ES2310434A1

ES2310434A1 - Un procedimiento de identificacion de un proceso de fibrosis renal, uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail en la elaboracion de composiciones farmaceuticas, procedimiento de identificacion de dichos compuestos inhibidores, dichas composiciones farmaceuticas y.

Info

Publication number: ES2310434A1
Application number: ES200600119A
Authority: ES
Inventors: Maria Angela Nieto Toledano; Agnes Boutet; Cristina Alvarez De Frutos
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Miguel Hernandez de Elche UMH
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Miguel Hernandez de Elche UMH
Priority date: 2006-01-19
Filing date: 2006-01-19
Publication date: 2009-01-01
Anticipated expiration: 2026-01-19
Also published as: WO2007082967A1; CA2637609A1; ES2310434B1; EP1980623A1; US20100286231A1; AU2006336009A1

Abstract

Un procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal, procedimiento de identificación de compuestos inhibidores, uso de los compuestos inhibidores de la expresión del gen del factor de transcripción snail en la elaboración de composiciones farmacéuticas, dichas composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones en la fibrosis renal. Snail es una proteína directamente implicada en la etiopatogenia de la fibrosis renal, además de un marcador de esta enfermedad. Por lo tanto, puede utilizarse su identificación como diagnóstico de fibrosis renal; y por otro lado, la proteína Snail puede ser de gran utilidad en la identificación de nuevos fármacos para el tratamiento de la fibrosis renal, y su inhibición génica como una forma de tratamiento.

Description

Un procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal, procedimiento de identificación de compuestos inhibidores, uso de los compuestos inhibidores de la expresión del gen del factor de transcripción Snail en la elaboración de composiciones farmacéuticas, dichas composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones en la fibrosis renal.

Sector de la técnica

La presente invención se enmarca en el campo de la biomedicina, y más concretamente en la aplicación de herramientas biotecnológicas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades humanas, y más concretamente de la fibrosis renal.

Estado de la técnica

El epitelio renal se origina a partir de células que sufren una transición mesénquima-epitelio (TME). El proceso inverso, la transición epitelio mesénquima (TEM), se ha implicado en la progresión de tumores epiteliales y en la fibrosis que desencadena en último término un fallo renal. Los factores de transcripción Snail inducen TEMs tanto fisiológicas como patológicas por medio de la represión de la transcripción de la Cadherina E, (entre otras dianas (Cano y col., 2000; Batlle y col., 2000; Bolos y col., 2003). Se ha determinado que Snail suprime también la expresión de la cadherina específica de riñón, Cadherina 16 (Thompson y col., 1995), por medio de la represión de la transcripción de su activador, HNF-1beta (Factor nuclear hepático-1 beta; Bai y col., 2002). Esta represión está activa durante el desarrollo embrionario temprano y se ha observado que la desaparición de Snail ocurre concomitante con la aparición de HNF-1beta y subsecuentemente de Cadherina 16, identificados como signos de diferenciación del epitelio renal (Dressler, 2002). La activación de Snail en el riñón maduro puede considerarse un proceso de retorno a las propiedades embriogénicas y se ha identificado como suficiente para inducir TEM y fibrosis renal en
ratones.

La fibrosis renal progresiva es una enfermedad devastadora que desencadena fallo renal en pacientes aquejados de distintas enfermedades como glomerulonefritis, nefropatía IgA, diabetes, daño renal inducido por toxicidad, obstrucción urinaria o deterioro de transplantes renales entre otras (Liu, 2004; Kalluri y Neilson, 2003, Zeisberg y Kalluri, 2004; Vongwiwatana y col., 2005). Se pensaba que la fibrosis renal procedía de la activación de fibroblastos intersticiales, pero hay datos concluyentes de que también proceden del resultado de una TEM sufrida por las células epiteliales de los túbulos renales (Iwano y col., 2002). Se han observado signos de TEM tubular en los riñones de pacientes con fibrosis renal (Jinde y col, 2001; Rastaldi y col, 2002) y en modelos animales se ha calculado que alrededor del 36% de la población fibroblástica procede de una TEM local de las células epiteliales (Kalluri y Neilson,
2003).

Por otro lado, la expresión de Snail aparece concomitante con la TEM sufrida en el riñón tras obstrucción uretral unilateral que causa fibrosis renal (Sato y col., 2003), aunque no se estableció una causa-efecto, ya que la causa de la fibrosis renal fue la obstrucción uretral. Además, la expresión de Snail aparece concomitante con la TEM sufrida por células mesoteliales, que constituye una fibrosis mesotelial (Yañez-Mo y col., 2003) en dializados de pacientes sometidos diálisis peritoneal y en células en cultivo tratadas con TGF-beta.

Está patentado el uso de BMP-7 como agente inhibidor y con capacidad de reversión de fibrosis renal BMP-7 (proteína formadora de hueso numero 7) ejerce este efecto por su capacidad inhibidora de TGF-beta, agente inductor de fibrosis renal y conocido inductor de Snail (revisado en Barrallo-Gimeno y Nieto, 2005; United States Patent Application 20020173453, Method of treating renal injury). Tanto TGF-beta como BMP-7 son moléculas señalizadoras extracelulares que inician una cascada compleja de eventos. Si la sola inducción de Snail reproduce la fibrosis renal es de esperar que la inhibición específica de Snail sea una terapia mucho más específica que la inhibición de toda la cascada de señalización de TGF-beta.

Finalmente, si la sola actividad de Snail en el riñón maduro es capaz de inducir TEM y fibrosis renal, la presencia de Snail podría considerarse un marcador de fibrosis renal, su inhibición una forma de terapia anti-fibrótica y Snail podría ser de gran utilidad en la identificación de nuevos fármacos antifibróticos.

Descripción de la invención Descripción breve

Un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal, en adelante procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal de la invención, basado en la identificación de la presencia de Snail en una muestra biológica y que comprende las siguientes etapas:

a) identificación de la presencia de Snail, en una muestra biológica de origen renal, y

b) comparación de la presencia de observada en a) con su ausencia en una muestra control, y donde su presencia es indicativa de la existencia de fibrosis renal.

Un objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de la invención en el que la identificación de Snail de a) se refiere a las formas humanas de Snail1 (hSnail1, SEQ ID NO 5 y 6) y (hSnail2, SEQ ID NO 7 y 8), ya sea la identificación en forma de un tránscrito génico (RNAm) o de la forma proteica de ambos genes.

