Verwendung von Qualitätsindikatoren zum Nachweis von Auftauprozessen in gefrorenen Gewebeproben
Besehreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von
Qualitätsindikatoren zum Nachweis von Auftauprozessen in kryokonservierten Proben. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum Nachweis von Auftauprozessen in
kryokonservierten Proben mittels bestimmter
Qualitätsindikatoren sowie die Qualitätskontrolle von
Gewebeproben, Lebensmitteln und die Erstellung von
metabolischen Profilen mittels dieser Qualitätsindikatoren.
Biologische Materialien, wie Gewebe, Zellen und Biofluids, und zugehörige Daten, die von Biobanken gesammelt und aufbewahrt werden, sind die wichtigsten Ressourcen, um den Ursprung und die Entwicklung von Krankheiten verstehen zu lernen und die Diagnose und Behandlung von Krankheiten verbessern zu können. Für die Erforschung von lokal eingegrenzten Krankheiten
(z.B. Krebs) oder organspezifischen Manifestationen von systemischen Krankheiten sind Gewebeproben besonders nützlich (Asslaber & Zatloukal, 2007) . Für die Entdeckung von
krankheitsspezifischen Effekten sind große Probenzahlen, teils von unterschiedlichen Quellen, nötig, und die Fähigkeit, die Ergebnisse miteinander zu vergleichen, ist von grundlegender Bedeutung. Die Vergleichbarkeit hängt stark von der Qualität der untersuchten Proben ab. Idealerweise sollten sie den
Status der Patienten während der Probenentnahme reflektieren, aber verschiedene Faktoren, z.B. die Vorgehensweise bei der Gewebeentnahme, das Konservierungsverfahren und die
Lagerbedingungen (z.B. Dauer der Lagerung, Temperatur),
verändern die Proben und beeinflussen die molekulare Qualität der untersuchten Probe. Gewebeproben können durch Einfrieren bei der erforderlichen Temperatur (z.B. -196 Grad Celsius (flüssiger Stickstoff) , -160 Grad Celsius (Gasphase über flüssigem Stickstoff), -80 Grad Celsius, -20 Grad Celsius), eventuell in einem geeigneten Medium, oder durch Stabilisieren des Gewebes in einem Fixiermittel (z.B. Formaldehyd,
Glutaraldehyd, Carnoy-Lösung, Methacarn, usw.) gelagert werden. Die Verwendung von Fixiermitteln ist ziemlich weit verbreitet, aber sie beeinflusst die molekulare Qualität der untersuchten Probe, da sie sich beispielsweise auf die
Extraktionseffizienz von Nukleinsäuren auswirkt (Srinivasan et al . , 2002, Viertier et al . , 2012), durch chemische Reaktionen zu irreversiblen Veränderungen führt bzw. die Konzentration kleiner Moleküle durch Auswaschen verändert oder sie kann aufgrund der Unvereinbarkeit des Fixiermittels mit einem methodischen Ansatz, der für die Analyse verwendet wird, Proben für bestimmte Analysen unbrauchbar machen. Daher ist das Lagerungsverfahren wichtig für die Stabilität, Integrität und somit auch für die molekulare Qualität des Gewebes und entscheidet letztendlich über die Brauchbarkeit der Proben. Frisch eingefrorenes Gewebe liefert die höchste molekulare Qualität, daher ist Kryokonservierung das bevorzugte
Lagerungsverfahren. Die Temperatur ist dabei ein kritischer Faktor, und es wurde gezeigt, dass selbst eine Lagerung bei -80 °C den Abbau von labilen chemischen Verbindungen nicht verhindern kann. Daher wird die Lagerung bei -196 °C in flüssigem Stickstoff empfohlen (Schrohl et al . , 2008), beziehungsweise bei -160 °C in der Gasphase über flüssigem Stickstoff. Temperaturschwankungen während der Lagerung und/oder des Transports, oder im schlimmsten Fall eine
Unterbrechung der Kühlkette, tragen zum Abbau der untersuchten
Probe vor deren Analyse bei. Dies macht die Validität von Daten, die aus solchen Proben erhalten werden zweifelhaft. Es sind daher Verfahren nötig, die die Art und das Ausmaß solcher Veränderungen nachweisen können und somit Schlüsse über die Qualität der Proben ermöglichen. Abhängig vom methodischen Ansatz, der für die Probenanalyse verwendet wird
(morphologische, genomische, transkriptomische oder
metabolomische Analyse) , sind unterschiedliche
Qualitätskontrollen nötig, um die molekulare Qualität einer Probe zu messen. So sind die Gesamtausbeute und die
extrahierbare Fragmentlänge die relevantesten Parameter für Nukleinsäuren (Jewell et al . , 2002; Chaigneau et al . , 2007, Viertier et al . , 2012), und die Proteinqualität hängt
beispielsweise von einer Aufrechterhaltung der Aktivitäten bestimmter Markerenzyme ab. Jedoch existieren keine geeigneten Qualitätskontrollen für Proben, die in metabolischen Studien verwendet werden. Der Einfluss von Lagerbedingungen und von Einfrier-Auftau-Zyklen auf Serum, Plasma und Vollblut war Gegenstand verschiedener Studien, wobei in den meisten Fällen eine begrenzte Anzahl von Verbindungen, die nicht als
repräsentativ für eine chemische Klasse angesehen werden, untersucht wurden (Bolelli et al . , 1995; Boyanton & Blick, 2002; Chaigneau et al . , 2007; Comstock et al . , 2001; Paltiel et al., 2008; Shih et al . , 2000). EP 1 201 639 Bl betrifft Lipoxin Verbindungen, die durch mehrfaches Auftauen aus der Probe gewonnen wurden und deren Metabolitenprofil analysiert wurde.
US2005130116 A offenbart das Metabolitenprofil von Tamoxifen. Die Zellhomogenate werden dabei wiederholt aufgetaut und wieder eingefroren.
WO 2007/003343 betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von
Drogen und Metabolitenprofilen in biologischen Proben sowie ein Verfahren zur Analyse von Drogen und Metabolitenprofilen wobei im Vergleich zu einem internen Standard unter Verwendung der Massenspektroskopie gemessen wird.
Es wurden keine breiteren Profile vermessen, die eine Mehrzahl von chemischen Klassen, wie Aminosäuren, biogene Amine,
Sphingomyeline, Acylcarnitine, usw., abdecken würden, und es ist nichts über solche grundlegenden molekularen Profile für die molekulare Qualität von untersuchten Gewebeproben bekannt.
Es besteht deshalb ein Bedürfnis, Mittel bereitzustellen, mit denen die Qualität von gefrorenen Gewebeproben analysiert werden kann. Es besteht weiterhin ein Bedarf an Indikatoren zur Qualitätskontrolle von Gewebeproben. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von Qualitätsindikatoren gemäß Anspruch 1, das Verfahren nach Anspruch 6 und den Kit nach Anspruch 16 gelöst.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von einem oder mehreren Qualitätsindikator (en) zum Nachweis von Auftauprozessen in einer gefrorenen Probe, insbesondere einer kryokonservierten Probe, wobei der/die Qualitätsindikator (en) ausgewählt
wird/werden aus Aminosäuren, biogenen Aminen, freiem Carnitin, Acylcarnitinen, Phosphatidycholinen, Sphingomyelinen,
Prostaglandinen, Glutathion Disulfid. In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung die erfindungsgemäße Verwendung, wobei der/die
Qualitätsindikator (en) ausgewählt werden aus Methionin (Met), Methionin-Sulfoxid (Met-SO) , Leucin (Leu) , dem
Methionin/Taurin-Verhältnis (Met/Taurin) , Tyrosin (Tyr) ,
Prolin (Pro) , asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) , Gesamt- Dimethylarginin ( Gesamt-DMA) , Kynurenin, freiem Carnitin (CO), Acetylcarnitin (C2), Propionylcarnitin (C3),
Butyrylcarnitin/Isobutyrylcarnitin (C4), der Kombination aus (C2+C3)/C0), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:3 (PC aa C36:3), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:5 (PC aa C38:5), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:2 (PC aa C36:2), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:6 (PC aa C38:6), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:3 (PC ae C42:3), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C40:l (PC ae C40:l), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:2 (PC ae C42:2), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:3 (lysoPC a C20:3), Lysophosphatidylcholin mit
Acylrestsumme C20:4 (lysoPC a C20:4), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:2 (lysoPC a C18:2),
Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:l
(lysoPC a C18:l), Sphingomyelin mit Acylrestsumme C16:0 (SM C16:0), Sphingomyelin mit Acylrestsumme C18:0 (SM C18:0), Sphingomyelin mit Acylrestsumme C24:l (SM C24:l),
Sphingomyelin mit Acylrestsumme C24:2 (SM C24:2),
Hydroxysphingomyelin mit Acylrestsumme C14:l (SM(OH) C14:l), Arachidonsäure (AA) , Docosahexaensäure (DHA) , 15 ( S ) -Hydroxy- 5Z, 8Z, HZ, 13E-eicosatetraensäure ( 15S-HETE) ) und
Glutathiondisulfid (GSSG) , und wobei die Glycerophospholipide im Bezug auf das
Vorhandensein von Ester- (a) und Ether- (e) Bindungen in der Glycerolgruppe unterschieden werden und wobei zwei Buchstaben (aa, ea oder ee) bedeuten, dass die erste und die zweite
Position des Glycerolgerüsts an einen Fettsäurerest gebunden sind und wobei ein einzelner Buchstabe (a oder e) eine Bindung mit nur einem Fettsäurerest bedeutet.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von einem oder mehreren Qualitätsindikator (en) der Gruppe I und / oder der Gruppe III zum Nachweis, ob eine gefrorene Probe, insbesondere kryokonservierte Probe, im Zeitraum zwischen dem Einfrieren und dem Auftauen der Probe, mindestens einmal partiell oder vollständig aufgetaut war und wobei der/die Qualitätsindikator (en) der Gruppe I
ausgewählt werden aus asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) , Methionin (Met), Methionin-Sulfoxid (Met-SO) , dem
Methionin/Taurin-Verhältnis (Met/Taurin) , Kynurenin, Leucin (Leu) , Gesamt-Dimethylarginin (Gesamt-DMA) , Tyrosin (Tyr) , Prolin (Pro), freiem Carnitin (CO), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:3 (lysoPC a C20:3), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:4 (lysoPC a C20:4),
Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:2 (lysoPC a C18:2), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:l (lysoPC a C18:l), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:3 (PC ae C42:3), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C40:l (PC ae C40:l), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:2 (PC ae C42:2), 15 (S) -Hydroxy-5Z, 8Z, HZ, 13E- eicosatetraensäure (15S-HETE), Arachidonsäure (AA) ,
Docosahexaensäure (DHA) , und der/die Qualitätsindikatoren der Gruppe III ausgewählt werden aus Acetylcarnitin (C2), Propionylcarnitin (C3),
Butyrylcarnitin/Isobutyrylcarnitin (C4), der Kombination aus (C2+C3) /CO) , und wobei die Glycerophospholipide im Bezug auf das
Vorhandensein von Ester- (a) und Ether- (e) Bindungen in der Glycerolgruppe unterschieden werden und wobei zwei Buchstaben (aa, ea oder ee) bedeuten, dass die erste und die zweite
Position des Glycerolgerüsts an einen Fettsäurerest gebunden sind und wobei ein einzelner Buchstabe (a oder e) eine Bindung mit nur einem Fettsäurerest bedeutet.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die erfindungsgemäße Verwendung von einer oder mehreren Qualitätsindikator (en) der Gruppe II gegebenenfalls zusammen mit einer oder mehreren Qualitätsindikator (en) der Gruppe I und/oder der Gruppe III zum Nachweis, ob eine gefrorene Probe, insbesondere eine kryokonservierte Probe, im Zeitraum zwischen dem Einfrieren und dem Auftauen der Probe mindestens einmal partiell
aufgetaut war und wobei die Qualitätsindikator (en) der Gruppe II ausgewählt werden aus Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:3 (PC aa C36:3), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:5 (PC aa C38:5), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:2 (PC aa C36:2), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:6 (PC aa C38:6), Sphingomyelin mit Acylrestsumme C18:0 (SM C18:0), Sphingomyelin mit Acylrestsumme C16:0 (SM C16:0),
Sphingomyelin mit Acylrestsumme C24:l (SM C24:l),
Sphingomyelin mit Acylrestsumme C24:2 (SM C24:2),
Hydroxysphingomyelin mit Acylrestsumme C14:l (SM (OH) C14:l), Glutathiondisulfid (GSSG) , und wobei die Glycerophospholipide im Bezug auf das
Vorhandensein von Ester- (a) und Ether- (e) Bindungen in der Glycerolgruppe unterschieden werden und wobei zwei Buchstaben (aa, ea oder ee) bedeuten, dass die erste und die zweite
Position des Glycerolgerüsts an einen Fettsäurerest gebunden sind und wobei ein einzelner Buchstabe (a oder e) eine Bindung mit nur einem Fettsäurerest bedeutet.
