ES2312561T3 - Resistencia al estres como marcador seleccionable para plantas transgenicas. - Google Patents
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Abstract
Método para obtener una planta transgénica o una célula de una planta transgénica que comprende una segunda secuencia nucleotídica, comprendiendo dicho método las etapas de: a) transformación de una parte de una planta o una población de células vegetales con una secuencia nucleotídica que comprende (i) una primera secuencia nucleotídica que codifica una trehalosa fosfato sintasa, un homólogo, o un parte catalíticamente activa de dicha trehalosa fosfato sintasa, estando dicha primera secuencia nucleótida unida funcionalmente a un promotor y (ii) uno o más sitios de restricción que comprenden dicha segunda secuencia nucleotídica, b) aplicación de las condiciones de estrés medioambientales o artificiales a la planta transformada o a la población celular vegetal obtenida en la etapa (a), o su descendencia, y c) selección, a partir de la planta o de la población celular vegetal transformada colocada en las condiciones de estrés medioambientales o artificiales de la etapa (b), la parte de la planta o de la población celular vegetal transformada que presenta un aumento a la resistencia al estrés en dichas condiciones de estrés medioambientales o artificiales. en el que las condiciones de estrés artificiales excluyen la utilización de antibióticos o biocidas.
Description
Resistencia al estrés como marcador
seleccionable para plantas transgénicas.
La presente invención se refiere a la producción
de plantas y semillas transgénicas. Con mayor exactitud, la
presente invención se refiere a un método mejorado para producir
plantas y semillas transgénicas, así como nuevas plantas y semillas
transgénicas que se pueden obtener con este método, vectores y
kits biológicos para dicha producción.
Bajo la influencia de unas condiciones de estrés
abiótico, tales como sequía, frío, salinidad y calor, muchos
organismos vivos ajustan su potencial osmótico acumulando solutos
compatibles con su metabolismo, como sorbitol, manitol,
glicina-betaína, prolina, sacarosa o trehalosa.
Este último compuesto es un disacárido no reductor
(\alpha-\alpha-1,1-diglucosa)
que tiene una función osmoprotectora en condiciones de estrés,
interaccionando con las membranas y las proteínas, evitando así la
separación de fases y la desnaturalización irreversible de dichos
organismos. La trehalosa está presente en muchos organismos vivos
como por ejemplo, bacterias, hongos, animales y plantas. En la
mayoría de ellos, la trehalosa se sintetiza en dos etapas
enzimáticas: en una primera etapa, a partir de
glucosa-6-fosfato y
uridin-difosfoglucosa en
trehalosa-6-fosfato catalizado por
la trehalosa-6-fosfato sintasa (de
ahora en adelante TPS, expresada por el gen TPS 7), después
en una segunda etapa de
trehalosa-6-fosfato a trehalosa,
catalizado por la
trehalosa-6-fosfato fosfatasa (de
ahora en adelante TPP, expresada por el gen TPS 2).
El mutante tps1\Delta de la levadura
Saccharomyces cerevisiae no sintetiza trehalosa y puede
crecer en glucosa como única fuente de carbono, según Van Aelst
et al., en Mol. Microbiol. (1993)
8:927-943. Este fenotipo se debe a una entrada
ilimitada de glucosa en glucólisis que provoca un agotamiento del
adenosin-5'-trifosfato (de ahora en
adelante ATP) intracelular y de los fosfatos inorgánicos. Las
pruebas experimentales de Thevelein et al., en Trends
Biochem. Science (1995) 2:410-418 sugieren que
la trehalosa-6-fosfato controla a
la hexoquinasa (de ahora en adelante HXK) II, por lo tanto la
ausencia de este intermediario provoca una alta actividad de la
actividad HXK II y por lo tanto a una sobrecarga metabólica de la
glucosa-6-fosfato. Además, la
entrada de azúcar también podría estar regulada por la propia
proteína TPS1, según Van Vaeck et al., en Biochem. J.
(2001) 353:157-162.
Los dos enzimas, TPS y TPP, están codificados
por genes diferentes en bacterias, como E. coli, levaduras
como Saccharomyces cerevisiae y en plantas como
Arabidopsis thaliana y Selaginella lepidophylla. En
las dos primeras especies, el enzima TPS está codificado por un
polipéptido de 56 kD, mientras que en las plantas está codificado
por una proteína de 100 a 109 kD. Existe una gran similitud en la
secuencia de las proteínas en la región común entre todos estos
enzimas TPS; salvo en las regiones aminoterminal y carboxiterminal
presentes en las proteínas TPS de las plantas, como indicaron
Blazquez et al., en Plant J. (1998)
13:685-689 y Zentella et al., en Plant
Physiol. (1999) 119:1473-1482. La solicitud de
patente internacional publicada como WO 00/22141 describe un método
para preparar un organismo eucariota, como una planta, animal u
hongo, que muestre una expresión constitutiva, inducible y/o
específica de órgano de un gen TPS específicamente
modificado, que comprende las etapas de:
- (a)
- suministrar un gen TPS,
- (b)
- diseñar una modificación del gen TPS alineando el gen con el gen correspondiente de levadura y determinando la parte del gen que se extiende más allá del extremo terminal 5' del gen de levadura.
- (c)
- eliminar o inactivar una parte de la región aminoterminal del gen TPS para aumentar la actividad TPS.
- (d)
- clonar el gen modificado en un vector de expresión bajo el control de un promotor constitutivo, inducible y/o específico de órgano,
- (e)
- transformar una célula o tejido vegetal con el vector de expresión obtenido,
- (f)
- regenerar una planta completa a partir de la célula o tejido vegetal transformado.
Dicho documento describe también plantas con un
aumento de la tolerancia al estrés y que incluían en su genoma
dicho gen TPS específicamente modificado.
Existen abundantes pruebas de que la HXK es un
componente principal en la respuesta al azúcar en levaduras y
vegetales, según Sheen et al., en Curr. Op. Plant
Biol. (1999) 2: 410-418. En los primeros
organismos, un mutante hxk2\Delta puede crecer normalmente
en un medio con mucha glucosa, además un doble mutante
hxk2\Deltatps1\Delta recupera la incapacidad de
un mutante tps1\Delta de crecer en un medio con glucosa,
lo que sugiere que HXKII es un factor anterior en esta ruta. Las
plantas transgénicas Arabidopsis thaliana (abreviatura: At)
que expresan AtHXK1 o AtHXK2 en la cadena complementaria,
presentaron un fenotipo insensible a la glucosa, es decir,
germinación, desarrollo y procesos de virescencia en medios con
mucha glucosa con un 6% (peso por volumen) de glucosa, mientras que
las semillas naturales detenían el crecimiento y tenían un aspecto
albino, en parte como resultado de la represión por glucosa de los
genes fotosintéticos que codifican ciertas proteínas, según Jang
et al., en Plant Cell (1997) 9:5-19.