Otro objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación y evaluación de la actividad de compuestos inhibidores de la proteína Snail útiles para el tratamiento de la fibrosis renal, en adelante procedimiento de identificación de compuestos de la presente invención, que comprende los siguientes pasos:

a): Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión de Snail que produzca fibrosis renal con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,

b): determinación de un parámetro indicativo del proceso de fibrosis renal, e

c): identificación de un compuesto inhibidor de la actividad de la proteína Snail cuando se observa una disminución de dicho parámetro de fibrosis renal.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el procedimiento de identificación de la invención donde el sistema biológico del punto a) es un animal transgénico donde la expresión de la proteína Snail es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca fibrosis renal. Una realización particular es aquella donde el animal transgénico es el ratón transgénico de la presente invención (Ejemplo 2, ratón transgSnail1-ER).

Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de la actividad de la proteína Snail, en adelante uso de un compuesto de la presente invención, en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la fibrosis renal, preferentemente humana.

Por tanto, en otra realización particular de la invención dicho uso de un compuesto se basa en que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína Snail humana y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:

a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Snail,

b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail,

c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail, y

d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína Snail

Una realización particular de la invención lo constituye el uso de un RNAi que se une preferentemente a la secuencia fragmento de RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO 9) o a otro fragmento que comprenda a esta.

Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica o un medicamento para el tratamiento de la fibrosis renal, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente inhibidor de la proteína Snail, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Una realización particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica en la que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína Snail humana y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:

b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail,

c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail, y

d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína Snail

Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por fibrosis renal, en adelante uso de la composición farmacéutica de la presente invención, consistente en la administración de dicha composición terapéutica que inhibe el proceso de fibrosis.

Un objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de esta invención en el que la fibrosis renal está provocada por una enfermedad, desorden o patología perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: glomerulonefritis, neuropatía IgA, diabetes, daño renal inducido por toxicidad, obstrucción urinaria y deterioro de transplantes renales.

Descripción detallada

La presente invención se basa en que los inventores han observado que los genes Snail reprimen la expresión in vivo de cadherina-16 por la represión indirecta de la transcripción del gen de su activador, HNF1-beta, tanto en modelos celulares como animales. Para determinar si ambos genes Snail pueden ser represores de la cadherina-16 in vivo, se estudiaron sus patrones de expresión relativos durante el desarrollo embrionario en ratones, cuando ocurren distintos procesos de TEM y TME que dan lugar a la formación del riñón maduro (Ejemplo 1) y en ratones transgénicos con expresión inducible de los genes Snail (Ejemplo 2).

Los datos muestran que los patrones de expresión son complementarios en los distintos estadios embrionarios y que la cadherina-16 sólo aparece a partir de mesénquima tras la desaparición de la expresión de los genes Snail1 y Snail2 (Ejemplo 1). Estos datos son compatibles con que Snail reprime la expresión del gen de la cadherina-16 in vivo de forma indirecta (Figura 2v), a través de la represión de HNF-1beta, y más concretamente a través de la acción directa sobre su promotor (unión a caja E consenso conservada identificada en la presente invención) induciendo una completa TEM (Figura 4a y 4c).

Además, para determinar si los genes Snail pueden reprimir la transcripción de NHF-1beta y consecuentemente la expresión de Cadherina-16 se generaron ratones transgénicos con actividad inducible de Snail1 (Ejemplo 2). Así, se observó que Snail1 reprime HNF-1beta in vivo, lo cual induce la represión de cadherina-16, e induce la pérdida de las características epiteliales de las células, que parecen adquirir una morfología similar a la fibroblástica que tiene lugar en una TEM completa (Figura 5b, e, h, k, insertos). Estos cambios aquí descritos son reminiscentes de los observados tras la inducción experimental de fibrosis renal en distintas condiciones (Liu, 2003).

En resumen, estos datos indican que los genes Snail 1 y 2 actúan como represores del fenotipo epitelial en el riñón maduro y, además, que solamente su activación es suficiente para inducir todas las características de TEM y de fibrosis renal, es decir, que existe una relación directa -no sólo una asociación temporal- entre la actividad de los genes Snail y la etiopatogenia de esta enfermedad. De esta forma, la presencia de Snail puede considerarse un marcador de fibrosis renal y, por tanto, utilizarse su identificación como diagnóstico de fibrosis renal; y por otro lado, la proteína Snail puede ser de gran utilidad en la identificación de nuevos fármacos para el tratamiento de la fibrosis renal, y su inhibición génica como una forma de terapia. Estas aproximaciones terapéuticas de la fibrosis renal se basan en el uso de compuestos o agentes inhibidores de la actividad de dicha proteína Snail.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal, en adelante procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal de la invención, basado en la identificación de la presencia de Snail en una muestra biológica y que comprende las siguientes etapas:

Tal como se utiliza en la presente invención el término "genes Snail" o "proteínas Snail" se refiere tanto al gen o proteína Snail1 (SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente) como al gen o proteína Snail2 (SEQ ID NO 3 y 4, respectivamente), así como a cualquier secuencia de nucleótidos o de aminoácidos (aás.) análoga a éstas de otras especies, respectivamente. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos o aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de nucleótidos o aás. mostradas en la presente memoria, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos o aás. conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos o aás, la adición de uno o más nucleótidos o aás. en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos o aás. en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, y que constituya una secuencia codificante o péptido con actividad similar a las secuencias de la invención, es decir, sea capaz de inducir fibrosis renal.

En general, una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de nucleótidos o aás. en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.

Un objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de la invención en el que la identificación de Snail de a) se refiere a las formas humanas de Snail1 (hSnail1, SEQ ID NO 5 y 6) y (hSnail2, SEQ ID NO 7 y 8), ya sea la identificación en forma de un tránscrito génico (RNAm) o de la forma proteica de ambos genes. La realización de estos análisis de identificación de los niveles de expresión de Snail puede ser llevado a cabo por un experto medio del área de la biomedicina gracias a la información descrita en la presente invención y en el estado de la técnica por distintas técnicas (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal en el que la identificación de Snail se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos específicos de Snail Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.

Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal en el que la identificación de Snail se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor de Snail

Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal en el que la identificación de Snail se lleva a cabo mediante RT-PCR de un precursor génico de Snail Este procedimiento está basado en la extracción de RNA polyA+ de una muestra biológica de origen renal y de un tejido control y la amplificación de la secuencia codificante de Snail con adecuados oligonucleótidos cebadores.

Por otro lado, este procedimiento de diagnóstico de fibrosis renal puede realizarse utilizándose a Snail como único marcador o de forma conjunta con otros marcadores de fibrosis renal, por ejemplo formando parte de un microarray de expresión biológica, ya sea en forma génica -a partir de RNAm- o en forma de proteína, que defina una huella o perfil diagnóstico de fibrosis pulmonar.

d): Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión de Snail que produzca fibrosis renal con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,

e): determinación de un parámetro indicativo del proceso de fibrosis renal, e

f): identificación de un compuesto inhibidor de la actividad de la proteína Snail cuando se observa una disminución de dicho parámetro de fibrosis renal.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el procedimiento de identificación de la invención donde el sistema biológico del punto a) es un animal transgénico donde la expresión de la proteína Snail es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca fibrosis renal. Una realización particular es aquella donde el animal transgénico es el ratón transgénico de la presente invención (Ejemplo 2, ratón transgSnail1-
ER).

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el procedimiento de identificación de la invención en el que el parámetro relacionado con el proceso de fibrosis renal de a) pertenece, a título ilustrativo y sin limitar el alcance de la presente invención, al siguiente grupo: un cambio morfológico característico de una TEM, nivel de vimentina, transcripción del gen Colágeno I y deposición de fibras de colágeno (Figura 6, Ejemplo 2).

Tal como se utiliza en la presente invención el término "compuesto/agente inhibidor o antagonista" se refiere a una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína Snail (por ejemplo, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 8), o con fragmentos funcionales de la misma, disminuye o elimina la intensidad o la duración de la actividad biológica de dicha proteína. En esta definición se incluye además aquellos compuestos que impiden o disminuyen la expresión del gen codificante de la proteína Snail, es decir, que impiden o disminuyen la transcripción del gen, la maduración del RNAm, la traducción del RNAm y la modificación post-traduccional. Un agente inhibidor puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido nucleico o polinucleótido, un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico o cualquier otro tipo de molécula que disminuya o elimina el efecto y/o la función de la proteína Snail

A modo ilustrativo, dicho polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Snail, o bien un polinucleótido que codifica una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail, o bien un polinucleótido que codifica un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail, o bien polinucleótido que codifica un RNA de interferencia ("small interference RNA" o siRNA) específico del mRNA de la proteína Snail

Estos polinucleótidos mencionados pueden ser utilizados en un proceso de terapia génica en el que mediante cualquier técnica o procedimiento se permita la integración de los mismos en las células de un paciente humano. Este objetivo puede conseguirse mediante la administración a estas células renales de una construcción génica que comprende uno de los polinucleótidos mencionados con el fin de transformar dichas células permitiendo su expresión en el interior de las mismas de manera que se inhiba la expresión de la proteína Snail Ventajosamente, dicha construcción génica puede estar incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o un vector de transferencia.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el proceso de transferencia de un gen exógeno o de una construcción génica exógena al interior de una célula, permitiendo de este modo la vehiculación de genes y construcciones génicas exógenas. Dichos vectores pueden ser vectores no virales o vectores virales (Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and problems. Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 177-211) y su administración puede ser preparada por un experto en la materia en función de las necesidades y especificidades de cada caso.

b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail,

c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail, y

d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína Snail

Con anterioridad se han descrito e incluso protegido mediante patente oligonucleótidos antisentido
(US20060003956, Materials and methods for the derepression of the E-cadherin promoter; Kajita M, McClinic KN, Wade PA. Aberrant expression of the transcription factors snail and slug alters the response to genotoxic stress. Mol Cell Biol. 2004, 24(17): 7559-66) y siRNAs que inhiben su expresión (Peinado H, Del Carmen Iglesias-de la Cruz M, Olmeda D, Csiszar K, Fong KS, Vega S, Nieto MA, Cano A, Portillo F. A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme in snail regulation and tumor progression. EMBO J. 2005, 24(19): 3446-58; Tripathi MK, Misra S, Chaudhuri G. Negative regulation of the expressions of cytokeratins 8 and 19 by SLUG repressor protein in human breast cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005, 329(2): 508-15). Por otro lado, estas técnicas de inhibición génica, y más concretamente la vehiculización de los compuestos -oligonucleótidos antisentido, iRNA, ribozimas o aptameros- puede llevarse a cabo mediante el uso de nanopartículas que incrementan el éxito de dicha transferencia (Lu PV and Woodle MC, Adv Genet 54: 117-42, 2005; Hawker CJ and Wooley KL, Science 19 (309): 1200-5,
2005).

Así, una realización particular de la invención lo constituye el uso de un RNAi que se une preferentemente a la secuencia fragmento de RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO 9) o a otro fragmento que comprenda a esta.

Las secuencias de nucleótidos a)-d) mencionadas previamente impiden la expresión del gen en mRNA o del mRNA en la proteína Snail, y, por tanto, anulan su función biológica, y pueden ser desarrolladas por un experto en el sector de ingeniería genética en función del conocimiento existente en el estado del arte sobre transgénesis y anulación de la expresión génica (Clarke, A.R. (2002) Transgenesis Techniques. Principles and Protocols, 2a Ed. Humana Press, Cardiff University; Patente US20020128220. Gleave, Martin. TRPM-2 antisense therapy; Puerta-Fernández E et al. (2003) Ribozymes: recent advances in the development of RNA tools. FEMS Microbiology Reviews 27: 75-97; Kikuchi, et al., 2003. RNA aptamers targeted to domain II of Hepatitis C virus IRES that bind to its apical loop region. J. Biochem. 133, 263-270; Reynolds A. et al., 2004. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology 22 (3): 326-330).

Por otro lado, el origen de estos compuestos inhibidores de la actividad de las proteínas Snail puede ser variado, de tal forma que pueden ser origen natural (por ejemplo, de origen vegetal, bacteriano, vírico, animales o microorganismos eucariotas) o sintético.

b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail,

c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail, y

d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína Snail

Al igual que lo comentado anteriormente, una realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el inhibidor de Snail es un RNAi que se une preferentemente a la secuencia fragmento de RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO 5) o a otro fragmento que comprenda a esta.

