luminóforos lantánidos), marcadores enzimáticos (o genes
informadores) (por ejemplo, genes informadores enzimáticos,
peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa,
luciferasa y fosfatasa alcalina; y genes informadores no
enzimáticos (por ejemplo, proteínas fluorescentes)), grupos
biotinilados quimioluminiscentes, epítopos polipeptídicos
predeterminados reconocidos por un informador secundario (por
ejemplo, secuencias de pares de cremallera se leucina, sitios de
unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metales,
identificadores de epítopos). "Sustancialmente puro" se refiere
a una especie objeto que es la especie predominante presente (es
decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra
especie individual en la composición), y preferentemente una
fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la
especie objeto comprende por lo menos aproximadamente el 50 por
ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares
presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura
comprenderá una proporción superior a aproximadamente el 80 por
ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la
composición, más preferentemente superior a aproximadamente el 85%,
90%, 95% y 99%. Muy preferentemente, la especie objeto se purifica
hasta esencialmente homogeneidad (no se pueden detectar especies
contaminantes en la composición mediante procedimientos de detección
convencionales) en que la composición consiste esencialmente en una
única especie macromolecular.
"Agente farmacéutico o fármaco" se refiere
a un producto químico o composición capaz de inducir un efecto
terapéutico deseable cuando es administrado apropiadamente (por
ejemplo, utilizando la cantidad y la modalidad de administración
apropiadas) a un paciente.
Se utilizan en la presente memoria otros
términos de química según la utilización convencional en la técnica,
tal como se ejemplifica por The McGraw-Hill
Dictionary of Chemical Terms (compilado por Parker, S., 1985),
McGraw-Hill, San Francisco).
La presente solicitud reconoce que se pueden
utilizar eficazmente polinucleótidos de
\beta-lactamasa en células eucarióticas no de
levaduras para identificar funcionalmente porciones activas de un
genoma asociadas directamente o indirectamente con un proceso
biológico. La presente solicitud reconoce asimismo por primera vez
que la actividad de \beta-lactamasa se puede medir
utilizando sustratos penetrantes de membranas en células vivas
incubadas con un producto químico de ensayo que interacciona
directamente o indirectamente con una porción del genoma que
presenta un polinucleótido de \beta-lactamasa
integrado. La presente solicitud, por lo tanto, permite la
identificación y el aislamiento rápidos de polinucleótidos genómicos
asociados indirectamente o directamente con un proceso biológico
definido y la identificación de compuestos que modulan dichos
procesos y regiones del genoma. Debido a que se hace posible la
identificación de polinucleótidos genómicos activos en células
vivas, se puede llevar a cabo una caracterización funcional
adicional utilizando las mismas células, y opcionalmente, el mismo
ensayo de rastreo. La capacidad de rastrear funcionalmente
inmediatamente después de la rápida identificación de una porción
funcionalmente activa de un genoma, sin necesidad de transferir la
porción identificada del genoma a un sistema de rastreo secundario,
representa, entre otras cosas, una ventaja clara sobre una
aplicación de un gen informador de la técnica anterior y
procedimientos que se describen en la presente memoria, tal como se
muestra en la Figura 1.
La solicitud comprende varios aspectos generales
y útiles, que incluyen:
- 1)
- un procedimiento para la identificación de genes o productos génicos asociados directamente o indirectamente (por ejemplo, regulados) con un proceso biológico de interés (que puede ser modulado mediante un compuesto) utilizando un polinucleótido genómico unido de manera operable a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa,
- 2)
- un procedimiento para la identificación de proteínas (por ejemplo, proteínas huérfanas o proteínas conocidas) o compuestos que modulan directamente o indirectamente (por ejemplo, activan o inhiben la transcripción) un polinucleótido unido de manera operable a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa.
- 3)
- un procedimiento de rastreo para un polinucleótido genómico activo (por ejemplo, un intensificador, promotor o región codificante en el genoma) que puede estar asociado directamente o indirectamente (por ejemplo regulado) con un proceso biológico de interés (que puede ser modulado por un compuesto) utilizando un polinucleótido genómico unido de manera operable a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa que puede ser detectada por FACS utilizando un sustrato fluorescente de \beta-lactamasa penetrante de membranas,
- 4)
- células eucarióticas con un polinucleótido genómico unido de manera operable a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa, y
- 5)
- polinucleótidos relacionados con los procedimientos y células anteriormente mencionados.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos aspectos, así como otros que se describen
en la presente memoria, se pueden alcanzar utilizando los
procedimientos y composiciones de materiales que se describen en la
presente memoria. se reconocerá además que diversos aspectos se
pueden combinar para preparar formas de realización deseables. Por
ejemplo, un procedimiento para la identificación de compuestos que
modulan polinucleótidos genómicos activos unidos de manera operable
a una proteína con actividad de \beta-lactamasa
que se puede detectar por FACS utilizando un sustrato fluorescente
de \beta-lactamasa penetrante de membranas.
Está previsto un procedimiento para la
identificación de porciones de un genoma, por ejemplo
polinucleótidos genómicos, en una célula viva utilizando un
polinucleótido que codifica una proteína con actividad de
\beta-lactamasa que se puede detectar con un
sustrato de \beta-lactamasa penetrante de
membranas. típicamente, el procedimiento consiste en insertar un
polinucleótido que codifica una proteína con actividad de
\beta-lactamasa en el genoma de un organismo
utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica,
desarrollado en el futuro o descrito en la presente memoria.
Usualmente, se utilizará una construcción de expresión de
\beta-lactamasa para integrar un polinucleótido
de \beta-lactamasa en un genoma eucariótico, tal
como se describe en la presente memoria. La célula, tal como una
célula eucariótica, se pone en contacto normalmente con una
concentración predeterminada de un modulador, ya sea antes o
después de la integración del polinucleótido de
\beta-lactamasa. La actividad de
\beta-lactamasa se mide a continuación usualmente
en el interior de la célula viva, preferentemente con sustratos
fluorescentes de \beta-lactamasa penetrantes de
membranas que son transformados por la célula en sustratos de
\beta-lactamasa no penetrantes de membranas tal
como se describe en la presente memoria y en la publicación PCT nº
WO96/30540 publicada el 3 de octubre de 1996, de Tsien et
al.
Una vez que los polinucleótidos de
\beta-lactamasa están integrados en el genoma de
interés, éstos quedan bajo el control transcripcional del genoma de
la célula huésped. La integración en el genoma es normalmente
estable, tal como se describe en la presente memoria y es conocida
en la técnica. El control transcripcional del genoma resulta con
frecuencia de la activación de un receptor (por ejemplo, un receptor
intracelular o de superficie celular), que puede regular sucesos
transcripcionales y traduccionales para cambiar la cantidad de
proteína presente en la célula. La cantidad de proteína presente con
actividad de \beta-lactamasa se puede medir por
medio de su acción enzimática sobre un sustrato. Normalmente, el
sustrato es una molécula pequeña no cargada que, cuando se añade a
la solución extracelular, puede penetrar la membrana plasmática
para encontrar la enzima. Se puede emplear asimismo una molécula
cargada, pero las cargas son enmascaradas generalmente por grupos
que serán escindidos por enzimas o procesos celulares endógenos o
heterólogos. (por ejemplo, ésteres escindidos por esterasas
citoplasmáticas). Tal como se describe más completamente en la
presente memoria y en la publicación PCT nº WO 96/30540 publicada
el 3 de octubre de 1996, de Tsien et al., la utilización de
sustratos que presentan cambios en sus espectros fluorescentes al
efectuar interacción con una enzima, es particularmente deseable.
En algunos ensayos, el sustrato fluorogénico se convierte en un
producto fluorescente por la actividad de
\beta-lactamasa. Alternativamente, el sustrato
fluorescente cambia las propiedades de fluorescencia en la
conversión por la actividad de \beta-lactamasa.
Preferentemente, el producto deberá ser muy fluorescente para
obtener una señal máxima, y muy polar, para permanecer atrapado en
el interior de la célula.
Se pueden utilizar vectores, tales como vectores
víricos y plasmídicos, para introducir genes o material genético de
la invención en células, preferentemente mediante integración en el
genoma de la célula huésped. Dichos vectores víricos pueden
consistir en cualquiera de los virus apropiados, tales como
retrovirus, adenovirus, virus asociados con adenovirus,
papilomavirus, herpes virus, o cualquier virus ecotrópico o
anfitrópico, preferentemente un retrovirus. Los virus pueden ser,
por ejemplo, retrovirus o cualquier otro virus modificado para que
sea replicativamente deficiente, citomegalovirus, virus de leucemia
de Friend, VIS, VIH, virus de sarcoma de Rouse, o virus de Maloney,
tal como virus de leucemia murina de Maloney.
Los vectores, tales como los vectores de
retrovirus, pueden codificar una proteína selectiva operable de tal
como que las células que han sido transformadas pueden ser
seleccionadas positivamente. Dicha proteína selectiva puede
consistir en factores de resistencia a antibióticos, tales como
resistencia a neomicina, tales como NEO. Alternativamente, se
pueden seleccionar negativamente células utilizando una enzima, tal
como timidina quinasa de virus de herpes simplex (HSVTK) que
transforma una protoxina en una toxina. Hay disponibles vectores
víricos, tales como vectores retrovíricos que son adecuados para
estos propósitos, tales como el vector PSIR (disponible en Clon
Tech de California con células de empaquetado PT67) GgU3Hisen y hay
disponibles variantes GgTNKneoU3 y GgTKNeoen de virus de leucemia
murina de Maloney. Se pueden realizar modificaciones de vectores
que hacen posible una integración más eficaz en el genoma de la
célula huésped. Dichas modificaciones incluyen secuencias que
favorecen la integración o procedimientos conocidos para promocionar
el transporte de ácido nucleico dentro del núcleo de la célula
huésped. Se pueden utilizar asimismo vectores víricos como los que
se describen en la patente US nº 5.364.783 de Ruley y von Melchner
para aumentar la eficacia de la transfección.
Se pueden utilizar asimismo vectores con
liposomas u otras vesículas que pueden transportar material genético
al interior de una célula. Las estructuras apropiadas son conocidas
en la técnica. Los liposomas pueden incluir vectores tales como
plásmidos o cromosomas artificiales de levaduras (YAC), que pueden
incluir material genético para ser introducido en la célula. Se
pueden introducir asimismo plásmidos en células mediante cualquiera
de los procedimientos conocidos, tales como electroporación, fosfato
de calcio o lipofección. Se pueden utilizar asimismo fragmentos de
ADN, sin un plásmido o vector vírico.
En un aspecto de la presente invención, se
utilizan vectores para introducir genes informadores en células.
Cuando el gen informador se integra en el genoma de una célula diana
de tal modo que el gen informador se expresa, dicho suceso se puede
detectar detectando el gen informador. Se pueden utilizar clones que
expresan el gen informador en una amplia diversidad de condiciones
para una diversidad de propósitos, incluyendo el descubrimiento de
genes y fármacos. Cromosomas identificados con construcciones de
expresión de \beta-lactamasa se pueden transferir
a células de recepción deseadas utilizando procedimientos
establecidos en la técnica.
Los polinucleótidos de
\beta-lactamasa se pueden disponer sobre una
diversidad de plásmidos para la integración en un genoma y para
identificar genes procedentes de una gran diversidad de organismos
(Gorman, C.M. et al., Mol. Cell. Biol. 2:
1044-1051 (1982); Alam, J. y Cook, J.L., Anal.
Biochem. 188:245-254, (1990)). Se utilizan técnicas
estándar para introducir estos polinucleótidos en una célula o un
organismo entero (por ejemplo, tal como se describe por Sambrook,
J., Fritsch, E.F. y Maniatis T. en Expression of cloned genes in
cultured mammalian cells. En: Molecular Cloning, compilado por
Nolan, C. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Se pueden utilizar marcadores de resistencia para seleccionar
células satisfactoriamente transfectadas.
Si se selecciona una construcción de expresión
de \beta-lactamasa para integrar un polinucleótido
de \beta-lactamasa en un genoma eucariótico, ésta
contendrá normalmente por lo menos un polinucleótido
\beta-lactamasa unido de manera operable a un
aceptor de empalme y opcionalmente a un donador de empalme.
Alternativamente, el polinucleótido de
\beta-lactamasa puede estar unido de manera
operable a cualquier medio para integrar un polinucleótido en un
genoma, preferentemente para la integración en un intrón de un gen
para producir un producto de traducción en el marco. La
construcción de expresión de \beta-lactamasa puede
comprender opcionalmente, dependiendo de la aplicación, un elemento
de IRES, un donador de empalme, un sitio poli A, un sitio de partida
traduccional (por ejemplo una secuencia Kozak) una LTR (repetición
terminal larga) y un marcador seleccionable.
Preferentemente, los polinucleótidos de
\beta-lactamasa codifican una forma citosólica de
una proteína con actividad de \beta-lactamasa.
Esto proporciona la ventaja de atrapar la proteína de
\beta-lactamasa normalmente secretada en el
interior de la célula, lo cual aumenta la relación de señal a ruido
de la señal asociada con actividad de
\beta-lactamasa. Normalmente, esto se efectúa
eliminando o inhabilitando la secuencia de señal normalmente
presente para la secreción. Tal como se utiliza en la presente
memoria, "proteína citosólica con actividad de
\beta-lactamasa" se refiere a una proteína con
actividad de \beta-lactamasa que carece de las
secuencias de aminoácidos apropiadas para la secreción a partir de
la célula, por ejemplo, la secuencia de señal. Por ejemplo, en el
polipéptido de la SEC. ID nº 1, la secuencia de señal ha sido
sustituida con los aminoácidos Met-Ser. De acuerdo
con ello, al efectuar la expresión, la actividad de
\beta-lactamasa permanece en el interior de la
célula. Para la expresión en células de mamíferos, es preferible
utilizar polinucleótidos de \beta-lactamasa con
secuencias nucleotídicas preferidas por células de mamíferos. En
algunos casos, se puede utilizar una forma secretada de
\beta-lactamasa con los procedimientos y
composiciones de la invención. En particular, los genes que
presentan secuencias que dirigen la selección se pueden identificar
con un ensayo de \beta-lactamasa. Esto permite
asimismo una multiplicación basada en la localización directa de
\beta-lactamasa.
Las proteínas con actividad de
\beta-lactamasa pueden ser cualesquiera de las
conocidas en la técnica, que se desarrollen en el futuro o
descritas en la presente memoria. Esto incluye, por ejemplo, las
enzimas representadas por las SEC. ID. n^{os} descritas en la
presente memoria. Los ácidos nucleicos que codifican proteínas con
actividad de \beta-lactamasa se pueden obtener
mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo,
mediante reacción de cadenas de polimerasa de ADNc utilizando
cebadores basados en la secuencia de ADN en la SEC. ID. nº 1. Se
describen procedimientos PCR, por ejemplo, en la patente US nº
4.683.195; Mullis et al., (1987) Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol. 51: 263; y Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton
Press, N.Y. 1989).
La construcción de expresión de
\beta-lactamasa incluye típicamente secuencias
para la integración, especialmente secuencias ideadas para dirigir
o aumentar la integración en el genoma. El aceptor de sitio de
empalme puede estar unido de manera operable al polinucleótido de
\beta-lactamasa para facilitarla expresión al
efectuar la integración en un intrón. Normalmente, se creará un ARN
de fusión con la región codificante de una porción operable
contigua del exón. Una secuencia de aceptor de empalme es una
secuencia en el extremo 3' de un intrón en el que éste se une a un
exón. Las secuencias de consenso para un aceptor de empalme están
constituidas por NTN (TC) (TC) (TC) TTT (TC) (TC) (TC) (TC) (TC)
(TC) NCAGgt. Las secuencias intrónicas están representadas por
letras mayúsculas y la secuencia exónica por letras minúsculas.
Estas secuencias representan las que se conservan de genomas
víricos a genomas de primates.
El sitio donador de empalme puede estar unido de
manera operable al polinucleótido de
\beta-lactamasa para facilitar la integración en
un intrón para promocionar la expresión que requiere una secuencia
de poliadenilación. Normalmente, se crea un ARN de fusión con la
región codificante o no traducida en el extremo 3' del
polinucleótido de \beta-lactamasa. Esto se
prefiere cuando se desea secuenciar la región codificante del gen
identificado. Un donador de empalme es una secuencia en el extremo
5' de un intrón en el que éste se une con un exón. La secuencia de
consenso para una secuencia de donador de empalme es
naggt(ag)aGT. Las secuencias intrónicas están
representadas con letras mayúsculas y las secuencias exónicas por
letras minúsculas. Estas secuencias representan las que se
conservan de genomas víricos a genomas de primates. Este donador de
empalme hace posible la identificación del gen diana utilizando 3'
RACE.
Como una alternativa al sitio donador de
empalme, un sitio poli A puede estar unido de manera operable al
polinucleótido de \beta-lactamasa. Las señales de
poliadenilación, es decir los sitios poli A, incluyen sitios SV40
poli A, tales como los descritos en el Catálogo de Invitrogen de
1996 (California). En algunos casos, puede ser deseable incluir en
la construcción de expresión de \beta-lactamasa un
sitio de partida traduccional. Por ejemplo, un sitio de partida
traduccional hace posible la expresión de
\beta-lactamasa incluso si la integración tiene
lugar en regiones no codificantes. Normalmente, dichas secuencias no
reducirán la expresión de un gen altamente expresado. Los sitios de
partida traduccionales incluyen una "secuencia Kozak" y son
las secuencias preferidas para la expresión en células de mamíferos
descritas por Kozak, M., en J. Cell Biol. 108:
229-241 (1989). La secuencia nucleotídica para una
proteína citosólica con actividad de
\beta-lactamasa en la SEC. ID. nº 3 contiene
secuencias Kozak para los nucleótidos -9 a 4 (GGTACCACCATGA).