und wobei die Qualitätsindikatoren der Gruppe I und der Gruppe III wie oben definiert sind.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen die
Verwendung wobei die Probe eine Gewebeprobe oder
Lebensmittelprobe ist, insbesondere eine Probe humanen oder tierischen Ursprungs aus Gewebe beispielsweise gesundes oder pathogenes Gewebe, oder Zellen, beispielsweise Zellen aus Zellkulturen oder Zellen, die aus Gewebe isolierte wurden.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweis von
Auftauprozessen in einer gefrorenen Probe, insbesondere einer kryokonservierten Probe umfassend die Schritte a) Nachweis eines oder mehrerer Qualitätsindikator (en) in der zu untersuchenden Probe, wobei die
Qualitätsindikatoren ausgewählt werden aus Aminosäuren, biogenen Aminen, freiem Carnitin, Acylcarnitin,
Phosphatidylcholin, Spingomyelin, Prostaglandin,
Glutathiondisulfid; b) Quantifizierung des/der ausgewählten
Qualitätsindikator (en) in der zu untersuchenden Probe; c) Vergleich des/der quantifizierten
Qualitätsindikator (en) in der zu untersuchenden Probe mit einem Bezugsniveau des/der ausgewählten
Qualitätsindikator (en) .
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Bezugsniveau eine Referenzprobe, die im Hinblick auf den/die Qualitätsindikator (en)
a) repräsentativ für einen Auftauprozess ist, insbesondere eine Referenzprobe, die einem Auftauprozess ausgesetzt war; oder b) eine permanent gefrorene Referenzprobe ist,
insbesondere eine permanent kryokonservierte
Referenzprobe; oder c) eine unmittelbar zuvor eingefrorene Referenzprobe ist; oder d) eine unmittelbar zuvor hergestellte Referenzprobe ist; oder e) ein Standard ist.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß die Referenzproben nach a) oder b) .
Besondere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können zum Nachweis von vollständigen Auftauprozessen in einer gefrorenen Probe, insbesondere einer kryokonservierten Probe verwendet werden, wobei der/die Qualitätsindikator (en) ausgewählt werden aus den Qualitätsindikatoren der Gruppe I und/oder der Gruppe III und wobei die Qualitätsindikatoren der Gruppe I und der Gruppe III wie oben definiert sind.
Andere besondere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens können zum Nachweis von partiellen Auftauprozessen in einer gefrorenen Probe, insbesondere einer kryokonservieren Probe verwendet werden, wobei der/die Qualitätsindikator (en) ausgewählt werden aus den Qualitätsindikatoren der Gruppe II und wobei die Qualitätindikatoren der Gruppe II wie oben definiert sind und wobei gegebenenfalls zusätzlich ein oder mehrere Qualitätsindikatoren ausgewählt aus der Gruppe I
und/oder der Gruppe III bestimmt werden und wobei die Qualitätsindikatoren der Gruppe I und der Gruppe III wie oben definiert sind.
In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der/die Qualitätsindikator (en) vor dem Nachweis gemäß
Schritt a) aus der zu untersuchenden Probe extrahiert und/oder von dem Rest der zu untersuchenden Probe abgetrennt.
In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Probe eine Gewebeprobe beispielsweise aus gesundem oder pathogenem Gewebe oder Lebensmittelprobe, insbesondere eine Probe humanen oder tierischen Ursprungs aus Gewebe oder Zellen .
In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Verwendung erfolgt der Nachweis und / oder die Quantifizierung der/des Qualitätsindikator (en) mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie ) , elektrochemischem Nachweis gegebenenfalls gekoppelt an HPLC, radioaktiver Markierung gegebenenfalls in Kombination mit Dünnschicht-Chromatographie, chemischer Modifizierungs-Assays (z.B. radioaktives Labeling) , enzymatischer Assays und
Massenspektrometrie (MS), beispielsweise
Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) ,
Hochleistungsflüssigchromatographie-Massenspektrometrie (HPLC- MS) , Umkehrphasenflüssigchromatographie-Massenspektrometrie (RPLC-MS) oder Ultrahochleistungsflüssigchromatographie- Massenspektrometrie (UPLC-MS), Elektrosprayionisierungs- Massenspektrometrie (ESI-MS), Gaschromatographie- Massenspektrometrie (GC-MS), Atmosphärendruckionisations- Massenspektrometrie (atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry, APCI-MS), Kapillarelektrophorese-
Massenspektrometrie (CE-MS), Tandem-Massenspektrometrie (MS- MS) oder einer Kombinationen dieser Nachweisverfahren.
In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Verwendung war die zu untersuchende die Probe mindestens einem partiellen oder vollständigen
Auftauprozess ausgesetzt, wenn sie mindestens 5 min,
vorzugsweise mindestens 10 min, beispielsweise 20 oder 30 oder 60 min oder 120 mineiner Temperatur von mehr als -10 Grad Celsius, vorzugsweise mehr als -5 °C, beispielsweise 0 °C oder +5°C ausgesetzt war.
In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Verwendung war die zu untersuchende die Probe mindestens einem partiellen oder vollständigen
Auftauprozess ausgesetzt, wenn mindestens einer der
Qualitätsindikatoren um mindestens 50 %, vorzugsweise
mindestens 100 %, besonders bevorzugt mindestens 200 %
gegenüber dem Bezugsniveau der Referenzprobe erhöht oder erniedrigt ist, beispielsweise ist mindestens ein
Qualitätsindikator um 25 %, 75 %, 125 %, 150 %, 175 %, 225 % oder 250 % oder 300 % oder 400 % oder mehr gegenüber der
Referenzprobe erhöht oder erniedrigt.
In besonderen Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Verfahren oder die erfindungsgemäße Verwendung die Analyse von mindestens 2 oder 3, beispielsweise 4, 5 oder 6, vorzugsweise 7, 8 oder 9 oder mehr, beispielsweise 10 oder 20 oder 25 oder 30 oder 34 oder mehr Qualitätsindikatoren.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Verfahrens um Nachweis von Metaboliten und/oder zur Analyse von metabolischen Profilen und/oder zur Qualitätskontrolle.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zum Nachweis von Auftauprozessen und/oder zur Qualitätsanalyse von gefrorenen Proben, insbesondere von kryokonservierten Proben umfassend a) eine Bezugsprobe bzw. Referenzprobe mit einer bekannten Menge eines oder mehrerer
Qualitätsindikator (en) ; b) eine Probe mit einer unbekannten Menge eines oder mehrerer Qualitätsindikator (en) ; c) ein Mittel zum Nachweis des/der quantifizierten Quältitätsindikator (en) , beispielsweise ein
Massenspektrometer ; und wobei der/die Qualitätsindikator (en) ausgewählt wird/werden aus Aminosäuren, biogenen Aminen, freiem Carnitin, Acylcarnitinen, Phosphatidycholinen,
Sphingomyelinen, Prostaglandinen, Glutathion Disulfid, insbesondere ausgewählt aus den Qualitätsindikatoren Methionin (Met), Methionin-Sulfoxid (Met-SO) , Leucin (Leu) , dem Methionin/Taurin-Verhältnis (Met/Taurin) , Tyrosin (Tyr) , Prolin (Pro) , asymmetrischem
Dimethylarginin (ADMA) , Gesamt-Dimethylarginin (Gesamt- DMA) , Kynurenin, freiem Carnitin (CO), Acetylcarnitin (C2), Propionylcarnitin (C3),
Butyrylcarnitin/Isobutyrylcarnitin (C4), der Kombination aus (C2+C3)/C0), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme
C36:3 (PC aa C36:3), Phosphatidylcholin mit
Diacylrestsumme C38:5 (PC aa C38:5), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:2 (PC aa C36:2),
Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:6 (PC aa
C38:6), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:3
(PC ae C42:3), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme
C40:l (PC ae C40:l), Phosphatidylcholin mit Acyl-
Alkylrestsumme C42:2 (PC ae C42:2), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:3 (lysoPC a C20:3),
Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:4
(lysoPC a C20:4), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme
C18:2 (lysoPC a C18:2), Lysophosphatidylcholin mit
Acylrestsumme C18 1 (lysoPC a C18:l), Sphingomyelin mit Acylrestsumme C16 0 (SM C16:0), Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C18 0 (SM C18:0), Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C24 1 (SM C24:l), Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C24 2 (SM C24:2), Hydroxysphingomyelin mit Acylrestsumme C14 1 (SM(OH) C14:l), Arachidonsäure (AA) ,
Docosahexaensäure (DHA) , 15 (S) -Hydroxy-5Z, 8Z, HZ, 13E- eicosatetraensäure (15S-HETE)) und Glutathiondisulfid (GSSG) und wobei die Glycerophospholipide im Bezug auf das
Vorhandensein von Ester- (a) und Ether- (e) Bindungen in der Glycerolgruppe unterschieden werden und wobei zwei Buchstaben (aa, ea oder ee) bedeuten, dass die erste und die zweite Position des Glycerolgerüsts an einen
Fettsäurerest gebunden sind und wobei ein einzelner
Buchstabe (a oder e) eine Bindung mit nur einem
Fettsäurerest bedeutet; d) und gegebenenfalls weitere Hilfskomponenten, wie z.B. Qualitätskontrollproben, Analytenstandards , interne
Standards, Datenanalyse-Software .
