JP2021104027A - 再生医療のためのベクターおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
2016年4月19日に作成され、EFS-Webを介して本明細書と共に電子的に提出された、サイズ15 kbの「UW57WOU1_ST25」という名の配列表のASCIIテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、核酸分子、ベクター、細胞、および関連組成物、ならびに静止細胞の増殖を誘導するためのそれらの使用および再生医療の方法におけるそれらの使用に関連する。
哺乳動物の心筋細胞(CM)の大多数は生後まもなく増殖を停止し、その後の心臓の成長は、過形成、即ち細胞数の増加よりむしろ肥大化、即ち細胞サイズの増大から主に生じる。下等脊椎動物および新生仔哺乳動物損傷モデルにおいて認められる心臓の再生にはCMの増殖が必要とされるため、CMの細胞周期離脱を制御する機構を理解すること、そしてこの細胞周期離脱を元に戻すことができるかどうかということに大きな関心がある。
[本発明1001]
以下を含む発現ベクター:
(a)リジン特異的デメチラーゼ4D(KDM4D)をコードする核酸配列;
(b)該核酸配列に機能的に連結された、KDM4Dの過剰発現をもたらすプロモーター;および
(c)KDM4Dの過剰発現を誘導的に抑制する調節エレメント。
[本発明1002]
(b)のプロモーターが組織特異的プロモーターである、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1003]
組織特異的プロモーターが、心臓組織、骨格筋、ニューロン、膵島細胞、または肝細胞に特異的である、本発明1002の発現ベクター。
[本発明1004]
調節エレメントがテトラサイクリン応答エレメントである、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1005]
本発明1002の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において組織特異的過形成を誘導するための方法。
[本発明1006]
本発明1003の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において心筋細胞(CM)の過形成を誘導するための方法。
[本発明1007]
本発明1003の発現ベクターを含有する心筋細胞(CM)を、哺乳動物の心臓に移植する段階を含む、哺乳動物においてCMの過形成を誘導するための方法。
[本発明1008]
KDM4DをCMに投与する段階を含む、CMの過形成を誘導するための方法。
[本発明1009]
本発明1003の発現ベクターを含有するCMを、哺乳動物の心臓に移植する段階を含む、哺乳動物において心機能を改善する方法。
[本発明1010]
本発明1003の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法。
[本発明1011]
KDM4Dを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法。
[本発明1012]
CM過形成を誘導するのに有効な条件下においてKDM4Dと共にCMを培養する段階を含む、CMを増殖させる方法。
[本発明1013]
CMが成体CM(ACM)である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
CMにおけるヒストンH3のリジン9(H3K9me3)レベルを減少させる段階を含む、心臓の再生を促進する方法。
[本発明1015]
減少させる段階が、心臓の再生を必要とする対象に本発明1003の発現ベクターを投与することを含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
発現ベクターが、該発現ベクターを含有するCMを投与することによって投与される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
減少させる段階が、KDM4Dを投与することを含む、本発明1014の方法。
[本発明1018]
投与が全身投与である、本発明1005〜1006、1008、1010〜1011、および1014〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
投与が静脈内投与である、本発明1005〜1006、1008、および1010〜1011、および1014〜1017のいずれかの方法。
[本発明1020]
投与が心筋内注射による、本発明1005〜1011、および1014〜1017のいずれかの方法。
