ES2304998T3 - Polinucleotidos aislados que tienen un contenido reducido de motivos de control epigenetico 5'cpg3' y usos de los mismos. - Google Patents
Polinucleotidos aislados que tienen un contenido reducido de motivos de control epigenetico 5'cpg3' y usos de los mismos. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para aumentar la capacidad de un gen procariótico nativo aislado de expresarse en un hospedador eucariótico, caracterizado porque comprende modificar la secuencia nucleotídica de dicho gen procariótico nativo aislado reduciendo su contenido de dinucleótidos 5''CpG3'' en al menos un 80%, sin cambiar la secuencia aminoacídica de la proteína o polipéptido codificado por dicho gen procariótico nativo.
Description
Polinucleótidos aislados que tienen un contenido
reducido de motivos de control epigenético 5'CpG3' y usos de los
mismos.
La presente invención se refiere a
polinucleótidos modificados derivados de un gen nativo y que tienen
un número reducido de motivos de control epigenético 5'CpG3', al
nivel de nucleótido, en comparación con el gen nativo. Estos
polinucleótidos modificados son útiles para aumentar la expresión
génica. La presente invención se refiere a procedimientos de uso de
estos polinucleótidos modificados en sistemas de expresión in
vitro, ex vivo e in vivo.
Las secuencias y regiones de ácido nucleico de
control epigenético son conocidas por estar implicadas en la
expresión de la regulación génica.
En eucariotas, numerosos estudios han mostrado
que la metilación de dinucleótidos 5'CpG3' (mCpG) tiene un efecto
represor sobre la expresión génica en vertebrados y plantas con flor
(Hsieh, Mol. Cell. Biol., 14: 5487-94, 1994;
Kudo, Mol. Cell. Biol., 18: 5492-99, 1998;
Goto y Monk, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:
362-378, 1998; Jones y col. 1998, Collas 1998). La
metilación de dinucleótidos 5'CpG3' en genes crea dianas
potenciales para complejos proteicos que se unen a secuencias de
ADN metiladas y a histona desacetilasas (MBD-HDAC).
Esto puede conducir a una represión transcripcional después de
la(s) modificación(es) de la cromatina.
Hasta ahora, el conocimiento de que la
metilación de secuencias de CpG en un gen silencia de forma
dominante la transcripción se ha usado para inhibir la expresión
génica de genes que se sobreexpresan o para los que no se desea la
expresión. Por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.856.462 y
5.874.416 dan a conocer oligonucleótidos que tienen un contenido
rico en dinucleótidos CpG y prevén los usos de estos
oligonucleótidos para inhibir la expresión génica específica.
El documento W09852581 se refiere al problema de
la vacunación y la terapia génica, más específicamente al problema
de controlar la inmunogenicidad de un ADN que se administra a un
organismo: para tener un efecto inmunológico aumentado (en el caso
de vacunas); o para tener un efecto inmunológico reducido (en el
caso de terapia génica). El documento W09852581 da a conocer que
habría dos clases o motivos CpG diferentes, a saber, motivos
CpG-N y motivos CpG-S. Según el
documento W09852581, los motivos CpG-N tendrían un
efecto neutralizante o inhibidor sobre la inmunogenicidad, mientras
que los motivos CpG-S tendrían un efecto estimulante
sobre la inmunogenicidad (véase, por ejemplo, página 9 líneas
1-12 y página 10 líneas 21-25). En
consecuencia, el documento W09852581 da a conocer que cuando se
pretende usar como vacuna un constructo de ácido nucleico, debería
reducirse el número de motivos CpG-N reteniendo los
motivos CpG-S, preferiblemente aumentando el número
de motivos CpG-S, y que cuando se pretende usar un
constructo de ácido nucleico como constructo de terapia génica,
debería reducirse el número de motivos CpG-S
reteniendo los motivos CpG-N, preferiblemente
aumentando el número de motivos CpG-N.
Contrariamente a la técnica anterior, la
presente invención aspira a retirar la barrera inhibidora de la
expresión que existe entre organismos de diferentes géneros y
especies. La invención reivindicada aspira a aumentar la capacidad
de un gen procariótico nativo aislado de expresarse en un
hospedador eucariótico.