Es asimismo preferible, cuando se utilizan
células de mamíferos, incluir un elemento de IRES ("sitio de unión
de entrada de ribosoma interno") en la construcción de expresión
de \beta-lactamasa. Típicamente, un elemento de
IRES mejorará el rendimiento de los clones de expresión. Una
advertencia de los vectores de integración es que únicamente uno en
cada tres inserciones en un intrón estará en el marco y producirá
una proteína informadora funcional. Esta limitación se puede
reducir clonando una secuencia de IRES entre el sitio de aceptor de
empalme y el gen informador (por ejemplo, un polinucleótido de
\beta-lactamasa). Esto elimina restricciones del
marco de lectura y una posible inactivación funcional de la proteína
informadora por fusión con una proteína endógena. Los elementos de
IRES incluyen los procedentes de picornavirus, virus relacionados
con picornavirus, y de hepatitis A y C. Preferentemente, el
elemento de IRES es de un poliovirus. Se pueden encontrar elementos
de IRES específicos, por ejemplo, en el documento WO9611211 de Das y
Coward publicado el 16/4/96, el documento EP 585983 de Zurr
publicado el 7/3/96, el documento WO9601324 de Berlioz publicado el
18/1/96 y el documento WO9424301 de Smith publicado el 27 de
octubre de 1994. Para mejorar la selección de polinucleótidos de
\beta-lactamasa en un genoma, se puede utilizar
un marcador seleccionable en la construcción de expresión de
\beta-lactamasa. Los marcadores seleccionables
para células de mamíferos son conocidos en la técnica, e incluyen
por ejemplo, timidina quinasa, dihidrofolato reductasa (junto con
metotrexato en forma de amplificador de DHFR), aminoglicósido
fosfotransferasa, higromicina B fosfotransferasa, asparagina
sintetasa, adenosina desaminasa, metalo tionieno, y genes
resistentes a antibióticos tales como genes con resistencia a
neomicina. Los marcadores seleccionables para células no de
mamífero son conocidos en la técnica e incluyen genes que
proporcionan resistencia a antibióticos, tales como canamicina,
tetraciclina
y ampicilina.
y ampicilina.
La solicitud se puede poner en práctica
fácilmente en genomas que presentan estructuras intrón/exón. Dichos
genomas incluyen los de mamíferos (por ejemplo, seres humanos,
conejo, ratón, rata, mono, cerdo y vaca), vertebrados, insectos y
levadura. Se utilizan más usualmente vectores dirigidos a intrones
en células de mamíferos como intrones, o secuencias interpuestas,
son considerablemente más grandes que los exones, o regiones
codificantes de ARNm en mamíferos. La dirección a intrones se puede
conseguir clonando un aceptor de empalme o secuencias intrónicas de
3' corriente arriba de un gen de nucleótido de
\beta-lactamasa seguido de una señal de
poliadenilación o un sitio donador de empalme de 5'. Cuando el
vector se inserta en un intrón, el gen informador (por ejemplo,
\beta-lactamasa) se expresa bajo el mismo control
que el gen en el cual ha sido insertado el mismo.
La solicitud se puede poner en práctica asimismo
en genomas que presentan números reducidos, o que carecen, de
estructura intrón/exón. Para eucariotas inferiores, que presentan
una organización genómica sencilla, es decir que contienen pocos y
pequeños intrones, se puede utilizar vectores dirigidos a exones.
Dichos vectores incluyen polinucleótidos de
\beta-lactamasa unidos de manera operable a
secuencias de poliadenilación y opcionalmente a un elemento de
IRES. Hongos de eucariotas inferiores y los eucariotas patógenos
(por ejemplo, parásitos y microorganismos). Para genomas que
carecen de estructuras intrón/exón, se puede utilizar una
integración de enzimas de restricción, una integración inducida por
transposones o una integración de selección para la integración
genómica. Dichos procedimientos incluyen los descritos por Kuspa y
Loomis, PNAS 89: 8803:8807 (1992) y Derbyshire, K.M., Gene 7
noviembre: 143-144 (1995). Los procariotas pueden
ser utilizados con la invención si la integración puede tener lugar
en dichos genomas. Los vectores retrovíricos pueden ser asimismo
utilizados para integrar los polinucleótidos de
\beta-lactamasa en un genoma (por ejemplo,
eucariótico), tal como los procedimientos y la composición
descritos en la patente US nº 5.364.783.
Típicamente, la integración tendrá lugar en las
regiones del genoma que son accesibles para el vector de
integración. Dichas regiones son normalmente porciones activas del
genoma en las que existe una actividad reguladora del genoma
aumentada, por ejemplo, actividad de polimerasa aumentada o un
cambio de la unión de ADN por proteínas que regulan la
transcripción del genoma. Muchas formas de realización de la
invención descritas en la presente memoria pueden dar como
resultado una integración aleatoria, especialmente en regiones
activamente transcritas.
La integración, sin embargo, puede ser dirigida
a regiones del genoma activas durante tipos específicos de
actividad del genoma. Por ejemplo, la integración en sitios en el
genoma que son activos durante fases específicas del ciclo celular
puede promocionarse sincronizando las células en una fase deseada
del ciclo celular. Dichos procedimientos de ciclos celulares
incluyen los conocidos en la técnica, tales como privación de suero
o los factores alfa (para la levadura). La integración se puede
dirigir asimismo a regiones del genoma activos durante la
regulación celular mediante un producto químico, tal como un
antagonista o agonista para un receptor o algún otros producto
químico que aumente o disminuya o module de otro modo la actividad
del genoma. Mediante la adición del producto químico de interés, se
puede aumentar la actividad del genoma, con frecuencia en regiones
especificas para promover la integración de un vector de integración
(por ejemplo, tal como una construcción de gen informador), , en
dichas regiones del genoma.
Por ejemplo, se podría aplicar un activador de
receptor nuclear (general o específico) para activarlas células
antes o durante la integración con el fin de promover la integración
de genes informadores en sitios el genoma que se vuelven más
activos durante la activación de receptores nucleares. Dichas
células se podrían rastrear a continuación con el mismo activador o
con un activador de receptor nuclear diferente para identificar qué
clones y qué porciones del genoma son activos durante la activación
de receptores nucleares. Cualquiera de los agonistas, antagonistas
y moduladores de los receptores descritos en la presente memoria se
pueden utilizar de dicha manera, así como cualquier otro producto
químico que aumente o disminuya la actividad del genoma.
Las células utilizadas corresponderán
típicamente al genoma de interés. Por ejemplo, si se desea
identificar regiones del genoma humano, se utilizarán entonces
generalmente células humanas que contienen un complemento genético
apropiado. Se podrían sesgar bibliotecas, sin embargo, utilizando
células que contienen copias adicionales de ciertos cromosomas u
otras porciones del genoma. Se pueden utilizar asimismo células que
no corresponden al genoma de interés si el genoma de interés o
porciones importantes del genoma de interés se pueden replicar en
las células, tal como preparando un híbrido de ser
humano-ratón.
Adicionalmente, mediante la apropiada selección
de células y proteínas expresadas, se pueden construir ensayos de
identificación y rastreo que detecten porciones activas del genoma
asociadas con un proceso biológico que requiere, en todo o en
parte, la presencia de una proteína particular (proteína de
interés). Se pueden seleccionar células dependiendo del tipo de
proteínas que son expresadas (de manera homóloga o heteróloga) o
procedentes del tipo de tejido a partir del cual se generó
originariamente la línea celular o explante. Si se desea la
identificación de porciones del genoma activadas mediante un tipo
particular de proteína, entonces la célula utilizada deberá
expresar dicha proteína.
Las células pueden expresar la proteína de
manera homóloga, es decir la expresión de la proteína deseada tiene
lugar de modo normal o natural en las células. Alternativamente, las
células se pueden dirigir para expresar una proteína de manera
heteróloga, es decir la expresión de la proteína deseada que no
tiene lugar de modo normal o natural en las células. Dicha
expresión heteróloga se puede dirigir "dando entrada" al gen en
la célula que codifica la proteína deseada o transfectando la
célula con un polinucleótido que codifica la proteína deseada (ya
sea por expresión constitutiva o por expresión inducible). Se
prefiere una expresión inducible si se cree que la proteína de
interés expresada puede ser tóxica para la células.
Se pueden utilizar muchas células. Dichas
células comprenden, de manera no limitativa, las células
embrionarias no humanas, o fetales o adultas. Estas células pueden
ser obtenidas a partir del mesodermo, ectodermo, o endodermo y
pueden ser células madre, tal como células madre adultas o
embrionarias no humanas, o células precursoras adultas. Las
células pueden ser de cualquier linaje, tal como vascular, neural,
cardiaco, fibroblastos, linfocitos, hepatocitos, cardiaco,
hematopoyético, pancreático, epidérmico, mioblastos o miocitos.
Otras células incluyen células de riñón de cría de hámster (BHK)
(ATTC nº CCL 10), células L de ratón (ATTC nº CCLI.3); células
Jurkats (ATTC nº TIB 152) y células 153 DG44 (véase Chasin (1986)
Cell. Molec. Genet. 12:555) células de riñón embriónico humano
(HEK) (ATCC nº CRL 1573), células de ovario de hámster chino (CHO)
(ATCC nº CRL9618, nº CCL61 y nº CRL9096), células PC12 (ATCC nº CRL
17.21) y células COS-7 (ATCC nº CRL 1651). Las
células preferidas incluyen células Jurkat, células CHO, células de
neuroblastomas, células P19, células F11, células
NT-2 y células HEK 293, tales como las descritas en
la patente US nº 5.024.939 y por Stillman et al., Mol. Cell.
Biol, 5: 2051-2060 (1985). Las células preferidas
para la expresión de proteínas heterólogas son las que se pueden
transfectar fácilmente y eficazmente.
Las células utilizadas en la presente invención
pueden ser procedentes de líneas celulares continuas o líneas
celulares primarias obtenidas a partir de, por ejemplo, tejidos,
órganos o fluidos de mamíferos. Se pueden utilizar en la presente
invención secciones de tejidos así como células dispersas. Se pueden
obtener asimismo células a partir de animales transgénicos que han
sido manipulados genéticamente para expresar un gen informador. Se
prefieren células obtenidas a partir de animales transgénicos o no
transgénicos para células que son difíciles de cultivar in
vitro, tales como células neurales y hepáticas. Las líneas
celulares primarias se pueden convertir en continuas utilizando
procedimientos conocidos, tales como fusionando células primarias
con una línea celular continua o expresando proteínas de
transformación. Las células de la invención se pueden almacenar o
utilizar en procedimientos de la invención en forma de poblaciones
clonales aisladas en placas tales como las que se describen en las
solicitudes de patente de los Estados Unidos que pertenecen al mismo
propietario, titulada "Low background multi-well
plates and platforms for spectroscopic measurements" (Coassin
et al., presentada el 2 de junio de 1997), y titulada "Low
background multi-well plates with greater than 864
wells for spectroscopic measurements" "Coassin" et
al., presentada el 2 de junio de 1997). Preferentemente, las
células se almacenan o se utilizan en placas con 96, 384, 1.536 ó
3.456 pocillos por placa. Se puede disponer una única célula o una
pluralidad de células en dichos pocillos. Dichas poblaciones
clonales aisladas presentarán típicamente 1.000, 10.000 ó 100.000 o
más de dichas poblaciones representativas de números sustancialmente
equivalentes de sitios de integraciones independientes. Dichos
paneles se pueden utilizar para el perfilado, identificación de
vías, identificación de moduladores, caracterización de moduladores
y para otros procedimientos de la invención.
Antes de ser transfectadas con un vector de
atrapamiento de la presente invención, las células pueden ser
transfectadas con un gen exógeno capaz de expresar una proteína
exógena, tal como un receptor (por ejemplo, GPCR) o un gen asociado
con la patología de un agente etiológico, tal como un virus, una
bacteria o un parásito. Las células que expresan dichas proteínas
exógenas se pueden transfectar a continuación con un vector de
atrapamiento para formar una biblioteca de clones que se pueden
rastrear. La solicitud da a conocer asimismo animales con
construcciones de expresión de \beta-lactamasa
integradas en el genoma de interés.
Muchas de las células utilizadas pueden informar
la modulación de procesos biológicos mediante una diversidad de
genes informadores adicionales o productos químicos o combinaciones
de los mismos. Por ejemplo, la beta-lactamasa, una
enzima, puede convertir sustratos no cromogénicos en productos
cromogénicos o modificar las propiedades cromogénicas o
fluorescentes de un sustrato tal como CCF2. Además, los informadores
fluorescentes, tales como proteínas fluorescentes, tales como
moléculas de proteína fluorescente verde (GFP), se pueden utilizar
como informadores. Algunas moléculas GFP mutantes presentan
diferentes propiedades fluorescentes en comparación con GFP de tipo
salvaje. Dichas GFP se pueden utilizar como informadores y se pueden
utilizar individualmente o en combinación en la presente invención.
Por ejemplo, las células pueden presentar múltiples informadores
que se pueden diferenciar para informar diferentes procesos
biológicos, o diferentes etapas en un proceso biológico, tales como
etapas en una vía de transducción de señales.
Las proteínas de interés que se pueden expresar
en las células de la invención incluyen: receptores de hormonas
(por ejemplo receptores de mineral corticosteroides,
glucocorticoides y hormonas tiroideas); receptores intracelulares
(por ejemplo, receptores huérfanos, retinoides, de vitamina D3 y de
vitamina A); moléculas de señalización (por ejemplo, quinasas,
factores de transcripción o moléculas tales como transductores de
señales y activadores de transcripción) (Science, volumen 264,
1994, páginas 1.415-1.421; Mol. Cell Biol., volumen
16, 1996, páginas 369-375); receptores de la
superfamilia de citoquinas (por ejemplo eritropoyetina, hormona del
crecimiento, interferones e interleuquinas (distintas de
IL-8) y factores estimuladores de colonias);
receptores acoplados a proteína G, véase la patente US nº 5.436.128
(por ejemplo, para hormonas, calcitonina, epinefrina, gastrina y
mediadores de pancrina o autocrina, tales como estomatostatina o
prostaglandinas) y receptores de neurotransmisores (norepinefrina,
dopamina, serotonina o acetilcolina); receptores de tirosinaquinasa
(tales como factor del crecimiento de insulina, factor del
crecimiento nervioso (patente US nº 5.436.128)). A continuación se
describen adicionalmente ejemplos de utilización de dichas
proteínas.
Cualquier diana, tal como un receptor
intracelular o extracelular implicado en una vía de transducción de
señales, tal como las vías de leptina o GPCR, se puede utilizar en
la presente invención. Además, los genes activados o reprimidos
mediante una diana se pueden aislar, identificar, y los moduladores
de dicho gen se pueden identificar utilizando la presente
invención. Por ejemplo, la presente invención puede identificar una
vía de receptor acoplado a Proteína G (GPCR), determinar su función,
aislar los genes modulados por el GPCR, e identificar moduladores
de dichas proteína moduladas con GPCR.
Como introducción a la biología celular de GPCR,
la activación de G\alpha15 o G\alpha16, a través de una vía de
señalización de proteína G, puede activar PLC\beta, que a su vez
aumenta los niveles de calcio intracelular. Un aumento de los
niveles de calcio puede conducir a la modulación del promotor
"sensible al calcio" que forma parte de un sistema de
detección de transducción de señales, es decir, un promotor que es
activado (por ejemplo, un promotor de NFAT, AP-1) o
inhibido por un cambio de los niveles de calcio. Se describe un
ejemplo de un sitio de unión de ADN de NFAT por Shaw, et
al., en Science: 291:202-205 (1988). De manera
similar, un promotor que es sensible a cambios de los niveles de
proteína quinasa C (por ejemplo, un "promotor sensible a proteína
quinasa C") puede ser modulado por una proteína G\alpha activa
a través de una vía de señalización de proteína G. Las células
seleccionadas descritas en la presente memoria pueden incluir
asimismo un receptor acoplado a proteína G. Se han clonado genes
que codifican numerosos GPCR (Simon et al., Science 252:
802-808 (1991)) y se pueden utilizar técnicas de
biología molecular convencional para expresar un GPCR sobre la
superficie de una célula de la invención. Preferentemente, el
promotor Sum sensible puede permitir únicamente un retardo
relativamente corto (por ejemplo, menos de 90 minutos) entre la
aplicación del GPCR y la activación transcripcional. Un promotor
sensible preferido incluye el factor nuclear de un promotor de
células T activado (Flanagan et al., Nature
352:803-807 (1991). Los polinucleótidos
identificados mediante procedimientos de la invención se pueden
utilizar como elementos de respuesta que son sensibles a señales
intracelulares (elementos de respuesta a señales). Los elementos de
respuesta se pueden utilizar en los ensayos que se describen en la
presente memoria, tales como la identificación de productos
químicos útiles. Dichos elementos de respuesta a señales pueden ser
sensibles a señales intracelulares que incluyen voltaje, pH y
niveles intracelulares de Ca^{++}, ATP, ADP, AMPc, GDT, GDP,
K^{+}, Na^{+}, Zn^{++}, oxígeno, metabolitos e IP3.
En un aspecto de la presente invención, se
pueden transformar células para que expresen un receptor exógeno,
tal como GPCR. Dicha línea celular transducida se puede transducir
entonces adicionalmente con un vector de atrapamiento para preparar
una biblioteca de clones que se pueden utilizar para identificar
células que informan la modulación del receptor exógeno.
Preferentemente, la línea celular huésped no expresaría
apreciablemente el receptor exógeno.
Sobre la base de la estructura singular de los
GPCR, que presentan siete dominios, probablemente de transmembrana,
(véase Watson y Arkinstall, The G-Protein Linked
Receptor Facts Book, Academic Press, Nueva York (1944)) se pueden
identificar GPCR huérfanos (GPCR que no presentan ninguna función
conocida) investigando bases de datos de secuencias, tales como las
proporcionadas por la National Library of Medicine (Bethesda, MD),
para motivos y homologías similares. Se puede utilizar,
naturalmente, esta misma estrategia para cualquier diana,
especialmente cuando se ha determinado una secuencia o motivo
paradigmático.
