ES2312753T3 - Procedimiento para producir moleculas de arn de interferencia en celulas de mamifero y usos terapeuticos para tales moleculas. - Google Patents
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Abstract
Uno o más vectores para su uso en terapia que comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en vectores separados y en los que cuando el uno o más vectores se introducen en una célula de mamífero la molécula de ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la expresión de un gen diana en la célula de mamífero, inhibiendo de ese modo la expresión del gen diana.
Description
Procedimiento para producir moléculas de ARN de
interferencia en células de mamífero y usos terapéuticos para tales
moléculas.
La presente invención se refiere a la
interferencia de ARN. Más particularmente, la presente invención se
refiere a procedimientos para producir moléculas de ARN de
interferencia en células de mamífero, con la excepción de células
madre embrionarias humanas o células germinales humanas, y a los
usos terapéuticos para tales moléculas expre-
sadas.
sadas.
La interferencia de ARN es el proceso de
silenciamiento génico postranscripcional, específico de secuencia,
en animales y plantas iniciado por ARN bicatenario (bc) que es
homólogo al gen silenciado (Hammond, S.M. et al., 2000;
Fire, A., 1999; Sharp, P.A., 2001). En particular, se sabe que ARNip
sintéticos y endógenos dirigen la degradación de ARNm seleccionado
como diana (Hammond, S.M. et al., 2000; Elbashir, S.M. et
al., 2001; Caplen, N.J. et al., 2001; Clemens, J.C.
et al., 2000; Lipardi, C. et al., 2001; Elbashir,
S.M. et al., 2001; Ui-Tei, K. et al.,
2000).
Esta potente tecnología genética ha implicado
habitualmente la inyección o transfección de ARN bc en organismos
modelo. La interferencia de ARN también es un potente inhibidor de
la expresión del gen seleccionado como diana en una variedad de
organismos (Wianny, F. et al., 2000; Kennerdell, J.R. et
al., 1998; Fire, A. et al., 1998; Oelgeschlager, M.
et al., 2000; Svoboda, P. et al., 2000). Recientes
estudios por varios grupos (Lipardi, C. et al., 2001; Sijen,
T. et al., 2001) sugieren que todos los ARN de interferencia
pequeños bc (ARNip) son parte de un complejo de riboproteína que
incluye una nucleasa relacionada con la ARNasa III (Dicer)
(Bernstein, E. et al., 2001), una familia de helicasas
(Dalmay, T. et al., 2001; Cogoni, C. et al., 1999) y
posiblemente una quinasa (Nykanen, A. et al., 2001) y una
RdRP (Lipardi, C. et al., 2001; Smardon, A. et al.,
2000). El mecanismo propuesto por Ligardi et al. (Lipardi,
C. et al., 2001) es que uno de los oligómeros de ARNip
(antisentido con respecto al ARN diana) ceba una RdRP, generando
ARNbc más largos, que entonces se escinden mediante la actividad
ARNasa III en dúplex de ARNip adicionales, modificando de ese modo
los ARNip del molde diana.
El ARNbc \geq 30 pb puede desencadenar en
células de mamífero respuestas de interferón que son intrínsecamente
no específicas de secuencia (Elbashir, S.M. et al., 2001).
Sin embargo, los dúplex de ARNip de 21 nucleótidos (nt) con
proyecciones cortas en 3' pueden mediar la interferencia de ARN de
una manera específica de secuencia en células de mamífero
cultivadas (Elbashir, S.M. et al., 2001). Dos grupos han
demostrado que dúplex de 19 a 21 bases con proyecciones UU o TT en
3' pueden provocar eficazmente una respuesta de ARNip en células de
mamífero (Elbashir, S.M. et al., 2001; Caplen, N.J. et
al., 2001). Sin embargo, una limitación al uso de ARNip como
reactivo terapéutico en células de vertebrados es que necesita
suministrarse ARN sumamente definido, corto, a células dianas, que
hasta la fecha se ha logrado sólo usando ARN en dúplex sintéticos
suministrados de manera exógena a las células (Elbashir, S.M. et
al., 2001; Caplen, N.J. et al., 2001).
La presente invención supera al menos la
limitación anterior.
La presente invención implica procedimientos
para producir moléculas de ARN de interferencia, bicatenario en
células de mamífero, y preferiblemente células humanas,
introduciendo en las células secuencias de ADN que codifican las
moléculas de ARN de interferencia.
El procedimiento comprende a) insertar
secuencias de ADN que codifican una cadena sentido y una cadena
antisentido de una molécula de ARN de interferencia en un vector
que comprende un promotor de ARN pol III y b) introducir el vector
en una célula de mamífero de modo que puede expresarse la molécula
de ARN.
En una realización preferida, la presente
invención incluye seleccionar en primer lugar una secuencia diana,
que preferiblemente es accesible para el apareamiento entre la
secuencia diana y el ARN de interferencia requerido para que el ARN
de interferencia funcione de manera apropiada. Pueden llevarse a
cabo procedimientos para identificar sitios diana usando
oligonucleótidos de ADN sintéticos en extractos celulares y/o un
enfoque de selección de sitio sobre ARN nativo, tal como se
describe en el presente documento. Una vez identificado un sitio
diana óptimo, pueden sintetizarse las secuencias apropiadas para
preparar las cadenas sentido y antisentido de la molécula de ARN de
interferencia.
Los sitios diana posibles incluyen los
encontrados en productos de transcripción de genes de agentes
infecciosos o celulares (virales, bacterianos, etc.).
En una realización preferida, la molécula de ARN
producida es una molécula de ARN de interferencia pequeño (ARNip),
mientras que las secuencias de ADN que codifican las cadenas sentido
y antisentido del ARNip son ADNip.
En una realización preferida, el promotor de ARN
pol III es un promotor de U6 de mamífero, y más preferiblemente el
promotor de ARN pol III U6 humano.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona uno o más vectores que comprenden (i) un primer casete
que comprende un promotor de ARN pol III, operativamente unido a una
secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de
ARN de interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) para su uso en
terapia y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN
pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la
cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer
casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en
vectores separados y en los que cuando el uno o más vectores se
introducen en una célula de mamífero la molécula de ARNip puede
expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la expresión de un
gen diana en la célula de mamífero, inhibiendo de ese modo la
expresión del gen diana.
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona el uso de uno o más vectores para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento del VIH, en el que el uno o más
vectores comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor
de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que
codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia
bicatenario, pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende
un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de
ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en
los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo
vector o están en vectores separados y en los que cuando el uno o
más vectores se introducen en una célula de mamífero la molécula de
ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la
expresión de un gen diana de VIH en la célula de mamífero,
inhibiendo de ese modo la expresión del gen diana de VIH.