本発明は、最終的に分化した細胞を、エピジェネティックな操作を介して増殖させるように誘導できるという予想外の知見に基づいている。従って本発明は、ACM細胞周期関連遺伝子のサイレンシングの制御におけるH3K9me3デメチラーゼの役割の発見に基づき、静止細胞において増殖を可逆的に誘導するための材料および方法を提供する。
特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての科学的および技術的な用語は、当技術分野において一般に使用される意味を有する。本明細書において使用される場合、以下の単語または句は特定の意味を有する。
ある態様においては、発現ベクターは以下を含む:(a)リジン特異的デメチラーゼ4D(KDM4D)をコードする核酸配列;(b)核酸配列に機能的に連結された、KDM4Dの過剰発現を誘導する、またはもたらすプロモーター;および(c)KDM4Dの過剰発現を誘導的に抑制する調節エレメント。任意に、ベクターは(d)核酸配列に機能的に連結された組織特異的プロモーターをさらに含む。ある態様においては、組織特異的なKDM4Dの過剰発現は、(b)において組織特異的プロモーターを選択することによってなされる。ある態様においては、組織特異的発現は(b)と付加的なプロモーター(d)の双方によって提供される。KDM4Dは、ヒストン3の9番目のリジン残基(H3K9)を脱メチル化することによって、ヒストン修飾H3K9me3を特異的に除去することができる。
本発明は、本明細書において説明される方法のためにキットとして提供することができる、および/または、使用することができる組成物を提供する。本発明の組成物は、本明細書において説明されるようなベクター、核酸分子、および細胞を含む。本発明の組成物およびキットは、本発明の実施を容易にするための付加的な容器、作用物質、および材料を包含し得る。
本発明は、本明細書において説明されるように哺乳動物に発現ベクターを投与する段階を含む、哺乳動物において組織特異的過形成を誘導するための方法を提供する。本方法は、静止細胞の増殖または再生が関心対象となる任意の器官または組織に合わせて調整することができる。再生または増殖が関心対象となり得る組織の例は、非限定的に、心臓、筋肉、脳、神経系、膵臓および肝臓を含む。本発明の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において心筋細胞(CM)の過形成を誘導するための方法も提供される。本発明は、哺乳動物において心筋細胞(CM)の過形成を誘導するための方法をさらに提供する。本方法は、本発明の発現ベクターを含有するCMを哺乳動物の心臓に移植する段階を含む。
本実施例は、ヒストンH3のリジン9(H3K9me3)のトリメチル化、即ちヘテロクロマチンと関連するヒストン修飾が成体CM(ACM)における細胞周期関連遺伝子のサイレンシングに必要であることを示す。これを試験するために、本発明者らは、CMにおいてヒストンデメチラーゼKDM4DによってH3K9me3が特異的に除去されているトランスジェニック(BiTg)マウスモデルを開発した。CMにおけるH3K9me3の消失は、ACMの細胞周期関連遺伝子のサイレンシングを優先的に妨げ、その結果CMの細胞周期進行が亢進される。正規化された心臓質量は出生後14日(P14)までに増加し、9週齢まで増加し続けた。BiTg心臓においてはACMのサイズではなくACMの数が有意に増加したことから、心臓の質量増加はCMの過形成によって説明されることが示唆される。H3K9me3を激減させた心臓を肥大性成長シグナルによって誘発すると、ACMの有糸分裂活性が刺激された。従って、ACMにおける細胞周期関連遺伝子のサイレンシングにはH3K9me3が必要であり、H3K9me3を激減させることによってインビボで過形成性の成長が行われることを本発明者らは示した。
マウス実験
導入遺伝子の発現を調節するために使用したαMHC-tTAマウスはRobbins labによって作製された(60)。本発明者らは、KDM4Dの発現を促進するために、弱毒化αMHCプロモーターの上流にテトラサイクリン応答エレメントを有する、以前に公表されたレスポンダー構築物を使用した(60)。FLAGタグおよびMYCタグで標識したヒトKDM4D cDNA(origene RC212600)を含有するプラスミドはcDNA配列においてNotI制限酵素切断部位を有していたが、本発明者らはサイレント変異を誘導することによってそれを破壊した(Agilent 200521)。得られたcDNAをレスポンダー構築物にサブクローニングし、その後ベクター骨格を取り除き、精製し、マウス前核に注入した(ワシントン大学トランスジェニックコアファシリティー)。得られたtetトランスジェニックマウスをαMHC-tTA系統と繁殖させ、CM特異的KDM4D誘導モデルを生み出した。トランスジェニックマウスに関与する全ての実験について同腹仔対照を使用した。≧8世代戻し交配してC57/B6系とした、ブリーダーから得られた10〜12週齢の同腹仔に対してTAC手術および偽手術を行った。ケタミン(130 mg/kg 腹腔内投与)およびキシラジン(8.8 mg/kg 腹腔内投与)を用いてマウスを麻酔し、説明されるように26ゲージ針を用いて大動脈縮窄術に供した(103)。
