ES2894673T3 - Vectores y métodos para terapia regenerativa - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión para el uso en cardioterapia regenerativa que comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica la desmetilasa 4D específica de lisina (KDM4D); (b) un promotor específico de tejido cardíaco que efectúa la sobreexpresión de KDM4D, en donde el promotor está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico; y (c) un elemento regulador que reprime de forma inducible la sobreexpresión de KDM4D.

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores y métodos para terapia regenerativa

Referencia a un listado de secuencias enviado por medio de EFS-Web

El contenido del archivo de texto ASCII del listado de secuencias denominado "UW57WOU1_ST25", que tiene un tamaño de 15 kb, se creó el 19 de abril de 2016 y se envió electrónicamente por medio de EFS-Web con esta solicitud.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico, vectores, células y composiciones relacionadas y su uso para inducir la proliferación de células inactivas y su uso en métodos de terapia regenerativa.

Antecedentes de la invención

La gran mayoría de los cardiomiocitos (CM) de mamíferos dejan de proliferar poco después del nacimiento y el crecimiento cardíaco posterior proviene principalmente de la hipertrofia, un aumento en el tamaño de las células, en lugar de la hiperplasia, un aumento en el número de células. Debido a que la proliferación de CM se requiere para la regeneración del corazón observada en modelos de lesión de vertebrados inferiores y mamíferos neonatales, existe un gran interés en comprender los mecanismos que regulan la salida del ciclo celular de los CM y si esta retirada del ciclo celular puede revertirse.

La cardiopatía isquémica que conduce a la insuficiencia cardíaca12 es la principal causa de muerte en el mundo3. Aunque los corazones humanos adultos no pueden reemplazar los CM perdidos después de una lesión, se observa una regeneración cardíaca sustancial en modelos de vertebrados inferiores y mamíferos. El pez cebra adulto4 y los ratones neonatales5 pueden regenerar sus corazones después de que se haya amputado >15 %. Los modelos de infarto de miocardio (IM) en ratones neonatales ofrecen un modelo de lesión clínicamente más relevante para demostrar la capacidad de regeneración del corazón en mamíferos67. Un hallazgo común en estos estudios fue el mecanismo por el cual se produjo la regeneración cardíaca. Se observó formación de coágulos de sangre, inflamación y deposición de colágeno en respuesta a las lesiones, pero finalmente nuevos CM repoblaron el tejido perdido. Los estudios de mapeo del destino revelaron que los nuevos cardiomiocitos provenían de la desdiferenciación y la proliferación de cardiomiocitos preexistentes, en lugar de células madre o progenitoras cardíacas4-6. Sin embargo, cuando se indujo una lesión cardíaca en ratones en un momento posterior, el día 7 posnatal (P7), se perdió la respuesta regenerativa, lo que condujo a una cicatrización fibrótica56 similar a lo que se observa con los iM humanos12. Por lo tanto, los corazones de los mamíferos pierden su capacidad regenerativa en una etapa temprana de la vida, un proceso que requiere la proliferación de CM.

La poca respuesta regenerativa que se observa en los corazones de los adultos pone de relieve la cuestión de si hay algún recambio de CM en los adultos. Aunque ha habido controversia sobre el alcance de la proliferación de ACM, estudios elegantes han estimado una tasa de renovación anual del 0,8 % en mamíferos89. Pero se demostró que esta fuente muy limitada de nuevos ACM proviene de ACM preexistentes8. La tasa de hiperplasia de ACM aumentó ligeramente después del IM, aunque la mayor parte de la actividad de síntesis de ^a Dⁿ dio como resultado poliploidización y multinucleación, en lugar de división celular completa8. En consistencia con la división celular de ACM muy poco frecuente, el análisis de la expresión de genes revela una regulación negativa drástica de los genes de progresión del ciclo celular en los ACM en comparación con los CM embrionarios10. Los modelos de constricción transaórtica (TAC) de sobrecarga de presión estimulan la expresión en ACM de los genes promotores de la fase G1/S, pero los genes que promueven la mitosis y la citocinesis permanecen silenciados10. Dado que los genes de fase G1/S se requieren para la hipertrofia de CM1112, los resultados de la expresión de genes son consistentes con el crecimiento restringido a hipertrofia y el aumento del contenido de ADN mostrado en los ACM después de TAC o IM813. Por lo tanto, los ^a C^m tienen un crecimiento celular que está desacoplado de la división celular14. Curiosamente, el cambio de los CM a un crecimiento hipertrófico coincide con la pérdida posnatal de la capacidad de regeneración5613.

El silenciamiento estable de los genes de G2/M y citocinesis representa parte del cambio en el perfil de expresión de genes que se produce cuando los CM experimentan diferenciación terminal13. Estudios recientes sugieren que los mecanismos epigenéticos, tales como las modificaciones postraduccionales de las proteínas histonas, la metilación del ADN y los ARN no codificantes, dirigen los cambios en la expresión de genes que se producen durante el desarrollo cardíaco y la enfermedad615-19. La modulación de los mecanismos epigenéticos puede retrasar la pérdida del potencial proliferativo y regenerativo de los CM hasta la adolescencia, pero la regeneración en los corazones de los adultos sigue siendo difícil de lograr20. De manera simplista, hay dos tipos de estructura y función de la cromatina definidas epigenéticamente: eucromatina accesible y en transcripción activa y, por el contrario, heterocromatina condensada y silenciada transcripcionalmente2122. Cada tipo de cromatina está asociado con distintos conjuntos de modificaciones de histonas y proteínas asociadas a la cromatina22-24. Se cree que las modificaciones de histonas establecen diferentes estados de la cromatina al alterar físicamente su estructura25-27, así como al reclutar otras proteínas efectoras que poseen dominios de unión específicos de modificación21’22. En general, la eucromatina está enriquecida con acetilaciones de histonas, H3K4me3 y H3K36me3, que reclutan la maquinaria transcripcional22 Por el contrario, la heterocromatina está enriquecida con H3K9me3, H3K27me3 y H4K20me3: metilaciones represoras que reclutan miembros de la familia de proteína de la heterocromatina 1 (HP1), proteínas Polycomb y otros efectores represores2122. Curiosamente, las células que han salido permanentemente del ciclo celular muestran una notable diferencia en la organización de la cromatina dentro del núcleo. En los CM fetales en proliferación, existe una heterocromatina limitada que se organiza en muchos focos pequeños dentro del núcleo, mientras que en los ACM, estos focos se acumulan en unos pocos focos grandes con heterocromatina adicional en la lámina nuclear10. Se observan patrones similares en otras células no proliferativas; la acumulación de heterocromatina coincide con la diferenciación terminal y la salida del ciclo celular28-30.

Los miembros de la familia de E2F y retinoblastoma (Rb, p107, p130) están en la interfaz de la regulación de genes del ciclo celular y de la estructura de la cromatina31-34. En las células en proliferación, las proteínas de la familia de E2F se unen a una secuencia consenso encontrada en los promotores de muchos genes de progresión del ciclo celular, donde actúan como reguladores maestros de la división celular3435. Cuando los miembros de la familia de Rb hipofosforilados se unen a E2F, inhiben la expresión de genes del ciclo celular y la proliferación celular. Sin embargo, la estimulación mitogénica puede conducir a la fosforilación de las proteínas Rb, lo que libera E2F para activar la expresión de genes del ciclo celular34. A diferencia de las células inactivas, los miocitos esqueléticos y cardíacos diferenciados terminalmente no proliferan en respuesta a estímulos mitogénicos3637. Esta salida permanente del ciclo celular está mediada por el reclutamiento dependiente de Rb de proteínas asociadas a H3K9me3 y H3K27me3 a promotores de genes dependientes de E2F10323839. H3K9me3 y H3K27me3 están altamente enriquecidas en promotores de genes del ciclo celular en los ACM en comparación con los CM embrionarios, donde H3K9me3 muestra un enriquecimiento preferencial en promotores de genes de G2/M y citocinesis10 La inactivación génica (KO) de Rb específica de ACM, combinada con la eliminación de p130 de la línea germinal, anuló la formación de heterocromatina de los genes del ciclo celular en los ACM10. Los ACM en estos ratones regularon positivamente los genes del ciclo celular, que incluyen los genes de G2/M y citocinesis, lo que dio como resultado la proliferación de ACM. Los ratones Rb/p130 KO desarrollan insuficiencia cardíaca, aunque no está claro si es un resultado de la proliferación de ACM o debido a cambios más amplios en el perfil de expresión de genes y la pérdida de la organización global de la heterocromatina10. Las proteínas de la familia de Rb interactúan con muchos modificadores de cromatina y factores de transcripción que también gobiernan la expresión de genes fuera del ciclo celular3334, lo que dificulta la atribución de cambios en los corazones Rb/p130 KO a un solo factor o vía. La perturbación específica de H3K9me3 in vitro por atenuación de la metiltransferasa Suv39h1 de H3K9me3 dio como resultado una reducción global de H3K9me3, acompañada de una reinducción específica de los genes de G2/M y citocinesis en ACM, pero esto no se observó in vivo10. La eliminación de HP1y también reindujo específicamente los genes del ciclo celular tardío en ACM, lo que demuestra que H3K9me3 y su efector corriente abajo se requieren para el silenciamiento de estos genes in vitro10, pero su papel fisiológico in vivo sigue siendo incierto.

Sigue existiendo la necesidad de comprender los mecanismos que regulan la salida del ciclo celular de los CM y proporcionar los medios mediante los cuales se pueda revertir esta retirada del ciclo celular. Además, sigue existiendo la necesidad de métodos de tratamiento de la cardiopatía isquémica para reducir la incidencia de insuficiencia cardíaca y las muertes relacionadas.

Muhammad Zoabi y otros se refieren a que la localización dependiente de ARN en la cromatina de la lisina desmetilasa KDM4D promueve la desmetilación de H3K9me3 (Nucleic Acids Res. (2014), vol. 42, núm. 21, páginas 13026-38).

Tae-Dong Kim y otros se refieren a la regulación del supresor de tumores p53 y la fisiología de células HCT116 por la histona desmetilasa JMJD2D/KDM4D (PLoS ONE (2012), vol. 7, núm. 4, página e34618).

Kyohei Oyama y otros se refieren al potencial de regeneración de cardiomiocitos adultos (Cell Research (2013), vol.

23, núm. 8, páginas 978 - 979).

Matoba Shogo y otros se refieren al desarrollo embrionario después de la transferencia nuclear de células somáticas impedida por la metilación persistente de histonas (Cell, (2014), vol. 159, núm. 4, páginas 884 - 895).

Tingare y otros se refieren a la epigenética en el corazón y al papel de las modificaciones de histonas en la remodelación cardíaca (Biochemical Society Transactions, (2013), vol. 41, páginas 789 - 96).

Resumen de la invención

La invención se define en las reivindicaciones.

Se describe un vector de expresión que puede alterar el silenciamiento de genes del ciclo celular en células adultas, tales como cardiomiocitos adultos y otras células inactivas en tejidos diferenciados terminalmente. Otros ejemplos de células inactivas y tejidos diferenciados terminalmente en los que pueden usarse vectores y usos en los métodos de la invención para inducir la proliferación incluyen, pero no se limitan a, músculo esquelético, neuronas, células de los islotes pancreáticos y hepatocitos. Estos vectores y usos en los métodos proporcionan herramientas para la terapia regenerativa y la reparación de tejidos.

En una modalidad de la presente invención, se proporciona un vector de expresión para el uso en cardioterapia regenerativa que comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica la desmetilasa 4D específica de lisina (KDM4D); (b) un promotor específico de tejido cardíaco que efectúa la sobreexpresión de KDM4D, en donde el promotor está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico; y (c) un elemento regulador que reprime de forma inducible la sobreexpresión de KDM4D. Opcionalmente, el vector comprende además (d) un promotor específico de tejido unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico. La KDM4D puede eliminar específicamente la modificación de histona H3K9me3 mediante la desmetilación del residuo de lisina en la posición 9 (H3K9) de la proteína de la heterocromatina 1 (HP1).

El promotor de (b) es un promotor específico de tejido cardíaco. Promotores independientes pueden cumplir las funciones descritas en (b) y (d) anteriores. Los ejemplos representativos de promotores específicos de tejido incluyen, pero no se limitan a, promotores específicos de tejido cardíaco, músculo esquelético, neuronas, células de los islotes pancreáticos o hepatocitos. Un promotor que es específico de tejido promueve la expresión del gen codificado por la secuencia de ácido nucleico predominantemente en el tejido particular. El promotor específico de tejido es específico de tejido cardíaco. Un promotor de cadena pesada de a-miosina (aMHC) es un ejemplo de un promotor específico del corazón. En otra descripción, el promotor específico de tejido es específico de tejido hepático o hepatocitos. Un promotor de CBA es un ejemplo de un promotor específico del hígado. Otros ejemplos de promotores específicos de tejido conocidos en la técnica incluyen los promotores de enolasa específica de neuronas (NSE) y de tubulina al para neuronas, promotores de al-antitripsina y de albúmina (ALB) para hepatocitos, y de troponina, CMV o cadena ligera de miosina-2 (MLC2) para cardiomiocitos.

