ES2312499T3 - Compuesto de lipoxina y su uso en el tratamiento y su uso en el tratamiento de los trastornos poliferativos de celulas. - Google Patents
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Abstract
Compuesto de la fórmula (Ver fórmula) en donde R'' es H o CH3; y los sustituyentes en C* están en la configuración RR.
Description
Compuesto de lipoxina y su uso en el tratamiento
de los trastornos proliferativos de células.
Las lipoxinas son un grupo de mediadores
biológicamente activos derivados del ácido araquidónico a través de
la acción de los sistemas de enzimas lipoxigenasa (LO). (Serhan,
C.N. y Samuelsson, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5335 (1984)).
La formación en tipos celulares humanos es iniciada por la
5-LO o 15-LO. (Serhan, C.N., J.
Bioenerg. Biomembr. 23:105 (1991)). Tipos unicelulares generan las
lipoxinas en cantidad de nanogramos durante la biosíntesis
transcelular de eicosanoides en
neutrófilos-plaquetas y eosinófilos. (Serhan, C.N.
y Sheppard, K.-A., J. Clin. Invest. 85:772 (1990)). Las LX son
eicosanoides que contienen tetraenos conjugados, y que modulan los
sucesos celulares en varios sistemas de órganos.
La lipoxina A_{4} (LXA_{4}) y la lipoxina B4
(LXB_{4}) son las dos lipoxinas principales. Cada una de ellas
potencia la actividad de la proteína quinasa C (PKC) en los núcleos
de células de eritroleucemia a 10 nM (Beckman, B.S. et al.,
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 201:169 (1992)). Cada una de ellas
provoca la vasodilatación a niveles nM (Busija, D.W. et al.,
Am. J. Physiol. 256:H468 (1989); Katoh, T. et al., Am. J.
Physiol. 263 (Renal Fluid Electrolyte Physiol. 32):F436 (1992)).
Los efectos vasodilatadores de las lipoxinas están bien
documentados. Por ejemplo, la administración de LXA_{4} en
cantidades micromolares vía inhalación bloquea la
broncoconstricción en pacientes asmáticos. (Christie, P.E. et
al., Am. Rev. Respir. Dis. 145:1281 (1992)).
En el rango 10^{-10} M, la LXA_{4} estimula
también la proliferación celular en combinación con concentraciones
subóptimas de factor estimulador de las colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF)
para inducir la formación de colonias en la médula ósea mieloide
(Stenke, L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 180:255
(1991)). La LXA_{4} también estimula la formación de colonias de
células mononucleares humanas (Popov, G.K. et al., Bull. Exp.
Biol. Med. 107:93 (1989)).
La LXA_{4} inhibe la quimiotaxis de los
leucocitos polimorfonucleares (Lee, T.H. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 180:1416 (1991)). Se ha hallado que una
combinación equimolar de lipoxinas modula la interacción de
neutrófilos polimorfonucleares y células mesangiales en la
inflamación glomerular. (Brady, H.R. et al., Am. J. Physiol.
Renal Physiol. 259:F809-F815 (1990)). La activación
de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) incluye la liberación
de mediadores de las anomalías estructurales y funcionales asociadas
con las etapas iniciales de la inflamación glomerular. (Wilson,
C.B. y Dixon, F.J. (1986), en: The Kidney, editado por B.M. Brenner
y F.C. Rector, Filadelfia, PA: Saunders, pp.
800-891).
Las lipoxinas actúan como antagonistas de los
leucotrienos (LT), los cuales son mediadores de la inflamación. La
LXA_{4} modula la obstrucción inducida por LTC_{4} de las vías
aéreas en pacientes asmáticos. (Christie, P.E. et al., Am.
Rev. Respir. Dis. 145:1281 (1992)). La LXA_{4} inhibe la
inflamación mediada por LTD_{4} y LTB_{4} en modelos animales
in vivo. (Badr, K.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
86:3438 (1989); Hedqvist, P. et al., Acta Physiol. Scand.
137:571 (1989)). La exposición previa a la LXA_{4} (nM) bloquea
las acciones vasoconstrictoras renales del LTD_{4} (Katoh, T.
et al., Am. J. Physiol. 263 (Renal Fluid Electrolyte Physiol.
32):F436 (1992)). La inflamación inducida por leucotrienos ocurre,
por ejemplo, en la artritis, en el asma, en varios tipos de
choques, en la hipertensión, en las enfermedades renales, en las
reacciones alérgicas, y en las enfermedades circulatorias,
incluyendo el infarto de miocar-
dio.
dio.
Aunque las lipoxinas son moléculas pequeñas
potentes que pueden administrare in vivo para tratar un
cierto número de enfermedades y afecciones. Los compuestos que
tienen las mismas bioactividades que las lipoxinas naturales pero
una vida media mayor serán compuestos farmacéuticos valiosos.
Esta invención trata sobre compuestos de
15-epi-lipoxina según la
reivindicación 1 sustancialmente purificados.
A diferencia de las lipoxinas naturales, las
moléculas pequeñas descritas ahora son muy potentes y
biocompatibles (es decir, no son tóxicas). Sin embargo, a diferencia
de las lipoxinas naturales, los análogos de lipoxina inhiben,
resisten, o experimentan de forma más lenta su metabolismo y, por
tanto, tienen una actividad farmacológica más prolongada. Además,
los compuestos descritos ahora son más lipofílicos que las lipoxinas
naturales y, por consiguiente, son captados más fácilmente por las
membranas biológicas.
Además, la invención trata sobre procedimientos
para mejorar una proliferación no deseada de ciertas células ex
vivo que se basan en poner en contacto las células con una
cantidad efectiva de un compuesto de
15-epi-lipoxina sustancialmente
purificado. En realizaciones preferidas, las células están
experimentando un crecimiento canceroso o tumoral. También en
realizaciones preferidas, las células se seleccionan de entre el
grupo consistente en: una célula epitelial, un leucocito, una célula
endotelial, y/o un fibroblasto.
En otro aspecto, la invención trata sobre
composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto de
15-epi-lipoxina sustancialmente
purificado de la presente invención, y un portador farmacéuticamente
aceptable. En una realización preferida, el compuesto de
15-epi-lipoxina está en una cantidad
efectiva para prevenir una proliferación no deseada de células en
un sujeto. En otra realización, la composición farmacéutica incluye
una cantidad efectiva de ácido acetilsalicílico (ASA).
La invención se refiere además a usos
diagnósticos y de investigación de los compuestos de lipoxina.
Otros aspectos y ventajas de esta invención se harán más evidentes a
partir de la descripción detallada y reivindicaciones
siguientes.
La Figura 1A es una gráfica que muestra la
expresión de la prostaglandina endoperóxido sintasa (PGHS) y de la
lipoxigenasa (LO) en células epiteliales alveolares del tipo II de
una línea celular tumoral humana (células A549). Las células se
cultivaron durante 24 h a 37ºC en frascos T-75
cm^{2} en presencia o ausencia de
interleucina-1_{\beta}
(IL-1_{\beta}) (1 ng/ml). Se tomó el ARN total
extraído (1 \mug) para su transcripción inversa (RT) y PCR usando
oligonucleótidos específicos para las PGHS-1 y -2, y
las 15-, 12- y 5-LO, y la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH). Las bandas radiactivas se cuantificaron
directamente mediante análisis con PhosphorImager, se normalizaron
respecto la expresión de GAPDH, y se expresaron como número de veces
del incremento en niveles de ARNm después de la exposición a
IL-1_{\beta}. La inserción de la Figura 1A muestra
la expresión del ARNm de la 15-LO en tejido pulmonar
humano y en monocitos de sangre periférica (PBM), ND significa que
no se ha detectado la expresión del ARNm de la
15-LO.
La Figura 1B es una gráfica que muestra un
perfil de RP-HPLC de ácidos
monohidroxieicosatetraenoicos (HETE) marcados con [^{3}H]
procedentes de células A549 (1,5 \times 10^{6} células/ml)
tratadas con IL-1_{\beta} y permeabilizadas,
expuestas al ácido [^{3}H]-araquidónico (20 mM)
durante 20 minutos a 37ºC. Los productos se extrajeron y
cromatografiaron usando un gradiente lineal de
metanol:H_{2}O:ácido acético (65:35:0,01; v/v/v) y metanol:ácido
acético (99,9:0,1, v/v) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Las
flechas indican la co-cromatografía de estándares
sintéticos.
La Figura 2A es una gráfica que muestra la
generación de 15-HETE. Se trataron células A549 (6
\times 10^{6} células/frasco) con IL-1_{\beta}
(1 ng/ml) durante 24 h, se sometieron a
congelación-descongelación (dos ciclos), se
expusieron durante 20 minutos a un vehículo (0,1% vol/vol etanol
(EtOH)), al ácido acetilsalicílico (ASA), al inhibidor del citocromo
P450 (ácido 17-octadecanoico
(17-ODYA), 5 \muM), o al inhibidor de la
5-LO (isómero Rev-5901, 5 \muM), y
se incubaron con ácido araquidónico (20 \muM) durante 20 min a
37ºC. En algunos experimentos, las células se desnaturalizaron
mediante calor (100ºC, 60 minutos) antes de la incubación. Las
incubaciones se detuvieron con la adición de metanol (2v), y los
productos se extrajeron para cromatografía líquida de alta presión
(HPLC) en fase inversa (RP). Los datos son media \pm SEM de cuatro
a seis frascos distintos. Se muestran *, P<0,05 y **, P<0,01
para el tratamiento frente a control.
La Figura 2B es una gráfica que muestra la
evolución temporal de la formación del 15-HETE a
partir de fuentes endógenas. Se hicieron crecer células A549 (1,5
\times 10^{6} células por ml) durante 48 h en ausencia o
presencia de IL-1_{\beta} (1 ng/ml), y se
incubaron (30 minutos a 37ºC) en 4 ml de HBSS con o sin A_{23187}
(5 \muM). Se determinaron los niveles de 15-HETE
mediante RIA. Los resultados representan la media \pm SEM de tres
experimentos diferentes determinados por duplicado. Se muestran las
*, P<0,05 para tratamientos frentes a vehículo.
La Figura 3 es una gráfica que muestra las
quiralidades relativas de los 15-HETE activados por
el ASA. Se expusieron células A549 (10^{7} células por frasco) a
IL-1_{\beta} (1 ng/ml) durante 24 h, se trataron
con vehículo (0,1% vol/vol etanol) (\boxempty) o ASA
(\ding{110}) durante 20 minutos, y a continuación se incubaron (30
minutos, 37ºC) en HBSS que contenía ácido araquidónico (20 \muM) y
A_{23187} (5 \muM). Los productos se cromatografiaron mediante
RP-HPLC (como en la Figura 1B) y se recogió la
región que contenía el 15-HETE, se extrajo con
cloroformo, y se trató con diazometano. El análisis quiral se
realizó con un DNBPG Bakerbond DNBPG (consultar los PROCEDIMIENTOS
para más detalles). Los resultados son representativos de dos
experimentos distintos que muestran resultados similares. La
inserción de la Figura 3 muestra la proporción entre 15R y
15S-HETE derivados de A549 en ausencia o presencia
(columnas rellenas) de ASA.
La Figura 4A es una gráfica que muestra un
cromatograma de RP-HPLC de productos procedentes de
la coestimulación de células epiteliales-neutrófilos
polimorfonucleares. Se expusieron células A549 confluentes a
IL-1_{\beta} (1 ng/ml) durante 24 h, se trataron
con ASA (20 min) y ácido araquidónico (20 \muM, 60 s), y ambas se
incubaron con PMN recién aislados (proporción de células A549:
células PMN de 1:8), seguidas por estimulación con el ionóforo
A_{23187} (5 \muM) en 4 ml de solución salina equilibrada de
Hank (HBSS) durante 30 minutos a 37ºC. Los productos se extrajeron y
tomaron para RP-HPLC tal y como se describe en la
sección de procedimientos del Ejemplo 5. El cromatograma se
representó a 300 nm y es representativo de n=6 experimentos.
La Figura 4B es una gráfica que muestra un
espectro ultravioleta (UV) en línea de los productos de la
coestimulación células epiteliales-PMN descrita en
la Figura 4A. El material que eluye debajo del pico B se identificó
como predominantemente
15-epi-LXB_{4}.
La Figura 4C es una gráfica que muestra un
espectro UV en línea de los productos de la coestimulación de
células epiteliales-PMN descrita en la Figura 4A. El
material que eluye debajo de los picos ilustrados se identificó como
predominantemente
15-epi-LXA_{4}.
La Figura 5A es una gráfica que muestra ASA
modulando la formación de lipoxinas que contienen tetraenos
(lipoxinas más 15-epi-lipoxinas)
durante la coestimulación de células
epiteliales-PMN. Se expusieron células A549 a
IL-1_{\beta} (1 ng/ml, 24 h) y se trataron (20
min, 37ºC) con vehículo (0,1% vol/vol) o con ASA, antes de la
adición del ácido araquidónico (20 \muM, 1 min) y de PMN recién
aislados (proporción celular A549/PMN de 1:5). Las coestimulaciones
se llevaron a cabo como en la Figura 4A. Los resultados representan
la media \pm SEM de 3-5 donantes distintos. La
inserción de la Figura 5A muestra el efecto de la proporción de
células sobre la generación de lipoxinas que contienen tetraenos
(lipoxinas más 15-epi-lipoxinas)
durante las coincubaciones de células A549 con PMN en ausencia
(\medcirc) o presencia (\ding{110}) de ASA.
La Figura 5B es una gráfica que muestra ASA
modulando la formación de peptidoleucotrienos (LTC_{4} más
LTD_{4}) durante la coestimulación de células
epiteliales-PMN de acuerdo con las condiciones
esbozadas en la Figura 5A. La inserción de la Figura 5B muestra el
efecto de la proporción de células sobre la generación de
peptidoleucotrienos (LTC_{4} más LTD_{4}) durante las
coincubaciones de células A549 con PMN en ausencia (\medcirc) o
presencia (\ding{110}) de ASA.
La Figura 6A es una gráfica que muestra el
efecto del tratamiento con lipoxina 4A (LXA_{4}), lipoxina B4
(LXB_{4}), dexametasona (DEX) y vehículo solo sobre el número de
células A549 a lo largo del tiempo. Se trataron células A549 en
placas de 96 pocillos con vehículo (0,15% EtOH) o concentraciones
equimolares (10^{-6} M) de LXA_{4}, LXB_{4} o DEX, durante 96
horas a 37ºC. En los intervalos indicados, se recolectaron las
células para el ensayo con MTT,
3-(4,5-dimetiltiazoil-2-il)-2,5-(difenil-tetrazolio
bromuro). Los datos son media \pm de 3-7
experimentos realizados por cuadruplicado. Se muestran *, P<0,05
y **, P<0,005 para compuestos frente a vehículo.
La Figura 6B es una gráfica que muestra el
efecto del tratamiento con LXA_{4}, LXB_{4} y DEX sobre el
porcentaje de inhibición de la proliferación de células A549 a
diferentes concentraciones de células A549. Se expusieron células
A549 a LXA_{4}, LXB_{4} o DEX en las concentraciones indicadas
durante 72 horas a 37ºC. Los resultados son la media \pm SEM de
5-8 experimentos realizados por cuadruplicado. Los
resultados se expresan como el porcentaje de inhibición de la
proliferación relativo al vehículo. Se muestran *, P<0,05, **,
P<0,025 y ***, P<0,005 para los compuestos frente al
vehículo.
La Figura 7A es una gráfica que muestra el
efecto de la LXA_{4}, LXB_{4} y DEX sobre la síntesis de ADN en
células A549, según se indica mediante la incorporación de
^{3}H-timidina, en donde las células A549 se
cultivaron durante 72 horas en presencia de LXA_{4}, LXB_{4} y
DEX a diferentes concentraciones que oscilaban entre 5 nM y 500 nM.
Veinticuatro horas antes del ensayo se añadió
metil-[^{3}H]timidina (2 \muCi/ml) a cada pocillo. Las
células se lavaron subsiguientemente cuatro veces con DPBS^{2+}
(4ºC), se lisaron con hidróxido sódico (NaOH) 0,25 N, y se
monitorizó la incorporación de radiactividad. Los valores
representan la media \pm SEM de 3 experimentos diferentes
realizados por cuadruplicado. Los resultados se expresan como el
porcentaje de incorporación de [^{3}H]timidina relativo al
vehículo. Se muestran *, P<0,05, y **, P<0,005 para los
compuestos frente al vehículo.
La Figura 7B es una gráfica que muestra el
efecto de la LXA_{4}, LXB_{4} y DEX sobre la inhibición de las
células A549, en donde las células A549 se sembraron en placas de
cultivo de 12 pocillos en presencia de LXA_{4}, LXB_{4} y DEX (1
\muM), y los recuentos de células se obtuvieron a las 72 horas
contando las células que excluían azul tripán. Los valores
representan la media \pm SEM de 3 experimentos diferentes. Los
resultados se expresan como el porcentaje de inhibición de la
proliferación relativo al vehículo. Se muestra *, P<0,05 para los
compuestos frente al vehículo.
La Figura 8 es un diagrama que muestra la vía
bioquímica propuesta para la generación de
15-epi-lipoxinas. Las actividades
ASA-PGHS-2 acetilada y/o P450
contribuyen al 15R-HETE. El 15R-HETE
epitelial experimenta conversión transcelular por parte de
5-LO de leucocitos a un intermedio
15-epi-5(6)-epoxitetraeno,
el cual es común a ambas
15-epi-LXA_{4} y
15-epi-LXB_{4}.
Tal y como se utiliza en la presente invención,
las siguientes frases y términos se definen como sigue:
Un "compuesto de lipoxina" debe significar
un compuesto de lipoxina natural (lipoxina A_{4} o lipoxina B4),
y/o un análogo de la lipoxina.
Un "análogo de la lipoxina" debe significar
un compuesto que tiene una "región activa" que funciona como
la región activa de una "lipoxina natural", pero que tiene una
"región de transformación metabólica" que difiere de la
lipoxina natural. Los análogos de la lipoxina incluyen compuestos
que son estructuralmente similares a una lipoxina natural,
compuestos que comparten el mismo sitio de reconocimiento del
receptor, compuestos que comparten la misma o similar región de
transformación metabólica de la lipoxina que la lipoxina, y
compuestos que son reconocidos en el campo como análogos de la
lipoxina. Los análogos de lipoxina incluyen los metabolitos análogos
de la lipoxina.
El compuesto de lipoxina de la presente
invención es un "compuesto de
15-epi-lipoxina". Tal y como se
utiliza en la presente invención, el "compuesto de
15-epi-lipoxina" es un compuesto
de lipoxina en el cual la configuración del carbono 15 es
R.
Los términos "lipoxina correspondiente" y
"lipoxina natural" se refieren a una lipoxina o metabolito de
lipoxina que ocurre de forma natural. Cuando un análogo tiene
actividad por un receptor específico de lipoxina, la lipoxina
correspondiente o natural es el ligando normal para ese receptor.
Por ejemplo, cuando un análogo es un análogo de LXA_{4} que tiene
actividad específica por un receptor específico de LXA_{4} sobre
células HL-60 diferenciadas, la lipoxina
correspondiente es la LXA_{4}. Cuando un análogo tiene actividad
como antagonista de otro compuestos (tales como los leucotrienos),
el cual es antagonizado por una lipoxina que ocurre de forma
natural, esa lipoxina natural es la lipoxina correspondiente.
El término "región activa" debe significar
la región de una lipoxina natural, o análogo de lipoxina, que está
asociada con las interacciones celulares in vivo. La región
activa puede unir el "sitio de reconocimiento" de un receptor
celular de lipoxina, o de una macromolécula o complejo de
macromoléculas, incluyendo un enzima y su cofactor. Los análogos de
lipoxina A_{4} preferidos tiene una región activa que incluye el
C5-C15 de la lipoxina A_{4} natural. Los análogos
de lipoxina B4 preferidos tienen una región activa que comprende el
C5-C14 de la lipoxina B4 natural.
El término "sitio de reconocimiento" o
receptor es reconocido en el campo y se pretende que se refiera
generalmente a una macromolécula, o complejo de macromoléculas,
funcional con la cual ciertos grupos de mensajeros celulares, tales
como las hormonas, los leucotrienos, y las lipoxinas, deben
interaccionar primero antes de que se inicien las respuestas
bioquímicas y fisiológicas a esos mensajeros. Tal y como se
utilizan en esta solicitud, un receptor puede estar aislado, sobre
una célula intacta o permeabilizada, o en un tejido, incluyendo un
órgano. Un receptor puede proceder de, o estar en un sujeto vivo, o
puede estar clonado. Un receptor puede existir normalmente o puede
ser inducido por un estado morboso, por una lesión, o por medios
artificiales. Un compuesto de esta invención puede unirse
reversible, irreversible, competitiva, no competitiva, o
acompetitivamente con respecto al sustrato natural de un sitio de
reconocimiento.
El término "región de transformación
metabólica" se pretende que se refiera generalmente a la porción
de una lipoxina, un metabolito de lipoxina, o un análogo de
lipoxina, incluyendo un análogo de metabolito de lipoxina, a partir
del cual un enzima, o un enzima y su cofactor, intenta realizar una
o más transformaciones metabólicas que, ese enzima o enzima y
cofactor normalmente transforma en lipoxinas. La región de
transformación metabólica puede ser o no propensa a la
transformación. Un ejemplo no limitante de una región de
transformación metabólica de una lipoxina es una porción de la
LXA_{4} que incluye el doble enlace C-13,14 o el
grupo hidroxilo C-15, o ambos.
El término "molécula marcadora detectable"
se pretende que incluya las moléculas fluorescentes,
fosforescentes, o radiomarcadas usadas para ubicar, seguir o
identificar el compuesto o sitio de reconocimiento del receptor al
cual está unida la molécula marcadora detectable. La molécula
marcadora puede detectarse mediante cualquiera de los diversos
procedimientos conocidos en el estado de la técnica.