ヘパリン処理したマウスをイソフルランで安楽死させ、心臓を摘出し、KB緩衝液(mmol/L;KCl 20、KH2PO4 10、K+-グルタミン酸70、MgCl2 1、グルコース25、タウリン 20、EGTA 0.5、HEPES 10、0.1%アルブミン、KOHによりpH 7.4)中で停止させた。精製ACM調製物を得るために、大動脈をカニューレ処置し、タイロード液(pH7.4、25uM ブレビスタチン-/-を添加)によって心臓を洗浄し、ランゲルドルフ灌流を用いてコラゲナーゼII(Worthington 4176)およびストレプトマイセス・グリセウスのプロテアーゼXIV(Sigma P5147)によって7分間分解した。心室を解離させ、得られた細胞懸濁液を、100μmメッシュを通して濾過した。低速遠心分離を3回行い、ACMを緩くペレット化し、懸濁液中の非CMを吸引し、ACM集団を密度精製し、>90%の棹型ACMを得た。胎児CMおよび出生後CMの調製物のために、Ads緩衝液(mmol/L: NaCl 116、HEPES 20、NAH2PO4 10.8、グルコース5.5、KCl 5.4、MgSO4 0.83)において心臓を洗浄し、酵素溶液(コラゲナーゼII, パンクレアチン(Sigma P3292))と共に回転させながらインキュベートした。20分ごとに遊離細胞を血清中に回収し(分解の停止)、その結果2時間内に心臓全体が解離された。得られた細胞懸濁液をパーコール(Sigma P4937)密度勾配遠心を用いて分画し、CM層および非CM層を各々回収した。CM調製物の品質および純度は、免疫染色法、フローサイトメトリー、および細胞タイプ特異的マーカーのRNA発現によって確認された。
TRISOL(Sigma T9424)フェノール/クロロホルム精製、それに続くデオキシリボヌクレアーゼ処理(Qiagen 74004)を用いたカラム精製によって細胞および組織からRNAを単離した。ヒト遺伝子発現の試験については、商業的な供給業者から健常なヒト心臓サンプルを得た(Clontech 636532、lot 1206518A;およびAgilent 540011、lot 6151000)。虚血性心疾患サンプルは、左室補助人工心臓の装着を受けた、同意を得ている60代の男性対象に由来した。
KDM2B(Mm01194587_m1)、KDM4A(Mm00805000_m1)、KDM6B(Mm01332680_m1)、KDM8(Mm00513079_m1)、GAPDH(Mm99999915_g1)。
0.5%イソフルラン使用下において、Visual Sonics Vevo 2100を用いてマウスの心電図および心機能を評価した。乳頭筋断面における傍胸骨短軸像をB-およびM-モードにおいて得た。400〜500 BPMの心拍数で画像を得た。遺伝子型については盲検化して、1人の操作者により画像処理および解析を行った。製造者の手引に従ってVevo Labs 1.7.0を用い、画像の定量化を行った。
単離したACMをペレット化し、溶解緩衝液(0.5% NP-40、25mM KCl、5mM MgCl2、10mM Tris-HCl、pH8.0)中に再懸濁し、ホモジナイズし(Wheaton 358103)、可溶性細胞質タンパク質を分離させた。クロマチン関連タンパク質をDNAから分離させるために核濃縮ペレットに以下を含む処理を行った:超音波処理、MNase処理、ならびに1% SDS、600mM NaCl、および20mM βMEの添加。BCAアッセイ(Thermo Scientific 23252)を用いて核タンパク質を定量化し、電気泳動のためにポリアクリルアミドゲルにロードし、続いてPVDF膜上に転写し、標識した抗体:KDM4D(Abcam ab93694)、H3K9me3(Abcam ab8898)、pan H3(Millipore 05-928)、H3K36me3(Active Motif 61101)、H3K9me2(Millipore 07-441)、およびH4K20me3(Abcam ab9053)をプローブとして検出を行った。HRPと結合させた二次抗体(Santa Cruz)およびECL検出法(Thermo Scientific 34095)を使用した。