Los ejemplos representativos de un elemento regulador que puede reprimir de forma inducible la expresión (o sobreexpresión) incluyen, pero no se limitan a, elementos sensibles a tetraciclina. Los expertos en la técnica apreciarán métodos alternativos de expresión de genes controlada que pueden adaptarse para el uso de una manera similar para regular la expresión de KDM4D, tanto temporal como histológicamente. Por ejemplo, el elemento regulador puede permitir la regulación positiva de la expresión de KDM4D, mientras que, alternativamente, el elemento regulador puede permitir la regulación negativa de la expresión de KDM4D. En otro ejemplo, el elemento regulador permite la regulación de la expresión de KDM4D específica de tejido y/o específica de condición.

Los vectores para el uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen vectores virales, así como vectores no virales, partículas similares a virus, vectores bacterianos, vectores bacteriófagos y otros vectores conocidos en la técnica. El vector puede ser un vector viral. El vector viral puede ser un vector de virus adenoasociado (AAV) u otro vector adecuado para infectar células inactivas. Los ejemplos representativos de un vector AAV incluyen, pero no se limitan a, AAV6 y AAV9.

En el presente documento también se describe un método para inducir la proliferación en una célula de mamífero mediante la reducción de los niveles de H3K9me3 en la célula por medio de KDM4D. En el presente documento se describe un método para inducir hiperplasia específica de tejido en un mamífero que comprende administrar al mamífero un vector de expresión como se describe en el presente documento. Opcionalmente, se proporciona un vector de expresión de la invención para el uso en un método para inducir hiperplasia de cardiomiocitos (CM) en el mamífero. La invención proporciona además el uso en un método para inducir hiperplasia de cardiomiocitos (CM) en un mamífero. El uso comprende injertar CM en el corazón del mamífero, en donde los CM contienen un vector de expresión de la invención.

De acuerdo con la invención, también se proporciona KDM4D para el uso en cardioterapia regenerativa en un mamífero, el uso comprende administrar KDM4D al mamífero. La invención proporciona adicionalmente KDM4D para el uso en un método para inducir hiperplasia de CM que comprende administrar KDM4D a los CM. La KDM4D puede administrarse con el uso de una modificación del péptido y/o un medio de suministro que proteja la actividad de KDM4D. La administración puede ser oral, intravenosa, subcutánea o transdérmica.

En el presente documento se describe un método para mejorar la función de un órgano en un mamífero que comprende injertar en el órgano células modificadas genéticamente con un vector de expresión de la invención. El órgano puede ser, por ejemplo, corazón, músculo, cerebro, páncreas o hígado. En una modalidad, la invención proporciona un vector de expresión de la invención para el uso en un método para mejorar la función cardíaca en un mamífero que comprende injertar CM en el corazón del mamífero, en donde los CM contienen un vector de expresión de la invención. En el presente documento se describe un método para mejorar la función cardíaca en un mamífero que comprende administrar al mamífero un vector de expresión de la invención. También se describe un método para mejorar la función cardíaca en un mamífero que comprende administrar KDM4D al mamífero.

La invención proporciona además un método de proliferación de CM in vitro que comprende cultivar CM con KDM4D en condiciones eficaces para inducir hiperplasia de CM. En una modalidad, los CM son CM adultos (ACM). Además, se describe un método para promover la regeneración cardíaca que comprende reducir los niveles de lisina 9 de histona H3 (H3K9me3) en CM. La reducción puede comprender administrar un vector de expresión de la invención a un sujeto que necesite regeneración cardíaca. El vector de expresión puede administrarse mediante la administración de CM que contienen el vector de expresión. Alternativamente, la reducción puede comprender administrar KDM4D.

Los usos de la invención pueden implicar la administración al sujeto por cualquiera de una variedad de medios comprendidos por los expertos en la técnica como adecuados para circunstancias particulares. En algunas modalidades, la administración es sistémica. En otras modalidades, la administración es intravenosa. En algunas modalidades, la administración es mediante inyección intramiocárdica. El sujeto es típicamente un mamífero. El mamífero puede ser humano. Alternativamente, el mamífero puede ser un sujeto veterinario. Los ejemplos de sujetos veterinarios incluyen, pero no se limitan a, sujetos equinos, caninos, bovinos, porcinos, ovinos y felinos. Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1F. Caracterización de histona desmetilasas en el desarrollo y la enfermedad. (1A-1D) niveles de expresión en CM a E15.5, P3, P7 y 10 semanas (adultos) de (1A) genes de cardiomiocitos, (1B) genes de progresión del ciclo celular, (1C) reguladores del ciclo celular y (1D) miembros de la familia de desmetilasa KDM4 de H3K9me3 durante el desarrollo. (1E) Expresión de genes de las HDM en ACM de ratón desdiferenciados. (1F) Expresión de KDM4D en una muestra de miocardiopatía isquémica humana (IHD), expresión normalizada respecto a GAPDH. Número de muestras: (A-D) P0=3, P3=2, P7=4, semana 10=3. (1E) A^c M=3, Desdif. ACM=3. (1F) Normal=2, IHD=3. Estadísticas: (1A-lD) ^a N^o VA unidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a E15.5, f P<0,05 frente a P3, t P<0,05 frente a P7. (1E-1F) Prueba T bilateral, * P<0,05.

Figuras 2A-2D. Generación del modelo de KDM4D específico de cardiomiocitos. (2A) Esquema que

muestra la estrategia de reproducción que da como resultado ratones BiTg y la inducción de KDM4D

en CM de BiTg. (2B) La expresión del transgén de KDM4D está fuertemente inducida en ACM de BiTg y corazones de P14, inducción en veces frente al control tet. (2C) Los ratones BiTg muestran una localización nuclear de KDM4D (etiqueta FLAG) específicamente en CM. (2D) Inducción de la proteína KDM4D y niveles globales de metilaciones de histonas específicas en ACM de 9 semanas. Número de muestras: (2B-2D) Cada ensayo tenía >3 animales por grupo. Estadísticas: ANOVA unidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a , f P<0,05 frente a tet, t P<0,05 frente a tTA.

Figuras 3A-3C. Expresión de genes en ACM que sobreexpresan KDM4D. (3A) Puntuaciones de enriquecimiento de Gene Ontology para "Proceso celular" y (3B) "Proceso del ciclo celular". Las puntuaciones de enriquecimiento de GO se generaron a partir de listas que contenían todos los genes con un aumento >3 veces en los ACM de BiTg a las 9 semanas en comparación con los controles. (3C) Expresión de genes de CM y del ciclo celular en ACM de 9 semanas, inducción en veces frente a NoTg. Número de muestras: (3A-3B) Control=2, BiTg=2. (3C) NoTg=3, tet=6, tTA=3, BiTg=5. Estadísticas: (3A-3B) Se usó ANOVA unidireccional para identificar genes con expresión alterada significativamente (P<0,05), se usó la prueba exacta de Fisher para identificar términos de GO con puntuaciones de enriquecimiento significativas (P<0,05). (3C) ANOVA unidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a NoTg, f P<0,05 frente a tet, t P<0,05 frente a tTA.

Figuras 4A-4E. La masa cardíaca aumenta en ratones con inducción de KDM4D. (4A) Imagen representativa que muestra corazones de BiTg fijados con PFA y de control a las 9 semanas, marcas=1 mm. (4B) Cuantificación de HW/BW a las 9 semanas que muestra que el fenotipo de crecimiento cardíaco es específico de los ratones BiTg. (4C) Cuantificación de HW/BW en diferentes edades de ratones, normalizada respecto a los controles para cada punto de tiempo. (4D) Tinción H&E en corazones de NoTg y BiTg de 9 semanas. (4E) Tinción WGA en corazones de NoTg y BiTg de 9 semanas y 4 semanas después de la cirugía TAC en ratones NoTg, que da como resultado fibrosis visible. Número de muestras: (4A-4B) NoTg=6, tet=11, tTA=9, BiTg=10. (4C) P0, Control=22, BiTg=9; P14, Control=14, BiTg=6; Control 9 semanas=26, BiTg=10; Control de 7 meses=19, BiTg=10. (D-E) Imágenes representativas de N>3 para cada grupo. Estadísticas: (4B) ANOVA unidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a NoTg, f P<0,05 frente a tet, t P<0,05 frente a tTA. (4C) Prueba T bilateral, control frente a BiTg, * P<0,05.

Figuras 5A-5E. El número de cardiomiocitos aumenta en ratones BiTg. (5A) Izquierda, tinción WGA en corazones de NoTg y BiTg de 9 semanas fijados con PFA, barra=20 pm. Derecha, cuantificación del área transversal de ACM. (5B) Cuantificación del área longitudinal y (5C) longitud medida en CM dispersos y aislados de 9 semanas, con imágenes representativas debajo. (5D) Volumen de ACM calculado y (5E) Número de ACM a las 9 semanas de edad. Número de muestras: (5A-5E) Cada ensayo tenía >3 animales por grupo. Estadísticas: (5A) ANOVA unidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a NoTg, f P<0,05 frente a tet, t P<0,05 frente a tTA. (5B, 5C) Prueba T bilateral, control frente a BiTg, * P<0,05. (5D-5E) Se usó el método de remuestreo para calcular el error estándar y se usó la prueba de permutación para calcular el valor p, * P<0,05.

Figuras 6A-6D. Actividad del ciclo celular de cardiomiocitos persistente y a bajo nivel en corazones de BiTg adultos. Tinción de marcador mitótico fosfo-H3 (pH3) en cortes de corazón de NoTg y BiTg (6A) a P14 y (6B) 9 semanas, bar=40 pm. (6A) Las flechas blancas apuntan a núcleos de no CM pH3+, las puntas de flecha amarillas apuntan a núcleos de CM pH3+. (6B) Derecha, gran aumento de la región encuadrada, barra=10 |jm. (6C) Marcador de ciclo celular Ki67 en corazones de BiTg de 9 semanas, barra=10 jm. (6D) Cuantificación del número de núcleos en ACM de 7 meses. Número de muestras: (6A-6D) Cada ensayo tenía >3 animales por grupo. Estadísticas: (6D) Prueba T bilateral, control frente a BiTg, * P<0,05.

Figuras 7A-7D. La expresión de KDM4D induce un crecimiento hiperplásico en corazones de BiTg adultos. (7A) Esquema que muestra el uso de doxiciclina para el control temporal de la expresión de KDM4D específica de CM en ratones BiTg. (7B) Cronología que muestra el protocolo para la expresión de KDM4D restringida al desarrollo. (7C) Expresión de KDM4D en ventrículos de 9 semanas o 3 semanas de ratones tratados con doxiciclina (dox), inducción en veces en comparación con el control tet. (7D) HW/BW a las 9 semanas en modelos de ratón donde la expresión de KDM4D específica de CM no está inducida (Dox E0-9s), desactivada en P14 (Dox 2s-9s) y expresada constitutivamente (sin dox). Número de muestras: DoxE0-9s, Control=17, BiTg=4; Dox2s-9s, Control=11, BiTg=8; Sin dox, Control=26, BiTg=10. Estadísticas: ANOVA bidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a control y BiTg DoxE0-9s, control y BiTg Dox2s-9s, y sin control dox.

Figuras 8A-8C. La carga hemodinámica estimula el crecimiento hiperplásico en corazones de BiTg. (8A) Imágenes representativas de corazones fijados con metanol y (8B) cuantificación de HW/BW de los corazones de control y BiTg a los 10 días después de la operación, barra=2 mm. (8C) Tinción representativa con tricrómico de Masson de ratones operados. Número de muestras: Simulación, Control=4, BiTg=4; TAC, Control=9, BiTg=8. Estadísticas: (8B) ANOVA bidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a Simulación-Control, f P<0,05 frente a Simulación-BiTg, $ P<0,05 frente a TAC-Control.

Figuras 9A-9D. La sobrecarga de presión estimula la actividad mitótica de ACM en ratones BiTg. (9A) Imágenes de corazones con TAC a bajo y alto aumento. Barra=40 jm (arriba) o 20 jm (abajo), las flechas blancas apuntan a núcleos de no CM pH3+, las puntas de flecha amarillas apuntan a núcleos de ACM pH3+. (9B) Cuantificación de la actividad mitótica de ACM en corazones de control y BiTg, 10 días después de la operación. (9C) Cuantificación del área transversal de ACM en corazones fijados con metanol, 10 días después de la operación. (9D) Número estimado de cardiomiocitos. Número de muestras: (9A-9D) Simulación, Control=3, BiTg=3; TAC, Control=8, BiTg=7. Estadísticas: (9B, 9C) ANOVA bidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a Simulación-Control, f P<0,05 frente a Simulación-BiTg, $ P<0,05 frente a TAC-Control. (9D) Se usó el método de remuestreo para calcular el error estándar y se usó la prueba de permutación para calcular el valor p, * P<0,05 frente al control.