Según un aspecto adicional, la invención
proporciona un procedimiento in vitro para someter a prueba
la expresión y función de moléculas de ARNip, que comprende:
cointroducir en una célula de mamífero in vitro (a) uno o
más vectores que comprenden (i) un primer casete que comprende un
promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN
que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de
interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete
que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una
secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula
de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en
el mismo vector o están en vectores separados y (b) un vector que
comprende un promotor que comprende un promotor operativamente
unido a un gen diana, hacer crecer la célula en condiciones en las
que se expresa la molécula de ARNip y someterla a prueba para
determinar la iniciación de la interferencia de ARN de la expresión
del gen diana, mediante lo cual se somete a prueba la función de la
molécula de ARNip. Según este aspecto de la invención, la función y
expresión endógena de la molécula de ARNip puede someterse a ensayo
basándose en la presencia, si es el caso, de interferencia de ARN y
más particularmente mediante cualquier inhibición de la expresión
del gen
diana.
diana.
Por tanto, la presente invención proporciona
muchas posibles aplicaciones terapéuticas, basándose en el diseño
de las moléculas de ARNip y su especificidad para dianas de
enfermedad seleccionadas. Por ejemplo, una aplicación de la
invención es el tratamiento del VIH, para el que pueden diseñarse
moléculas de ARNip para inhibir la expresión de dianas de VIH
seleccionadas, inhibiendo de ese modo la expresión de VIH.
En una realización preferida, la invención
implica inhibir la expresión de un gen diana de VIH introduciendo
uno o más vectores en una célula de mamífero, preferiblemente una
célula humana infectada por VIH. El uno o más vectores comprenden
un promotor adecuado y secuencias de ADN que codifican una cadena
sentido y una cadena antisentido de una molécula de ARNip, que
preferiblemente es específica para el producto de transcripción del
gen diana de VIH. Más preferiblemente, la molécula de ARNip es
específica para un sitio diana seleccionado en el producto de
transcripción del gen diana de VIH seleccionado. Entonces puede
expresarse la molécula de ARNip e iniciarse la interferencia de ARN
de la expresión del gen diana, inhibiendo de ese modo la expresión
del gen diana.
En una realización más preferida, el VIH es
VIH-1. En otra realización preferida, pueden
expresarse múltiples constructos de ARNip dirigidos hacia
diferentes sitios en el genoma de VIH, iniciando de ese modo la
interferencia de ARN de la expresión de varios genes diana de VIH
diferentes y sorteando así posiblemente la resistencia genética del
virus.
La figura 1A muestra un diagrama esquemático de
un constructo rev-EGFP.
La figura 1B [SEC ID Nº: 9] y 1C (AS (I) [SEC ID
Nº: 1], S (I) [SEC ID Nº: 2], AS (II) [SEC ID Nº: 3], S (II) [SEC
ID Nº: 4]) muestran diagramas esquemáticos de un constructo de
promotor de U6 y de un constructo de ARNip dirigido por el promotor
de U6.
La figura 1D muestra ARNip (S (I) [SEC ID Nº:
5], AS (I) [SEC ID Nº: 6], S (II) [SEC ID Nº: 7], AS (II) [SEC ID
Nº: 8] según una realización de la invención.
La figura 2 muestra fotografías de geles de los
ensayos de accesibilidad para los sitios I y II en extractos
celulares preparados a partir de células que expresan
rev-EGFP.
La figura 3 muestra fotografías obtenidas de la
toma de imágenes mediante microscopio de fluorescencia del efecto
de ARNip sobre la expresión de EGFP.
La figura 4 es un gráfico de barras que muestra
el grado de inhibición de la expresión de EGFP por ARNip según una
realización de la invención
Las figuras 5A a 5G muestran autorradiografías
de análisis de geles de tipo Northern.
La figura 6 es un gráfico que muestra la
inhibición de VIH-1 NL4-3 por ARNip
según una realización de la invención.
Las moléculas de ARN de interferencia, y más
preferiblemente moléculas de ARNip, producidas y/o usadas según la
invención incluyen los tipos conocidos en la técnica. Las moléculas
de ARNip de interferencia son ARN bicatenarios (bc) que general y
preferiblemente contienen aproximadamente de 19 a 23 pares de bases.
Las moléculas también contienen preferiblemente proyecciones en 3',
más preferiblemente proyecciones UU en 3' o TT en 3'.
El término "introducir" abarca una variedad
de procedimientos de introducción de ADN en una célula, in
vitro o bien in vivo, incluyendo tales procedimientos la
transformación, transducción, transfección e infección. Los
vectores son agentes útiles y preferidos para introducir ADN que
codifica las moléculas de ARN de interferencia en las células. Los
posibles vectores incluyen vectores de plásmido y vectores virales.
Los vectores virales incluyen vectores retrovirales, vectores
lentivirales y otros vectores tales como vectores adenovirales o
vectores adenoasociados.
En una realización, las secuencias de ADN se
incluyen en vectores separados, mientras que en otra realización,
las secuencias de ADN se incluyen en el mismo vector. Si las
secuencias de ADN se incluyen en el mismo vector, las secuencias de
ADN también pueden insertarse en el mismo casete
transcripcional.
También pueden usarse sistemas de suministro
alternativos para introducir ADN en las células en la presente
invención, incluyendo, por ejemplo, liposomas, así como otros
sistemas de suministro conocidos en la técnica.
El promotor usado según la invención es un
promotor de ARN pol III, que se ubica preferiblemente inmediatamente
en sentido 5' de las secuencias de ADN que codifican la molécula de
ARN de interferencia.
En una realización preferida, la invención usa
un promotor de ARN pol III U6 de mamífero, y más preferiblemente el
promotor de ARNsn pol III U6 humano, que se ha usado anteriormente
para la expresión de transcritos de ribozima cortos definidos, en
células humanas (Bertrand, E. et al., 1997; Good, P.D. et
al., 1997). Se encontró que la pol III de U6 y su secuencia de
terminación sencilla (de cuatro a seis uridinas) expresan ARNip en
células. Pueden insertarse secuencias que codifican ARN de
interferencia o ARNip seleccionadas apropiadamente en un casete
transcripcional, proporcionando un sistema óptimo para someter a
prueba la función y expresión endógena de las moléculas de
ARN.
ARN.
En una realización preferida, las células de
mamífero son células humanas, con la excepción de células madre
embrionarias humanas o células germinales humanas. Sin embargo,
también se entiende que la invención puede llevarse a cabo en otras
células diana, tales como otros tipos de células de vertebrados o
células eucariotas.
Según la invención, se demostró la expresión
eficaz de dúplex de ARNip dirigidos contra la secuencia rev
de VIH-1. Usando un constructo de fusión
rev-EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) en ensayos
de cotransfección transitoria, se observó aproximadamente un 90% de
inhibición de la expresión. Se han sometido a prueba los mismos
constructos de expresión de ARNip contra VIH en ensayos de
cotransfección dando como resultado una reducción de cuatro log en
los niveles de antígeno p24 de VIH.