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Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto inhibidor de la actividad de la proteína Snail, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.

En una realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.

Un objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de esta invención en el que la fibrosis renal está provocada por una enfermedad, desorden o patología perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: nefropatía IgA, glomerulonefritis, diabetes, daño renal inducido por toxicidad, obstrucción urinaria y deterioro de transplantes renales.

Descripción de las figuras

Figura 1. Snail induce TEM en células NMuMG concomitante con la represión de Cadherina-16. Imágenes de contrate de fases (a, b), expresión de Cadherina E (c, d) y F-actina (e, f) en células transfectadas con el vector vacío (Mock) o transfectadas con Snail1 (Snail). La motilidad se determinó por un ensayo de herida en cultivo (g, h). Las propiedades invasivas se analizaron por la capacidad de las células de traspasar geles de colágeno IV. (k) Expresión de Cadherina E, cadherina-16 y Snail1 por RT PCR en células Mock y Snail. Las células que expresan Snail han perdido la Cadherina E, reorganizado las fibras de actina y adquirido una morfología fibroblástica, todo ello indicativo de una TEM. Adicionalmente, son capaces de cerrar la herida en 24 horas y de invadir los geles de colágeno. Barras de escala 50 \mum.

Figura 2. Los epitelios renales que expresan Cadherina-16 se originan de mesénquima positivo para los genes Snail. Hibridación in situ para Cadherina-16, Snail 1 y Snail 2 en distintos días del desarrollo embrionario del ratón: 10.5 (a-i), 13.5 (j-o) y 17.5 (p-u). La Cadherina-16 se expresa en el epitelio recién formado del ducto néfrico (nd, b) que ya no expresa Snail (e, h, insertos). Snail se observa en el mesénquima metanéfrico indiferenciado (mm). Los sistemas urogenitales disecados (ver inserto en j) o sus secciones (j-o) se hibridaron con sondas para detectar Cadherina-16 y los genes Snail. La Cadherina-16 se expresa también en los túmulos en formación (j, k) junto con los ductos sexuales (sd) y los túmulos epiteliales del mesonefros transitorio (ms) como se ve en el inserto en j. Los genes Snail se siguen expresan en el mesénquima remanente (mm, l-o). El epitelio de las nefronas y los túbulos colectores expresan niveles altos de Cadherina-16 cuando todo el mesénquima se ha diferenciado a epitelio y la expresión de los genes Snail ha desaparecido (r-u). Esta expresión se mantiene en el riñón adulto. Barras de escala 100 \mum. v, Los factores de transcripción Snail inhiben la actividad del promotor del gen de la Cadherina-16. Snail 1 y Snail 2 siguen reprimiendo la actividad del promotor cuando los sitios de unión de Snail han sido eliminados.

Figura 3.- La expresión de HNF-1beta precede la de Cadherina-16 en los componentes epiteliales del riñón en desarrollo. Hibridación in situ de embriones de 10.5, 13.5 y 17.5 días de desarrollo y sus secciones correspondientes. La expresión de HNF-1beta se observa tan pronto como aparecen epitelios derivados de mesénquima. A 10.5 días de desarrollo, la expresión se observa en el conducto nefrítico (b) y en el mesénquima que se está condensando en regiones donde aun no ha aparecido la expresión de Cadherina-16 (Figura 2c). A 13.5 días de desarrollo, además del conducto nefrítico, se observan muchos lugares de expresión de HNF-1beta (d), algunos de los cuales ya expresan Cadherina-16. Snail2 se expresa en el mesénquima metanefrítico. Barras de escala 100 \mum.

Figura 4.- Snail1 y Snail2 reprimen la expresión de Cadherina-16 por la represión de la transcripción de su activador, HNF-1beta. a) La activación de Snail1 reprime la expresión de Cadherina-16 y HNF-1beta. Las células NMuMG transfectadas establemente con una versión activable de Snail1 cambian su morfología 24 horas después de la inducción. b) Expresión del transgén por RT PCR. c) RT PCR a tiempo real de Cadherina-16 y HNF-1beta 24 horas después de la administración del inductor, 4-OH-tamoxifeno. y d) Diagrama de la región de 1 kb por delante del lugar de iniciación de la traducción del gen del HNF-1beta de ratón mostrando una región muy conservada con humanos. Los dos sitios de unión de Snail están indicados con cajas negras. Snail1 y Snail2 reprimen la actividad del promotor nativo de HNF-1beta, pero no afectaron la de un promotor con el sitio conservado eliminado.

Figura 5.- Snail1 reprime la expresión de HNF-1beta y cadherina-16 in vivo . a, b) La proteína Snail exógena se traslocó al núcleo tras la administración de tamoxifeno, como se observa por medio del anticuerpo anti-receptor de estrógenos humano. c) RT-PCR a tiempo real de Snail1 en ratones normales y transgénicos en ausencia o presencia de tamoxifeno. Expresión de HNF-1beta (d, e), cadherina-16 (g, h) y Snail2 (j, k) en secciones de la médula de riñones transgénicos de dos semanas y sus valores correspondientes de expresión por RT-PCR a tiempo real (f, i y l, respectivamente). Barras de escala 25 \mum. Aunque no se muestra, también desaparece la Cadherina E, diana directa de Snail mostrada en tejidos de distinta etiología (revisado en Barrallo-Gimeno y Nieto, 2005).

Figura 6.- La activación de Snail es suficiente para inducir fibrosis renales en ratones transgénicos. La activación de Snail induce un cambio morfológico característico de una TEM (a, b); una activación del marcador mesenquimático vicentina (c, d); activación de la transcripción del gen del Colágeno I (e, f) y deposición de fibras de colágeno como se observa con la tinción de Trichome-Masson (g, h).

Figura 7.- La activación de Snail también produce fibrosis en la corteza renal. Se observan los mismos cambios morfológicos que en la médula, indicativos de TEM, así como la desaparición de Cadherina-16 y Cadherina E y la aparición de Snail2 y de depósitos de Colágeno I.