Figuras 10A-10C. KDM4A desmetila H3K9me3 y H3K36me3 en ACM. (10A) Cronología que muestra el protocolo de sobreexpresión de KDM4A mediada por adenovirus en ACM WT cultivados. (10B) tinción con p-galactosidasa en ACM no infectados (arriba) e infectados con lacZ (abajo), que muestra una eficacia de infección >80 %. (10C) Inmunotransferencia que muestra que los ACM que expresan KDM4A tiene reducciones globales en H3K9me3 y H3K36me3, pero no en H3K27me3 (Millipore 07449). Lamina A/C (Cell Signalling 47775) y H3 se usaron como controles de aplicación. Número de muestras: N>3 para cada grupo.

Figuras 11A-11B. Expresión del transgén de KDM4D específico de CM. (11A) Expresión del transgén de KDM4D en varias muestras de tejido de BiTg a las 9 semanas de edad, normalizada respecto a los niveles de expresión en corazones de BiTg. (11B) Inmunotinción de KDM4D exógena (etiqueta FLAG) que muestra ausencia de expresión en células cardíacas no CM.

Figuras 12A-12B. Reguladores del ciclo celular en ACM de BiTg. (12A) Expresión de genes (RNA-seq, RPKM, inducción en veces frente a control) de miembros de la familia de E2F en ACM de 9 semanas. (12B) qRT-PCR de reguladores del ciclo celular en ACM de 9 semanas, inducción en veces frente a NoTg. Número de muestras: (12A) N=2 por grupo, (12B) NoTg=3, tet=6, tTA=3, BiTg=5. Estadísticas: (12A) Prueba T bilateral, * P<0,05. (12B) AnOVA unidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a NoTg, f P<0,05 frente a tet, $ P<0,05 frente a tTA. Figuras 13A-13B. Las células apoptóticas no se detectan 10 días después de la operación. (13A) Imágenes representativas de tinción TUNEL en cortes de vibrátomo. (13B) Los cortes de corazón tratados con DNAsal de ratones adultos no operados dan una señal fuerte específica del núcleo, lo que demuestra que nuestro ensayo puede detectar la tinción TUNEL. Número de muestras: N=2 para cada grupo.

Figuras 14A-14C. Los corazones de BiTg tienen miocardio aumentado y cavidades del LV dilatadas. (14A) Imágenes representativas de cortes de vibrátomo del papilar medio, barra=2 mm. Cuantificación del área del miocardio (14B) y área de la cavidad del LV (14C). Número de muestras: N=3 por grupo. Estadísticas: ANOVA bidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a Simulación-Control, f P<0,05 frente a Simulación-BiTg, $ P<0,05 frente a TAC-Control.

Figuras 15A-15B. Estructura de cromatina única en CM proliferativos. (15A) Inmunotinción en cortes de corazón de tipo silvestre embrionario y posnatal que muestran la localización opuesta del marcador de heterocromatina H3K9me3 (Active Motif, 39161) con el marcador de eucromatina H3K36me3 (Diagenode, C15200183); también se observa el cambio en la organización de la cromatina durante el desarrollo posnatal, bar=5 jm. (15B) En los cortes de corazón de BiTg, los núcleos de ACM pH3+ (puntas de flecha) muestran una organización de heterocromatina que se asemeja a los CM embrionarios, a diferencia de la organización típica de la cromatina de ACM (flechas).

Figura 16. Modelo de regeneración de ratón neonatal. El esquema en el panel superior ilustra la cronología para la creación de ratones BiTG en los que se produce IM en P7 y se sacrifica en POD21 para histología y genotipaje. La detección de cicatrices usa tinción con rojo sirio verde resistente 21 días después del IM. El área fibrótica se analiza como un porcentaje tomado de (la suma del área fibrótica en L600 y L800/suma del área miocárdica en el LV en L600 y L800) x 100.

Figura 17. Los ratones que sobreexpresan KDM4 tienen una mayor regeneración después del IM. Los cortes histológicos en los paneles de la izquierda muestran muestras no BiTG y BiTG tomadas en L0 a L1000 indicado. Los gráficos de barras en los paneles de la derecha muestran el porcentaje de área fibrótica promedio y máximo para los dos grupos.

Figuras 18A-18C. La expresión de KDM4D específica de CM adultos es suficiente para inducir la expresión de genes del ciclo celular tardío en ACM. (18A) Ilustración esquemática de la administración de doxiciclina hasta P21 y sobreexpresión posterior de KDM4D. (18B) Inducción en veces de KDM4D representado para sujetos tanto tet como BiTg, con tratamiento con doxiciclina en E0-P21, o sin tratamiento con doxiciclina. (18C) Inducción en veces de genes indicados para sujetos no BiTg y BiTg.

Figura 19. Datos preliminares que muestran la expresión de KDM4D

específica de CM adultos y la actividad del ciclo celular después del IM.

El pienso con doxiciclina se administró de E0-P28. El IM se produjo a las 10 semanas, durante el período de sobreexpresión de KDM4D, y a las 14 semanas (30 días después del IM), se examinó el tejido en busca de , para comparación del control (panel izquierdo) y BiTg (panel derecho).

Descripción detallada de la invención

La invención se basa en el hallazgo inesperado de que la proliferación de células diferenciadas terminalmente puede inducirse por medio de manipulación epigenética. Por lo tanto, la invención proporciona un vector de expresión o KDM4D para el uso en métodos para inducir reversiblemente la proliferación en células inactivas basados en el descubrimiento del papel de las desmetilasas de H3K9me3 en la regulación del silenciamiento de genes del ciclo celular de ACM. El alcance de la invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Antes del descubrimiento de las histona desmetilasas (HDM)40, se creía que H3K9me3 y la metilación de histonas en general eran una marca permanente41. Sin embargo, se está empezando a apreciar la naturaleza dinámica de la metilación de histonas42-44, aunque se conoce poco sobre las funciones de las HDM en el corazón. Curiosamente, los miembros de la familia de KDM4 de desmetilasas de H3K9me3 se encuentran regulados positivamente en varias formas de cáncer y se cree que promueven la proliferación y sobrevivencia celular45-48. Un miembro de la familia de KDM4, KDM4A, se ha estudiado en el corazón1749. La sobreexpresión específica de CM de KDM4A en ratones exacerbó la hipertrofia inducida por TAC y la expresión de genes de CM fetales, mientras que la eliminación de KDM4A específica de CM disminuyó los efectos de la sobrecarga de presión; aunque ninguna manipulación tuvo un efecto en el inicio49. Los estudios mecanicistas demostraron que la atenuación de KDM4A en CM neonatales aumenta los niveles de H3K9me3 en el promotor de ANP y regula negativamente de manera modesta la expresión de ANP17. El enriquecimiento de H3K9me3 y HP1 en el promotor de ANP se redujo en un modelo de corazón de funcionamiento aislado de precarga elevada que induce la expresión de ANP17. Sin embargo, la expresión de KDM4A y el enriquecimiento en el promotor del gen de ANP no cambiaron en este modelo17. Por lo tanto, no está claro cómo KDM4A regula la expresión de genes de CM fetales en los ACM. Lo que complica aún más la interpretación de estos resultados es el hecho de que KDM4A tiene especificidad por doble sustrato; KDM4A puede desmetilar la H3K9me3 represora, pero también la H3K36me3 activadora50-52. También se encontró que los niveles globales de ambas modificaciones se redujeron en ACM con sobreexpresión de KDM4A mediada por adenovirus. Un miembro de la familia de KDM4, KDM4D, tiene una actividad desmetilasa de H3K9 fuerte y específica50-52, lo que le confiere una utilidad particular como herramienta experimental para estudiar específicamente a H3K9me3. Hasta este estudio, la KDM4D no se ha explorado.

Definiciones

Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen significados comúnmente usados en la técnica a menos que se especifique de otro modo. Como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Como se usa en el presente documento, "desmetilasa 4D específica de lisina" o "KDM4D" significa un miembro específico de la familia de KDM4 de desmetilasas específicas de lisina que exhibe actividad desmetilasa específica del residuo de lisina metilado en la posición 9 (H3K9) de la proteína de la heterocromatina 1 (HP1). La KDM4D puede tener la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos incluye opcionalmente además etiquetas, tales como, por ejemplo, una etiqueta MYC y/o una etiqueta FLAG, como se muestra en SEQ ID NO: 2.

Como se usa en el presente documento, "reprime de forma inducible" o "represión inducible" se refiere a la regulación de la expresión de genes mediante la cual la expresión del gen puede reprimirse tras la introducción de una condición inductora. La condición inductora puede ser la administración de o el contacto con un agente que efectúa la represión. El agente puede ser un correpresor, tal como se encuentra en la regulación génica por represión en donde la expresión está activa, excepto cuando el correpresor está presente para suprimir la expresión de genes. Alternativamente, el agente puede ser un inductor, tal como se encuentra en la regulación génica por inducción en donde la expresión está inactiva, excepto cuando el inductor está presente para permitir la expresión de genes.

Como se usa en el presente documento, un "elemento regulador" se refiere a un elemento que regula la expresión de genes. El elemento regulador puede inducir o reprimir la expresión de genes en respuesta a la presencia o ausencia de una condición.

Como se usa en el presente documento, un "elemento sensible a tetraciclina" se refiere a un elemento regulador que reduce la expresión de un promotor inducible por tet en presencia de tetraciclina o un derivado de la misma, por ejemplo, doxiciclina. Un ejemplo de un elemento sensible a tetraciclina es un transactivador controlado por tetraciclina (tTA), creado por fusión del represor de tetraciclina (tetR) con un dominio de activación transcripcional, tal como el dominio C-terminal de VP16 del virus del herpes simple (HSV).

El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" u "oligonucleótido" se refiere a una secuencia de nucleótidos, un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de otro modo, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos naturales.

El término "cebador", como se usa en el presente documento, significa un oligonucleótido diseñado para flanquear una región de ADN a amplificar. En un par de cebadores, un cebador es complementario a los nucleótidos presentes en la cadena sentido en un extremo de un fragmento polinucleotídico a amplificar y otro cebador es complementario a los nucleótidos presentes en la cadena antisentido en el otro extremo del fragmento polinucleotídico a amplificar. Un cebador puede tener al menos aproximadamente 11 nucleótidos y, preferentemente, al menos aproximadamente 16 nucleótidos y no más de aproximadamente 35 nucleótidos. Típicamente, un cebador tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia con un polinucleótido diana con el que se hibrida el cebador.

Como se usa en el presente documento, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido, producido de forma natural o sintética, por medio de métodos recombinantes o mediante amplificación por PCR, que se hibrida con al menos parte de otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria.

Como se usa en el presente documento, el término "fragmento activo" se refiere a una porción sustancial de un oligonucleótido que puede realizar la misma función de hibridarse específicamente con un polinucleótido diana. Como se usa en el presente documento, "se hibrida", "que se hibrida" e "hibridación" significan que el oligonucleótido forma una interacción no covalente con la molécula de ADN diana en condiciones estándar. Las condiciones de hibridación estándar son aquellas condiciones que permiten que un cebador o sonda oligonucleotídica se hibride con una molécula de ADN diana. Tales condiciones se determinan fácilmente para un cebador o sonda oligonucleotídica y la molécula de ADN diana con el uso de técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. La secuencia de nucleótidos de un polinucleótido diana es generalmente una secuencia complementaria al cebador o sonda oligonucleotídica. El oligonucleótido de hibridación puede contener nucleótidos que no hibridan que no interfieren con la formación de la interacción no covalente. Los nucleótidos que no hibridan de un cebador o sonda oligonucleotídica pueden ubicarse en un extremo del oligonucleótido de hibridación o dentro del oligonucleótido de hibridación. Por lo tanto, un cebador o sonda oligonucleotídica no tiene que ser complementario a todos los nucleótidos de la secuencia diana siempre que haya hibridación en condiciones de hibridación estándar.

El término "complemento" y "complementario", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de dos moléculas de ADN de formar apareamiento de bases entre sí, donde una adenina en una molécula de ADN se apareará con una guanina en una segunda molécula de ADN y una citosina en una molécula de ADN se apareará con una timina en una segunda molécula de ADN. Dos moléculas de ADN son complementarias entre sí cuando una secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN puede formar apareamiento de bases con una secuencia de nucleótidos en una segunda molécula de ADN. Por ejemplo, las dos moléculas de ADN 5'-ATGC y 5'-GCAT son complementarias, y el complemento de la molécula de ADN 5'-ATGC es 5'-GCAT. El término complemento y complementario también abarca dos moléculas de ADN en las que una molécula de ADN contiene al menos un nucleótido que no se apareará con al menos un nucleótido presente en una segunda molécula de ADN. Por ejemplo, el tercer nucleótido de cada una de las dos moléculas de ADN 5-ATTGC y 5-GCTAT no se aparearán, pero estas dos moléculas de ADN son complementarias como se define en el presente documento. Típicamente, dos moléculas de ADN son complementarias si se hibridan en las condiciones estándar mencionadas anteriormente. Típicamente, dos moléculas de ADN son complementarias si tienen al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia.

Como se usa en el presente documento, "un" o "una" significa al menos uno, a menos que se indique claramente de otro modo.