El término "análogo de lipoxina marcado" se
comprende adicionalmente que abarca compuestos que están marcados
con isótopos radiactivos, tales como, pero no limitándose al tritio
(^{3}H), deuterio (^{2}H), carbono (^{14}C), o marcado de
otro modo (por ejemplo, fluorescentemente). Los compuestos de esta
invención pueden marcarse o derivatizarse, por ejemplo, para
experimentos de unión cinéticos, para la elucidación adicional de
las vías metabólicas y de los mecanismos enzimáticos, o para la
caracterización mediante procedimientos conocidos en el campo de la
química analítica.
El término "inhibe el metabolismo"
significa el bloqueo o la reducción de la actividad de un enzima
que metaboliza una lipoxina nativa. El bloqueo o la reducción pueden
ocurrir mediante unión covalente, mediante unión irreversible,
mediante unión reversible que tiene un efecto práctico de unión
irreversible, o mediante cualquier otro medio que impida al enzima
operar de su forma usual sobre otro análogo de lipoxina, incluyendo
un metabolito análogo del lipoxina, una lipoxina, o un metabolito de
lipoxina.
El término "resiste al metabolismo" se
pretende que incluya la incapacidad de experimentar una o más de
las transformaciones degradantes metabólicas mediante al menos una
de las enzimas que metaboliza lipoxinas. Dos ejemplos no limitantes
de análogos de la LXA_{4} que resisten el metabolismo son (1) una
estructura que no puede ser oxidada a la forma
15-oxo, y (2) una estructura que puede oxidarse a la
forma 15-oxo, pero que no es sensible a la reducción
enzimática a la forma 13,14-dihidro.
El término "experimenta el metabolismo más
lentamente" significa que tiene una cinética de reacción más
lenta, o que requiere más tiempo para completar la serie de
transformaciones metabólicas por parte de uno o más de los enzimas
que metabolizan la lipoxina. Un ejemplo no limitante de análogo de
la LXA_{4} que experimenta su metabolismo más lentamente es una
estructura que tiene una energía de transición de estado para la
deshidrogenación del C-15 más elevada que la de la
LXA_{4}, porque el análogo está estéricamente impedido en el
C-16.
El término "tejido" se pretende que incluya
células intactas, sangre, preparaciones de sangre tales como el
plasma y suero, huesos, articulaciones, músculos, músculos lisos, y
órganos.
El término "halógeno" se pretende que
incluya los átomos de flúor, cloro, bromo y yodo, o los grupos
fluoro, cloro, bromo y yodo.
El término "sal farmacéuticamente
aceptable" se pretende que incluya sales farmacéuticamente
aceptables reconocidas en el campo. Esas sales no tóxicas usualmente
se hidrolizan en condiciones fisiológicas, e incluyen las bases
orgánicas e inorgánicas. Los ejemplos de sales incluyen el sodio,
potasio, calcio, amonio, cobre y aluminio, así como las aminas
primarias, secundarias y terciarias, las resinas de intercambio
iónico básicas, las purinas, piperazinas, y similares. Se pretende
que el término incluya además los ésteres de grupos hidrocarburos
inferiores, tales como de metil, etil y propil.
El término "composición farmacéutica"
comprende uno o más análogos de lipoxinas como ingrediente(s)
activo(s),
o una sal o sales farmacéuticamente aceptable de los mismos, y pueden contener también un portador farmacéuticamente aceptable, y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos opcionales. Las composiciones incluyen las composiciones apropiadas para la administración oral, rectal, oftálmica, pulmonar, nasal, dérmica, tópica, parenteral (incluyendo la subcutánea, intramuscular e intravenosa) o administración mediante inhalación. La ruta más apropiada en cualquier caso particular dependerá de la naturaleza y gravedad de la condición que se esté tratando, y de la naturaleza del ingrediente o ingredientes activos. Las composiciones pueden presentarse en forma de dosis unitarias, y prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en el campo de la farmacia. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para los propósitos de mejorar la respuesta terapéutica. Por ejemplo, pueden administrarse a diario varias dosis divididas, o la dosis puede reducirse proporcionalmente a lo largo del tiempo. Una persona capacitada en el estado de la técnica normalmente puede determinar la cantidad de dosis efectiva y el régimen apropiado. Una composición farmacéutica de análogo de lipoxina puede referirse también a una combinación que comprende lipoxinas, análogos de lipoxina, y/o metabolitos de la lipoxina, incluyendo los metabolitos de los análogos de lipoxina. Un ejemplo no limitante de una combinación es una mezcla que comprende un análogo x de la lipoxina que inhibe una enzima que metaboliza las lipoxinas, y que opcionalmente tiene una actividad específica con un sitio de reconocimiento de un receptor de lipoxina, y un segundo análogo y de lipoxina que tiene actividad específica con un sitio de reconocimiento de receptor de lipoxina y que opcionalmente inhibe o resiste el metabolismo de lipoxinas. Esta combinación resulta en una vida media en tejido más prolongada al menos para y, puesto que x inhibe uno de los enzimas que metaboliza lipoxinas. Por tanto, la acción de la lipoxina mediada o antagonizada por y está potenciada.
o una sal o sales farmacéuticamente aceptable de los mismos, y pueden contener también un portador farmacéuticamente aceptable, y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos opcionales. Las composiciones incluyen las composiciones apropiadas para la administración oral, rectal, oftálmica, pulmonar, nasal, dérmica, tópica, parenteral (incluyendo la subcutánea, intramuscular e intravenosa) o administración mediante inhalación. La ruta más apropiada en cualquier caso particular dependerá de la naturaleza y gravedad de la condición que se esté tratando, y de la naturaleza del ingrediente o ingredientes activos. Las composiciones pueden presentarse en forma de dosis unitarias, y prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en el campo de la farmacia. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para los propósitos de mejorar la respuesta terapéutica. Por ejemplo, pueden administrarse a diario varias dosis divididas, o la dosis puede reducirse proporcionalmente a lo largo del tiempo. Una persona capacitada en el estado de la técnica normalmente puede determinar la cantidad de dosis efectiva y el régimen apropiado. Una composición farmacéutica de análogo de lipoxina puede referirse también a una combinación que comprende lipoxinas, análogos de lipoxina, y/o metabolitos de la lipoxina, incluyendo los metabolitos de los análogos de lipoxina. Un ejemplo no limitante de una combinación es una mezcla que comprende un análogo x de la lipoxina que inhibe una enzima que metaboliza las lipoxinas, y que opcionalmente tiene una actividad específica con un sitio de reconocimiento de un receptor de lipoxina, y un segundo análogo y de lipoxina que tiene actividad específica con un sitio de reconocimiento de receptor de lipoxina y que opcionalmente inhibe o resiste el metabolismo de lipoxinas. Esta combinación resulta en una vida media en tejido más prolongada al menos para y, puesto que x inhibe uno de los enzimas que metaboliza lipoxinas. Por tanto, la acción de la lipoxina mediada o antagonizada por y está potenciada.
El término "compuestos de lipoxina
sustancialmente puro o purificado" se define por abarcar
compuestos naturales o sintético de lipoxinas que tienen menos de
aproximadamente un 20% (en peso seco) de otras macromoléculas
biológicas, y que preferiblemente tienen menos de aproximadamente un
5% de otras macromoléculas biológicas (sin embargo, pueden estar
presentes agua, tampones, y otras moléculas pequeñas, especialmente
moléculas que tienen un peso molecular inferior a 5000). El término
"purificado" tal y como se utiliza en la presente invención
preferiblemente significa al menos el 80% en peso seco, más
preferiblemente en el rango de 95-99% en peso, y
los más preferiblemente al menos 99,8% en epso, de macromoléculas
biológicas del mismo tipo que están presentes (sin embargo, pueden
estar presentes agua, tampones, y otras moléculas pequeñas,
especialmente moléculas que tienen un peso molecular inferior a
5000). El término "puro" tal y como se usa en la presente
invención, preferiblemente tiene los mismos límites numéricos que el
"purificado" inmediatamente anterior. "Aislado" y
"purificado" no abarcan ni los materiales naturales en su
estado nativo, ni los materiales naturales que se han separado en
componentes (por ejemplo, en un gel de acrilamida) pero que no se
han obtenido como sustancias o soluciones puras (por ejemplo,
proteínas que carecen de contaminación, o reactivos de
cromatografía tales como los agentes desnaturalizantes, y los
polímeros, por ejemplo, la acrilamida o agarosa).
El término "sujeto" se pretende que incluya
los organismos vivos propensos a patologías o enfermedades causadas
o contribuidas por la inflamación, las respuestas inflamatorias, la
vasoconstricción, la supresión mieloide y/o la proliferación
celular no deseada. Los ejemplos de sujetos incluyen los humanos,
perros, gatos, vacas, cabras y ratones. El término sujeto se
pretende que incluya además las especies transgénicas.
El término "trastorno proliferativo
celular" incluye los trastornos que implican la proliferación no
deseada de una célula. Los ejemplos no limitantes de tales
trastornos incluyen los tumores (por ejemplo, de cerebro, pulmón
(células pequeñas y células no pequeñas), ovario, próstata, mama o
colon) u otros carcinomas o sarcomas (por ejemplo, leucemia,
linfoma).
El término "mejorado" se pretende que
incluya el tratamiento de, la prevención de, la limitación de y/o
la inhibición de la proliferación celular no deseada, y/o un
trastorno proliferativo celular. Compuestos de lipoxina.
La presente invención se basa en el hallazgo
sorprendente de que los compuestos de
15-epi-lipoxina según la
reivindicación 1 sustancialmente puros mejoran la proliferación
celular no deseada en un sujeto.
La presente invención se basa en el hallazgo
sorprendente de que las lipoxinas son metabolizadas rápidamente de
forma única por ciertas células in vivo. Aunque otros
productos derivados de LO (por ejemplo, los leucotrienos) son
metabolizados por la \omega-oxidación seguida por
la \beta-oxidación (Huwyler et al., Eur. J.
Biochem. 206:869-879 (1992)), la presente invención
se basa en el hallazgo inesperado de que las lipoxinas son
metabolizadas por una serie de reacciones de oxidación y reducción
que actúan sobre ciertos sitios de la molécula de lipoxina. Por
ejemplo, se ha hallado que el metabolismo de LXA_{4} ocurre, al
menos parcialmente, a través de la oxidación del hidroxilo
C-15 para generar
15-oxo-LXA_{4}, la reducción del
doble enlace C-13,14 para rendir
13,14-dihidro-15-oxo-LXA_{4}
y la reducción adicional para rendir
13,14-dihidro-LXA_{4}. En la
LXB_{4}, y en sus isómeros naturales, la oxidación análoga ocurre
en el hidroxilo C-5, y la reducción ocurre en el
doble enlace C-6,7.
\newpage
Las lipoxinas que comprenden una "región
activa" una "región de transformación metabólica", tal y
como ambos términos se definen en la presente invención, tienen
generalmente la estructura siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{1} puede
ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y R_{2} puede
ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de lipoxina descritos en la
presente invención tienen la siguiente fórmula estructural I:
en donde X es R_{1}, OR_{1}, o
SR_{1};
en donde R_{1} es
(i) hidrógeno;
(ii) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(iii) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(iv) aralquilo de 7 a 12 átomos de carbono;
(v) fenilo;
(vi) fenilo sustituido,
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en -NO_{2}, -CN, -C(=O)-R_{1},
-SO_{3}H, e
hidrógeno;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(vii) molécula marcadora detectable; o
(viii) alquenilo de cadena lineal o ramificada,
de 2 a 8 átomos de carbono, ambos inclusive;
en donde Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (CN);
en donde Q_{3} es O, S o NH;
en donde uno de R_{2} y R_{3} es hidrógeno y
el otro es,
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(c) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(d) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(e) R_{a}Q_{2}R_{b}
en donde Q_{2} es -O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada; y
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{4} es
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
en donde Y_{1} o Y_{2} es -OH, metilo, o
-SH, y en donde el otro es,
(a) H
(b) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 a 3; y Z es ciano, nitro, o halógeno;
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada; o
(d) alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive;
o Y_{1} y Y_{2} tomados conjuntamente
son
(a) =N; o
(b) =O;
en donde R_{5} es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono, el cual
puede ser de cadena recta o ramificada;
(b)
-(CH_{2})_{n}-R_{i}
en donde n = 0 a 4 y R_{i} es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(ii) fenilo; o
(iii) fenilo sustituido,
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en hidrógeno, -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, metoxi, y -SO_{3}H;
y
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(c) -R_{a}Q_{a}R_{b}
en donde Q_{a} = -O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
(d)
-C(R_{iii})(R_{iv})-R_{i}
en donde R_{iii} y R_{iv} se seleccionan
independientemente de entre el grupo consistente en,
(i) H;
(ii) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 + 3, y en donde cualquier Z se selecciona
independientemente de entre el grupo consistente en halógeno;
(e) haloalquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, y de 1 a 6 átomos de halógeno, ambos inclusive, de
cadena recta o ramificada; y en donde R_{6} es,
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
(c) halógeno; pero excluyendo las amidas en la
posición C1, los alcanoatos en la posición C1, y las sales en
posición C1 farmacéuticamente aceptables del ácido
(5S,6R,15S)-trihidroxi-7E,9E,11Z,13E-eicosatetraenoico
(LXA_{4}); y excluyendo los alcanoatos en las posiciones
C-5, C-6, y C-15 del
LXA_{4}.
Los análogos de lipoxina tienen la siguiente
estructura II:
en donde X es R_{1}, OR_{1}, o
SR_{1};
en donde R_{1} es
(i) hidrógeno;
(ii) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(iii) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(iv) aralquilo de 7 a 12 átomos de carbono;
(v) fenilo;
(vi) fenilo sustituido,
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en -NO_{2}, -CN, -C(=O)-R_{1},
hidrógeno, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(vii) molécula marcadora detectable, tal como,
pero no limitada a las marcas fluorescentes; o
(viii) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, de cadena recta o ramificada;
en donde Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (C=N);
en donde Q_{3} es O, S o NH;
en donde uno de R_{2} y R_{3} es hidrógeno y
el otro es,
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(c) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(d) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(e) R_{a}Q_{2}R_{b}
en donde Q_{2} es -O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{4} es
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
en donde Y_{1} o Y_{2} es -OH, metilo, -H, o
-SH, y en donde el otro es,
(a) H;
(b) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 a 3, Z es ciano, nitro, o halógeno, incluyendo F, Cl, Br,
I;
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
(d) alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive;
o Y_{1} e Y_{2} tomados conjuntamente
son
(a) =N; o
(b) =O;
en donde R_{5} es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono, el cual
puede ser de cadena recta o ramificada;
(b)
-(CH_{2})_{n}-R_{i} en donde n = 0 a 4
y R_{i} es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(ii) fenilo; o
(iii) fenilo sustituido,
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en hidrógeno, -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, metoxi, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(c) -R_{a}Q_{a}R_{b}
en donde Q_{a} = -O- o -S-; y
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
(d)
-C(R_{iii})(R_{iv})-R_{i}
en donde R_{iii} y R_{iv} se seleccionan
independientemente de entre el grupo consistente en,
(i) H; y
(ii) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 + 3
en donde cualquier Z se selecciona de entre el
grupo consistente en halógeno.
(e) haloalquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, y de 1 a 6 átomos de halógeno, ambos inclusive, de
cadena recta o ramificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de lipoxina tienen la siguiente
estructura III:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X es R_{1}, OR_{1}, o
SR_{1}; en donde R_{1}
es
(i) hidrógeno;
(ii) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(iii) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(iv) aralquilo de 7 a 12 átomos de carbono;
(v) fenilo;
(vi) fenilo sustituido,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en -NO_{2}, -CN, -C(=O)-R_{1},
hidrógeno, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(vii) molécula marcadora detectable; o
(viii) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, de cadena recta o ramificada;
en donde Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (C=N);
en donde Q_{3} es O, S o NH;
en donde uno de R_{2} y R_{3} es hidrógeno y
el otro es,
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(c) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(d) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(e) R_{a}Q_{2}R_{b} en donde Q_{2} es
-O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{4} es
(a) H; o
(b) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada; en donde
Y_{1} o Y_{2} es hidroxilo, metilo, hidrógeno o tiol, y en donde
el otro es
(a) H;
(b) CH_{a}Z_{b}
en donde a + b = 3, a = 0 a 3, b = 0 a 3
Z es ciano, nitro, o halógeno [incluyendo F, Cl,
Br, I];
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
(d) alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive;
o Y_{1} e Y_{2} tomados conjuntamente
son
(a) =N; o (b) =O;
y en donde R_{5} es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono, el cual
puede ser de cadena recta o ramificada;
(b)
-(CH_{2})_{n}-R_{i} en donde n = 0 a 4
y R_{i} es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(ii) fenilo;
\newpage
(iii) fenilo sustituido,
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en hidrógeno, -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, metoxi, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(c) -R_{a}Q_{a}R_{b}
en donde Q_{a} = -O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada; o
(d)
-C(R_{iii})(R_{iv})-R_{i}
en donde R_{iii} y R_{iv} se seleccionan
independientemente de entre el grupo consistente en,
(i) H;
(ii) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 + 3
en donde cualquier Z se selecciona de entre el
grupo consistente en halógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de lipoxina tienen la siguiente
fórmula estructural IV:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X es R_{1}, OR_{1}, o
SR_{1};
en donde R_{1} es
(i) hidrógeno;
(ii) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(iii) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(iv) aralquilo de 7 a 12 átomos de carbono;
(v) fenilo;
(vi) fenilo sustituido,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en -NO_{2}, -CN, -C(=O)-R_{1},
metoxi, hidrógeno, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(vii) molécula marcadora detectable; o
(viii) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, de cadena recta o ramificada;
en donde Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (CN);
en donde Q_{3} es O, S o NH;
en donde uno de R_{2} y R_{3} es hidrógeno y
el otro es,
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(c) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(d) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(e) R_{a}Q_{2}R_{b} en donde Q_{2} es
-O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{4} es
(a) H; o
(b) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
en donde Y_{1} o Y_{2} es -OH, metilo, o
-SH, y en donde el otro es,
(a) H;
(b) CH_{a}Z_{b}
en donde a + b = 3, a = 0 a 3, b = 0 a 3,
Z es ciano, nitro, o halógeno;
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada; o
(d) alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive;
o Y_{1} e Y_{2} tomados conjuntamente
son
(a) =N; o
(b) =O;
en donde R_{5} es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono, el cual
puede ser de cadena recta o ramificada;
(b)
-(CH_{2})_{n}-R_{i}
en donde n = 0 a 4 y R_{i} es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(ii) fenilo; o
(iii) fenilo sustituido,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en hidrógeno, -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, metoxi, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(c) R_{a}Q_{a}R_{b}
en donde Q_{a} = -O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
(d)
-C(R_{iii})(R_{iv})-R_{i}
en donde R_{iii} y R_{iv} se seleccionan
independientemente de entre el grupo consistente en,
(i) H; o
(ii) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 + 3, y
en donde cualquier Z se selecciona de entre el
grupo consistente en halógeno; o
(e) haloalquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, y de 1 a 6 átomos de halógeno, ambos inclusive, de
cadena recta o ramificada; y
en donde R_{6} es (a) H; (b) alquilo desde 1 a
4 átomos de carbono, ambos inclusive, de cadena lineal o ramificada;
o (c) halógeno.
\newpage
Los análogos de lipoxina tienen la siguiente
fórmula estructural V:
en donde R_{1}
es
(i) hidrógeno;
(ii) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(iii) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(iv) aralquilo de 7 a 12 átomos de carbono;
(v) fenilo;
(vi) fenilo sustituido,
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en -NO_{2}, -CN, -C(=O)-R_{1},
hidrógeno, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(vii) molécula marcadora detectable; o
(viii) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, de cadena recta o ramificada;
en donde n = 1 a 10, ambos inclusive;
en donde R_{2}, R_{3a}, y R_{3b} se
seleccionan independientemente de entre,
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(c) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(d) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(e) R_{a}Q_{2}R_{b}
en donde Q_{2} es -O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada; y
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde Y_{1} o Y_{2} es -OH , metilo,
hidrógeno, o -SH y
en donde el otro es
(a) H;
(b) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 a 3, y Z es ciano, nitro, o halógeno;
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
(d) alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
o Y_{1} e Y_{2} tomados conjuntamente
son
(a) =N; o
(b) =O;
en donde Y_{3} o Y_{4} es -OH, metilo,
hidrógeno, o -SH, y en donde el otro es,
(a) H;
(b) CH_{a}Z_{b}
en donde a + b = 3, a = 0 a 3, b = 0 a 3, y
cualquier Z es ciano, nitro, o halógeno;
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
(d) alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
o Y_{3} e Y_{4} tomados conjuntamente
son
(a) =N; o
(b) =O;
en donde Y_{5} o Y_{6} es -OH, metilo,
hidrógeno, o -SH, y en donde el otro es,
(a) H;
(b) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 a 3, Z es ciano, nitro, o halógeno;
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
(d) alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
o Y_{5} e Y_{6} tomados conjuntamente
son
(a) =N; o
(b) =O;
en donde R5 es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono, el cual
puede ser de cadena recta o ramificada;
(b) -(CH_{2})_{n} -R_{i}
en donde n = 0 a 4 y Ri es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(ii) fenilo; o
\newpage
(iii) fenilo sustituido,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en hidrógeno, -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R1, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, metoxi, e hidroxilo;
(c) -R_{a}Q_{a}R_{b}
en donde Q_{a} = -O- o -S-; y
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
(d)
-C(R_{iii})(R_{iv})-R_{i}
en donde R_{iii} y R_{iv} se seleccionan
independientemente de entre el grupo consistente en,
(i) H; o
(ii) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 + 3, y
en donde cualquier Z se selecciona de entre el
grupo consistente en halógeno; o
(e) haloalquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, y de 1 a 6 átomos de halógeno, ambos inclusive, de
cadena recta o ramificada; pero excluyendo las amidas en la posición
C1, los alcanoatos en la posición C1, y las sales en posición C1
farmacéuticamente aceptables del ácido
(5S,14R,15S)-trihidroxi-6E,8Z,10E,12E-eicosatetraenoico
(LXAB); y los alcanoatos en las posiciones C-5,
C-6, y C-15 del LXAB.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de lipoxina tienen la fórmula
estructural VI:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{a} se selecciona de
entre el
grupo
(a) H; o
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono;
\newpage
en donde R_{b} se selecciona de entre el grupo
consistente en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de lipoxina tienen la siguiente
fórmula estructural VII:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{a} se selecciona de entre el
grupo
(a) H; o
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono;
en donde R_{b} y R_{c} se seleccionan
independientemente del grupo
(a) H;
(b) hidroxilo, o tiol;
(c) metilo o halometilos incluyendo -CF_{3} y
-CH_{2}F;
(d) halógeno;
(e) alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono,
incluyendo el metoxi;
en donde Rd y Re se seleccionan
independientemente del grupo
(a) H;
(b) hidroxilo, o tiol;
(c) metilo o halometilo incluyendo -CF_{3} y
-CH_{2}F;
(d) halógeno;
(e) alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, ambos
inclusive, incluyendo el metoxi; o
(f) alquilo o haloalquilo de 2 a 4 átomos de
carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena lineal o
ramificada; pero excluyendo las amidas en la posición C1, los
alcanoatos en la posición C1, y las sales en posición C1
farmacéuticamente aceptables del ácido
(5S,6R,15S)-trihidroxi-7E,9E,11Z,13E-eicosatetraenoico
(LXA_{4}); y los alcanoatos en las posiciones C-5,
C-6, y C-15 del LXA_{4}.