Por el contrario, la superexpresión de los genes AtHXK en
Arabidopsis thaliana provoca un fenotipo hipersensible a la
glucosa que es más grave marcado que en un tipo natural al crecer
en un medio rico en glucosa.
Los marcadores actualmente conocidos para la
selección de plantas transformadas pertenecen a una de las
siguientes clases principales, teniendo todas ellas varios
inconvenientes.
Los marcadores de resistencia a antibióticos se
conocen como herramientas de selección. Se ha expresado alguna
preocupación sobre estos marcadores, considerando que podrían
expandirse por transferencia genética horizontal a patógenos
bacterianos del intestino humano o del entorno. Aunque no se ha
demostrado jamás que esto ocurra en la práctica, los enormes
problemas asociados al aumento de la resistencia a los antibióticos
en los patógenos microbianos permite recordar que en el pasado se
han pasado por alto ciertos problemas y que esto podría volver
ocurrir con la introducción de las plantas transgénicas.
También han surgido críticas similares contra
los otros tipos de marcador de selección, tales como genes de
resistencia a herbicidas, que se podrían expandir en el entorno a
las malas hierbas haciéndolas posteriormente más difíciles de
erradicar. Los marcadores de resistencia a antibióticos o
herbicidas sólo son necesarios para la construcción de plantas
transgénicas, y después permanecen en la planta como entidades
totalmente inútiles. Por lo tanto, la sustitución de los
marcadores de resistencia a antibióticos por otros tipos de
marcadores no supone un problema fundamental para el desarrollo de
plantas transgénicas. Por lo tanto, aunque los posibles riesgos
asociados con el uso de marcadores de resistencia a antibióticos
podrían ser puramente teóricos, desempeñan un papel importante en
las críticas contra el uso de organismos modificados genéticamente.
La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), en
un reciente informe (http:
//www.who.int/fsf/GMfood/FAO-WHO_Consultation_report_2000.pdf),
llegaron a la conclusión de que no existían evidencias de que los
marcadores actualmente utilizados implicaran ningún riesgo para la
salud humana o de los animales domésticos. Sin embargo, dicho
informe agrega que la posibilidad de transferencia y expresión de
estos genes es un riesgo que justifica que su uso deba evitarse en
el genoma de plantas modificadas genéticamente ampliamente
distribuidas. Además, una reciente proposición de la Comisión
Europea (julio de 2000) sugiere una norma que prohiba todos los
genes de resistencia a antibióticos en los cultivos modificados
genéticamente. Por lo tanto, el uso de marcadores de resistencia a
antibióticos ya no será evidentemente un método de elección para la
construcción de plantas transgénicas para su uso en la industria
alimentaría.
Una segunda clase de marcadores implica
marcadores escindibles. La eliminación de un marcador de
resistencia a antibióticos puede lograrse con el sistema llamado
Cre-lox descrito por Yoder et al., en
Biotechnology (1994) 12: 263-267 o a través
de recombinación en el genoma de los cloroplastos, como describen
Lamtham et al., en Nature Biotechnology (2000)
18:1172-1176. En el primer caso, el marcador de
resistencia a antibióticos se introduce entre dos repeticiones lox
u, después de la inducción de la recombinasa Cre usando un promotor
inducible, los sitios lox se recombinan provocando la escisión del
marcador. Esta metodología adolece del problema de que aún no se
ha demostrado de forma convincente la ausencia del marcador en toda
la planta. Por lo tanto, parece preferible eliminar completamente el
uso de marcadores de resistencia a antibióticos para la
construcción de plantas transgénicas de grado alimenticio.
Pueden realizarse también críticas similares a
la eliminación de marcadores por recombinación en plastidios, que
presentan además complicaciones adicionales Dado el gran número de
plastidios en una célula, normalmente existen miles de copias de un
gen marcador en una célula. La eliminación de un gen marcador no
es por lo tanto completa, por lo tanto se producen necesariamente
plantas heteroplásmicas que contienen tanto plastidios libres de
marcadores como plastidios con marcadores. La generación de plantas
sin marcadores requiere una clasificación de los plastidios
citoplásmicos durante divisiones celulares consecutivas y el
subcultivo de las plantas procedentes de las células embrionarias
homoplásticas. Es difícil garantizar que durante el crecimiento y
el subcultivo de las plantas, no se generarán formas inactivas del
gen marcador de resistencia que pudieran pasar a otros organismos y
volver a activarse por mutación o recombinación. Aunque la
ausencia de genes marcadores puede demostrarse de forma convincente
usando una hibridación de tipo Southern, la tecnología de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés)
y los controles adecuados, este método siempre adolecerá del
inconveniente de que los genes marcadores han estado presentes en
algún momento del proceso y que podrían haber provocado problemas
desconocidos.
Otro sistema usa el gen de la
manosa-6-fosfato isomerasa de
Escherichia coli como marcador, como describen Miles et
al., en Gene (1984) 32:41-48. La manosa
se transporta dentro las células vegetales por transportadores de
hexosas y la HXK vegetal la fosforila en
manosa-6-fosfato, pero ya no puede
metabolizarse más debido a la falta de
manosa-6-fosfato isomerasa. Como
resultado, las células vegetales no pueden usar manosa como fuente
de carbono para crecer. La transformación con un gen de la
manosa-6-fosfato isomerasa, hace que
las plantas transgénicas puedan volver a crecer en un medio con
manosa como fuente de carbono. Un inconveniente de este método es
el uso de un gen bacteriano de una bacteria patógena oportunista
para la generación de plantas transgénicas. Otra limitación de este
sistema es que ciertas plantas parecen poder usar la manosa con la
misma eficiencia que otros azúcares según Stoop et al., en
Plant Physiology (1993) 103:1001-1008.
Por lo tanto, en la técnica se necesitan
marcadores para la transformación de plantas que no codifiquen
marcadores de resistencia a antibióticos o biocidas. En la técnica
se necesitan también marcadores para la transformación de plantas
que se integren en un lugar predeterminado del genoma de la planta.