La presente invención satisface también otras
necesidades que resultarán evidentes para los expertos en la
técnica tras la lectura de la siguiente memoria descriptiva.
La presente invención se refiere a
polinucleótidos aislados y modificados que derivan de un gen nativo
de un primer hospedador, que es un hospedador procariótico,
reduciendo el contenido de dicho gen nativo en dinucleótidos 5'CpG3'
en al menos un 80%, sin cambiar la secuencia aminoacídica de la
proteína o polipéptido codificado por dicho gen nativo. Los
polinucleótidos aislados y modificados demuestran un nivel aumentado
de expresión una vez introducidos en una célula de un segundo
hospedador, que es un hospedador eucariótico, en comparación con el
nivel de expresión del gen nativo. La secuencia de los
polinucleótidos aislados modificados según la invención es tal que
los niveles de expresión de los polinucleótidos aumentan en el
segundo hospedador, particularmente en casos en que en condiciones
estándar los niveles de expresión del gen nativo en el segundo
hospedador son nulos o muy bajos.
La invención comprende:
- -
- un procedimiento para aumentar la capacidad de un gen procariótico nativo aislado de expresarse en un hospedador eucariótico,
- así como
- -
- el uso de dichos polinucleótidos modificados:
- \bullet
- para aumentar la expresión de dicha proteína o polipéptido en una célula hospedadora eucariótica ex vivo o in vitro en comparación con el nivel de expresión alcanzado cuando se usa dicho gen procariótico nativo,
- \bullet
- para preparar un animal transgénico no humano que tiene una expresión aumentada de dicha proteína o polipéptido en comparación con el nivel de expresión alcanzado cuando se usa dicho gen procariótico nativo.
La invención comprende también polinucleótidos
aislados que comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo constituido por la SEC ID Nº 1 (LagZ) y la SEC ID Nº 2
(LagoZ), así como vectores de expresión, células y organismos vivos
modificados genéticamente para comprender y/o expresar cualquiera de
estos polinucleótidos. Más particularmente, la presente invención
proporciona dos microorganismos que tienen un gen lacZ modificado
con un contenido menor de CpG. Estos microorganismos se han
depositado en la "Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes (CNCM)" con los números 1-1691
("pPytknlsLagZ" depositado el 16 de abril de 1996) y
1-2354 ("pBSEF Lago LTR" depositado el
25 de noviembre de 1999).
La invención y sus numerosas ventajas se
entenderán mejor tras la lectura de la siguiente memoria
descriptiva no restrictiva y los dibujos adjuntos, que tienen sólo
fines de ilustración.
La Figura 1 muestra las secuencias nucleotídicas
de los genes LacZ, LagZ y LagoZ. Los nucleótidos en negrita
corresponden a las mutaciones conservativas introducidas para
cambiar los dinucleótidos CpG. Los nucleótidos subrayados
corresponden a mutaciones fortuitas no conservativas que han
aparecido durante los ciclos de mutagénesis.
La Figura 2 muestra la estructura de constructos
de ADN que se prepararon para generar ratones transgénicos que
expresan polinucleótidos aislados según la invención. Todos los
constructos contienen la señal de localización nuclear de SV40
(nls), un gen indicador, gen LagZ o LacZ, y la señal de
poliadenilación MoMuLV. Cada barra vertical por encima o por debajo
del gen indicador indica un dinucleótido CpG. El tamaño de cada
inserto de ADN se indica en kilobases (kb). Prom EF1 \alpha
a: promotor del gen de la subunidad a del factor de elongación
de la translocación humana; el: exón 1; Prom HPRT.:
promotor del gen de hipoxantina fosforribosiltransferasa humana;
LCR de \beta-globina: región de control de
mini-locus del locus de
\beta-globina; Poli A: señal de
poliadenilación del virus de leucemia murina de Moloney. La tabla
de la izquierda contiene los parámetros usados para identificar una
región CpG según Larsen y col. (1992) para cada gen indicador.