Como se usa en el presente documento, "prevenir" o "proteger contra" una afección o enfermedad significa obstaculizar, reducir o retrasar el inicio o progresión de la afección o enfermedad.

Como se usa en el presente documento, el término "aislado" significa que un fragmento de ADN, molécula de ADN, secuencia codificante u oligonucleótido natural se elimina de su entorno natural, o es una molécula sintética o un producto clonado. Preferentemente, el fragmento de ADN, molécula de ADN, secuencia codificante u oligonucleótido está purificado, es decir, esencialmente libre de cualquier otro fragmento de ADN, molécula de ADN, secuencia codificante u oligonucleótido y productos celulares asociados u otras impurezas.

Vectores

En una modalidad, el vector de expresión para el uso en cardioterapia regenerativa comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica la desmetilasa 4D específica de lisina (KDM4D); (b) un promotor específico de tejido cardíaco que efectúa la sobreexpresión de KDM4D, en donde el promotor está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico; y (c) un elemento regulador que reprime de forma inducible la sobreexpresión de KDM4D. Opcionalmente, el vector comprende además (d) un promotor específico de tejido unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico. La sobreexpresión específica de tejido de KDM4D se logra mediante la selección de un promotor específico de tejido en (b). La expresión específica de tejido puede proporcionarse mediante (b) y un promotor adicional (d). La KDM4D puede eliminar específicamente la modificación de histona H3K9me3 mediante la desmetilación del residuo de lisina en la posición 9 de la histona 3 (H3K9).

Si bien el promotor de (b) es un promotor específico de tejido, y promotores independientes pueden cumplir las funciones descritas en (b) y (d) anteriores, la selección de un promotor específico de tejido se diseña para optimizar la expresión preferencial en el tejido diana al tiempo que minimiza la expresión no intencionada en otros lugares. Los ejemplos de promotores específicos de tejido incluyen, pero no se limitan a, promotores específicos de tejido cardíaco (cadena pesada de miosina, troponina I o T), músculo esquelético (miogeneína, MyoD, creatina quinasa muscular), neuronas, células de los islotes pancreáticos o hepatocitos. Un promotor que es específico de tejido promueve la expresión del gen codificado por la secuencia de ácido nucleico predominantemente en el tejido particular. El promotor específico de tejido es específico de tejido cardíaco. Un promotor de cadena pesada de amiosina (aMHC) es un ejemplo de un promotor específico del corazón. En otra descripción, el promotor específico de tejido es específico de tejido hepático o hepatocitos. Un promotor de CBA es un ejemplo de un promotor específico del hígado. Otros ejemplos de promotores específicos de tejido conocidos en la técnica incluyen los promotores de enolasa específica de neuronas (NSE) y tubulina al para neuronas, promotores de a1-antitripsina y albúmina (ALB) para hepatocitos, y troponina, CMV o cadena ligera de miosina-2 (MLC2) para cardiomiocitos.

Los ejemplos representativos de un elemento regulador que puede reprimir de forma inducible la expresión (o sobreexpresión) incluyen, pero no se limitan a, elementos sensibles a tetraciclina y proteínas sensibles a hormonas. Los expertos en la técnica apreciarán métodos alternativos de expresión de genes controlada que pueden adaptarse para el uso de una manera similar para regular la expresión de KDM4D, tanto temporal como histológicamente. Por ejemplo, el elemento regulador puede permitir la regulación positiva de la expresión de KDM4D, mientras que, alternativamente, el elemento regulador puede permitir la regulación negativa de la expresión de KDM4D. En otro ejemplo, el elemento regulador permite la regulación de la expresión de KDM4D específica de tejido y/o específica de condición. Si bien es conveniente la capacidad de desactivar la expresión de KDM4D, no es esencial para todas las modalidades. En una modalidad, la invención proporciona un vector para el uso en cardioterapia regenerativa que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la desmetilasa 4D específica de lisina (KDM4D) y un promotor específico de tejido cardíaco que efectúa la sobreexpresión de KDM4D, en donde el promotor está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico.

Los vectores para el uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen vectores virales, así como vectores no virales, partículas similares a virus, vectores bacterianos, vectores bacteriófagos y otros vectores conocidos en la técnica. El vector puede ser un vector viral. El vector viral puede ser un vector de virus adenoasociado (AAV) u otro vector adecuado para infectar células inactivas. Los ejemplos representativos de un vector AAV incluyen, pero no se limitan a, AAV6 y AAV9.

Secuencia de aminoácidos de KDM4D (SEQ ID NO: 1):

Met E T Met K S K A N C A Q N P N C N I Met I F H P T K E E F N D F D K Y I A Y Met E S Q G A H R A G L A K I I P PK E W K A R E T Y D N I S E I L I A T P L Q Q V A S G R A G V F T Q Y H K K K K A Met T V G E Y R H L A N S K K Y Q T P P H Q N F E D L E R K Y W K N R I Y N S P I Y G A D I S G S L F D E N T K Q W N L G H L G T I Q D L L E K E C G V V I E G V N T P Y L YF G Met W K T T F A W H T E D Met D L Y S I N Y L H L G E P K T W Y V V P P E H G Q R L E R L A R E L F P G S S R G C G A F L R H K V A L I S P T V L K E N G I P F N R I T Q E A G E F Met V T F P Y G Y H A G F N H G F N C AE A I N F A T P R W I DY G K Met A S Q C S C G E A R V T F S Met D A F V R I L Q P E R Y D L W K R G Q D R A V V D H Met E P R V P AS Q E L S T Q K E V Q L P R R A A L G L R Q L P S H W A R H S P W P Met A A R S G T R C H T L V C S S L P R Q SA V S G T A T Q P R A A A V H S S KK P S S T P S S T P G P S A Q I I H P S N G R R G RG R P P Q K L R A Q E L T L Q T P A K R P L L A G T T C T A S G P E P E P L P E D G A L Met D K P V P L S P G L Q H P V K A S G C S W APVP

Secuencia de aminoácidos adicional opcional con etiquetas myc (subrayada) y flag (sombreada) (SEQ ID NO: 2): T R T L P L E Q K L I S E E D L A A N D l L D Y K D D D D K V Parada

Composiciones & kits

En el presente documento se describen composiciones que pueden proporcionarse como kits y/o usarse para los métodos descritos en el presente documento. Las composiciones comprenden vectores, moléculas de ácido nucleico y células como se describe en el presente documento. Las composiciones y kits pueden incluir recipientes, agentes y materiales adicionales para facilitar la práctica de la invención. El alcance de la invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Vectores de expresión y KDM4D para el uso en la invención

La invención proporciona un vector de expresión para inducir hiperplasia específica de tejido en un mamífero. El método se puede adaptar a cualquier órgano o tejido en el que sea de interés la proliferación o la regeneración de células inactivas. Los ejemplos de tejidos en los que la regeneración o la proliferación pueden ser de interés incluyen, pero no se limitan a, corazón, músculo, cerebro, sistema nervioso, páncreas e hígado. También se proporciona un vector de expresión para el uso en la inducción de hiperplasia de cardiomiocitos (CM) en un mamífero que comprende administrar al mamífero un vector de expresión de la invención. El uso comprende injertar CM en el corazón del mamífero, en donde los CM contienen un vector de expresión de la invención.

La invención proporciona adicionalmente KDM4D para el uso en un método para inducir hiperplasia de CM que comprende administrar KDM4D a los CM. La KDM4D puede administrarse con el uso de una modificación del péptido y/o un medio de suministro que proteja la actividad de KDM4D. La administración puede ser sistémica, localizada, oral, intravenosa, subcutánea o transdérmica.

En el presente documento se describe un método para mejorar la función de un órgano en un mamífero que comprende injertar en el órgano células modificadas genéticamente con un vector de expresión de la invención. El órgano puede ser, por ejemplo, corazón, músculo, cerebro, páncreas o hígado. En una modalidad, la invención proporciona el uso en un método para mejorar la función cardíaca en un mamífero que comprende injertar CM en el corazón del mamífero, en donde los CM contienen un vector de expresión de la invención. En el presente documento se describe un método para mejorar la función cardíaca en un mamífero que comprende administrar al mamífero un vector de expresión de la invención. También se describe un método para mejorar la función cardíaca en un mamífero que comprende administrar KDM4D al mamífero.

La invención proporciona además un método de proliferación de CM in vitro que comprende cultivar CM con KDM4D en condiciones eficaces para inducir hiperplasia de CM. En una modalidad, los CM son CM adultos (ACM). Además, en el presente documento se describe un método para promover la regeneración cardíaca que comprende reducir los niveles de lisina 9 de histona H3 (H3K9me3) en los CM. La reducción puede comprender administrar un vector de expresión de la invención a un sujeto que necesite regeneración cardíaca. El vector de expresión puede administrarse mediante la administración de CM que contienen el vector de expresión. La reducción puede comprender administrar KDM4D.

Los usos de la invención pueden implicar la administración al sujeto por cualquiera de una variedad de medios comprendidos por los expertos en la técnica como adecuados para circunstancias particulares. En algunas modalidades, la administración es sistémica. En otras modalidades, la administración es intravenosa. En algunas modalidades, la administración es mediante inyección intramiocárdica. El sujeto es típicamente un mamífero. En una modalidad, el mamífero es un ser humano. En otras modalidades, el mamífero es un sujeto veterinario. Los ejemplos de sujetos veterinarios incluyen, pero no se limitan a, sujetos equinos, caninos, bovinos, porcinos, ovinos y felinos. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a los expertos en la realización y uso de la misma. Los ejemplos no pretenden de ninguna manera limitar de otro modo el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Regulación epigenética de la detención del ciclo celular de cardiomiocitos

Este ejemplo demuestra que la trimetilación de lisina 9 de histona H3 (H3K9me3), una modificación de histona asociada con heterocromatina, se requiere para el silenciamiento de genes del ciclo celular en CM adultos (ACM). Para probar esto, se desarrolló un modelo de ratón transgénico (BiTg) en el que la histona desmetilasa KDM4D elimina específicamente H3K9me3 en CM. La pérdida de H3K9me3 en CM altera preferentemente el silenciamiento de genes del ciclo celular de ACM y da como resultado un aumento del ciclo de CM. La masa cardíaca normalizada aumentó el día 14 posnatal (P14) y continuó en aumento hasta las 9 semanas de edad. El número de ACM, pero no el tamaño, aumentó significativamente en los corazones de BiTg, lo que sugiere que la hiperplasia de CM explica el aumento de la masa cardíaca. La exposición de los corazones con poca H3K9me3 a una señal de crecimiento hipertrófico estimuló la actividad mitótica de ACM. Por lo tanto, se demostró que se requiere H3K9me3 para el silenciamiento de genes del ciclo celular en ACM y que la reducción de H3K9me3 permite el crecimiento hiperplásico in vivo.

Métodos

Estudios en ratones. Los ratones aMHC-tTA usados para controlar la expresión del transgén se generaron en el laboratorio Robbins (60). Se usó la construcción de sensibilización publicada anteriormente, que posee un elemento sensible a tetraciclina corriente arriba de un promotor de aMHC atenuado para controlar la expresión de KDM4D (60). El plásmido que contenía ADNc de KD^m4^d humano etiquetado con F^lA^g y MYC (origene RC212600) tenía un sitio de restricción Notl presente en la secuencia de ADNc, que se destruyó mediante la inducción de una mutación silente (Agilent 200521). El ADNc resultante se subclonó en la construcción de sensibilización, después se liberó de la cadena principal del vector, se purificó y se inyectó en pronúcleos de ratón (instalación central de transgénicos de la Universidad de Washington). El transgénico tet resultante se cruzó con la línea aMHC-tTA para generar el modelo de inducción de KDM4D específica de CM. Se usaron compañeros de camada de control para todos los experimentos que implicaban ratones transgénicos. Se realizaron operaciones TAC y simuladas en compañeros de camada de 10 a 12 semanas de reproductores retrocruzados >8 generaciones con la cepa C57/B6. Los ratones se anestesiaron con el uso de ketamina (130 mg/kg i.p.) y xilazina (8,8 mg/kg i.p.) y se sometieron a constricción aórtica transversal con el uso de una aguja de calibre 26 como se describe (103).