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der
erfindungsgemäßen Qualitätsindikatoren und Verfahren zur Kontrolle von medizinischen Proben, beispielsweise Blutproben oder Gewebeproben, Organen, in der Transplantationsmedizin,
zur Konservierung von Lebensmitteln, beispielsweise Fisch, Fleisch, Obst und Gemüse.
Im Sinne der Erfindung bedeutet „Kryokonservierung" das
Aufbewahren einer Probe durch Einfrieren in flüssigem
Stickstoff. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, die Vitalität der Zellen bzw. des Gewebes nahezu unbegrenzt aufrechtzuerhalten, obgleich das biologische System in den Aggregat zustand eines Festkörpers übergeht. Kryokonservierung kann sowohl bei Pflanzenzellen als auch bei tierischen Zellen angewandt werden. Die konservierten Zellen können so über einen sehr langen Zeitraum erhalten werden, in der alle
StoffWechselvorgänge nahezu zum Stillstand kommen. Nach dem Auftauen können die Zellen bzw. das Gewebe ihre normalen physiologischen Prozesse wieder aufnehmen. Kryokonservierung kann bei Zellproben bzw. Gewebeproben bis hin zu kleinen
Organen, wenn man unter Zuhilfenahme des richtig abgestimmten Frostschutzmittels die Proben sehr schnell einfriert, also zum Beispiel mit flüssigem Stickstoff auf 77K (-196 °C) abkühlt, angewendet werden. „Gefrorene Proben" können Proben sein, die bei einer höheren Temperatur als -196 °C gefroren werden, z.B. durch Einfrieren mit flüssigem Stickstoff, bei -80 °C, -20 °C. „Gefrorene
Proben" werden erfindungsgemäß mindestens bei einer Temperatur von 0 °C, vorzugsweise bei einer Temperatur von -10 °C, -15 °C, -20 °C oder niedriger gefroren, aufbewahrt, gelagert, transportiert .
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Satz von
Qualitätsindikatoren basierend auf kleinen Molekülen
bereitgestellt, der einen zuverlässigen Nachweis von
Unregelmäßigkeiten während der Lagerung und/oder dem Transport
von gefrorenem, vorzugsweise kryokonserviertem Gewebe ermöglicht. Dieser Satz von Qualitätsindikatoren beinhaltet Aminosäuren und biogene Amine (Methion (Met); Methionin- Sulfoxid (Met-SO) ; Leucin (Leu) ; das Methion/Taurin-Verhältnis (Met/Taurin) ; Tyrosin (Tyr) ; Prolin (Pro) ; asymmetrisches
Dimethylarginin (ADMA) ; Gesamt-Dimethylarginin (Gesamt-DMA) ; Kynurenin) , freies Carnitin und Acylcarnitine (freies Carnitin (CO); Acetylcarnitin (C2); Propionylcarnitin (C3);
Butyrylcarnitin/Isobutyrylcarnitin (C4); die Kombination:
(C2+C3)/C0), Phosphatidylcholine (Phosphatidylcholin mit
Diacylrestsumme C36:3 (PC aa C36:3); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:5 (PC aa C38:5); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:2 (PC aa C36:2); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:6 (PC aa C38:6); Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:3 (PC ae C42:3); Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C40:l (PC ae C40:l);
Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:2 (PC ae
C42:2)), Lysophosphatidylcholine (Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:3 (lysoPC a C20:3); Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:4 (lysoPC a C20:4);
Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:2
(lysoPC a C18:2); Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:l (lysoPC a C18:l)), Sphingomyeline ( Sphingomyelin mit Acylrestsumme C16:0 (SM C16:0); Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C18:0 (SM C18:0); Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C24:l (SM C24:l); Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C24:2 (SM C24:2); Hydroxysphingomyelin mit
Acylrestsumme C14:l (SM(OH) C14:l)), Prostaglandine
(Arachidonsäure (AA) ; Docosahexaensäure (DHA) ; 15 ( S ) -Hydroxy- 5Z, 8Z, HZ, 13E-eicosatetraensäure ( 15S-HETE) ) und
Glutathiondisulfid (GSSG) (Glycerophospholipide werden in Bezug auf das Vorhandensein von Ester- (a) und Ether- (e)
Bindungen in der Glycerolgruppe unterschieden, wobei zwei Buchstaben (aa, ea oder ee) angeben, dass die erste und die zweite Position des Glycerolgerüsts an einen Fettsäurerest gebunden sind, während ein einzelner Buchstabe (a oder e) eine Bindung mit nur einem Fettsäurerest anzeigt; z.B. gibt PC aa C24:0 ein Phosphatidylcholin mit 24 Kohlenstoffatomen in den beiden Fettsäureketten und ohne Doppelbindung in einer von ihnen an.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr möglich, zuverlässig nachzuweisen, ob eine bestimmte gefrorene, insbesondere kryokonservierte Gewebeprobe während der Lagerung oder dem Transport einer erhöhten Temperatur oder einem
Auftauprozess ausgesetzt war. Dieses Wissen kann verwendet werden, um zu entscheiden, ob eine Probe im Kontext von metabolomischen Untersuchungen verwendet werden kann, oder ob man bei der Datenanalyse besondere Sorgfalt walten lassen muss. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Qualitätsindikatoren für jede einzelne Probe zeigen können, ob die Probe die Qualität hat, um in metabolomischen Untersuchungen verwendet werden zu können. Auch kann dieses Wissen verwendet werden, um festzustellen, ob Gewebe zur
Verwendung als Lebensmittel noch tauglich ist, oder verworfen werden muss .
Die Qualitätsindikatoren gemäß der vorliegenden Erfindung sind natürliche Moleküle, von denen man weiß, dass sie an
biochemischen Prozessen im Gewebe beteiligt sind. Diese
Moleküle wurden jedoch bisher nicht als relevant für den
Nachweis von Auftauprozessen während einer Lagerung und/oder eines Transports von gefrorenem, insbesondere
kryokonserviertem Gewebe und dem damit zusammenhängenden Abbau der Gewebeprobe diskutiert.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Nachweisen von Auftauprozessen in einer gefrorenen, insbesondere kryokonservierten Probe, das dadurch
gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Substanz, die
ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methion (Met);
Methionin-Sulfoxid (Met-SO) ; Leucin (Leu) ; dem Methion/Taurin- Verhältnis (Met/Taurin) ; Tyrosin (Tyr) ; Prolin (Pro) ;
asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) ; Gesamt-Dimethylarginin ( Gesamt-DMA) ; Kynurenin; freiem Carnitin (CO); Acetylcarnitin (C2); Propionylcarnitin (C3);
Butyrylcarnitin/Isobutyrylcarnitin (C4); der Kombination:
(C2+C3)/C0); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:3 (PC aa C36:3); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:5 (PC aa C38:5); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:2 (PC aa C36:2); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:6 (PC aa C38:6); Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:3 (PC ae C42:3); Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C40:l (PC ae C40:l); Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:2 (PC ae C42:2); Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:3 (lysoPC a C20:3); Lysophosphatidylcholin mit
Acylrestsumme C20:4 (lysoPC a C20:4); Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:2 (lysoPC a C18:2);
Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:l
(lysoPC a C18:l); Sphingomyelin mit Acylrestsumme C16:0 (SM C16:0); Sphingomyelin mit Acylrestsumme C18:0 (SM C18:0);
Sphingomyelin mit Acylrestsumme C24:l (SM C24:l);
Sphingomyelin mit Acylrestsumme C24:2 (SM C24:2);
Hydroxysphingomyelin mit Acylrestsumme C14:l (SM(OH) C14:l); Arachidonsäure (AA) ; Docosahexaensäure (DHA) ; 15 ( S ) -Hydroxy- 5Z, 8Z, HZ, 13E-eicosatetraensäure (15S-HETE) und
Glutathiondisulfid (GSSG) , in der Probe nachgewiesen und quantifiziert wird und das Ergebnis dieser Quantifizierung mit
der Menge der mindestens einen nachgewiesenen und
quantifizierten Substanz in einer permanent gefrorenen, insbesondere kryokonservierten Gewebeprobe verglichen wird.
Die Ergebnisse der Quantifizierung der Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung werden mit dem Bezugsniveau
(Referenzprobe) der jeweils getesteten Substanzen verglichen, d.h. mit Niveaus, die repräsentativ sind für permanent
kryokonservierten Gewebeproben, oder mit Niveaus, die
repräsentativ sind für einen Auftauprozess in einer
kryokonservierten Gewebeprobe. In der Regel werden für die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung Bezugsniveaus angegeben, die einen Auftauprozess in einer Gewebeprobe anzeigen. Vorzugsweise werden die quantifizierten Niveaus für die Gewebeproben gemäß der vorliegenden Erfindung mit diesen bekannten Bezugsniveaus verglichen. Daher ist die Menge mindestens einer nachgewiesenen und quantifizierten Substanz in einer aufgetauten, zuvor kryokonservierten Gewebeprobe eine numerische Grenze für die Menge dieser Substanz. Vorzugsweise ist ein solches Bezugsniveau keine Stichprobe, sondern ein Durchschnittswert auf der Basis einer Probensammlung.
Die Bezugsniveaus (Referenzproben) , die im vorliegenden
Verfahren angewendet werden, können auch an bestimmte
Techniken angepasst werden, die verwendet werden, um Niveaus von Metaboliten (die den Qualitätsindikatoren entsprechen) in biologischen Proben zu messen (z.B. LC-MS, GC-MS usw.), wobei die Niveaus der Metaboliten je nach dem spezifischen
Verfahren, das verwendet wird, verschieden sein können. Die Festlegung solcher Bezugsniveaus für ein bestimmtes Verfahren ist für einen Fachmann ohne Weiteres möglich. Die Probenanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung kann anhand
beliebiger Verfahren durchgeführt werden, die für
metabolomische Analysen angewendet werden. Üblicherweise beinhalten diese Analysen die folgenden wichtigen Schritte, die einem Fachmann ohne Weiteres zur Verfügung stehen:
Zunächst müssen die Metaboliten aus der biologischen Quelle (Gewebeprobe) auf effiziente und ergebnisoffene Weise
extrahiert werden. Es muss besonders sorgfältig darauf geachtet werden, unerwünschte Prozesse (beispielsweise
Oxidation) in den Proben zu vermeiden oder diese Prozesse zumindest zu berücksichtigen, wenn diese Proben weiter
verarbeitet und analysiert werden. Dann können die Analyte abgetrennt werden, üblicherweise anhand von
chromatographischen Verfahren oder Elektrophorese,
insbesondere Kapillarelektrophorese, Flüssigchromatographie, insbesondere HPLC oder UPLC, oder Gaschromatographie. Der Nachweis, die Identifizierung und die Quantifizierung der Analyten werden üblicherweise durch Massenspektrometrie (MS) oder Kernspinresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie ) durchgeführt . LC- oder GC-MS sind die am stärksten bevorzugten Methoden für die Entwicklung von metabolischen Profilen. Außerdem
existieren Bibliotheken von massenspektralen Fingerabdrücken, oder können entwickelt werden, die eine Identifizierung und einen ( Interlabor- ) Vergleich eines Metaboliten gemäß seines Fragmentierungsmusters ermöglichen. MS ist empfindlich und kann auch sehr spezifisch sein. Es gibt auch eine Reihe von Studien, die MS als eigenständige Technik verwenden: die Probe wird ohne vorherige Abtrennung direkt in das
Massenspektrometer infundiert, und MS dient sowohl zur
Abtrennung als auch zum Nachweis von Metaboliten.