(C+G) es el (número de C más número de G) / número de nucleótidos
en la secuencia, y CpG/CxG es el (número de CpG x número de
nucleótidos en la secuencia) / (número de C x número de G).
La Figura 3 muestra los resultados de la
expresión de los transgenes EFLagZ y EFLacZ durante la
gametogénesis.
- A)
- Cronología de eventos meióticos durante la ovogénesis y espermatogénesis. La figura resume la sucesión de los eventos importantes en ovogénesis y espermatogénesis, empezando por la etapa de colonización en los rebordes genitales por células germinales primordiales hasta la etapa de gametos maduros y la primera etapa de escisión después de la fertilización. dpc designa el número de días después del apareamiento (para embriones). dpp indica el número de días después del nacimiento. P, L, Z: etapas de preleptoteno, leptoteno y cigoteno de la profase 1, respectivamente. Pach: etapa de paquiteno de la profase 1; 2º Spc: espermatocito secundario; Rd spd: espermátida redonda; El spd: espermátida alargada y n: genoma haploide.
- B)
- Expresión de transgenes EFLagZ and EFLacZ transmitidos por vía materna y C) por vía paterna durante la gametogénesis y en la gónada adulta. Se obtuvieron embriones o animales cruzando hembras o machos transgénicos heterocigóticos con machos o hembras (B6D2)F1 según el origen parental del transgén. Los números entre flechas indican el número de embriones o animales analizados. - : \beta-gal negativo; +: \beta-gal positivo; e: sólo unas pocas células germinales eran \beta-gal positivas; las células germinales \beta-gal positivas estaban agrupadas, 1: una hembra transgénica era \beta-gal positiva en gónadas; 2: dos hembras transgénicas eran \beta-gal positivas en gónadas; 3: cuatro hembras transgénicas eran \beta-gal positivas en gónadas; 4: dos machos transgénicos eran \beta-gal positivos en gónadas; nd: no determinado. La última columna en C) designa un análisis cuantitativo de la expresión transgénica parental en testículos adultos. Se cuantificó la actividad \beta-gal usando un sustrato fluorogénico de \beta-galactosidasa (MUG). La actividad \beta-gal de los testículos de control era de 41,5 x 10^{-7} unidades \beta-gal (valor medio de 12 testículos de control analizados).
La Figura 4 muestra resultados que indican que
los inhibidores de histona desacetilasas anulan el estado reprimido
de transgenes LacZ transmitidos por vía materna y paterna en
embriones de 2 células. Se recuperaron embriones de 1 célula de
diferentes líneas que portaban un transgén de origen materno (A) o
paterno (B) a 24 hphCG y se dejaron desarrollar en ausencia
(control) o presencia de butirato de sodio (NaB; 2,5 mM) o
tricostatina A (TSA; 66 nM) durante 24 h. Se usó afidicolina, un
inhibidor de ADN polimerasas sola (Aph; 2 \mug/ml) o en
combinación con butirato de sodio (Aph + NaB).
La Figura 5 resume en diagramas la expresión de
los transgenes EFLagZ, EFLacZ, HPRTLacZ y HPRTLacZDCR durante la
gametogénesis y el desarrollo temprano del embrión. La expresión de
los transgenes EFLagZ y LacZ durante el desarrollo de gameto y
embrión se indica con trazos rojos y verdes, respectivamente. En la
parte izquierda, se indica la expresión de transgenes mediante el
genoma paterno y en la parte derecha la expresión de transgenes
mediante el genoma materno. Se muestra la gametogénesis en la parte
inferior del ciclo, se muestra el periodo de escisión del embrión en
la parte superior del ciclo y se muestra el embrión
post-implantación a la derecha. Los periodos de
desarrollo en los que cambia la permisividad transcripcional de los
transgenes se indican por flechas. Las etapas de gametogénesis y
embrión en preimplantación correspondientes a la anulación de la
inhibición transgénica (flechas rojas, verdes y negras) del
establecimiento de la inhibición (barras verticales rojas, verdes y
negras) se indican fuera del ciclo. Las líneas de puntos rojas y
verdes indican que la anulación de la inhibición transgénica es
progresiva. Las barras verticales y flechas negras indican que los
dos transgenes EFLagZ y LacZ estaban inhibidos y se expresan en el
mismo tipo celular o periodo de preimplantación. dpc: día
post-coito; dpp: día post-parto;
PGC: células germinales primordiales; Ap Spg: espermatogonios de
tipo A;PI-Lp-Zyg: etapas de
preleptoteno, leptoteno y cigoteno de la profase I.