\newpage
Los análogos de lipoxina tienen la fórmula
estructural VIII:
en donde R_{a} se selecciona de
entre el
grupo
(a) H; o
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono;
en donde R_{b} y R_{c} se seleccionan
independientemente del grupo
(a) H;
(b) hidroxilo o tiol;
(c) halometilo, incluyendo el -CF_{3};
(d) halógeno;
(c) alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada; o
(f) alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, ambos
inclusive;
en donde Rd y Re se seleccionan
independientemente del grupo
(a) H;
(b) hidroxilo, o tiol;
(c) metilo o halometilo incluyendo -CF_{3} y
-CH_{2}F;
(d) halógeno;
(e) alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, ambos
inclusive, incluyendo el metoxi; o
(f) alquilo o haloalquilo de 2 a 4 átomos de
carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena lineal o
ramificada;
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de lipoxina tienen la fórmula
estructural IX:
en donde R_{a} se selecciona de
entre el
grupo
(a) H; o
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono;
en donde R_{b} y R_{c} se seleccionan
independientemente del grupo
(a) H;
(b) hidroxilo o tiol;
(c) halometilo, incluyendo -CF_{3} y
-CH_{2}F;
(d) halógeno;
(e) alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena lineal o ramificada; o
(f) alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, ambos
inclusive;
y en donde R5 es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono, el cual
puede ser de cadena recta o ramificada;
(b) -(CH_{2})_{n} -R_{i}
en donde n = 0 a 4 y Ri es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(ii) fenilo; o
(iii) fenilo sustituido,
en donde cada uno de Z_{i},
Z_{iii}, y Z_{v} se seleccionan independientemente de entre el
grupo consistente en hidrógeno, -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R1, y
-SO_{3}H;
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo, hidrógeno, metoxi, e hidroxilo;
(c) -R_{a}Q_{a}R_{b}
en donde Q_{a} = -O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
(d)
-C(R_{iii})(R_{iv})-R_{i}
en donde R_{iii} y R_{iv} se seleccionan
independientemente de entre el grupo consistente en,
(i) H; o
(ii) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 + 3
en donde cualquier Z se selecciona de entre el
grupo consistente en halógeno; o
(e) haloalquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
ambos inclusive, y de 1 a 6 átomos de halógeno, ambos inclusive, de
cadena recta o ramificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos tienen la fórmula estructural
X:
en donde R_{a} se selecciona de
entre el
grupo
(a) H; o
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena lineal o ramificada; o
en donde R_{b} y R_{c} se seleccionan
independientemente del grupo
(a) H;
(b) hidroxilo o tiol;
(c) halometilo, incluyendo, por ejemplo, el
-CF_{3};
(d) halógeno;
(e) alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena lineal o ramificada; o
(f) alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, ambos
inclusive, incluyendo el metoxi.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos tienen la fórmula estructural
XI:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{a}
es
(i) hidrógeno;
(ii) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena lineal o ramificada; o
(iii) molécula marcadora detectable;
en donde n = 1 a 10, ambos inclusive;
en donde Y_{2}, R_{3a}, y R_{3b} se
seleccionan independientemente de entre,
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(c) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(d) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono, ambos
inclusive, el cual puede ser de cadena recta o ramificada;
(e) R_{a}Q_{2}R_{b}
en donde Q_{2} es -O- o -S-;
en donde R_{a} es un alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada; y
en donde R_{b} es un alquilo de 0 a 8 átomos
de carbono, ambos inclusive, el cual puede ser de cadena recta o
ramificada;
en donde Y_{1} es -OH, metilo, o -SH;
en donde Y_{2} es
(a) H;
(b) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 a 3, Z es halógeno; o
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
en donde Y_{3} e Y_{5} se seleccionan
independientemente de entre el grupo consistente en,
(a) H;
(b) CH_{a}Z_{b} en donde a + b = 3, a = 0 a
3, b = 0 a 3, Z es ciano, nitro, o halógeno; o
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada;
en donde Y_{4} e Y_{6} se seleccionan
independientemente de entre el grupo consistente en,
(a) H;
(b) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena lineal o ramificada;
(c) alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, ambos
inclusive, de cadena recta o ramificada; o
(d) hidroxilo o tiol; y
en donde R_{5} es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono, el cual
puede ser de cadena recta o ramificada;
(b)
-(CH_{2})_{n}-R_{i} en donde n = 0 a 3
y R_{i} es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
ambos inclusive;
(ii) fenilo;
(iii) fenilo sustituido,
en donde cada uno de Z_{ii} y Z_{iv} se
seleccionan independientemente de entre el grupo consistente en
halógeno, metilo,
\newpage
Los compuestos de esta invención tienen la
siguiente fórmula estructural:
en donde R' es H o CH_{3};
y
en donde los sustituyentes en C* están en la
configuración R.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos preferidos de la presente
invención pueden prepararse como se describe específicamente en el
Ejemplo 1 siguiente. Otros compuestos de esta invención pueden
prepararse mediante estrategias combinadas para la síntesis de
análogos de lipoxina (LX) y prostaglandinas usando procedimientos
químicos estándares, tales como la hidrogenación selectiva, el
acoplamiento Pd(0)-Cu(I), el
acoplamiento del tipo Wittig, la epoxidación de Sharpless, y las
reducciones asimétricas, a continuación del acoplamiento de los
intermediarios principales descritos más abajo y en la literatura,
para genera los análogos de LX estables de esta invención. (Webber,
S.E. et al., Adv. Exp. Med. Biol., 229:61 (1988); Radüchel,
B. y Vorbrüggen, H., Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukotriene
Res., 14:263 (1985); y Nicolaou, K.C. et al., Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 30:1100 (1991)). Las variaciones geométricas pueden
conseguirse, por ejemplo, según se describe en la patente
estadounidense nº 4.576.758 y en Nicolaou, K.C., J. Org. Chem.
54:5527 (1989).
Tal y como se muestra más abajo, los compuestos
análogos de la LX que comprenden el subgénero 1 en el Esquema I
pueden prepararse como tres fragmentos principales (A, B, y C), los
cuales pueden combinarse para formar la molécula total.
Esquema
I
La síntesis del epoxi-alcohol
para el precursor del fragmento 2 puede generarse con los
sustituyentes R_{2}, R_{3} y R_{4} seleccionados de entre
hidrógeno, fenilo, halógeno o metilo. Cada uno de estos respectivos
epoxi-alcoholes puede transformarse en derivados
feniluretanos como 3.
con PhNCO, pirimidina y CH_{2}Cl2
seguidos por la catálisis mediante ácido de Lewis, abriendo el SN2
para rendir un carbonato 1,2-cíclico que contiene
el diol vecinal en C-6 en la configuración
(R) requerida para la unión, y C-5 en la
configuración (S) establecida también para la bioactividad y
unión en un sitio de reconocimiento. Estos alcoholes se protegen a
continuación para generar el fragmento A precursor como
4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos fragmentos A pueden ahora acoplarse al
intermedio fragmento B, un bromuro de fosfonio 5 como en Webber,
S.E. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 229:61 (1988), en
cantidades de gramos para generar los productos del fragmento A + B
combinado 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los intermedios fragmento C del Esquema I se
generan en paralelo a la preparación de los acoplamiento
A-B. En estos fragmentos C, las sustituciones en
Y_{1} y/o Y_{2} son metilo, metoxi, hidrógeno, ciano, nitro, o
halógeno; ver el Ejemplo 3 específico. En consecuencia, tener los
derivados 15-metilo y/o, por ejemplo, el
16-metilo o 16-fenoxi, permite que
estos análogos sustituidos de la LX4 no sean propensos a la
deshidrogenación.
Por tanto, los fragmentos C que aportan la
resistencia preferida a la oxidación y/o deshidrogenación
enzimática pueden convertirse mediante la protección de los sitios
claves, seguida por la bromidación para rendir los productos de
vinilbromuro del fragmento C, tales como el 6b que se acopla a 6
usando cantidades catalíticas de P(Ph_{3})_{4} y
CuI para generar la estructura fundamental completa de los análogos
del LXA_{4} de la fórmula I genérica. Este esquema se ilustra
además mediante los Ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esquema
II
Los compuestos de esta invención dentro de las
fórmulas II y III de los subgéneros pueden sintetizarse de manera
similar.
Los compuestos en los géneros II y III se
generan preparando primero individualmente los compuestos
sustituidos del fragmento A, que están acoplados cada uno de ellos,
como en el Esquema I, a fragmento B preparado individualmente para
generar los fragmentos 7 o A_{1} + B_{1} que poseen
sustituciones individuales en X, Q_{1}, R_{2}, R_{3}, y
R_{4}, tal y como se indicó.
El fragmento C1 8 portador del grupo acetilénico
C-14,15 y las sustituciones finales
\omega-C-20, se generaran cada
uno de ellos como se mostró más arriba para los análogos de
prostaglandina de la estructura 6, y se convertirán en sus
respectivos productos bromados como en (KCN JAC 1985, Webber) para
rendir productos bromados de cada fragmento C1 o especie 8
sustituido individual, que son apropiados para el acoplamiento a 20
usando cantidades catalíticas de P(Ph_{3})_{4} y
CuI para generar los productos combinados de la clase análogo de
LXA_{4}-acetilénico. Cada uno de los productos
finales puede someterse a continuación a RP-HPLC
con gradientes, usando la detección mediante matriz de diodos
rápidos (como en Serhan, C.N., Methods in Enzymology), para la
purificación. La presencia de la modificación en
C-15 a C-20 del LXA_{4} puede
alterar el metabolismo por parte de las deshidrogenasas y
oxigenasas proporcionando un impedimento estérico, se han preparado
análogos estables de la prostaglandina que llevan sustituciones en
C-15 y finales en \omega y no son metabolizadas
por las deshidrogenasas (Radüchel, B. y Vorbrüggen, H., Adv.
Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res., 14:263 (1985), y
Vorbrüggen, H. et al., en: Chemistry, Biochemistry, and
Pharmacological Activity of Prostanoids (editores Roberts, S.M.,
Scheinmann, F.). Oxford: Pergamon Press).
Los compuestos ciclo-LXA_{4}
de esta invención en el género de la fórmula IV pueden prepararse de
la manera siguiente.
Esquema
III
El compuesto padre de esta clase se somete
también a una estrategia de síntesis total similar, y se le asignan
tres fragmentos principales A, B y C en la Estructura 30. Puede
prepararse un precursor para el fragmento A mediante rutas usadas en
Nicolaou, K.C., J. Org. Chem., 54:5527 (1989) para preparar 10 en la
síntesis del metiléster del
7-cis,11-trans-LXA_{4}.
El fragmento B en 30 puede obtenerse a través
del precursor 11 o saligenin-([O-hidroxibencil
alcohol) tal y como se generó en (Vorbrüggen et al., p. 353).
El alcohol bencílico 11 se hace reaccionar con 10 (1:1) en presencia
de NaH en DMF para rendir 12. Este intermedio clave se silila en
BSFTA, seguido por el acoplamiento con fragmentos individuales
designados para los precursores C.
13 puede entonces acoplarse al vinilbromuro del
fragmento C de un determinado diseño individual tratando el
precursor bromado con 4,0 equivalentes de AgNO3, a continuación 7,0
equivalentes de KCN, EtOH/THF/H_{2}O (1:1:1), 0 \Rightarrow
25ºC, 2-4 h. Los productos individuales se someten a
continuación a la catálisis de Lindlar para una hidrogenación suave
catalítica selectiva, en CH_{2}Cl2, 2-3 h, para
rendir compuestos individuales que pertenecen al género IV. Cada
uno de ellos puede saponificarse en LiOH/THF para rendir los
correspondientes ácidos libres después de su aislamiento mediante
RP-HPLC.
La invención de los compuestos del género IV se
ilustra adicionalmente más abajo, la síntesis del metiléster de
15(\pm)metil-ciclo-LXA_{4}
y del correspondiente ácido libre.
Los compuestos de esta invención en el género de
la fórmula V pueden prepararse de la manera siguiente. Varios
sistemas estudiados con la LXB_{4} indican que se necesitan varios
sitios dentro del compuesto natural para su bioactividad (Serhan,
C.N., J. Bioenerg. and Biomembr., 23:105 (1991)). Estos sitios
incluyen el alcohol en C-14 en la configuración
(R), y el doble enlace en C-8,9 del tetraeno
en la configuración cis. Además, en base a estudios
metabólicos, que resultaron en la presente invención, se han
identificado varios sitios clave adicionales que son necesarios
para preservar la bioactividad del LXB_{4}. Estos incluyen
proteger el alcohol en C-15 de la actividad
deshidrogenasa (es decir, bloquea la formación del
5-oxo-LXB_{4}); mantener tanto el
enlace \Delta8 como el alcohol 14 (R); e impedir la reducción del
doble enlace \Delta6-7 y las
\beta/\omega-oxidaciones de los compuestos
resultantes.
Esquema
IV
En consecuencia, el género V (14) mantiene las
regiones del LXB_{4} que son necesarias para su bioactividad,
pero modifica las regiones accesibles a la degradación metabólica.
De nuevo, un análisis retrosintético da prioridad a tres fragmentos
clave A, B y C indicados en 14. El acoplamiento de los intermedios
claves para generar miembros de la clase de análogos del LXB_{4}
usa técnicas estándares, tal y como se esbozaron para LXA_{4} y
sus análogos, a saber, la hidrogenación selectiva (para generar la
geometría 8-cis); el acoplamiento
Pd(0)-Cn(I) para unir los fragmentos A
y B portadores de sustituciones únicas; el acoplamiento del tipo
Wittig para unir fragmentos C que portan las sustituciones
requeridas, y la epoxidación de Sharpless para rendir el alcohol
vecina en 14(R) (consultar las referencias Nicolaou, K.C.
et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30:1100 (1991)); Weber,
S.E. et al., Adv. Exp. Med. Biol., 229:61 (1988), editores
Wong, P.K. y Serhan, C.N.), y las citadas en éstas). Por tanto,
usando una estrategia similar para los análogos del LXA_{4} y la
construcción de la LXB_{4} nativa, pueden obtenerse los análogos
específicos.
Los fragmentos A de 15 que portan sustituciones
en R_{2}, R_{6} y R_{7} que pueden ser (H, CH_{3},
OCH_{3}, fenilo, fenilo sustituido con halógenos) se generan
mediante procedimientos estándares a partir de, por ejemplo, 16, con
CH_{2} de longitud de cadena creciente.
El compuesto 16 se convierte en el vinilbromuro
15 como en (Nicolaou K.C. et al., Angew. Chem. Int. Ed.
Engl., 30: 1100-1116 (1991)) a través del
intermedio trimetilsilil acetilénico 17, que se reduce a
pinanil-9BBN y a continuación a
n-BuN_{4}NF en THF para rendir 18, que se somete
entonces a bromuración, después de proteger los grupos esenciales
tales como el alcohol, para rendir 15 (fragmento A).
El fragmento C en 14 se genera a partir del
compuesto 19 con las sustituciones R_{5} como se indicó.
El alcohol acetilénico 19 se reduce entonces en
LAH seguido por la epoxidación asimétrica de Sharpless para generar
20, que se aísla mediante RP-HPLC para rendir el
isómero (+) que se usa para generar el alcohol en
C-14 requerido de los análogos de la LXB_{4} en la
configuración (R); el compuesto 20 se transforma en el
correspondiente aldehído 21 después de proteger los grupos
sustituidos en R_{4} y R_{5}, así como el alcohol, usando PCC
en cloruro de metileno. (Nicolaou, K.C. et al., Angew. Chem.
Int. Ed. Engl., 30:1100 (1991)).
La sal de fosfonio 22 puede prepararse como en
la referencia (Weber, S.E. et al., Adv. Exp. Med. Biol.,
229:61 (1988), editores Wong, P.K. y Serhan, C.N.), y usarse aquí
para generar el acoplamiento B-C a través de un
acoplamiento del tipo Wittig, para rendir 23 que porta las
sustituciones indicadas en el grupo de 23, en donde R_{4} y
R_{5} portan sustituciones. El doble enlace en cis de 23
puede isomerizarse para rendir el isómero trans, usando I_{2}
como un catalizador, para rendir la forma precursora progenitora de
14 como 24.
Entonces, se lleva a cabo el acoplamiento de 24
a 15 mediante acoplamiento con
Pd(O)-Cu(I) para rendir el precursor
acetilénico de 14, denominado 25. A continuación después de la
hidrogenación catalítica de Lindlar selectiva, los análogos
individuales de la LXB_{4} se pueden purificar adicionalmente a
través de RP-HPLC, usando el esqueleto de tetraeno
como un medio apropiado para aislar los productos individuales
empleando la detección rápida con matriz de diodos rápidos (Serhan,
C.N., Meth. Enzymol., 187:167 (1990)).
Los compuestos de esta invención tienen la
actividad biológica de las LX naturales, pero son más resistentes a
la degradación o, alternativamente, inhiben la degradación de las LX
naturales. Por tanto, los compuestos descritos tienen utilidad como
compuestos farmacéuticos para tratar o prevenir en un sujeto un
cierto número de enfermedades o patologías asociadas con una
respuesta celular mediada por LX inadecuada o inapropiada.
Basándose en el efecto
anti-proliferativo de los compuestos
15-epi-lipoxina descubiertos, los
compuestos de la invención pueden usarse en procedimientos para
mejorar la proliferación celular no deseada, poniendo en contacto
las células con una composición farmacéutica que incluye una
cantidad efectiva del compuesto
15-epi-LX sustancialmente
purificado y un portador farmacéuticamente aceptable. La célula
puede ponerse en contacto in vivo y/o in vitro.
Alternativamente, las células pueden extraerse de un sujeto, ponerse
en contacto ex vivo con el compuesto
15-epi-lipoxina sustancialmente
purificado de la presente invención e implantarse en el sujeto. Los
compuestos de la invención pueden usarse también en un procedimiento
para mejorar un trastorno proliferativo de células en un sujeto,
incluyendo la administración de una cantidad efectiva de un
compuesto 15-epi-LX sustancialmente
purificado.
La cantidad efectiva es ordinariamente la
cantidad que se precisa para garantizar una exposición suficiente
para una población de células diana. Tal cantidad ordinariamente
dependerá de la naturaleza del compuesto
15-epi-LX, el modo de
administración, la gravedad de la proliferación celular no deseada o
del trastorno proliferativo de células, y de otros factores que
considere una persona con formación ordinaria cuando determine el
régimen de dosificación.
Las células apuntadas a poner en contacto pueden
estar experimentando un crecimiento canceroso y/o tumoral.
Alternativamente, las células diana pueden estar experimentando
proliferación celular anómala en respuesta a un estímulo, tal como
la reestenosis; y/o las células diana pueden consistir en células
transformadas que tienen un carácter genético alterado respecto el
de las células originales.
Las células diana preferidas incluyen las
células epiteliales, los leucocitos, las células endoteliales, y/o
los fibroblastos.
En base a la acción estimuladora de las LX sobre
células seleccionadas, los compuestos de la invención pueden usarse
en procedimientos para tratar un sujeto con un trastorno supresor
mieloide mediante la administración al sujeto de una cantidad
efectiva de una composición farmacéutica que comprende un análogo de
LX. La cantidad efectiva es ordinariamente la cantidad que se
precisa para garantizar una exposición suficiente de la población
de células diana. Tal cantidad ordinariamente dependerá de la
naturaleza del análogo, del modo de administración, de la gravedad
de la supresión mieloide, y de otros factores considerados por una
persona con formación ordinaria cuando determine el régimen de
dosificación.
El uso terapéutico de un análogo de LX
proliferativo de células incluye también extraer las células de un
sujeto, estimular el crecimiento celular in vitro, y
reintroducir la preparación de células potenciada, totalmente o en
parte, en el sujeto. Opcionalmente, pueden usarse agentes
terapéuticos adicionales (por ejemplo, citocinas tales como el
GM-CSF) conjuntamente con la LX durante la
estimulación, o conjuntamente con la introducción de la preparación
de células.
Los compuestos de esta invención pueden usarse
para tratar o prevenir la inflamación o una respuesta inflamatoria.
La LXA_{4} inhibe la activación de los leucocitos, los cuales son
los mediadores de la inflamación. El efecto inducido por la
LXA_{4} incluye la inhibición de la migración de leucocitos, de la
generación de especies oxigenadas reactivas, y de la formación de
mediadores proinflamatorios implicados en la hinchazón del tejido.