Los resultados anteriores se lograron usando un
promotor de ARNsn pol III de U6 humano para expresar los ARN de
oligómero de 21 bases apropiados en células humanas. El diseño del
promotor es tal que la primera base del transcrito es la primera
base del ARNip, y el transcrito termina dentro de un tramo de 6 U
codificado en el gen. El promotor de U6+1 inicia la transcripción
con un trifosfato, y el transcrito no está tapado a menos que se
incluyan las primeras 27 bases del ARN de U6 en el transcrito
(Bertrand, E. et al., 1997; Good, P.D. et al., 1997).
Por tanto, se creía que podían prepararse ARNip cuya estructura
imitase estrechamente ciertos requisitos predefinidos (Elbashir,
S.M. et al., 2001; Caplen, N.J. et al., 2001).
Tal como se indicó anteriormente, se diseñan
casetes de expresión de modo que las secuencias que codifican
cadenas sentido y antisentido del ARNip pueden estar en el mismo
vector o bien en vectores separados. Aunque se pronosticó que el
vector que contenía ambas cadenas sentido y antisentido era superior
para la cotransfección de las dos por separado, este no fue el
caso. Es probable que la cotransfección yuxtaponga las dos
secuencias de modo que los transcritos tengan una amplia
oportunidad de formar ARNbc. Una característica interesante del
sistema de expresión es que en células que expresan ambos oligómeros
de ARN sentido y antisentido, se acumula un producto dimensionado
de manera anómala inesperado en grandes cantidades (figuras
5A-D). Los experimentos con pretratamiento con
ARNasa de los ARN antes de la electroforesis e inmunotransferencia
sugieren que este transcrito mayor es bicatenario. El ARN bc puede
estar en forma de un dúplex sencillo, o podría estar unido
covalentemente. Se ha mostrado que los ARNip unidos covalentemente
son eficaces cuando se expresan en células, un resultado algo
contradictorio con los resultados cuando se usa ARNip suministrado
ex vivo (Elbashir, S.M. et al., 2001; Caplen, N.J.
et al., 2001).
Con el fin de establecer si hay diferencias o no
en las accesibilidades al sitio diana para el apareamiento de ARNip
tal como se observó para ribozimas y oligos antisentido (Scherr, M.
et al., 1998; Scherr, M. et al., 2001; patente
estadounidense número 6.562.570), se sometieron a prueba dos sitios
diana para los ARNip. Se eligió un sitio mediante un mecanismo de
exploración de biblioteca de oligonucleótidos diseñado para
identificar sitios accesibles para el apareamiento antisentido en
ARN nativo en extractos celulares (Scherr, M. et al., 2001),
mientras que el otro sitio se eligió al azar en un segmento de
rev que se solapa con la secuencia tat de
VIH-1. Las marcadas diferencias en la accesibilidad
para el apareamiento de oligos en estos dos sitios se tradujeron en
marcadas diferencias en las actividades inhibidoras de ARNip en la
fusión rev-EGFP. A pesar de las diferencias en la potencia
contra la diana rev-EGFP, ambos ARNip fueron potentes
inhibidores en ensayos de cotransfección con VIH-1.
Por tanto, la invención demuestra la expresión intracelular
funcional de ARNip en células de mamífero, particularmente célula
humanas.
Un resultado interesante era la relación entre
la accesibilidad al sitio de oligómeros de ADN antisentido y la
eficacia de los ARNip dirigidos contra el transcrito
rev-EGFP. Más específicamente, se observó una relativa
carencia de inhibición de la diana rev-EGFP mediada por ARNip
de sitio I. Este resultado no era el resultado de la escasa
expresión de estos oligómeros, dado que parecen expresarse en
cantidades equivalentes a ARNip de sitio II (figuras
5A-D). Estos resultados diferentes podrían deberse a
la posición del sitio diana de ARNip en relación con el extremo del
transcrito diana, que se ha demostrado que limita la amplificación
de los ARNip en Drosophila (Elbashir, S.M. et al.,
2001). Sin embargo, este no parece ser el caso dado que el sitio I
está colocado a 301 nucleótidos en sentido 3' del sitio de inicio
transcripcional de pIND-rev-EGFP, que es bastante más de la
distancia mínima requerida para amplificar los ARNip. Estos
resultados podrían deberse a diferentes dianas usadas en diferentes
experimentos. La accesibilidad relativa del sitio I en el contexto
del ARNm de fusión de rev-EGFP puede ser limitativa tal como
se muestra mediante experimentos de oligo-ARNasaH
(figura 2). En los transcritos de VIH-1, el sitio I
está presente en ambos transcritos tat y rev, así
como en los transcritos no cortados y empalmados, y cortados y
empalmados individualmente. Dada la complejidad de los diferentes
transcritos que albergan el sitio I, no es posible establecer cuál
de estos es sensible a los ARNip de sitio I.
ARNm diana para someter a prueba ARNip.
Un requisito previo para el desarrollo de enfoques de ARNip para
silenciar la expresión génica viral es tener un sistema de ensayo de
células humanas apropiado. Con el fin de someter a ensayo los
ARNip, se fusionó rev con EGFP (proteína fluorescente verde
potenciada) para proporcionar un sistema indicador para controlar
la función de ARNip (figura 1A). Se obtuvo el control temporal de la
expresión de ARNm diana insertando el gen de la fusión de
rev-EGFP en el sistema de vector pIND inducible por ecdisona
(Invitrogen) (figura 1A). Resultará fácilmente evidente para los
expertos en la técnica que pueden usarse promotores y sistemas de
vector alternativos para expresar genes de fusión diana o genes
diana seleccionados, durante los ensayos de cotransfección.
Con el fin de usar el sistema inducible, se usó
una línea celular 293/EcR, que se modificó genéticamente para
responder al análogo de hormona de insectos ponasterona A. Cuando se
transfectó el vector pIND-rev-EGFP en estas células seguido
por la adición del inductor, se observó fluorescencia de EGFP en tan
sólo 3 h tras la adición de ponasterona A y continuó durante más de
100 h. En ausencia de ponasterona A, no se observó fluorescencia de
EGFP.
En la figura 1A, se indican las ubicaciones
relativas de los dos sitios diana de ARNip en la diana
rev-EGFP, así como las ubicaciones de estos dos sitios diana
en transcritos de VIH a partir de pNL4-3.