Aislamiento y cultivo de células CM. Los ratones heparinizados se sacrificaron con isoflurano y los corazones se extrajeron y se detuvieron en tampón KB (mmol/L: K^c I 20, KH2PO4 10, K+-glutamato 70, MgCl2 1, glucosa 25, taurina 20, EGTA 0,5, HEPES 10, albúmina al 0,1 %, pH 7,4 con KOH). Para las preparaciones de ACM purificadas, se canuló la aorta y se lavó el corazón con solución de Tyrodes (pH 7,4, complementada con Blebbistatina 25 uM -/-) y se digirió durante 7 minutos con colagenasa II (Worthington 4176) y proteasa de Streptomyces griseus XIV (Sigma P5147) con el uso de perfusión de Langendorf. Los ventrículos se disociaron y la suspensión celular resultante se filtró a través de una malla de 100 pm. Tres rondas de centrifugación a baja velocidad, donde los ACM sedimentan débilmente y los no CM en suspensión se aspiran, purifican por densidad la población de ACM, lo que da como resultado >90 % de ACM en forma de varilla. Para las preparaciones de CM embrionarios y posnatales, los corazones se lavaron en tampón Ads (mmol/L: NaCl 116, h Ep ES 20, NAH2PO4 10,8, glucosa 5,5, Kcl 5,4, MgSO4 0,83) y se incubaron con solución enzimática (Colagenasa II, Pancreatina (Sigma P3292)) con rotación. Las células liberadas se recolectaron en suero (con detención de la digestión) cada 20 minutos, lo que dio como resultado la disociación de todo el corazón en 2 horas. La suspensión celular resultante se fraccionó con el uso de un gradiente de percoll (Sigma P4937), y se recolectaron cada una de la capa de CM y la capa de no CM. La calidad y pureza de las preparaciones de CM se comprobaron mediante inmunotinción, citometría de flujo y expresión de ARN de marcadores específicos del tipo celular.

El ADNc de ACM de control y de ACM desdiferenciados se generó como se describió (57). En resumen, los ACM se sembraron en placas recubiertas con laminina y se cultivaron con factores de crecimiento durante 10-14 días, lo que dio como resultado una pérdida de la organización del sarcómero y un aumento de la actividad del CC.

Aislamiento y análisis del ARN. Se aisló el ARN de células y tejidos con el uso de purificación con fenol/cloroformo TRISOL (Sigma T9424), seguido de purificación en columna con tratamiento con DNasa (Qiagen 74004). Para los estudios de expresión de genes humanos, se obtuvo una muestra de corazón humano normal de proveedores comerciales (Clontech 636532, lote 1206518A; y Agilent 540011, lote 6151000). Las muestras de cardiopatía isquémica provinieron de sujetos masculinos en sus 60 años que dieron su consentimiento que se sometieron a la colocación de un dispositivo de asistencia al ventrículo izquierdo.

El ADNc se sintetizó como se describe en las directrices de los fabricantes (Roche 04896866001). La qPCR se realizó con el uso de SYBR green (Life Technologies 4472908) en una máquina de PCR en tiempo real (ABI 7900HT). Los cebadores se validaron mediante PCR estándar con electroforesis para confirmar la banda diana específica y la ausencia de dímeros de cebadores. Las curvas de disociación de qPCR fueron consistentes con un solo producto específico. Los valores de Ct se asignaron con el uso del software SDS 2.4 de ABI con umbrales y valores de referencia automatizados. Se usó el método de la curva estándar o el método de dCt para cuantificar la expresión, y la expresión de cada gen se normalizó mediante GAPDH. Sin embargo, en la Figura 1 A-D, se presentan valores de -log(Ct). Encontrar un gen de control adecuado que se exprese de manera estable en diferentes etapas del desarrollo de los CM no es trivial (104). Gapdh fue el control que se expresó de manera más estable en todas las muestras en comparación con S26 y Rplp0, pero en comparación con la normalización por el ARN inicial, la normalización con Gapdh dio como resultado que la expresión de genes de CM de E15.5 se subestimara en -2,5 veces, ya que la expresión de Gapdh disminuye en CM de P3, después permanece estable; en consistencia con la alta actividad glucolítica en corazones fetales (105). Las curvas estándar se generaron con el uso de tejido o células con alta expresión del gen indicado, lo que da como resultado eficiencias de qPCR que varían de 88-97 %. Las secuencias de cebadores usadas son:

Ratón (SEQ ID NO: 3-50, respectivamente; SEQ ID NO individuales entre paréntesis a continuación):

Gapdh F-CCAATGTGTCCGTCGTGGATCT (3), R-GTTGAAGTCGCAGGAGACAACC (4);

ANP F-AGGATTGGAGCCCAGAGTGGA (5), R-TGATAGATGAAGGCAGGAAGC (6);

bMHC F-GCGACTCAAAAAGAAGGACTTTG (7), R-GGCTTGCTCATCCTCAATCC (8);

aMHC F-AGAAGCCCAGCGCTCCCTCA (9), R-GGGCGTTCTTGGCCTTGCCT (10);

cTNI F--GCAGCCCAGAGGAAACCCAACC (11), R-AGCCGCATCGCTGCTCTCATC (12);

Ccnd1 F-TGCTGCAAATGGAACTGCTTCTGG (13), R-TACCATGGAGGGTGGGTTGGAAAT (14);

Ccne1 F-GCTTCGGGTCTGAGTTCCAA (15), R-GGATGAAGAGCAGGGGTCC (16);

Cdk4 F-GGGACCTGAAGCCAGAGAAC (17), R-CCACAGAAGAGAGGCTTCCG (18);

Ccnb1 F-GCCTCACAAAGCACATGACTG (19), R-TCGACAACTTCCGTTAGCCT (20);

Cdk1 F-GGCGAGTTCTTCACAGAGACTTG (21), R-CCCTATACTCCAGATGTCAACCGG (22);

AurkB F-GCACCTGAAACATCCCAACAT (23), R-GGTCCGACTCTTCTGCAGTT (24);

Plk1 F-GTATTCCCAAGCACATCAA (25), R-GTAGCCAGAAGTGAAGAAC (26);

E2F1 F-TGCCAAGAAGTCCAAGAATCA (27), R-CTGCTGCTCACTCTCCTG (28);

E2F4 F-TGTCCTTGGCAGCACTCA (29), R-TTCACCACTGTCCTTGTTCTCA (30);

Rb F-CCTGATAACCTTGAACCTGCTTGT (31), R-GCTGAGGCTGCTTGTGTCT (32);

p130 F-CACCGAACTTATGATGGACAG (33), R-ATGGCTTCTGCTCTCACT (34);

p107 F-GCAGAGGAGGAGATTGGAACA (35), R-GCTACAGGCGTGGTGACT (36);

p21 F-GCAGACCAGCCTGACAGATTT (37), R-CTGACCCACAGCAGAAGAGG (38);

p53 F-CAGTGGGAACCTTCTGGGAC (39), R-CGCGGATCTTGAGGGTGAAA (40);

KDM4A F-CTGCTAGGGCTTTAGGCTCC (41), R-TTTGGGAGGAACGACCTTGG (42);

KDM4B F-CAGAGAGCATCACGAGCAGA (43), R-CTCTTGGGCAGCTCCTCTTC (44);

KDM4C F-GCGGGTTCATGCAAGTTGTT (45), R-GTTTCAGAGCACCTCCCCTC (46);

KDM4D (endógena) F-TCTGAGTCTGCCTTCTTCTG (47), R-GCCAGGGTTCACAAGTCCTGAG (48);

KDM4D (transgén) F-TTGATGGACAAGCCTGTACC (49), R-TCATTTGCTGCCAGATCCTC (50).

Ratón: Se usaron reactivos TaqMan (Life Technologies) para los siguientes genes: KDM2B (Mm01194587_m1), KDM4A (Mm00805000_m1), KDM6B (Mm01332680_m1), KDM8 (Mm00513079_m1), GAPDH (Mm99999915_g1).

Humano (SEQ ID NO: 51-54, respectivamente; SEQ ID NO individuales entre paréntesis a continuación): GAPDH F-CCTCAACGACCACTTTGTCA (51), R-TTACTCCTTGGAGGCCATGT (52);

KDM4D F-AAGCCCAGCTCAACTCCATC (53), R-TGTCCATCAAAGCCCCATCC (54).

La construcción de la biblioteca de RNAseq (Illumina Tru-Seq) y la secuenciación de ARN de extremos pareados (ABI3730XL) se realizaron en las instalaciones centrales de la Universidad de Washington de Stam Lab. El alineamiento de las lecturas se realizó con el uso del paquete Bowtie/Cufflinks. Se usó la serie de Partek Genomic para la cuantificación del ARNm, el análisis de expresión diferencial y la ontología genética.

Ecocardiografía 2-D. Con isoflurano al 0,5 %, se evaluó el EKG y la función cardíaca de los ratones con el uso de Visual Sonics Vevo 2100. Se recolectaron imágenes paraesternales del eje corto en el plano del músculo papilar en los modos B y M. Las imágenes se recolectaron con frecuencias cardíacas que variaban de 400-500 latidos por minuto. Un solo operador que desconocía los genotipos obtuvo las imágenes y realizó el análisis. La cuantificación de imágenes se realizó con el uso de Vevo Labs 1.7.0, de acuerdo con las directrices del fabricante.

Extracción de proteínas y transferencia Western. Los ACM aislados se sedimentaron y resuspendieron en tampón de lisis (NP-40 al 0,5 %, KCI 25 mM, MgCl2 5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) y se homogeneizaron (Wheaton 358103), lo que liberó proteínas citoplasmáticas solubles. Los sedimentos enriquecidos en núcleos se procesaron para liberar del ADN las proteínas asociadas a la cromatina; lo que incluye ultrasonidos, tratamiento con MNasa y adición de SDS al 1%, NaCl 600 mM y pME 20 mM. Las proteínas nucleares se cuantificaron con el uso de un ensayo BCA (Thermo Scientific 23252) y se aplicaron a geles de poliacrilamida para electroforesis, posteriormente se transfirieron a una membrana de PVD^f y se expusieron a los anticuerpos indicados: KDM4D (Abcam ab93694), H3K9me3 (Abcam ab8898), pan H3 (Millipore 05-928), H3K36me3 (Active Motif 61101), H3K9me2 (Millipore 07-441) y H4K20me3 (Abcam ab9053). Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Santa Cruz) y detección de ECL (Thermo Scientific 34095).

Estudios histológicos y cuantificación de las dimensiones de los CM y el número de CM. Para el análisis histológico, los corazones detenidos en P14 o 9 semanas se fijaron con PFA al 4 %. Los cortes de parafina se tiñeron con H&E, tricromo de Masson o se inmunotiñeron con el uso del protocolo estándar con anticuerpos contra FLAG (Sigma F7425) a-actinina (Sigma A7811), troponina T cardíaca (Thermo Scientific MS-295-P), Ki67 (Abcam ab15580) y fosfo-H3 (Abcam ab5176) y Hoechst (Life Technologies H3570) para visualizar los núcleos. Las imágenes se adquirieron con microscopía confocal (Nikon A1R). Para evaluar el área transversal de ACM, los cortes se tiñeron con aglutinina de germen de trigo (WGA, Life Technologies W6748), un marcador de la membrana plasmática. Se adquirieron imágenes cosidas de todo el ventrículo izquierdo con un endoscopio Nikon Ti-E. Se eligieron varias regiones en cada corte al azar, aunque se excluyeron los vasos grandes, el epicardio y el endocardio, y se analizaron >1000 células por animal con el uso de la función "analizar partículas" de Image J (imagen negativa de la tinción WGA), lo que dio como resultado una medición directa de la zona transversal. Para las mediciones de longitud y área longitudinal de ACM, los ACM aislados se fijaron con PFA al 4 % y se obtuvieron imágenes. El área y el eje largo de cientos de ACM para cada animal se trazaron y cuantificaron manualmente con el uso de la función de "medición" de Image J. Se calculó el volumen de CM con el uso de la fórmula: (longitud media de ACM x área transversal media de ACM). El número de CM se estimó a partir de la siguiente fórmula: [volumen cardíaco medio (masa cardíaca/1,06, la densidad del tejido muscular(106))/volumen medio de ACM x 0,75 (la proporción de volumen cardíaco murino adulto ocupado por CM(106))] El número de núcleos por ACM se contó manualmente para >100 células por animal.

Obtención de imágenes de cortes gruesos. Para la determinación inequívoca del tipo de célula en los ensayos de tinción de fosfo-H3 en ratones operados, se desarrolló un método para generar, teñir y obtener imágenes de cortes de corazón de 100 pm de grosor, que se describirá en detalle en un artículo sobre metodologías. Brevemente, los corazones se detuvieron en tampón KB, se perfundieron con KB, después se fijaron en perfusión con metanol enfriado a -20 °C. Los corazones se rehidrataron en gradientes de Metanol:PBS (100:0, 80:20, 60:40), después se lavaron con PBS y se montaron en agarosa de bajo punto de fusión al 5 %. Se hicieron cortes de 100 pm grosor de un vibrátomo Leica 1200s y se tiñeron en suspensión, con los reactivos enumerados anteriormente, así como con faloidina (ThermoFisher Scientific A22287). Los cortes teñidos se montaron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina al 0,01 %. Para aumentar la transparencia de los cortes, que es necesaria para ver el interior de los cortes gruesos, estos se aclararon: los cortes se incubaron en una serie de isopropanol (70 %, 85 %, 95 %, 100 %) seguido de incubaciones en una solución 1:2 de alcohol bencílico y benzoato de bencilo. Un solo operador que desconocía los genotipos preparó las muestras, obtuvo las imágenes con microscopía confocal y las analizó. Se calculó el número de ACM pH3+ con el uso de la fórmula: [(núcleos de ACM pH3+/mm3)/(# de núcleos/ACM)/(ACM/mm3)] Se observó que las medidas del área transversal en los corazones con operación simulada fueron 19,2 % menores que al inicio, lo que se atribuyó a las diferencias en el procedimiento de fijación, en consistencia con otros informes que comparan la contracción celular después de la fijación con formaldehído o alcohol (107). Debido a esto, el área transversal en todos los grupos se corrigió mediante la multiplicación por un factor constante de 1,192, al calcular el número de ACM en las muestras posoperatorias fijadas con metanol:

[volumen cardíaco medio (masa cardíaca/1,06, la densidad del tejido muscular(106))/volumen medio de ACM (longitud inicial media de ACM x área transversal media posoperatoria de ACM) x 0,75 (la proporción de volumen cardíaco murino adulto ocupado por los CM (106))].