NMR beruht nicht auf einer Abtrennung der Analyten, und die
Probe kann somit für weitere Analysen wiedergewonnen werden. Alle Arten von niedermolekularen Metaboliten können
gleichzeitig gemessen werden - in diesem Sinne kommt NMR einem universalen Nachweis nahe. In der Praxis ist es jedoch relativ unempfindlich im Vergleich zu Verfahren auf Basis von
massenspektrometrischen Techniken; außerdem können NMR- Spektren von komplexen Mischungen sehr schwierig zu
interpretieren sein. MS und NMR sind mit Abstand die
meistverwendeten Techniken in der Metabolomik. Andere
Nachweisverfahren, die verwendet werden, sind unter anderem ein elektrochemischer Nachweis (gekoppelt an HPLC) , Radiolabel (in Kombination mit Dünnschicht-Chromatographie), chemische Modifizierungs-Assays (z.B. radioaktives Labeling) und
enzymatische Assays. Vorzugsweise wird die Probenanalyse in Bezug auf die Metaboliten gemäß der vorliegenden Erfindung durch Massenspektrometrie durchgeführt. Daher wird das
Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch Massenspektrometrie, vorzugsweise Flüssigchromatographie- Massenspektrometrie (LC-MS), insbesondere Hochleistungs- flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS) ,
Umkehrphasenflüssigchromatographie-Massenspektrometrie (RPLC- MS) oder Ultrahochleistungsflüssigchromatographie- Massenspektrometrie (UPLC-MS); Elektrosprayionisierungs- Massenspektrometrie (ESI-MS), Gaschromatographie- Massenspektrometrie (GC-MS) Atmosphärendruckionisations- Massenspektrometrie (atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry, APCI-MS), Kapillarelektrophorese- Massenspektrometrie (CE-MS), Tandem-Massenspektrometrie (MS- MS) oder Kombinationen dieser Massenspektrometrieverfahren nachgewiesen und quantifiziert.
Der Grad des Auftauens führte zu unterschiedlichen Ausmaßen und Richtungen der Konzentrationsänderungen der
Qualitätsindikatoren gemäß der vorliegenden Erfindung. Das bedeutet, dass eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Konzentrationsänderung der Substanzen gemäß der vorliegenden Erfindung in Gewebeproben und dem Grad des
Auftauprozesses besteht. Andernfalls, wenn die Konzentrationen dieser Verbindungen sich nicht verändert haben, waren die Gewebeproben permanent kryokonserviert , bevor sie analysiert wurden. Aufgrund ihres Verhaltens während des Auftauens können die Qualitätsindikatoren in drei Gruppen - Gruppe I, Gruppe II und Gruppe III - eingeteilt werden:
Gruppe I: Indikatorniveaus werden beim Auftauen höher.
Beispiele für Qualitätsindikatoren der Gruppe I sind:
asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) , Methion (Met),
Methionin-Sulfoxid (Met-SO) , Methionin/Taurin-Verhältnis
(Met/Taurine) , Kynurenin, Leucin (Leu) , Gesamt-Dimethylarginin (Gesamt-DMA) , Tyrosin (Tyr) , Prolin (Pro) , freies Carnitin (CO), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:3 (lysoPC a C20:3), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:4 (lysoPC a C20:4), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:2
(lysoPC a C18:2), Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:l (lysoPC a C18:l), Phosphatidylcholin mit Acyl- Alkylrestsumme C42:3 (PC ae C42:3), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C40:l (PC ae C40:l), Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:2 (PC ae C42:2), 15 ( S ) -Hydroxy- 5Z, 8Z, HZ, 13E-eicosatetraensäure (15S-HETE), Arachidonsäure (AA) , Docosahexaensäure (DHA) .
Gruppe II: Indikatorniveaus werden zu Anfang des Auftauens höher und fallen anschließend ab. Beispiele für
Qualitätsindikatoren der Gruppe II sind: Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:3 (PC aa C36:3), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:5 (PC aa C38:5), Phosphatidylcholin
mit Diacylrestsumme C36:2 (PC aa C36:2), Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:6 (PC aa C38:6), Sphingomyelin mit Acylrestsumme C18:0 (SM C18:0), Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C16:0 (SM C16:0), Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C24:l (SM C24:l), Sphingomyelin mit
Acylrestsumme C24:2 (SM C24:2), Hydroxysphingomyelin mit
Acylrestsumme C14:l (SM (OH) C14:l), Glutathiondisulfid
(GSSG) .
Gruppe III: Indikatorniveaus sinken nach dem Auftauen.
Beispiele für Qualitätsindikatoren der Gruppe III sind:
Butyrylcarnitin/Isobutyrylcarnitin (C4), Acetylcarnitin (C2), Propionylcarnitin (C3), Kombination (C2+C3)/C0
Jeder Qualitätsindikator gemäß der vorliegenden Erfindung kann eigenständig (d.h. ohne die Notwendigkeit anderer Marker) verwendet werden, um Auftauprozesse gemäß der vorliegenden Erfindung nachzuweisen. Aufgrund der Möglichkeiten von
Massenspektrometern ist es jedoch sehr einfach, mehr als einen Marker in einer Probe zu analysieren. Dadurch ist eine noch zuverlässigere und empfindlichere Bestimmung der molekularen Qualität möglich. Durch Kombinieren von Qualitätsindikatoren aus der Gruppe II mit Indikatoren aus der Gruppe I und/oder der Gruppe III ist somit eine genauere Identifizierung von teilweise aufgetauten Gewebeproben möglich. Dementsprechend ist es bevorzugt, mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, insbesondere mindestens vier der Substanzen zu
bestimmen, zu quantifizieren und zu vergleichen. Noch stärker bevorzugt werden mindestens fünf, vorzugsweise mindestens zehn, insbesondere vierunddreißig der Metaboliten gemäß der vorliegenden Erfindung analysiert. Demgemäß gilt in einer bevorzugten Ausführungsform des
vorliegenden Verfahrens die Gewebeprobe als aufgetaut, wenn mindestens eine Substanz in einer Menge enthalten ist, die in Bezug auf die Menge dieser Substanz in einer permanent
kryokonservierten Gewebeprobe um mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 100 %, noch stärker bevorzugt mindestens 200 % erhöht /erniedrigt ist. Einige der Qualitätsindikatoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, weisen wesentlich höher-fachige-Unterschiede (im Vergleich zu den permanent kryokonservierten Proben) auf. Jede bevorzugte
Kombination aus Qualitätsindikatormessungen gemäß der
vorliegenden Erfindung kann auf Basis der hier angegebenen Informationen ausgearbeitet werden. Eine Optimierung in Bezug auf Empfindlichkeit, Aussagekraft, Spezifität usw. kann von einem Fachmann vorgenommen werden. Dabei sind die hierin enthaltenen Daten, insbesondere gemäß der Offenbarung im
Beispielsabschnitt, besonders hilfreich.
Wenn die Menge (n) oder das bzw. die Niveau (s) von einem oder mehreren Metaboliten in der Gewebeprobe bestimmt wird
(werden), kann (können) diese Menge (n) oder diese (s) Niveau (s) mit Bezugsniveaus, z.B. Referenzproben von aufgetauten Geweben verglichen werden, um bei der Identifizierung von
Auftauprozessen zu helfen oder um festzustellen, ob die Probe aufgetaut worden ist. In diesem Zusammenhang darf man nicht vergessen, dass biologische Messungen immer natürliche
Variationen zeigen, die mit geeigneten Kalibrierungen der einzelnen Systeme in den Griff gebracht werden müssen. Daher ist die Feststellung objektiver Werte häufig problematisch, während relative Unterschiede zwischen aufgetauten/permanent tiefgefrorenen Gruppen für ein bestimmtes Verfahren und/oder eine bestimmte Apparatureinrichtung leicht erhalten werden können, ohne dass objektive Standardwerte erforderlich wären, die unabhängig vom Nachweis- und Quantifizierungsinstrument
sind .
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist in einer bevorzugten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich unter Verwendung von Software-basierten
statistischen und bioinformatischen Datenanalysen durchgeführt wird .
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Massenspektrometers zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens durch Messen eines oder mehrerer (oder aller) Metaboliten gemäß der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung. Der Kit gemäß der vorliegenden Erfindung weist beispielsweise auf: · ein Massenspektrometer ,
• eine Standardprobe, die eine bekannte Menge mindestens einer Substanz aus der Gruppe von Qualitätsindikatoren gemäß der vorliegenden Erfindung (und somit einen bekannten Status in Bezug auf die molekulare Qualität) enthält, und · eine Gewebeprobe, die eine unbekannte Menge mindestens einer Substanz aus der Gruppe der Qualitätsindikatoren gemäß der vorliegenden Erfindung enthält.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Kit der vorliegenden Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine oder mehrere der folgenden Komponenten aufweist:
Qualitätskontrollproben, Analytenstandards , interne Standards oder Datenanalyse-Software.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung der molekularen Qualität einer
kryokonservierten Gewebeprobe, das dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Substanz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methionin (Met); Methionin-Sulfoxid (Met- SO) ; Leucin (Leu) ; Methionin/Taurin-Verhältnis (Met/Taurine) ; Tyrosin (Tyr) ; Prolin (Pro) ; asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) ; Gesamt-Dimethylarginin (Gesamt-DMA) ; Kynurenin; freiem Carnitin (CO); Acetylcarnitin (C2); Propionylcarnitin (C3); Butyrylcarnitin/Isobutyrylcarnitin (C4); Kombination:
(C2+C3)/C0); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:3 (PC aa C36:3); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:5 (PC aa C38:5); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C36:2 (PC aa C36:2); Phosphatidylcholin mit Diacylrestsumme C38:6 (PC aa C38:6); Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:3 (PC ae C42:3); Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C40:l (PC ae C40:l); Phosphatidylcholin mit Acyl-Alkylrestsumme C42:2 (PC ae C42:2); Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C20:3 (lysoPC a C20:3); Lysophosphatidylcholin mit
Acylrestsumme C20:4 (lysoPC a C20:4); Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:2 (lysoPC a C18:2);
Lysophosphatidylcholin mit Acylrestsumme C18:l
(lysoPC a C18:l); Sphingomyelin mit Acylrestsumme C16:0 (SM C16:0); Sphingomyelin mit Acylrestsumme C18:0 (SM C18:0);
Sphingomyelin mit Acylrestsumme C24:l (SM C24:l);
Sphingomyelin mit Acylrestsumme C24:2 (SM C24:2);
Hydroxysphingomyelin mit Acylrestsumme C14:l (SM(OH) C14:l); Arachidonsäure (AA) ; Docosahexaensäure (DHA) ; 15 ( S ) -Hydroxy- 5Z, 8Z, HZ, 13E-eicosatetraensäure (15S-HETE) und
Glutathiondisulfid (GSSG) , in der Probe nachgewiesen und quantifiziert wird und das Ergebnis dieser Quantifizierung mit der Menge der mindestens einen nachgewiesenen und
quantifizierten Substanz in einer entsprechenden Probe mit bekannter molekularer Qualität verglichen wird.