Accesibilidad al sitio diana en el transcrito
de la fusión rev-EGFP. Se demostró previamente
que pueden usarse oligonucleótidos de ADN sintéticos en extractos
de células u ovarios para identificar sitios accesibles para el
apareamiento de bases por ambos ADN antisentido y ribozimas (Scherr,
M. et al., 1998; Scherr, M. et al., 2001; Lee, N.S.
et al., 2001). Se usaron bibliotecas de oligómeros de ADN de
19-mero semialeatorias (Scherr, M. et al.,
2001) en extractos celulares preparados a partir de células que
expresan los transcritos de ARNm de rev-EGFP. Usando este
enfoque para explorar la secuencia rev entera, sólo se
identificó un único producto de TdPCR (datos no mostrados), que se
centraba dentro de la secuencia 5'GCCTGTGCCTCTTCAGCTACC 3' [SEC ID
Nº:10], ubicada a 213 nucleótidos en sentido 3' del codón AUG de
rev y a 494 nucleótidos en sentido 3' del sitio de
iniciación de la transcripción de pIND. Dado que esta secuencia
alberga un motivo de rotura de ribozima de cabeza de martillo CUC,
también se sintetizó una ribozima de cabeza de martillo que rompe
tras el sitio CUC. Esto permitió una comparación entre la actividad
inhibidora del ARNip con una ribozima expresada a partir del mismo
sistema de promotor. Para determinar si hay o no diferencias en el
transporte dirigido mediado por ARNip de un mensaje dado, se
seleccionó un segundo sitio de 21 nucleótidos con una G en 5' y una
C en 3', que tiene un contenido en GC total similar al sitio I. Los
requisitos de una G en 5' y una C en 3' se basan en el primer
nucleótido del transcrito pTZU6+1, que se inicia con una G (figuras
1C y D). La segunda secuencia diana, 5'GCGGAGACAGCGACGAAGAGC3' [SEC
ID Nº:11], también se ubica en un exón común a tat y
rev, a 20 nucleótidos en sentido 3' del codón de iniciación
transcripcional de rev y a 301 nucleótidos en sentido 3' de
la señal de iniciación transcripcional de pIND.
En la figura 1B, se muestra la presentación
esquemática del promotor en sentido 5' y se muestra la parte de
transcrito del casete de expresión de U6 con las secuencias y la
estructura representada del transcrito primario esperado. En la
figura 1C se muestran las secuencias de los insertos sentido y
antisentido de 21 bases con una sucesión de 6T y XbaI. La primera G
provino del SalI tratado con Mung Bean del vector pTZU6+1.
Los 6T pueden procesarse en los 2T (letras mayúsculas) mediante la
polimerasa ARN pol III. En la figura 1D, se representan los ARNip
supuestos derivados de la expresión conjunta de los
21-meros antisentido y sentido [S/AS (I) o (II)],
con proyecciones UU en 3'.
Para determinar si las dos secuencias diana eran
igualmente accesibles para el apareamiento antisentido, se
sintetizaron oligonucleótidos de ADN de 21-mero
complementarios a cada uno de los dos sitios diana de ARNip y se
usaron como sondas para determinar la accesibilidad para el
apareamiento de bases con los transcritos de la fusión
rev-EGFP en extractos celulares. Se demostró (figura 2) que
el sitio II es sumamente accesible para el apareamiento de bases
con su oligo relacionado (reducción del 89% en el producto de
RT-PCR en relación con el control sin oligo). Esto
era al contrario que los resultados obtenidos con el oligo de sitio
I, que redujo el transcrito de rev-EGFP en un 27% en
relación con el control. Dado que estos dos sitios tienen marcadas
diferencias en sus accesibilidades para el apareamiento antisentido
(figura 2), proporcionaron una buena prueba del papel que desempeña
la accesibilidad a la diana en el transporte dirigido mediado por
ARNip.
En la figura 2, las bandas teñidas con bromuro
de etidio representan productos de RT-PCR de ARNm de
rev-EGFP (parte superior, 673 nucleótidos) o actina beta
(parte inferior, 348 nucleótidos). Los carriles desde la izquierda
hasta la derecha son: control, sin oligo añadido, menos (-) o más
(+) RT; sondas de oligonucleótidos para el sitio I (-) o (+) RT,
sondas de oligonucleótidos para el sitio II (-) o (+) RT. La
reducción en el ARNm diana está provocada por la actividad ARNasa H
endógena tal como se describió anteriormente (Scherr, M. et
al., 1998).
Se insertaron genes que codifican ARNip
dirigidos al sitio I o II detrás del promotor de ARNsn pol III U6
de pTZU6+1 (figuras 1B y C). Se construyeron los casetes
transcripcionales de modo que están en el mismo vector o bien en
vectores diferentes. Los constructos en vectores separados
proporcionaron un conjunto de controles sentido y antisentido.
Reducción de la expresión del gen diana.
Las secuencias de ARNip, junto con controles sentido, antisentido y
de ribozima se cotransfectaron con el plásmido que expresa la diana
rev-EGFP en células 293/EcR. De dieciséis a veinticuatro
horas más tarde, se añadió el inductor ponasterona A a los cultivos
celulares dando como resultado la inducción del producto de fusión
rev-EGFP. Se incubaron las células durante 48 horas
adicionales antes de los análisis microscópicos de fluorescencia y
la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los
oligómeros de ARN sentido y antisentido combinados dirigidos al
sitio II en la secuencia rev redujeron la señal de EGFP en
aproximadamente un 90% en relación con los controles, mientras que
los oligómeros de ARN sentido y antisentido combinados dirigidos
contra el sitio I dieron sólo una modesta reducción en la
fluorescencia (figuras 3 y 4). La inhibición mediada por los ARNip
de sitio I era similar independientemente de si se expresaban ambos
oligómeros de ARN sentido y antisentido a partir del mismo plásmido
o estructuras principales de plásmido diferentes (véanse las
figuras 1B y C). Los constructos de control, que incluían sentido
solo, antisentido solo o una ribozima dirigida al sitio II,
expresados cada uno a partir del promotor de U6, no dieron una
reducción significativa de la expresión de EGFP en relación con el
control de estructura principal de vector (figuras 3 y 4).
En la figura 3, se contransfectaron células
293/EcR con pIND-rev-EGFP y diversos constructos de ARNip
tal como se indica. Se examinaron las células microscópicamente para
detectar la expresión de EGFP tras la adición de ponasterona A tal
como se describe en el presente documento. El panel E muestra
células fluorescentes tras la transfección con el control que es un
constructo sentido/antisentido irrelevante para el rev.
Otros tipos de controles [S (II), AS (II), vector] eran similares
(A, B, D). El panel C muestra una reducción de \sim90% en las
células fluorescentes cuando se transfectaron células 293/EcR con
S/AS (II). Los paneles F-J son imágenes teñidas con
DAPI que muestran que está presente el mismo número de células en
cada campo. Se confirmó el silenciamiento específico de genes diana
en al menos tres experimentos independientes.