La función de genes procedentes de virus u otros
patógenos que efectúan la expresión de genes en células, tales como
células de mamíferos, se puede determinar utilizando la presente
invención. Además, se pueden identificar productos químicos que
modulan dichos genes utilizando los procedimientos de la presente
invención. Por ejemplo, muchos virus transformadores, después de
infectar una célula, presentan el efecto de sobrerregular genes
implicados en la proliferación celular, lo cual permite que las
células infectadas con virus produzcan virus adicionales, que
pueden infectar células adicionales. Dichos virus transformadores
pueden actuar estimulando un receptor de la célula diana. Un
ejemplo del mecanismo es el virus de eritroleucemia de Friend. Este
virus utiliza el receptor de eritropoyetina para entrar en las
células. Cuando el virus está unido al receptor, es activada una
vía que causa una sobreproliferación de glóbulos rojos. Si se inhibe
la activación del receptor de eritropoyetina, esto daría como
resultado una reducción de la acumulación de glóbulos rojos que
puede impedir o reducir la gravedad de la leucemia. El desarrollo
de un ensayo que informa la activación de genes diana de mamíferos
hace posible la identificación de moduladores o de otras vías
dependientes de virus o patógenos. Estos moduladores se pueden
utilizar como agentes terapéuticos.
Un procedimiento general para establecer este
ensayo utiliza el virus o una proteína vírica aislada como el
estímulo para modular una vía. En primer lugar, se prepara una
biblioteca de atrapamiento de genes utilizando una línea celular
que puede ser infectada por el virus o activada por la proteína
vírica. El virus se añade a estas células, y se aíslan clones que
responden específicamente a la infección vírica mediante la
expresión de un gen informador.
Como ejemplo, es conocido que la porción de
GP-120 de proteína del VIH presenta un efecto
mitogénico en células expuestas a GP-120, lo cual
indica que las vías de señalización corriente abajo que están siendo
activadas pueden asociarse con la citotoxicidad del virus y
permiten su proliferación. Se pueden aislar clones de células que
son inducidos por esta activación que se puede utilizar para
rastrear moduladores de este efecto citotóxico o proliferativo. Se
pueden utilizar otras proteínas víricas, tales como NEF procedente
de VIH. Los productos químicos que inhiben este efecto pueden
presentar un valor terapéutico útil para tratar una infección o
toxicidad vírica.
Este enfoque se puede aplicar a cualquier
patógeno celular que presenta un efecto sobre células diana, tal
como citotoxicidad, proliferación celular, inflamación u otras
respuestas. Otras dianas etiológicas incluyen otros virus, tales
como retrovirus, adenovirus, papilomavirus, herpes virus,
citomegalovirus, virus asociados con adenovirus, hepatitis virus, y
cualquier otro virus. Además de los virus, se puede utilizar
cualquier otro patógeno tal como parásitos, bacterias y viroides,
en la presente invención. Las dianas víricas particulares incluyen,
pero sin limitarse a ellas, NEF, proteína de hepatitis X, y otras
proteínas víricas, tales como las que pueden ser codificadas o
llevadas por virus. Además, se pueden añadir dos o más componentes
víricos para identificar componentes patógenos covíricos. Esto
constituye una herramienta particularmente valiosa para identificar
vías moduladas por dos o más virus simultáneamente, o en el
transcurso del tiempo, como en afecciones víricas de activación
lenta. Por ejemplo, se puede utilizar una cotransfección con VIH y
CMV. Las dianas o componentes víricos no incluyen oncogenes o
protooncogenes que se encuentran en genomas no infectados y
productos génicos de los mismos.
Las células que comprenden polinucleótidos de
\beta-lactamasa integrados en el genoma se pueden
poner en contacto con productos químicos de ensayo o moduladores de
un proceso biológico y ser rastreados para determinar la actividad.
Normalmente, el producto químico de ensayo que se está rastreando
presentará por lo menos una diana definida, usualmente una
proteína. El producto químico de ensayo se aplica normalmente a las
células para alcanzar una concentración final predeterminada en el
medio que baña las células. Típicamente, los rastreos se llevan a
cabo a concentraciones de 100 uM o inferiores, preferentemente 10 uM
o inferior y preferentemente 1 uM o inferior para rastreos
confirmatorios. Tal como se describe más completamente en la
presente memoria, las células se pueden someter a múltiples ciclos
de rastreo y selección utilizando el mismo producto químico en cada
ciclo para asegurar la identificación de clones con la respuesta
deseada a un producto químico, o con diferentes productos químicos
para caracterizar cuál de los productos químicos produce una
respuesta (ya sea un aumento o una reducción de la actividad de
\beta-lactamasa) en las células. Dichos
procedimientos se pueden aplicar a cualquier producto químico que
modifique la función de cualquiera de las proteínas mencionadas en
la presente memoria o conocidas en la técnica.
Pueden utilizarse asimismo, sin embargo
productos químicos y procesos biológicos sin una diana definida y
rastrearse con las células de la invención. Por ejemplo, una vez se
ha identificado que un clon contiene un polinucleótido genómico
activo que es activado por una señal celular particular (incluyendo
señales extracelulares), por ejemplo por un neurotransmisor, ese
mismo clon se puede rastrear con productos químicos que carecen de
una diana definida para determinar si la activación por el
neurotransmisores bloqueada o aumentada por el producto químico.
Esto constituye un procedimiento particularmente útil para descubrir
dianas terapéuticas corriente debajo de la activación del receptor
(en este caso un neurotransmisor). Dichos procedimientos se pueden
aplicar a cualquier producto químico que modifique la función de
cualquiera de las proteínas mencionadas en la presente memoria o
conocidas en la técnica. Este tipo de ensayo "sin diana" es
particularmente útil como herramienta de rastreo para las
condiciones mediales y las vías descritas en la presente
memoria.
Los procedimientos y composiciones descritos en
la presente memoria ofrecen cierto número de ventajas sobre la
técnica anterior. Por ejemplo, el rastreo de bibliotecas de
integración de genes basados en mamíferos está limitado por la
utilización de sistemas informadores ya existentes. Muchos genes
informadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina secretada,
y luciferasa, no se pueden utilizar para ensayar células vivas
individuales (incluyendo FACS) debido a que el ensayo requiere una
lisis de células para determinar la actividad de genes
informadores. Alternativamente, la
\beta-galactosidasa puede detectarla expresión en
células individuales, pero la carga de sustrato requiere la
permeabilización de células, lo cual puede causar efectos
perjudiciales sobre las funciones celulares normales.
Adicionalmente, las propiedades de sustratos de
\beta-galactosidasa fluorescentes, tales como
fluorescein-di-\beta-D-galactopiranósido,
y los productos hacen muy difícil rastrear grandes bibliotecas para
células expresantes y no expresantes debido al sustrato y el
producto no es bien retenido o no permite un análisis
"ratiométrico" para determinar la cantidad de sustrato no
escindido. Se podría utilizar proteína fluorescente verde (GFP), un
informador no enzimático, para detectar la expresión en células
vivas individuales, pero presenta una sensibilidad limitada. El
nivel de expresión de GFP habría de ser por lo menos de 100.000
moléculas por cada célula para que fuese detectable en un formato de
rastreo y no se podrían medir pequeños cambios o bajos niveles de
la expresión de genes. Además, la GFP es relativamente estable y no
sería adecuada para medir una infrarregulación de genes. Otras
ventajas de la invención se describen en la presente memoria o
serán reconocidas fácilmente por un experto en la materia al
efectuar una revisión de la presente descripción.
La invención proporciona un procedimiento para
la identificación de proteínas o productos químicos que modulan
directamente o indirectamente un polinucleótido genómico.
Generalmente, el procedimiento comprende insertar una construcción
de expresión de \beta-lactamasa en un genoma
eucariótico no de levadura, contenido en por lo menos una célula
viva, poner en contacto la célula con una concentración determinada
de un modulador, y detectar la actividad de
\beta-lactamasa en la célula. Preferentemente, se
mide la escisión de un sustrato de
\beta-lactamasa penetrante de membranas y el
sustrato de \beta-lactamasa penetrante de
membranas se transforma en la célula en un sustrato atrapado.
Preferentemente, la construcción de expresión de
\beta-lactamasa comprende un polinucleótido de
\beta-lactamasa, un donador de empalme, un aceptor
de empalme y un elemento de IRES. El procedimiento puede incluir
asimismo determinar la secuencia de ácido nucleico codificantes de
un polinucleótido unido de manera operable a la construcción de
expresión de \beta-lactamasa utilizando
procedimientos conocidos en la técnica, tales como RACE.
Los moduladores descritos en la presente memoria
se pueden utilizar en este sistema para ensayar un aumento o una
reducción de la actividad de \beta-lactamasa en
clones suficientemente integrados. Dichas células pueden incluir
opcionalmente proteínas específicas de interés tal como se expone en
la presente memoria. Por ejemplo, la célula puede incluir una
proteína o un receptor que es conocido que se une al modulador. (por
ejemplo, un receptor nuclear o un receptor que presenta un dominio
de transmembrana expresado de manera heteróloga u homóloga por la
célula). Se puede añadir un segundo modulador ya sea simultáneamente
o secuencialmente a la célula o células y la actividad de
\beta-lactamasa se puede medir antes, durante o
después de dichas adiciones. Las células se pueden separar sobre la
base de su respuesta al modulador (por ejemplo, sensible o no
sensible) y se pueden caracterizar con cierto número de diferentes
moduladores para crear un perfil de activación o inhibición de las
células.
La actividad de
\beta-lactamasa se medirá con frecuencia en
relación con una muestra de referencia, con frecuencia un testigo.
Por ejemplo, la actividad de \beta-lactamasa se
mide en presencia del modulador y se compara con la actividad de
\beta-lactamasa en ausencia del modulador u
opcionalmente un segundo modulador. Alternativamente, la actividad
de \beta-lactamasa se mide en una célula que
expresa una proteína de interés y en una célula que no expresa la
proteína de interés (usualmente el mismo tipo de célula). Por
ejemplo, puede ser conocido que un modulador se une a un receptor
expresado por una célula y la actividad de
\beta-lactamasa en la célula se aumenta en
presencia del modulador en comparación con la actividad de
\beta-lactamasa detectada en una correspondiente
célula en presencia del modulador, en que la correspondiente célula
no expresa el receptor.
Cuando un gen informador se integra en el genoma
de una célula huésped, de tal modo que el gen informador se expresa
en una diversidad de circunstancias, estos clones se pueden utilizar
para el descubrimiento de fármacos y de la genonomía funcional.
Estos clones informan la modulación del gen informador en respuesta
a una diversidad de estímulos, tales como hormonas y otras señales
fisiológicas. Dichos estímulos pueden estar implicados en una
diversidad de vías conocidas o desconocidas que son moduladas por
moduladores o dianas conocidos o desconocidos. Por tanto, estos
clones se pueden utilizar como herramienta para descubrir productos
químicos que modulan una vía particular o para determinar una vía
celular.
Dichas vías son muy variadas, y quedan
comprendidas en clases generales, que presentan especies
específicas, que pueden ser moduladas por moduladores conocidos o
desconocidos o agonistas o antagonistas de los mismos. A título de
ejemplo, la Tabla 1 ilustra diversas vías, especies de estas clases,
y moduladores conocidos de estas especies. La invención se puede
utilizar para identificar regiones del genoma que son moduladas por
dichas vías, o un suceso fisiológico.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización, está previsto un
sistema de ensayo genómico para identificar dianas transcripcionales
corriente abajo para vías de señalización. Este procedimiento
requiere que la diana de interés active la expresión génica al
efectuar la adición de un producto químico o la expresión de la
proteína diana. Se prefiere una línea celular que sea muy similar
al tipo de tejido en el que la diana funciona, para generar una
biblioteca de clones con diferentes sitios de integración con
polinucleótidos de \beta-lactamasa u otros genes
informadores. Puede conocerse que esta línea celular produce una
respuesta celular, tal como una diferenciación al efectuar la
adición de un modulador particular. Si este tipo de línea celular
está disponible, es preferible para un rastreo, ya que representa
el contexto nativo de la diana. Si no está disponible una línea
celular que exprese homólogamente la diana, se puede generar una
línea celular que exprese de manera heteróloga la diana en la línea
celular más relevante. Por ejemplo, si la diana se expresa
normalmente en la célula linfoides, entonces se utilizaría una
línea celular linfoide para generar la biblioteca.
La biblioteca de clones, que se describe
adicionalmente en la presente memoria, se puede separar en dos
agrupaciones mediante FACS utilizando el sistema FRET que se
describe en la presente memoria: una agrupación de expresión (por
ejemplo células azules) y una agrupación de no expresión (por
ejemplo células verdes). Estas dos agrupaciones se pueden tratar a
continuación con un modulador seguido de FACS para aislar clones
inducidos (por ejemplo, de verdes a azules) o clones reprimidos
(por ejemplo, de azules a verdes). Se pueden realizar ciclos
adicionales de estimulación seguidos de FACS para comprobar los
resultados iniciales. La especificidad de la activación se puede
ensayar añadiendo productos químicos adicionales que no activarían
la diana definida. Esto haría posible la identificación de clones
que presentan polinucleótidos de \beta-lactamasa
integrados en genes activados mediante una diversidad de señales
celulares.
Una vez se ha aislado una agrupación de células
con las características deseadas, éstas se pueden expandir y sus
correspondientes genes se clonan y se caracterizan. Las dianas que
se podrían utilizaren este sistema de ensayo incluyen receptores,
quinasas, interacciones de proteína/proteína o factores de
transcripción y otras proteínas de interés expuestas en la presente
memoria.
En otra forma de realización, está previsto un
procedimiento para identificar genes expresados de forma
experimental o específicos del tejido. Se pueden insertar
nucleótidos de \beta-lactamasa, usualmente de
manera aleatoria, en cualquier célula precursora tal como una
célula madre embriónica o hematopoyética para crear una biblioteca
de clones. Los clones de expresión constitutiva se pueden recoger
seleccionando células azules y se pueden recoger células que no
expresan seleccionando células verdes utilizando el sistema FRET
descrito en la presente memoria. A continuación la biblioteca de
clones se puede estimular o hacer que se diferencie, y se aíslan
clones inducidos o reprimidos. Los marcadores de superficies
celulares conjuntamente con anticuerpos identificados fluorescentes
u otras moléculas detectoras se podrían utilizar para controlar la
expresión de genes de referencia simultáneamente.
Adicionalmente, mediante estimulación y
selección de células madre en diversas etapas de desarrollo, es
posible identificar rápidamente genes responsables de la maduración
y diferenciación de tejidos particulares. Adicionalmente, clones
que presentan un polinucleótido de \beta-lactamasa
integrado, ya sea aleatoriamente o mediante una recombinación
homóloga, en genes expresados de forma experimental, se pueden
utilizar con FACS para aislar poblaciones de células específicas
para un estudio adicional, tal como un rastreo. Dichos
procedimientos se pueden utilizar para la identificación de
poblaciones de células que presentan propiedades celulares
particulares, así como para proporcionar un informador intracelular
que permita el aislamiento y el rastreo de dicha población de
células.
La presente solicitud puede proporcionar líneas
celulares de rastreo para una diversidad de dianas cuyos elementos
de señalización corriente abajo ya son conocidos o postulados.
Dichas líneas celulares de rastreo se pueden utilizar ya sea para
rastrear moduladores de dianas transfectadas o como lecturas para
una clonación de expresión o para análisis funcionales de dianas no
caracterizadas. Se pueden preparar líneas celulares de rastreo para
cualquier vía o cualquier modulador, tales como los que se describen
en la Tabla 1.
En el caso de canales de iones, se generan
líneas celulares en las que se utiliza la expresión de
\beta-lactamasa para detectar un cambio de
voltaje. Esto es posible debido a que la señalización intracelular
es sensible al potencial de membrana y modulará la expresión de un
subconjunto de genes. En un ejemplo, una biblioteca de células
neuronales preparada siguiendo los procedimientos generales
expuestos en los Ejemplos 1 a 13, tales como células de
neuroblastoma de raíz dorsal, se rastrean para determinar la
respuesta a una despolarización incubando células en un medio con
alta concentración de potasio (alto K^{+}). Dependiendo de las
características particulares de la biblioteca de células y del
procedimiento utilizado, se identifican clones con una respuesta
transcripcional a un tratamiento de despolarización seleccionando
células que cambian de verde a azul o de azul a verde después de la
despolarización. Estos clones se designan como clones sensibles al
voltaje y se pueden utilizar como líneas celulares de rastreo para
identificar productos químicos que modulan canales de iones (ya sea
expresadas o transfectadas de manera endógena) que causan un cambio
del voltaje al efectuar ya sea la activación o la inhibición (por
ejemplo canales de K^{+} o de Na^{+}). Dichas células son
asimismo útiles para una clonación de expresión de canales de
iones. Por ejemplo, un clon sensible al voltaje se podría
transfectar con una biblioteca de ADNc. Las células transfectadas
con canales funcionales que cambian el potencial de membrana son
detectadas por medio de beta-lactamasa y los
productos génicos de ADNc se analizan para determinar su actividad
como canales de iones.
Además, un gen que codifica un canal de iones
conocido se puede aplicar por transfección a una línea celular
sensible al voltaje y a continuación se utiliza como rastreo para
determinar moduladores de canales. Por ejemplo, la expresión o
activación farmacológica de un canal de Na^{+} puede causar una
despolarización que puede ser informada por la línea celular. Esta
línea celular se puede utilizar para rastrear agonistas o
antagonistas, dependiendo del protocolo experimental de los
moduladores de canales de iones. En una variación de este enfoque,
una biblioteca genómica procedente de una línea celular que carece
de canales de K^{+}, tal como células L929, se puede transfectar
directamente con un gen de canal de K^{+}. La expresión del canal
de K^{+} causa un cambio de voltaje, tal como una
hiperpolarización, ocasionando un cambio de expresión de ciertos
genes sensibles al voltaje. Los clones que expresan estos genes se
pueden utilizar para rastrear reguladores del canal de iones.