Bei der wachsenden Zahl von Forschern, die einen Bedarf an humanem Gewebe für Forschungszwecke haben, und der zunehmenden Verwendung von Mikro-Arrays und molekularem Profiling mit hohem Durchsatz, um erkranktes Gewebe zu bewerten, ist es wichtig, den Forschern Informationen über die molekulare
Qualität des Gewebes zur Verfügung zu stellen. Mehrere
Faktoren, unter anderem der Probentyp, eine Hypoxie vor der Exzision, die Konservierungsbehandlung der Probe, das
Extraktionsverfahren, die Art und Dauer der Lagerung sowie Gefrier- und Auftaufaktoren beeinflussen die molekulare
Qualität des Gewebes (zitiert nach Jewell et al 2002) .
Einfrieren ist ein schonendes Verfahren zur Konservierung von Fleisch, Geflügel und Fisch. Der Verlust an Vitaminen und Nährstoffen ist im Vergleich zu anderen
Konservierungsverfahren selbst nach Monaten noch sehr gering. Jedoch fördert eine nicht ordnungsgemäße Lagerung (Antauen nach einer Unterbrechung der Kühlkette) mikrobielles Wachstum, das durch Wasserexsudation aus dem Gewebe während des
Auftauens beschleunigt wird. Große Mengen von Pathogenen können zu Morbidität und Mortalität führen. Zum Schutz des Verbrauchers müssen gefrorene Lebensmittel immer gefroren bleiben, und eine Überwachung des Gefrierzustands ist
empfohlen. Wegen der offensichtlichen Ähnlichkeiten der
Prozesse können die Marker gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur für den Nachweis eines Auftauens in Gewebeproben verwendet werden, die beispielsweise in Biobanken gelagert werden, sondern auch für den Nachweis eines Auftauens in vorzugsweise rohem, oder auch verarbeiteten, gefrorenem
Fleisch, Geflügel oder Fisch.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Beispiel 1: Gewinnung und Verarbeitung von Gewebeproben
Die Lebergewebeproben wurden durch die Medizinische
Universität Graz (Graz, Österreich) gewonnen, und der
Stabilitätsversuch wurde am Fraunhofer Institut für
Biomedizinische Technik IBMT (St. Ingbert, Deutschland), durchgeführt. Normales humanes Lebergewebe (ca. 10 g) wurde durch chirurgische Resektion von Leberteilen, die von
Tumormetastasen befallen waren, erhalten, wobei darauf geachtet wurde, nur nicht-tumoröses Material zu verwenden. Die Verwendung von humanem Material für diesen Zweck war von der Biobank der Medizinischen Universität Graz, implizit vom
Ethikausschuss der Medizinischen Universität Graz und durch Einverständniserklärung des Spenders genehmigt. Das Gewebe wurde dann in Würfel von etwa 200 mg geschnitten, die in
Isopentan schockgefroren wurden, das in flüssigem Stickstoff vorgekühlt worden war. Die gefrorenen Gewebewürfel wurden in
Kryoröhrchen überführt, die in flüssigem Stickstoff vorgekühlt worden waren, und anschließend in flüssigem Stickstoff gelagert, bis sie für die Versuche verschickt wurden. Der Transport wurde in einer Trockenverpackung, einem sogenannten Dry-Shipper durchgeführt, der vorab mit flüssigem Stickstoff beschickt worden war, und in dem die Proben während des
Transports in einer kalten Stickstoffatmosphäre (-130 0 bis - 150 °C) gehalten wurden. Bei Ankunft am Ziel (nach ca. 24 h) wurden die Proben bis zur Versuchsdurchführung in gasförmigen Stickstoff über Flüssigphase (-160°C) überführt. Als Teil des
Stabilitätsversuchs gab es drei Gruppen von Proben: (a) Die Gewebeproben wurden bis zur chemischen Analyse an der
Biocrates Life Sciences AG (Innsbruck, Österreich) permanent bei -196 °C gelagert, (b) die Proben wurden einmal von -196 °C auf ca. -5 °C erwärmt und dann bis zur Analyse wieder
bei -196 °C gelagert, (c) die Proben wurden einmal von -196 °C auf ca. +10 °C erwärmt und dann bis zur Analyse wieder bei - 196 °C gelagert.
Beispiel 2: Allgemeine Analytik
Die Probenvorbereitung und die metabolomischen Analysen wurden durch die BIOCRATES Life Sciences AG, Innsbruck, Österreich, durchgeführt. Eine multiparametrische, sehr robuste,
metabolomische Target-Plattform mit hohem Durchsatz, die aus Fließinjektionsanalyse (FIA) -MS/MS- und LC-MS/MS-Verfahren bestand, wurde für die gleichzeitige Quantifizierung eines breiten Bereichs von endogenen Zwischenstufen verwendet, und zwar aus dem Panel, das in Tabelle 1 offenbart ist. Alle
Vorgehensweisen (Probenhandhabung, Analytik) wurden von
Mitarbeitern durchgeführt, die für die Gruppen geblindet waren .
Beispiel 3: Homogenisierung von Geweben
Die gefrorenen Lebergewebeproben wurden in 2,0 ml fassende Precellys-Röhrchen (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland) eingewogen, die mit keramischen Kügelchen
ausgestattet waren. Homogenate wurden durch Zufügen von
EtOH/0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5 (85:15), zu der Gewebeprobe im Verhältnis 3:1 (Gew. /Vol.) hergestellt. Der Precellys-24-
Homogenisator (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland) nutzt eine Bewegung, die eine 8 beschreibt, um die Kügelchen schnell herumzuwirbeln, um bis zu 24 Proben auf einmal temperaturgesteuert (0 - 4 °C) mit dem folgenden
Programm zu zerkleinern (Frequenz, Zyklen, Zyklusdauer, Pause zwischen Zyklen) : 5800 UpM, 3 x 30 Sekunden, 25 s. Die
Homogenate wurden bei 18000g bei 2 °C 5 Minuten lang
zentrifugiert , die resultierenden Überstände wurden in ein Kryoröhrchen (1,5 ml, Biozym, Oldendorf, Deutschland)
pipettiert und sofort analysiert, um einen Abbau der Analyten zu vermeiden.
Beispiel 4: Acylcarnitine, Sphingomyeline, Hexosen,
Glycerophospholipide (FIA-MS/MS) Um die Konzentration von Acylcarnitinen, Sphingomyelinen und Glycerophospholipiden in Leberhomogenisat zu bestimmen, wurde das AbsolutelDQ Kit pl50 (Biocrates Life Sciences AG)
vorbereitet wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Kurz zusammengefasst wurden 10 μΐ Leberhomogenat in die Mitte des Filters auf der oberen, 96 Mulden aufweisenden Platte des Kits gegeben, und die Proben wurden unter Verwendung eines
Stickstoffverdampfers (VLM Laboratories) getrocknet.
Anschließend wurden 20 μΐ einer 5%-igen Phenylisothianatlösung zur Derivatisierung zugegeben. Nach einer Inkubation wurden die Filterspots erneut unter Verwendung eines Verdampfers getrocknet. Die Metaboliten wurden unter Verwendung von 300 μΐ einer 5 mM Ammoniumacetatlösung in Methanol extrahiert. Die Extrakte wurden durch Zentrifugation in die untere, 96 tiefe Mulden aufweisende Platte erhalten, gefolgt von einem
Verdünnungsschritt mit 600 μΐ des fließenden MS-Lösungsmittels
des Kits. Eine Massenspektrometrieanalyse wurde auf einem API4000 QTrap®-Tandem-Massenspektrometrieinstrument (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies), das mit einer
Elektrosprayionisierungs-Quelle (ESI) ausgestattet war, unter Anwendung des Analyse-Aufnahmeverfahrens , das in dem
AbsolutelDQ-Kit bereitgestellt wird, durchgeführt. Das
Standard-FIA-MS/MS-Verfahren wurde für alle Messungen mit zwei aufeinander folgenden 20 μΐ-ΐη ektionen (eine für eine
positive und eine für eine negative Analyse) angewendet. Ein Multiple-Reaction-Monitoring (MRM) -Nachweis wurde zur
Quantifizierung verwendet, wobei der Spektren- Parseralgorithmus, der in die Met IQ-Software (Biocrates Life Sciences AG) integriert ist, angewendet wurde.
Konzentrationswerte für 148 Metaboliten (alle Analyten mit dem metabolomischen Kit bestimmt, außer den Aminosäuren, die anhand eines anderen Verfahrens bestimmt wurden) , die durch interne Kalibrierung erhalten wurden, wurden für eine
umfassende statistische Analyse exportiert.
Beispiel 5: Aminosäuren, biogene Amine (LC-MS/MS)
Aminosäuren und biogene Amine wurden durch Umkehrphasen-LS- MS/MS quantitativ analysiert, um eine chromatographische
Trennung von isobaren (gleiche MRM-Ionenpaare ) Metaboliten für eine individuelle quantitative Bestimmung zu erhalten, die durch eine externe Kalibrierung und unter Verwendung von internen Standards durchgeführt wurde. Ein Probenvolumen von 10 μΐ (Gewebehomogenat ) ist für die Analyse unter Befolgung der folgenden Probenpräparationsprozedur erforderlich. Die Proben wurden auf Filterspots gegeben, die in eine 96
Solvinert-Mulden aufweisende Platte eingebracht wurden (zuvor
wurden interne Standards eingebracht und unter Stickstoff getrocknet), die über einer Platte mit 96 tiefen Mulden
(Sammelplatte) fixiert war. 20 μΐ 5%-iges Phenylisothiocyanat- Derivatisierungsreagens wurden zugegeben. Die derivatisierten Proben wurden nach der Inkubation durch wässriges Methanol in die Sammelplatte extrahiert. Probenextrakte wurden mittels LC- ESI-MS/MS im positiven MRM-Erfassungsmodus mit einem API4000 QTrap®-Tandem-MassenspektrometrieInstrument (Applied
Biosystems/MDS Analytical Technologies) analysiert. Die analysierten individuellen Metabolitenkonzentrationen (Analyst 1.4.2-Software, Applied Biosystems) wurden für eine umfassende statistische Analyse exportiert.