(Raud, J. et al., Adv. Exp. Med. Biol,. 314:185 (1991);
"Cell-Cell Interactions in the Release of
Inflammation Mediators", volumen 314). La LXB_{4} presenta
acciones radioprotectoras, tales como prevenir la diarrea y ataxia,
en un ensayo in vivo con células madre hematopoyéticas de
ratón (Walken, T.L. Jr., J. Radiat. Res., 29:255 (1988)).
La inflamación o las respuestas inflamatorias
mediadas por leucocitos causan o contribuyen a una amplia variedad
de enfermedades y afecciones, incluyendo varias formas de asma y
artritis. Se incluyen las respuestas inflamatorias a lesiones
físicas, tales como el trauma físico, la exposición a radiaciones, y
otras.
Los compuestos de esta invención pueden usarse
para tratar o prevenir la inflamación antagonizando la acción de
los leucotrienos. La LXA_{4} inhibe la inflamación inducida por
LTB_{4}, bloqueando tanto la filtración del plasma como la
migración de leucocitos en un ensayo in vivo en el abazón del
hámster (Hedqvist, P. et al., Acta Physiol. Scand., 137:571
(1989).) La filtración del plasma y la migración de leucocitos son
sucesos clave tanto en la cicatrización de heridas como en la
inflamación. La LXA_{4} también antagoniza las acciones
hemodinámicas renales inducidas por el LTD_{4}, y bloquea la unión
del LTD_{4} a las células mesangiales, las cuales son
responsables, en parte, de regular la hemodinámica en el riñón.
(Badr. K.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:438
(1989)).
Los compuestos de esta invención pueden
administrarse para antagonizar la acción de los sulfidopéptido
leucotrienos, tales como el LTD_{4}, LTC_{4}, y LTB_{4}. Las
respuestas vasoconstrictoras mediadas por leucotrienos están
asociadas con enfermedades tales como: el asma, las reacciones
anafilácticas, las reacciones alérgicas, el choque, la inflamación,
la artritis reumatoides, la gota, la psoriasis, la rinitis alérgica,
el síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (síndrome de
distrés respiratorio adulto), la enfermedad de Crohn, el choque
séptico (por endotoxinas), el choque traumático, el choque
hemorrágico, el choque isquémico intestinal, la enfermedad
glomerular renal, la hipertrofia prostática benigna, la enfermedad
intestinal inflamatoria, la isquemia de miocardio, el infarto de
miocardio, la choque circulatorio, la lesión cerebral, el lupus
eritematoso sistémico, la enfermedad renal crónica, la enfermedad
cardiovascular, y la hipertensión.
Los compuestos de esta invención pueden usarse
para tratar o prevenir una respuesta inflamatoria o afección
vasoconstrictora. Las LX inducen la vasodilatación dependiente de
epitelio (LXA_{4}) (Lefer, A.M. et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85:8340 (1988)) y la dilatación de las arteriolas
cerebrales en cerdos recién nacidos in vivo (LXA_{4} y
LXB_{4}) (Busija, D.W. et al., Am . J. Physiol., 256:468
(1989)). Adicionalmente, la LXA_{4} induce la dilatación
arteriolar rápida in vivo en el abazón del hámster (Dahlen,
S.-E. et al., Acta Physiol. Scand., 130:643 (1987)) y en la
hemodinámica de la rata (Badr, K.F. et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 145: 408 (1987)).
Las respuestas o afecciones vasoconstrictoras
causan, contribuyen, o están asociadas con enfermedades y
afecciones tales como las enfermedades hemodinámicas renales,
incluyendo las enfermedades glomerulares, las enfermedades
cardiovasculares, incluyendo la hipertensión, el infarto de
miocardio, la isquemia de miocardio, y las enfermedades vasculares y
las enfermedades gastrointestinales.
En la presente invención se describe un
procedimiento para examinar análogos de la LX, u otros compuestos,
para identificar aquellos que tienen una vida media en tejido más
prolongada que la correspondiente LX natural. Este procedimiento
puede usarse para determinar si el compuesto inhibe, resiste, o
experimenta más lentamente su metabolismo en comparación con la LX
natural. Este procedimiento se lleva a cabo preparando al menos un
enzima que metaboliza las LX, poniendo en contacto el compuesto con
la preparación de enzima, y determinando si el compuesto inhibe,
resiste o experimenta más lentamente su metabolismo por parte del
enzima. Las células que tienen un sitio de reconocimiento de LX,
tales como los neutrófilos polimorfonucleares, los monocitos de
sangre periférica, y las células HL-60
diferenciadas, se encuentran entre las fuentes apropiadas para la
preparación de enzima. El sitio de reconocimiento de LX puede
existir naturalmente, o puede inducirse artificialmente, o mediante
un estado morboso, o mediante una lesión. Un ejemplo no limitante de
sitios de reconocimiento de LXA_{4} inducido artificialmente, es
la inducción de tales sitios en células HL-60
diferenciadas.
La preparación de los enzimas puede comprender
recolectar las células y realizar una lisis mediante
congelación-descongelación tres veces, seguida por
ultracentrifugación para rendir un sobrenadante a 100.000 g.
También puede usarse un precipitado de células a 100.000 g. Además,
una preparación enzimática puede comprender cualesquier enzimas que
no participen en el metabolismo de la LX natural, pero que realicen
transformaciones sobre la LX similares o equivalentes a las
transformaciones realizadas por el enzima o enzimas que metabolizan
naturalmente las LX. Son ejemplos no limitantes de enzimas
apropiados la 15-hidroxiprostaglandina
deshidrogenasa, las monooxigenasas del citocromo
P-450 procedentes de leucocitos humanos, y los
microsomas de hígado de rata y humano.
La caracterización de los metabolitos de la LX
incluye técnicas estándares tales como la extracción, la
cromatografía, y la HPLC cuantitativa, seguidas por derivatización
con trimetilsililo, O-metoxima, y el análisis
mediante cromatografía de gases/espectroscopia de masas. Los
detalles experimentales se describen más abajo en el Ejemplo I.
Los análogos de LX pueden examinarse también en
busca de actividad de unión con un sitio de reconocimiento del
receptor de LX, por ejemplo, poniendo en contacto el compuesto con
un sitio de reconocimiento del receptor y determinando si se une y
en qué grado lo hace. Los ejemplos de ensayos de unión cinéticos
incluyen los ensayos de unión de desplazamiento homólogo, de unión
competitiva, de equilibrio, y de isoterma.
El sitio de reconocimiento del receptor puede
existir de forma normal o puede ser inducido por un estado morboso,
por una lesión, o mediante medios artificiales. Por ejemplo, pueden
usarse el ácido retinoico, el PMA o el DMSO, para inducir la
diferenciación en células HL-60. Las células
HL-60 diferenciadas expresan sitios de
reconocimiento de receptor específicos para la LXA_{4}. Los
ejemplos de otras células que podrían examinarse en busca de
especificidad por la LX incluyen los PMN, las células epiteliales, y
los monocitos de sangre periférica.
La selección de ligandos competitivos dependerá
de la naturaleza del sitio de reconocimiento, de la estructura del
sustrato natural, de cualesquier análogos estructurales o
funcionales del sustrato natural conocidos en el estado de la
técnica, y de otros factores considerados por un especialista
capacitado al realizar tal determinación. Tales ligandos incluyen
también antagonistas del receptor conocidos. Los compuestos de esta
invención pueden marcarse radiactivamente con isótopos, incluyendo
el ^{2}H, ^{3}H, ^{13}C, y ^{14}C, mediante técnicas
estándares conocidas en el estado de la técnica de la radioquímica o
de la química sintética.
En un ejemplo de este procedimiento, la
especificidad estructural de los sitios de reconocimiento de la
LXA_{4} inducidos se verificó con LXB_{4}, LTC_{4}, LTB_{4}
y metilésteres del ácido trihidroxiheptanoico. Los detalles
experimentales se describen más abajo en el Ejemplo 2.
Además, los compuestos de esta invención pueden
usarse para ejercer ciertas acciones sobre tipos celulares
específicos, como modelos de desarrollo de la inflamación y
lesiones. Por ejemplo, la LXA_{4} estimula la movilización del
Ca^{2+} intracelular, del remodelado de lípidos, y de la
quimiotaxis sin agregación en PMN humanos (Palmblad, J. et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 145:168 (1987); Lee, T.H.
et al., Clin. Sci., 77:195 (1989); Nigam, S. et al.,
J. Cell. Physiol., 143:512 (1990); Luscinskas, F.W. et al.,
Biochem. Pharmacol., 39:355 (1990)). La LXA_{4} también bloquea
las respuestas inducidas por ambos, LTB_{4} y FMLP, tales como la
generación de IP3. La LXB_{4} también estimula la remodelación de
lípidos. La LXA_{4} activa la PKC aislada, y es específica para
la subespecie \gamma de las PKC, la cual se halla en el cerebro y
en la médula espinal. (Hansson, A. et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 134:1215 (1986); Shearman, M.S. et al., FEBS
Lett., 245:167 (1989)).
La presente invención se ilustra además mediante
los ejemplos siguientes, los cuales no son parte de la
invención.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
3-metil-3-trimetilsiloxi-1-bromo-1-octeno
(130 mg, 0,44 mmol) en benceno (1,5 mL) se le añadió
n-propilamina (0,05 mL, 0,61 mmol) y
Pd(PPh_{3})_{4} (20 mg, 0,02 mmol), y se protegió
la solución de la luz. Se desgasó mediante el procedimiento de
congelación-descongelación, y se agitó a temperatura
ambiente durante 45 min. Se añadieron
(7E,9E,5S,6R)-metil-5,6-di(tent-butildimetilsiloxi)-dodeca-7,9-dieno-11-inoato
(183 mg, 0,44 mmol) (compuesto 12) y yoduro de cobre (14 mg, 0,07
mmol), y se desgasó la solución una vez más mediante el
procedimiento de congelación-descongelación. La
mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente, y se apagó
con una solución acuosa saturada de NH4Cl, y se extrajo con éter. A
continuación se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, y se
evaporó el solvente. La cromatografía en columna Flash (sílica, 3%
éter hexanos) proporcionó un compuesto puro como un líquido incoloro
(171 mg, rendimiento del 57%).
A una solución del compuesto (171 mg, 0,25 mmol)
en THF (0,5 mL) se le añadió n-BuN4F (0,9 mL, 0,90
mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. La reacción se
completó en 2 horas, momento en el que se vertió sobre agua y se
extrajo con éter. Los extractos de éter se lavaron con salmuera, se
secaron sobre Na2SO4 y se evaporó el solvente. La cromatografía en
columna Flash (sílica, 4% de MeOH/CH_{2}Cl2) proporcionó el
metiléster (24 mg) junto con algo de la lactona correspondiente.
Tiempos de retención en HPLC: 9:39 min (fase inversa Microsorb, 4,6
mm \times 25 cm, columna C-18, MeOH/H_{2}O
70:30, velocidad de flujo 1 ml/min, detector de UV a 300 nm). UV en
MeOH: \lambda_{max} 283, 294, 311 nm. ^{1}H RMN (500 MHz
CDCl_{3}) \delta 6,53 (dd, J = 15,2 10,9 Hz, 1 H), 6,32 (dd, J
= 15,1, 11,0 Hz, 1 H), 6,17 (d, J = 15,9 Hz, 1 H) 5,83 (dd, J =
17,5, 2,1 Hz, 1 H), 5,80 (dd, J = 15,2, 6,7 Hz, 1 H), 5,72 (dd, J =
17,0, 2,1 Hz, 1 H), 4,14 (m, 1 H), 3,68-3,64 (m,
4H), 2,35-2,31 (m, 2 H), 1,51-1,48
(m, 1 H), 1,43-1,42 (m, 2 H),
1,30-1,23 (m, 15 H), 0,85 (t, 3 H). 13 C NMR (126
MHz, CDCl_{3}) \delta 150,01, 140,18, 132,95, 132,26, 112,43,
107,50, 75,23, 73,76, 42,49, 33,67, 32,17, 31,36, 27,96, 23,56,
22,58, 21,03, 14,03.
Se mezcló una solución del precursor metiléster
del compuesto 1 (3 mg en CH_{2}Cl2 (1 ml)) con el catalizador de
Lindlar (1 mg) y se colocó en una atmósfera de hidrógeno. La mezcla
se agitó a temperatura ambiente en la oscuridad, seguida por HPLC
hasta que se obtuvo el 80% de conversión (1 h). La filtración sobre
celita, la evaporación del solvente, y la separación mediante HPLC
proporcionó una metiléster puro. Tiempos de retención en HPLC:
10:02 min (fase inversa Microsorb, 10 mm \times 25 cm, columna
C-18, MeOH/H_{2}O 70:30, velocidad de flujo 4
ml/min, detector de UV a 300 nm). UV en MeOH: \etamax 287, 301,
315 nm.
Este compuesto se preparó de forma similar a la
preparación del precursor metiléster del compuesto 1 (a partir de
3-ciclohexil-3-trimetilsiloxi-1-bromo-1-octeno).
La desilación de este compuesto también se realizó de forma similar
para proporcionar el metiléster. Tiempos de retención en HPLC: 8:02
min (fase inversa Microsorb, 4,6 mm \times 25 cm, 25 cm, columna
C-18, MeOH/H_{2}O 70:30, velocidad de flujo 1
ml/min, detector de UV a 300 nm). UV en MeOH: \lambda_{max}
282, 293, 311 nm. ^{1}H RMN (360 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,56
(dd, 15,4, 10,9 Hz, 1 H), 6,33 (dd, J = 15,2, 10,9 Hz, 1 H), 6,13
(dd, J = 15,8, 6,5 Hz, 1 H), 5,81 (dd, J = 15,2, 6,4 Hz, 1 H), 5,80
(d, J = 15,6 Hz, 1 H), 5,73 (dd, J = 15,4, 2,1 Hz, 1 H), 4,15 (br, I
H), 3,93-3,90 (m, 1 H), 3,67 (br, 1 H), 3,65 (s, 3
H), 2,34 (t, 2 H), 1,82-1,65 (m, 10 H),
1,46-1,38 (m, 3 H), 1,26-1,01 (m, 5
H).
La hidrogenación selectiva del precursor
metiléster del compuesto 3, seguida por la purificación mediante
HPLC, proporcionó el precursor metiléster del compuesto 4. Tiempos
de retención en HPLC: 9:72 min (fase inversa Microsorb, 10 mm
\times 25 cm, columna C-18, MeOH/H_{2}O 70:30,
velocidad de flujo 4 ml/min, UV detector at 300 nm), UV en MeOH:
\lambda_{max} 288, 301, 315 nm. ^{1}H RMN (250 MHz,
C_{6}D_{6}) \delta 6,66-6,89 (m, 2 H),
5,95-6,24 (m, 4 H), 5,55-5,66 (m, 2
H), 3,82 (m, 1 H), 3,73 (m, 1 H), 3,41 (m, 1 H), 3,31 (s, 3H,
OCH_{3}), 2,08 (t, 2 H, CH_{2}COO), 1,00-1,81
(m, 18 H).
Los metilésteres pueden convertirse en los
alcoholes correspondientes usando técnicas estándares.
Se prepara aproximadamente 1 g de cetona
acetilénica a usando la acilación de Friedel-Crafts
del bis(trimetilsilil)-acetileno con cloruro
de hexanoilo, y se reduce usando
(-)-pinail-9-BBN
para rendir el alcohol (S) en CH_{3}N2, como en Webber, S.E.
et al., Adv. Exp. Med. Biol. 229:61 (1988); Nicolaou, K.C.
et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1100 (1991); y
Vorbrüggen, H. et al., En: Chemistry, Biochemistry, and
Pharmacological Activity of Prostanoids (editores Roberts, S.M.,
Scheinmann, F.). Oxford: Pergamon Press, para generar el metilo en
C-15.
Alternativamente, puede tratarse el grupo ceto
con CH_{3}MgBr (6 \Rightarrow 70ºC), como en Vorbrüggen, H.
et al., en: Chemistry, Biochemistry, and Pharmacological
Activity of Prostanoids (editores Roberts, S.M., Scheinmann, F.).
Oxford: Pergamon Press para rendir el 15(6)metilo de b
(2-5 g) en CH_{2}Cl2 seco (\sim20 ml) a 0ºC,
con las adiciones secuenciales de 2,6-lutidina (5,2
ml) y tert-butildimetilsilil triflato (6,9 ml).
Esta reacción se mezcla durante 1 h, y a continuación se diluye con
100 ml de éter para su extracción acuosa y secado con MgSO4.
El producto c se acopla entonces con d,
que se genera como en Nicolaou,
K.C. et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. 30:1100 (1991);
Nicolaou, K.C. et al., J. Org. Chem. 54:5527 (1989), y
Webber, S.E. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 229:61 (1988). La
estructura d procedente del fragmento A en el Esquema I se suspende
en 4,0 equivalentes de AgNO_{3}, a continuación en 7,0
equivalentes de KCN, conteniendo EtOH:THF:H_{2}O (1:1:1),
0-25ºC durante 2 h para generar el análogo
C-metiléster protegido de la
15-metil-LXA_{4}, que se concentra
y saponifica en THF con LiOH (2 gotas, 0,1 M) a 4ºC
12-24 h para rendir el ácido libre
correspondiente.
Este compuesto se genera usando una estrategia
similar, acoplando el d de más arriba con e, ver más arriba, o f
para generar el análogo
15-fenil-LXA_{4}, o con g para
generar los análogos
17-m-clorofenoxi-LXA_{4}.
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Cada uno de los fragmentos C apropiados en el
Esquema I (es decir, e, f, g, h) se prepara como se revisó en
Radüchel, B. y Vorbrüggen, H., Adv. Prostaglandin Thromboxane
Leukotriene Res. 14:263 (1985) para los correspondientes análogos de
prostaglandina conocidos. En h, R=H; Cl, metoxi o halógeno.
Usando el fragmento generado A_{2}B_{2} del
Esquema II, se prepararon los correspondientes fragmentos C_{2}
para el acoplamiento. Las estructuras j y k are se generaron como en
Nicolaou, K.C. et al., J. Org. Chem. 54:5527 (1989) y se
metilaron como en Radüchel, B. y Vorbrüggen, H., Adv. Prostaglandin
Thromboxane Leukotriene Res. 14:263 (1985), y se acoplaron a 7 para
rendir estos análogos de LX. Los materiales podrían someterse a
RP-HPLC para su purificación, ver más arriba.
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El fragmento A_{2}B_{2} combinado indicado
puede prepararse a partir de los acoplamientos de los fragmentos
A_{1} y B_{1}, ilustrado en la Ruta II, para llevar a cabo la
estructura de 7 ó 4, ver más arriba, para su acoplamiento al
fragmento C_{2}. El precursor del fragmento C_{2} 1 puede
prepararse como en Radüchel, B. y Vorbrüggen, H., Adv.
Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res. 14:263 (1985) para un
análogo de prostaglandina.
El precursor m, tal y como se preparó
previamente (Nicolaou, K.C., J. Org. Chem. 54:5527 (1989)) se añade
a de 1,2 a 0,05 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4}, a
0,16 equivalentes de CuI, a n-PrNH_{2}, en benceno
con 1 portando Me_{2}Al, 2-3 horas a temperatura
ambiente, para rendir n.
Los grupos protectores de alcohol TBDMS=R se
eliminan con 10 equivalentes de HF-pyr, THF,
0-25ºC (4 h), seguidos por la exposición a 3,0
equivalentes de Et_{3}N, MeOH, 25ºC, 15 minutos para abrir las
\delta-lactonas inducidas por ácido que
usualmente se forman entre el carboxilo en C-1 y el
alcohol en C-5 en las LX (Serhan, C.N., Meth.
Enzymol. 187:167 (1990), y Nicolaou, K.C., J. Org. Chem. 54:5527
(1989)). Después de un tratamiento suave con el catalizador de
Lindlar, 5% en peso, el material extraído se somete a saponificación
con LiOH en THF para generar el ácido libre de la molécula diana,
que puede someterse a purificación adicional mediante
RP-HPLC con fase móvil en gradiente como en (Serhan,
C.N. et al., Meth. Enzymol. 187:167 (1990)).
El compuesto o en forma de derivado SiMe_{3},
puede colocarse (\sim1 gm) en un frasco de 100 ml de fondo
redondo, bajo una atmósfera enriquecida con argón, en benceno
desgasado (20 ml). A esto se le añaden 3,0 equivalentes de un
fragmento vinilbromuro, ver más abajo. Esta reacción de acoplamiento
se lleva a cabo en cantidades catalíticas de
Pd(PPh_{3})_{4} y CuI, y puede monitorizarse
inyectando alícuotas de esta suspensión en RP-HPLC
monitorizada mediante intensidad de UV con un diodo de barrido
rápido. La reacción progresa durante 1-3 h a 23ºC,
transcurridas las cuales el material se extrae con acetato de
etilo:H_{2}O 4:1 (v/v), y se concentra mediante rotoevaporación.
El metiléster puede saponificarse en LiOH/THF para proporcionar
rendimientos cuantitativos del ácido carboxílico libre. Pueden
prepararse otros derivados como más arriba, usando el fragmento A
con diferentes grupos de fragmento B que se han sustituido para
proporcionar, por ejemplo, un dimetilo u otros derivados. Esto puede
obtenerse tomando la cetona p fácilmente disponible, y tratándola
con CH_{3}MgBr (60ºC) para generar q, que puede acoplarse también
al fragmento A, como más arriba, usando técnicas convencionales
tales como el acoplamiento con
Pd(O)-Cu(I). También puede obtenerse
una longitud de cadena incrementada respecto del
C-15.
La
5-metil-LXB_{4} impide o retarda
la formación de la 5-oxo-LXB_{4}.
Usando el esquema general esbozado más arriba, puede construirse el
fragmento A para portar el 5-metilo en un precursor
vinilbromuro r, que se acopla, mediante acoplamiento con
Pd(0)-Cu(I), a un fragmento B + C
unido.
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El vinilbromuro r puede obtenerse a partir del s
que contiene sustituyentes dimetilo o hidrógeno en su posición C4.