En otra forma de realización, está previsto un
procedimiento para la identificación demoduladores de proteínas
huérfanas o de polinucleótidos genómicos que son modulados
directamente o indirectamente por una proteína huérfana. Los genes
de enfermedades humanas se identifican con frecuencia y se encuentra
que muestran poca o ninguna homología de secuencias con genes
funcionalmente caracterizados. Dichos genes presentan con frecuencia
una función desconocida y por tanto codifican una "proteína
huérfana". Usualmente, dichas proteínas huérfanas comparten una
proporción inferior al 25% de homología de secuencias de aminoácidos
con otras proteínas conocidas o no se consideran como parte de una
familia de genes. Con dicha moléculas, no existe normalmente ningún
punto de partida terapéutico. Mediante la utilización de
bibliotecas de los clones descritos en la presente memoria, se
puede extraer una información funcional acerca de estos nuevos
genes.
Las proteínas huérfanas se pueden expresar,
preferentemente sobreexpresar, en células de mamíferos vivas. Al
inducir una sobreexpresión del gen huérfano y controlando el efecto
sobre clones específicos, se pueden identificar genes que son
regulados transcripcionalmente por la proteína huérfana. Mediante la
identificación de genes cuya expresión es influenciada por el nuevo
gen de enfermedad u otra proteína huérfana, se pueden predecir las
bases fisiológicas de la enfermedad o función de la molécula
huérfana. La visión obtenida utilizando este procedimiento puede
conducir a la identificación de una diana terapéutica para una
intervención de la enfermedad.
En otra forma de realización, está previsto un
procedimiento para el rastreo de una diana o modulador definido
utilizando polinucleótidos genómicos identificados con los
procedimientos descritos en la presente memoria. El procedimiento
de identificación de genes descrito en la presente memoria se puede
utilizar asimismo conjuntamente con un sistema de rastreo para
determinar cualquier diana que funcione (ya sea naturalmente o
artificialmente) a través de una regulación transcripcional.
En muchos casos, son conocidos un receptor y su
ligando, per no los procesos biológicos corriente abajo requeridos
para la señalización. Por ejemplo, un receptor de citoquina y
citoquina pueden ser conocidos, pero el mecanismo de señalización
corriente abajo no lo es. Una biblioteca de clones generados a
partir de una línea celular que expresa el receptor de citoquina se
puede rastrear para identificar clones que muestran cambios en la
expresión génica cuando son estimulados por la citoquina. Los genes
inducidos se podrían caracterizar para describir la vía de
señalización. Utilizando los procedimientos de la invención, no se
requiere la caracterización de genes para el desarrollo del
rastreo, ya que la identificación de un clon celular que
específicamente responde a la citoquina constituye un rastreo
secundario que se puede utilizar. Por consiguiente, los clones que
muestran una activación o desactivación al efectuar la adición de
la citoquina se pueden expandir y utilizar para rastrear agonistas
o antagonista del receptor de citoquina. La ventaja de este tipo de
rastreo consiste en que no requiere una comprensión inicial de la
vía de señalización y por tanto es capaz especialmente de
identificar guías para nuevas vías.
En otra forma de realización, está previsto un
procedimiento para caracterizar funcionalmente una diana utilizando
un panel de clones que presentan polinucleótidos genómicos activos
como se han identificados en la presente memoria. Como se generan
grandes números de líneas celulares específicamente sensibles que
contienen polinucleótidos genómicos activos identificados con un
proceso biológico o modulador particular, se pueden utilizar paneles
que contienen clones específicos para un análisis funcional de
otros moduladores celulares potenciales. Dichos paneles de líneas
celulares sensibles se pueden utilizar para perfilar rápidamente
reguladores transcripcionales potenciales. Dichos paneles, además
de contener clones con polinucleótidos genómicos activos
identificados, que fueron generados por los paneles de la
invención, pueden incluir clones generados por procedimientos más
tradicionales. Se pueden generar clones que contienen tanto el
polinucleótido genómico activo identificado con un polinucleótido
de \beta-lactamasa, como elementos de respuesta
específicos, tales como SRE, CRE, NFAT, TRE, IRE o informadores
bajo el control de promotores específicos. Dichos paneles
permitirían por tanto el análisis rápido de efectores potenciales y
sus mecanismos de activación celular. Se puede utilizar asimismo un
segundo gen informador (por ejemplo, gen
\beta-galactosidasa) con este procedimiento, así
como el otro procedimiento descritos en la presente memoria.
En otra forma de realización, está previsto un
procedimiento de perfilado de productos químicos de ensayo
utilizando un clon o un panel de clones que presentan
polinucleótidos activos identificados. La caracterización de
productos químicos de ensayo es similar a la caracterización de
dianas, excepto en que la(s) diana(s)
celular(es) no han de ser conocidas. Este procedimiento
permite por consiguiente el análisis de los efectos de productos
químicos de ensayo (por ejemplo fármacos punteros) sobre la función
celular definiendo los genes afectados por el fármaco o precursor
de fármaco.
Dicho procedimiento puede encontrar una
aplicación en el área de descubrimiento de fármacos y de efectos
secundarios (por ejemplo un efecto citotóxico) de fármacos. El
fármaco potencial se añadiría a una biblioteca de clones genómicos
y se aislarían o se identificarían los clones que fueron inducidos o
reprimidos. Este procedimiento es análogo a la caracterización de
dianas, excepto en que la diana de fármaco secundaria es
desconocida. Además de proporcionar un rastreo para determinar los
efectos secundarios, el ensayo proporciona información sobre el
mecanismo de la toxicidad.
Está previsto un procedimiento para la
identificación de polinucleótidos genómicos activos utilizando
clones que presentan polinucleótidos de
\beta-lactamasa integrados, y FACS. Se pueden
utilizar bibliotecas de integración de
\beta-lactamasa en un formato de rastreo de alta
capacidad, tal como FACS, para detectar la regulación
transcripicional. La compatibilidad de los ensayos de
\beta-lactamasa con FACS hace posible un
procedimiento sistemático para definir patrones de regulación
transcripcional mediada por una gama de factores. Este enfoque no
ha sido factible o práctico utilizando sistemas informadores ya
existentes. Este nuevo procedimiento permitirá la rápida
identificación de genes que responden a una diversidad de señales,
incluyendo la expresión específica de tejidos y durante la
formación del patrón.
Por ejemplo, después de la integración de un
polinucleótido de \beta-lactamasa, se pueden
separar células expresantes y no expresantes mediante FACS. Estas
dos poblaciones de células se pueden tratar con moduladores
potenciales y se pueden controlar cambios de expresión génica
utilizando una lectura fluorescente ratiométrica. Se aislarán
agrupaciones de clones que muestran ya sea una sobrerregulación o
una infrarregulación de expresión génica de informadores. Se pueden
identificar a continuación genes diana procedentes de clones
sensibles. Además, al poder separar células expresantes y no
expresantes en diferentes momentos puntuales después de la adición
del modulador, se pueden identificar genes que son regulados
diferencialmente en función del tiempo. Este enfoque hace posible
por tanto la elucidación de cascadas de transcripción mediadas por
señalización celular. Específicamente, esto proporcionará un medio
para identificar genes corriente abajo que son regulados
transcripcionalmente por una diversidad de moléculas que incluyen
receptores nucleares, receptores de citoquina o factores de
transcripción.
Las aplicaciones de esta tecnología son casi
ilimitadas en las áreas de descubrimiento de genes y de análisis
funcional. Se podrían generar y utilizar bibliotecas de líneas
celulares procedentes de diversos tipos de tejidos para identificar
genes con patrones de expresión o mecanismos de regulación
específicos. Dichas bibliotecas de clones representarían millones
de sitios de integración que saturarían el genoma y pueden hacer
posible la identificación de cualquier gen expresado basado en su
regulación transcripcional. Los rasgos característicos del sistema
informador de \beta-lactamasa, en parte, permite
su utilización para este ensayo de integración genómica en un
formato de alta capacidad.
Existe una diversidad de otros enfoques que se
pueden utilizar con la invención, incluyendo enfoques similares a
los propuestos para \beta-lactamasa. Los ejemplos
incluirían epítopos de anticuerpos presentados sobre la superficie
celular con anticuerpos fluorescentes para detectar genes positivos.
Se podrían utilizar asimismo matrices de geles que retienen
informadores secretados y que hacen posible la detección de células
positivas. Estos enfoques, sin embargo, estarían limitados en
cuanto a sensibilidad y no se serían ratiométricos en su detección.
Estos permitirían, por tanto, únicamente la selección de células
positivas sobre la base de la intensidad fluorescente.
Una vez se han identificado los polinucleótidos
genómicos activos, se pueden secuenciar los mismos utilizando
diversos procedimientos, incluyendo RACE (rápida amplificación de
extremos de ADNc). RACE es un procedimiento para la identificación
de secuencias de ARNm desconocidas que flanquean secuencias de ARNm
conocidas. Se pueden identificar los dos extremos 5' y 3'
dependiendo de las condiciones de RACE. Se realiza 5' RACE
preparando en primer lugar ARN procedente de una línea celular o
tejido de interés. Este ARN total o poli A se utiliza a
continuación como un molde para reacciones de transcripción inversa
que o se pueden cebar aleatoriamente o se pueden cebar con un
cebador específico de genes. Se une a continuación un enlazador de
polinucleótidos al extremo 3' del ADNc recién transcrito mediante
transferasa terminal o ARN ligasa. Este ADNc se utiliza a
continuación como el molde para PCR utilizando un cebador en el
interior del gen informador y el otro cebador que corresponde a la
secuencia que ha sido unida al extremo 3' del ADNc de la primera
cadena. La presente solicitud es particularmente bien adecuada para
dichas técnicas y no requiere la construcción de clones o
construcciones adicionales una vez que se ha identificado el
polinucleótido genómico.
Cualquier sustrato de
\beta-lactamasa penetrante de membranas
susceptible de ser medido en el interior de la célula después de la
escisión se puede utilizar en los procedimientos y las composiciones
de la invención. Los sustratos de \beta-lactamasa
penetrantes de membranas no requerirán permeabilizar células
eucarióticas ya sea por choque hipotónico o por electroporación.
Generalmente, dichos procedimientos formadores de poros no
específicos no son deseables para utilizarlos en células
eucarióticas debido a que dichos procedimientos dañan las células,
con lo cual se disminuye la viabilidad y se introducen variables
adicionales en el ensayo de rastreo (tal como una pérdida de los
contenidos iónicos y biológicos de las células sometidas a choque o
a poración). Dichos procedimientos se pueden utilizar en células con
paredes celulares o membranas que impiden en gran medida o retardan
la difusión de dichos sustratos. Preferentemente, los sustratos de
\beta-lactamasa penetrantes de membranas se
transforman en la célula en un sustrato de
\beta-lactamasa con una penetrabilidad de
membranas reducida (usualmente por lo menos cinco veces menos
penetrantes) o sea, no penetrantes de membranas. Pueden tener lugar
transformaciones en el interior de la célula por medio de enzimas
intracelulares (por ejemplo, esterasas) o metabolitos
intracelulares o moléculas orgánicas (por ejemplo grupos
sulfhidrilo). Preferentemente, dichos sustratos son fluorescentes.
Los sustratos fluorescentes incluyen los que son susceptibles de
cambios, ya sea individualmente o en combinación, de la
fluorescencia total, excitación o espectros de emisión o FRET.
Preferentemente, se emplean sustratos de tipo
FRET con los procedimientos y composiciones de la invención.
Incluyendo sustratos fluorogénicos de fórmula general I:
D-S-A, en la que D es un donador de
FRET y A es un aceptor de FRET y S es un sustrato para una proteína
con actividad de \beta-lactamasa. La actividad de
\beta-lactamasa escinde los enlaces, ya sea
D-S o S-A con lo cual se libera D o
A, respectivamente a partir de S. Dicha escisión que resulta de la
actividad de \beta-lactamasa aumenta
sorprendentemente la distancia entre D y A lo cual ocasiona
normalmente una completa pérdida de la transferencia de energía
entre D y A. Generalmente, las moléculas de estructura
D-S-A se construyen para maximizar
la transferencia de energía entre D y A. Preferentemente, la
distancia entre D y A es generalmente igual o menor que el
R_{0}.
Como se apreciaría fácilmente por los expertos
en la materia, la eficacia de la transferencia de energía de
resonancia de fluorescencia depende del rendimiento cuántico de
fluorescencia del fluoróforo donador, la distancia de
donador-aceptor y la integral de superposición de la
emisión de fluorescencia del donador y la absorción del aceptor. La
transferencia de energía es muy eficaz cuando un fluoróforo donador
con alto rendimiento cuántico de fluorescencia (preferentemente,
uno que se aproxima al 100%) está emparejado con un aceptor con gran
coeficiente de extinción en longitudes de onda que coinciden con la
emisión del donador. La dependencia de la transferencia de energía
de fluorescencia, de los parámetros anteriormente mencionados ha
sido expuesta por Forster, T. (1948) Ann. Physik 2:
55-75; Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence
Spectroscopy, Nueva York: Plenum Press (1983); Herman, B.,
Resonance energy transfer microscopy, en: Fluorescence Microscopy of
Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, volumen
30, compilado por Taylor, D. L. y Wang, Y. L., San Diego: Academic
Press (1989), páginas 219-243; Turro, N. J., Modern
Molecular Photochemistry, Menlo Part: Benjamin/Cummings Publishing
Co., Inc. (1978), páginas 296-361, y están
disponibles tablas de integrales de superposición espectral para
las personas que trabajan en este campo, por ejemplo, Berlman, I. B.
Energy transfer parameters of aromatic compounds, Academic Press,
Nueva York y Londres (1973). La distancia entre el fluoróforo
donador y el colorante aceptor a la cual tiene lugar la
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) con
el 50% de eficacia se denomina R_{0} y se puede calcular a partir
de las integrales de superposición espectrales. Para el par
donador-aceptor,
fluoresceína-tetrametil-rodamina,
que se utiliza frecuentemente para la medición de distancias en
proteínas, esta distancia R_{0} es de aproximadamente 50 a 70 A,
dos Remedios, C. G. et al. (1987), J. Muscle Research and
Cell Motility 8:97-117. La distancia a la cual la
transferencia de energía en este par excede del 90% es de
aproximadamente 45 A. Cuando se une a la cadena principal de
cefalosporina, las distancias entre donadores y aceptores se
encuentran en el intervalo de 10 A a 20 A, dependiendo de los
enlazadores utilizados y del tamaño de los cromóforos. Para una
distancia de 20 A, un par de cromóforos habrá de presentar un
R_{0} calculado mayor que 30 A para el 90% de los donadores para
transferir su energía al aceptor, lo cual da como resultado una
extinción mejor que el 90% de la fluorescencia del donador. La
escisión de dicha cefalosporina mediante
\beta-lactamasa atenúa la extinción y produce un
aumento de la eficacia de fluorescencia del donador que excede de
diez veces. De acuerdo con ello, resulta evidente que la
identificación de pares donador-aceptor apropiados
para su utilización tal como se enseña en esta memoria según la
presente invención, sería esencialmente rutinaria para un experto
en la materia.
Se prefieren sustratos de genes informadores
descritos por Tsien et al., en la Publicación PCT nº
W096/30540 publicada el 3 de octubre de 1996 para
\beta-lactamasa.
Cuando se utilizan sustratos fluorescentes, se
reconocerá que se pueden utilizar diferentes tipos de sistemas de
control fluorescentes para practicar la invención. Preferentemente,
se utilizan sistemas FACS o sistemas destinados a un rastreo de
alta capacidad, por ejemplo, placas de microtitulación de 96
pocillos o mayores. Los procedimientos para realizar ensayos en
materiales fluorescentes son bien conocidos en la técnica y se
describen, por ejemplo, por Lakowicz, J. R., en Principles of
Fluorescence Spectroscopy, Nueva York: Plenum Press (1983); Herman,
B., Resonance energy transfer microscopy, en: Fluorescence
Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell
Biology, volumen 30, compilado por Taylor, D. L. y Wang, Y. L., San
Diego: Academic Press (1989), páginas 219-243;
Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park:
Benjamin/Cummings Publishing Col. Inc. (1978), páginas
296-361.
La fluorescencia en una muestra se puede medir
utilizando un fluorímetro. En general, la radiación de excitación,
procedente de una fuente de excitación que presenta una primera
longitud de onda, se hace pasar a través de un sistema óptico de
excitación. El sistema óptico de excitación produce la radiación de
excitación para excitar la muestra. En respuesta a ello, las
proteínas fluorescentes en la muestra emiten una radiación que
presenta una longitud de onda que es diferente de la longitud de
onda de excitación. Un sistema óptico de recogida recoge entonces
la emisión procedente de la muestra. El dispositivo puede incluir un
controlador de temperatura para mantener la muestra a una
temperatura específica mientras que se está explorando por barrido.
Según una forma de realización, una platina de translación
multiaxial transporta una placa de microtitulación que mantiene una
pluralidad de muestras con el fin de poner en posición diferentes
pocillos para que queden expuestos. La platina de translación
multiaxial, el controlador de temperatura, el dispositivo de
auto-enfoque y el sistema electrónico asociados con
la formación de imágenes y la recogida de datos se pueden gestionar
mediante un ordenador digital apropiadamente programado. El
ordenador puede transformar asimismo los datos recogidos durante el
ensayo en otro formato para su presentación.
Preferentemente, se utiliza FRET como un modo de
controlar la actividad de \beta-lactamasa en el
interior de la célula. El grado de FRET se puede determinar
mediante cualquier duración de vida espectral o de fluorescencia
característica de la construcción excitada, por ejemplo,
determinando la intensidad de la señal fluorescente procedente del
donador, la intensidad de la señal fluorescente procedente del
aceptor, la relación de las amplitudes de fluorescencia próximas a
las máximas de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia
próximas al máximo de la emisión del donador, o la duración de vida
del estado excitado del donador. Por ejemplo, la escisión del
enlazador aumenta la intensidad de fluorescencia procedente del
donador, reduce la intensidad de fluorescencia procedente del
aceptor, reduce la relación de amplitudes de fluorescencia
procedente del aceptor a la procedente del donador, y aumenta la
duración de vida del estado excitado del donador.