En la figura 4, se contransfectaron células
293/EcR con constructos de ARNip y pIND-rev-EGFP tal como se
describe en el presente documento. Se analizaron las células para
detectar la expresión de EGFP mediante FACS y se cuantificó el
nivel de fluorescencia en relación con células transfectadas con
pIND-rev-EGFP solo. Los datos son el promedio \pm DE de
tres experimentos separados. Sólo el constructo de ARNip que
contenía ambas secuencias sentido y antisentido dirigidas al sitio
II accesible [S/AS (II) o S+AS (II)] mostró una reducción de
aproximadamente el 90%. Se indican las diversas combinaciones de
constructos de ARNip dirigidos por U6 cotransfectados con
pIND-rev-EGFP. S/AS indica el vector con ambas secuencias de
ARNip sentido y antisentido mientras que S+AS indica que las
secuencias de ARNip están en vectores separados. Rbz indica la
ribozima de cabeza de martillo contra el sitio II. Se confirmó el
silenciamiento específico de genes diana en al menos tres
experimentos independientes.
Expresión de ARNip y dianas en células
293. Se llevaron a cabo análisis de geles de tipo Northern para
examinar los patrones de expresión y tamaños de los ARNip
transcritos a partir del sistema de promotor de ARN pol III de U6
en células 293. Estos análisis de geles de tipo Northern demostraron
una fuerte expresión de ARN sentido y antisentido tal como se
controló mediante hibridación con las sondas apropiadas (figura
5).
En la figura 5, se prepararon muestras de ARN a
partir de células 293/EcR contransfectadas transitoriamente con
pIND-rev-GFP y diversos constructos de ARNip tal como se
indicó y se sometieron a inducción con ponasterona A tal como se
describió anteriormente. Se resolvió el ARN total en un gel de
acrilamida al 10%/urea 8 M para ARNip, un gel de agarosa al 1%/gel
de formamida para la diana o un gel de acrilamida al 10%/urea 7M
para el tratamiento con ARNasa A/T1. En las figuras 5A a 5D, se
realizó la hibridación usando sondas de ADN marcado con ^{32}P
para transcritos sentido y antisentido para ARNip de sitio I y sitio
II. Los productos de hibridación tenían \sim23 y \sim46
nucleótidos de longitud. La figura 5E muestra los resultados de la
hibridación de los transcritos de ribozima (II) dirigidos al sitio
II. Los ARN preparados a partir de células que expresan la rebozima
para el sitio II detectaron un transcrito del tamaño esperado para
el transcrito de ribozima (\sim75 nucleótidos). Dado que la sonda
usada para detectar la ribozima es también complementaria al ARNip
antisentido para el sitio II, también se hibrida con los ARN
antisentido dirigidos al sitio II.
Se detectaron todos los ARN control (sentido
solo, antisentido solo o ribozima) en los tamaños esperados (figuras
5A-E). Los ARN preparados a partir de células que
expresan simultáneamente constructos sentido y antisentido
generaron productos hibridados de los tamaños esperados para los ARN
individuales cortos (\sim23 nucleótidos). Además de los ARN
dimensionados como monómero, un producto de hibridación fuerte de
aproximadamente dos veces el tamaño de los oligómeros de ARN cortos
(\sim46 nucleótidos) era claramente visible (figuras
5A-E). Este producto se detectó sólo en ARN
preparados a partir de células que expresaban ambos sentido y
antisentido, y se hibridaron con ambas sondas sentido y antisentido
(figuras 5A-E). Dado que el sistema de gel usado
para resolver los transcritos era un gel desnaturalizante, parecía
improbable que el producto dimensionado de manera anómala pudiese
ser ARNbc. No obstante, para someter a prueba esta posibilidad, se
trataron las muestras de ARN con una mezcla de ARNasa A y T1 antes
de la inmunotransferencia y electroforesis en gel desnaturalizante.
Ambas de estas ARNasas rompen preferentemente ARN monocatenarios.
Por tanto, si el producto anómalo es bicatenario, debe ser
totalmente resistente a la destrucción por nucleasas. Se realizaron
dos tipos de análisis. El primero implicó simplemente tratar las
muestras de ARN con la mezcla de ARNasas, mientras que el segundo
implicó calentar las muestras hasta 95ºC antes del tratamiento con
ARNasas (figura 5G).
En la figura 5G, se trataron los ARN de una
transfección combinada usando S/AS (I+II) con una mezcla de ARNasa
A y T1. Las muestras se calentaron (+) o bien no se calentaron (-) a
90ºC antes del tratamiento con ARNasas. El producto de hibridación
en el carril tratado con ARNasas, pero sin calentamiento, puede
tener \sim21 nucleótidos de longitud. Se observó este producto
con sondas para ARNip sentido o bien antisentido dirigidos al sitio
II.
Los ARN totalmente en forma de dúplex deben ser
resistentes a la rotura, mientras que el tratamiento térmico
seguido por el enfriamiento rápida de los ARN debería separar las
cadenas y hacerlas susceptibles a la rotura por ARNasas. Los
resultados obtenidos (figura 5C) eran consecuentes con que el
producto dimensionado de manera anómala fuese bicatenario. La
muestra no calentada tratada con la mezcla de ARNasa generó un
producto que migraba más rápido que los otros ARN. La especie de
ARN que migraba más rápido se hibridó con ambas sondas sentido y
antisentido. En cambio, la muestra que se calentó antes del
tratamiento con ARNasa no dio bandas de hibridación detectable. La
migración más rápida de este producto podría deberse al recorte por
ARNasas de bases no apareadas del dúplex. Estos productos también
podrían derivarse de la rotura por ARNasas de bucles
monocatenarios, que podría separar los dos ARN, permitiendo una
movilidad en gel más rápida. De manera importante, los transcritos
grandes, dimensionados de manera anómala se general sólo en células
que expresan ambos transcritos sentido y antisentido, y por tanto
deben depender de la formación de ARNbc (Bernstein, E. et
al., 2001; Clemens, J.C. et al., 2000). Además del
producto dimensionado de manera anómala, se detectó otra banda que
migraba entre el producto dimensionado de manera anómala y el ARNsn
de U6 de 106 nucleótidos sólo con una sonda que es complementaria
al ARNip antisentido para el sitio II. Este producto tenia \sim65
nucleótidos de longitud y podría ser un producto de la primera
reacción de rotura dicer en un producto extendido con ARN
polimerasa dependiente de ARN (RdRP) del ARNip antisentido (Lipardi,
C. et al., 2001; Sijen, T. et al., 2001). Finalmente,
la expresión de U6+1 de la ribozima dirigida al sitio II (figura 5E)
no dio como resultado la inhibición de la expresión de
rev-EGFP (figura 4).
Para determinar si los complejos de ARNip
dirigían la degradación del ARNm de rev-EGFP, se llevaron a
cabo análisis de hibridación de tipo Northern para examinar con
sonda los transcritos de rev-EGFP (figura 5F). La figura 5F
muestra los resultados de la hibridación de los transcritos de la
fusión de rev-EGFP. Se examinaron con sonda ARNm de GAPDH
humano y ARNsn de U6 como controles internos para cada experimento.