組織学的解析のために、停止させたP14または9週齢の心臓を4%PFAによって固定した。パラフィン切片はH&E、Massonトリクロームによって染色した、またはFLAG(Sigma F7425)、α-アクチニン(Sigma A7811)、心筋トロポニンT(Thermo Scientific MS-295-P)、Ki67(Abcam ab15580)およびホスホH3(Abcam ab5176)抗体、および核を視覚化するためのヘキスト(Life Technologies H3570)を用いた標準プロトコルによって免疫染色した。共焦点顕微鏡(Nikon A1R)によって画像が得られた。ACM横断面積を評価するために、細胞膜のマーカーであるコムギ胚芽凝集素(WGA、Life Technologies W6748)によって切片を染色した。Nikon Ti-E scopeにおいて、全左心室のスティッチングされた画像を得た。本発明者らは、各切片における複数の領域を無作為に選択したが、大血管、心外膜および心内膜は除外した。そしてImageJの 「粒子分析」機能(WGA染色のネガ画像)を用いて動物個体当たり>1000細胞を解析し、その結果横断面積の直接測定を得た。ACMの縦断面積および長さの測定のために、4%PFAによって単離ACMを固定し、画像化した。各動物個体につき何百というACMの面積および長軸を手作業でトレースし、ImageJの「計測」機能を用いて定量化した。本発明者らは以下の公式を用いてCM体積を計算した:(平均ACM長×平均ACM横断面積)。以下の公式によりCM数を見積もった:[平均心体積(心臓の質量/1.06、筋組織の密度(106)/平均ACM体積×0.75(成体マウス心体積のCMに占められる比率(106))]。動物個体当たり>100細胞について、ACM当たりの核数を手作業によって計測した。
施術マウスのホスホH3染色アッセイにおける細胞タイプの明確な同定のために、方法の項目においてその詳細が説明される、厚さ100μmの心臓切片を作製、染色、および画像化するための方法を本発明者らは開発した。手短に言うと、心臓をKB緩衝液において停止させ、KBによって灌流し、その後-20℃まで冷やしたメタノールによって灌流固定した。心臓をメタノール中で再水和した:PBS勾配(100:0、80:20、60:40)、その後PBSで洗浄し、5%低融点アガロース中にマウントした。Leica 1200s ビブラトームにより厚さ100μmの切片を切り出し、上記に挙げられた試薬およびファロイジン(ThermoFisher Scientific A22287)を用いて懸濁液中において染色した。染色した切片を0.01%ポリ-L-リジンでコーティングしたカバーガラスにマウントした。厚みのある切片の内部が見えるために必要な切片の透明度を高めるよう、それらを透明化した:一連の濃度のイソプロパノール(70%、85%、95%、100%)において切片をインキュベートし、続いてベンジルアルコールと安息香酸ベンジルの1:2溶液中にてインキュベートを行った。サンプルを調製し、共焦点顕微鏡によって画像化し、遺伝子型については盲検化して、1人の操作者により解析を行った。本発明者らは以下の公式を用いてpH3+ ACM数を計算した:[(pH3+ ACM核/mm3)/(核数/ACM)/(ACMmm3]。偽手術を施した心臓における横断面積測定値がベースラインより19.2%少なかったが、ホルムアルデヒドまたはアルコールによる固定後の細胞の縮小を比較した他の報告と一致して、この原因は固定の工程における相違であることに留意する(107)。このことから、術後のメタノール固定処理サンプルにおけるACM数を計算する際には、定数係数1.192をかけることによって全群の横断面積を補正した:[平均心体積(心臓質量/1.06、筋組織の密度(106)/平均ACM体積(平均ACMベースライン長×平均ACM術後の横断面積)×0.75(CMによって占められる、成体マウス心体積の比率(106))]。
全ての結果は平均±平均の標準誤差で表される。一元配置ANOVAについてはGraphpad Prismを使用し、2群を超える群間比較の試験についてはTukey’s Post hoc多重比較検定を行った。二元配置ANOVAについてはGraphpad Prismを使用し、2つの独立変数の試験についてはTukey’s Post hoc 多重比較検定を行った。2群を比較する試験を解析するためにMicrosoft ExcelのF-testおよび両側t検定機能を使用した。計算のために異なる基本計測を組み合わせた結果(図5、DおよびE、ならびに図9D)については、標準誤差をコンピュータ算出するためにブートストラップ法(10,000 ブートストラップサンプル)を使用し、p値をコンピュータ算出するために並べ替え検定(100,000 モンテカルロサンプル)を使用した;ACM横断面積、ACM長、および心体積は独立変数であるとの仮定による。RNA-seq解析については、統計処理を行うためにPartek Genomic Suitesを使用した。