El precursor protegido t que contiene los fragmentos B + C se genera
como se describió en la referencia (Nicolaou K.C. et al.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1100-1116 (1991).).
El compuesto t se convierte en s o 28 mediante acoplamiento con el
vinilbromuro indicado. Por tanto, la molécula diana puede generarse
añadiendo r a 1,0 equivalentes (\approx 1 gm) de un frasco de
fondo redondo desgasado que contiene Et2NH como solvente, con t
inyectado en Et_{2}NH a 1,2 equivalentes.
Pd(Ph_{3}P)_{4} se añade a 0,02 equivalentes para
proporcionar el metiléster conteniendo
8(9)-acetilénico precursor de s.
El material se extrae y somete a rotoevaporación
suspendido en quinolina (0,5 eq) en CH_{2}Cl2, y se somete a
hidrogenación usando catalizado de Lindlar (10%; 25ºC) y un chorro
de H2 gas para reducir selectivamente el doble enlace acetilénico
en la posición 8. La formación del componente tetraeno del
metiléster de 5-metil-LXB_{4} o
metiléster de 4-dimetil-LXB_{4}
puede monitorizarse mediante RP-HPLC para verificar
la finalización de la reducción (es decir, 1-3 h).
Los metilésteres se saponifican a continuación a sus
correspondientes ácidos libres tratando los productos con LiOH en
THF, se añaden 25 \mul H_{2}O a 0\Rightarrow24º,
8-24 h.
La células HL-60 se compraron a
la American Type Culture Collection (Rockville, MD), y el resto de
reactivos para el cultivo de células a GIBCO (Grand Island, NY).
Versene (EDTA) procedía de Whittaker Bioproducts (Walkersville,
MD). El metiléster sintético de 11,12-acetilénico
LXA_{4} y las LX procedían de Cascade Biochemical (Reading,
U.K.). Las
15(S)15-m-PGE1, PGE1 y
5-HETE procedían de Cayman Chemical Co. (Ann Arbor,
MI). La [11,12-^{3}H]LXA_{4} se preparó
a partir de la 11,12-acetilénico LXA_{4} usando
catalizador de Lindlar como una tritiación por encargo
(NET-259, lote 0 2793-275, New
England Nuclear, Boston, MA). Los productos tritiados se aislaron
usando RP-HPLC (Fiore et al., J. Biol. Chem.
267:16168 (1992); Serhan, C.N., Meth. Enzymol. 187:167 (1990)). La
metoxiamina y el NAD procedían de Sigma Chemical Company (St.
Louis, MO). El dióxido de manganeso y el reactivo de Adams procedían
de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI).
Los PMN humanos se obtuvieron de voluntarios
sanos mediante centrifugación en gradiente de sangre venosa fresca
heparinizada (Böyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21:77 (1986)).
Las células HL-60 se sembraron en medio RPMI
suplementado con penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100
\mu/ml), suero fetal bovino (10%) (Hyclone, Logan, UT), y se
incubaron (37ºC con una atmósfera de 5% de CO2) en frascos de
plástico de 250 ml. Los frascos individuales que contenían 5
\times 10^{-7} HL-60 células/ml se incubaron en
presencia o ausencia de forbol 12-miristato
13-acetato (PMA) (10 o 16 nM, 24-27
h), y se monitorizó la adherencia en busca de la inducción del
fenotipo parecido a macrófago como en Collins, S.J., Blood 70:1233
(1987). Los monocitos de sangre periférica se obtuvieron (Goldyne,
M.E. et al., J. Biol. Chem. 259:8815 (1984)) después de
sembrar células mononucleares recientes en placas de petri de
plástico, que contenían PBS con glucosa (1 mg/ml), durante 1 h a
37ºC. Las células no adherentes se eliminaron, y las células
mononucleares adherentes se resuspendieron cuidadosamente usando
Versene (7 ml/placa) y se lavaron en PBS. Se contaron los PMN
(>98%), los monocitos adherentes (>95%) y las células
HL-60 mediante microscopía óptica, se suspendieron
en PBS para las incubaciones, y <2-3% en cada
caso fueron permeables al azul tripán. En algunos experimentos, se
prepararon sobrenadantes sin células a partir de células
HL-60 tratadas con PMA (16 nM) durante
24-72 h. Después de recolectarlas, las células
diferenciadas se lavaron, a continuación se sometieron a lisis
mediante congelación-descongelación (repetida 3
veces) y ultracentrifugación (100.000 g, 1 h).
Las incubaciones con eicosanoides se detuvieron
con metanol frío que contenían PGB2 o 5-HETE como
estándares internos (el 5-HETE se usó cuando se
cuantificaba el 15-oxo-ETE). Los
productos se extrajeron usando Sep-pak C18 y se
cromatografiaron rutinariamente como en Serhan, C.N., Meth. Enzymol.
187:167 (1990). El sistema de RP-HPLC consistía en
una bomba dual para gradientes LKB equipada con una columna Altex
Ultrasphere-ODS (4,6 mm \times 25 cm), una
velocidad de flujo de 1 ml/min, eluida (0-20 min)
con metanol/H_{2}O/ácido acético (65:35:0.01) y metanol/ácido
acético (99,99/0,1) en un gradiente lineal (20-45
min), que se usó para cuantificar los
\omega-metabolitos de la LTB_{4} (es decir,
20-COOH y
20-OH-LTB_{4}) así como la
LXA_{4}. La recuperación de los estándares internos fue del 82,2
\pm 7,9, media \pm S.D. (n = 13). Los compuestos
I-IV se separaron usando una columna Altex
Ultrasphere-ODS (10 mm \times 25 cm) eluida a una
velocidad de flujo de 3,0 ml/min con metanol/H_{2}O/ácid acético
(60:40:0,01, v/v/v). La formación de
15-oxo-ETE por parte de
sobrenadantes de 100.000 g (cf. Agins, A.P. et al., Agents
Actions 21:397 (1987); Xun, C-Q. et al.,
Biochem. J. 279:553 (1991); y Sok, D-E. et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156:524 (1988)) se
cuantificaron después de la RP-HPLC usando una
columna ODS (4,6 mm \times 25 cm) eluida con
metanol/H_{2}O/ácido acético (70:30:0,01, v/v/v) monitorizada a
280 nm con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Los productos
derivados de monocitos se cromatografiaron también usando una
columna Hypersil (5 IL, 4 mm \times 300 mm) eluida con
metanol/H_{2}O/ácido acético (60:40:0,01, v/v/v) y una velocidad
de flujo de 1 ml/min. Los espectros se registraron en línea usando
un detector de matriz de diodos (Hewlett-Packard
1040M, serie II) equipado con el programa HPLC3D ChemStation (serie
para DOS). Los espectros se adquirieron usando un paso de 4 nm,
B_{w} = 10 nm, rango = 235-360 nm, con un
intervalo de muestreo de 1,28 s.
La GC/MS se realizó con un espectrómetro de
masas Hewlett-Packard 5971A con detector selectivo
de cuadropolo, equipado con una estación de trabajo HPG1030A y un
GC 5890. La columna fue una HPUltra 2 (fase de resina de silicona
5% de fenil metil entrecruzada; 25 m \times 0,2 mm \times 0,33
mm), y las inyecciones se hicieron en modo no fraccionado en
bis(TMS)trifluoroacetamida (BSTFA). El programa
de temperaturas se inició a 150ºC y alcanzó los 250ºC a los 10
minutos, y los 325º a los 20 minutos. Los metilésteres de ácidos
grasos saturados C_{16}-C_{26} estándares
proporcionaron los siguientes tiempos de retención
(minutos:segundos; media de n = 6). C_{16}, 8,03; C_{18}, 9,77;
C_{20}, 12,22; C_{22}, 16,11; C_{24}, 20,72; C_{26}, 23,62,
que se usaron para calcular los valores C respectivos de los
metabolitos derivados de la LX como en Serhan, C.N., Meth. Enzymol.
187:167 (1990). Se preparó diazometano y los productos metilésteres
se trataron con BSTFA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) para
obtener derivados Me_{3}Si. Los derivados
O-metoxima de metiléster se prepararon como en
Kelly, R.W. y Abel, M.H., Biomed. Mass Spectrom. 10:276 (1983). Las
hidrogenaciones catalíticas se realizaron en metanol (1 ml) con el
reactivo de Adams (Aldrich, Milwaukee, WI) mediante la saturación
del óxido de platino IV (1-2 mg) con una corriente
de hidrógeno burbujeando (20 min, temperatura ambiente). Después de
la extracción, los materiales se trataron con diazometano seguido
por BSTFA (durante la noche; temperatura ambiente).
Metabolismo de la LXA_{4}: los neutrófilos
intactos procedentes de sangre periférica de donantes sanos no
metabolizan significativamente la LXA_{4} exógena, mientras que
células procedentes de los mismos donantes rápidamente
transformaban la LXA_{4} a través de la
\omega-oxidación. Por contra, las células
HL-60 tratadas con PMA que mostraba características
similares a monocito/macrófago rápidamente transformaron la
LXA_{4}. Durante los primeros 60 segundos de exposición, > 70%
de la LXA_{4} fue metabolizada. En ausencia de tratamiento con
PMA, ni las células HL-60 intactas (no
diferenciadas), ni sus sobrenadantes libres de células (100.000
\timesg) transformaron la LXA_{4} (n = 3).
Las células HL-60 diferenciadas
incubadas con LXA_{4} convirtieron este eicosanoide en varios
productos. La LXA_{4} marcada fue transformada en cuatro productos
principales que portaban tritio (denominados compuestos
I-IV), los cuales se recolectaron para su ulterior
análisis.
Estructuras de los compuestos
I-IV. Para obtener cantidades de estos
compuestos que permitieran la realización de estudios
estructurales, se establecieron sus tiempos de retención en
RP-HPLC usando el perfil de elución de la marca 3H
para identificar límites, y se cromatografiaron muestras sin marcar
procedentes de varias incubaciones y se recolectaron
individualmente de dentro de estas regiones para su análisis
mediante GC/MS. La monitorización de iones seleccionados de los
productos obtenidos después del tratamiento con diazometano y BSFTA
reveló que cada uno de los compuestos I-IV mostraba
iones prominentes a m/z 203
[-CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3}],
indicando que los carbonos 1 a 5 de LXA_{4} (el carbono
carboxílico es el número 1) no estaban modificados, aunque cada
producto tuvo un tiempo de retención diferente del de la LXA_{4}.
El metiléster, derivado trimetilsililo de la LXA_{4} mostró iones
destacados en su espectro de impacto de electrones a m/z 203 (pico
base) y 173, con su ion molecular a 582 (M^{+}4). En este
derivado de la LXA_{4} se observaron otros iones con valor
diagnóstico a m/z 171 (203-32), 409
(M-173), 379 (M-203), 482
(M-100) y 492 (M-90) (Serhan, C.N.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5335 (1984); y Serhan,
C.N., Meth. Enzymol 187:167 (1990)). Es digno de mención que las LX
en general son conocidas por generar picos de ion molecular
extremadamente débiles (Serhan, C.N. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:5335 (1984)). No obstante, los compuestos
etiquetados I & II también poseen iones destacados a m/z 173
(Me_{3}SiO^{+}=CH-(CH_{2})_{4}-CH_{3}),
indicando que el fragmento de carbonos 15-20 de
estos productos derivados de la LXA_{4} estaba intacto, mientras
que el ion a m/z 173 no era evidente en los compuestos III y IV.
Por tanto, la conclusión de que los compuestos I-IV
son metabolitos de la LXA_{4} se basa en: sus propiedades físicas
(HPLC y GC/MS), el hallazgo de que son portadores de la marca de
tritio, así como la ausencia de estos productos en incubaciones con
células HL-60 no tratadas con PMA.
A continuación, se concentró la atención en los
compuestos III y IV, puesto que parecían representar metabolitos
con modificaciones estructurales en el fragmento del carbono 15 a 20
de la LXA_{4}. Puesto que la \omega-oxidación
(hidroxilación en el carbono 20) era una posibilidad, se buscaron en
los perfiles de datos de GC-MS adquiridos los iones
que pudieran resultar de las respectivas formas
20-OH y 20-COOH de la LXA_{4}
después de la derivatización, a saber, m/z 261 y 217
(Me_{3}SiO^{+}=CH-(CH_{2})_{4}-CH_{2}OSiMe_{3}
y
Me_{3}SiO^{+}=CH-(CH_{2})_{4}-CO2Me).
Ni III ni IV mostraron iones destacadas a m/z 261 o 217, indicando
que estos productos no eran probablemente el resultado de la
\omega-oxidación.
Se obtuvo el espectro de masas (valor C 24,3)
del derivado Me_{3}Si, metiléster del compuesto III. Se
observaron iones destacados en su espectro a m/z 203 (pico base,
CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3}),
171 (203-32; eliminación de CH_{3}OH), 215
[(M-203)-90, eliminación de
trimetilsilanol (Me_{3}SiOH)] y 99
(O=C-(CH_{2})_{4}-CH_{3}). Había iones
de menor intensidad a m/z 508 (M^{+}) y 418 (M-90;
pérdida de Me_{3}SiOH). La presencia de estos iones sugirió que
el material que coeluía con el compuesto III marcado con 3H era el
derivado 15-oxo de la LXA_{4}. Esto está apoyado
por varias líneas de evidencia, a saber, la pérdida virtual del ion
destacado a m/z 173
(Me_{3}SiO^{+}=CH-(CH_{2})_{4}-CH_{3}),
la presencia de m/z 99
(O=C-(CH_{2})_{4}-CH_{3}), la ausencia
de un cromóforo tetraeno y la aparición de un nuevo cromóforo a UV
\lambda_{max} a 335-340 nm. El cromóforo
tetraeno se confirmó tratando la LXA_{4} con MnO2 en cloroformo,
tal y como se usa para la conversión de prostaglandina (Änggard, E.
y Samuelsson, B., J. Biol. Chem. 239:4097 (1964)). También, el
espectro de masas del producto de hidrogenación catalítica dio un
valor de C de 25,1, con iones destacados a m/z 203 (pico base), m/z
99 (66%), m/z 313 (M-203 o
M-CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3};
35%) y m/z 171 (36%), sin ion destacado a m/z 173. Había iones
menos intensos a m/z 516 (M^{+}) y m/z 426
(M-90). Por tanto, el desplazamiento hacia arriba de
8 uma y la fragmentación de este derivado saturado concordaban con
la generación del correspondiente derivado
15-oxo.
Para examinar aún más este producto derivado de
la LXA_{4}, se trató con diazometano una alícuota del material
que eluía por debajo del pico etiquetado III, seguido por la
metoximación (como en Bergholte, J.M. et al., Arch. Biochem.
Biophys. 257:444 (1987)) y el tratamiento con BSTFA. Su espectro,
valor C de 25,4, mostró iones destacados a m/z 203 (pico base), 171
(203-32; pérdida de CH_{3}OH) y 229
[M-128 o
CH_{3}O-N=C-(CH_{2})_{4}CH_{3}-(2
\times 90)]. Había iones de menor intensidad a m/z 537 (M^{+}),
466 (M-71, el corte \alphat del ion
M-CH_{2}(CH_{2})_{3}CH_{3}),
481 (M-56 o
M-CH_{2}=CH-CH_{2}-CH_{3},
un ion de reorganización de McLafferty), 431 [M-106
(posible pérdida de C_{7}H_{5}N^{+})], 401
[M-136 (eliminación de Me_{3}SiOH + CH_{3} +
OCH_{3}), y 460 (M-77, pérdida de NOCH_{3} más
MeOH). De nuevo, estaba virtualmente ausente en su espectro un ion
a m/z 173 que pudiera haberse originado a partir de un fragmento
C-15 que contuviera alcohol
(Me_{3}SiO^{+}-CH-(CH_{2})_{4}-CH_{3}).
Por tanto, los iones presentes concuerdan con el metiléster,
derivado O-metoxima generado a partir del derivado
que contiene 15-oxo de la LXA_{4}. Juntos, los
iones destacados observados con estos diferentes derivados sugieren
que el material que eluye debajo del pico etiquetado III era el
producto 15-oxo de la LXA_{4} (es decir, la
15-oxo-LXA_{4}).
\newpage
El espectro de masas del derivado Me_{3}Si
metiléster (valor C de 26,0) del compuesto IV mostraba iones
destacados a m/z 203 (pico base,
CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3}),
171 (203-32; pérdida de CH_{3}OH), 99
(O=C-(CH_{2})_{4}-CH_{3}) y 307
(M-203 o
M-CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3}).
Había iones de menor intensidad a m/z 510 (M^{+}), 420
(M-90; pérdida de trimetilsilanol), y 208
(M-(99+203)). Su espectro de UV mostraba un triplete de absorbancia
con máximos a 259, 269 y 280 nm, consistente con un cromóforo
trieno conjugado. La presencia de estos iones y el espectro de UV
sugieren que se trataba de un metabolito
dihidro-15-oxo de la LXA_{4}. Esta
estructura básica está respaldada por la presencia de un ion a m/z
99 que concuerda con un grupo ceto en la posición del carbono 15, y
la presencia de m/z 203 como pico base reveló que los grupos
alcohol en los carbonos 5 y 6 permanecían intactos. Además, la
ausencia de un cromóforo trienona (\lambda cal = 310 nm) indica
que tenía lugar la pérdida de un doble enlace en la posición
\Delta13-14 para rendir el cromóforo trieno
observado. Conjuntamente, estos resultados indican que el compuesto
IV era la
13,14-dihidro-15-oxo-LXA_{4}.
El metiléster, derivado Me_{3}SiO del
compuesto II (valor de C = 25,4) originó iones a m/z 203 (pico
base; CH (OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}COOCH_{3}), 173
(Me_{3}SiO^{+}=CH-(CH_{2})_{4}-CH_{3}),
171 (203-32) y 584 (M^{+}). Su ion molecular era
dos unidades de masa superior al derivado de LXA_{4}. Estos
iones, y la triple banda de absorbancia \lambda_{max} MeOH 259
nm, 269 y 282 nm, sugieren que el compuesto II era un derivado
dihidro de la LXA_{4}. El metiléster, derivado Me_{3}SiO del
compuesto I procedente de células HL-60, originó
dos productos en GC. El principal (valor de C = 25,0) originó iones
similares en su espectro de masas a los de la LXA_{4}, pero en
cambio, su ion molecular estaba a m/z 586, con iones presentes
también a m/z 555 (M-31) y 496
(M-90), indicando que dos de los cuatro dobles
enlaces estaban reducidos (no se muestra). Sin embargo, no se
observaron productos idénticos con monocitos de sangre periférica
(ver más abajo), y, por tanto, los materiales derivados de células
HL-60 procedentes del pico I no se caracterizaron
adicionalmente en el presente experimento. Las estructuras de
I-IV indican que la LXA_{4} no es metabolizada a
través de la \omega-oxidación por leucocitos
intactos, sino que, por contra, es deshidrogenada en el alcohol en
el carbono 15, y también transformada de un tetraeno conjugado a
estructuras de trieno. Tomadas conjuntamente, estas observaciones
sugieren que la LXA_{4} puede ser atacada por la deshidrogenasa de
15-prostaglandina dependiente de NAD
(15-PGDH), un enzima que se sabe realiza reacciones
similares con prostanoides como sustrato (Änggard, E. y Samuelsson,
B., J. Biol. Chem. 239:4097 (1964), y revisada en Hansen, H.S.,
(1976) Prostaglandins 12:647 (1976)).
Recientemente se ha mostrado que la actividad
15-PGDH está inducida en las células
HL-60 (Xun, C-Q. et al.,
Biochem. J. 279:553 (1991)), y que aparentemente utiliza el
15-HETE como sustrato, con un 92% de eficiencia en
comparación con la PGE2 (Agins, A.P. et al., Agents Actions
21:397 (1987)). Además, sobrenadantes de 100.000 g preparados a
partir de células HL-60 tratadas con PMA
convirtieron el 15-HETE en
15-oxo-ETE, indicando la presencia
de una actividad deshidrogenasa después de la diferenciación. La
LXA_{4} compitió por la catálisis del 15-HETE
dando una Ki = 8,2 \pm 2,6 mM (SEM, n = 6) calculada a partir de
gráficas de Lineweaver-Burke. A concentraciones
equimolares de LXA_{4} y 15-HETE, la LXA_{4}
bloqueó la formación de 15-oxo-ETE
en un \approx 50%. La conversión relativa para LX comparada con
la PGE1 para sobrenadantes de 100.000 g indicó que eran convertidas
la LXA_{4}, la 11-trans-LXA_{4},
así como la LXB_{4}, pero no la
15-metil-PGE1. Conjuntamente, estos
resultados sugieren que la LXA_{4} >
11-trans-LXA_{4} > LXB_{4}
son sustratos de la 15-PGDH o de un sistema
enzimático equivalente.
Puesto que el PMA induce la diferenciación de
las células HL-60 a una línea parecida a
monocito-macrófago (Collins, S.J., Blood 70:1233
(1987)), se incubaron monocitos de sangre periférica para determinar
si metabolizaban la LX. Las LX muestran acciones potentes con los
monocitos (Stenke, L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
180:255 (1991b)) y estas células no \omega-oxidan
eicosanoides (Goldyne, M.E. et al., J. Biol. Chem. 259:8815
(1984)). Cuando se expusieron a la LXA_{4} suspensiones de ambos,
monocitos intactos (n = 5) y células permeabilizadas (por
congelación-descongelación o tratadas con saponina,
n = 5), está se convirtió en
15-oxo-LXA_{4} y a productos
conjugados que contenían trienos,
13,14-dihidro-LXA_{4} y
13,14-dihidro-15-oxo-LXA_{4}.