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Ejemplos de la invención

Ejemplo 1

Los genes Snail reprimen la expresión de cadherina-16 por la represión de la transcripción del gen de su activador, HNFI-beta

La expresión ectópica de Snail1 en la línea celular NMuMG indujo una TEM como se ha descrito previamente en otras líneas celulares epiteliales (Cano y col., 2000; Batlle y col., 2000) con la adquisición de características mesenquimales como la pérdida de la expresión de cadherina E (Figura 1d), la reorganización del citoesqueleto de actina F (Figura 1f) y, además, adquieren movilidad (Figura 1g y 1h) y propiedades invasivas (Figura 1i y 1j). Además de reprimir marcadores epiteliales conocidos, también reprimió la expresión de la Cadherina-16 (Figura 1k), una cadherina específica del riñón. Ya que la mama de ratón y otras líneas celulares procedentes de mama humana no expresaban Cadherina-16, se concluyo que esta expresión es una peculiaridad de la línea celular NMuMG, pero indujo a estudiar si Snail puede reprimir a la Cadherina-16 en el riñón.

Para determinar si ambos genes Snail pueden ser represores de la Cadherina-16 in vivo, se estudió los patrones de expresión relativos durante el desarrollo embrionario en ratones, cuando ocurren distintos procesos de TEM y TME que dan lugar a la formación del riñón maduro. Tan pronto como los conductos nefríticos se epitelizan la expresión de Sanil2 se reprime y la cadherina-16 aparece claramente, observándose que la diferenciación en gradiente anteroposterior de los conductos se correlaciona con la expresión complementaria de los genes cadherina-16 y Senil (Figura 2a-2i). Los conductos colectores inducen al mesénquima nefrítico a condensarse y a diferenciarse en estructuras tubulares las cuales van a dar lugar a las nefronas. El mesénquima nefrítico expresa ambos genes Snail1 y Snail2 (Figura 2f y 2i) y, de nuevo, su epitelización se correlaciona con su represión y el inicio de la expresión de cadherina-16 (Figura 2j-2o). En el día 17.5 dpc, además de lo mencionado para los conductos colectores, se observa una fuerte expresión de cadherina-16 en la neurona. (Figura 2p-2u). Los genes Snail se encuentran en este momento completamente reprimidos en el riñón sin que se observe mesénquima desdiferenciado, situación que se mantiene durante la vida adulta. Los datos muestran que los patrones de expresión son complementarios en los distintos estadios embrionarios y que la Cadherina-16 sólo aparece a partir de mesénquima tras la desaparición de la expresión de los genes Snail1 y Snail2. Estos datos son compatibles con que Snail reprime la expresión del gen de la Cadherina-16 in vivo.

Para determinar si Snail reprimía directamente la transcripción del gen de la cadherina-16, se analizó su promotor, donde se encontraron dos cajas E, consenso de unión del factor de transcripción Snail, localizadas en posición en las posiciones -581 y -746 (Figura 2v). Cuando se transfectó Snail1 o Snail2 junto a una construcción génica conteniendo estas dos cajas y capaz de reproducir el patrón de expresión de Cadherina-16 (Whyte DA y col 1999; Shao X y col 2002), se observó una disminución en la actividad del promotor del 61% y 56%, respectivamente. Para confirmar si las cajas de unión de Snail eran necesarias para producir este efecto, se co-transfectaron con Snail1 o Snail2 construcciones con esas cajas mutadas o eliminadas. Estos experimentos produjeron el mismo resultado, lo que indica que Snail reprime la actividad del promotor de la Cadherina-16 de forma indirecta (Figura 2v).

Debido a que los genes Snail están caracterizados como represores, se investigó si su efecto represor lo realizaba por medio de la represión de un activador de Cadherina-16. HNF-1beta es un potente activador conocido de Cadherina-16 (Bai y col, 2002) y porque además presenta un patrón de expresión durante el desarrollo renal muy interesante. Así, 5 se estudió su patrón de expresión relativo al de los genes Snail y la Cadherina-16 durante el desarrollo del riñón y se observó que muestra una expresión complementaria a la de los genes Snail, que aparece cuando los genes Snail desaparecen y que su expresión ocurre antes que la de Cadherina-16 y en los mismos territorios. De esta forma a los 10 dpc, HNF-1beta se expresa en la diferenciación de los ductos nefríticos en la región posterior (Figura 3c) donde los genes Snail han sido reprimidos y la cadherina-16 no está expresada (Figura 2c). En el 13.5 dpc el mesénquima metanéfrico expresa Snail1 y Snail2, mientras que los tránscritos de HNF-1beta son detectados en algunas áreas de mesénquima epitelializado las cuales son todavía negativas a la cadherina-16 (Figura 3d-f). Las nefronas que se diferencian desde ese mesénquima para dar lugar a las estructuras epiteliales funcionales del riñón maduro expresan tanto HNF-1beta y cadherina (Figura 2). Estos datos son compatibles con que Snail reprime a HNF-1beta y que esta represión impide la aparición de cadherina-16.

Para determinar si la activación aguda de Snail es capaz de reprimir HNF-1beta y cadherina-16, se ha utilizado una construcción inducible que activa Snail1 por la administración de 4-OH-Tamoxifeno (semejante a la utilizada en Locascio y col., 2002) en células NMuMG. Este procedimiento se utiliza para la activación rápida de factores de transcripción, ya que la proteína se encuentra sintetizada de forma inactiva y el agente inductor simplemente la transporta al núcleo de la célula para que actúe como factor de transcripción regulando la expresión de otros genes. Estos experimentos permitieron afirmar que la sola activación de la proteína Snail1 fue capaz de reprimir la transcripción de HNF-1beta y cadherina-16 en 24 h induciendo una completa TEM (Figura 4a y 4c). Interesantemente, 6 horas tras la activación de Snail se observó una represión de los niveles de HNF-1beta del 20% y unos valores de cadherina-16 sin alterar. Estos datos indican que Snail induce la represión secuencial de HNF-1beta y cadherina-16, es decir, que Snail inhibe la expresión de cadherina-16 a través de la represión de HNF-1beta.