Estos datos demostraron la destrucción selectiva del transcrito de
fusión sólo en células que expresan la combinación de ARNip sentido
y antisentido de sitio II. Los ARNip de sitio I, aunque se
expresaban abundantemente (figuras 5A y 5B) dieron como resultado
una inhibición marginal de la expresión de rev-EGFP (figura
4), con poca degradación del transcrito (figura 5F). La combinación
de ARNip de sitios I y II dio como resultado una menor inhibición
que los ARNip de sitio II solos. Se cree que esto resulta de un
efecto de la dosificación porque la concentración de cada uno de
los plásmidos que codifican estos ARNip era la mitad de la usada
para las cotransfecciones de sitio único. De la manera más
interesante, Los ARNip de sitio I eran potentes inhibidores de la
replicación de VIH.
Inhibición de VIH por ARNip expresados.
En otra realización de la invención, se construyó un sistema de
expresión de ARNip para inhibir la infección por
VIH-1. Con el fin de someter a prueba la actividad
inhibidora potencial de los diversos constructos descritos
anteriormente, se cotransfectaron cada uno de los vectores de ARNip
(sitio I y II) así como los constructos control con ADN proviral de
VIH-1 pNL4-3 en células 293. A los
intervalos indicados en la figura 6, se tomaron muestras de
sobrenadante de los cultivos celulares y se midieron los niveles de
antígeno viral p24 de VIH-1. En la figura 6, se
cotransfectó ADN proviral de pNL4-3 con los
diversos constructos de ARNip dirigidos por U6+1 a una proporción
1:5 de ADN proviral a ADN de constructo de U6. Veinticuatro horas
tras la transfección, y en los momentos indicados, se tomaron
alícuotas de sobrenadante para los ensayos del antígeno p24 de
VIH-1. Los diversos constructos de ARNip usados se
indican en la figura 6.
Se encontró que los ARNip de sitio II ARNip
inhibían fuertemente la replicación de VIH-1 en este
ensayo. De manera algo inesperada, los ARNip de sitio I también
inhibieron de manera potente la replicación de VIH-2
(tal como se mide mediante la producción de antígeno p24). La
combinación de ambos constructos de ARNip de sitio I y II fue la
más potente, proporcionando aproximadamente cuatro log de inhibición
en relación con los constructos control. Tal inhibición potente de
VIH-1 no se ha observado anteriormente con otros
agentes anti-VIH-1 a base de ARN
usando un ensayo de cotransfección. Las posibles explicaciones para
las diferencias en la actividad inhibidora por los ARNip de sitio I
contra la fusión rev-EGFP frente al propio
VIH-1 se abordan en el presente documento. La
observación de que dos dianas de VIH diferentes son ambas sustratos
para ARNip es sumamente esperanzadora para estrategias que
requieren un transporte dirigido múltiple para sortear la
resistencia genética del virus.
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos que no pretenden ser
limitantes.
Para evaluar la accesibilidad de secuencias
diana para el apareamiento de bases antisentido, se utilizó la
actividad ARNasa H endógena presente en los extractos celulares
preparados a partir de células 293 estables que contienen la
rev-GFP. Se sintetizaron dos oligonucleótidos de ADN
complementarios a cada uno de los dos sitios diana y se usaron como
sondas para determinar la accesibilidad en extractos celulares según
el protocolo de Scherr, M. et al., 1998, tal como se
describe en el presente documento, con algunas modificaciones
menores.
Se hicieron crecer células 293 estables que
contenían el gen de CMV-revGFP hasta del 50 al 90%
de confluencia en placas de 100 mm. Se recogieron las células
usando un raspador de células y se aclararon dos veces en solución
salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces. Se resuspendieron las
células en el mismo volumen de tampón de hinchamiento hipotónico
(Tris-HCl 7 mM, pH 7,5, KCl 7 mM, MgCl_{2} 1 mM,
\beta-mercaptoetanol 1 mM) y 1/10 del volumen
final de tampón neutralizante (Tris-HCl 21 mM, pH
7,5, KCl 116 mM, MgCl_{2} 3,6 mM,
\beta-mercaptoetanol 6 mM) en hielo. Se sonicaron
las disoluciones resuspendidas 15 segundos tres veces en un baño de
agua enfriada con hielo. Se centrifugó el homogenado a 20.000 x g
durante 10 minutos a 4ºC. Se usaron los sobrenadantes
inmediatamente, o se almacenaron como alícuotas en el mismo volumen
de tampón de almacenamiento de glicerol (Tris-HCl
15 mM, pH 7,5, KCl 60 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, glicerol al 45%,
\beta-mercaptoetanol 5 mM) a -80ºC. Se usaron
estas alícuotas congeladas siempre en el plazo de 3 meses tras la
congelación.
Se incubaron los extractos celulares con 4
\muM de los respectivos oligodesoxirribonucleótidos antisentido
de 21 pb (sitio I o II) durante 15 minutos a 37ºC en un volumen
total de 30 \mul de tampón de rotura (Tris-HCl
100 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 100 mM y DDT 10 mM). Tras la extracción
con fenol y la precipitación con etanol, se digirieron los
precipitados con 20 U de ADNasa I durante 45 minutos a 37ºC, seguido
por extracción con fenol y precipitación con etanol. Se
resuspendieron los precipitados en agua DEPC y se controlaron para
determinar la absorción a
DO_{260}.
DO_{260}.
Se llevó a cabo la reacción de transcriptasa
inversa (RT) usando de 300 ng a 1 \mug de ARN total preparado a
partir de la muestra de extracto de 30 \mul anterior con 5 U de
transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney
(Mo-MLV Rtase, Life Technologies, Inc. NY) según las
instrucciones del fabricante.
Se realizó el cebado de la primera cadena con 20
pmol de cebador 3' de un oligómero complementario a la secuencia
rev o 50 ng de cebadores de hexámero al azar. Se usó actina
\beta como control interno. Se realizaron reacciones de PCR para
cada conjunto de cebadores por separado en un volumen total de 50
\mul que contenían Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50
mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,1 mM de cada dNTP, 0,4 \muM de cada
cebador, 1,5 U de taq ADN polimerasa y 2 \mul de muestra de
reacción de RT. Se llevó a cabo la reacción de PCR a 94ºC durante
30 segundos, 68ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 30 segundos
para un total de 24 a 36 ciclos tras estudiar el ciclo de
control.
Se separaron las muestras de reacción en un gel
de agarosa al 1,2% y se visualizaron con tinción de bromuro de
etidio, luego se cuantificaron usando al programa de cuantificación
AlphaImager^{TM} (Alpha Innotech Corp.).
Se insertó un fragmento de SacII
(rellenado)-EcoRI que contiene el gen de la fusión
rev-GFP de CMV-rev-GFP en sitios HindIII
(rellenado)-EcoRI del vector pIND (Invitrogen),
dando el constructo pIND-rev-GFP de (figura 1A).