Preferentemente, se determinan los cambios del
grado de FRET en función del cambio de la relación de la cantidad
de fluorescencia procedente de los restos de donador y aceptor, un
procedimiento denominado "ratioing". Los cambios de la
cantidad absoluta de sustrato, la intensidad de excitación y la
turbidez o de otras absorbancias de fondo en la muestra a la
longitud de excitación afectan a las intensidades de fluorescencia
procedentes tanto del donador como del aceptor aproximadamente en
paralelo. Por tanto, la relación de las dos intensidades de emisión
constituye una medida más sólida y preferida de la escisión que
cualquier intensidad sola.
La duración de vida del estado de excitación del
resto donador es, de manera similar, independiente de la cantidad
absoluta de sustrato, la intensidad de excitación o la turbidez de
otras absorbancias de fondo. Su medición requiere un equipo con una
resolución de tiempos en nanosegundos, excepto en el caso especial
de complejos de lantánidos en el cual caso es suficiente una
resolución de microsegundos a milisegundos.
El sistema informador fluorescente ratiométrico
descrito en la presente memoria presenta ventajas importantes sobre
los informadores ya existentes para el análisis de integración de
genes, ya que permite una detección y un aislamiento sensibles de
células vivas individuales expresantes y no expresantes. Este
sistema de ensayo utiliza un sustrato fluorescente, no polar, no
tóxico que se carga fácilmente ya continuación queda atrapado
intracelularmente. La escisión del sustrato fluorescente por
\beta-lactamasa proporciona un cambio de emisión
fluorescente a medida que el sustrato se convierte en producto.
Debido a que la lectura del informador de
\beta-lactamasa es ratiométrica, es única entre
los ensayos de genes informadores en el sentido de que controla
variables tales como la cantidad de sustrato cargado en células
individuales. La lectura intracelular estable, fácilmente
detectada, elimina la necesidad de establecer líneas celulares
clonales antes del análisis de expresión. Con el sistema informador
de \beta-lactamasa u otros sistemas análogos se
puede utilizar una selección de flujos para aislar células
expresantes y no expresantes procedentes de agrupamientos de
millones de células viables. Esta selección positiva y negativa
permite su utilización con procedimientos de identificación de
genes para aislar clones deseados procedentes de grandes
agrupaciones de clones que contienen millones de células que
contienen cada una un sitio de integración único.
La presente solicitud se puede utilizar con
sistemas y procedimientos que utilizan terminales de ordenador
automatizados e integrables para identificar moduladores, vías,
productos químicos que presentan una actividad útil y otros
procedimientos descritos en la presente memoria. Dichos sistemas se
describen en general en la técnica (véase las patentes US nº
4.000.976 a nombre de Kramer et al. (concedida el 4 de enero
de 1977), nº 5.104.621 a nombre de Pfost et al. (concedida
el 14 de abril de 1992), nº 5.125.748 a nombre de Bjornson et
al. (concedida el 30 de junio de 1992), nº 5.139.744 a nombre de
Kowalski (concedida el 18 de agosto de 1992) nº 5.206.568 a nombre
de Bjomson et al. (concedida el 27 de abril de 1993) nº
5.350.564 a nombre de Mazza et al. (27 de septiembre de
1994), nº 5.589.351 a nombre de Harootunian (concedida el 31 de
diciembre de 1996), y las solicitudes PCT nº WO 93/20612 a nombre
de a Baxter Deutschland GmbH (publicada el 14 de octubre de 1993),
nº WO 96/05488 a nombre de McNeil et al. (publicada el 22 de
febrero de 1996) y nº WO 93/13423 a nombre de Agong et al.
(publicada el 8 de julio de 1993).
Típicamente, dicho sistema incluye: A) un módulo
de almacenamiento y recuperación que comprende localizaciones de
almacenamiento para almacenar una pluralidad de productos químicos
en solución en pocillos direccionables, un recuperador de pocillos
y que presenta una selección y recuperación programables de los
pocillos direccionables y que presenta una capacidad de
almacenamiento de por lo menos 10.000 pocillos direccionables, B) un
módulo de distribución de muestras que comprende un manipulador de
líquidos para aspirar o administrar soluciones desde los pocillos
seleccionados direccionables, presentando el módulo de distribución
de productos químicos una selección y aspiración programables de
los pocillos direccionables seleccionados y una administración
programable a los pocillos direccionables (incluyendo una
administración en series de pocillos direccionables con diferentes
densidades de pocillos direccionables por centímetro cuadrado), C)
un transportador de muestras para transportar los pocillos
direccionables seleccionados al módulo de distribución de muestras y
que presenta opcionalmente un control programable de transporte de
los pocillos direccionables seleccionados (incluyendo una ruta
adaptativa y un tratamiento paralelo), D) un módulo de reacción que
comprende ya sea un administrador de reactivos para administrar
reactivos a los pocillos direccionables seleccionados o un detector
de fluorescencia para detectar reacciones químicas en los pocillos
direccionables seleccionados y un módulo de proceso de datos e
integración. Los pocillos direccionables deberán estar constituidos
por materiales biocompatibles que son asimismo compatibles con el
ensayo que se ha de realizar (véase la solicitud de patente US,
"Systems and methods for rapidy identifying useful chemicals in
liquid samples" (Stylli et al., solicitada el 16 de mayo
de 1997).
El módulo de almacenamiento y recuperación, el
módulo de distribución de muestras y el módulo de reacción están
integrados y controlados de forma programable por el módulo de
tratamiento e integración. El módulo de almacenamiento y
recuperación, el módulo de distribución de muestras, el
transportador de muestras, el módulo de reacción y el módulo de
tratamiento de datos e integración están unidos de manera operable
para facilitar un tratamiento rápido de los pocillos de muestras
direccionables. Típicamente, los dispositivos de la invención
pueden tratar aproximadamente de 10.000 a 100.000 pocillos
direccionables que pueden representar aproximadamente de 5.000 a
100.000 productos químicos en un periodo de tiempo de 24 horas. Los
clones de células generados utilizando la presente invención se
pueden depositar individualmente en pocillos de una plataforma de
múltiples pocillos que presenta cualquier número de pocillos, tales
como 96, 864, 3456 o más. Las células en los pocillos se pueden
cultivar, almacenar, rastreare inventariar utilizando dicho
sistema.
La presente solicitud se refiere asimismo a
entidades químicas e información (por ejemplo, moduladores o
productos químicos o bases de datos de actividades biológicas de
productos químico o dianas) generadas o descubiertas mediante la
operación de la presente solicitud, particularmente productos
químicos e información generados utilizando dichos sistemas.
La estructura de un modulador candidato que
puede ser identificado mediante la invención se puede determinar o
confirmar mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales
como una espectrografía de masas. Para los moduladores supuestos
almacenados durante periodos de tiempo prolongados, se puede
confirmar la estructura, la actividad y la potencia del modulador
supuesto.
Dependiendo del sistema utilizado para
identificar un modulador candidato, el modulador candidato
presentará una actividad farmacológica supuesta. Por ejemplo, si se
ha encontrado que el modulador candidato inhibe la proliferación
(activación) de células T in vitro, entonces el modulador
candidato presentará propiedades farmacológicas probables como
inmunosupresor o antiinflamatorio (véase, Suthanthiran et
al., Am. J. Kidney Disease, 28: 159-172
(1996)). Dichos nexos son conocidos en la técnica para varios
estados de enfermedad, y se espera que se descubran más con el
transcurso del tiempo. Sobre la base de dichos nexos, se pueden
seleccionar modelos confirmatorios apropiados in vitro e
in vivo de la actividad farmacológica, así como la
toxicología. Los procedimientos descritos en la presente memoria se
pueden utilizar asimismo para determinar la selectividad y
especificidad farmacológica, y la toxicidad.
Una vez identificados, los moduladores candidato
se pueden evaluar para determinar los efectos toxicológicos
utilizando procedimientos conocidos (véase Lu, Basic Toxicology,
Fundamentals, Target Organs, and Risk Assessment, Hemisphere
Publishing Corp., Washington (1985); la patente US nº 5.196.313 a
nombre de Culbreth (concedida el 23 de marzo de 1993) y la patente
US nº 5.567.952 a nombre de Benet (concedida el 22 de octubre de
1996). Por ejemplo, se puede establecer la toxicología de un
modulador candidato determinando la toxicidad in vitro para
una línea celular, tal como una línea celular, por ejemplo, de un
ser humano. Los moduladores candidato se pueden tratar, por
ejemplo, con extractos de tejidos, tales como preparaciones de
hígado, tales como preparaciones microsómicas, para determinar el
aumento o la reducción de propiedades toxicológicas del producto
químico después de ser metabolizado por un organismo completo. Los
resultados de estos tipos de estudios son predictivos con
frecuencia de propiedades toxicológicas de productos químicos en
animales, tales como mamíferos, incluyendo seres humanos.
Alternativamente, o además de estos estudios
in vitro, las propiedades toxicológicas de un modulador
candidato en un modelo animal, tal como ratones, ratas, conejos o
monos, se pueden determinar utilizando procedimientos establecidos
(véase Lu, supra (1985); y Creasey, Drug Disposition in
Humans, The Basis of Clinical Pharmacology, Oxford University
Press, Oxford (1979)). Dependiendo de la toxicidad, el órgano diana,
el tejido, el lugar y el mecanismo supuesto del modulador
candidato, al experto no le sería gravoso determinar la dosis
apropiada, los valores de LD_{50}, las vías de administración y
los regímenes que serían apropiados para determinar las propiedades
toxicológicas del modulador candidato. Además de modelos animales,
se pueden realizar pruebas clínicas en seres humanos siguiendo
procedimientos establecidos, tales como los expuestos por la United
States Food and Drug Administration (USFDA) o administraciones
equivalentes de otros gobiernos. Estos estudios de toxicidad
proporcionan la base para determinar la eficacia de un modulador
candidato in vivo.
La eficacia de un modulador candidato se puede
establecer utilizando varios procedimientos reconocidos en la
técnica, tales como procedimientos in vitro, modelos animales
o pruebas clínicas en seres humanos (véase Creasey, supra
(1979)). Existen modelos in vitro reconocidos para varias
enfermedades o afecciones. Por ejemplo, la capacidad de un producto
químico para prolongar la duración de vida de células infectadas
por VIH in vitro es reconocida como un modelo aceptable para
identificar productos químicos que se espera que sean eficaces para
tratar una infección por VIH o el SIDA (véase Daluge et al.,
Antimicro. Agents Chemother. 41: 1082-1093 (1995)):
Además, La capacidad de la ciclosporina A (CsA) para impedir la
proliferación de células T in vitro ha sido establecida como
un modelo aceptable para identificar productos químicos que se
espera que sean eficaces como inmunosupresores (véase Suthanthiran
et al., supra, (1996)). Para casi todas las clases de
terapéutica, enfermedad o afección, hay disponible un modelo in
vitro o animal aceptable. Dichos modelos existen, por ejemplo,
para trastornos gastrointestinales, cánceres, cardiología,
neurobiología e inmunología. Además, dichos procedimientos in
vitro pueden utilizar extractos de tejidos, tales como
preparaciones de hígado, tales como preparaciones microsómicas, para
proporcionar una indicación fiable de los efectos del metabolismo
sobre el modulador candidato. De manera similar, se pueden utilizar
modelos animales aceptables para establecer la eficacia de productos
químicos para tratar enfermedades o afecciones. Por ejemplo, la
rodilla de conejo es un modelo aceptable para ensayar productos
químicos para determinar la eficacia en el tratamiento de la
artritis (véase Shaw y Lacy, J. Bone Joint Surg. (Br)
55:197-205 (1973)). La hidrocortisona, que está
aprobada para su utilización en seres humanos para tratar la
artritis, es eficaz en este modelo, lo cual confirma la validez de
este modelo (véase McDonough, Phys. Ther. 62:
835-839 (1982)). Cuando se selecciona un modelo
apropiado para determinar la eficacia de un modulador candidato, el
experto puede ser guiado por el estado de la técnica para
seleccionar un modelo apropiado, la dosis y la vía de
administración, el régimen y el punto final y como tal, no le sería
excesivamente gravoso.
Además de modelos animales, se pueden utilizar
pruebas clínicas en seres humanos para determinarla eficacia de un
modulador candidato en seres humanos. La USFDA, o agencias
gubernamentales equivalentes, han establecido procedimientos para
dichos estudios.
Los procedimientos in vitro e in
vivo anteriormente descritos establecen asimismo la selectividad
de un modulador candidato. Es reconocido que los productos químicos
pueden modular una amplia variedad de procesos biológicos o que son
selectivos. Se pueden utilizar paneles de células basados en la
presente invención para determinar la especificidad del modulador
candidato. La selectividad es evidente, por ejemplo, en el campo de
la quimioterapia, en el que la selectividad de un producto químico
que sea tóxico para las células cancerosas, pero no para las
células cancerosas, es evidentemente deseable. Los moduladores
selectivos son preferibles debido a que presentan menos efectos
secundarios en la determinación clínica. La selectividad de un
modulador candidato se puede establecer in vitro ensayando la
toxicidad y el efecto de un modulador candidato sobre una
pluralidad de líneas celulares que presentan una diversidad de vías
y sensibilidades celulares. Los datos obtenidos a partir de estos
estudios de toxicidad in vitro se pueden extender a estudios
de modelos animales, incluyendo pruebas clínicas en seres humanos,
para determinar la toxicidad, la eficacia y la selectividad del
modulador candidato.
La selectividad, especificidad y toxicología,
así como la farmacología general de un producto químico de ensayo
se pueden mejorar con frecuencia generando productos químicos de
ensayo adicionales basándose en las correlaciones de
estructura/propiedad del producto químico de ensayo originalmente
identificado que presenta actividad (un "Hit"). Los productos
químicos de ensayo identificados que presentan actividad se pueden
modificar para mejorar diversas propiedades, tales como la
afinidad, duración de vida en la sangre, toxicología, especificidad
y penetrabilidad de membranas. Dichos productos químicos de ensayo
refinados se pueden someter a ensayos adicionales descritos en la
presente memoria para un análisis de actividad. Los procedimientos
para generar y analizar dichos productos químicos son conocidos en
la técnica, tales como en la patente US nº 5.574.656 a nombre de
Agrafiotis et al.
La presente solicitud puede incluir asimismo un
modulador en una composición farmacéutica que comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable preparado para el almacenamiento y
posterior administración, que presenta una cantidad
farmacéuticamente eficaz del modulador candidato en un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable. Los productos químicos
identificados mediante los procedimientos descritos en la presente
memoria no incluyen productos químicos públicamente disponibles en
la fecha de presentación de la presente solicitud o en la técnica
anterior. Los vehículos o diluyentes aceptables para utilización
terapéutica son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se
describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mark
Publishing Co. (A. R, Gennaro, compiladores, 1985). Se pueden
proporcionar agentes de conservación, estabilizadores, colorantes e
incluso agentes saborizadores en la composición farmacéutica. Por
ejemplo, se pueden añadir benzoato de sodio, ácido sórbico y
ésteres de ácido p-hidroxibenzoico como agentes de
conservación. Además, se pueden utilizar antioxidantes y agentes de
suspensión.
Las composiciones de la presente solicitud se
pueden formular y utilizar en forma de tabletas, cápsulas o
elixires para una administración oral; supositorios para una
administración rectal; soluciones y suspensiones estériles para una
administración inyectable; y otros similares. Se pueden preparar
inyectables en formas convencionales ya sea en forma de soluciones
o suspensiones, en formas sólidas adecuadas para una solución o
suspensión en un líquido antes de la inyección, o en forma de
emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, una
solución salina, dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albúmina,
glutamato de sodio, hidrocloruro de cisteína y otros similares.
Además, si se desea, la composición farmacéutica inyectable puede
contener cantidades secundarias de sustancias auxiliares no tóxicas,
tales como agentes de humectación, agentes de tamponación de pH, y
otros similares. Si se desea, se pueden utilizar preparaciones que
favorecen la absorción (por ejemplo, liposomas).
La cantidad farmacéuticamente eficaz del
modulador candidato requerida como una dosis dependerá de la vía de
administración, del tipo de animal que se esté tratando y del las
características físicas del animal específico bajo consideración.
La dosis se puede adaptar para conseguir un efecto deseado, pero
dependerá de tales factores como el peso, la dieta, la medicación
simultánea y de otros factores que los expertos en las técnicas
médicas reconocerán. En la práctica de los procedimientos de la
invención, las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar solas
o en combinación con otra, o en combinación con otros agentes
terapéuticos o de diagnóstico. Estos productos se pueden utilizar
in vivo, normalmente en un mamífero, preferentemente un ser
humano, o in vitro. Para una utilización in vivo, la
composición farmacéutica se puede administrar al mamífero en una
diversidad de maneras, que incluyen una administración por vía
parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, colónica,
rectal, nasal o intraperitoneal, empleando una diversidad de formas
de dosificación. Dichos procedimientos se pueden aplicar asimismo
para ensayar la actividad de productos químicos in vivo.
Como resultará fácilmente evidente para un
experto en la materia, la dosificación in vivo útil que se
ha de administrar y el modo particular de administración variará
dependiendo de la edad, el peso y la especie de mamífero tratado,
de la composición farmacéutica particular empleada, y de la
utilización específica para la cual se emplea la composición
farmacéutica. La determinación de niveles de dosificación eficaces,
es decir los nivel de dosificación para conseguir el resultado
deseado, se puede efectuar por un experto en la materia utilizando
los procedimientos rutinarios como los anteriormente expuestos.
Típicamente, las aplicaciones químicas en seres humanos de los
productos se comienzan a niveles de dosificación inferiores,
aumentándose el nivel de dosificación hasta que se alcanza el
efecto deseado. Alternativamente, se pueden utilizar estudios in
vitro aceptables para establecer dosis y vías de administración
útiles de las composiciones identificadas mediante los presentes
procedimientos utilizando procedimientos farmacológicos
establecidos.
En estudios en animales no humanos, las
aplicaciones de las composiciones farmacéuticas potenciales se
comienzan a niveles de dosificación superiores, reduciéndose la
dosificación hasta que ya no se alcanza el efecto deseado o se
reducen o desaparecen los efectos secundarios negativos. La
dosificación para los productos de la presente invención puede
variar ampliamente dependiendo de los efectos deseados y de la
indicación terapéutica. Típicamente, las dosificaciones pueden
estar comprendidas entre aproximadamente 10 ng/kg y 1 \mug/kg de
peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 100 \mug/kg
y 10 mg/kg de peso corporal. La administración es preferentemente
oral sobre una base diaria.