Además, en la técnica se necesitan marcadores para la
transformación de plantas basados en genes de plantas obtenidos a
partir de la misma planta que se va a transformar o basados en
genes que tengan una actividad enzimática idéntica a la de un gen
presente en la planta que se va a transformar.
La presente invención proporciona nuevos
marcadores para la selección de plantas transgénicas. Estos
marcadores de selección provocan la superexpresión del gen de la
trehalosa fosfato sintasa, lo que hace que la planta transgénica
sea significativamente más resistente a uno o más factores de
estrés medioambientales y/o artificiales. Los marcadores implicados
en la presente invención son preferentemente los genes de la
trehalosa fosfato sintasa, después de cuya superexpresión en la
planta, no se acumulan compuestos tóxicos ni cambia la morfología
ni el desarrollo de la planta en la que se expresa dicho gen.
Los marcadores implicados en la presente
invención son preferentemente los genes de la trehalosa fosfato
sintasa obtenidos a partir de la misma especie que la planta que se
va a transformar. Sin embargo, los genes con una función bioquímica
similar pero obtenidos a partir de otras especies de plantas, o de
una levadura, sirven también como marcador según la presente
invención. Los marcadores de la presente invención pueden
insertarse perfectamente en el genoma de la planta transgénica de
interés, y tendrán la capacidad útil de hacer que la planta
transgénica sea más resistente a uno o más factores o condiciones
de estrés artificiales o medioambientales que imiten dicho estrés,
como sequía (deshidratación), saturación hídrica, calor, frío,
congelación, estrés osmótico, salinidad, luz, nutrientes u
oligoelementos escasos o en exceso, presión y similares.
La presente invención se refiere más
específicamente al uso de la trehalosa fosfato sintasa como un
marcador de selección que haga que las plantas transgénicas sean
más resistentes al estrés medioambiental como sequía, estrés
osmótico y bajas concentraciones de fosfato.
Según la presente invención, la selección de
plantas transgénicas se realiza con un método que no se basa en la
selección por resistencia de una planta a antibióticos ni a
biocidas. La presente invención incluye además vectores y kits
biológicos que comprenden los genes de la trehalosa fosfato sintasa
que pueden integrarse en el genoma de la planta. La presente
invención se refiere también a plantas transgénicas, y semillas,
tejidos órganos y cultivos celulares que se pueden obtener de las
mismas y/u obtenidas mediante los marcadores de selección de la
presente invención.
La figura 1 muestra dos vectores binarios
idóneos para la transformación de plantas mediante Agrobacterium
tumefaciens. plBT/01 contiene 35SAtTPS1 y NptIl
en el ADN-T (figura 1A) y el pTPSM contiene
35SAtTPS1 como marcador único en el ADN-T
(fig. 1B).
La figura 2 muestra una mezcla de plantas
Arabidopsis thaliana que sobreexpresan AtTPS1 con las
plántulas de Arabidopsis thaliana de tipo natural, las
flechas indican las plántulas seleccionadas y la barra al fondo
representa 5 mm (figura 2A y 2B), la figura 2C muestra un producto
de PCR de extractos genómicos usando como promotor directo 35S y
como promotor reverso AtTPS1, en el que el carril 1 se
corresponde con el control homocigótico de 35SAtTPS1, el
carril 2 se corresponde con el extracto natural y el carril 3 con
la planta transgénica seleccionada.
La figura 3 muestra un análisis de PCR de los
extractos de once plántulas de Arabidopsis thaliana de la
invención (calles 1 a 11) seleccionadas en un medio con 6% de
glucosa. El promotor directo fue 35S y el reverso AtTPS1. El
carril 12 corresponde a un extracto de una planta que
superexpresaba AtTPS1 y el carril 13 al extracto
natural.
La figura 4 muestra plántulas de Nicotiana
tabacum de tipo natural y otras que superexpresan
35SAtTPS1 crecidas durante 12 días es un medio MS 1X con un
6% de glucosa, de dos líneas transgénicas independientes:
Nt(35SAtTPS1).05 (figura 4A) y Nt(35SAtTPS1 ).19
(figura 4B). Las plántulas Nt de tipo natural aparecen en la
figura 4C.
El término "homólogo" como se usa en la
presente memoria descriptiva, se refiere a una secuencia de
proteína en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, y en la
que el nivel de similitud con la proteína de tipo natural es de al
menos un 80%, preferentemente al menos un 85% y más preferentemente
al menos un 90%.
El término "condiciones de estrés
artificiales", tal como se usa en la presente memoria
descriptiva se refiere a condiciones que imitan las condiciones de
estrés medioambiental que pueden afectar a la planta de interés.
Esto excluye específicamente la resistencia a antibióticos o
biocidas.
Los presentes inventores han determinado, en
experimentos en los que se analizaron diez líneas transgénicas
independientes para cada construcción de la siguiente tabla 1, que
se observa un aumento del contenido en trehalosa cuando en plantas
transgénicas se expresan determinados alelos truncados de la
planta TPS (\DeltaiNAtTPS1 y \DeltaNSITPS1 de ahora en adelante
se refieren al truncamiento de la región aminoterminal
correspondiente a los aminoácidos 100 ó 88 de Arabidopsis
thaliana (At) y Selaginella lepidophylla,
respectivamente). La siguiente tabla 1 indica el contenido de
trehalosa en las plantas At transgénicas. Como puede observarse,
las plantas At, que superexpresan el gen AtTPS1 completo son
muy similares o indistinguibles de las de tipo natural.
Adicionalmente, el gradiente dependiente de gen observado de las
alteraciones morfológicas
(\DeltaNSITPS1>\DeltaNAtTPS1>SITPS1>AtTPS1) está
muy relacionado con los niveles de trehalosa de las líneas
transgénicas de cada construcción génica.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización, la presente
invención se refiere a proteínas de trehalosa fosfato sintasa que,
cuando se superexpresan en una planta, aumentan la resistencia o la
tolerancia de dicha planta a factores medioambientales tales como
la temperatura (frío o calor), la presión osmótica (sequía,
salinidad) y similares, así como otras condiciones de estrés
artificiales. Los genes correspondientes se utilizan de este modo
como marcadores de selección para la transformación de una planta
con un gen foráneo. Preferentemente, los genes de resistencia al
estrés de la trehalosa fosfato sintasa, después de su
superexpresión no provocan ningún efecto fenotípico. Sin embargo,
las diferencias fenotípicas pueden tolerarse cuando las plantas
transformadas después de su recogida se procesen de modo que el
fenotipo modificado no sea apreciable. El gen de resistencia al
estrés usado como marcador de selección puede obtenerse a partir
de la misma especie de planta que se va a producir o transformar.