Beispiel 6: Prostanoide, oxidierte Fettsäuren (LC-MS/MS) Prostanoide - ein Begriff, der Prostaglandine (PG) ,
Thromboxane (TX) und Prostacycline zusammenfasst - und aus oxidierten Fettsäuren bestehende Metaboliten wurden in
Gewebehomogenatextrakten mittels LC-ESI-MS/MS (Unterwurzacher et al., 2008) durch Online-Festphasenextraktion (SPE) -LC-MS/MS mit einem API4000 QTrap®-Tandem-Massenspektrometrieinstrument (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies) im negativen MRM-Nachweismodus analysiert. Kurz zusammengefasst wurden Filterspots in einer Platte mit 96 Mulden mit internem
Standard gespiket; 20 μΐ Gewebehomogenate wurden hinzugefügt und mit wässrigem Methanol extrahiert, dann wurden die
einzelnen Extrakte analysiert. Daten von Prostanoiden und oxidierten Fettsäuren wurden mit Analyst 1.4.2-Software
(Applied Biosystems) quantifiziert und schließlich für eine statistische Analyse exportiert.
Beispiel 7: Glutathion and Glutathiondisulfid (LC-MS/MS)
Glutathion and Glutathiondisulfid wurden mittels LC/MS/MS unter Verwendung eines API 5500®-Massenspektrometers (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies) analysiert. Glutathion wurde als das alkylierte Iodacetamid-Addukt nachgewiesen, da eine Bildung dieser Spezies verhinderte, dass während der Probenverarbeitung eine GSH-Oxidation stattfand. Nach einer chromatographischen Trennung wurden die Analyten durch
Elektrosprayionisierungs-Tandemmassenspektrometrie mit
positiven Ionen im Multiple-Reaction-Monitoring-Modus unter Verwendung einer Kalibrierung mit internen Standards
quantifiziert. Die Konzentrationen der analysierten einzelnen Metaboliten (Analyst 1.5.1-Software, Applied Biosystems) wurden für eine umfassende statistische Analyse exportiert.
Tabelle 1: Untersuchte Metaboliten (Qualitätsindikatoren)
Name Familie Gemeinsamer Metabolit (Qualitätsindikator)
CO Ac.Ca. Carnitine (free)
C10 Ac.Ca. Decanoylcarnitine [Caprylcarnitine] (Fumarylcarnitine)
C10:1 Ac.Ca. Decenoylcarnitine
C10:2 Ac.Ca. Decadienoylcarnitine
C12 Ac.Ca. Dodecanoylcarnitine [Laurylcarnitine]
C12-DC Ac.Ca. Dodecanedioylcarnitine
C12:1 Ac.Ca. Dodecenoylcarnitine
C14 Ac.Ca. Tetradecanoylcarnitine
C14:1 Ac.Ca. Tetradecenoylcarnitine [Myristoleylcarnitine]
C14:1 -OH Ac.Ca. 3-Hydroxytetradecenoylcarnitine [3-Hydroxymyristoleylcarnitine]
C14:2 Ac.Ca. Tetradecadienoylcarnitine
C14:2-OH Ac.Ca. 3-Hydroxytetradecadienoylcarnitine
C16 Ac.Ca. Hexadecanoylcarnitine [Palmitoylcarnitine]
C16-OH Ac.Ca. 3-Hydroxyhexadecanolycarnitine [3-Hydroxypalmitoylcarnitine]
C16:1 Ac.Ca. Hexadecenoylcarnitine [Palmitoleylcarnitine]
C16:1 -OH Ac.Ca. 3-Hydroxyhexadecenoylcarnitine [3-Hydroxypalmitoleylcarnitine^
C16:2 Ac.Ca. Hexadecadienoylcarnitine
C16:2-OH Ac.Ca. 3-Hydroxyhexadecadienoylcarnitine
C18 Ac.Ca. Octadecanoylcarnitine [Stearylcarnitine]
C18:1 Ac.Ca. Octadecenoylcarnitine [Oleylcarnitine]
C18:1 -OH Ac.Ca. 3-Hydroxyoctadecenoylcarnitine [3-Hydroxyoleylcarnitine]
C18:2 Ac.Ca. Octadecadienoylcarnitine [Linoleylcarnitine]
C2 Ac.Ca. Acetylcarnitine
C3 Ac.Ca. Propionylcarnitine
C3-OH Ac.Ca. Hydroxypropionylcarnitine
C3:1 Ac.Ca. Propenoylcarnitine
C4 Ac.Ca. Butyrylcarnitine / Isobutyrylcarnitine
C4-OH (C3-DC) Ac.Ca. 3-Hydroxybutyrylcarnitine / Malonylcarnitine
C4:1 Ac.Ca. Butenoylcarnitine
C5 Ac.Ca. Isovalerylcarnitine / 2-Methylbutyrylcarnitine / Valerylcarnitine
C5-DC (C6-OH) Ac.Ca. Glutarylcarnitine / Hydroxycaproylcarnitine
C5-M-DC Ac.Ca. Methylglutarylcarnitine
C5-OH(C3-DC-M) Ac.Ca. 3-Hydroxyisovalerylcarnitine / 3-Hydroxy-2-methylbutyryl
C5:1 Ac.Ca. Tiglylcarnitine / 3-Methyl-crotonylcarnitine
C5:1 -DC Ac.Ca. Tiglylcarnitine / 3-Methyl-crotonylcarnitine
C6 (C4:1 -DC) Ac.Ca. Hexanoylcarnitine [Caproylcarnitine]
C6:1 Ac.Ca. Hexenoylcarnitine
C7-DC Ac.Ca. Pimelylcarnitine
C8 Ac.Ca. Octanoylcarnitine [Caprylylcarnitine]
C8:1 Ac.Ca. Octenoylcarnitine
C9 Ac.Ca. Nonoylcarnitine [Pelargonylcarnitine]
SM (OH) C14:1 S.L Sphingomyelin with acyl residue sum (OH) C14:1
SM (OH) C16:1 S.L Sphingomyelin with acyl residue sum (OH) C16:1
SM (OH) C22:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum (OH) C22:1
SM (OH) C22:2 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum (OH) C22:2
SM (OH) C24:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum (OH) C24:1
SM C26:0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C26:0
SM C26:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C26:1
PC aa C24:0 GP.L Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C24:0
PC aa C26:0 GP.L Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C26:0
PC aa C28:1 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C28:1
PC aa C32:3 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C32:3
PC aa C34:4 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C34:4
PC aa C36:6 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C36:6
PC aa C38:0 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C38:0
PC aa C40:1 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C40:1
PC aa C40:2 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C40:2
PC aa C40:3 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C40:3
PC aa C42:0 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C42:0
PC aa C42:1 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C42:1
PC aa C42:2 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C42:2
PC aa C42:4 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C42:4
PC aa C42:5 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C42:5
PC aa C42:6 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C42:6
PC ae C30:0 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C30:0
PC ae C30:1 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C30:1
PC ae C30:2 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C30:2
PC ae C32:2 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C32:2
PC ae C36:0 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C36:0
PC ae C38:0 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C38:0
PC ae C40:0 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C40:0
PC ae C40:1 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C40:1
PC ae C40:2 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C40:2
PC ae C40:3 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C40:3
PC ae C40:4 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C40:4
PC ae C40:6 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C40:6
PC ae C42:0 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C42:0
PC ae C42:1 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C42:1
PC ae C42:2 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C42:2
PC ae C42:3 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C42:3
PC ae C42:4 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C42:4
PC ae C42:5 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C42:5
PC ae C44:3 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C44:3
PC ae C44:4 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C44:4
PC ae C44:5 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C44:5
PC ae C44:6 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C44:6 lysoPC a C14:0 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C14:0
lysoPC a C16:1 GP.L Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C16:1 lysoPC a C17:0 GP.L Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C17:0 lysoPC a C20:3 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C20:3 lysoPC a C24:0 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C24:0 lysoPC a C26:0 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C26:0 lysoPC a C26:1 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C26:1 lysoPC a C28:0 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C28:0 lysoPC a C28:1 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C28:1 lysoPC a C6:0 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C6:0
Gly Am.Ac. Glycine
Ala Am.Ac. Alanine
Ser Am.Ac. Serine
Pro Am.Ac. Proline
Val Am.Ac. Valine
Thr Am.Ac. Threonine
Leu Am.Ac. Leucine
lle Am.Ac. Isoleucine
Asn Am.Ac. Asparagine
Asp Am.Ac. Aspartate
Gin Am.Ac. Glutamine
Glu Am.Ac. Glutamate
Met Am.Ac. Methionine
His Am.Ac. Histidine
Phe Am.Ac. Phenylalanine
Arg Am.Ac. Arginine
Cit Am.Ac. Citrulline
Tyr Am.Ac. Tyrosine
Trp Am.Ac. Tryptophan
Orn Am.Ac. Ornithine
Lys Am.Ac. Lysine
ADMA B.Am. asymmetrical Dimethylarginin
totalDMA B.Am. Total dimethylarginine: sum ADMA + SDMA
Met-SO Am.Ac. Methionine-Sulfoxide
Kynurenine B.Am. Kynurenine
Putrescine B.Am. Putrescine
Spermidine B.Am. Spermidine
Spermine B.Am. Spermine
Creatinine B.Am. Creatinine
13S-HODE P.G. 13(S)-hydroxy-9Z, 1 1 E-octadecadienoic acid
12S-HETE P.G. 12(S)-hydroxy-5Z,8Z,10E, 14Z-eicosatetraenoic acid
15S-HETE P.G. 15(S)-hydroxy-5Z,8Z,1 1 Z, 13E-eicosatetraenoic acid
LTB4 P.G. Leukotriene B4
DHA P.G. Docosahexaenoic acid
PGE2 P.G. Prostaglandin E2
PGD2 P.G. Prostaglandin D2
AA P.G. Arachidonic acid
Lac En. Met. Lactate
Suc En. Met. Succinic acid (succite)
Hex En. Met. Hexose pool
PE a C16:0 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with acyl residue sum C16:0
PE a C18:0 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with acyl residue sum C18:0
PE a C18:1 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with acyl residue sum C18:1
PE a C18:2 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with acyl residue sum C18:2
PE a C20:4 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with acyl residue sum C20:4
PE a C22:4 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with acyl residue sum C22:4
PE a C22:5 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with acyl residue sum C22:5
PE a C22:6 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with acyl residue sum C22:6
PE e C18:0 GP.L. Lysophosphatidylethanolamine with alkyl residue sum C18:0
PG e C14:2 GP.L. Lysophosphatidylglycerol with alkyl residue sum C14:2
PE aa C20:0 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C20:0
PE aa C22:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C22:2
PE aa C26:4 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C26:4
PE aa C28:4 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C28:4
PE aa C28:5 GP.L Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C28:5
PE aa C34:0 GP.L Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C34:0
PE aa C34:1 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C34:1
PE aa C34:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C34:2
PE aa C34:3 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C34:3
PE aa C36:0 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C36:0
PE aa C36:1 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C36:1
PE aa C36:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C36:2
PE aa C36:3 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C36:3
PE aa C36:4 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C36:4
PE aa C36:5 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C36:5
PE aa C38:0 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C38:0
PE aa C38:1 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C38:1
PE aa C38:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C38:2
PE aa C38:3 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C38:3
PE aa C38:4 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C38:4
PE aa C38:5 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C38:5
PE aa C38:6 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C38:6
PE aa C38:7 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C38:7
PE aa C40:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C40:2
PE aa C40:3 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C40:3
PE aa C40:4 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C40:4
PE aa C40:5 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C40:5
PE aa C40:6 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C40:6
PE aa C40:7 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C40:7
PE aa C48:1 GP.L. Phosphatidylethanolamine with diacyl residue sum C48:1
PE ae C34:1 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C34:1
PE ae C34:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C34:2
PE ae C34:3 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C34:3
PE ae C36:1 GP.L Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C36:1
PE ae C36:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C36:2
PE ae C36:3 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C36:3
PE ae C36:4 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C36:4
PE ae C36:5 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C36:5
PE ae C38:1 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C38:1
PE ae C38:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C38:2
PE ae C38:3 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C38:3
PE ae C38:4 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C38:4
PE ae C38:5 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C38:5
PE ae C38:6 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C38:6
PE ae C40:1 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C40:1
PE ae C40:2 GP.L Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C40:2
PE ae C40:3 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C40:3
PE ae C40:4 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C40:4
PE ae C40:5 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C40:5
PE ae C40:6 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C40:6
PE ae C42:1 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C42:1
PE ae C42:2 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C42:2
PE ae C46:5 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C46:5
PE ae C46:6 GP.L. Phosphatidylethanolamine with acyl-alkyl residue sum C46:6
PG aa C30:0 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C30:0
PG aa C32:0 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C32:0
PG aa C32:1 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C32:1
PG aa C33:6? GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C33:6?