全ての動物試験は施設内動物実験審査委員会(IACUCプロトコル#4290-01)の承認、ワシントン大学機関ガイドライン、および実験動物の管理と使用に関する指針に従って行った。ヒト虚血性心疾患サンプルは、署名しインフォームドコンセントを与えた参加者から得た;ヒトサンプルの使用はワシントン大学施設内治験審査委員会によって承認された(IRB#35358)。
製造者の手引(Agilent 240082)に従ってKDM4AおよびLacZに関連するアデノウイルスを作製した。ラミニンコーティングされたウェルで、1×ITS、1×PS、5mMタウリン、1mM ピルビン酸Na、5mMクレアチン、2mM L-カルニチン、および25mM ブレビスタチンを5%FBSの存在下で添加したM199培地において、単離したACMをプレーティングした。1時間後、2%FBS含有培地に培地を変え、150 moiのウイルスを加えた。ACMは2%FBSを含有する培地において採集の段階まで維持した。5mM フェリシアン化カリウム、5mM フェロシアン化カリウム、2mM MgCl2、および1mg/mL X-galにおいて4時間インキュベートした4% PFA固定ACMについてβ-ガラクトシダーゼ染色を行った。
ドキシサイクリン含有飼料(Harlan TD.00502)を指定の時点に自由に与えた。Dox 2週-9週群は、P14-9wからP18-9wまでの期間、doxを与えられたマウスを含むことに留意する。
心臓の乳頭筋中央面からビブラトーム切片を切り出し、画像化した。ImageJにおいて心筋面積およびLV内腔面積を手作業でトレースし、「測定」ツールを用いて面積を計算した。
製造者の手引に従ってTUNEL染色キット(Life Technologies C10618)を用い、ビブラトーム切片においてアポトーシスを可視化した。TUNEL標識に続き、WGA、ヘキストおよびファロイジンによって染色し、ビブラトーム切片についての手順にて説明されるように画像化した。
CMにおけるH3K9me3ヒストンデメチラーゼ発現の特徴付け
細胞周期関連遺伝子発現の制御におけるH3K9me3の役割をよりよく理解するために、心臓の成長を通した、CMにおける細胞周期とH3K9me3-HDM遺伝子発現との関係を特徴付けた(図1)。過去の研究(9、53、54)と一致して、CM特異的な、細胞周期関連遺伝子の発現における成長に伴う変化は、ミオシンアイソフォームの転換ならびにACMにおけるG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子の劇的なダウンレギュレーションを含んでいた(図1、AおよびB)。細胞周期転写制御因子E2F1はACMにおいては167倍ダウンレギュレートされた(P<0.0001、対E15.5 CM)一方、抑制的E2F4の発現は高いままであった(図1C)。骨格筋(35)およびCM(9)における以前の研究と一致して、Rbおよびp130と対照的に、p107が増殖性筋細胞において特異的に発現されるRbファミリーメンバーであることが見出された(図1C)。KDM4ファミリーメンバーの発現はそれほど劇的ではないが、胎児CM、G2/M、および細胞質分裂関連遺伝子の発現と同様のパターンに従っており、P7の後(図1D)、CMの再生能の喪失と同時期に(2、3)、適度にダウンレギュレートされた。ACMにおけるH3K9me3-HDMのダウンレギュレーションは、ACMにおける、胎児CMと比較した全体的なH3K9me3レベルの増加と一致している(9)。ACMにおいてKDM4Dの基底レベルが低いことは、限られた増殖能しかない組織におけるKDM4Dの発現に関する別の研究と一致している(55、56)。
インビボでのACM細胞周期関連遺伝子のサイレンシングにおけるH3K9me3の役割を探求するために、本発明者らはKDMファミリーメンバー4Dを過剰発現させることにした。なぜならば:1)KDM4Dは最も特異的なH3K9me3デメチラーゼである(50〜52)(図10)、2)それは増殖性CMにおいて発現され、脱分化ACMにおいて増加する(図1、DおよびE)、3)それは肥大性成長が優勢に行われる心筋症サンプルにおいては発現されない(図1F)、4)それは非CMにおける増殖および生存を促進する(46〜48)、および5)機能獲得実験は重複する因子による補償をより受けにくいからである(59)。本発明者らは、テトラサイクリントランス活性化因子(tTA)がCMにおいて特異的に発現される、過去に特徴付けられているテトラサイクリン誘導性(tet-off)過剰発現モデルを使用した(60)。本発明者らは、弱毒化αMHCプロモーターに関連する、tTA結合配列を有するテトラサイクリン反応性プロモーターの下流にMYC-およびFLAG-タグ標識したKDM4D cDNAを含有するCM特異的トランスジェニックマウス系統を作製した(60)。