Sin embargo, también se pueden usar los genes de otras especies de
plantas, p. ej., que hacen que la planta sea más resistente después
de su superexpresión. Los genes procariotas como por ejemplo los
genes bacterianos, tengan o no un homólogo funcional en los
organismos superiores como las plantas, no entran dentro del
alcance de la presente invención. Preferentemente, el gen de
tolerancia al estrés que se vaya a utilizar como marcador de
selección codifica la trehalosa fosfato sintasa no truncada, sin
embargo otras muchas secuencias nucleotídicas pueden estar incluidas
en el alcance de la presente invención tal como se explicará más
adelante. En otra forma de realización, la presente invención se
refiere a los vectores y kits biológicos para la producción o
transformación de plantas que contengan una secuencia nucleotídica
que codifique una proteína de resistencia al estrés trehalosa
fosfato sintasa. Preferentemente, estos vectores son para la
transfección de Agrobacterium tumefaciens. Los métodos de
transfección, así como otros métodos biolisticos aplicables,
resultan muy conocidos para los expertos en la materia y están
descritos, por ejemplo por E. Galun en The manufacture of
Medical and Health Products by Transgenic Plants (Imperial
College Press, 2001).
Muy específicamente, la presente invención se
refiere al uso de un gen homólogo de la
trehalosa-6-fosfato sintasa o un
fragmento con el extremo aminoterminal del mismo truncado como
marcador de selección para la transformación de plantas. La
presente invención se refiere también al uso de un gen heterólogo
de la trehalosa-6-fosfato sintasa
natural o un fragmento del mismo como marcador de selección para la
transformación de plantas. La presente invención se refiere también
al uso del extremo aminoterminal de un gen homólogo o heterólogo
de la trehalosa-6-fosfato sintasa
como marcador de selección para la transformación de plantas.
Según una forma de realización, la presente
invención se refiere a la producción de una planta transgénica o
una célula vegetal transgénica con un aumento de la resistencia al
estrés bajo unas condiciones de estrés medioambientales o
artificiales, con un método que comprende las etapas de:
- a)
- transformación de una parte de una planta o una población de células vegetales con una secuencia nucleotídica que comprende (i) una primera secuencia nucleotídica que codifica una trehalosa fosfato sintasa o una homóloga de la misma, o un parte catalíticamente activa de dicha proteína, estando dicha secuencia unida operativamente a un promotor y (ii) uno o más sitios de restricción que comprenden una segunda secuencia nucleotídica,
- b)
- aplicación de las condiciones de estrés medioambientales o artificiales a la planta transformada o a la población celular vegetal obtenida en la etapa (a), o su descendencia, y
- c)
- selección, de la planta o de la población celular vegetal transformada colocada bajo las condiciones de estrés medioambientales o artificiales de la etapa (b), la parte de la planta o de la población celular vegetal transformada que presenta un aumento a la resistencia al estrés bajo dichas condiciones de estrés medioambientales o artificiales.
Preferentemente, dicha trehalosa fosfato
sintasa, su homóloga o una parte catalíticamente activa de la
misma, se selecciona como proteína que no altera el fenotipo de la
planta transformada respecto a las propiedades o características
que nos sean las de resistencia al estrés.
La segunda secuencia nucleotídica que se usará
en el método anterior no es un parámetro crítico de la presente
invención. Por ejemplo, puede ser una secuencia nucleotídica que
codifique un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo (como un
fragmento variable de cadena sencilla, un fragmento F_{ab} y un
F(_{ab}')_{2}, o una región determinante de
complementariedad), un antígeno, una proteína terapéutica, un
inhibidor enzimático, una citocina, un factor de crecimiento, una
hormona peptídica, una proteasa, un enzima o un producto enzimático
de los mismos.
Como se describe anteriormente en la presente
memoria descriptiva, la presencia de la primera secuencia
nucleotídica actúa como un marcador para (es decir, indicativo de)
la presencia de una segunda secuencia nucleotídica en la planta
transgénica o célula vegetal transgénica con un aumento de la
resistencia al estrés. Preferentemente, la primera secuencia
nucleotídica y la segunda secuencia nucleotídica se integran en el
genoma de dicha planta transgénica o célula vegetal transgénica con
un aumento de la resistencia al estrés.
Cuando en el método de la presente invención se
usa una parte activa de una proteína trehalosa fosfato sintasa,
puede ser el extremo aminoterminal truncado o el extremo
carboxiterminal truncado de dicha proteína. Según una forma de
realización preferida de la invención, dicha proteína eucariótica
de resistencia al estrés es un enzima que cataliza la producción de
un fosfato de azúcar, un fosfato de glicerol o un fosfato de
azúcar-alcohol, como la
trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS).
Más preferentemente, la primera secuencia nucleotídica usada en el
método de la presente invención es una que codifica una
trehalosa-6-fosfato sintasa
truncada.
Sólo a título ilustrativo, se incluyen otros
ejemplos de proteínas eucarióticas de resistencia al estrés:
- -
- la proteína NHX1 revisada por Zhang et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU (2001) 98:12832-6,
- -
- proteínas de choque térmico como las revisadas por Sun et al., en Plant J. (2001) 27:407-15,
- -
- la proteína AVP1 revisada por Gaxiola et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (2001) 98:11444-9,
- -
- la proteína NCED revisada por luchi et al., en Plant J. (2001) 27:325-333,
- -
- la proteína APX1 revisada por Shi et al., en Gene (2001) 273:23-7,
- -
- la proteína APX3 revisada por Wang et al., en Plant Cell Physiol. (1999) 40:725-32,
- -
- la proteína BiP (proteína de unión) revisada por Alvimetal. en Plant Physiol. (2001) 126:1042-54,
- -
- la proteína OASTL revisada por Youssefian et al., en Plant Physiol. (2001) 126:1001-11,
- -
- la proteína DREB1 revisada por Yamaguchi-Shinozaki et al., en Novartis Found. Symp. (2001) 236: 176-86,
- -
- la proteína SCOF1 (una proteína de dedos de zinc inducible por frío) revisada por Kim et al., en Plant J. (2001) 25: 247-59,
- -
- la proteína GST/GPX revisada por Roxas et al., en Plant Cell Physiol. (2000) 41:1229-34,
- -
- la proteína GS2 revisada por Hoshida et al., en Plant Mol. Biol. (2000) 43:103-11,
- -
- la proteína HAL1 revisada por Gisbert et al., en Plant Physiol. (2000) 123:393-402,
- -
- la proteína PRP2 revisada por Winicov en Planta (2000) 210:416-22, y
- -
- la proteína SAT revisada por Blaszczyk et al., en Plant J. (1999) 20:237-243.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera secuencia nucleotídica puede
codificar también una proteína quimérica que combine dominios de
las proteínas trehalosa fosfato sintasa de resistencia al estrés de
dos o más especies vegetales diferentes.