Para construir los vectores de expresión de
ARNip, se prepararon dos casetes usando el vector pTZ U6+1 (figura
1B). (Bertrand, E. et al., 1997; Good, P.D. et al.,
1997). Un casete alberga las secuencias sentido de 21 nucleótidos y
el otro una secuencia antisentido de 21 nucleótidos. Se diseñaron
estas secuencias para dirigirse al sitio I o bien al sitio II
(figura 1A). Se insertó una sucesión de 6T en el extremo 3' de cada
sitio de 21 meros seguido por un sitio de restricción XbaI. Se
prepararon las secuencias sentido o antisentido 20 de nucleótidos
(excluyendo el primer G) con una sucesión de 6T y el sitio de
restricción XbaI a partir de oligonucleótidos sintéticos (Lee, N.S.
et al., 2001; Lee, N.S. et al., 1999). El primer G de
los insertos se proporcionó por el sitio Sal I del vector cuyos
extremos se hicieron romos mediante nucleasa mung bean. Se
digirieron los insertos mediante BsrBI para sentido y AluI para
antisentido (sitio I), StuI para sentido y SnaBI para antisentido
(sitio II) para el clonado de extremo romo inmediatamente en el
sentido 3' de la secuencia promotora de U6. Se digirieron los
extremos 3' de los insertos con Xba I para la inserción en el
vector pTZU6+1 digerido por Sal I (romo)- Xba I para crear las
unidades de transcripción deseadas (figura 1C).
Para crear los plásmidos en los que ambas
secuencias, sentido y antisentido están en el mismo vector, se
digirieron los vectores que abrigan la secuencia sentido pTZU6+1
con BamHI (que se rellenó usando T4 ADN polimerasa) y HindIII. Se
subclonaron los fragmentos digeridos que contienen las secuencias
sentido en los sitios SphI (rellenado por T4 ADN
polimerasa)-HindIII de los constructos AS(I)
o AS(II) antisentido, generando ambas, unidades de
transcripción sentido y antisentido [S/AS (I) o S/AS (II)] (figura
1C). Se confirmaron las secuencias de ADN para cada uno de los
constructos anteriores antes de usar.
Se hicieron crecer células 293/EcR a 37ºC en
EMEM suplementado con FBS al 10%, L-glutamina 2 mM y
0,4 mg/ml de Zeocina. Veinticuatro horas antes de la transfección,
se volvieron a sembrar en placa las células en placas de 24 ó 6
pocillos al 50-70% de confluencia con medio reciente
sin Zeocina. Se llevó a cabo la transfección conjunta de plásmidos
diana (pIND-rev-GFP) y siDNAs en una proporción 1:1 con
reactivo Lipofectamina Plus^{TM} (Life Technologies, GibcoBRL)
tal como se describe por el fabricante. 0,5 mg de
pIND-rev-GFP y 0,5 mg de siDNAs y 0,1 mg de pCMV- lacZ (para
eficacia de transfección), formulada en Lipofectamina Plus, se
aplicaron por cultivo de 6 pocillos. Se incubaron las células
durante la noche y en el día siguiente se añadió ponasterona A 5 mM
(Invitrogen) para inducir la expresión de pIND-rev-EGFP. Dos
días tras la inducción se recogieron las células transfectadas para
medir la fluorescencia de EGFP mediante FACS usando un citómetro de
flujo modular (Cytomation, Fl). Se normalizaron las eficacias de
transfección usando un ensayo fluorescente
b-galactosidasa (Diagnostic Chemicals Ltd, CN).
También se realizó obtención de imagen en microscopio fluorescente
para monitorizarla expresión de EGFP. Para la visualización
microscópica, se hicieron crecer las células sobre cubreobjetos de
vidrio en placas de 24 pocillos. Se llevaron a cabo las
transfecciones conjuntas sobre cubreobjetos de vidrio usando 0,25
mg cada un de ADN de plásmido de expresión rev-EGFP y ARNip
(total 0,5 mg). Tras 2 días, se fijaron las células tranfectadas en
PFA 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente y se trataron con
reactivo antidesvanecimiento que contenía DAPI. Se recogieron las
imágenes usando un microscopio Olympus BX50 y una videocámara
DEI-750 (Optronics) con aumento de 40x con un tiempo
de exposición
de 1/8 s. Se confirmó el silenciamiento específico de los genes diana en al menos tres experimentos independientes.
de 1/8 s. Se confirmó el silenciamiento específico de los genes diana en al menos tres experimentos independientes.
Se prepararon muestras de ARN de células
293-EcR transfectadas conjuntamente transitoriamente
con pIND-rev-GFP y ARNip y sometido a inducción de
ponasterona A tal como descrito anteriormente. Se realizó el
aislamiento del ARN total usando el ARN STAT-60
(TEL-TEST B ) según las instrucciones del
fabricante. Se resolvió el ARN total sobre un gel de acrilamida al
10%/urea 8 M para ARNip o un gel de agarosa al 1%/formamida para la
diana, y se trasfirió sobre membrana Hybond-N+
(Amersham Phamacia Biotech). Se realizaron las etapas de hibridación
y lavado a 37ºC. Para detectar el ARNip sentido o antisentido, se
usaron sondas de ADN radiomarcadas de 21 meros. También se
exploraron con sonda ARNsn de U6 humano y ARNm de GAPDH como
patrones internos. Para detectar las ribozimas dirigidas frente a
sitio II del ARNm de rev, una sonda complementaria de 42
meros para todo el núcleo de ribozima y se usó secuencias
flanqueantes (esta sonda también detecta el oligómero ARNip para
antisentido sitio II). Para la caracterización de los ARN 46 de
tamaño anómalo, se trataron ARN total de S/AS (I+II) con una mezcla
de RNAasa A y T1 durante 30 minutos a 37ºC con o bien sin
precalentar a 90ºC durante 5 minutos.
Para detección del ARNm de rev-EGFP, se
usó una sonda complementaria 25 meros para el ARNm de EFP de la
proteína de fusión rev-GFP.
Para determinación de la actividad
anti-VIH-1 del ARNip, se realizaron
ensayos transitorios mediante transfección conjunta de ADNip y ADN
proviral de VIH-1 infeccioso, pNL4-3
en células 293. Antes de la transfección, se hicieron crecer las
células durante 24 horas en placas de seis pocillos en 2 ml EMEM
complementado con FBS al 10% y L-glutamina 2 mM, y
se transfectaron usando reactivo Lipofectamina Plus^{TM} (Life
Technologies, GibcoBRL) tal como se describe por el fabricante. Se
formularon las mezclas de ADN constituidas por 0,8 \mug de ADNip
o controles, y 0,2 \mug de pNL4-3 en lípidos
catiónicos y se aplicaron a las células. Después de 1, 2, 3 y 4
días, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para
determinar el antígeno p24 de VIH-1 (Beckman
Coulter Corp). Se calcularon los valores de p24 con el auxilio del
lector de placa de ELISA Dynatech MR5000 (Dynatech Lab Inc).