PG aa C34:0 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C34:0
PG aa C34:1 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C34:1
PG aa C34:2 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C34:2
PG aa C34:3 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C34:3
PG aa C36:0 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C36:0
PG aa C36:1 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C36:1
PG aa C36:2 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C36:2
PG aa C36:3 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C36:3
PG aa C36:4 GP.L. Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C36:4
PG aa C38:5 GP.L Phosphatidylglycerol with diacyl residue sum C38:5
PG ae C32:0 GP.L Phosphatidylglycerol with acyl-alkyl residue sum C32
PG ae C34:0 GP.L. Phosphatidylglycerol with acyl-alkyl residue sum C34
PG ae C34:1 GP.L. Phosphatidylglycerol with acyl-alkyl residue sum C34
PG ae C36:1 GP.L. Phosphatidylglycerol with acyl-alkyl residue sum C36
PS aa C34:1 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C34:1
PS aa C34:2 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C34:2
PS aa C36:0 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C36:0
PS aa C36:1 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C36:1
PS aa C36:2 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C36:2
PS aa C36:3 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C36:3
PS aa C36:4 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C36:4
PS aa C38:1 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C38:1
PS aa C38:2 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C38:2
PS aa C38:3 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C38:3
PS aa C38:4 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C38:4
PS aa C38:5 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C38:5
PS aa C40:1 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C40:1
PS aa C40:2 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C40:2
PS aa C40:3 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C40:3
PS aa C40:4 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C40:4
PS aa C40:5 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C40:5
PS aa C40:6 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C40:6
PS aa C40:7 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C40:7
PS aa C42:1 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C42:1
PS aa C42:2 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C42:2
PS aa C42:4 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C42:4
PS aa C42:5 GP.L. Phosphatidylserine with diacyl residue sum C42:5
PS ae C34:2 GP.L. Phosphatidylserine with acyl-alkyl residue sum C34:2
PS ae C36:1 GP.L. Phosphatidylserine with acyl-alkyl residue sum C36:1
PS ae C36:2 GP.L. Phosphatidylserine with acyl-alkyl residue sum C36:2
PS ae C38:4 GP.L. Phosphatidylserine with acyl-alkyl residue sum C38:4
SM C14:0 S.L Sphingomyelin with acyl residue sum C14:0
SM C16:0 S.L Sphingomyelin with acyl residue sum C16:0
SM C16:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C16:1
SM C17:0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C17:0
SM C18:0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C18:0
SM C18:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C18:1
SM C19:0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C19:0
SM C19:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C19:1
SM C19:2 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C19:2
SM C20:0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C20:0
SM C20:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C20:1
SM C20:2 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C20:2
SM C21 :0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C21 :0
SM C21 :1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C21 :1
SM C21 :2 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C21 :2
SM C21 :3 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C21 :3
SM C22:0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C22:0
SM C22:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C22:1
SM C22:2 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C22:2
SM C22:3 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C22:3
SM C23:0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C23:0
SM C23:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C23:1
SM C23:2 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C23:2
SM C23:3 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C23:3
SM C24:0 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C24:0
SM C24:1 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C24:1
SM C24:2 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C24:2
SM C24:3 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C24:3
SM C24:4 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C24:4
SM C26:3 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C26:3
SM C26:4 S.L. Sphingomyelin with acyl residue sum C26:4
SM C3:0 S.L Sphingomyelin with acyl residue sum C3:0 lysoPC a C16:0 GP.L Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C16:0 lysoPC a C18:0 GP.L Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C18:0 lysoPC a C18:1 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C18:1 lysoPC a C18:2 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C18:2 lysoPC a C20:4 GP.L. Lysophosphatidylcholine with acyl residue sum C20:4
PC e C18:0 GP.L. Lysophosphatidylcholine with alkyl residue sum C18:0
PC aa C30:0 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C30:0
PC aa C30:1 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C30:1
PC aa C30:2 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C30:2
PC aa C32:0 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C32:0
PC aa C32:1 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C32:1
PC aa C32:2 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C32:2
PC aa C34:0 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C34:0
PC aa C34:1 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C34:1
PC aa C34:2 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C34:2
PC aa C34:3 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C34:3
PC aa C36:0 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C36:0
PC aa C36:1 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C36:1
PC aa C36:2 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C36:2
PC aa C36:3 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C36:3
PC aa C36:4 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C36:4
PC aa C36:5 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C36:5
PC aa C38:1 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C38:1
PC aa C38:2 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C38:2
PC aa C38:3 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C38:3
PC aa C38:4 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C38:4
PC aa C38:5 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C38:5
PC aa C38:6 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C38:6
PC aa C40:4 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C40:4
PC aa C40:5 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C40:5
PC aa C40:6 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C40:6
PC aa C40:7 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C40:7
PC aa C40:8 GP.L. Phosphatidylcholine with diacyl residue sum C40:8
PC ae C32:0 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C32:0
PC ae C32:1 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C32:1
PC ae C32:6 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C32:6
PC ae C34:0 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C34:0
PC ae C34:1 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C34:1
PC ae C34:2 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C34:2
PC ae C34:3 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C34:3
PC ae C34:6 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C34:6
PC ae C36:1 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C36:1
PC ae C36:2 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C36:2
PC ae C36:3 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C36:3
PC ae C36:4 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C36:4
PC ae C36:5 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C36:5
PC ae C38:1 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C38:1
PC ae C38:2 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C38:2
PC ae C38:3 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C38:3
PC ae C38:4 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C38:4
PC ae C38:5 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C38:5
PC ae C38:6 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C38:6
PC ae C40:5 GP.L. Phosphatidylcholine with acyl-alkyl residue sum C40:5
Histamine B.Am. Histamine
Serotonin B.Am. Serotonin
Phenylethyla B.Am. Phenylethylamine
TXB2 P.G. Tromboxane B2
PGF2a P.G. Prostaglandin F2alpha
SDMA B.Am. Symmetrical Dimethylarginine
OH-kynurenine B.Am. Hydroxykynurenine
9S-HODE P.G. (±)9-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic acid
14(15)-EpETE P.G. (±)14(15)-epoxy-5Z,8Z,1 1 Z, 17Z-eicosatetraenoic acid
15S-HpETE P.G. 15(S)- hydroperoxy-5Z,8Z, 1 1 Z, 13E-eicosatetraenoic acid
5S-HpETE P.G. 5(S)-hydroperoxy-6E,8Z,1 1 Z, 14Z-eicosatetraenoic acid
LTD4 P.G. Leukotriene D4
6-keto-PGF1 a P.G. 6-keto-Prostaglandin F1 alpha
8-isoPGF2a P.G. 8-iso-Prostaglandin F2alpha
Nitrotyrosine B.Am Nitrotyrosine
Dopamine B.Am Dopamine
Sarcosine B.Am Sarcosine
GSH Glutathione
GSSG Glutathione disulfide.
Die Tabelle 1 fasst die analysierten Metaboliten
(Qualitätsindikatoren) und die jeweiligen Abkürzungen
zusammen. Glycerophospholipide sind weiter in Bezug auf das Vorhandensein von Ester- (a) und Etherbindungen (e) in der Glycerolgruppe differenziert, wobei zwei Buchstaben (aa, ea oder ee) anzeigen, dass die erste und die zweite Position des Glycerolgerüsts an einen Fettsäurerest gebunden sind, während ein einzelner Buchstabe (a oder e) eine Bindung an nur einen Fettsäurerest anzeigt, z.B. zeigt PC_ea_33:l ein plasmalogenes Phosphatidylcholin mit 33 Kohlenstoffatomen in den beiden Fettsäure-Seitenketten und eine einzelne Doppelbindung in einer davon an.
Beispiel 7: Datenanalyse
Alle Berechnungen wurden unter Verwendung eines Excel- Softwarepakets (T-Test, Fold Change) durchgeführt. Es wurden Konzentrationen aus 54 Proben bestimmt. Fold Changes bzw. x- fache Änderungen entsprechen der relativen Änderung in Prozent zwischen der mittleren Konzentration in der gefrorenen Gruppe und der mittleren Konzentration in den aufgetauten bzw.
angetauten Proben.
Beispiel 8: Auswahl von Qualitätsindikator Kombinationen
Für den Satz von Qualitätsindikatoren gemäß der vorliegenden Erfindung können parsimonische Multi-Metaboliten-Panels verwendet werden, um die molekulare Qualität von
kryokonserviertem Gewebe zu bewerten.