Para determinar si la represión HNF-1beta por Snail es directa sobre el promotor, se realizaron experimentos semejantes a los descritos sobre el promotor de la Cadherina-16 con Snail1 y Snail2. Se identificaron dos cajas E consenso de unión de Snail, una de ellas conservada en el promotor de ratón y humano (Figura 4d). Los experimentos de cotransfección con la construcción de este promotor intacto de HNF-1beta mostraron que ambos genes Snail 1 y 2 -tal como se describieron anteriormente para el promotor de la cadherina-16- reprimen la actividad del promotor (Figura 4d), pero no así de aquellos en los que se habían eliminado las dos cajas, o simplemente la caja conservada (Figura 5d). Estos datos muestran que Snail es un represor directo de la transcripción del gen de HNF-1beta a través de su unión a la caja conservada.

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Ejemplo 2

Snail induce fibrosis renal en ratones transgénicos

Para determinar si los genes Snail pueden reprimir la transcripción de NHF-1beta y consecuentemente la expresión de Cadherina-16 y también la de Cadherina E (su diana conocida en otros tejidos (revisado en Barrallo-Gimerno y Nieto, 2005) en el riñón, se generaron ratones transgénicos con actividad inducible de Snail1 (ratón transgSnail1-ER). Se utilizó el mismo sistema que para la expresión inducible en líneas celulares. Ratones normales y transgénicos se trataron con una inyección de excipiente o con tamoxifeno tras el nacimiento durante dos semanas, momento en que fueron sacrificados y se analizó la expresión (Figura 5c) y localización de la proteína transgénica (Figura 5a y 5b). El análisis de los riñones correspondientes mostró la traslocación de la proteína exógena al núcleo (Figura 5b) y la represión de la expresión de los genes de la Cadherina E, la Cadherina-16 y HNF-1beta sólo en los ratones transgénicos tratados con tamoxifeno (Figura 5d-5i; suplementaria figura 5 online). Se observó también la inducción de la expresión de Snail2, el miembro de la familia con expresión prominente durante el desarrollo renal (Figura 5j-51; suplementaria figura 5 online) y mostrado como funcionalmente equivalente a Snail1 en líneas celulares y en embriones como inductor de TEM (Bolós y col., 2003; del Barrio y Nieto, 2002). En resumen, se observó que Snail1 reprime HNF-1beta in vivo, lo cual induce la represión de cadherina-16. Conjuntamente con esta represión de la cadherina-E la expresión de Sanill presente un alto impacto en la pérdida de las características epiteliales, de tal forma que las células de los conductos colectores de la médula parecen adquirir una morfología similar a la fibroblástica reminiscente de la TEM (Figura 5b, e, h, k, insertos).

Para verificar que la expresión de los genes Snail indujo no sólo la represión de los genes citados, sino una TEM completa, se analizó el fenotipo histológico de los riñones de estos animales transgénicos y se observó que en la médula renal la activación de Snail1 indujo un cambio morfológico compatible con TEM, activación del marcador mesenquimático vimentina y activación de la transcripción de Colágeno I (Figura 6e-f) junto con sus depósitos (Figura 6g-h), marcador prototípico de fibrosis renal (Alexakis y col., 2005). Estos cambios también aparecieron en la corteza renal (Figura 7). Los cambios aquí descritos son reminiscentes de los observados tras la inducción experimental de fibrosis renal en distintas condiciones (Liu, 2003). Estos datos indican que los genes Snail1 y Snail2 actúan como represores del fenotipo epitelial en el riñón y, además, que solamente su activación es suficiente para inducir todas las características de la fibrosis renal.

Materiales y Métodos

Plásmidos y anticuerpos. Plásmidos de expresión. pcDNA3-Snail1 corresponde a la secuencia completa del cDNA de Snail1 de ratón insertada en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen; Cano et al., 2000). pcDNA3-Snail-ER corresponde a la secuencia codificante de Snail1 unida a una versión mutada del dominio de unión al agonista del receptor de estrógeno humano que reconoce el ligando sintético 4'-OH-Tamoxifeno (Locascio et al., 2002). La secuencia completa del cDNA de Snail2 de ratón fue también clonada en pcDNA3 (pcDNA3-Snail2). Plásmidos reporteros. La construcción reportera del promotor de cadherina-16 de ratón pKsp(1268F)-Luc ha sido amablemente proporcionada por el Doctor Peter Igarashi (Universidad de Tejas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX). La secuencia del promotor de HNF-1\beta de ratón conteniendo 1072 pb desde el ATG ha sido amplificada por PCR a partir del DNA genómico de las células NMuMG utilizando una DNA polimerasa de alta fidelidad (PfuTurbo, Stratagene). Los oligonucleótidos iniciadores utilizados para la amplificación fueron 5'-ggtaccATCTACACATTCACTACTAGA-3' (SEQ ID NO 10) y 5'-acgcgtTTTCCAAGGACGGAAAAAGAA-3' (SEQ ID NO 11) correspondiendo a la secuencia del GenBank^{TM} X55842 y conteniendo los sitios de restricción KpnI y MluI en los extremos 5', respectivamente. El producto de PCR purificado ha sido subclonado en el vector pGL3-basic (Promega). El kit Quickchange Site Directed Mutagenesis (Stratagene) ha sido utilizado para introducir mutaciones dentro de las cajas E presentes en el promotor de cadherina-16 de ratón. La secuencia 5'-CA(G/C)(G/C)TG-3' ha sido mutada por 5'-AA(G/C)(G/C)TA-3'. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados para eliminar las cajas E en los promotores de cadherina-16 y de HNF-1\beta están disponibles si se requieren. Anticuerpos: Anti-cadherina-E (ECCD2, 1:200, Takara), anti-vimentina (MO725, 1:200, Dako). La proteína de fusión Snail1-ER ha sido detectada por inmunoblots o inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-\alpha receptor de estrógeno humano (1:100, Santa-Cruz). La F-actina ha sido detectada usando la faloidina-FITC (1:10, Sigma).