Para un rendimiento satisfactorio del método de
la presente invención, por ejemplo cuando la proteína eucariótica
de resistencia al estrés es un enzima que cataliza la producción de
un fosfato de azúcar, un fosfato de glicerol o un fosfato de
azúcar-glicerol, más particularmente, la trehalosa
fosfato sintasa, las condiciones de estrés aplicadas en la etapa
(b) del método son preferentemente condiciones de estrés inducidas
poniendo en contacto la planta transformada o la población celular
vegetal obtenida en la etapa (a), o su progenie, con un medio con
un alto contenido de un azúcar, un azúcar-alcohol o
un glicerol, como por ejemplo sacarosa (o sucrosa), es decir, de
aproximadamente 3 a 8% en peso y más preferentemente de 4 a 7% en
peso.
La primera secuencia nucleotídica usada en el
método de la invención puede proceder de una planta o una levadura.
La elección de la planta o levadura pertinente para este propósito
no es un parámetro crítico de la presente invención. Las plantas
idóneas para este propósito incluyen, entre otras, plantas
dicotiledóneas como el tabaco (Nicotiana tabacum), soja
(Glycine max), manzana, remolacha azucarera, Arabidopsis
thaliana, alfalfa, petunia, algodón, zanahoria, apio, col,
pepino, pimienta, canola, tomate, patata, lenteja, lino, brócoli,
frijol, lechuga, colza, coliflor, espinaca, col de bruselas,
alcachofa, guisante, quingombó, calabacín, col rizada, berza, té,
café y Selaginella lepidophylla. Se incluyen también las
plantas monocotiledóneas como arroz Oryza sativa, cereales,
cebada, maíz, girasol (Helianthus annuus), trigo, avena,
mijo, sorgo, amaranto, cebolla, espárrago y caña de azúcar. Una
levadura original idónea para la primera secuencia nucleotídica es
Saccharomyces cerevisiae.
El promotor al que se une funcionalmente la
primera secuencia nucleotídica no es un parámetro crítico de la
presente invención. Puede ser un promotor constitutivo, un promotor
inducible o un promotor específico de tejido, siendo estas
categorías muy conocidas para los expertos en la materia con
ventajas particulares en determinados casos. Un ejemplo preferente
comercialmente disponible de promotor constitutivo idóneo es el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Un
ejemplo muy conocido de un promotor vegetal que cause una expresión
específica en órganos de reserva es el promotor de la patatina.
Algunos ejemplos de promotores vegetales inducidos por estrés
incluyen el promotor LTI78 (descrito por Nordin et al., en
Plant Mol. Biol. (1993) 21: 641-653) y el
promotor RAB18 (descrito por Lang et al., en Plant Mol.
Biol. (1992) 20: 951-962).
Ahora abordaremos más detalladamente algunos
aspectos de la selección del promotor, en referencia al caso
específico en el que la primera secuencia nucleotídica codifica una
trehalosa-6-fosfato sintasa
sintasa. Aunque se espera que la acumulación de trehalosa en
determinados momentos (p. ej., durante la exposición a estrés o en
una planta madura) y en determinados tejidos (p. ej., órganos de
reserva o, en momentos apropiados, tejidos sensibles al frío) que
sea beneficioso, o al menos que no sea perjudicial para la planta,
existe la posibilidad de que otras veces y en otros tejidos, la
acumulación de trehalosa pueda ser perjudicial para la planta, tal
y como se describen Veluthambi et al., en Plant
Physiol. (1981) 68: 1369-1374. Puede que sea
ventajoso usar un promotor vegetal que no permita una expresión
total del gen que causa la síntesis de la trehalosa, hasta que la
planta sea madura o se encuentre en las condiciones
medioambientales, incluyendo sequía y baja temperatura, en las que
los beneficios de la trehalosa superen a las posibles desventajas
para la planta. Algunos ejemplos de dichos promotores no
constitutivos son muy conocidos para los expertos en la materia, e
incluyen el promotor de la
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa
(Rubisco), descrito por Krebbers et al., en Plant Mol.
Biol. (1988) 11:745-759. Por otro lado, el uso
de promotores inducidos por estrés evitará la acumulación de
trehalosa hasta que sea necesario. En plantas que pueden crecer con
un contenido de trehalosa, la presente invención se puede llevar a
cabo sin recurrir a un promotor inducido por estrés, sin embargo,
el uso de promotores inducidos por estrés para evitar la producción
de trehalosa hasta que sea necesaria tiene la ventaja adicional de
evitar las consecuencias de la producción que en caso contrario
ocurrirían por la desviación de la capacidad fotosintética a la
síntesis de trehalosa.
Existen diferentes formas, todas conocidas por
los expertos en la materia, de realizar la etapa (a) de
transformación del método de la invención, que incluyen la práctica
de la transformación genética en la que interviene Agrobacterium
tumefaciens y el método de transformación biolística, descritas
brevemente ambas por, E. Galun (citado anteriormente).
La planta o la población celular vegetal que se
transforma en la etapa (a) del método de la presente invención no
es un parámetro crítico de la presente invención. Puede ser por
ejemplo una planta dicotiledónea como el tabaco (Nicotiana
tabacum), soja (Glycine max), manzana, remolacha
azucarera, Arabidopsis thaliana, alfalfa, petunia, algodón,
zanahoria, apio, col, pepino, pimienta, canola, tomate, patata,
lenteja, lino, brócoli, frijol, lechuga, colza, coliflor, espinaca,
col de bruselas, alcachofa, guisante, quingombó, calabacín, col
rizada, berza, té, café y Selaginella lepidophylla. Puede
ser también una planta monocotiledónea como el arroz Oryza
sativa, cereales, cebada, maíz, girasol (Helianthus
annuus), trigo, avena, mijo, sorgo, amaranto, cebolla,
espárrago y caña de azúcar.