ヘテロ接合体tet反応性KDM4D(tet)マウスと共にヘテロ接合体tTAマウスを繁殖させたところ、CMにおいて特異的にKDM4Dを構成的発現する二重トランスジェニック(BiTg)マウス(図2A)、ならびにシングルトランスジェニック対照(tetまたはtTA)および非トランスジェニック対照(非Tg)が得られた。BiTgのCMにおいては、tTAタンパク質が発現され、KDM4Dの上流のtet応答エレメントに結合し、KDM4D導入遺伝子発現を誘導する(図2A)。本発明者らは、P14および9週においてBiTgの心臓でKDM4D発現が強く誘導されることを確認した(図2B)。BiTgマウスの他の器官または非CM心臓細胞においては、KDM4D導入遺伝子発現は検出できなかった(図11、AおよびB)が、例外的に、αMHCプロモーターを用いた過去の報告(60)と一致して、BiTgの肺において低レベルで検出可能であった。心臓切片の免疫蛍光画像処理から、外来性KDM4Dタンパク質が特異的に発現され、BiTgのCMの核に局在化したことが示された(図2C)。ウエスタンブロット法により、BiTg ACMにおけるKDM4Dタンパク質の発現が確証され、全体的なH3K9me3レベルが激減したことが示された(図2D)。本発明者らはまた、他のKDM4ファミリーメンバーとは対照的に(図10)、KDM4Dデメチラーゼ活性はH3K9me3に特異的であり(50〜52)、ACMにおけるH3K9me2またはH3K36me3を脱メチル化しなかったことをも確証した(図2D)。特定の遺伝子座におけるメチル化レベルの変化の可能性は除外されていないが、H3K9me3およびHP1の下流の抑制的指標として関係付けられた(61〜63)、H4K20me3には変化がなかった(図2D)。
インビボにおける全体的な遺伝子発現に対してH3K9me3の激減が与える影響を評価するために、本発明者らは9週のACMについてRNA配列決定を行った。制約なし勾配相関法(unconstrained slope correlation test)によって、全ゲノムトランスクリプトームを比較した場合にR2=0.9764が示され、非Tgと単一トランスジェニックマウスには遺伝子発現の違いが示されなかったため、対照ACMサンプルをグループ化した。RNA-seq解析によってBiTg ACMが138個の細胞プロセスのうち16個、および142個の細胞周期プロセスのうち16個に関わる遺伝子の発現を増加させたことが明らかになった(図3、AおよびB)。際立ったことに、細胞周期進行に関わる細胞のプロセスが優先的に増加していた(図3A)。細胞周期プロセス内では、後期細胞周期の、特に有糸分裂に関与する区分の期が遺伝子発現の増加を示していた(図3B)。本発明者らは、G2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子における増加をqRT-PCRによって確証した(5.8〜21.4倍、P<0.01)。また、胎児CM遺伝子も増加していた(図3C)。胎児CM遺伝子の発現は高い頻度で病的状態と関連するが、より未熟なCMに特異的な遺伝子の発現が、胎児や新生仔の心臓における増殖能力のあるCMでも変わらなかったことは留意されるべきである(9、64)(図1、AおよびB)。本発明者らはまた、細胞周期関連遺伝子転写制御因子についても試験し(図12、AおよびB)、細胞周期進行の正の制御因子E2F1およびE2F2が、BiTgマウスのACMにおいては対照ACMと比べて高度に発現されたことを見出した(>12倍、P<0.03)。抑制的E2FメンバーであるE2F4-6には変化がなかった。興味深いことに、増殖性筋細胞におけるE2F/Rbファミリーの発現と一致して(図1、BおよびC)、BiTgのACMにおいてはp107も増加した(図12B)。
BiTgマウスは、9週における体重に対する心臓重量の比率(HW/BW)が20.8%増えており(図4B;P<0.0001)、目に見えてより大きな心臓を有していた(図4A)。HW/BWにおけるこの増加はBiTgマウスにおいてはP14で最初に明らかとなり(図4C;12.9%増、P<0.001)、KDM4Dの過剰発現が出生後の心臓の成長を特異的に促進したことが示唆された。この心臓の肥大は筋節の乱れ、線維化または脈管構造の変化とは関連しておらず(図4、DおよびE)、細胞外マトリックスにおいては増加がなかった(65)(図4E)。ACM横断面積の定量化または単離ACMの縦断面積および長さの直接測定では、対照と比較したBiTg ACMにおける径または算出体積の差異は明らかではなかった(図5、A〜D)。算出された筋細胞数から、BiTg心臓は対照と比較してACMが22%多かったことが示された(図5E;P<0.03)。H3K9me3激減の心機能に対する長期効果を決定するために、本発明者らは7月齢のBiTgマウスおよび対照マウスに対して心エコー検査を行った;駆出率、短縮率、心拍出量、および左心室サイズは全群において同様であった(表1)。心機能または形態における有意な差は認められなかった。