Cultivo celular y generación de células establemente transfectadas con Snail1 o Snail1-ER. La línea celular NMuMG procede del epitelio de la glándula mamaria de ratón. Esta línea celular epitelial expresa altos niveles de cadherina-E y es muy sensible a la transición epitelio-mesénquima inducida por TGF\beta (Miettinen et al., 1994). Para la transfección, las células NMuMG se sembraron en placas de 6 pocillos (5x10^{4} células por posillo de 3.5 cm) en una mezcla 1:1 de medio Ham's F12 y de medio Dulbecco's Modified Eagle's complementada con 100 IU/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina, 2 mM de glutamina y 2.5 \mug/ml de anfotericina B, 10% de suero bovino fetal y 10 \mug/ml de insulina. 24 horas después de sembrar las células, se añadieron 500 ng de DNA en presencia de LIPOFECTAMINA (Roche) y las células se incubaron con el DNA toda la noche. Un día después, se empezó la selección de las células transfectadas resistentes a la neomicina utilizando el análogo de neomicina G-418 (Calbiochem, 400 \mug/ml). Se aislaron dos clones independientes transfectados con Snail1 o Snail1-ER.

Ensayos de migración y de invasión. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 3x10^{5} células por pocillo. A las 24 horas, se realizó una herida en la zona central del cultivo confluente y las células se incubaron por un periodo adicional de 24 horas tras lavar el cultivo y añadirle medio fresco. Los cultivos se observaron a varios tiempos y se tomaron fotografías de la zona herida utilizando un microscopio invertido Zeiss Axiovert. Los ensayos de invasión en geles de colágeno de tipo IV se realizaron en cámaras de Boyden como se describe en Cano et al., 2000. Las células del compartimiento de abajo fueron recogidas y contadas después de 24 horas. En paralelo los núcleos de las células presentes en la parte inferior del filtro se tiñeron con DAPI después de una fijación en metanol y de haber quitado todas las células de la parte superior del filtro.

Análisis genético por microarray. Se utilizó el Chip U74Av2 para genoma murino de Affymetrix para definir el perfil de expresión génica de las células transfectadas con Snail1 (Snail1-transfectantes). Este perfil fue comparado con el de las células transfectadas con el vector vacío (mock-transfectantes). Los RNA biotinilados se analizaron e hibridaron al Chip. A continuación, el Chip se tiñó con estreptavidina-ficoeritrina y se escaneó. Los chips se analizaron usando el programa Affymetrix® Microarray Suite 5.0.

Análisis de los transcritos. Los mRNAs Poly(A)+ se extrajeron de las células NMuMG utilizando el kit Microfast Track (Invitrogen). Para el análisis por Northern blots, alícuotas de 1.5 \mug de mRNAs Poly(A)+ purificados con celulosa oligo(dT) fueron transferidos a membranas de nylon que se hibridaron con sondas radiomarcadas con [\alpha-^{32}P]dCTP (rediprime II, Amersham Biosciences). Las sondas de DNA de Snail1, cadherina-E, cadherina-16 y GAPDH fueron amplificadas por RT-PCR a partir de 25 ng de los cDNAs purificados correspondientes y sus hibridaciones se visualizaron por autoradiografía utilizando un Hyperfilm MP (Amershan Biosciences). La RT-PCR para Snail1 y GAPDH se describió en Cano et al., 2000. La RT-PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7000 y las sondas TagMan®. Los oligonucleótidos y las sondas se obtuvieron de Applied Biosystems Assays-on-Demand como sigue: Mm-99999915-g1 (GAPDH), Mm-00441533-g1 (Snail1), Mm00483196-m1 (Cadherina-16) y Mm-00447452-m1 (HNF-1\beta). La expresión de RNA se calculó utilizando el método comparativo Ct normalizado con GAPDH. Los resultados finales se expresan relativos a un calibrador (células mock o ratones silvestres) utilizando la formula 2^{-(\Delta \Delta ct)}\pmSD. El RNA fue extraído y el cDNA sintetizado a partir de las células transfectadas con Snail1-ER o con el vector vacío a varios tiempos después del tratamiento con 4'-OH-Tamoxifeno y a partir de los riñones de los animales normales o transgénicos neonatales o después de dos semanas de administración de tamoxifeno o excipiente.

Hibridación in situ . Los embriones de ratón proceden de la cepa Balb-C y sus edades, establecidas en días post-coitum (dpc) se determinaron considerando el día en el cual se ve el tapón vaginal como el día 0.5. Los sistemas uro-genitales o los riñones se disecaron a estadios 13.5 dpc y 17.5 dpc respectivamente, se fijaron en paraformaldehido a 4 en PBS/DEPC toda la noche. A continuación se procesaron directamente para la hibridación in situ (ISH) o se embebieron en gelatina y cortaron con un vibratomo para obtener secciones de 50 \mum. Las ISH en secciones de gelatina o en embriones enteros se realizaron como se describe en Blanco et al., 20002 utilizando las sondas de RNA marcadas con DIG-11-UTP de Snail1, Snail2 y cadherina-E de ratón (Cano et al., 2000; Sefton et al., 1998). Las sondas para Cadherina-16 y HNF-1\beta de ratón fueron obtenidas por RT-PCR a partir del cDNA de las células NMuMG utilizando los oligonucleótidos descritos arriba. Después de la hibridación, los embriones o las secciones de riñones se procesaron como descrito en Cano et al. 2000.

Análisis de promotor. Las actividades de los promotores de cadherina-16 y HNF-1\beta se determinaron co-transfectando las células NMuMG con 50 ng de pcDNA3-Snail, pcDNA3-mSnail2 o el vector vacío y con 300 ng de pKsp(1268F)-Luc ó 400 ng de pmHNF-1\beta-Luc. Un plásmido con el gen Renilla reniformis luciferase (phRL-CMV-Luc, Promega) SE co-transfectó como control de eficiencia. 24 horas después de la transfección, las actividades de las luciferasas de luciérnaga (Luc) y de renilla se determinaron utilizando el sistema Dual Luciferase Reporter Assay (Promega) siguiendo las instrucciones del proveedor. La actividad Luc fue normalizada a la de la luciferasa de renilla. En todos los experimentos, la cantidad total de DNA transfectado fue estandardizada añadiendo el vector vacío. Los resultados se representan como el porcentaje de la actividad de luciferasa relativa a los controles (valores de luciferasa en células co-transfectadas con el vector vacío).