Según otra forma de realización, la presente
invención se refiere a una planta transgénica o una parte de la
misma, una semilla de una planta transgénica o una célula de una
planta transgénica que se puede obtener mediante el método de
producción descrito anteriormente. En términos de producto, puede
describirse en líneas generales como una planta transgénica o una
parte de la misma, una semilla de una planta transgénica o una
células de una planta transgénica que tiene integrado en su genoma
(i) una primera secuencia nucleotídica que codifica una trehalosa
fosfato sintasa o una homóloga de la misma, o un parte
catalíticamente activa de dicha proteína, estando dicha secuencia
unida operativamente a un promotor y (ii) una segunda secuencia
nucleotídica. Sus diversos componentes, es decir, la primera
secuencia nucleotídica que codifica una proteína trehalosa fosfato
sintasa (una homóloga o una parte catalíticamente activa de la
misma), el promotor y la segunda secuencia nucleotídica, se han
descrito con detalle en lo que respecta al método de producción,
por lo que no existe la necesidad de volver a repetir su
significado.
En otra forma de realización, el método de
producción de la presente invención puede hacer uso de un vector
que puede describirse en líneas generales como uno que comprende (i)
una primera secuencia nucleotídica que codifica una trehalosa
fosfato sintasa o una homóloga de la misma, o un parte
catalíticamente activa de dicha proteína, estando dicha secuencia
unida funcionalmente a un promotor y (ii) uno o más sitios de
restricción para la inserción de una segunda secuencia
nucleotídica. En otra forma de realización adicional, el método de
producción de la presente invención puede hacer uso de un kit
biológico específico y puede describirse en términos generales como
uno que comprende (1) un vector como el previamente descrito y (2)
una o más secuencias nucleotídicas a partir de las cuales se puede
analizar la inserción de la primera secuencia nucleotídica y/o la
segunda secuencia nucleotídica en el genoma de la planta
transgénica o de la célula de la planta transgénica. Dicho análisis
puede realizarse mediante métodos como la hibridación por
inmunotransferencia de tipo Southern con secuencias de vectores o
promotores de PCR, por ejemplo, sitios de restricción flanqueadores
en los se clonó el transgen o mediante promotores internos o
adyacentes al gen introducido de resistencia al estrés, por ejemplo
la SEC. ID. Nº 1 o la SEC. ID. Nº 2 descritas en el ejemplo 4. Los
distintos términos que se usan en la definición del vector o del
kit biológico de la presente invención se usan en la presente
memoria descriptiva con el mismo significado que en la parte de la
especificación dedicada al método de producción.
Tal como los expertos en la materia podrán
comprender, la presente invención presenta una ventaja significativa
en términos de tecnología respetuosa con el medio ambiente al
evitar el uso de marcadores de resistencia a antibióticos o
biocidas.
A continuación se describirá e ilustrará la
presente invención mediante un número limitado de ejemplos que no
deben interpretarse sin embargo como una limitación del alcance de
la invención.
Existen varias líneas transgénicas de A.
thaliana que superexpresan \DeltaNSITPS1, \DeltaNAtTPS1,
SITPS1 o AtTPS1 cuando germinan en presencia de medios
ricos en glucosa (es decir un 6% en peso). Además, se generaron
varias líneas transgénicas antisentido AtTPS1 y se
analizaron consecuentemente. Las plantas se germinaron con una luz
constante y a 23ºC. Una semana después se observó una diferencia
notable entre las plantas de tipo natural y las de cadena
complementaria, por un lado y la superexpresión de los alelos
TPS1 de la planta por el otro. Estas últimas plantas tienen
una germinación normal, elongación del hipocotilo, virescencia y
expansión de las hojas cotiledóneas en medios con mucha glucosa.
Por el contrario, la planta de tipo natural tenía un aspecto
blanco y eran mucho más pequeñas. Las líneas transgénicas que
expresaron el AtTPS1 de la cadena complementaria fueron
incluso más pequeñas y germinaron a menor velocidad que las de tipo
natural. En un medio normal (es decir, 1% en peso de glucosa)
todas las plantas que albergaban las diferentes construcciones de
planta TPS1 parecían normales y no se observaron diferencias
significativas entre las mismas.
El fenotipo insensible a la glucosa fue más
destacable en las plantas que superexpresaban el alelo
AtTPS1, lo que sugiere que la presencia del extremo
aminoterminal cuando el gen TPS1 superexpresado pertenece a
la planta homóloga, es un elemento clave en las propiedades de
percepción de glucosa de la proteína de planta TPS1. Este
fenotipo insensible a la glucosa no está necesariamente asociado a
la síntesis de trehalosa, es decir, puede que no exista una
correlación entre la acumulación de altos niveles de trehalosa y la
severidad del fenotipo de insensibilidad a la glucosa. Una posible
explicación puede ser que la propia superexpresión en A.
thaliana del extremo aminoterminal de AtTPS1 imita parte del
fenotipo de insensibilidad a la glucosa. De este modo, estos datos
sugieren que la proteína TPS1 como tal, tiene un papel regulador en
el control de la percepción de la glucosa en las plantas y una
parte importante de este fenómeno está asociado con este extremo
aminoterminal.
La superexpresión de los genes TPS en las
plantas provoca la acumulación de trehalosa como resultado de la
ruptura de la trehalosa-6-fosfato
por una fosfatasa endógena. La manipulación de esta ruta
metabólica produce un fosfato inorgánico como subproducto. Por lo
tanto, analizamos el comportamiento de plantas transgénicas que
albergaban varias construcciones TPS de plantas en medios con altas
y bajas concentraciones de fosfato. En los siguientes experimentos,
medios con altas concentraciones de fosfato significan un medio MS
(es decir con Na_{2}PO_{4} 1 mM) mientras que medios con bajas
concentraciones de fosfato sólo tienen Na_{2}PO_{4} 1 \muM tal
y como describieron Lopez-Bucio et al., en
Nature Biotechnol. (2000) 18: 450-453. Para
observar las diferencias de crecimiento, las plantas crecieron
durante tres semanas con 16 horas de luz a 23ºC. Las plantas
transgénicas que superexpresan homólogos de TPS1 fueron capaces de
crecer en medios con bajas concentraciones de fosfato a una tasa
normal sin ninguna alteración morfológica evidente, mientras que
las plantas de tipo natural mostraron una serio retardo en el
crecimiento (tamaño reducido aproximadamente un
25-35% del tamaño normal) y un aumento de la
coloración marrón, característica de una privación de fosfato según
Raghatoma en Current Op. Plant Biol. (2000)
3:182-187. Las líneas transgénicas que expresan el
gen AtTPS1 de la cadena complementaria fueron mucho más
sensibles a las bajas concentraciones de fosfato que las de tipo
natural.