La formulación exacta, la vía de administración
y la dosificación se pueden seleccionar por el médico individual en
vista de la afección del paciente. (véase por ejemplo, Fingl et
al., en The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975).
Deberá observarse que el médico asistente conocería la manera y
momento determinar, interrumpir o ajustar la administración debido
a la toxicidad, disfunción orgánica u otros efectos negativos. A la
inversa, el médico asistente conocería asimismo la manera de
ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clínica
no fuese suficiente (evitando la toxicidad). La magnitud de una
dosis administrada en el tratamiento del trastorno de interés
variará con la gravedad de la afección que se ha de tratar y la vía
de administración. La gravedad de la afección se puede evaluar en
parte, por ejemplo, mediante procedimientos estándar de evaluación
de pronósticos. Además, la dosis y quizás la frecuencia de la dosis,
variará asimismo según la edad, el peso corporal y la respuesta del
paciente individual. Se puede utilizar un programa comparable al
anteriormente expuesto en medicina veterinaria.
Dependiendo de las afecciones específicas que se
estén tratando, dichas composiciones farmacéuticas se pueden
formular y administrar por vía sistémica o local. Se pueden
encontrar técnicas de formulación y administración en la
publicación Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^{a} edición,
Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Las vías adecuadas pueden
incluir una administración oral, rectal, transdérmica, vaginal,
transmucosa o intestinal; una administración parenteral, que
incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares,
así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas,
intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Para inyección, las composiciones farmacéuticas
se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en
soluciones tampón fisiológicamente compatibles, tales como solución
de Hanks, solución de Ringer o una solución tampón salina
fisiológica. Para dicha administración intramucosa, se utilizan en
la formulación agentes penetrantes apropiados a la barrera que se
ha de penetrar. Dichos agentes penetrantes son generalmente
conocidos en la técnica. La utilización de vehículos
farmacéuticamente aceptables para formular las composiciones
farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria para la
práctica de la invención en dosificaciones adecuadas para una
administración sistémica se encuentran dentro del ámbito de la
invención. Con una selección apropiada del vehículo y una práctica
de preparación adecuada, las composiciones, en particular la
formuladas en forma de soluciones, se pueden administrar por vía
parenteral, tal como mediante una inyección intravenosa. Las
composiciones farmacéuticas se pueden formular fácilmente
utilizando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en
la técnica en dosificaciones adecuadas para una administración oral.
Dichos vehículos hacen posible que los productos químicos se
formulen en forma de tabletas, píldoras, cápsulas, líquidos, geles,
jarabes, suspensiones densas, suspensiones y otras similares, para
ingestión oral por un paciente que se ha de tratar.
Los agentes destinados a ser administrados por
vía intracelular se pueden administrar utilizando técnicas bien
conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, dichos
agentes se pueden encapsular en liposomas, y administrar a
continuación como se ha descrito anteriormente. Todas las moléculas
presentes en una solución acuosa en el momento de la formación del
liposoma se incorporan en el interior acuoso. El contenido
liposómico queda protegido del microambiente externo y, debido a
que los liposomas se funden con las membranas celulares, es
administrado eficazmente en el citoplasma celular. Adicionalmente,
debido a su hidrofobia, se pueden administrar directamente pequeñas
moléculas orgánicas por vía intracelular.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
su utilización incluyen composiciones en las que los componentes
activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el
propósito que se persigue. La determinación de la cantidad eficaz
de una composición farmacéutica está comprendida en la capacidad de
los expertos en la materia, especialmente a la luz de la
descripción detallada proporcionada en la presente memoria. Además
de los componentes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden
contener vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables que
comprenden excipientes y agentes auxiliares que facilitan el
tratamiento de los productos químicos activos en preparaciones que
se pueden utilizar en farmacia. Las preparaciones formuladas para
una administración oral pueden encontrarse en forma de tabletas,
grageas, cápsulas o soluciones. Las composiciones farmacéuticas de
la presente invención se pueden preparar de una manera que es
conocida por sí misma, por ejemplo, por medio de procedimientos
convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de
grageas, levitación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o
liofilización. Las formulaciones farmacéuticas para una
administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los
productos químicos en forma de una solución acuosa. Adicionalmente,
se pueden preparar suspensiones de los productos químicos activos
en forma de suspensiones de inyecciones aceitosas apropiadas. Los
solventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos
tales como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos,
tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las
suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener sustancias que
aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como
carboximetil-celulosa sódica, sorbitol o dextrano.
Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores
adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los productos
químicos para permitirla preparación de soluciones muy
concentradas.
concentradas.
Las composiciones farmacéuticas para utilización
oral se pueden obtener combinando los productos químicos activos
con excipientes sólidos, triturando opcionalmente la mezcla
resultante y tratando la mezcla de gránulos, después de añadir los
agentes auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o
núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular,
materiales de carga tales como azúcares, que incluyen lactosa,
sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones celulósicas tales como,
por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz,
almidón de patata, gelatina, goma tragacanto,
metil-celulosa,
hidroxipropilmetil-celulosa,
carboximetil-celulosa sódica y/o
polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes de
desintegración, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o
ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Se
proporcionan núcleos de grageas con revestimientos adecuados. Para
este propósito, se pueden utilizar soluciones concentradas de
azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco,
polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido
de titanio, soluciones de lacas y solventes orgánicos adecuados o
solventes mixtos. Se pueden añadir sustancias colorantes o pigmentos
a las tabletas o a los revestimientos de las grageas para
identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis
de productos químicos activos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar diversas construcciones de
expresión de \beta-lactamasa (BLEC) se
construyeron múltiples BLEC y se aplicaron por transfección a
células de mamífero.
La primera de éstas, BLEC-1 se
construyó clonando la forma citoplasmática de la SEC. ID nº 4 de
\beta-lactamasa (véase la Tabla 2) de tal modo
que se uniese funcionalmente a la secuencia del aceptor de empalme.
En-2, tal como se muestra en la FIGURA 3. Este
vector cuando se inserta en un intrón genómico dará como resultado
la generación de un ARN de fusión entre un gen diana endógeno y
\beta-lactamasa ("BL"). La
BLEC-1 contiene asimismo una secuencia de
poli-adenilación de hormona de crecimiento bovino
(BGH-poli A) corriente debajo de la
beta-lactamasa citoplasmática.
La BLEC-2 se construyó de manera
idéntica al BLEC-1, excepto en que se insertó una
secuencia de sitio de entrada ribosómico interno (IRES) de
polivirus entre el aceptor de empalme. En-2 y
\beta-lactamasa ("BL"). Esto elimina las
restricciones del marco de lectura y la posible inactivación de
beta-lactamasa por fusión con una proteína
endógena. Para hacer posible la selección de transfectantes estables
para BLEC-1 y BLEC-2, una casete
resistente a neomicina o a G418 se clonó corriente debajo de la
secuencia de poli-adenilación de BGH. Esta casete
consiste en un promotor, un gen resistente a neomicina y una
secuencia de poli-adenilación de SV40, tal como se
muestra en la Figura 3.
Se construyeron dos construcciones alternativas
BLEC-3 y BLEC-4 similares a
BLEC-1, y BLEC-2 respectivamente,
excepto en que el SV40-poli A se sustituyó con una
secuencia de donador de empalme. Esto deberá enriquecer la
inserción en regiones transcritas, ya que ello requiere la presencia
de un aceptor de empalme endógeno y una secuencia de
poliadenilación corriente abajo del sitio de inserción del vector
para generar clones resistentes a G418. Las BLEC-3
y BLEC-4 utilizan también el promotor PGK para
impulsar el gen de resistencia a neomicina en lugar del promotor
beta-actina humana.
La estructura de CCF2-AM
(sustrato de BL) utilizada en los siguientes experimentos es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar la función de cada uno de los
vectores de BLEC, se aplicaron los mismos por transfección a
células RBL-1 y se seleccionaron clones estables
para cada uno de los cuatro plásmidos de BLEC (véase la Tabla 2).
Medios selectivos contenían DMEM, suero bovino (FBS) al 10% y 400
\mug/ml de Gentamicina (G418). Se agruparon clones de células
resistentes a G418 procedentes de múltiples transfecciones para
generar una biblioteca de clones integrados estables en BLEC.
Esta biblioteca de clones integrados en
BLEC-1 se cargó con el sustrato fluorescente de BL
(CCF-2-AM) añadiendo
CCF-2-AM 10 \muM en HBSS que
contenía Hepes 10 \muM, 7,1 y glucosa al 1%. Después de 1 hora de
incubación a una temperatura de 22ºC, se lavaron las células con
HBSS y se examinaron después de la excitación con luz de 400 nm
utilizando un filtro de emisión de paso largo de 435 nm. En estas
condiciones de ensayo, el 10% de las células presentaron una
fluorescencia azul lo cual indicaba que estaban expresando
\beta-lactamasa. Este resultado sugiere que la
construcción BLEC-1 está funcionando como un vector
de integración génica.
Se generaron asimismo líneas celulares estables
aplicando por transfección BLEC-1 a células
CHO-K1 y Jurkat. Las poblaciones de clones
integrados en BLEC-1 procedentes de células CHO y
Jurkat mostraron resultados similares a los obtenidos con clones de
RBL-1 expresando BL del 10 al 15% de los clones de
células integrados es BLEC tal como se determina por su relación
azul/verde después de cargarlos con
CCF-2-AM. Este resultado muestra
que las BLEC funcionan en una diversidad de tipos de células
incluyendo células T humanas (Jurkat), leucocitos basófilos de rata
(RBL) y células de ovarios de hámster chino (CHO).
Se utilizó una selección de células activadas
fluorescentes de poblaciones multiclonales de clones integrados en
genes de RBL-1 para identificar clones con expresión
génica de BL regulada. Se aisló una población de células que no
expresaba BL seleccionando una biblioteca de clones integrados en
BLEC-1 generados por transfección de células
RBL-1 tal como se describe en el Ejemplo 2. Se
aislaron 180.000 clones que expresaban poco o nada de BL
seleccionando clones con una baja relación azul/verde (población
R1), tal como se muestra en la FIGURA 4A. Esta población de clones
se cultivó durante siete días y se volvió a seleccionar por FACS
para ensayar las propiedades fluorescentes de la población. Un
análisis FACS de los clones de células seleccionados a partir de R1
muestra que la mayor parte de las células con una alta relación
azul/verde \sim0,1% han sido eliminadas mediante un ciclo de
selección para células verdes, tal como se muestra en la FIGURA 4B.
Queda asimismo claro que la población total ha cambiado hacia más
cantidad de células verdes en comparación con la población parental,
tal como se muestra en la FIGURA 4A. Hay, sin embargo, células con
una alta relación azul/verde que se muestran en la población verde
seleccionada. éstas pueden representar clones en los que la BLEC se
ha integrado en un gen diferencialmente regulado tal como un gen
cuya expresión cambia a lo largo del ciclo celular.
La población de clones de RBL-1
mostrada en la FIGURA 4B se estimuló mediante la adición de
ionomicina luM durante 6 horas y se volvió a seleccionar para
identificar clones que presentaban la BLEC integrada en un gen que
es inducible aumentando el calcio intracelular. La siguiente Tabla 4
expone los resultados de este experimento. Un mayor porcentaje de
clones azules estaba presente en las tres
sub-poblaciones azules (R4, R2, R5) en la población
estimulada con ionomicina en comparación con la no estimulada. Esta
población seleccionada representa las siguientes clases de células
azules: R4 (la relación azul/verde más alta (azules brillantes)),
R2 (azules multicolores), y R5 (relación azul/verde inferior (las
menos azules). Adicionalmente, en la población estimulada con
ionomicina hay una reducción del porcentaje de células verdes
procedentes de la población no estimulada (R6). Este aumento de los
clones azules en la población estimulada con ionomicina indica que
una subpoblación de clones azules presentan la BLEC insertada en un
gen que es inducido por ionomicina. Se seleccionaron clones azules
individuales procedentes de la población estimulada con ionomicina y
se analizan para determinar su perfil de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de hacer posible el aislamiento de clones
de células con expresión de BL inducible procedentes de grandes
poblaciones de células, se pueden aislar clones basados en su nivel
de expresión de BL. Para aislar células con diferentes niveles de
expresiones de BL se pueden seleccionar clones azules después de
diferentes tiempos de exposición a un sustrato o por su relación
azul/verde. Células con una relación azul/verde inferior o las que
requieren tiempos de incubación más prolongados representarán clones
que expresan niveles inferiores de BL. Esto se demuestra mediante
la exploración por barrido FACS anteriormente mencionada ya que los
clones seleccionados de la ventana R4 presentan una relación
azul/verde superior lo cual indica que están expresando niveles
superiores de BL, las células seleccionadas de la R5 presentan una
relación azul/verde inferior (visualmente de color turquesa) lo
cual indica una expresión de BL inferior. Células seleccionada de la
ventana R3 que contiene todas las células azules muestran
variaciones del color azul, del azul brillante (alta relación
azul/verde) a azul turquesa (baja relación azul/verde).
Para demostrar que las construcciones de
expresión son relativamente estables para clones seleccionados, se
seleccionaron células de R3 (población azul) tal como se muestra en
la FIGURA 4A y se cultivaron en ausencia de una presión selectiva
durante varias semanas. Hubo un pequeño cambio del porcentaje de
células azules en la población cultivada, manteniéndose el
porcentaje azul a \sim90%. Este resultado representa un
enriquecimiento de 10 veces para clones que expresan
constitutivamente BL mediante un ciclo de selección por FACS.
Las células en la ventana R6 presentan la
relación azul/verde más baja y aparecen visualmente de color verde.
Las células R6 no están expresando por tanto BL o están expresando
BL por debajo del límite de detección del ensayo de los
solicitantes.
Para investigar adicionalmente la estabilidad de
las integraciones de genes informadores en genes constitutivamente
activos, se seleccionaron clones azules individuales a partir de
poblaciones de clones de células generadas transfectando
RBL-1, y CHOK1 con BLEC-1. Después
de la adición de CCF-2 a la población de células
multiclonales, se seleccionaron clones azules individuales en
placas de microtitulación de 96 pocillos. Estos clones se
expandieron a platos de 24 pocillos lo cual duró de 7 a 10 días. La
viabilidad de las células varió entre los dos tipos de células
formando el 80% de los clones seleccionados colonias para las
células CHO y el 36% para la células RBL-1. Después
de la expansión en platos de 24 pocillos, se ensayaron 20 clones
estables en BLEC-1 de CHO para determinar la
expresión de BL mediante la adición de
CCF-2-AM. 20/20 de estos clones
expresaron BL variando el porcentaje de células azules en un clon
del 70% al 99%. Este resultado es consistente con los datos
anteriores presentados para RBL-1 en que la
población azul seleccionada se ensayó para determinar la expresión
de BL después de varias semanas de cultivo no selectivo. Hubo, sin
embargo, diferencias importantes entre clones en su relación
azul/verde y por lo tanto en su nivel de expresión de BL. Esto
sugirió que los genes con diferentes niveles de expresión
constitutiva habían sido identificadas con la BLEC. Aunque hubo
diferencias importantes en el color azul entre clones
independientes, la fluorescencia azul en un clon fue
consistentemente similar tal como se esperaría en una población
clonal. Hubo, sin embargo, células verdes en los clones azules
seleccionados, lo cual puede indicar que hay alguna pérdida del
sitio de integración del plásmido en BLEC-1 cuando
los clones se hacen crecer a partir de una célula
individual.
individual.
Se expandieron clones individuales y se
utilizaron para preparar ARN para RACE para identificar el gen
diana, y ADN para un análisis Southern.
Las células Jurkat constituyen una línea de
células T derivadas de una leucemia de células T humana. Esta línea
celular mantiene muchas de las capacidades de señalización de
células T primarias y se pueden activar utilizando anticuerpos
anti-CD3 o lectinas mitogénicas tales como
fitohemaglutinina (PHA). Células Jurkat de tipo salvaje fueron
transfectadas por electroporación con una construcción de
atrapamiento de beta-lactamasa
(BLEC-1, BLEC-1A, o
BLEC-1B véase la Figura 3) ("construcciones
BLEC") que contiene un gen que codifica un gen de
beta-lactamasa que no está bajo el control de un
promotor reconocido por las células Jurkat y un gen de resistencia
a neomicina que puede ser expresado en células Jurkat. La
BLEC-1 se expone en la FIGURA 3. La
BLEC-1A presenta un sitio de Notl después del sitio
de SV40 poli A. Esto permite el corte del inserto fuera de la
cadena principal del plásmido. La BLEC-1B es igual
que La BLEC-1A excepto en que el ATG en el comienzo
de la traducción de betalactamasa se ha cambiado a ATC. Esto eliminó
el sitio de comienzo de traducción y requiere la adición de un ATG
de corriente arriba para producir beta-lactamasa. Se
seleccionaron transformantes estables para determinar su
resistencia a 800 \mug/ml de G418. Después de 400 experimentos
independientes, se produjo un agrupamiento mayor que un millón de
clones con inserciones de BLEC. Esta población de células
constituye una biblioteca de clones de células en las que se insertó
la construcción BLEC a lo largo del genoma ("biblioteca de BLEC
de Jurkat"). Aproximadamente el diez por ciento de las células de
esta biblioteca expresan beta-lactamasa en ausencia
de estímulos añadidos. Se determinó la actividad de
beta-lactamasa en las células poniendo en contacto
las células con CCF2-AM y cargándolas en presencia
de Pluronic 128 (de Sigma) a una concentración de aproximadamente
100 \mug/ml. Se pueden obtener clones individuales de poblaciones
de células que expresan beta-lactamasa mediante
selección
por FACS.
por FACS.