7月齢のマウスにおける心エコー検査の結果。HR:心拍数、EF:駆出率、CO:心拍出量、LVEDD:左心室拡張末期径、LV質量:左心室質量。平均およびSEM値が示される。サンプル数:各遺伝子型につきN=3。統計:一元配置ANOVA/Tukey法。*P<0.05対非Tg、†P<0.05対tet、‡P<0.05対tTA。
対照と比べて高度にアップレギュレートされても、BiTg ACMにおける後期細胞周期関連遺伝子の発現は野生型の胎児CMおよび出生後CMよりはずっと少ない(図1Bと図3Cとを比較)。BiTg心臓において増加されてはいるが、細胞周期進行しているCMの絶対数も少なく、正規化された心臓質量は9週と7か月の間にさらには増加しなかった(図4C)ことから、成体BiTg心臓においてはベースラインでのCM増殖が非常に限られたものであることが示唆される。典型的に肥大性成長を生じるTAC後には、数多くの成長因子シグナル伝達経路の強い活性化があるため(9、66)、インビボにおいてKDM4DがACM増殖を促進する能力を試験するために優れたモデルではないかと考えられた。これにより、TACのような肥大性成長シグナルがH3K9me3激減ACMにおいて過形成を誘導するかどうか、または、それらが対照心臓と同様に肥大化を経るかどうかを決定することができた。BiTgおよび同腹仔対照は11週齢に偽手術またはTAC術を受け、術後10日に試験された。非施術マウスと同様に、偽手術を受けたBiTg心臓は、対照より目に見えて大きかった(図8A)。TACは、対照マウスにおけるHW/BWの20.9%の増加と比較して、BiTgマウスにおいてはHW/BWの48.2%の増加を誘導した(図8B;P<0.0001)。TAC誘導の心臓の成長がACMの肥大化または過形成のどちらによって生じたのかを決定するために、ACM横断面積を測定した。偽手術BiTg ACMは偽手術対照と同様であった(図5A);しかし、TAC BiTg ACMについては、TAC対照ACMと比較して横断面積が12.5%小さかった(図9、AおよびC;P<0.05)。TAC後にACMでは長さではなく横断面積が増加するため(67)、本発明者らはCM数を評価し、BiTg心臓のACMにおいては対照と比較して56.6%の増加があったことを認めた(図9D、P<0.001)。TAC後にBiTg ACMが細胞周期進行していることを確証するために、ホスホH3についてアッセイを行い、BiTgマウスのpH3+ ACMにおいては対照マウスと比較して41倍の増加があったことを認めた(0.77%対0.019%;P<0.0001)(図9、AおよびB)。この細胞周期活性は線維化(図8Cおよび図9A)またはアポトーシスの増加(図13)とは関連していなかった。CMの細胞周期進行の再誘導が心機能に負の影響を与えるかどうかを決定するために、術後9日に2Dエコーを行った(表2)。TAC後、BiTgマウスにおいてはLVEDDが増加すると共に、駆出率が減少した。しかし、計算された心拍出量には変化はなく、これはおそらくBiTg心臓の心室のサイズによるものと推察される(図14)。
術後10日の12週齢のマウスにおける心エコー検査の結果。HR:心拍数、EF:駆出率、CO:心拍出量、LVEDD:左心室拡張末期径、LV質量:左心室質量。平均およびSEM値が示される。サンプル数:偽手術、対照=4、BiTg=4;TAC、対照=9、BiTg=8。統計:両側t検定、対照対BiTg、*P<0.05。
CMの増殖によって新生仔哺乳動物の心臓が再生できる(2、3)、およびACMが非常に限られてはいるが幾らかの分裂能を保持している(7)という発見から、ACMの細胞周期の制御についての興味が再燃している(4、69〜71)。哺乳動物の新生仔CMにおいて増殖を促進できる多くの戦略が、ACMにおいては効果がなかった(72、73)ことから、ACMにおいては増殖に対して強力な障壁があるということが強調されている。近年、心外膜パラクリン因子FSTL1(70)、miR-15の阻害(3)、およびNRG1コレセプターErbb2(74)がACM増殖を促進することが示唆されたが、ACMにおける分子機構および関連標的は未だ理解され得ないままである。本発明者らは以前に、ACMのG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子においてはヘテロクロマチンマーカーH3K9me3が胎児CMと比べて濃縮されることから、この指標がACM増殖に対する障壁と関係付けられることを見出した(9)。本例では、成長、脱分化、および疾患におけるH3K9me3デメチラーゼの発現が特徴付けられ、KDM4Dが胎児CMにおいて発現されたこと、そして脱分化するACMにおいてアップレギュレートされた主要なH3K9me3特異的デメチラーゼであったことが示される。CM特異的なKDM4Dの過剰発現はH3K9me3を特異的に激減させ、ACMにおけるG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子の発現、心臓の質量、ACM数、およびACM有糸分裂活性の増加を導いた。