Como en el ejemplo 1, las líneas transgénicas
que superexpresan AtTPS1 mostraron un mejor rendimiento en
medios con bajas concentraciones de fosfato. Por lo tanto, a partir
de estos datos se puede concluir que la proteína TPS1 de planta que
contiene preferentemente el extremo aminoterminal intacto está
implicada de algún modo en la acumulación del fosfato inorgánico
(Pi) a través de un mecanismo regulador que no está necesariamente
vinculado a la liberación de Pi por la desfosforilación de la
trehalosa-6-fosfato.
Para usar el gen AtTPS1 como marcador en
un vector binario, se preparó un constructo pTPSM. El vector pTPSM
se obtiene a partir del pBIN 19 sin el gen de resistencia a
kanamicina (Nptli). Al igual que el plBT/01, pTPSM contiene
el ADNc de AtTPS1 bajo el control del promotor 35S en el
ADN-T, como se muestra en la figura 1. El vector
pTMS se preparó en varias etapas: pBN35 es un vector pBIN19 con el
promotor 35S y la secuencia de terminación Nos sin el ADNc entre
ellos. El gen Nptll de pBN35 se eliminó cortando el vector
con ApaI y NheI y después de la actividad polimerasa
de T4 religando el resto del vector resultando el pEBN35. Después
AtTPS1 se cortó del vector plBT/01 usando una doble digestión
KpnI y XbaI y, después de una primera ligación en
pBLuscript, AtTPS1 se subclonó entre los sitios KpnI y
Xbal de pEBN35S, resultando el constructo pTPSM. Este vector
puede mejorarse aún más agregando más sitios de restricción únicos
en el ADN-T para subclonar un gen de interés
específico.
Se transformó Agrobacterium tumefaciens
C58C1 con el plBT/01 o pTPSM por electroporación. Las plantas de
Arabidopsis crecieron hasta la floración y se transformaron
usando el método de inmersión floral descrito por Desfeux et
al., en Plant Phys. (2000) 23:895. Se recogieron las
semillas maduras de las plantas transformadas, se secaron a 23ºC
durante dos semanas y después se conservaron a 4ºC.
Para seleccionar las semillas transgénicas de un
grupo de semillas no transformadas, primero se esterilizaron con
vapor, después se agregó agua estéril a las semillas, y se
incubaron con luz constante a 4ºC durante 24 horas. El medio de
crecimiento estaba formado por Murashige 1X y sales Skoog y una
mezcla de vitaminas (comercialmente disponible en Life
Technologies); MES 2,5 mM a pH 5,7 ajustado con KOH, fitoagar 0,8%
y 6% de glucosa antes de verter en las placas (la glucosa se
esterilizó al autoclave por separado a partir del resto del medio).
Las semillas se dispersaron en placas en baja densidad (es decir
un máximo de 2000 semillas por placa de 145 mm de diámetro) usando
2-3 ml de H_{2}O (0,1% de agar o agarosa para
enmascarar la sensibilidad a la glucosa de las semillas de tipo
natural), se puede usar papel de filtro (Whatman N.º 1) para evitar
que las semillas se peguen entre sí. Las semillas aisladas
percibieron el mismo nivel de glucosa, acentuando la diferencia
entre las transgénicas y las de tipo natural. Las condiciones de
crecimiento de las plantas fueron 22ºC y 24 horas de luz. Las
placas de Petri se cerraron para mantener unos niveles de humedad
altos. Las semillas se incubaron en dichas condiciones de
crecimiento durante 5 a 7 días.
Las plantas seleccionadas crecieron durante 2 ó
3 semanas en tierra. Las hojas se usaron para preparar el ADN
genómico, el análisis por PCR se realizó usando los siguientes
promotores, con una temperatura de hibridación de 56ºC.
| 35S directo: | AAGAAGACGTTCCAACCACG | [SEC. ID Nº 1] |
| AtTPS1 reverso: | CGCTCAGAACAACTATGGTT | [SEC. ID. Nº 2] |
Para optimizar las condiciones para la selección
de las plantas Arabidopsis transgénicas usando el marcador
de selección AtTPS1, se preparó inicialmente una mezcla con
1000 veces más de semillas naturales que las líneas ya disponibles
que superexpresan 35SAtTPS1 que han sido transformadas con el
vector plBT/01. La mezcla de semillas se esterilizó y se sometió a
vernalización durante 24 horas a 4ºC con luz constante. El medio
con Murashige 1X y Skoog se enriqueció con un 6% de glucosa. La
mezcla de semillas se sembró a una concentración de 2000 semillas
por placa (145 mm de diámetro) usando agua. Las plantas germinaron
a 22ºC con luz constante. 6 días después de la siembra, se tomaron
fotografías de una fracción de las plantas (figura 2A y 2B). Bajo
estas condiciones, las plántulas de Arabidopsis de tipo
natural continuaron blancas y pequeñas, mientras que las plántulas
transformadas con 35SAtTPS1 presentaba un aspecto sano con
cotiledones verdes y más grandes.
Se analizó la plántula más grande, tal como se
muestra en la figura 2, para comprobar la presencia del casete
35SAtTPS1 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
usando el ADN genómico como molde. El promotor directo situado cerca
del extremo del promotor 35S y el promotor inverso en una región
específica de la secuencia de AtTPS1 permite la
amplificación de un producto de 2132 pb. Se obtuvo un producto de
PCR con el tamaño teórico cuando se uso como molde el ADN de la
plántula seleccionada como se muestra en la figura 2C, lo que
confirma que la plántula seleccionada incorporaba efectivamente el
gen 35SAtTPS1 en su genoma.
Para evaluar la fiabilidad de la selección
realizada, se aumento la escala del experimento. Se sembraron
aproximadamente 4000 semillas en un medio MS con un 6% de glucosa.