Ratones transgénicos. El transgén Snail1-ER fue diseñado como descrito anteriormente (Locascio et al., 2002) y un ratón transgénico (ratón transgSnail1-ER) para esta construcción se generó según los procedimientos estándares (Hogan, B., Beddington, R. & Lacy, F. Manipulating the mouse embryo. A laboratory manuel. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994). Para este estudio, seleccionamos una línea de animales cuya expresión de la proteína transgénica es muy alta en el riñón. En este modelo, aunque la proteína Snail1-ER esté expresada constitutivamente, su función como factor de trascripción se desarrolla únicamente cuando se trasloca la proteína en el núcleo después del tratamiento con el tamoxifeno. El transgén se detecta a partir del DNA procediendo de la cola de los animales por PCR (los detalles respecto a los oligonucleótidos utilizados están disponibles si se requiere). La localización subcelular de la proteína fue analizada por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-receptor de estrógeno humano. El mismo anticuerpo sirvió para valorar la cantidad de la proteína Snail1-ER en los distintos tejidos obtenidos de los ratones transgénicos por Western Blots. El tamoxifeno (Sigma) fue disuelto primero en etanol (10% del volumen final) y luego en aceite de maíz (Sigma) para tener una concentración final de 30 mg/ml. La solución fue sonicada para mejorar su solubilidad y se administraron 3 mg de Tamoxifeno subcutáneamente por cada 20 gramos de peso corporal en los animales neonatales cada tres días durante dos semanas. Una vez finalizado el tratamiento, los animales se sacrificaron y los riñones obtenidos se embebieron en gelatina, se cortaron con un vibratomo para la ISH o la inmunohistoquímica o fueron procesados para la extracción de RNAs.

Referencias

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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ

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<120> UN PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE UN PROCESO DE FIBROSIS RENAL, USO DE LOS COMPUESTOS INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE SNAIL EN LA ELABORACIÓN DE COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS, PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE DICHOS COMPUESTOS INHIBIDORES, DICHAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y SUS APLICACIONES EN LA FIBROSIS RENAL

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<130> Snail

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<160> 11

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 1613

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<212> DNA

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<213> Mouse

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<220>

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<221> CDS

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<222> (64)..(858)

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<223> Secuencia codificante de Snail1 de ratón

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<400> 1

1

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<212> PRT

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<400> 2

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<211> 2084

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<212> DNA

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<213> Mouse

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<220>

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<221> CDS

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<222> (116)..(925)

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<223> Secuencia codificante de Snail2 de ratón

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<400> 3

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6

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<210> 4

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<211> 269

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<212> PRT

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<213> Mouse

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<400> 4

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<211> 1708

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (71)..(865)

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<223> Secuencia codificante de Snail1 humano

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 264

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 2101

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (165)..(971)

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<223> Secuencia codificante de Snail2 humano

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16

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<210> 8

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<211> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

17

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

19

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<210> 10

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Artificial sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligo A

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<400> 10

20

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<210> 11

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Artificial sequence

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<220>

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<223> Oligo B

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<400> 11

21

Claims

1. Un procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal caracterizado porque se basa en la identificación de la presencia del factor de transcripción SNAIL en una muestra biológica y que comprende las siguientes etapas:

a) identificación de la presencia del factor de transcripción SNAIL, en una muestra biológica de origen renal, y

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el factor de transcripción Snail de a) se refiere a la identificación de un transcrito del gen Snail1 humano (SEQ ID NO 5) o del gen Snail2 (SEQ ID NO 7).

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el factor de transcripción Snail de a) se refiere a la identificación del factor de transcripción Snail1 humano (SEQ ID NO 6) o del factor de transcripción Snail2 humano (SEQ ID NO 8).

4. Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la identificación del factor de transcripción Snail de a) se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos específicos, monoclonales o policlonales, frente al factor de transcripción SNAIL.

5. Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la identificación del factor de transcripción Snail de a) se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor del factor de transcripción SNAIL.

6. Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la identificación del factor de transcripción Snail de a) se lleva a cabo mediante la amplificación RT-PCR de un precursor génico del factor de transcripción SNAIL.

7. Procedimiento de identificación y evaluación de la actividad de compuestos inhibidores del factor de transcripción Snail útiles para el tratamiento de la fibrosis renal caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a): Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión del factor de transcripción SNAIL que produzca fibrosis renal con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,

8. Procedimiento de identificación según la reivindicación 7 caracterizado porque el sistema biológico del punto a) es un animal transgénico donde la expresión del factor de transcripción Snail es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca fibrosis renal.

9. Procedimiento de identificación según la reivindicación 8 caracterizado porque el animal transgénico es el ratón transgSnail1-ER.

10. Procedimiento de identificación según la reivindicación 7 caracterizado porque el parámetro relacionado con el proceso de fibrosis renal de b) pertenece al siguiente grupo: un cambio morfológico característico de una TEM, nivel de vimentina, transcripción del gen Colágeno I y deposición de fibras de colágeno.

11. Uso de un compuesto o agente inhibidor de la actividad del factor de transcripción Snail en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la fibrosis renal, preferentemente humana caracterizado porque el compuesto es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen codificante del factor de transcripción Snail humano, ya sea Snail1 o Snail2, y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:

a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del factor de transcripción Snail,

b) una ribozima específica del mRNA del factor de transcripción Snail,

c) un aptámero específico del mRNA del factor de transcripción Snail, y

d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína Snail.

12. Uso de un compuesto según la reivindicación 11 caracterizado porque el iRNA de d) se une preferentemente a la secuencia fragmento de RNAm del factor de transcripción Snail (SEQ ID NO 9) o a otro fragmento que comprenda a esta.

13. Composición farmacéutica o un medicamento para el tratamiento de la fibrosis renal caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen codificante del factor de transcripción Snail humano, ya sea Snail1 o Snail2, y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:

b) una ribozima específica del mRNA del factor de transcripción Snail,

c) un aptámero específico del mRNA del factor de transcripción Snail, y

d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA del factor de transcripción Snail.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13 caracterizado porque el iRNA de d) se une preferentemente a la secuencia fragmento de RNAm del factor de transcripción Snail (SEQ ID NO 9) o a otro fragmento que comprenda a esta.

15. Uso de la composición farmacéutica según las reivindicaciones 13 a la 14 en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por fibrosis renal, y consistente en la administración de dicha composición terapéutica que inhibe el proceso de fibrosis.

16. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 15 caracterizado porque la fibrosis renal está provocada por una enfermedad, desorden o patología perteneciente al siguiente grupo: glomerulonefritis, nefropatía IgA, diabetes, daño renal inducido por toxicidad, obstrucción urinaria y deterioro de transplantes renales.