Beispiel 9: Ergebnisse
In der vorliegenden Erfindung wurden metabolische Signaturen (die Konzentration mehrerer Qualitätsindikatoren) in Gewebe identifiziert, um anzuzeigen, ob eine kryokonservierte
Gewebeprobe während der Lagerung und/oder des Transports ganz oder teilweise aufgetaut wurde. Dieses Wissen kann verwendet werden, um zu entscheiden, ob eine Probe im Kontext von metabolomischen Studien verwendet werden kann oder ob während der Datenanalyse besondere Sorgfalt aufgewendet werden muss. Es wurden Vergleiche durchgeführt, um die Daten für aufgetaute (T) und teilweise aufgetaute bzw. angetaute (PT) Gewebeproben zu erzeugen:
(a) T/F: Aufgetautes (T) vs . gefrorenes (F) Gewebe (T/F)
(b) PT/F: Angetautes (PT) vs . gefrorenes (F) Gewebe (c) T/PT: Aufgetautes (T) vs . angetautes (PT) Gewebe
Auf Basis ihres Verhaltens während des Auftauens können die Qualitätsindikatoren in drei Gruppen eingeteilt werden: (i) ansteigend während des Auftauens, (ii) ansteigend zu Anfang des Auftauens und anschließend absinkend, (iii) absinkend während des Auftauens, (iv) stabil. Mit Hilfe der Indikatoren der Gruppen (i) und (iii) können aufgetaute Gewebeproben identifiziert werden, während Indikatoren der Gruppe (ii),
allein oder in Kombination mit Indikatoren aus den Gruppen und (iii), hauptsächlich verwendet werden, um angetaute Gewebeproben zu identifizieren.
Gruppe I: Niveau der Konzentration an Qualitätsindikator (Metabolit) steigen während des Auftauens
Tabelle 2:
Qualitätsindikator T / F PT / F T / PT (Stability indicator)
ADMA 57.92 1.33 43.64
Met 43.24 1.60 26.94
Met-SO 36.55 1.07 34.08
Met/Taurine 34.72 1.52 22.89
Kynurenine 26.42 1.22 21.74
Leu 22.93 1.41 16.26 total DMA 21.65 1.24 17.52
Tyr 14.54 1.56 9.31
Pro 12.57 1.20 10.52
CO 1.45 1.04 1.39 lysoPC a C20:3 24.68 1.40 17.58 lysoPC a C20:4 19.96 1.42 14.02 lysoPC a C18:2 19.53 1.33 14.65 lysoPC a C18:l 13.40 1.20 11.14
PC ae C42:3 6.19 1.56 3.96
PC ae C40:l 5.16 1.51 3.40
PC ae C42:2 2.73 1.44 1.89
15S-HETE 16.00 1.50 10.67
AA 13.38 1.19 11.28
DHA 2.49 1.01 2.46
Tabelle 2: Vergleich der Niveaus der Qualitätsindikatoren, wobei die Qualitätsindikatoren Metaboliten sind (Fold Change) , in permanent gefrorenen (F) , angetauten (PT) und aufgetauten Gewebeproben (T) (Fold Change 57,92 für den T/F-Vergleich bedeutet einen 58-fachen Anstieg des Niveaus des
Qualitätsindikators, in diesem Beispiel ADMA, im Vergleich zu einer permanent gefrorenen Gewebeprobe) .
Tabelle 3: Ergebnisse des Hypothesentests (T-Tests).
Qualitätsindikator (Stabilit T / F PT / F T / PT indicator )
ADMA 1.15E-18 6.50E-01 3.03E-11
Met 5.81E-18 8.38E-01 1.52E-09
Met-SO 4.65E-12 5.73E-01 4.39E-06
Met/Taurine 1.90E-16 7.49E-01 1.02E-08
Kynurenine 9.59E-21 7.03E-01 6.72E-12
Leu 9.94E-14 8.86E-01 6.00E-07 total DMA 7.75E-18 6.74E-01 1.39E-10
Tyr 8.59E-19 8.80E-01 8.01E-11
Pro 2.00E-19 7.11E-01 2.61E-11
CO 3.67E-10 3.79E-01 1.31E-05 lysoPC a C20:3 4.40E-15 7.81E-01 3.27E-08 lysoPC a C20:4 2.19E-15 8.64E-01 1.39E-08 lysoPC a C18:2 3.51E-15 7.59E-01 2.29E-08 lysoPC a C18:l 1.44E-16 7.99E-01 3.60E-09
PC ae C42:3 3.97E-18 2.47E-01 1.84E-09
PC ae C40:l 3.07E-19 1.86E-01 1.77E-10
PC ae C42:2 1.64E-20 9.87E-05 1.03E-08
15S-HETE 6.05E-11 9.36E-01 1.07E-05
AA 2.64E-20 8.41E-01 6.15E-12
DHA 4.39E-07 4.54E-01 4.67E-03
Gruppe II: Das Niveau der Metaboliten (Qualitätsindikatoren) stiegen zu Anfang des Auftauens und sanken anschließend
Tabelle 4: Vergleich der Niveaus der Metaboliten
(Qualitätsindikatoren) (Fold Change) in permanent gef
angetauten und aufgetauten Gewebeproben.
Qualitätsindikator T / F PT / F T / PT (Stability indicator)
PC aa C36:3 1.39 1.73 0.80
PC aa C38:5 1.41 1.73 0.82
PC aa C36:2 1.27 1.61 0.78
PC aa C38:6 1.26 1.50 0.84
SM C18:0 1.10 1.76 0.63
SM C16:0 0.90 1.38 0.65
SM C24 : 1 0.83 1.66 0.50
SM C24 : 0 0.82 1.60 0.51
SM (OH) C14:l 0.75 1.27 0.59
Glutathione disulfide (GSSG) 0.0017 1.78 0.0009
Tabelle 5: Ergebnisse des Hypothesentests (T-Tests).
Gruppe III: Niveau der Konzentration an Metabolit
(Qualitätsindikator) sinken beim Auftauen.
Tabelle 6: Vergleich von Metabolitenniveaus (Fold Change) in permanent gefrorenen, angetauten und aufgetauten Gewebeproben.
Qualitätsindikator (Stability T / F PT / F T / indicator ) PT
C4 0.13 0.97 0.14
C2 0.06 0.84 0.07
C3 0.05 0.91 0.06
(C2+C3) /CO 0.04 0.80 0.05
Tabelle 7: Ergebnisse des Hypothesentests (T-Tests).
Qualitätsindikator (Stability T / F PT / F T / PT indicator )
C4 3.81E-19 8.81E-01 3.30E-20
C2 1.22E-17 2.25E-01 2.15E-23
C3 9.42E-20 6.77E-01 8.66E-31
(C2+C3) /CO 2.68E-21 1.12E-01 7.79E-22
References :
Asslaber M., Zatloukal K. (2007). Biobanks : transnational, European and global networks. Brief Funct Genomic Proteomic, 6(3), 193-201.
Bolelli G . , Muti P., Micheli A . , Sciajno R., Franceschetti F., Krogh V., Pisani P., Berrino F. (1995) . Validity for Epidemiological Studies of Long-Term Cryoconservation of Steroid and Protein hormones in Serum and Plasma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 4, 509-513.
Boyanton B.L. and Blick K.E. (2002) . Stability Studies of Twenty-four Analytes in Human Plasma and Serum. Clin Chem, 48(12), 2242-2247.
Chaigneau C., Cabioch T., Beaumont K., Betsou F. (2007). Serum biobank certification and the establishment of quality controls for biological fluids: examples of serum biomarker stability after temperature Variation. Clin Chem Lab Med, 45, 1390-1395.
Comstock G.W., Burke A.E., Norkus E.P., Gordon G.B., Hoffman S.C., Helzsouer K.J. (2001). Effects of Repeated Freeze-Thaw Cycles on Concentrations of Cholesterol, Micronutrients , and Hormones in Human Plasma and Serum. Clin Chem, 47(1), 139-142.
Holland N.T., Smith M.T., Eskenazi B., Bastaki M. (2003). Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res, 543(3), 217-234.
Jewell S.D., Srinivasan M . , McCart L.M., Williams N., Grizzle W.H., LiVolsi V., MacLennan G., Sedmak D.D. (2002) . Analysis of the Molecular Quality of Human Tissues. An Experience From the
Cooperative Human Tissue Network. Am J Clin Pathol, 118, 733-741.
Mager S.R., Oomen M.H.A., Morente M.M., Ratcliffe C, Knox K., Kerr D.J., Pezzella F., Riegman P.H.J. (2007) . Standard operating procedure for the collection of fresh frozen tissue samples . Eur J Cancer, 43, 828-834.
Paltiel L., Ronningen K.S., Meitzer H.M., Baker S.V., Hoppin J.A.
(2008) . Evaluation of Freeze Thaw Cycles on stored plasma in the Biobank of the Norwegian Mother and Child Cohort Study. Cell Preserv Technol, 6(3), 223-230.
Riegman P.H.J., Morente M.M., Betsou F., de Blasio P., Geary P, . the Marble Arch International Working Group on Biobanking for
Biomedical Research (2008) . Biobanking for better healthcare. Mol Oncol, 2, 213-222.
Schrohl A.-S., Würtz S., Kohn E., Banks R.E., Nielsen H.J., Sweeo, F.C.G.J., Brünner N. (2008) . Banking of Biological Fluids for Studies of Disease-associated Protion Biomakers. Molecular &
Cellular Proteomics, 7, 2061-2066.
Shih W.J., Bachorik P.S., Haga J.A., Myers G.L., Stein E.A. (2000) .
Estimating the Long-Term Effects of Storage at -70°C on Cholesterol, Triglyceride, and HDL-Cholesterol Measurements in Stored Sera. Clin Chem, 46(3), 251-364.
Srinivasan M., Sedmak D., Jewell S. (2002) . Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids. Am J Pathol., 161, 1961-1971.
Unterwur zacher I., Koal T., Bonn G.K., Weinberger K.M., Ramsay S.L.
(2008) . Rapid sample preparation and simultaneous quantitation of
Prostaglandins and lipoxygenase derived fatty acid metabolites by liquid chromatography-mass spectrometry from small sample volumes . Clin Chem Lab Med., 46 ( 11 ) , 1589-1597.
Viertier C, Groelz D, Gündisch S, Kashofer K, Reischauer B, Riegman PH, Winther R, Wyrich R, Becker KF, Oelmüller U, Zatloukal K. (2012) A
New Technology for Stabilization of Biomolecules in Tissues for Combined Histological and Molecular Analyses . J Mol Diagn J Mol Diagn. 2012; 14 (5) : 458-466
Yuille M., van Ommen G.-J. Brechot C., Cambon-Thomsen A. , Dagher G., Landegren U., Litton J.-E., Pasterk M. , Peltonen L., Taussig M.,
Wichmann H . -E . , Zatloukal K. (2007) . Biobanking for Europe. Brief Bioinform, 9(1), 14-24.