Al igual que con las células HL-60 diferenciadas,
los monocitos rápidamente convirtieron la LXA_{4} (> 60%) antes
de 30 s. Las relaciones temporales para la formación de estos
metabolitos en monocitos intactos y permeabilizados fueron
similares, y sugieren que el metabolito
15-oxo-LXA_{4} es un intermedio
transitorio. También, en cada suspensión de monocitos incubadas con
3H-LXA_{4} (d = 33), la
13,14-dihidro-15-oxo-LXA_{4}
y la 13,14-dihidro-LXA_{4} fueron
los productos principales portadores de la radiomarca. Es digno de
mención que se observó que un producto que eluía antes de la
13,14-dihidro-LXA_{4}, a
15,5-17 minutos, también mostraba un cromóforo
trieno, y que posiblemente era el isómero 11-trans
de la 13,14-dihidro-LXA_{4}, el
cual resulta de la isomerización cis-trans hallada
durante el estudio. El doble enlace 11-cis de la
LXA_{4} nativa es lábil e isomeriza fácilmente a todo
trans durante la extracción y aislamiento (Romano, M. y
Serhan, C.N., Biochemistry 31:8269 (1992)).
Las células de leucemia promielocítica humana
(HL-60) se compraron a la American Type Culture
Collection (Rockville, MD). El medio RPMI y los reactivos de
cultivo celular procedían de GIBCO (Grand Island, NY). La LXA_{4}
sintética, el ácido trihidroxiheptanoico (metiléster), la LXB_{4},
LTD_{4}, LTC_{4} y la LTB_{4} procedían de Biomol (Plymouth
Meeting, PA), y SKF 104353 procedía de Smith Kline y French
Laboratories. ONO 4057 procedía de ONO Pharmaceutical Co., Ltd.
(Osaka, Japan). [14,15-^{3}H]LTB_{4}
(32,8 mCi/mmol), el ácido
[1-^{14}C]araquidónico (50,2 mCi/mmol), el
32P\gammaATP (3.000 Ci/mmol), el ácido
[9,10-3H(N)]palmítico (30,0 mCi/mmol), y el
ácido [9,10-3H(N)]mirístico (30,7 Ci/mmole)
se compraron a New England Nuclear (DuPont Co., Boston, MA). La
11,12-acetilénico LXA_{4} procedía de Cascade
Biochemicals (Oxford, UK). Los filtros para tubos de
microcentrífuga (0,45 \mum, acetato de celulosa) se compraron a
PGC Scientific (Gaithersburg, MD), y los aceites de silicona
procedían respectivamente de Harwick Chemical Corp. (Akron, OH) (d =
1,05) y Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) (d = 0,963). El
nitroazul de tetrazolio, el PMA, el DMSO, las proteasas, el ácido
retinoico y la Actinomicina D se compraron a Sigma (St. Louis, MO).
La proteína activadora de islotes (IAP) procedía de LIST Biological
Lab., Inc. (Campbell, CA). El material de plástico, las placas de
TLC Whatman LK6D y el solvente (grado HPLC) procedían de Fisher
(Springfield, NJ).
Preparación de
[11,12-^{3}H]LXA_{4}. La tritiación
del metiléster de 11,12-acetilénico fue llevada a
cabo como servició de tritiación bajo pedido
(NET-259:92-2326) por New England
Nuclear (Boston, MA). De forma resumida, se caracterizó el
11,12-acetilen metiléster mediante absorbancia UV y
HPLC en fase inversa, como en (Nicolaou, K.C. et al., J. Am.
Chem. Soc. 107:7515 (1985)), y se expuso a una atmósfera de tritio
en cloruro de metilo a temperatura ambiente. Esta incubación se
agitó en presencia del catalizador de Lindlar (1,0 mg, procedente
de Fluka Chemicals) durante \sim 1 h. La mezcla resultante se
guardó en metanol y se aisló usando RP-HPLC. Los
productos tritiados se cromatografiaron como metilésteres utilizando
un sistema de HPLC con gradientes equipado con un detector
espectral de matriz de fotodiodos rápidos (Serhan, C.N., Methods in
Enzymology: Arachidonate Related Lipid Mediators, en Murphy R.C.,
Fitzpatrick, F. (editores), vol. 187. Orlando, FL, Academic,
(1990), p. 167). Esta mezcla contenía tanto metilésteres de
[11,12-^{3}H]LXA_{4} como de
[11,12-^{3}H]-11-trans-LXA_{4}
(proporción \sim 1:3), según se determinó mediante coelución con
estándares sintéticos. Después de la RP-HPLC, se
recolectaron las fracciones que contenían
[11,12-^{3}H]LXA_{4}, y se extrajeron
con acetato de etilo. El ácido libre se preparó mediante
saponificación con LiOH (Fiore, S. et al., J. Biol. Chem.
267:16168 (1992)). El material procedente de estas fracciones,
cuando se inyectó en el HPLC con detección
UV-electroquímica, dio más del 90% de radiactividad
asociada con un producto que contenía tetraeno, el cual coeluía con
la LXA_{4} sintética. Los materiales que eluían con el tiempo de
retención de la LXA_{4} auténtica en dos sistemas de HPLC se
tomaron para experimentos de unión. La actividad específica
calculada para la [11,12-^{3}H]LXA_{4}
era de 40,5 Ci/mmol.
Cultivos celulares y diferenciación. Se
sembraron células HL-60 en medio RPMI suplementado
con 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, y un 10%
de suero fetal bovino (Hyclone, Logan, UT), y se incubaron a 37ºC
con una atmósfera de 5% de CO2, en frascos de 250 ml. Los frascos
individuales que contenían \sim 50 \times 10^{6} células/ml
recibieron a continuación dimetilsulfóxido (DMSO) (1,12% v/v, 120
h), o ácido retinoico (RA) (1 mM, 120 h), o forbol miristato
acetato (PMA) (20 nM, 48 h). Antes de realizar ensayos de unión, se
lavaron las células dos veces en solución salina tamponada con
fosfato (PBS), sin Ca^{2+}- ni Mg^{2+}, se contaron y se
suspendieron a 20 \times 10^{6} células/ml en tampón Tris (10
mM), pH 7,4 (Fiore, S. et al., J. Biol. Chem. 267:16168
(1992)). Se realizó la reducción de nitroazul de tetrazolio para
monitorizar la inducción del fenotipo polimorfonuclear como en
(Imaizumi, M. y Breitman, T.R., Blood 67:1273 (1986)), y se
determinó la adherencia celular para la inducción del fenotipo
parecido a macrófagos (Collins, S.J., Blood 70:1273 (1987)). Se
obtuvieron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC),
mantenidas en cultivo, tercer paso, del Dr. M. Gimbrone (Brigham and
Women's Hospital, Departamento de Patología).
Aislamiento de PMN, plaquetas y RBC a partir
de sangre periférica. Se obtuvieron PMN humanos mediante el
procedimiento de Böyum modificado (Böyum, A., Scan. J. Clin. Lab.
Invest. 21:77 (1968)) a partir de sangre heparinizada reciente
después de la venipuntura de voluntarios normales sanos. Se
monitorizó el número de células y la viabilidad, mediante su
capacidad para excluir azul de tripán, de las suspensiones en PBS,
excediendo ambas el 98%. Los glóbulos rojos se obtuvieron a partir
de 10 ml de sangre heparinizada después de tres centrifugaciones en
PBS (2.500 rpm, 10 minutos a 21ºC). La sangre extraída en ácido
citrato-dextrosa (9:1, v/v) se usó para aislar
plaquetas tal y como se había descrito previamente (Serhan, C.N. y
Sheppard, K.-A., J. Clin. Invest. 85:772 (1990)).
Unión del ligando. La unión de
3H-LXA_{4} y 3H-LTB_{4} se
realizó esencialmente como en Fiore, S. et al., J. Biol.
Chem. 267:16168 (1992). Después de suspender las células en tampón
Tris 10 mM (pH 7,4, Ca^{2+} 2,5 mM, Mg^{2+} 1,2 mM), se
incubaron alícuotas (0,5 ml) (20 minutos a 4ºC) con
3H-ligandos solos (0,3 nM), o en presencia de
concentraciones crecientes de homoligandos u otros compuestos
(3-300 nM). Las incubaciones se centrifugaron
rápidamente (60 segundos, 12,000 g) sobre aceite de silicona (d =
1.028), y la radiactividad asociada a las células se determinó
mediante recuento del centelleo líquido (Wallac 1409, Pharmacia,
Piscataway, NJ). Los experimentos de unión con células HUVES se
realizaron en placas de 12 pocillos con 3,5 \times 10^{5}
células/pocillo. Transcurridos 10 minutos, se lavaron los pocillos
dos veces con PBS, y se recuperó la marca asociada a las células
añadiendo ácido acético glacial (0,5 ml). Los resultados obtenidos
de estos ensayos de sometieron a análisis adicional usando el
programa Ligand (Elsevier-Biosoft, Cambridge,
UK).
Actividad PLD. Los PMN humanos y las
células HL-60 (50 \times 10^{6} células/ml),
preparadas como más arriba, se incubaron con ácido
3H-palmítico (8 \muCi/50 \times 10^{6}
células) durante 40-60 minutos, a 37ºC en PBS. La
captación por parte de las células osciló entre el
60-80% de la marca añadida, respectivamente, el 7,1
\pm 4,2% (n = 10; media \pm S.D.) y el 32,6 \pm 10,3% (n = 6;
media \pm S.D.) en las clases de fosfolípido total de los PMN y
de las células HL-60. Las incubaciones se llevaron a
cabo a 37ºC (10 \times 10^{6} células/ml PBS). Los agonistas se
añadieron en 50 mL de PBS o con 1:10 (v/v) EtOH:PBS para la
formación de fosfatidiletanol (PEt) como en Billah, M.M. et
al., J. Biol. Chem. 264:17069 (1989). En los instantes
indicados, se detuvieron las incubaciones mediante la adición de
3,5 ml de CHCl3/MeOH (2/5, v/v), enfriado en hielo, que contenía
ácido 1-^{14}C-araquidónico (5.000
cpm) usado aquí como estándar interno para cuantificar las
recuperaciones de la extracción. Las muestras se extrajeron usando
una extracción de Bligh y Dyer modificada como en (Serhan, C.N. y
Sheppard, K.-A., J. Clin. Invest. 85:772 (1990)). Las fases
orgánicas, concentradas en 50 ml de CHCl3/MeOH (8/2, v/v), se
puntearon sobre placas de TLC K6D lineales, reveladas con la fase
orgánica acetato de etilo/isooctano/ácido acético/agua
(110/50/20/100, v/v/v/v) durante 50 minutos (Billah, M.M. et
al., J. Biol. Chem. 264:17069 (1989)). En este sistema, el ácido
fosfatídico (PA) tiene un Rf = 0,1 \pm 0,04 y la PEt tiene un Rf
= 0,56 \pm 0,04; n = 38, \pm S.D., que se separan claramente de
otros fosfolípidos (que permanecían en el origen) o de los lípidos
neutros (Rf = 0,75 \pm 0,90). Los lípidos se visualizaron con
vapor de yodo, y se identificaron mediante coelución con estándares
auténticos que también se puntearon y cromatografiaron en cada
placa de TLC. Las regiones correspondientes a PA, PEt, y a los
estándares internos se rascaron y cuantificaron mediante recuento
del centelleo líquido. Además del marcaje con
3H-miristato o 3H-palmitato, se
usaron células marcadas con ambos
[1-^{14}C]araquidonato (0,25 \muCi/30
\times 10^{6} PMN) y 32P\gammaATP (20 \muCi/50 \times
10^{6} PMN) para monitorizar la formación estimulada por LXA de
PA y la generación de PEt. En estos experimentos, se resolvió el PA
usando acetato de etilo/isooctano/ácido acético (45/15/10, v/v/v)
como sistema solvente (Bocckino, S.B. et al., Anal. Biochem.
180:24 (1989)) y dio un Rf = 0,46 \pm 0,03 (n = 15). Todos los
valores mencionados para la formación de PEt en las TABLAS 4 y 5 se
calcularon sustrayendo el dpm obtenido en presencia de
agonista(s) solo(s) menos los medidos en presencia de
agonista(s) y 0,5% de EtOH.
Impacto de la IAP y de la estaurosporina
sobre la actividad PLD inducida por la LXA_{4}. Los ensayos
de actividad PLD, realizados como se ha descrito (ver más arriba),
estuvieron precedidos por la exposición de las células a IAP o
estaurosporina. El tratamiento con IAP de los PMN se realizó tal y
como se había descrito previamente (Nigam, S. et al., J.
Cell Physiol. 143:512 (1990)), y las células HL-60
se incubaron en presencia o ausencia de IAP (300 ng/ml) durante 2 h
a 37ºC (Kanaho, Y. et al., J. Biol. Chem. 267:23554 (1992)).
Se añadieron alícuotas (10^{7} células/0,5 ml) a 0,4 ml de
tampón. A continuación, las células incubadas se expusieron a 100
ml de vehículo (PBS, EtOH 0,04%) o LXA_{4} (10^{-7} M y
10^{-9} M), en presencia o ausencia de 0,5% EtOH. La
estaurosporina (100 nM) se añadió a las suspensiones de células
durante 5 minutos a 37ºC antes de la adición de LXA_{4}.
Después de la preparación de
[11,12-^{3}H]LXA_{4} sintética, se
caracterizó su unión específica a células promielicíticas
(HL-60) y se realizaron comparaciones directas con
la unión específica de la
[14,15-^{3}H]LTB_{4}. Cuando se
monitorizaron marcadores fenotípicos rutinarios, las células
HL-60 no tratadas exhibieron un bajo nivel de unión
específica a ambos ligandos, la 3H-LXA_{4} y la
3H-LTB_{4}. La diferenciación inducida por la
exposición a DMSO (1,12%) o ácido retinoico (1 mM) durante 5 días
estuvo acompañada por un incremento de tres a cinco veces en la
unión específica a ambos radioligandos. Las células tratadas con PMA
(20 nM, 48 h) que mostraban características del fenotipo parecido
al macrofágico, es decir, células negativas para NBT que se
adhieren al plástico (ver Imaizumi, M. y Breitman, T.R., Blood
67:1273 (1986); Collins, S.J., Blood 70:1233 (1987)), también
condujeron a la aparición de unión específica con ambas,
3H-LXA_{4} y 3H-LTB_{4}. La
unión de equilibrio con la 3H-LXA_{4} a 4ºC se
alcanzó a los 10 minutos, y permaneció virtualmente inalterada
durante los siguientes 20 minutos.
Para verificar si la inducción de la unión
específica a ambos 3H-ligandos requería la síntesis
de novo, se añadió actinomicina D (2 mg/ml) a las incubaciones con
PMA. La actinomicina D bloqueó el incremento inducido por PMA en la
unión específica a ambos eicosanoides marcados, sugiriendo que la
inhibición de la biosíntesis proteica de novo también bloqueaba la
aparición de sitios de unión específica. El impacto de los
tratamientos con proteasa y glicosidasa se verificó tanto con
células HL-60 diferenciadas como con PMN humanos
para la unión específica a la 3H-LXA_{4}. El
tratamiento con proteasas redujo la unión específica y proporcionó
evidencia adicional en apoyo de un componente proteico de los sitios
de unión específica de la LXA_{4}.
Los resultados de los ensayos de unión de
isoterma (4ºC, 10 min) con células HL-60
diferenciadas y [11,12-^{3}H]LXA_{4}
(0,1-30 nM) mostraron que los sitios de unión
específica de la [11,12-^{3}H]LXA_{4}
tenían una Kd = 0,6 \pm 0,3 nM. Se observó una porción no lineal
en la gráfica de Scatchard para concentraciones observadas con
unión específica de PMN humanos a LXA_{4} (Fiore, S. et
al., J. Biol. Chem. 267:16168 (1992)). Los resultados aquí
obtenidos con la unión específica de la LTB_{4} con células
HL-60, Kd = 0,12 nM, coinciden esencialmente con
los valores publicados recientemente por Harada (Xie, M. et
al., J. Clin. Invest. 88:45 (1991)), a saber Kd = 0,23 nM.
Para caracterizar adicionalmente las
interacciones de la 3H-LXA_{4} con sus sitios de
unión específicos, se realizaron experimentos de unión de
competición con células HL-60 diferenciadas. La
LXA_{4}, LXB_{4}, LTB_{4}, LTC_{4} y el antagonista del
recepto de leucotrienos SKF 104353 (antagonista del LTD_{4};
Harada, Y., Hiroshima J. Med. Sci. 39:89 (1990)), y el
ONO-4057 (antagonista del LTB_{4}; Gleason, J.G.
et al., J. Med. Chem. 30:959 (1987)) se verificaron como
ligandos potencialmente competidores. Ni la LXB_{4}, ni la
LTB_{4}, ni el ácido trihidroxihepatnoico (metiléster) (300 nM)
fueron capaces de desplazar la unión específica de la
3H-LXA_{4} con las células HL-60
diferencias, mientras que el LTC_{4} causó una disminución de
\sim30% de la unión específica cuando se añadió en un exceso molar
3 log. El hallazgo de que la LXA_{4} (300 nM) era incapaz de
competir con la unión del 3H-LTB_{4} (0,3 nM) a
células HL-60 diferenciadas sugiere que la
LXA_{4} y el LTB_{4} interaccionan con clases distintas de
sitios de unión específica. Los antagonistas del receptor de
leucotrienos SKF 104353 y ONO-4057 no desplazaron la
unión de la 3H-LXA_{4} con las células
HL-60 diferenciadas, pero el SKF 104353 y el
LTD_{4} fueron efectivos para competir la unión específica de la
3H-LXA_{4} con HUVEC. Las HUVEC mostraron una Kd
de 11,0 \pm 2,6 nM y una Bmax de 2,5 \times 10^{-10} M para
la 3H-LXA_{4}, y se calcularon valores
virtualmente idénticos para la competición con LTD_{4}. En el
caso del 3H-LTB_{4}, las HUVEC no unieron
específicamente el LTB_{4}, pero la asociación celular no
específica fue evidente con este ligando 3H (n = 3; no se muestran).
La asociación específica de la 3H-LXA_{4} no fue
evidente entre otros diversos tipos celulares estudiados. Aquí, ni
las plaquetas lavadas, ni los RBC, ni las líneas celulares
cultivadas de células \beta (Raji), o de células T (Jurkat)
mostraron unión específica por la 3H-LXA_{4}.
Considerados en su conjunto, estos resultados indican que la
LXA_{4} interacciona con sitios de unión únicos sobre las células
HL-60 diferenciadas, y que no es sensible a ninguno
de los antagonista del receptor de leucotrienos (SKF 104353 o
ONO-4057). En las HUVEC, la unión específica de la
3H-LXA_{4} fue sensible tanto al LTD_{4} como
al SKF 104353, pero no al ONO-4057, sugiriendo que
la unión específica de la 3H-LXA_{4} en este tipo
de células puede reflejar su interacción con receptores del
LTD_{4} putativos.
La LXA_{4} rápidamente estimula la formación
de ácido fosfatídico en neutrófilos humanos (Nigam, S. et
al., J. Cell Physiol. 143:512 (1990)). Para determinar si la
unión de 3H-LXA_{4} confiere la activación de la
PLD, se monitorizaron la PEt y el PA en ambos, PMN y células
HL-60. Los resultados indican que la LXA_{4}
estimula la actividad PLD en estos tipos celulares con respuestas
temporales similares. Los PMN expuestos a la LXA_{4} (10^{-10}
M) rápidamente generaron la PEt, producto atrapador de etanol, antes
de 60 segundos, que declinó hasta niveles de basales hacia los 5
minutos. En ausencia de EtOH añadido, no se formó PEt a niveles
estadísticamente significativos. Se obtuvo una dependencia bifásica
de la concentración para la formación de PEt tanto en PMN como en
células HL-60 diferenciadas. Se notó una respuesta
aparentemente máxima con el rango de concentración de
\sim10^{-9}-10^{-10} M de LXA_{4}, y se
observó un segundo pico de actividad a 10^{-7} M LXA_{4}. Por
debajo de 10^{-8} M, tanto el péptido quimiotáctico FMLP como la
LXA_{4} dieron resultados de magnitud similar, aunque el FMLP
parecía ser ligeramente más potente con los PMN de algunos
donantes. Para evaluar la contribución potencial de otras vías
biosintéticas, se examinó también la formación de PA inducida por
la LXA_{4} en ambos, PMN marcados con 32P\gammaATP y con
[1-^{14}C]-araquidonato. El PA
marcado con 32P fue evidente en niveles estadísticamente
significativos sólo después de 30 minutos de exposición a la
LXA_{4} (10^{-7} M). Se obtuvieron resultados similares con la
formación de PA marcado con ^{14}C derivado de precursores
marcados con ^{14}C-araquidonato. Estos hallazgos
indican que la LXA_{4} puede estimular también otras rutas de
formación de PA en los PMN, pero sólo después de 30 minutos de
exposición.
Sólo las células HL-60
diferenciadas (que expresan sitios de unión específicos para la
^{3}H-LXA_{4}) incubadas con la LXA_{4}
generan rápidamente PEt, la cual fue evidente antes de 30 segundos.
Las células HL-60 no diferenciadas incubadas con
LXA_{4} (10^{-9} M) no generaron rápidamente PEt. La dependencia
de la concentración con estas células también dio una respuesta
bifásica con la LXA_{4}, y dio un máximo aparente a 10^{-9} M.
Para investigar los posibles sucesos de transducción de señal
implicados en la activación de la PLD mediada por la LXA_{4}, los
PMN y las células HL-60 se expusieron a continuación
a IAP o a estaurosporina. Los resultados indican que la actividad
PLD mediada por la LXA_{4} evocada en el rango de concentración
inferior (10^{-9}-10^{-10} M) era sensible al
tratamiento con IPA en ambos tipos de células y, de forma similar,
la actividad PLD estimulada a concentraciones más elevadas de
LXA_{4} (10^{-7} M) era inhibida por la estaurosporina. Por
tanto, en ambos sistemas celulares, a concentraciones inferiores a
10^{-8} M, la LXA_{4} interacciona rápidamente con sitios de
unión específicos que disparan la actividad PLD y, por
consiguiente, confieren una respuesta funcional, mientras que dentro
de las concentraciones submicromolares de LXA_{4}, puede
estimular procesos adicionales que también conducen a la activación
de la PLD.