La presente invención aspira en primer lugar a
retirar la barrera inhibidora de la expresión de genes, y más
particularmente entre genes de hospedadores de diferentes géneros y
especies.
Para proporcionar una comprensión aún más clara
y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones,
incluyendo el alcance dado en las mismas a dichos términos, se
proporcionan las siguientes definiciones:
A menos que se definan de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen
el mismo significado entendido normalmente por un experto en la
técnica a la que pertenece esta invención. Aunque puede usarse
cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los
descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la
presente invención, se describen los procedimientos y materiales
preferidos. Todas las patentes de EE.UU. y bibliografía científica
citadas en esta solicitud evidencian el nivel de conocimiento en
este campo. Con fines de aclaración, se definen los siguientes
términos a continuación.
Derivado: (véase también
"modificado"). Se dice que un polinucleótido "deriva" de
un gen nativo o un fragmento del mismo cuando dicho polinucleótido
comprende al menos una porción sustancialmente similar en su
secuencia al gen nativo o a un fragmento del mismo. Preferiblemente,
el polinucleótido es también sustancialmente similar en su función
al gen nativo del que deriva.
Expresión: Los términos "expresión"
o "expresar", como se entiende en general y se usa en la
presente memoria, designan el proceso mediante el cual un gen
estructural produce un polipéptido. Implica la transcripción del gen
en ARNm y la traducción de dicho ARNm en polipéptido(s).
Epigenético: Significa cualquier cambio
de la estructura de ADN, de cromatina o de ARN que no implique
modificaciones de los nucleótidos que comprenden el ADN o ARN.
Estos cambios pueden conducir a modificaciones tridimensionales de
la estructura de ADN o cromatina. Los ejemplos de cambios incluyen
modificaciones químicas de las purinas o pirimidinas constituyentes
del ADN.
Regulación epigenética: Significa todas
las modificaciones químicas introducidas por una célula hospedadora
frente a una secuencia de ADN natural o artificial. Significa
también modificaciones de la estructura de cromatina que una célula
hospedadora impone a una secuencia de ADN natural o artificial.
Incluye también la compartimentalización de una secuencia de ADN
natural o artificial en un compartimento nuclear de una célula que
comprende propiedades transcripcionales y cromatínicas particulares.
En eucariotas, los dinucleótidos 5'CpG', que pueden estar metilados
o no metilados constituyen un motivo de regulación epigenética bien
conocido y regulan así la transcripción de un gen. En procariotas,
un motivo de regulación epigenética conocido incluye la secuencia
5'GATC3'.
Vector de expresión: Designa un vector o
vehículo similar a un vector de clonación pero que es capaz de
expresar un gen (o un fragmento del mismo) que se ha clonado en el
mismo. Típicamente, la expresión del gen ocurre cuando el vector se
ha introducido en el hospedador. El gen clonado se dispone
habitualmente bajo el control de ciertas secuencias de control o
elementos reguladores tales como secuencias promotoras. Las
secuencias de control de la expresión varían dependiendo de si el
vector se diseña para expresar el gen ligado operativamente en un
hospedador procariótico o eucariótico, y puede contener elementos
transcripcionales adicionales tales como elementos potenciadores,
elementos de especificidad de tejido y/o sitios traduccionales y de
terminación.
Fragmento: Designa cualquier parte de un
gen o un polinucleótido que es suficiente para codificar un
polipéptido entero, una de sus porciones o uno de sus epitopos.