El análisis genómico Southern de estos clones
utilizando una sonda de ADN que codifica betalactamasa mostró el
vector insertado en el genoma huésped entre una y tres veces por
cada célula, presentando la mayor parte de los clones uno o dos
sitios de inserción de vectores (para análisis genómico Southern,
véase Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)). Un análisis Northern de estos
clones utilizando una sonda de ADN que codifica betalactamasa mostró
que el nivel de expresión y el tamaño de mensajes variaba de un
clon a otro clon (para análisis Northern, véase Sambrook,
supra, (1989)). Esto indicaba que los transcritos de fusión
se estaban realizando con diferentes genes funcionalmente
identificados con beta-lactamasa, lo cual permite
que el gen informador se exprese en las mismas condiciones que el
gen endógeno. Utilizando cebadores apropiados, se utilizó una RACE
(Gibco BRL) para aislar los genes unidos al gen de
beta-lactamasa expresado en un subconjunto de estos
clones constitutivamente expresantes. Estos genes se clonaron y se
secuenciaron utilizando procedimientos conocidos (véase Sambrook,
supra, (1989)). Estas secuencias se compararon con
secuencias conocidas utilizando técnicas de búsqueda BLAST
establecidas. Las secuencias conocidas que se identificaron
incluyeron: beta-catenina, moesina y
\beta-adaptina. Adicionalmente, se identificaron
varias secuencias nuevas que representan genes supuestos.
Se aislaron clones integrados en BLEC de Jurkat
que presentan una expresión de beta-lactamasa al
efectuar una activación de las células Jurkat mediante PHA (clones
inducidos por PHA), seleccionando por FACS una biblioteca de BLEC
de Jurkat. Estos clones representan células en las que la
construcción de atrapamiento se había integrado en un gen
sobrerregulado por activación con PHA (célula T). De este modo,
estas células informan la activación transcripcional de un gen al
efectuar una activación celular. Se identificaron y se aislaron
clones individuales por FACS utilizando CCF2-AM
para detectar actividad de beta-lactamasa. Este
procedimiento de aislamiento de clones, el paradigma de selección
inducida, utilizó tres protocolos de estimulación y selección
secuenciales e independientes. Se utilizó como testigo una lectura
de FACS para células Jurkat que no contienen una construcción BLEC
puesta en contacto con CCF2-AM. Estas células
testigo eran todas verdes.
El primer procedimiento de selección aisló una
agrupación de clones azules (que expresan
\beta-lactamasa, tal como se indicó poniendo en
contacto las células con CCF2-AM) que se habían
estimulado previamente durante 18 horas con 10 \mug/ml de PHA
procedente de una biblioteca de BLEC de Jurkat no seleccionada. Esta
agrupación representó el 2,83% de la población de células no
seleccionadas originales. Esta agrupación seleccionada contenía
clones que expresan constitutivamente beta-lactamasa
y clones en los que la expresión de beta-lactamasa
fue inducida por estimulación con PHA ("clones estimulables").
Después de la selección, esta agrupación de clones se cultivó en
ausencia de PHA para permitir que las células, en el caso de clones
estimulables, se expandieran y volvieran a un estado de reposo (es
decir, que carecían de expresión génica inducida por PHA).
El segundo procedimiento de selección aisló una
agrupación de clones de células verdes (que no expresan
\beta-lactamasa, tal como se indicó poniendo en
contacto las células con CCF2-AM) procedentes de la
primera agrupación seleccionada que se habían cultivado, después de
la selección, sin estimulación con PHA durante 7 días. El segundo
procedimiento de selección separa clones que expresan
constitutivamente beta-lactamasa de células que
expresan beta-lactamasa al efectuar una
estimulación. Esta segunda agrupación representó el 11,59% de la
población de células antes de la segunda selección. Esta agrupación
de células se cultivó en ausencia de PHA para multiplicar el número
de células antes de una tercera selección.
El tercer procedimiento de selección utilizó el
mismo procedimiento que el primer procedimiento de selección y se
utilizó para aislar células individuales que expresan
beta-lactamasa en respuesta al ser puestas en
contacto con 10 \mug/ml de PHA durante 18 horas. Se seleccionaron
clones azules particulares, individualmente en pocillos
particulares de placas de microtitulación de 96 pocillos. Este
procedimiento de selección por FACS de tres ciclos enriqueció
clones inducibles por PHA en aproximadamente 10.030 veces.
Dichos clones aislados se expandieron y se
ensayaron para determinar la inducibilidad por PHA mediante una
inspección microscópica con y sin estimulación con PHA en presencia
de CCF2-AM. Se identificó un total de cincuenta y
cinco clones inducibles por PHA utilizando este procedimiento. La
inducibilidad por PHA de estos clones varió de 1,5 a 40 veces el
cambio en la relación 460/530 en comparación con células testigo no
estimuladas. Un análisis genómico Southern utilizando una sonda de
ADN que codifica beta-lactamasa estableció que estos
clones representaban 34 sucesos de integración de vectores estables
independientes. En las siguientes Tabla 6 y Tabla 7 se proporciona
una relación de clones obtenidos mediante los procedimientos de la
invención y sus características.
Además de clones inducibles por PHA, se aislaron
clones inducibles por 12-miristato
13-acetato de forbol (PMA) (Calbiochem),
tapsigargina (Thaps) (Calbiochem) y PMA + Thaps, utilizando el
procedimiento general anteriormente expuesto utilizando el inductor
indicado en lugar de PHA. El PMA es un activador específico de PKC
(proteína quinasa C) y Thaps es un activador específico de
liberación de ion calcio intracelular (Thaps). Estos clones se
aislaron utilizando tres ciclos de FACS utilizando los
procedimientos generales descritos para los clones inducibles por
PHA en el Ejemplo 5. En tales casos, el PHA fue sustituido por otros
estimuladores. El PMA se proporcionó a una concentración de 8 nM.
La Thaps se proporcionó a una concentración de 1 \muM. Cuando
estos dos estimulantes se combinaron, su concentración no cambió.
Tal como se muestra en la Tabla 5, se seleccionaron clones sobre la
base de su activación por PMA, Thaps, o PMA con Thaps después de
tres o dieciocho horas de estimulación ("tiempo de
estimulación"). Estos resultados demuestran que los criterios de
selección de FACS se pueden variar dependiendo del tipo de clones
modulados deseados. Utilizando condiciones de selección variadas,
es posible aislar clones funcionalmente distintos corriente abajo de
la diana de señalización deseada.
Se aislaron mediante selección por FACS clones
en BLEC de Jurkat que presentan una expresión de
beta-lactamasa reducida al efectuar la activación
de las células Jurkat mediante PHA. Estos clones representan células
en las que la construcción de atrapamiento BLEC se había integrado
en un gen infrarregulado por activación con PHA (célula T). De este
modo, estas células informan la represión transcripcional de un gen
al efectuar una activación celular. Se identificaron y se aislaron
clones individuales mediante FACS utilizando CCF2-AM
para detectar actividad de beta-lactamasa
utilizando el siguiente paradigma de selección reprimido.
Se utilizó una primera selección para aislar una
población de células que expresan constitutivamente
beta-lactamasa identificando y aislando una
población de células azules a partir de una población no estimulada
de células Jurkat transfectadas con BLEC puestas en contacto con
CCF2-AM. La población seleccionada de células
representó el 2,89% de la población no seleccionada. Estas células
se cultivaron, se dividieron en dos agrupaciones, y se estimularon
con uno o dos estímulos diferentes, ya sea 10 \mug/ml de PHA
durante 18 horas, o PMA 8 nM y Tapsigargina 1 \muM durante 18
horas. Estas células estimuladas se pusieron en contacto con CCF2
(cargándolas en presencia de 400 PET (4% en peso/volumen) y
Pluronic® 128 (100 \mug/ml)) y las células verdes en la población
se seleccionaron utilizando un FACS. La población seleccionada
representó el 8,41% de la población de células antes de la segunda
selección. El tercer ciclo de FACS fue para células individuales
azules no estimuladas. La población de células obtenida representó
el 18,2% de la población de células antes de la tercera
selección.
El procedimiento de selección representa un
enriquecimiento de 2.260 veces para clones reprimibles por PHA.
Estos clones presentan el gen de beta-lactamasa
integrado en un gen que es infrarregulado por estimulación con PHA
de las células. Seis de 80 clones individuales ensayados fueron
reprimidos por PHA o PMA + Tapsigargina. Se confirmó que todos
estos clones constituían sucesos de integración independientes
mediante un análisis genómico Southern utilizando una sonda de ADN
que codifica betalactamasa. En la Tabla 5 están representados los
resultados de estos estudios.
Los clones aislados a partir de procedimientos
inducidos por PHA (Ejemplo 6) y reprimidos por PHA (Ejemplo 7)
anteriormente descritos se caracterizaron para determinar la
especificidad de su modulación y el tiempo requerido para la
inducción o represión. Los clones fueron estimulados con múltiples
activadores o inhibidores durante un intervalo de tiempo de una a
veinticuatro horas. Como se muestra en la Tabla 6, cinco clones
producidos mediante los paradigmas de selección inducido y
reprimido utilizando una pluralidad de activadores se ensayaron
para determinar su sensibilidad a una diversidad de activadores de
células T, supresores, y combinaciones de los mismos.
\newpage
En este estudio, el PMA, que es un activador de
PKC, la tapsigargina, que aumenta el calcio intracelular, el PHA,
que activa la vía de receptores de células T, y la ciclosporina A
que es un inmunosupresor clínicamente aprobado que inhibe la
calcineurina de fosfatos dependiente de Ca2^{+}, se investigaron
para determinar su capacidad para modular la expresión de
beta-lactamasa en clones de BLEC inducidos y
reprimidos por PHA.
Los clones seleccionados muestran una
dependencia variable para su activación e inhibición por estos
activadores e inhibidores lo cual proporciona una indicación de los
sucesos de señalización requeridos para su activación
transcripcional. Cinco de los clones relacionados se generaron
utilizando los enfoques anteriormente descritos en el Ejemplo 6. El
clon C2 se generó utilizando un enfoque más clásico. Este clon se
generó transfectando una construcción de plásmido en el que un
elemento de respuesta 3X NFAT ha sido unido de manera operable a la
expresión de beta-lactamasa. Este elemento 3XNFAT
representa una secuencia de ADN que está presente en la región
promotora de IL-2 y otros genes activados de células
T. Además la línea celular C2 ha sido establemente transfectada con
el receptor muscurínico M1. Esto permite la activación de la
expresión de beta-lactamasa en este clon utilizando
un agonista muscurínico de M1 tal como carbacol. Esta línea celular
representa por tanto un buen testigo para los activadores e
inhibidores celulares ensayados ya que están establecidos los
sucesos de señalización requeridos para su
activación.
activación.
Los resultados de estos estudios indican que las
líneas celulares generadas varían en cuanto a su especificidad con
respecto a la activación o represión mediante activadores. Así,
dependiendo del tipo de sistema en que estas células han de
utilizarse para investigar, mediante los presentes procedimientos se
pone a disposición un panel de clones con una especificidad
variable con respecto a una vía específica.
La Tabla 7 y la Tabla 8 proporcionan datos
similares a los proporcionados en la Tabla 5 para todos los clones
obtenidos mediante los procedimientos de los Ejemplos 5 a 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para confirmar que los cambios en la actividad
de genes informadores reflejaban los cambios de la expresión de
ARNm en estos clones, se realizó un análisis Northern sobre clones
inducidos, constitutivos y reprimidos utilizando una sonda de ADN
radiomarcada, dirigida hacia el gen de
beta-lactamasa. Todos los clones que presentaron
una inducibilidad de la enzima beta-lactamasa
ensayados mostraron una inducibilidad de ARNm de
beta-lactamasa. Todos los clones que presentaron
una expresión constitutiva de beta-lactamasa
mostraron una expresión constitutiva de ARNm de
beta-lactamasa. Todos los clones que presentaron una
expresión de beta-lactamasa reprimida mostraron un
ARNm de beta-lactamasa reprimido. El tamaño del
mensaje de ARNm de beta-lactamasa testigo fue de
aproximadamente 800 pares de bases. Los tamaños de algunos de los
clones de \beta-lactamasa del ARN fueron cambiados
a superiores en el gel, lo cual indicaba que se había realizado un
ARN de fusión entre el transcrito endógeno y
beta-lactamasa. Se identificaron dos genes
conocidos, CDK-6 (aislado a partir del clon
J83-PTI15) y Erg-3 (aislado a partir
del clon J89-PTI4), y dos genes desconocidos, que
se aislaron a partir de los clones J83PI15 y J83PI2,
respectivamente. Para el clon J389-PTI4, se realizó
una transferencia Northern con una sonda de Erg-3
preparada utilizando cebadores de PCR apropiados determinados a
partir de una secuencia publicada que se hibrida tanto con el ARN
de fusión como con el ARN de tipo salvaje (para la secuencia de
Erg-3 véase Stamminger et al., Int. immunol.
5: 63-70 (1993); para metodologías de PCR, véanse
las patentes US nº 4.800.159, nº 4.683.195 y nº 4.683.202). La
inducibilidad en las células Jurkat de tipo salvaje imitó la
actividad de beta-lactamasa en este clon.
Se utilizó el clon J32-6D4 de
células T para identificar inhibidores potenciales de la vía de
receptores de células T. Este clon se seleccionó para un estudio
adicional debido a que es difícil identificar productos químicos
que inhiben una vía de receptores de células T específica. De este
modo, este clon se utilizó para identificar compuestos químicos que
inhiben esta vía de receptores de células T que es estimulada
asimismo por el activador PMA de PKC.
Se realizó un primer rastreo utilizando un
conjunto genérico de 480 productos químicos con propiedades
conocidas. Era conocido que los productos químicos en este conjunto
presentaban una actividad farmacológica. Aproximadamente el uno por
ciento (7/480) de estos productos químicos mostró una proporción de
inhibición mayor que el 50% de la activación por PHA de la
expresión de beta-lactamasa en el clon
J32-6D4 cuando se ensayó por duplicado a una
concentración de 10 \muM del producto químico. Se activaron
células con 1 \mug/ml de PHA durante 18 horas en presencia de los
productos químicos para ensayar la actividad inhibitoria. En la
Tabla 9 se muestran los siete productos químicos que inhibieron
específicamente el clon J32-6D4. Dos de estos
productos químicos inhibieron específicamente el clon
J32-6DA y no la línea celular C2 testigo. Este
ensayo para determinar la especificidad de inhibición incluyó el
rastreo de 480 productos químicos para determinar la actividad
inhibitoria utilizando el clon C2, en el que el receptor
muscarínico M1 estaba unido a una lectura de gen informador de
beta-lactamasa de NFAT (véase el Ejemplo 7). En
estos experimentos, la inhibición medida fue la inhibición de la
expresión inducida por carbacol de beta-lactamasa.
Estos resultados, la inhibición específica de células
J32-6D4 pero no de células C2, muestran que los
productos químicos no son tóxicos, no inhiben la transcripción
general y no inhiben el producto de gen informador.
Habiendo demostrado en el Ejemplo 9 que el clon
J32-6D4 se comporta sólidamente en un rastreo de
productos químicos, dicho clon se utilizó para rastrear 7.500
productos químicos adicionales de una biblioteca de productos
químicos patentada a una concentración de 10 \muM por cada
producto químico. Esta colección de productos químicos, a
diferencia de la colección de productos químicos utilizados en el
Ejemplo 9, contiene productos químicos sin una actividad
farmacológica conocida. Setenta y siete productos químicos mostraron
una inhibición de por lo menos el 50% de la activación por PHA de
la expresión de beta-lactamasa siguiendo los
procedimientos generales expuestos en el Ejemplo 7. Dichos 77
productos químicos se volvieron a ensayar para determinar esta
actividad utilizando el mismo procedimiento y se confirmó que 31
productos químicos presentaban actividad. Se determinaron los
valores de IC50 de la inhibición de la activación por PHA de la
expresión de beta-lactamasa para estos 31 productos
químicos utilizando concentraciones del producto químico
comprendidas entre aproximadamente 20 \muM y 2 nM. Los valores de
IC50 reflejan la concentración de un producto químico necesaria para
inhibir la activación por PHA del clon en el 50% y se determinaron
utilizando procedimientos conocidos. Estos 31 productos químicos se
ensayaron asimismo para determinar su inhibición cruzada de la
activación inducida por carbacol de la expresión de
beta-lactamasa del clon C2, tal como se describe en
el Ejemplo 8.
Dos productos químicos, designados producto
químico A y producto químico B, presentaron valores de IC50 de
aproximadamente 200 \muM e inhibieron específicamente la
activación por PHA de la expresión de beta-lactamasa
del clon J32-6D4, pero no la activación por
carbacol del clon C2 a la concentración ensayada. Todos los demás
de los 31 compuestos químicos o bien inhibieron tanto el clon
J32-6D4 como el clon C2, o presentaron valores de
IC50 por encima de 1 \muM.
Los productos químicos A y B se ensayaron además
para determinar su efecto anti-proliferativo sobre
células Jurkat y sobre células L de ratón (línea celular de
fibroblastos de ratón). El compuesto químico B no presentó ningún
efecto anti-proliferativo tanto sobre células Jurkat
como sobre células L a concentraciones hasta de 10 \muM. El
producto químico A presentó un efecto antiproliferativo sobre las
células Jurkats y las células L a una concentración de 100 nM. Los
ensayos de proliferación se realizaron sembrando aproximadamente
20.000 células inactivadas por PHA en una placa de 24 pocillos.
Dichas células se pusieron en contacto con productos químicos y se
incubaron a continuación a una temperatura de 37ºC durante cinco
días. Las células se pusieron en contacto con 10 \mug/ml de MTT
(Sigma Chemical Co., MO) durante tres horas. Las células se
recogieron seguidamente, se volvieron a suspender en isopropanol, y
se leyó la absorbancia en un lector de placas a una longitud de
onda de 570 nM con una sustracción de ruido de fondo en una lectura
a una longitud de onda de 690 nm (véase Carmichael et al.,
Cancer Res. 47:936 (1987)).