Seis días después, se seleccionaron las plántulas más grandes con
cotiledones verdes de entre las plántulas blancas y pequeñas. El
análisis de PCR demostró que más del 80% de las plántulas
seleccionadas contenía el casete 35SAtTPS1 tal y como se
muestra en la figura 3.
Las semillas de Nicotiana tabacum que
tenían el ADNc de 35SAtTPS1 en su genoma, germinaron más rápido en
un medio con mucha glucosa siendo por lo tanto menos sensibles a la
glucosa que las semillas naturales, tal como se muestra en la tabla
2 siguiente, que indica que el porcentaje de germinación en un
medio con un 6% en peso de glucosa, 10, 11 y 12 días después de la
siembra, respectivamente. Las plántulas de tipo natural no fueron
más blancas, pero si más pequeñas que las plantas transgénicas tal y
como se muestra en la figura 4. Incluso aunque pueda necesitarse un
protocolo de transformación diferente para N. tabacum en
comparación con A. thaliana, el ajuste de las condiciones
también permite seleccionar plantas transgénicas de tabaco en un
medio con glucosa.
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La lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo para comodidad del lector. No forma parte del
documento de patente europea. Incluso aunque se ha dedicado un
enorme tiempo para compilar las referencias, no puede excluirse
algún error u omisión, y la OEP renuncia a cualquier responsabilidad
a este respecto.
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<110> K.U.Leuven R&D
\hskip1cmThevelein, Johan
\hskip1cmLeyman, Barbara
\hskip1cmVan Dijck, Patrick
\hskip1cmAvonce, Nelson
\hskip1cmIturriaga, Gabriel
\vskip0.400000\baselineskip
<120> producción de plantas
transgénicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
K-1932-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> UK 0100105.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-01-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de PatentIn 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del mosaico de la coliflor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 35S promotor de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AtTPS1 promotor de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
Claims (19)
1. Método para obtener una planta transgénica o
una célula de una planta transgénica que comprende una segunda
secuencia nucleotídica, comprendiendo dicho método las etapas
de:
- a)
- transformación de una parte de una planta o una población de células vegetales con una secuencia nucleotídica que comprende (i) una primera secuencia nucleotídica que codifica una trehalosa fosfato sintasa, un homólogo, o un parte catalíticamente activa de dicha trehalosa fosfato sintasa, estando dicha primera secuencia nucleótida unida funcionalmente a un promotor y (ii) uno o más sitios de restricción que comprenden dicha segunda secuencia nucleotídica,
- b)
- aplicación de las condiciones de estrés medioambientales o artificiales a la planta transformada o a la población celular vegetal obtenida en la etapa (a), o su descendencia, y
- c)
- selección, a partir de la planta o de la población celular vegetal transformada colocada en las condiciones de estrés medioambientales o artificiales de la etapa (b), la parte de la planta o de la población celular vegetal transformada que presenta un aumento a la resistencia al estrés en dichas condiciones de estrés medioambientales o artificiales.
en el que las condiciones de estrés
artificiales excluyen la utilización de antibióticos o
biocidas.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la expresión de dicha primera secuencia nucleotídica no altera el
fenotipo de la planta transformada respecto a las propiedades o
características que no sean las de resistencia al estrés.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicha segunda secuencia nucleotídica codifica un anticuerpo, un
fragmento de anticuerpo, un antígeno, una proteína terapéutica, un
inhibidor enzimático, una citocina, un factor de crecimiento, una
hormona peptídica, una proteasa, un enzima o un producto
enzimático de la misma.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha primera secuencia
nucleotídica y dicha segunda secuencia nucleotídica están
integradas en el genoma de dicha planta transgénica o célula
vegetal transgénica con un aumento de la resistencia al estrés.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha primera secuencia
nucleotídica codifica un fragmento truncado del extremo
aminoterminal que comprende la parte catalíticamente activa de
dicha trehalosa fosfato sintasa.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas condiciones de estrés
aplicadas en la etapa (b) son condiciones de estrés artificiales
inducidas al poner en contacto la planta transformada o la
población de células vegetales obtenidas en la etapa (a), o su
descendencia, con un medio que contiene aproximadamente del 3 al 8%
en peso de un azúcar, un azúcar-alcohol o un
glicerol.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
dicho azúcar es glucosa.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha primera secuencia
nucleotidica codifica una
trehalosa-6-fosfato sintasa no
truncada.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha primera secuencia
nucleotídica procede de una planta.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
dicha primera secuencia nucleotídica procede de la misma planta que
la especie de planta que se está transformando en la etapa (a) o de
una especie vegetal diferente de la especie de planta transformada
en la etapa (a).
11. Método según la reivindicación 9, en el que
dicha primera secuencia nucleotídica procede de una planta
dicotiledónea.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
dicha planta dicotiledónea se selecciona entre el grupo formado
por el tabaco (Nicotiana tabacum), soja (Glycine max),
manzana, remolacha azucarera, Arabidopsis thaliana, alfalfa,
petunia, algodón, zanahoria, apio, col, pepino, pimienta, canola,
tomate, patata, lenteja, lino, brócoli, frijol, lechuga, colza,
coliflor, espinaca, col de bruselas, alcachofa, guisante, quingombó,
calabacín, col rizada, berza, té, café y Selaginella
lepidophylla.
13. Método según la reivindicación 9, en el que
dicha primera secuencia nucleotídica procede de una planta
monocotiledónea.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha primera secuencia
nucleotídica procede de una levadura.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho promotor se selecciona
entre el grupo formado por los promotores constitutivos, los
promotores inducibles y los promotores específicos de tejido.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha primera secuencia
nucleotídica codifica una proteína quimérica que combina diferentes
dominios de dicha trehalosa fosfato sintasa de al menos dos
especies vegetales diferentes.
18. Planta transgénica o una parte de la misma,
una semilla de una planta transgénica o una célula de una planta
transgénica que se puede obtener mediante el método según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado
porque dicha trehalosa fosfato sintasa, homóloga o parte
catalíticamente activa de la misma, es el único marcador de
selección transformado en dicha parte de planta o población
celular vegetal.
19. Utilización de un gen homólogo de la
trehalosa-6-fosfato sintasa o un
fragmento con el extremo Aminoterminal truncado del mismo o un gen
heterólogo de la trehalosa-6-fosfato
sintasa o un fragmento del mismo o el extremo aminoterminal de un
gen homólogo o heterólogo de la
trehalosa-6-fosfato sintasa como
marcador de selección para la transformación de la planta.
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