Estadísticas. Todos los resultados se muestran como media ± error estándar de medias. Se usó Graphpad Prism para ANOVA unidireccionales y se realizaron pruebas post hoc de Tukey en estudios que compararon más de dos grupos. Se usó Graphpad Prism para ANOVA bidireccionales y se realizaron pruebas post hoc de Tukey en estudios con dos variables independientes. Se usaron las funciones de la prueba F de Microsoft Excel y la prueba T bilateral para analizar los estudios que compararon dos grupos. Para los resultados en los que se combinaron diferentes medidas básicas para los cálculos (Figura 5, D y E, y Figura 9D) se usó el método de remuestreo (10000 muestras remuestreadas) para calcular el error estándar y se usó la prueba de permutación (100 000 muestras de Monte-Carlo) para calcular el valor p; con el supuesto de que el área transversal de ACM, la longitud de ACM y el volumen cardíaco son variables independientes. Para el análisis de RNA-seq, se usó la serie de Partek Genomic para realizar la estadística.

Aprobación del estudio. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con un Comité institucional de uso y cuidado de animales aprobado (protocolo IACUC #4290-01), las directrices institucionales de la Universidad de Washington y la Guía del Instituto Nacional de Salud para el uso y cuidado de animales de Laboratorio. Las muestras de cardiopatía isquémica humana provinieron de participantes que dieron su consentimiento por escrito e informado; el uso de muestras humanas fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Washington (IRB# 35358).

Estudios con adenovirus. Los adenovirus para KDM4A y LacZ se generaron de acuerdo con las directrices del fabricante (Agilent 240082). Los ACM aislados se sembraron en placas con pocillos recubiertos con laminina en medio M199 complementado con ITS 1x, PS 1x, taurina 5 mM, piruvato de Na 1 mM, creatina 5 mM, L-carnitina 2 mM y blebistatina 25 mM, con la presencia de FBS al 5 %. Después de 1 hora, el medio se cambió por medio que contenía FBS al 2 % y se añadieron 150 moi de virus. Los ACM se mantuvieron en un medio que contenía FBS al 2 % hasta la cosecha. La tinción con beta-galactosidasa se realizó en ACM fijados con PFA al 4 % que se incubaron en ferricianuro de K+ 5 mM, ferrocianuro de K+ 5 mM, MgCh 2 mM y X-gal 1 mg/ml durante 4 horas.

Inducción de KDM4D controlada temporalmente. Se administró pienso que contenía doxiciclina (Harlan TD.00502) ad lib durante los tiempos indicados. Téngase en cuenta que el grupo Dox 2 semanas-9 semanas incluye ratones que recibieron dox en un intervalo de P14-9s a P18-9s.

Cuantificación del área del miocardio y del LV. Se hicieron cortes de vibrátomo del plano del músculo papilar medio de los corazones y se obtuvieron imágenes. El área del miocardio y el área de la cavidad del LV se trazaron manualmente en ImageJ y el área se calculó con el uso de la herramienta "medición".

Cuantificación de la apoptosis. La apoptosis se visualizó en cortes de vibrátomo con el uso de un kit de tinción TUNEL (Life Technologies C10618) de acuerdo con las directrices del fabricante. Después del marcaje con TUNEL, se tiñó para WGA, Hoechst y faloidina, y se obtuvieron imágenes como se describe en los procedimientos para los cortes de vibrátomo.

Resultados

Caracterización de la expresión de histona desmetilasa de H3K9me3 en CM.

Para comprender mejor el papel de H3K9me3 en la regulación de la expresión de genes del ciclo celular, se caracterizó la relación entre el ciclo celular y la expresión de genes de HDM de H3K9me3 en CM durante el desarrollo cardíaco (Figura 1). Los cambios en el desarrollo en la expresión de genes específicos de CM y del ciclo celular incluyeron el cambio de isoformas de miosina y la drástica regulación negativa de genes de G2/M y citocinesis en ACM (Figura 1, A y B), en consistencia con estudios previos (9,53,54). El factor de transcripción del ciclo celular E2F1 se reguló negativamente en 167 veces en ACM (P<0,0001, frente a CM de E15.5), mientras que la expresión de E2F4 represor permaneció alta (Figura 1C). En consistencia con estudios previos en músculo esquelético (35) y CM (9), se encontró que p107 era el miembro de la familia de Rb que se expresaba específicamente en miocitos proliferativos, a diferencia de Rb y p130 (Figura 1C). La expresión de los miembros de la familia de KDM4 siguió un patrón de expresión similar, aunque menos drástico, que los genes de CM fetales, G2/M y citocinesis, y se reguló negativamente de forma moderada después de P7 (Figura 1D), lo que coincide con la pérdida del potencial regenerativo de los CM (2,3). La regulación negativa de las HDM de H3K9me3 en ACM es consistente con el aumento de los niveles globales de H3K9me3 en ACM en comparación con los CM embrionarios (9). El bajo nivel basal de KDM4D en ACM es consistente con otros informes de expresión de KDM4D en tejidos con potencial proliferativo limitado (55,56).

Para detectar las HDM que podrían estar implicadas en la proliferación de CM, se buscaron las HDM que se regularon positivamente durante la desdiferenciación de CM, ya que la desdiferenciación parece ser un requisito para la proliferación de CM en los modelos de regeneración del corazón de ratón neonatal y pez cebra (1-3). La desdiferenciación de ACM de mamíferos se puede lograr in vitro mediante cultivo a largo plazo con factores de crecimiento, lo que da como resultado el desensamblaje de los sarcómeros y la restauración del potencial proliferativo (57). De un panel de diversas HDM, KDM4D fue la de mayor regulación positiva (401 veces) durante la desdiferenciación (Figura 1E; P<0,03). Debido a que la expresión de KDM4A se encuentra elevada en muestras de miocardiopatía hipertrófica humana y la sobreexpresión de KDM4A específica de CM exacerbó el crecimiento hipertrófico en ratones (49), nos preguntamos si KDM4D estaba regulado positivamente en el miocardio isquémico humano. La expresión de KDM4D se mantuvo sin cambios en los corazones de los sujetos con miocardiopatía isquémica (Figura 1F), lo que es consistente con la hiperplasia de CM extremadamente baja en este escenario (58). Generación de un modelo de ratón transgénico para reducir H3K9me3 específicamente en CM

Para explorar el papel de H3K9me3 en el silenciamiento de genes del ciclo celular de ACM in vivo, se eligió sobreexpresar el miembro 4D de la familia de KDM porque: 1) KDM4D es la desmetilasa de H3K9me3 más específica (50-52) (Figura 10), 2) se expresa en CM proliferativos y se encuentra elevada en ACM desdiferenciados (Figura 1, D y E), 3) no se expresa en muestras de miocardiopatía donde predominaría el crecimiento hipertrófico (Figura 1F), 4) promueve la proliferación y sobrevivencia en no CM (46-48), y 5) los experimentos de ganancia de función están menos sujetos a compensación por factores redundantes (59). Se usó un modelo de sobreexpresión inducible por tetraciclina (tet-desactivado) caracterizado anteriormente en el que el transactivador de tetraciclina (tTA) se expresa específicamente en CM. (60). Se generó una línea de ratón transgénico específica de CM que contiene un ADNc de KDM4D etiquetado con MYC y FLAG corriente abajo de un promotor sensible a tetraciclina, que contiene una secuencia de unión a tTA en el contexto de un promotor de aMHC atenuado (60). El cruce de ratones tTA heterocigotos con ratones KDM4D (tet) sensibles a tet heterocigotos produce ratones bitransgénicos (BiTg) que expresan constitutivamente KDM4D específicamente en CM (Figura 2A), así como controles monotransgénicos (tet o tTA) y no transgénicos (NoTg). En CM de BiTg, la proteína tTA se expresa y se une al elemento sensible a tet corriente arriba de KDM4D, lo que induce la expresión del transgén de KDM4D (Figura 2A). Se confirmó que la expresión de KDM4D se inducía fuertemente en corazones de BiTg en P14 y 9 semanas (Figura 2B). La expresión del transgén de KDM4D no fue detectable en otros órganos en ratones BiTg o en células cardíacas no CM (Figura 11, A y B), con la excepción de que se pudieron detectar niveles bajos en pulmones de BiTg, en consistencia con informes anteriores que usan el promotor de aMHC (60). Las imágenes de inmunofluorescencia en cortes de corazón mostraron que la proteína KDM4D exógena se expresaba y localizaba específicamente en los núcleos de CM de BiTg (Figura 2C). El análisis de transferencia Western confirmó la expresión de la proteína KDM4D y mostró que los niveles globales de H3K9me3 se encontraban reducidos en los ACM de BiTg (Figura 2D). También se confirmó que, a diferencia de otros miembros de la familia de KDM4 (Figura 10), la actividad desmetilasa de KDM4D es específica de H3K9me3 (50-52) y no desmetila H3K9me2 o H3K36me3 en ACM (Figura 2D). H4K20me3, que se ha implicado como una marca represora que está corriente abajo de H3K9me3 y HP1 (61-63) se mantuvo sin cambios (Figura 2D); aunque esto no descarta cambios en los niveles de metilación en loci de genes específicos.

H3K9me3 se requiere para el silenciamiento de genes del ciclo celular de ACM in vivo.

Para evaluar el efecto de la reducción de H3K9me3 sobre la expresión global de genes in vivo, se realizó la secuenciación de ARN en ACM de 9 semanas. Las muestras de control de ACM se agruparon ya que los ratones monotransgénicos y NoTg no mostraron diferencias en la expresión de genes, y la prueba de correlación de pendiente no restringida mostró R2=0,9764 al comparar el transcriptoma del genoma completo. El análisis de RNA-seq reveló que los ACM de BiTg tenían mayor expresión de genes implicados en 16 de 138 procesos celulares y 16 de 142 procesos del ciclo celular (Figura 3, A y B). Sorprendentemente, los procesos celulares implicados en el ciclo celular aumentaron preferentemente (Figura 3A). Dentro de los procesos del ciclo celular, las categorías implicadas en las últimas fases del ciclo celular, particularmente la mitosis, mostraron una mayor expresión de genes (Figura 3B). Se confirmaron aumentos en genes de G2/M y citocinesis mediante qRT-PCR (5,8 a 21,4 veces, P<0,01) y también aumentaron los genes de CM fetales (Figura 3C). Aunque la expresión de genes de CM fetales se asocia frecuentemente con un estado patológico, debe tenerse en cuenta que la expresión de genes específicos de CM menos maduros también podría ser consistente con CM competentes para la proliferación en corazones fetales y neonatales (9,64) (Figura 1, A y B). También se examinaron los reguladores de la transcripción de genes del ciclo celular (Figura 12, A y B) y se encontró que los reguladores positivos de la progresión del ciclo celular, E2F1 y E2F2, estaban altamente expresados en los ACM de BiTg en comparación con los ACM de control (>12 veces, P<0,03). Los miembros E2F represores, E2F4-6, se mantuvieron sin cambios. Curiosamente, p107 también aumentó en ACM de BiTg (Figura 12B), en consistencia con la expresión de la familia de E2F/Rb en miocitos proliferativos (Figura 1, B y C).

La reducción de H3K9me3 específica de CM promueve la hiperplasia de CM sin alterar la función cardíaca.

Los ratones BiTg tenían corazones visiblemente más grandes (Figura 4A) con un aumento del 20,8 % en la relación del peso del corazón con respecto al peso corporal (HW/BW) a las 9 semanas (Figura 4B; P<0,0001). Este aumento en H^w /BW se hizo evidente por primera vez en ratones BiTg en P14 (Figura 4C; aumento del 12,9 %, P<0,001); lo que sugiere que la sobreexpresión de KDM4D promovió específicamente el crecimiento cardíaco posnatal. Esta hipertrofia cardíaca no se asoció con la desorganización de los sarcómeros, fibrosis o alteración de la vasculatura (Figura 4, D y E) y no hubo aumento en la matriz extracelular (65) (Figura 4E). La cuantificación del área transversal de ACM o las mediciones directas del área longitudinal y la longitud de ACM aislados no revelaron diferencias en las dimensiones o volúmenes calculados en los ACM de BiTg en comparación con los controles (Figura 5, A-D). El número de miocitos calculado sugirió que los corazones de BiTg tenían un 22 % más de ACM en comparación con los controles (Figura 5E; P<0,03). Para determinar el efecto a largo plazo de la reducción de H3K9me3 sobre la función cardíaca, se realizó una ecocardiografía en ratones BiTg y de control de 7 meses: las fracciones expulsadas, el acortamiento fraccional, el gasto cardíaco y el tamaño de la cavidad del ventrículo izquierdo fueron similares en todos los grupos (Tabla 1). No se observaron diferencias significativas en la morfología o la función cardíaca.