Se prepararon varios de los análogos preferidos
de la LX (mostrados estructuralmente como compuestos 1 a 8 más
arriba) mediante síntesis total tal y como se ha descrito en el
Ejemplo 1. A continuación de la preparación y aislamiento de estos
compuestos a través de la HPLC, primero se ensayaron los compuestos,
para determinar si retenían la actividad biológica, usando el
ensayo de adhesión de neutrófilos y los ensayos de transmigración
de células epiteliales (según se describen en Nash, S et al.,
J. Clin. Invest. 80:1104-1113; Nash, S et
al., (1991) J. Clin. Invest. 87: 1474-1477
(1987); Parkos, C.A. et al., J. Clin. Invest.
88:1605-1612 (1991); Parkos, C.A. et al., J.
Cell. Biol. 117:757-764 (1992); Madara J.L. et
al., J. Tiss. Cult. Meth. 14:209-216
(1992)).
Se halló que los compuestos 1 a 8 (10^{-7} -
10^{-10} M) inhibían la adhesión de neutrófilos a las células
endoteliales, y su transmigración sobre células epiteliales. Se
halló que los precursores acetilénicos (compuestos 1, 3, 5 y 7)
eran físicamente más estables que sus contrapartidas tetraenos. El
compuesto 7, que no tiene un grupo alcohol en la posición 15 u
otras modificaciones en la serie, no mostró actividad biológica en
los ensayos. Por tanto, parece que es necesario un sustituyente en
la posición C15 de la LX para la actividad biológica de al menos
los análogos de la LXA_{4}. La
15-metil-LXA_{4} (compuesto 2)
también se mostró capaz de inhibir la adhesión polimorfonuclear
(PMN) activada por el leucotrieno B4 (LTB_{4}) a las células
endoteliales humanas con una IC50 de \sim 1 nM. Se halló que los
análogos 1 a 8 de la LX bloqueaban la migración a potencias
superiores o iguales a las de la LXA_{4} sintética. Se halló que
el compuesto 7 era esencialmente inactivo dentro del rango de
concentración para la inhibición inducida por la LXA_{4} u otros
análogos. Los resultados en estos bioensayos que contienen
neutrófilos indican que los análogos de la LXA_{4} con
modificaciones en las posiciones C15-C20 retienen su
acción biológica y pueden inhibir los sucesos de adhesión y
transmigración de PMN.
La "vida media bio" de los compuestos
1-8 se ensayó usando células de la leucemia
promielocítica humana (HL-60) tratadas con éster de
forbol, según se describió en el Ejemplo 2. Estas células
convirtieron más del 95% de la LXA_{4} durante los cinco minutos
siguientes a su adición a la incubación de células. La LXA_{4} en
este sistema fue rápidamente convertida en
15-oxo-LXA_{4}. Sin embargo, en el
mismo ensayo, la 15-metil-LXA_{4}
(compuesto 2) y la ciclohexil-LXA_{4} (compuesto
4) se recuperaron cuantitativamente en el medio de incubación a
intervalos de hasta dos horas. Estos resultados indican que la
modificación en las posiciones del carbono 20 a carbono 15 impide
el metabolismo adicional de la LXA_{4} por parte de los
leucocitos.
\newpage
Además, la estabilidad del metiléster
acetilénico de la LXA_{4} (compuesto 1) se recuperó esencialmente
intacta después de 60 minutos de incubación ex vivo en sangre
completa (37ºC), según se verificó después de su extracción y HPLC
en fase inversa. Cuando se consideran conjuntamente, estos
resultados indican que los análogos de la LX retienen su acción
biológica y son resistentes a su ulterior metabolismo in
vitro.
(5S,6R,15R)-trihidroxi-7,9,13-trans-11-cis-eicosatetraenoato
sintético: Se preparó el carboximetil éster
(15-epi-LXA_{4}-metiléster)
mediante síntesis orgánica total, y fue un obsequi del Prof. N. A.
Petasis (Departamento de Química, University of Southern
California). El ácido libre
15-epi-LXA_{4} se obtuvo mediante
saponificación del
15-epi-LXA_{4}-metiléster
en tetrahidrofurano con LiOH (0,1 M) a 4ºC durante 24 h. Las
muestras de referencia de eicosanoides sintéticos procedían de
Cascade Biochem Limited (Reading, Berkshire, Inglaterra). Los
inhibidores de las actividades 5-LO (isómero Rev
5901) y del citocromo P450 (ácido 17-octadecainoico,
17-ODYA) procedían de Biomol (Plymouth Meeting,
PA). El ([32P]) dCTP y ([^{3}H]) ácido araquidónico y
metil-timidina radiomarcados procedían de Dupont
NEN (Boston, MA). El ionóforo (A_{23187}), ASA, el
3,(4,5-dimetiltiazoil-2-il)-2,5-(difenil-tetrazolio
bromuro) (MTT), y el isotiocianato de guanidinio se compraron a
Sigma Chemical Co (St. Louis, MO). La interleucina-1
\beta (IL-1_{\beta}) recombinante humana se
obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, MN). La solución salina
tamponada con fosfato de Dulbecco que contenían tanto CaCl2 (0,6 mM)
como MgCl2 (1,0 mM) (pH 7,4) (DPBS^{2+}), el suero fetal bovino
(FBS), la penicilina y la estreptomicina, procedían de Bio Whittaker
(Walkersville, MD). La solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y
la mezcla de nutrientes F-12K procedían de Gibco
Laboratories (Grand Island, NY). Los solventes aptos para
cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y el cloruro de cesio
se compraron a JT Baker (Phillipsburg, NJ), el metilformato procedía
de Eastman Kodak Co (Rochester, NY), y los cartuchos
Sep-Pak C18 eran de Waters Associates (Milford, MA).
El diazometano se preparó a partir de
N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina
comprada a Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). La
N,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida
(BSTFA) procedía de Pierce (Rockford, IL). El equipo de síntesis de
ADNc de la primera hebra, y otros reactivos de biología molecular
procedían de Promega (Madison, WI). Los cebadores de
oligonucleótidos se compraron a Integrated DNA Technologies
(Coralville, IA).
Las células A549 epiteliales del tipo II humanas
de carcinoma pulmonar humano, y los fibroblastos de piel humana (de
mama) normales se obtuvieron de la American Type Culture Collection
(Rockville, MD). La línea celular A549 procede de un carcinoma de
células alveolares humanas, y fue una línea celular útil porque
podía ensayarse fácilmente y podía mantenerse en cultivo sin
macrófagos de tejido contaminantes. (Lieber, M., et al.,
"A continuous tumor-cell line from a human lung
carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells".
Int. J. Cancer 17(1):62-70 (1976). Los
fibroblastos se utilizaron dentro de su limitada ventana de
viabilidad, y se anotó su número de pasos (los resultados se
muestran para células de los pasos 3-5). Las
células A549 epiteliales se sembraron en frascos de cultivo
T-75 cm^{2}, y se mantuvieron en medio
F-12K suplementado con un 10% de FBS inactivado con
calor, penicilina (50 U/mL) y estreptomicina (50 (g/mL). Los PMN
humanos procedentes de donantes sanos, que no habían tomado ASA u
otra medicación durante al menos dos semanas, se obtuvieron
mediante centrifugación en gradiente de
Ficoll-Hypaque y sedimentación en dextrano, (Böyum
A., "Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human
blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of
granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1
g". Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21(suplemento
7):77-89 (1968).), y se suspendieron en DPBS+ a pH
7,4. La viabilidad de las células A549 y de los PMN se determinó
por su capacidad para excluir el azul de tripán, y fue
respectivamente de 95 \pm 2 y 97 \pm 1%. Estos valores no se
alteraron significativamente durante las incubaciones descritas.
En las incubaciones que implicaban células A549
permeabilizadas (preparadas mediante un ciclo rápido de
congelación-descongelación), las células A549 (1,5
\times 10^{6} células/ml) tratadas con
IL-1_{\beta} (1 ng/ml, 24 h) se
pre-trataron durante 20 minutos con vehículo (0,1%
EtOH), ASA (500 (M; usada desde el principio hasta el final), 5 (M
17-ODYA, un inhibidor del citocromo P450, (Muerhoff
A.S., et al., "Prostaglandin and fatty acid \omega and
(\omega-1)-oxidation in rabbit
lung: acetylenic fatty acid mechanism-based
inactivators as specific inhibitors". J. Biol. Chem.
244:749-756 (1989).), o 5 mM isómero Rev 5901, un
inhibidor de la 5-LO, se sometieron a dos ciclos de
congelación rápida en un baño de hielo seco-acetona,
y se descongelaron hasta temperatura ambiente (ciclo completo
<20 minutos), y se incubaron con ácido araquidónico (20 (M)
durante 20 minutos, a 37ºC, en 4 ml de DPBS^{2+}. En los
experimentos que implicaban ácido araquidónico radiomarcado, las
incubaciones se iniciaron con la adición de ácido
[^{3}H]-araquidónico (0,25 (Ci/ml), más ácido
araquidónico sin marcar (20 (M) durante 20 minutos, a 37ºC.
Para los experimentos de evolución temporal que
implicaban la generación de 15-HETE a partir de
fuentes endógenas (ver Figura 2B), se expusieron células A549
intactas a IL-1_{\beta} (1 ng/ml) durante hasta
48 h, y a continuación se trataron con vehículo (conteniendo 0,1%
EtOH) o ASA durante 20 minutos, seguidos por la adición del
ionóforo A_{23187} (5 \muM) en 4 ml de HBSS, durante 30 minutos,
a 37ºC.
En los experimentos de coincubación, las células
A549 confluentes se expusieron a IL-1_{\beta} (1
ng/ml, 24 h), se lavaron en HBSS, y se trataron con vehículo solo o
ASA durante 20 minutos, y con ácido araquidónico (20 M) durante 60
segundos, a 37ºC. Las coincubaciones se realizaron mediante la
adición de PMN a monocapas de células A549, seguida por la
coestimulación con el ionóforo A_{23187} (5 \muM) en 4 ml de
HBSS durante 30 minutos a 37ºC.
Las incubaciones se detuvieron con 2 volúmenes
de MeOH frío que contenían prostaglandina B2 (200 ng), y los
productos se extrajeron usando cartuchos Sep-Pak
C-18. Los materiales que eluían en las fracciones de
metilformato se concentraron bajo corriente de N2, y se escanearon
en busca de material absorbente de ultravioleta (en metanol) con un
espectrofotómetro modelo 84452 (Hewlett Packard Co, Palo Alto, CA),
antes de su inyección en un sistema de HPLC con fase inversa (RP).
Este sistema consistía en una generador de gradientes con bomba
dual (LKB, Bromma, Sweden), un detector de matriz de diodos
(Hewlett-Packard 1040M, serie II), y el programa
HPLC3D ChemStation. Los datos de UV recogidos se recuperaron a 300
nm para monitorizar los tetraenos conjugados, a 270 nm para los
trienos, y a 234 nm para los monoHETE. Todos los espectros de UV se
adquirieron usando un paso de 4 nm, B_{w} = 10 nm, y un rango =
220-360 nm, con un intervalo de muestreo de 0,96
s.
Los eicosaonides monohidroxi (es decir, 5-, 12-
y 15-HETE) procedentes de células A549 se analizaron
usando una columna Ultrasphere-ODS (5 mm, 4,6 mm
\times 25 cm) (Beckman Instruments, Fullerton, CA), la cual se
eluyó con MeOH/H_{2}O/ácido acético (65:35:0,01 ; v/v/v) como fase
uno (t 0-20 minutos), y un gradiente lineal con
MeOH/ácido acético (99,9:0,1, v/v) como fase dos
(20-45 minutos), a una velocidad de flujo de 1,0
ml/min. Los enantiómeros R y S del
15-HETE se resolvieron e identificaron usando un
sistema de HPLC quiral similar al descrito por Hawkins et
al., (1988). (Hawkins et al., "Resolution of
enantiomers of hydroxyeicosatetraenoate derivatives by chiral phase
high-pressure liquid chromatography". Anal.
Biochem. 173:456-462 (1988).) De forma resumida,
después de la RP-HPLC, el material que había eluido
bajo el pico de 15-HETE se extrajo con cloroformo y
se convirtió en metiléster mediante tratamiento con diazometano en
éter, el análisis quiral de realizó con una columan quiral
Bakerbond DNBPG (covalente) (5 mm, 4,6 mm \times 25 cm) (JT
Baker, Phillipsburg, NJ), eluida con
n-hexano/2-propanol (100:0,4; v/v) a
una velocidad de flujo de 0,8 ml/min. Cuando se indica, la
generación de 15-HETE a partir de fuentes endógenas
se monitorizó mediante radioinmunoensayo (RIA). Se generó
anticuerpo contra el 15S-HETE con un 0,1% de
reactividad cruzada a 50% B/B0 para el 5-HETE
(PerSeptive Diagnostics, Cambridge, MA).
Para el análisis de las LX (incluyendo las LX y
las 15-epi-LX) procedentes de
células A549-PMN, se realizaron coincubaciones
usando una columna Waters (Bondapak C18 (3,9 \times 300 nm) eluida
con una fase móvil isocrática MeOH/H_{2}O/ácido acético
(60:40:0,01; v/v/v) con una velocidad de fluo de 0,6 ml/min, o una
columna Altex Ultrasphere ODS (5 mm, 10 mm \times 25 cm) eluida
con MeOH/H_{2}O/ácido acético (65:35:0,01; v/v/v) a una velocidad
de flujo de 3 ml/minuto. Los peptidoleucotrienos (LTC_{4} y
LTD_{4}) eluidos en las fracciones MeOH procedentes de
extracciones con cartuchos Sep-Pak se resolvieron
con una columna Beckman Ultrasphere-ODS eluida con
MeOH/H_{2}O/ácido acético (65:35:0,01; v/v/v), pH 5,7, a 1
ml/minuto. Las incubaciones de PMN con 15R-HETE se
detuvieron con MeOH, y las fracciones de metilformato de los
productos extraídos con Sep-Pak C18 se inyectaron
en una columna Altex Ultrasphere ODS (5 mm, 10 mm \times 25 cm) y
se eluyeron con MeOH/H_{2}O/ácido acético (65:35:0,01; v/v/v)
usando un flujo de 3 ml/minuto. El material debajo de los picos que
absorbían a 300 nm se recogió individualmente después de la
RP-HPLC, y se analizó mediante cromatografía de
gases-espectrometría de masas
(GC-MS) empleando un GC
Hewlett-Packard 5890 GC serie II equipado con un
detector de masas selectivo de cuadrupolo 5971A, como en Clària, J.
y Serhan, C.N., "Aspirin triggers previously undescribed
bioactive eicosanoids by human endothelial
cell-leukocyte interaction". Proc. Natl Acad.
Sci. USA 92:9475-9479 (1995).
Se obtuvo del ARN total a partir de células A549
mediante el procedimiento de isotiocianato de guanidinio y cloruro
de cesio, y se produjo el ADNc mediante RT. Se construyeron
cebadores de oligonucleótidos a partir de secuencias publicadas de
la PGHS-1 y PGHS-2
((5'-TGC CCA GCT CCT GGC CCG CCG
CTT-3' (codificante), 5'-GTG CAT
CAA CAC AGG CGC CTC TTC-3' (no codificante)), y
(5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA ATT GCT- 3'
(codificante) y 5'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT
CTT-3' (no codificante)), respectivamente),
15-LO (5'-ATG GGT CTC TAC CGC ATC
CGC GTG TCC ACT-3' (codificante) y
5'-CAC CCA GCG GTA ACA AGG GAA CCT GAC
CTC-3' (no codificante)), 12-LO,
(Funk, C.D. y FitzGerald, G. A., "Eicosanoid forming enzyme mRNA
in human tissues". J. Biol. Chem.
266:12508-12513 (1991)), (5'-AGT TCC
TCA ATG GTG CCA AC-3' (codificante) y
5'-ACA GTG TTG GGG TTG GAG AG-3'
(no codificante)), y 5-LO (5'-GAA
GAC CTG ATG TTT GGC TACC3' (codificante) y 5'-AGG
GTT CTC ATC TCC CGG-3' (no codificante)). La
amplificación de de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) se realizó con los cebadores
5'-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG
GCA-3' (codificante) y 5'-TCT AGA
CGG CAG GTC AGG TCC ACC-3' (no codificante). Las
muestras de PGHS-1, PGHS-2 y GAPDH
se amplificaron durante 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC
durante 1 minuto, emparejamiento a 58ºC durante 2 minutos, y
extensión a 72ºC durante 3 minutos. Las 5-, 12- y
15-LO se amplificaron a 94ºC (1 minuto), 55ºC (2
minuto) y 72ºC (2,5 min) durante 35 ciclos. Los productos de la PCR
se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, y su
identidad se monitorizó mediante análisis con enzima de
restricción. Para la detección de dianas específicas amplificadas
mediante PCR, se añadieron 0,5 Ci de [32P]dCTP (3000
Ci/mmol) a la mezcla de la PCR, y los productos se cuantificaron
mediante un Phosphorimager usando el programa
Image-Quant (Molecular Dynamics, San Lorenzo,
CA).
Se usó un microcultivo de ensayo con
3,(4,5-dimetiltiazoil-2-il)-2,5-(difenil-tetrazolio
bromuro) (MTT) (Marshall, N.J., et al., "A critical
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure
cell growth and function". Growth Regul. 5:69-84
(1995).), para examinar las acciones de las LX y otros eicosanoides
sobre la proliferación celular. Las células A549 y los fibroblastos
procedentes de la fase exponencial de cultivos de mantenimiento se
contaron y prepararon en placas de cultivo de 96 pocillos
replicadas, en volúmenes de 100 ml de medio (\sim2000
células/pocillo). Transcurridas 24 horas a 37ºC, se retiró el medio
de cultivo, y se añadió medio de cultivo reciente (100 ml) que
contenían los compuestos (5-1000 nM) o vehículo
(medio más 0,15% de etanol) a los 4 replicados, para cada una de
las condiciones estudiadas, y las placas de cultivo se incubaron a
continuación durante hasta 96 horas a 37ºC en una atmósfera de 5% de
CO2. Al final de este período, se añadieron a los pocillos 25 ml de
MTT en HBSS (5 mg/ml) recién preparado, y las placas se incubaron
durante 4 horas a 37ºC. Se aspiró la solución de tinción, y se
lavaron los pocillos una vez con HBSS, y el colorante captado por
las células se extrajo en 100 ml de alcohol isopropílico:HCl 1 N
(96:4, v/v), y se cuantifico a 570 nm usando un lector de
microplacas (Molecular Devices, Menlo Park, CA). En algunos
experimentos, las células se hicieron crecer en placas de cultivo
de 12 pocillos, y se trataron como más arriba, y se contaron usando
un hemocitómetro de Neubauer. La viabilidad se comprobó
rutinariamente usando el ensayo de exclusión de azul tripán. Para
las células A549 y los fibroblastos, se estableció una relación
lineal entre los valores de MTT y el número de células dentro del
rango de los experimentos mostrado (r = 0,995, P < 0,005). Las
células A549 cultivadas durante 72 horas en presencia de los
compuestos (5-1000 nM) o vehículo (0,15% EtOH) se
lisaron con NaOH 0,25 N, y se determinó el contenido celular en
proteína aplicando el procedimiento de microensayo de
Bio-Rad (Richmond, CA) usando la albúmina de suero
bovino como estándar. El contenido promedio de proteína celular en
células A549 en reposo fue de 46,6 \pm 1,5 pg/célula.
Se sembraron células A549 (\sim2 \times
10^{4} células/ml) en placas de 96 pocillos, se dejaron asentar
durante 24 horas, y se cultivaron durante 72 horas adicionales en
presencia de compuestos (5-1000 nM) o vehículo
(medio más 0,15% de etanol). Veinticuatro horas antes del ensayo, se
añadieron 2 Ci/ml de metil-[^{3}H]timidina (actividad
específica = 6,7 Ci/mmol) a cada pocillo. (Consultar Cybulsky et
al., "Eicosanoids enhance epidermal growth factor receptor
activation and proliferation in glomerular epithelial cells". Am.
J. Physiol. 262 (Renal Fluid Electrolyte Physiol.31):
F639-F646 (1992).) Después del pulso de marcado,
cada pocillo se lavó cuatro veces con DPBS^{2+} frío, y las
células se lisaron con NaOH (0,25 N) y se midió la radiactividad.
Se usó la prueba t de Student para el análisis estadístico, y las
diferencias se consideraron significativas a un valor de P de
0,05.
Los eicosanoides se forman por la oxigenación
inicial del ácido araquidónico a través de las vías enzimáticas de
la PGHS o LO. (Samuelsson B., et al., "Leukotrienes and
Lipoxins: structures, biosynthesis, and biological effects".
Science 237:1171-1176 (1987).) Para verificar cual
de los enzimas generadores de eicosanoides está presente y/o es
regulado por citocinas en las células A549, se monitorizaron
mediante RP-HPLC, seguida por análisis con
Phosphorimager, los niveles de ARNm de PGHS-1 y -2 y
5-, 12- y 15-LO en células A549 cultivadas en
presencia o ausencia de IL1_{\beta}. Tal como se ilustra en la
Figura 1A, los niveles de ARNm para la PGHS2 estaban incrementados
significativamente (\sim dos veces) después de la estimulación de
las células A549 con IL-1_{\beta}. Por contra,
los niveles de ARNm para la PGHS1 y la 5-LO no
estaban significativamente alterados después de la exposición de
las células a citocina (Figura 1A). Las células A549 no consiguieron
mostrar expresión de 15- o 12-LO antes o después de
la inducción de citocinas (Figura 1A). La ausencia de ARNm de
15-LO en las células A549 se confirmó adicionalmente
realizando la RT-PCR en paralelo con ARN de tejido
pulmonar humano y de monocitos de sangre periférica, los cuales se
sabe que son respectivamente fuente positiva y negativa, (cf. Funk
C.D. y FitzGerald G.A., "Eicosanoid forming enzyme mRNA in human
tissues". J. Biol. Chem. 266:12508-12513
(1991)), de ARNm de 15-LO (ver Figura 1A,
recuadro).
recuadro).