También se realizó la viabilidad celular usando un recuento de
exclusión de colorante Trypan Blue en 4 días después de la
transfección.
Lo anterior demuestra la utilidad de la
invención para, entre otras cosas, diseñar y someter a prueba
transcriptos de ARNip para diversas aplicaciones terapéuticas y
genéticas. También se cree que la invención demuestra por primera
vez la expresión funcional de ARNip en células de mamífero.
Los resultados anteriores también demuestran la
utilidad de ARNip como agentes inhibidores de VIH-1.
Combinando varios constructos de ARNip dirigidos como diana a
diferentes sitios en el genoma VIH-1, debería ser
posible superar la resistencia genética del virus, creando de ese
modo un enfoque de terapia genética potente de infección por
VIH-1.
Las publicaciones y otros materiales citados en
el presente documento para aclarar los antecedentes de la invención
y para proporcionar detalles adicionales con respecto a la práctica
de la invención se incorporan en el presente documento por
referencia en la misma extensión como si indicasen individualmente
para incorporarse por referencia.
Aunque la invención se ha dado a conocer por
referencia a los detalles de las realizaciones preferidas de la
invención, debe entenderse que la divulgación pretende ser
ilustrativa y no tener un sentido limitativo.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> Rossi, John
\hskip1cm Lee, Nan-Sook
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR
MOLÉCULAS DE ARN DE INTERFERENCIA EN CÉLULAS DE MAMÍFERO Y USOS
TERAPÉUTICOS PARA TALES MOLÉCULAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1954-392
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/356127
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-02-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNip antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcttcgtc gctgtctccg cttttttgct ctaga
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNip sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggagacag cgacgaagag cttttttgct ctaga
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNip antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtagctgaa gaggcacagg cttttttgct ctaga
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNip sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctgtgcct cttcagctac cttttttgct ctaga
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARNip sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggagacag cgacgaagag cuu
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARNip antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcucuucguc gcugucuccg cuu
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARNip sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccugugccu cuucagcuac cuu
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARNip antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgguagcugaa gaggcacagg cuu
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de terminación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipucuagagcgg acuucggucc gcuuuu
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio diana de ARNip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctgtgcct cttcagctac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio diana de ARNip sitio diana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggagacag cgacgaagag c
\hfill21
Claims (30)
1. Uno o más vectores para su uso en terapia que
comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN
pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la
cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario,
pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor
de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que
codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que
el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o
están en vectores separados y en los que cuando el uno o más
vectores se introducen en una célula de mamífero la molécula de
ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la
expresión de un gen diana en la célula de mamífero, inhibiendo de
ese modo la expresión del gen diana.
2. El uno o más vectores según la reivindicación
1, en los que la célula de mamífero es una célula humana.
3. El uno o más vectores según la reivindicación
1, en los que el primer y segundo casetes están en vectores
separados.
4. El uno o más vectores según la reivindicación
1, en los que el primer y el segundo casetes están en el mismo
vector.
5. El uno o más vectores según la reivindicación
1, en los que el vector es un vector de plásmido.
6. El uno o más vectores según la reivindicación
1, en los que el vector es un vector viral.
7. El uno o más vectores según la reivindicación
1, en los que el promotor de ARN pol III es un promotor de ARN pol
III U6 de mamífero.
8. El uno o más vectores según la reivindicación
1, en los que el gen diana es un gen diana de VIH.
9. El uno o más vectores según la reivindicación
8, en los que el VIH es VIH-1.
10. El uno o más vectores según la
reivindicación 9, en los que el gen diana de VIH es
VIH-1 rev.
11. El uno o más vectores según la
reivindicación 9, en los que el gen diana de VIH es
VIH-1 tat.
12. El uno o más vectores según la
reivindicación 9, en los que el gen diana de VIH es ambos
VIH-1 rev y VIH-1
tat.
13. El uno o más vectores según la
reivindicación 9, en los que la célula de mamífero es una célula
humana infectada por VIH.
14. Uso de uno o más vectores para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento del VIH, en el que
el uno o más vectores comprenden (i) un primer casete que comprende
un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de
ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de
interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete
que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una
secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula
de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en
el mismo vector o están en vectores separados y en los que cuando el
uno o más vectores se introducen en una célula de mamífero la
molécula de ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de
ARN de la expresión de un gen diana de VIH en la célula de mamífero,
inhibiendo de ese modo la expresión del gen diana de VIH.
15. El uso según la reivindicación 14, en el que
la célula de mamífero es una célula humana.
16. El uso según la reivindicación 14, en el que
el primer y el segundo casetes están en vectores separados.
17. El uso según la reivindicación 14, en el que
el primer y el segundo casetes están en el mismo vector.
18. El uso según la reivindicación 14, en el que
el vector es un vector de plásmido.
19. El uso según la reivindicación 14, en el que
el vector es un vector viral.
20. El uso según la reivindicación 14, en el que
el promotor de ARN pol III es un promotor de ARN pol III U6 de
mamífero.
21. El uso según la reivindicación 14, en el que
el VIH es VIH-1.
22. El uso según la reivindicación 21, en el que
el gen diana de VIH es VIH-1 rev.
23. El uso según la reivindicación 21, en el que
el gen diana de VIH es VIH-1 tat.
24. El uso según la reivindicación 21, en el que
el gen diana de VIH es ambos VIH-1 rev y
VIH-1 tat.
25. El uso según la reivindicación 14, en el que
la célula de mamífero es una célula humana infectada por VIH.
26. Un procedimiento in vitro para
someter a prueba la expresión y función de moléculas de ARN de
interferencia pequeño (ARNip), que comprende cointroducir en una
célula de mamífero in vitro (a) uno o más vectores que
comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN
pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la
cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario
pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor
de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que
codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que
el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o
están en vectores separados y (b) un vector que comprende un
promotor operativamente unido a un gen diana, hacer crecer la
célula en condiciones en las que se expresa la molécula de ARNip y
someterla a prueba para determinar la iniciación de la
interferencia de ARN de la expresión del gen diana, mediante lo cual
se somete a prueba la función de la molécula de ARNip.
27. El procedimiento según la reivindicación 26,
en el que la célula de mamífero es una célula humana.
28. El procedimiento según la reivindicación 26,
en el que el primer y el segundo casetes están en vectores
separados.
29. El procedimiento según la reivindicación 26,
en el que el primer y el segundo casetes están en el mismo
vector.
30. El procedimiento según la reivindicación 26,
en el que el promotor de ARN pol III es un promotor de ARN pol III
U6 de mamífero.
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