Tabla 1. Morfología y función cardíaca normales en ratones BiTg a los 7 meses.

Resultados de la ecocardiografía en ratones de 7 meses. HR: frecuencia cardíaca, EF: fracción expulsada, CO: gasto cardíaco, LVEDD: dimensión telediastólica del ventrículo izquierdo, masa del LV: masa del ventrículo izquierdo. Se muestran los valores medios y SEM. Número de muestras: N=3 para cada genotipo. Estadísticas: ANOVA unidireccional/prueba de Tukey, * P<0,05 frente a NoTg, f P<0,05 frente a tet, t P<0,05 frente a tTA.__________________________________________________________________ NoTg tet tTA BiTg

HR (BPM) 440 ± 10 461 ± 16 452 ± 6 404 ± 3tt

EF (%) 74,5 ± 3,7 80,9 ± 1,6 83,8 ± 2 80,2 ± 4,6

FS (%) 42,7 ± 3,2 48,9 ± 1,6 52,3 ± 2,2 48,8 ± 4,9

CO (ml/min) 16,4 ± 1,4 20,5 ± 1 17,4 ± 1,5 19,1 ± 0,7 LVEDD (mm) 3,47 ± 0,06 3,61 ± 0,02 3,35 ± 0,15 3,73 ± 0,07

Para evaluar la actividad del ciclo celular, se inmunotiñeron cortes de miocardio de P14 y 9 semanas para la serina-10 en histona H3 fosforilada (pH3), un marcador de mitosis. Se observaron CM pH3+ solo en ratones BiTg en ambos puntos de tiempo (Figura 6, A y B). Se observaron tendencias similares para el marcador general de actividad del ciclo celular Ki67 en corazones de 9 semanas (Figura 6C). La cuantificación del número de núcleos por ACM a los siete meses reveló que había un aumento de ACM mononucleados y una disminución de los binucleados en corazones de BiTg (Figura 6D). Estos hallazgos son consistentes con un modelo donde el aumento de la masa cardíaca en ratones BiTg fue secundario a la hiperplasia de CM.

La masa cardíaca aumentó hasta las 9 semanas de edad en ratones BiTg (Figura 4C). La actividad del ciclo celular en ACM de BiTg de 9 semanas, aunque elevada en comparación con los controles (Figura 6, B y C), fue poco frecuente (<2 CM pH3+/campo 200x). Para determinar si el aumento de masa estaba relacionado con el crecimiento hipertrófico posnatal normal de un mayor número de CM en corazones de BiTg o si había hiperplasia de CM en curso, se usó doxiciclina (Dox) para desactivar la expresión de KDM4D (Figura 7A). Se examinó la masa cardíaca en ratones BiTg donde la expresión de KDM4D nunca se indujo o se indujo en el útero pero se suprimió en P14 (Figura 7B). El tratamiento con Dox redujo la expresión de KDM4D en los ventrículos de BiTg para controlar los niveles en una semana (Figura 7C). Los ratones BiTg adultos que tenían la expresión de KDM4D suprimida desde la concepción mostraron HW/BW que eran indistinguibles de los controles (Figura 7D). Los corazones de BiTg con expresión constitutiva de KDM4D eran más grandes en P14 (Figura 4C; aumento del 12,9 % frente al control; P<0,001). Sin embargo, cuando la expresión de KDM4D se desactivó a las 2 semanas, el tamaño del corazón a las 9 semanas fue menor en comparación con los ratones con expresión constitutiva de KDM4D (Figura 7D; 7,9 % frente a 20,8 %; P<0,05). Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión de KDM4D continúa promoviendo hiperplasia de CM adicional entre las semanas 2 a 9.

Las señales hipertróficas estimulan la proliferación de ACM con poca H3K9me3.

Aunque se encuentra altamente regulada positivamente en comparación con los controles, la expresión de genes del ciclo celular tardío en ACM de BiTg es mucho menor que en CM embrionarios y posnatales de tipo silvestre (comparar la Figura 1B con la Figura 3C). Además, el número absoluto de CM en ciclo, aunque aumentó en corazones de BiTg, fue bajo y la masa cardíaca normalizada no aumentó más entre 9 semanas y 7 meses (Figura 4C), lo que sugiere que la proliferación de CM es muy limitada al inicio del estudio en corazones de BiTg adultos. Dado que existe una activación fuerte de numerosas vías de señalización de factores de crecimiento después de TAC que típicamente dan como resultado un crecimiento hipertrófico (9,66), se creyó que este podría ser un modelo excelente para evaluar la capacidad de KDM4D para promover la proliferación de ACM in vivo. Esto permitió determinar si una señal de crecimiento hipertrófica tal como TAC induciría hiperplasia en ACM con poca H3K9me3 o si experimentarían una hipertrofia similar a la de los corazones de control. BiTg y los compañeros de camada de control se sometieron a cirugías simuladas o TAC a las 11 semanas de edad y se examinaron 10 días después de la cirugía. De forma similar a los ratones no operados, los corazones de BiTg con operación simulada eran visiblemente más grandes que los controles (Figura 8A). TAC indujo un aumento del 48,2 % en HW/BW en ratones BiTg en comparación con un 20,9 % en ratones de control (Figura 8B; P<0,0001). Para determinar si el crecimiento cardíaco inducido por TAC se produjo por hipertrofia o hiperplasia de ACM, se midió el área transversal de ACM. Los ACM de BiTg simulados eran similares a los controles simulados (Figura 5A); sin embargo, en ACM de BiTg con TAC, el área transversal fue 12,5 % más pequeña en comparación con los ACM de control con TAC (Figura 9, A y C; P<0,05). Dado que el área transversal de ACM, pero no la longitud, aumenta después de TAC (67), se estimó el número de CM y se encontró un aumento del 56,6 % en ACM en corazones de BiTg en comparación con los controles (Figura 9D, P<0,001). Para confirmar que los ACM de BiTg estaban en ciclo después del TAC, se analizó la fosfo-H3 y se observó un aumento de 41 veces en ACM pH3+ en ratones BiTg en comparación con los ratones de control (0,77 % frente a 0,019 %; P<0,0001) (Figura 9, A y B). Esta actividad del ciclo celular no se asoció con fibrosis (Figura 8C y Figura 9A) o aumento de la apoptosis (Figura 13). Para determinar si la reinducción del ciclo de células CM afectaba negativamente la función cardíaca, se realizaron ecografías 2-D 9 días después de la cirugía (Tabla 2). La fracción expulsada disminuyó en ratones BiTg después de TAC junto con un aumento de LVEDD. Sin embargo, el gasto cardíaco calculado se mantuvo sin cambios, presumiblemente debido al tamaño de la cavidad en los corazones de BiTg (Figura 14).

Tabla 2. Morfología y función cardíaca en ratones operados con TAC.

Resultados de la ecocardiografía en ratones de 12 semanas de edad, 10 días después de la operación. HR: frecuencia cardíaca, EF: fracción expulsada, CO: gasto cardíaco, LVEDD: dimensión telediastólica del ventrículo izquierdo, masa del LV: masa del ventrículo izquierdo. Se muestran los valores medios y SEM. Número de muestras: Simulación, Control=4, BiTg=4; TAC, Control=9, BiTg=8. Estadísticas: prueba T bilateral, control frente a BiTg, * P<0,05._______________________________________________________ Simulación TAC

Control BiTg Control BiTg

HR (BPM) 428 ± 17 416 ± 7,6 430 ± 11 406 ± 10

EF (%) 71,1 ± 4,2 72,4 ± 3,7 75,5 ± 4,4 51,2 ± 3,7*

FS (%) 39,5 ± 3,5 40,8 ± 3,4 43,7 ± 3,5 25,9 ± 2,3*

CO (ml/min) 11,6 ± 2,4 12,4 ± 1,5 9,8 ± 0,9 10,9 ± 0,7 LVEDD (mm) 3,04 ± 0,14 3,19 ± 0,11 2,83 ± 0,09 3,57 ± 0,10*

Discusión

Desde el descubrimiento de que los corazones de los mamíferos neonatales pueden regenerarse mediante la proliferación de CM (2,3) y que los ACM conservan cierta capacidad de división, aunque muy limitada (7), se ha reavivado el interés en la regulación del ciclo celular de ACM (4,69-71). Muchas estrategias que pueden promover la proliferación en CM de mamíferos neonatales han sido ineficaces en ACM (72,73), lo que pone de relieve el hecho de que existen fuertes barreras para la proliferación en ACM. Recientemente, se sugirió que el factor paracrino epicárdico FSTL1 (70), la inhibición por miR-15 (3) y el correceptor de NRG1 Erbb2 (74) promueven la proliferación de ACM, aunque los mecanismos moleculares y las dianas relevantes en los ACM siguen siendo difíciles. Anteriormente se encontró que el marcador de heterocromatina H3K9me3 estaba enriquecido en genes de G2/M y citocinesis en ACM en comparación con CM fetales lo que implica que esta marca es una barrera para la proliferación de ACM (9). Este ejemplo caracteriza la expresión de desmetilasas de H3K9me3 en el desarrollo, la desdiferenciación y la enfermedad y muestra que KDM4D se expresó en CM fetales y fue la principal desmetilasa específica de H3K9me3 regulada positivamente en ACM desdiferenciados. La sobreexpresión de KDM4D específica de CM redujo H3K9me3 específicamente y condujo a aumentos en la expresión de genes de G2/M y citocinesis en ACM, masa cardíaca, número de ACM y actividad mitótica de ACM.

El renovado interés en la proliferación de CM también ha llamado la atención sobre la necesidad de mejorar las metodologías para detectar la proliferación de ACM (75). El indicador estándar de la proliferación de ACM ha sido la histología indirecta in situ de marcadores de ciclo celular generales o específicos de fase. Sin embargo, se ha sugerido que estos resultados a menudo son ambiguos porque puede ser difícil determinar si el marcador está presente en un CM o un no CM (75,76). La mayoría de los estudios se realizan en cortes cardíacos de menos de 10 |jm de grosor, lo cual es significativamente más delgado que incluso el eje más corto de los ACM de mamíferos, y se confunden aún más por la vasculatura miocárdica densa y los no CM que son la mayoría de las células cardíacas (77). Esta limitación se abordó mediante el desarrollo de una nueva técnica de preparación de muestras y obtención de imágenes que produce reconstrucciones de imágenes en 3D de alta resolución de cortes gruesos aclarados con varias capas de ACM completos, lo que permite una identificación inequívoca de los ACM mitóticos en ratones que sobreexpresan KDM4D (Figura 9). Nuestros métodos corroboran los hallazgos del marcaje de proliferación acumulada in vivo en modelos de rastreo de linaje de CM (espectrometría de masas de isótopos múltiples (7), análisis de mosaico con marcadores dobles (78) y ensayos clonales multicolores (76)) y respalda el consenso emergente de que la proliferación de ACM es poco frecuente y difícil de estimular (75). A pesar del hecho de que la expresión de genes del ciclo celular tardío aumentó notablemente a las 9 semanas en CM con poca H3K9me3 (Figura 3C), sus niveles de expresión fueron mucho más bajos en comparación con los CM neonatales (Figura 1B). Además, la gran mayoría de los ACM de BiTg parecieron salir del ciclo celular en P14 (Figura 6A) y la diferencia en HW/BW en comparación con los controles no pareció aumentar más después de 9 semanas (Figura 4C). Esto sugiere mecanismos que, además de H3K9me3, previenen la proliferación en ACM.

Este ejemplo confirma que H3K9me3 se requiere para el silenciamiento de genes del ciclo celular de ACM in vivo, pero que H3K9me3 no es suficiente por sí misma para explicar el silenciamiento estable de los genes del ciclo celular en los ACM, ya que se mantuvo en genes de G2/M y citocinesis incluso después de que se eliminó la represión por doble inactivación génica de Rb/p130 (9). En ese estudio, HP1^y, cuyo cromodominio se une específicamente a H3K9me3, se desplazó de los promotores de genes del ciclo celular tardío. Este estudio sugirió que el silenciamiento estable de genes del ciclo celular en los ACM requería el reclutamiento de HP1y y que H3K9me3, aunque se requería, no era suficiente para silenciar los genes (9). Dado que tanto Rb como H3K9me3 se requieren para la unión de HP1 en muchos sistemas, es posible que la sobreexpresión de KDM4D elimine la represión de los genes del ciclo celular tardío en los ACM al eliminar el sustrato de unión de HP1y de la cromatina. Independientemente, dado que Rb y H3K9me3 están presentes en numerosos genes, no está claro por qué preferentemente se elimina la represión de los genes del ciclo celular tardío. Quizás esto pueda estar relacionado con combinaciones particulares de miembros de la familia de E2F y Rb que forman complejos distintos y se dirigen a subconjuntos específicos de genes (33,34). En ACM de BiTg, este ejemplo mostró que los miembros de la familia de E2F/Rb más aumentados por la reducción de H3K9me3 fueron E2F1 y p107 (Figura 12), que son los mismos miembros de la familia de E2F/Rb que se expresan específicamente en CM proliferativos embrionarios y neonatales (Figura 1C) (9). En consistencia con la pérdida de la capacidad de HP1 de dirigirse a genes dependientes de E2F en los ACM de BiTg, no se ha demostrado que p107, a diferencia de Rb, se une a HP1 (39). En concordancia, Rb tiene dominios adicionales de unión a proteínas y fosforregulados que no se encuentran en p107, y la eliminación de p107 no ha mostrado el fenotipo de hiperplasia que se observa con la pérdida de función de Rb (79;80). Por tanto, los aumentos selectivos en los niveles de expresión de la familia de E2F/Rb y el reclutamiento diferencial de HP1 pueden explicar el aumento preferencial de los genes del ciclo celular tardío en los ACM de BiTg.