心臓組織の再生についての動物モデルは図16において説明される。本モデルを用いたところ、図17において説明されるように、KDM4D過剰発現マウスは組織学的解析について、MI(心筋梗塞)後における再生の増強を示す。MI後21日にKDM4D過剰発現マウスでは、平均線維化面積および最大線維化面積の双方において、対照マウスと比べて統計学的に有意な(p<0.05)減少が認められた。これらのデータから、心臓組織の再生医療についてのKDM4Dの有用性が示される。
遺伝子治療を用いた心臓再生の実施および評価のためにベクターを構築することができる。ベクターはAAV6もしくはAAV9のようなAAVウイルス、または心筋細胞についての特異性を提供する他のハイブリッドAAV血清型を用いて構築することができる。CM特異的発現についてはトロポニンプロモーターが使用される。AAV-KDM4Dベクター(SEQ ID NO:1および任意にSEQ ID NO:2を発現する)を心筋梗塞時にまたはその直後に、心臓組織に注入する。回復および再生をモニタリングするために、その後ある時間間隔で心エコー検査(ECHO)および心臓磁気共鳴(CMR)による心機能の評価を行う。試験の終わりに、梗塞サイズおよびACM増殖を評価する。
Claims (20)
- 以下を含む発現ベクター:
(a)リジン特異的デメチラーゼ4D(KDM4D)をコードする核酸配列;
(b)該核酸配列に機能的に連結された、KDM4Dの過剰発現をもたらすプロモーター;および
(c)KDM4Dの過剰発現を誘導的に抑制する調節エレメント。 - (b)のプロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項1記載の発現ベクター。
- 組織特異的プロモーターが、心臓組織、骨格筋、ニューロン、膵島細胞、または肝細胞に特異的である、請求項2記載の発現ベクター。
- 調節エレメントがテトラサイクリン応答エレメントである、請求項1記載の発現ベクター。
- 請求項2記載の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において組織特異的過形成を誘導するための方法。
- 請求項3記載の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において心筋細胞(CM)の過形成を誘導するための方法。
- 請求項3記載の発現ベクターを含有する心筋細胞(CM)を、哺乳動物の心臓に移植する段階を含む、哺乳動物においてCMの過形成を誘導するための方法。
- KDM4DをCMに投与する段階を含む、CMの過形成を誘導するための方法。
- 請求項3記載の発現ベクターを含有するCMを、哺乳動物の心臓に移植する段階を含む、哺乳動物において心機能を改善する方法。
- 請求項3記載の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法。
- KDM4Dを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法。
- CM過形成を誘導するのに有効な条件下においてKDM4Dと共にCMを培養する段階を含む、CMを増殖させる方法。
- CMが成体CM(ACM)である、請求項12記載の方法。
- CMにおけるヒストンH3のリジン9(H3K9me3)レベルを減少させる段階を含む、心臓の再生を促進する方法。
- 減少させる段階が、心臓の再生を必要とする対象に請求項3記載の発現ベクターを投与することを含む、請求項14記載の方法。
- 発現ベクターが、該発現ベクターを含有するCMを投与することによって投与される、請求項15記載の方法。
- 減少させる段階が、KDM4Dを投与することを含む、請求項14記載の方法。
- 投与が全身投与である、請求項5〜6、8、10〜11、および14〜17のいずれか一項記載の方法。
- 投与が静脈内投与である、請求項5〜6、8、および10〜11、および14〜17のいずれか一項記載の方法。
- 投与が心筋内注射による、請求項5〜11、および14〜17のいずれか一項記載の方法。
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