Para caracterizar el perfil de los productos
monohidroxi producidos por las células epiteliales de las vías
aéreas, se permeabilizaron células A549 (1,5 \times 10^{6}
células/ml) estimuladas con IL-1_{\beta}, y se
incubaron con ácido araquidónico, y los productos formados se
extrajeron y analizaron mediante RP-HPLC. El perfil
cromatográfico reveló la presencia de un producto principal con una
intensa absorbancia UV a 234 nm, el cual coeluía con el
15-HETE sintético. También, cuando se añadió ácido
[^{3}H]-araquidónico a las células A549 tratadas
con IL1_{\beta} se recuperó material radiomarcado debajo del pico
que coeluía con el 15-HETE (Figura 1B). En estos
experimentos, no se observó de forma consistente la formación de 5-
o 12-HETE. El tratamiento con ASA De las células
A549 condujo a un marcado incremento en la formación de
15-HETE, mientras que la incubación de las células
A549 permeabilizadas con 17-ODYA, un inhibidor
descrito del metabolismo de eicosanoides con P450 (Muerhoff, A.S.
et al., "Prostaglandin and fatty acid \omega and
(\omega-1)-oxidation in rabbit
lung: acetylenic fatty acid mechanism-based
inactivators as specific inhibitors", J. Biol. Chem.
244:749-756 (1989)), resultó en una reducción de
\sim50% en el 15-HETE (Figura 2A). La
17-ODYA es un potente inhibidor del metabolismo de
eicosanoides con P450 y no inhibe selectivamente ni la actividad
ciclooxigenasa, ni la LO (Consultar Muerhoff et al., y los
materiales auxiliares de los suministradores.) El inhibidor de
5-LO (isómero Rev-5901) no alteró la
cantidad de 15-HETE producido por las células A549
de forma estadísticamente significativa. Las células A549
desnaturalizadas con calor redujeron las cantidades de
15-HETE en un \sim90%, sugiriendo un componente
enzimático en su formación. También se obtuvo la producción de
15-HETE a partir de fuentes endógenas de
araquidonato en células A549 intactas (25,0 \pm 10,0 ng/10^{7}
células) tratadas con IL-1_{\beta} (1 ng/ml)
durante 24 horas. Considerados conjuntamente, estos resultados
indican que 15-HETE es el principal producto
monohidroxi generado por las células A549, y sugiere que la
PGHS-2 acetilada y el citocromo P450 contribuyen
ambos a su biosíntesis.
Para investigar la evolución temporal de la
generación de 15-HETE a partir de fuentes endógenas
de araquidonato, se expusieron células A549 intactas a
IL-1_{\beta} (1 ng/ml) durante hasta 48 h, y se
monitorizó la cantidad de 15-HETE inmunoreactivo
presente en el sobrenadante de las células mediante un RIA
específico. En condiciones de reposos, las células A549 produjeron
niveles significativos de 15-HETE inmunoreactivo
(19,1 \pm 10,5 ng/10^{7} células, n = 3, d = 2). Estos valores
no cambiaron con la adición del ionóforo A_{23187} (5 (M) en
ausencia de IL-1_{\beta} (Figura. 2B). También, en
ausencia de estimulación con ionóforo, la adición de IL1_{\beta}
a las células A549 durante hasta 48 h no resultó en una generación
aumentada de 15-HETE (Figura 2B). En acusado
contraste, la adición de IL-1_{\beta} más la
estimulación con A_{23187} de las células A549 condujo a un
marcado incremento en la producción de 15-HETE
(Figura 2B). Los niveles máximos se hallaron a las 24 horas de
exposición a la citocina, y los niveles de 15-HETE
declinaron a partir de ese momento.
Puesto que la estereoquímica del alcohol en el
15-HETE producido por las células A549 tenía
interés, se examinaron las cantidades relativas de los enantiómeros
R y S individuales de 15-HETE,
generados por las células A549 tratadas con
IL-1_{\beta}, usando un análisis de HPLC de fase
quiral. (Ver Procedimientos.) La PGHS-2, así como
el citocromo P450, son enzimas distintos de la 15-LO
que pueden convertir el ácido araquidónico en
15-HETE. El 15-HETE derivado de
PGHS-2 y acetilado por ASA tiene su grupo alcohol
sobre el carbono C-15 principalmente en la
configuración R. (Holtzman, M.J., et al.,
"Identification of a pharmacologically distinct prostaglandin H
synthase in cultured epithelial cells". J. Biol. Chem.
267:21438-21445 (1992)). Aquí, el
15-HETE producido por las células A549 cebadas con
IL1_{\beta} se convirtió en su metiléster y se sometió a análisis
quiral mediante SP-HPLC. El 15-HETE
procedente de células A549 activadas estaba el 65% en la
configuración R y el 35% en la configuración S
(Figura. 3). El pre-tratamiento de las células A549
con ASA (20 minutos, 37ºC) resultó en un incremento de 3 veces en la
cantidad de 15R-HETE, mientras que la formación de
15S-HETE permaneció inalterada (Figura 3). En
presencia de ASA, el 15R-HETE representaba el 85%
de la cantidad total de 15-HETE producido por las
células A549. Estos resultados indican que la mayoría del
15-HETE generado por las células A549 cebadas con
IL-1_{\beta}, en presencia de ASA, estaba en la
configuración R.
La biosíntesis transcelular de eicosanoides es
un medio importante de amplificación de los mediadores lipídicos,
así como de generación de nuevos mediadores. (Marcus, A.J.,
"Aspirin as prophylaxis against colorectal cancer", N. Engl.
J. Med. 333:656-658 (1995).) La coestimulación de
células endoteliales humans y PMN después del tratamiento con ASA
resulta en la formación de una nueva clase de eicosanoides
bioactivos. (Claria, J. y Serhan, C.N., "Aspirin triggers
previously undescribed bioactive eicosanoids by human endothelial
cell-leukocyte interactions", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92:9475-9479 (1995).) Estos nuevos
eicosanoides se identificaron como
15-epi-LX, y su biosíntesis implica
la transformación por leucocitos del 15-HETE de
origen endotelial activado por ASA. En vista de estos resultados, es
posible que la formación de nuevos eicosanoides mediante
biosíntesis transcelular ocurra también durante las interacciones
células epiteliales-PMN. Para comprobar esta
hipótesis, se expusieron células A549 confluentes a
IL-1_{\beta} (1 ng/ml, 24 h), se trataron con
ASA, y se coestimularon con PMN. La Figura 4A muestra un perfil de
HPLC representativo del material obtenido de células estimuladas y
expuestas a ASA, el cual revela la presencia de cuatro productos
principales con intensa absorbancia UV cuando se representa a 300
nm. El análisis espectral en línea de estos productos mostró que
cada uno de ellos exhibía un triplete de bandas de absorción
característico de los cromóforos conjugados que contienen tetraeno,
indicativos de la estructura básica de las LX (máximo a 301 nm y
hombros a 288 y 316 \pm 2 nm) (FiguraS 4B y 4C).
En los perfiles cromatográficos se identificaron
la LXA_{4} y la 15-epi-LXA_{4}
basándose en la coelución con estándares sintéticos y a la
presencia del cromóforo característico. En esta incubaciones, la
15-epi-LXA_{4} era responsable de
\sim88% de la cantidad total de LXA_{4} detectada, lo que
concuerda con la observación de que la mayoría del
15-HETE generado por células A549 cebadas con
IL-1_{\beta} y expuestas a ASA se halla en la
configuración R (cf. FiguraS 3 y 4A, 4B y 4C). En este
sistema de RP-HPLC, la
15-epi-11-trans-LXA_{4}
y la LXB_{4} coeluían, al igual que la
11-trans-LXA_{4} y la
15-epi-LXB_{4} (no se muestra).
Estos isómeros de la LX no se resolvieron adicionalmente mediante
HPLC y se indican en el perfil debajo respectivamente de los picos
marcados como picos A y B (Figura 4A). Los compuestos debajo de los
picos A y B sí que se resolvieron como OTMS, derivados metiléster,
en GC-MS (ver más abajo). Los productos se
presentaron en una proporción \sim8:2 a favor de sus epímeros 15R
(n = 3). El Compuesto C (Figura 4A) no coeluyó con ninguna de las LX
previamente identificadas, y también estaba presente en el perfil
de RP-HPLC procedente de PMN activados incubados con
15R-HETE (no se muestran los datos, n = 5). El
material que eluía debajo del Compuesto C coincidía con las
propiedades físicas del Compuesto III que se aisló recientemente a
partir de interacciones de células endoteliales-PMN
(cf. Clària, J. y Serhan, C.N. "Aspirin triggers previously
undescribed bioactive eicosanoids by human endothelial
cell-leukocyte interactions", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92:9475-9479 (1995).) Aunque la
estereoquímica completa del Compuesto C permanece sin determinar,
los datos espectrales de UV y las movilidades cromatográficas
sugieren que puede ser la forma 15-epímero de la
7-cis-11-trans-LXA_{4}.
(Nicolaou, K.C., et al. "Identification of a novel
7-cis-11-translipoxin
A_{4}, generated by human neutrophils: total synthesis,
spasmogenic activities and comparison with other geometric isomers
of LXs A_{4} and B4", Biochim. Biophys. Acta
1003:44-53 (1989).) Por tanto, las LX generadas
durante la coestimulación epitelial de células
A549-PMN después del tratamiento con ASA, era
predominantemente 15-epi-LX (Figura
4A).
Además de la capacidad de producir LX, las
coincubaciones del PMN activados con células A549 también generaron
cantidades significativas (\sim8 veces más de LX conteniendo
tetraenos) de peptidoleucotrienos (pLTs; LTC_{4} y LTD_{4}) en
ausencia de ASA (FiguraS 5A y 5B). Las cantidades de ambos, LX y
pLT, producidas en estas condiciones dependían de las proporciones
de células individuales (FiguraS 5A y 5B, recuadros). La exposición
de células A549 epiteliales de las vías aéreas a ASA (20 minutos)
antes de la adición de los PMN provocó un incremento en la
formación de LX y una disminución en los pLT (FiguraS 5A y 5B). Ni
los PMN ni las células A549 incubadas por separado, en ausencia o
presencia de ASA, generaron niveles detectables de LX o pLT
(FiguraS 5A y 5B, y datos no mostrados). Considerados conjuntamente,
estos resultados indican que, durante las interacciones célula
A594-PMN, tanto las LX como los pLT se originan a
partir de rutas transcelulares.
Las LX son vasodilatadores y reguladores
potentes de las respuestas de leucocitos, tales como la inhibición
de la quimiotaxis, la adhesión a células endoteliales, y la
transmigración a través del epitelio. (Consultar Serhan, C.N.,
"Lipoxin biosynthesis and its impact in inflammatory and vascular
events". Biochim. Biophys. Acta 1212:1-25
(1994).) Por el contrario, los pLT poseen tanto una acción
vasoconstrictora como proinflamatoria, así como estimulan el
crecimiento de varios tipos celulares, incluyendo los fibroblastos,
las células del músculo liso y del epitelio glomerular. (Baud, L.,
et al., "Leukotriene C4 binds to human glomerular
epithelial cells and promotes their proliferation in
vitro". J. Clin. Invest. 76:374-377 (1985).)
Las LX invierten la acción vasoconstrictora del LTD_{4} en la
hemodinámica renal en ratas, y bloquean la hematopoyesis estimulada
por LTC_{4}. (Serhan, C.N., "Lipoxin biosynthesis and its impact
in inflammatory and vascular events". Biochim. Biophys. Acta
1212:1-25 (1994).) Puesto que ASA potencia la
formación de 15-epi-LX e inhibe la
biosíntesis de pLT (FiguraS 5A y 5B), estos eicosanoides pueden
desempeñar acciones contrarreguladoras sobre la proliferación
celular y contribuir a los mecanismos protectores del ASA en el
cáncer humano. Con esta finalidad, se ensayó el efecto de estos
productos de la LO sobre la proliferación de células epiteliales
(FiguraS 6A y 6B), y sus acciones se compararon con las de la
dexametasona, un inhibidor claramente aceptado, empleando un ensayo
de microcultivo soluble con tetrazolio (MTT). (Alley, M.C., et
al., "Feasibility of drug screening with panels of human
tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay". Cancer
Res. 48:589-601 (1988).) Estos experimentos se
realizaron con LXA_{4} y LXB_{4} sintéticas, las cuales estaban
disponibles en cantidades suficientes para un bioensayo, en vez de
con la 15-epi-LX, que el la LX
principal producida por estas células. Tal y como se muestra en las
Figura 6A y 6B, la LXA_{4} y la LXB_{4} inhibieron la
proliferación de las células A549 de forma dependiente del tiempo
(A) y de la dosis (B). La LXA_{4} y la LXB_{4}, así como la
dexametasona [1 mM], inhibieron la proliferación celular de las A549
después de 72 y 96 horas de tratamiento (Figura 6A). Transcurridas
72 horas, la LXA_{4} compartió las propiedades antiproliferativas
(Figura 6A) observadas para la dexametasona con estas células. (Cf.
Croxtall, J.D., y Flower R.J., "Lipocortin 1 mediates
dexamethasone-induced growth arrest of the A549 lung
adenocarcinoma cell line". Proc. Natl. Sci. USA
89:3571-3575 (1992).) La concentración de inhibición
mitad del máximo (IC50) para la LXA_{4} era de \sim80 nM en
comparación con la de la dexametasona, que es \sim7 nM. La
LXB_{4} a concentraciones de 0,5 y 1 mM era 3 veces más activa
que la LXA_{4} o la dexametasona (Figura 6B). Es interesante que
ambas, la LXA_{4} y la LXB_{4} mostraron esencialmente una
potencia igual para bloquear el crecimiento de las células A549
cuando cada una de ellas se añadía repetidamente (es decir, a
intervalos de 24-horas) a las células durante 3
días consecutivos (no se muestran los datos, n = 3, d = 4),
sugiriendo que la LX puede ser inactivada por estas células
epiteliales. Los resultados de experimentos adicionales que
empleaban el recuento directo de células (Figura 7B) y la medición
del contenido de proteína celular total (no se muestran los datos, n
= 3, d = 4) eran paralelos a los obtenidos con el ensayo del MTT,
confirmando de ese modo las acciones antiproliferativas de las LX
en las células A549. Además, ocurría un bloqueo de la síntesis de
ADN, según se determinó mediante la incorporación de
^{3}H-timidina, cuando las células A549 se
exponían durante 72 horas a concentraciones de 50 nM o superiores
de LXB_{4} o dexametasona (Figura 7A). Después de la incubación de
las células A549 con los compuestos, se halló que la viabilidad de
las células era de \sim98%, según se determinó mediante el ensayo
de exclusión del azul tripán, indicando que estos compuestos no eran
citotóxicos dentro del rango de concentraciones usadas en estos
experimentos.
Las formas epiméricas de la LXA_{4} y
LXB_{4} (15-epi-LXA_{4} y
15-epi-LXB_{4}, respectivamente),
las cuales eran las formas dominantes de LX aisladas a partir de
estas células, también mostraron ser unos inhibidores potentes de
la proliferación de células epiteliales, tal y como se muestra en la
Tabla 1 siguiente.
Las células (2000 A549 células/pocillo) se
hicieron crecer en placas de 96 pocillos y se expusieron al vehículo
(0,15% vol/vol en EtOH/medio F-12K) o a
concentraciones equimolares (10^{-7} M) de LXA_{4},
15-epi-LXA_{4}, LXB_{4},
15-epi-LXB_{4}, o dexametasona,
durante 72 horas, a 37ºC. Los valores representan \pm SEM de 3 a
7 experimentos realizados por cuadruplicado, y se expresan como
porcentaje de inhibición sobre el crecimiento celular. * Los
valores P indican diferencias estadísticas en comparación con las
células solas. & P<0,001 para la
15-epi-LXB_{4}. A niveles
equimolares (100 nM), la
15-epi-LXA_{4} inhibió el
crecimiento de las células A549 con un alcance similar al de la
LXA_{4}. Por otra parte, la
15-epi-LXB_{4}, aislada a partir
de la conversión del 15R-EHTE por parte de PMN
activados y añadida de nuevo a las células A549, proporcionó una
actividad antiproliferativa más potente que la LXB_{4} (\sim80%
vs. \sim34% de inhibición de la proliferación, P<0,001; Tabla
1). Este compuesto se caracterizó mediante UV, HPLC y
GC-MS (valor de C: 23,3). Los iones de diagnóstico
para el metiléster OTMS fueron m/z 173 (pico base), 203, 289, 379, y
de forma menos prominente los iones a 482
(M^{+}-100) [No fue posible obtener su ion
molecular debido a su baja abundancia]. Por tanto, el material
predominante debajo del pico marcado B en la Figura 4B eran
consistente con el de la
15-epi-LXB_{4}, la cual dio un
valor C inferior y distinto del de la LXB_{4} como derivado
metiléster OTMS en el análisis de GC-MS. Los
espectros de masas de la
15-epi-LXB_{4} y de la LXB_{4}
eran esencialmente idénticos (no se muestran), pero sus valores de
C eran distintos. El material que eluía debajo del pico denominado C
(aislado a partir de PMN activados incubados con
15R-HETE) también mostró una suave acción
inhibitoria sobre el crecimiento de las células epiteliales (18
\pm 2% de inhibición de la proliferación, n = 3, d = 4). En
contraste acusado, la
15-epi-trans-LXA_{4},
la 11-trans-LXB_{4}, la
8,9-acetilénico-LXB_{4}, los
peptidoleucotrienos (LTC_{4} y LTD_{4}), y los precursores de
la LX (15S- y 15R-HETE), ensayados cadas uno a
10^{-6}-10^{-9} M, no fueron capaces de inhibir
significativamente la proliferación de las células A549 (no se
muestran los datos, n = 3-5, d = 4). Estos
resultados indican que la LX y la
15-epi-LX proporcionan una acción
estereoselectiva al bloquear la proliferación celular en células
A549. La LXA_{4} y la LXB_{4} se ensayaron con fibroblastos de
piel humana para determinar si eran antiproliferativas para este
tipo de células. A 100 nM, tanto la LXA_{4} como la LXB_{4}
inhibieron la proliferación de los fibroblastos. La LXB_{4} dio un
38,0 \pm 7,5% de inhibición y la LXA_{4} 10,7 \pm 1,8%, en
comparación con la dexametasona (29,7 \pm 0,4%) como control
positivo (n = 3).
La presencia de un sistema enzimático de
citocromo P450 activo en las células A549 de las vías aéreas
humanas, (Vogel, et al., "Transforming growth
factor-\beta1 inhibits
TCDD-induced cytochrome P450IA1 expressions in
human lung cancer A549 cells". Arch. Toxicol.
68:303-307 (1994).), junto con los resultados de
que la inhibición del P450, así como la desnaturalización con calor,
bloquea la generación del 15-HETE en estas células
(Figura 2A), sugiere que este sistema enzimática en las células
epiteliales contribuye también a la biosíntesis del
15-HETE y a la generación de la
15-epi-lipoxina mediante rutas
transcelulares (Figura 8). Consideradas conjuntamente, estas
observaciones (FiguraS 1-4) establecen la existencia
de dos vías enzimáticas distintas (a saber, la de la
PGHS-2 ASA-acetilada y la del
citocromo P450), que pueden iniciar la formación de
15-epi-lipoxina durante las
interacciones PMN-células epiteliales de las vías
aéreas (Figura 8). También, debería destacarse que, en vista de la
capacidad de ASA para inducir los enzimas P450, Pankow, D. et
al., "Acetylsalicylic acid - inducer of cytochrome
P-450 2E1?" Arch. Toxicol.
68:261-265 (1994), es posible que estas rutas
independientes puedan actuar concertadamente para generar la
15-epi-lipoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante sólo es para provecho del lector. No forma parte del
documento de la Patente Europea. Aunque se ha tenido sumo cuidado al
compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones, y
la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este aspecto.
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261-265 [0165]
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BRIGHAM AND WOMEN'S HOSPITAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 75 FRANCIS STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: BOSTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MASSACHUSETTS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02115
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS DE LIPOXINA Y SU USO EN EL TRATAMIENTO DE LOS TRASTORNOS PROLIFERATIVOS DE CÉLULAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOLICITANTE: LAHIVE & COCKFIELD, LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 28 STATE STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: BOSTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MASSACHUSETTS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 02109-1875
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Emisión #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/712,610
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 13-SEPTIEMBRE-1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL PROCURADOR/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: DECONTI, GIULIO A., JR.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31,503
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: BWI-112C2PC
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (617)227-7400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX:
\vskip0.500000\baselineskip
- (617)742-4214
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCCCAGCTC CTGGCCCGCC GCTT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCATCAAC ACAGGCGCCT CTTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCAAATGAG ATTGTGGGAA AATTGCT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATCATCTC TGCCTGAGTA TCTT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGGTCTCT ACCGCATCCG CGTGTCCACT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCCAGCGG TAACAAGGGA ACCTGACCTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTCCTCAA TGGTGCCAAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGTGTTGG GGTTGGAGAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGACCTGA TGTTTGGCTA CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGGTTCTCA TCTCCCGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACCCATGG CAAATTCCAT GGCA
\hfill24
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NO CODIFICANTE: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTAGACGGC AGGTCAGGTC CACC
\hfill24
Claims (6)
1. Compuesto de la fórmula
en donde R' es H o CH_{3}; y los
sustituyentes en C* están en la configuración
RR.
2. Composición farmacéutica que comprende un
compuesto según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente
aceptable.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 2 para su uso en la prevención de una proliferación
no deseada de células en un sujeto.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 2, que comprende además ácido acetilsalicílico.
5. Procedimiento para inhibir o prevenir una
proliferación no deseada de una célula ex vivo, el cual
comprende poner en contacto la célula con un compuesto según la
reivindicación 1.
6. Uso de un compuesto según la reivindicación 1
en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un
trastorno proliferativo.
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|---|---|---|---|
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