Este ejemplo demostró que los ACM pueden tolerar niveles moderados de expresión de genes de G2/M y citocinesis sin efectos perjudiciales sobre la función cardíaca (Figura 3 y Tabla 1). Esto es similar a otros modelos de ciclo de ACM limitado (76), pero contrasta con nuestros hallazgos anteriores donde la alteración de la formación de heterocromatina y la inducción de la reentrada al ciclo celular en los ACM se asoció con una función cardíaca disminuida (9). Una diferencia fundamental entre los ratones KDM4D y ese modelo es que la sobreexpresión de KDM4D se dirige específicamente a una vía de metilación, mientras que Rb/p130 KO probablemente alteró múltiples modificaciones epigenéticas (H3K9me3, H3K27me3 y H4K20me3) (9,32,33). Esto puede explicar por qué los genes implicados en la promoción de todas las fases del ciclo celular se regularon positivamente en Rb/p130 KO, mientras que la alteración específica de H3K9me3 o HP1y conduce a un aumento preferencial de la expresión de genes de G2/M y citocinesis (9) (Figura 3). En consistencia con esta noción, la cromatina con poca H3K9me3 en ratones KDM4D mantuvo su estructura global, que incluye la heterocromatina, a diferencia del modelo Rb/p130, con la excepción de los ciclos de ACM pH3+ (Figura 15). Por lo tanto, las metilaciones represoras tienen papeles superpuestos en el mantenimiento de la estructura global de la cromatina en los ACM en consistencia con los informes de reducción de H3K9me3 en otros tipos de células (27,81,82).

Hemos sugerido que hay una transición en la estructura de la heterocromatina durante la diferenciación posnatal en ACM (9) de heterocromatina limitada organizada en muchos focos pequeños dentro del núcleo del CM embrionario, a unos pocos focos grandes con heterocromatina adicional en la lámina nuclear en los núcleos de CM posnatales. (Figura 15A). Se encontró que los ACM pH3+ en ratones BiTg tenían una estructura de cromatina gruesa similar a la de los CM embrionarios proliferativos (Figura 15B). La relación entre la estructura de la cromatina de orden superior y la regulación específica de genes no está clara, aunque los estudios sugieren que actúan de forma independiente (27,82). Curiosamente, H3K9me3 y las proteínas asociadas a H3K9me3 también regulan el ciclo celular por medio de mecanismos independientes de la transcripción que implican cambios en la estructura global de la cromatina requerida para la síntesis de ADN y la mitosis (42,83). No es sorprendente que pH3, el sello distintivo de la actividad mitótica, se inhiba por la trimetilación del residuo de aminoácido adyacente H3K9 y la doble inactivación génica de las metiltransferasas Suv39h1/2 de H3K9me3 dio como resultado un aumento de fibroblastos embrionarios pH3+ de ratón (84,85), lo que sugiere que la reducción global de H3K9me3 facilita la actividad mitótica. Aunque varios mecanismos pueden contribuir a la actividad del ciclo celular de ACM mediada por KDM4D, hemos proporcionado evidencia que respalda un modelo donde se previene el silenciamiento de genes del ciclo celular mediante la reducción de H3K9me3, pero represores adicionales parecen prevenir la activación fuerte del ciclo celular en ausencia de estimulación del crecimiento.

Los resultados pueden compararse con los hallazgos de los estudios de otra importante vía de señalización de regulación de la proliferación celular, la vía de Hippo/Yap, que controla el tamaño de los órganos. Esta vía se ha estudiado intensamente con varios modelos de ratón de pérdida de función y ganancia de función específicos de CM durante el desarrollo de CM y en la adultez (71,93). Aunque la ganancia de función de Yap1 en adultos aumentó la proliferación de ACM, los niveles fueron 20 veces menores que los de CM neonatales de NoTg (76). Los autores postularon que la activación de Yap por sí sola es insuficiente para superar las múltiples barreras que bloquean la proliferación de ACM. En varios otros sistemas, la señalización de Yap no logra impulsar la proliferación en ausencia de señalización de E2F (94-96). Curiosamente, los enfoques de secuenciación de inmunoprecipitación de la cromatina e informática encontraron sitios de unión de E2F y Yap cercanos entre sí en muchos promotores de genes del ciclo celular (95-97), lo que sugiere que E2F y Yap podrían ser vías paralelas. De hecho, en los modelos de regeneración hepática, el aumento de la activación de E2F por triple inactivación génica de los miembros de la familia de Rb dio como resultado la proliferación celular; sin embargo, el aumento de la proliferación disminuyó con el tiempo debido a la disminución de la señalización de Yap (97). La activación forzada de Yap1 o la reducción del tamaño del hígado por hepatectomía parcial permitió que persistieran los aumentos de la proliferación mediados por E2F. Esto sugiere que la vía intrínseca de Hippo/Yap tiene una capacidad notable de detectar y regular el tamaño normal del órgano y que los aumentos de la proliferación mediados por E2F pueden aumentarse mediante la estimulación del crecimiento o la señalización de Yap. Esto es consistente con nuestro hallazgo de que la carga hemodinámica, que aumenta los niveles de Yap activo (98), estimuló una proliferación drástica incluso en corazones KDM4D adultos inactivos. Curiosamente, la proteína Yap1 endógena se expresa altamente en CM posnatales y se mantiene a las 8 semanas pero se pierde a las 20 semanas (99), lo que puede explicar los aumentos en la nivelación de HW/BW a las 9 semanas en nuestro modelo. El sinergismo de la activación de E2F y Yap también es consistente con un modelo de bloques múltiples para la proliferación de ACM. Los estudios futuros que examinen la conectividad de las vías de señalización de la familia de E2F/Rb e Hippo/Yap en el ciclo celular de CM pueden aclarar si la regulación por H3K9me3 de los genes del ciclo celular es estrictamente dependiente de E2F. La importancia relativa de estas vías es especulativa, pero las señales de crecimiento que típicamente inducen la hipertrofia de ACM causaron la reinducción de la proliferación de ACM tanto en ACM con poca H3K9me3 como en ratones Yap1 informados anteriormente (76). Aunque los ACM de NoTg en el presente ejemplo y estos modelos activados por YAP tenían una actividad mitótica similar, muy limitada después del estímulo de crecimiento (-0,02 % (76) frente a 0,019 % Figura 9B) se encontraron sustancialmente más ACM de BiTg mitóticos después de TAC que los observados en ACM activados por Yap1 después de IM (0,77 % Figura 9B frente a 0,07 % (76)). No está claro si todos los ACM de BiTg conservaron el potencial proliferativo o si existe un subconjunto de ACM altamente proliferativos, pero si la señal de pH3 está presente durante 3 horas de un ciclo celular de 22 horas (102), esto sugeriría que el 5,7 % de los ACM de BiTg estaban en ciclo activo durante 10 días después de TAC.

En conclusión, la inducción de KDM4D específica de CM y la posterior reducción de H3K9me3 son suficientes para mantener la competencia de proliferación en ACM. Estos resultados favorecen la comprensión de cómo se regula el crecimiento cardíaco e identifican un nuevo papel para H3K9me3 y una vía efectora común para la regulación del ciclo celular de CM. El hecho de que la sobreexpresión de KDM4D no afectara la función cardíaca normal pero permitiera la hiperplasia en respuesta a señales hipertróficas respalda el uso de KDM4D para mejorar la respuesta regenerativa en escenarios clínicos. Esta estrategia es muy adecuada para terapias génicas con expresión de KDM4D localizada y controlada temporalmente y proporciona cardioterapias regenerativas.

Ejemplo 2: Modelo de regeneración de ratón neonatal

En la Figura 16 se ilustra un modelo animal para la regeneración de tejido cardíaco. Con el uso de este modelo, los ratones que sobreexpresan KDM4D muestran una mayor regeneración después de un infarto de miocardio (IM) por análisis histológico, como se ilustra en la Figura 17. Se observó una reducción estadísticamente significativa (p<0,05) tanto en el área fibrótica promedio como en el área fibrótica máxima en los ratones que sobreexpresaban KDM4D en comparación con los ratones de control 21 días después del IM. Estos datos demuestran la utilidad de KDM4D para la terapia regenerativa de tejidos cardíacos.

Ejemplo 3: Terapia génica para la regeneración del corazón

Se pueden construir vectores para la implementación y evaluación de la regeneración cardíaca con el uso de terapia génica. Los vectores pueden construirse con el uso de virus AAV, tales como AAV6 o AAV9 u otros serotipos híbridos de AAV que ofrecen especificidad por cardiomiocitos. Se usa un promotor de troponina para la expresión específica de CM. El vector AAV-KDM4D (que expresa SEQ ID NO: 1 y opcionalmente S^eQ ID NO: 2) se inyecta en tejido cardíaco en el momento del infarto de miocardio o poco después. La evaluación de la función cardíaca mediante ecocardiografía (ECHO) y resonancia magnética cardíaca (CMR) se realiza en intervalos de tiempo posteriores para monitorizar la recuperación y la regeneración. Al final del estudio, se evalúan el tamaño del infarto y la proliferación de ACM.

En una versión de la construcción, KDM4D puede desactivarse después de unas pocas semanas de regeneración para que los niveles de KDM4D regresen a los valores iniciales, una vez que se han repoblado los CM perdidos. Los expertos en la técnica apreciarán los ajustes al protocolo que se pueden hacer para tener en cuenta vectores y/o promotores alternativos que pueden lograr el mismo efecto, así como para tener en cuenta el momento adecuado del período de tratamiento antes de que los niveles de KDM4D regresen a los valores iniciales, considerando las circunstancias individuales, tales como el alcance del daño y/o la capacidad de respuesta del paciente.

Referencias

1. Jopling,C. y otros 2010. Nature 464:606-609.

2. Porrello,E.R. y otros 2011. Science 331:1078-1080.

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5. Laflamme,M.A. y Murry,C.E. 2011. Nature 473:326-335.

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7. Senyo,S.E. y otros 2013. Nature 493:433-436.

8. Bergmann,O. y otros 2009. Science 324:98-102.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión para el uso en cardioterapia regenerativa que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica la desmetilasa 4D específica de lisina (KDM4D); (b) un promotor específico de tejido cardíaco que efectúa la sobreexpresión de KDM4D, en donde el promotor está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico; y

(c) un elemento regulador que reprime de forma inducible la sobreexpresión de KDM4D.

2. El vector de expresión para el uso de la reivindicación 1, en donde el elemento regulador es un elemento sensible a la tetraciclina.

3. El vector de expresión para el uso de la reivindicación 1, en donde la terapia comprende inducir hiperplasia de cardiomiocitos (CM) en un mamífero.

4. El vector de expresión para el uso de la reivindicación 1 o 3,

el uso comprende administrar el vector de expresión de la reivindicación 1 o 3 al mamífero.

5. El vector de expresión para el uso de la reivindicación 1 o 3, el uso comprende:

injertar CM en el corazón del mamífero, en donde los CM contienen el vector de expresión de la reivindicación 1 o 3.

6. KDM4D para el uso en cardioterapia regenerativa en un mamífero, el uso comprende administrar KDM4D al mamífero.

7. KDM4D para el uso de la reivindicación 6, el uso comprende administrar KDM4D a los CM.

8. Un método de proliferación de CM in vitro que comprende cultivar CM con KDM4D en condiciones eficaces para inducir hiperplasia de CM.

9. Un método de proliferación de CM in vitro que comprende cultivar CM con el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 5 en condiciones eficaces para inducir hiperplasia de CM.

10. El método de la reivindicación 8 o 9, en donde los CM son CM adultos (ACM).

11. El vector de expresión o KDM4D para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, en donde la administración es sistémica.

12. El vector de expresión o KDM4D para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, en donde la administración es intravenosa.

13. El vector de expresión o KDM4D para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en donde la administración es mediante inyección intramiocárdica.

14. KDM4D para el uso de la reivindicación 6, el uso comprende administrar KDM4D mediante el contacto del mamífero con el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 5.

15. KDM4D para el uso de la reivindicación 7, el uso comprende administrar KDM4D:

mediante el contacto de los CM con el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 5; o

mediante la administración de CM proliferados por los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.