Se desarrolló un ensayo para ensayar los
compuestos químicos identificados en el Ejemplo 9 para determinar
su capacidad para inhibir la activación y la proliferación de
glóbulos blancos periféricos normales para confirmar su presunta
actividad (véase en general, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, (1988)). Se extrajo sangre
periférica procedente de seres humanos normales y se introdujo en
tubos Vacutainer® heparinizados y se incubó con diversas
concentraciones de enterotoxina estafilocócica B (superantígeno)
(SEB, a una concentración de 0,001 a 10 ng/ml) durante 1 hora a una
temperatura de 37ºC. Brefeldin A, el cual se añadió y las células
se incubaron durante 5 horas adicionales. Se añadió EDTA para
despegar las células, y se retiró una parte alícuota de 100 \mul,
los glóbulos rojos se lisaron con cloruro de amonio, las células
remanentes se contaron y su viabilidad se determinó utilizando una
tinción de viabilidad utilizando procedimientos conocidos. Los
glóbulos rojos que permanecían en la muestra original se lisaron con
cloruro de amonio y las células remanentes (leucocitos) se
permeabilizaron con una solución permeabilizante de FACS utilizando
procedimientos establecidos. Dichos leucocitos se recogieron por
centrifugación, se lavaron y se tiñeron con la combinación de
anticuerpos CD69, IFN\gamma y CD3, que se marcaron de modo
detectable. Las células testigo consistieron en células incubadas
en ausencia de SEB y las células testigo de tinción consistieron en
células teñidas con anticuerpos CD69/MslgG1 y CD3, que se marcaron
de modo detectable. Cultivos similares se incubarán durante 71
horas, se someterán a impulsos con timidina tritiada durante 1 hora
y se recogerán y la radiactividad incorporada se computará por
centelleo para determinar un índice de estimulación utilizando
procedimientos establecidos.
Utilizando concentraciones preferidas de SEB, se
añadieron diversas concentraciones de ciclosporina A (CsA) para
determinar las condiciones óptimas de CsA para el bloqueo de la
estimulación por SEB de células T de sangre periférica para su
utilización como testigo para células T no proliferativas. Los
testigos consistieron en células incubadas con medios de cultivo en
lugar de CsA. Los cultivos testigo incubados durante 1 hora fueron
bloqueados con Brefeldin A durante 5 horas adicionales, se
recogieron, y se tiñeron para determinar IFN\gamma intracelular o
se cultivaron durante 71 horas adicionales, se sometieron a impulsos
con timidina tritiada durante una hora, se recogieron y se
computaron mediante centelleo líquido.
Utilizando concentraciones preferidas de SEB y
de CsA, se estimuló sangre procedente de donadores normales en
presencia y en ausencia de CsA. Esto estableció intervalos normales
esperados para el grado de activación (% de IFN\gamma + CD3
activado + células durante 6 horas), para la proliferación
(absorción de 3H-TdR a las 72 horas) y bloqueo por
CsA en ambos momentos).
Utilizando condiciones preferidas, se incubó
sangre humana con el Producto Químico A o con el Producto Químico B
a concentraciones de 2, 20 y 200 nM. Se utilizó CsA como testigo
positivo para la supresión de células T. Cultivos de una hora se
bloquearon con Brefeldin A durante 5 horas adicionales, se
recogieron y se computaron por centelleo líquido. Se presentaron
los recuentos de células y el porcentaje de viabilidad para cada
condición de cultivo.
Los resultados de estos estudios deberán
demostrar que por lo menos uno de los compuestos químicos
identificados mediante los procedimientos de la presente invención
presentan la actividad farmacológica prevista en células
humanas.
Otra utilización de este procedimiento consiste
en la identificación de genes expresados durante diversos procesos
celulares, tales como la biología de desarrollo y la apoptosis. Se
pueden identificar genes implicados en programas de desarrollo
específicos, tales como la diferenciación de
pre-adipocitos para formar adipocitos maduros,
utilizando este procedimiento.
Con el fin de practicar este procedimiento, se
prepara una biblioteca de clones a partir de una línea celular de
pre-adipocitos tal como 3T3-L1
utilizando los procedimientos descritos en general en los Ejemplos
10 a 12 anteriores. Naturalmente, se utilizan células de
pre-adipocitos en lugar de células Jurkat. Esta
línea celular se puede diferenciar de modo reversible para formar
adipocitos maduros exponiéndola a dexametasona e indometasona
(véase, Hunt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
83:3786-3789 (1986)). Estos adipocitos maduros se
pueden diferenciar reversiblemente para formar
pre-adipocitos con el factor de necrosis tumoral
alfa TNFa (véase Torti et al., J. Cell. Biol. 108:
1105-1113 (1989)). De este modo, se puede preparar
una biblioteca de células capaz de señalar la expresión de genes
implicados en la diferenciación celular.
La biblioteca de atrapamiento de genes
3T3-L1 se selecciona por FACS para eliminar células
azules que expresan constitutivamente
beta-lactamasa. Las células verdes remanentes se
diferencian a continuación para formar adipocitos maduros
utilizando la dexametasona y la indometasona. Se aíslan células
azules (que expresan beta-lactamasa) utilizando
FACS. Estos clones representan células en las que la construcción de
atrapamiento se integra en un gen que se expresa en adipocitos
diferenciados, pero no en adipocitos no diferenciados. Este
procedimiento se puede repetir múltiples veces para asegurar el
enriquecimiento de células que expresan genes específicos de
adipocitos.
Alternativamente, se pueden aislar clones de
células que se diferencian durante un intervalo de tiempo
específico. Por ejemplo, se seleccionan células azules y verdes
diferenciadas durante 2 días con dexametasona e indametasona. Estas
poblaciones de células representan células en las que la
construcción de atrapamiento se integra en un gen que se expresa
tempranamente en el proceso de diferenciación. Esto permite la
identificación de genes que se expresan durante el programa de
desarrollo, pero que no se expresan en
pre-adipocitos o en adipocitos maduros. Este
procedimiento se puede utilizar para aislar genes expresados durante
una diversidad de programas de desarrollo, incluyendo, pero sin
limitarse a ellos células neuronales, cardiacas, musculares y
cancerosas.
Estas líneas celulares se pueden utilizar para
identificar genes implicados en el proceso de diferenciación, y se
pueden asimismo utilizar para rastrear productos químicos que
modulan el proceso de diferenciación utilizando los procedimientos
descritos en los Ejemplos 8 a 10 anteriores. Los fármacos que se
pueden identificar incluyen los que favorecen el crecimiento de
células, tales como células neuronales, o deprimen el crecimiento o
invierten la diferenciación de células, tales como células
cancerosas.
Se pueden utilizar los procedimientos generales
de los Ejemplos 8 a 10 de una manera análoga para identificar
líneas celulares adecuadas para rastrear receptores acoplados con
proteína G (GPCR). Es conocido que los GPCR proporcionan señales
por medio de una entre varias vías intracelulares. Estas vías se
pueden activar farmacológicamente en bibliotecas de células para
proporcionar líneas celulares de rastreo potenciales. Por ejemplo,
es conocido que los GPCR acoplados con Gq elevan la cantidad de
calcio libre intracelular por medio de la activación de fosfolipasa
Cb (PLCb). Aislando líneas celulares sensibles a un aumento del
calcio de la biblioteca genómica (por ejemplo inducida por
ionomicina o tapsigargina), se generan líneas celulares de
rastreo.
Por ejemplo, un clon sensible al calcio se
transfectó con un GPCR de tipo Gq por electroporación. Células del
clon J389PTI4 se transfectaron por electroporación con un plásmido
(pADNc3 (Invitrogen) o pADNc3-M1 (pADNc3 que puede
expresar de manera operable el receptor M1) para preparar líneas
celulares J389PTI4/pADNc3 y J389PTI4/
pADNc3-M1). La línea celular J389PTI4/pADNc3-M1 expresó el receptor M1, mientras que la línea celular J389PTI4/
pADNc3 no lo hizo. Por tanto, la célula J389PTI4/pADNc3 es una célula testigo. Dos días después de la transfección, se estimularon células con carbacol 20 \muM en una placa de microtitulación de 96 pocillos durante 6 horas a una temperatura de 37ºC. Estas células se pusieron en contacto con colorante CCF-2 durante otros 90 minutos. Los cambios de la relación 460/530 se midieron en un lector de placas de fluorescencia Cytofluor (Modelo Serie 4000) (Perceptive Biosystems) y corresponden a la expresión de genes informadores. En la Tabla 10 se exponen estos resultados. La capacidad del clon transitoriamente transfectado para detectar un ligando para el GPCR demuestra el potencial para generar líneas celulares de rastreo utilizando clones preparados siguiendo los procedimientos de la presente invención. La estimulación por carbacol detectada en el ensayo de transfección transitoria representa una respuesta en aproximadamente el 20% de las células. Para desarrollar una línea celular de rastreo estable para el receptor M1, esta población se puede seleccionar para determinar clones individuales sensibles a carbacol y dichos clones se pueden expandir y rastrear para identificar los clones más sensibles.
pADNc3-M1). La línea celular J389PTI4/pADNc3-M1 expresó el receptor M1, mientras que la línea celular J389PTI4/
pADNc3 no lo hizo. Por tanto, la célula J389PTI4/pADNc3 es una célula testigo. Dos días después de la transfección, se estimularon células con carbacol 20 \muM en una placa de microtitulación de 96 pocillos durante 6 horas a una temperatura de 37ºC. Estas células se pusieron en contacto con colorante CCF-2 durante otros 90 minutos. Los cambios de la relación 460/530 se midieron en un lector de placas de fluorescencia Cytofluor (Modelo Serie 4000) (Perceptive Biosystems) y corresponden a la expresión de genes informadores. En la Tabla 10 se exponen estos resultados. La capacidad del clon transitoriamente transfectado para detectar un ligando para el GPCR demuestra el potencial para generar líneas celulares de rastreo utilizando clones preparados siguiendo los procedimientos de la presente invención. La estimulación por carbacol detectada en el ensayo de transfección transitoria representa una respuesta en aproximadamente el 20% de las células. Para desarrollar una línea celular de rastreo estable para el receptor M1, esta población se puede seleccionar para determinar clones individuales sensibles a carbacol y dichos clones se pueden expandir y rastrear para identificar los clones más sensibles.
Se pueden utilizar procedimientos similares para
generar líneas celulares para receptores acoplados con Gs o Gi. En
estos casos, se pueden aislar clones sensibles a aumentos o
reducciones de AMPc. Se puede utilizar una diversidad de líneas
celulares para estos procedimientos, tales como células CHO, HEK293,
neuroblastomas, P19, F11 y NT-2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
G. Friedrich, P. Soriano,
Methods in Enzymology, Vol. 225: 681 (1993)
G. Friedrich, P. Soriano, Genes
& Development, Vol. 5: 1513 (1991)
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Enzimology, Vol. 225: 664 (1993)
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Biochem, Vol. 13: 343 (1993)
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Acids Research, Vol. 17, nº 17: 7155 (1987)
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W. Wurst, et al., Genetics,
Vol. 139: 889 (1995).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: AURORA BIOSCIENCES CORPORATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11149 N. Torrey Pines Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 92037
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimientos y composiciones para determinar los perfiles de respuesta celular
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Microsoft Word Ver. 6.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-SEPT-1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/179,697
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-SEPT-1996
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 793 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...795
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 858 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...858
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 843 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 49...843
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 792 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...792
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 786 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...786
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA nº 5:
Claims (18)
1. Procedimiento para determinar un perfil de
respuesta celular para una diana, que comprende:
- i)
- introducir una diana en una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor que codifica una \beta-lactamasa,
- ii)
- inducir la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o poner en contacto dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana,
- iii)
- separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de dicha \beta-lactamasa en respuesta a la etapa (ii),
- iv)
- identificar una pluralidad de polinucleótidos genómicos que presentan un incremento o una disminución en la expresión presente en dicha segunda pluralidad de células, en el que un incremento o una disminución en la expresión de cada uno de dichos polinucleótidos genómicos de dicha pluralidad de polinucleótidos proporciona un perfil de respuesta celular relacionado con dicha diana,
en el que dicho polinucleótido de
\beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha
primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector
vírico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento para determinar un perfil de
respuesta celular para un producto químico, que comprende:
- i)
- poner en contacto una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor, con dicho producto químico,
- ii)
- separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de la \beta-lactamasa en respuesta al contacto con dicho producto químico,
- iii)
- identificar una pluralidad de polinucleótidos genómicos que presentan un incremento o una disminución en la expresión presente en dicha segunda pluralidad de células, en el que un incremento o una disminución en la expresión de cada uno de dichos polinucleótidos genómicos de dicha pluralidad de polinucleótidos proporciona un perfil de respuesta celular relacionado con dicho producto químico,
en el que dicho polinucleótido de
\beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha
primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector
vírico.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento para cribar compuestos para su
actividad como activador o inhibidor de una diana, que
comprende:
- i)
- introducir una diana en una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido sin promotor que codifica \beta-lactamasa,
- ii)
- inducir la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o poner en contacto dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana,
- iii)
- separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de la \beta-lactamasa en respuesta a la etapa (ii),
- iv)
- poner en contacto una célula obtenida a partir de dicha segunda pluralidad de células con un producto químico de ensayo,
- v)
- inducir opcionalmente la expresión de dicha diana en dicha célula o poner en contacto dicha célula con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana,
- vi)
- determinar si dicho producto químico de ensayo incrementa o disminuye la actividad de la \beta-lactamasa en comparación con una célula de control que no se puso en contacto con dicho producto químico de ensayo,
en el que dicho polinucleótido de
\beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha
primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector
vírico.
\newpage
4. Procedimiento para desarrollar un panel
sensor celular, que comprende:
- i)
- introducir una diana en una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor que codifica una \beta-lactamasa,
- ii)
- inducir la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o poner en contacto dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana,
- iii)
- separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de dicha \beta-lactamasa en respuesta a la etapa (ii),
- iv)
- seleccionar células para dicho panel sensor celular a partir de dicha segunda pluralidad de células que presentan una variación de 1,5 a 40 veces mayor en la proporción 460/530 de la fluorescencia medida en respuesta a la inducción de la expresión de dicha diana en dichas células clonales, o en respuesta a la exposición de dichas células clonales a un ligando, inhibidor o activador para dicha diana, y
en el que dicho polinucleótido de
\beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha
primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector
vírico.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho vector vírico comprende una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de aceptor de
empalme, una secuencia de donador de empalme,
en el que dicha secuencia de aceptor de empalme
flanquea a dicho polinucleótido que codifica dicha
\beta-lactamasa, y dicha secuencia de donador de
empalme flanquea a dicho polinucleótido que codifica dicha
\beta-lactamasa.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho vector vírico comprende además una secuencia de inicio
traduccional para dicha \beta-lactamasa.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha segunda pluralidad de células presenta una variación
de 1,5 a 40 veces mayor en la proporción 460/530 de la fluorescencia
medida en respuesta a la inducción de la expresión de dicha diana
en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o la puesta en
contacto con dicha primera pluralidad de células eucarióticas con
un ligando, inhibidor o activador de dicha diana.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que dicha secuencia de inicio traduccional comprende una
secuencia de Kozak.
9. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho vector vírico comprende además un sitio de entrada de
ribosoma interno.
10. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho vector vírico comprende además un sitio de
poliadenilación para dicha \beta-lactamasa.
11. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho vector vírico es un retrovirus.
12. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicha primera pluralidad de células eucarióticas comprende
poblaciones de por lo menos 10.000 células.
13. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicha primera pluralidad de células eucarióticas comprende
poblaciones de por lo menos 100.000 células.
14. Panel sensor celular, que comprende:
una pluralidad de células clonales, en el que
cada célula clonal comprende un polinucleótido genómico distinto
unido funcionalmente a un polinucleótido de
\beta-lactamasa sin promotor que codifica una
\beta-lactamasa, y
en el que dichas células clonales presentan una
variación de 1,5 a 40 veces mayor en la proporción 460/530 de la
fluorescencia medida en respuesta a la inducción de la expresión de
dicha diana en dichas células clonales, o en respuesta a la
exposición de dichas células clonales a un ligando, inhibidor o
activador de dicha diana, y
en el que dicho polinucleótido de
\beta-lactamasa sin promotor se introdujo en
dichas células clonales mediante un vector vírico con la condición
de que dichas células clonales no sean obtenidas mediante un
procedimiento que comprende la etapa que consiste en utilizar
embriones humanos para generar células madre embrionarias
huma-
nas.
nas.
\newpage
15. Panel sensor celular, que comprende:
una pluralidad de células clonales, en el que
cada una de dichas células clonales comprende un polinucleótido
genómico distinto unido funcionalmente con una construcción de
expresión de \beta-lactamasa sin promotor, y
en el que dichas células clonales presentan una
variación de 1,5 a 40 veces mayor en la proporción 460/530 de la
fluorescencia medida en respuesta a la puesta en contacto de un
producto químico de ensayo con dichas células clonales, y
en el que dichas células clonales fueron
seleccionadas a partir de una población de células a la que se había
introducido un vector vírico, y en el que dicho vector vírico
carece de un promotor para expresar dicha
\beta-lactamasa, con la condición de que dichas
células clonales no sean obtenidas mediante un procedimiento que
comprende la etapa que consiste en utilizar embriones humanos para
generar células madre embrionarias humanas.
16. Panel sensor celular según la reivindicación
14 ó 15, en el que dicho panel comprende además por lo menos una
línea celular en la que dicha expresión de
\beta-lactamasa está bajo el control de un
elemento de respuesta.
17. Panel sensor celular según la reivindicación
14 ó 15, en el que dicho panel es una placa multipocillo.
18. Panel sensor celular según la reivindicación
14 ó 15, en el que dichas células clonales se obtienen a partir de
células madre hematopoyéticas o embrionarias, con la condición de
que las células madre embrionarias no sean obtenidas mediante un
procedimiento que comprende la etapa que consiste en utilizar
embriones humanos para generar células madre embrionarias
humanas.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US719697 | 1996-09-26 | ||
US08/719,697 US5928888A (en) | 1996-09-26 | 1996-09-26 | Methods and compositions for sensitive and rapid, functional identification of genomic polynucleotides and secondary screening capabilities |
Publications (2)
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