Gen: Una molécula de ácido nucleico que
se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm)
en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se
dispone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los
límites del gen se determinan normalmente por un codón de inicio en
el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en
el extremo 3' (carboxi). Un gen puede incluir, pero sin limitación,
ADNc de ARNm procariótico o eucariótico, secuencias de ADN genómico
de ADN procariótico o eucariótico, e incluso secuencias de ADN
sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción estará
localizada habitualmente 3' a la secuencia génica. Sin embargo, la
invención no está limitada a genes enteros sólo puesto que,
dependiendo de los usos particulares, podrían usarse también
fragmentos del gen y/o genes quiméricos.
Hospedador: Una célula, tejido, órgano u
organismo capaz de proporcionar componentes celulares para permitir
la expresión de un ácido nucleico exógeno incrustado en un vector o
un genoma vírico, y para permitir la producción de partículas
víricas codificadas por dicho vector o genoma vírico. Este término
se pretende que incluya también hospedadores que se han modificado
para conseguir estas funciones. Bacterias, hongos, animales
(células, tejidos u organismos) y plantas (células, tejidos u
organismos) son ejemplos de un hospedador. Los "hospedadores no
humanos" comprenden vertebrados tales como roedores, primates no
humanos, ovejas, perros, vacas, anfibios, reptiles, etc..
Aislado: Significa alterado "por la
mano del hombre" de su estado natural, concretamente, si aparece
en la naturaleza, se ha cambiado, purificado o retirado de su
entorno original o todo ello. Por ejemplo, un polinucleótido
presente de forma natural en un organismo vivo no está
"aislado". El mismo polinucleótido separado de los materiales
coexistentes de su estado natural, obtenido mediante clonación,
amplificación y/o síntesis química, está "aislado" como se
emplea el término en la presente memoria. Además, un polinucleótido
que se introduce en un organismo mediante transformación,
manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento
recombinante, está "aislado" incluso si sigue presente en dicho
organismo.
Modificado: Como se usan en la presente
memoria, los términos "modificado", "modificar" o
"modificación", aplicados a los términos polinucleótidos o
genes, designan polinucleótidos que difieren en su secuencia
nucleotídica de otro polinucleótido o gen de referencia. Los cambios
en la secuencia nucleotídica del polinucleótido modificado pueden
alterar o no la secuencia aminoacídica de un polipéptido codificado
por el polinucleótido/gen de referencia. Los cambios nucleotídicos
pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones
aminoacídicas, proteínas de fusión y truncamientos en el polipéptido
codificado por la secuencia de referencia. Según la invención, las
modificaciones son conservativas de tal modo que estos cambios no
alteran la secuencia aminoacídica del polipéptido codificado. Los
polinucleótidos modificados pueden prepararse mediante técnicas de
mutagénesis, mediante síntesis directa, y mediante otros
procedimientos recombinantes conocidos por los expertos. Los
polinucleótidos de la invención pueden contener también
modificaciones químicas o restos químicos adicionales no presentes
en el gen nativo. Estas modificaciones pueden mejorar la
solubilidad, absorción, semivida biológica y similares de los
polinucleótidos. Los restos pueden reducir como alternativa la
toxicidad de los polinucleótidos, eliminar o atenuar cualquier
efecto secundario indeseable y similares. Un experto en la técnica
sabe cómo obtener polinucleótidos derivados de un gen nativo.
Nativo: Como se usa en la presente
memoria aplicado a un objeto, designa el hecho de que un objeto
pueda encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un gen que está
presente en un organismo que puede aislarse de su estado natural no
aislado se dice que es un "gen nativo".
Polinucleótido: Cualquier secuencia de
ADN, ARN o molécula que tiene un nucleótido o más, incluyendo
secuencias nucleotídicas que codifican un gen entero. El término se
pretende que comprenda todos los ácidos nucleicos tanto de origen
natural como no natural en una célula, tejido u organismo
particular. Esto incluye ADN y fragmentos del mismo, ARN y
fragmentos del mismo, ADNc y fragmentos del mismo, marcadores de
secuencias expresadas y secuencias artificiales que incluyen
secuencias artificiales aleatorizadas.
Vector: Una molécula de ARN o ADN
autorreplicativa que puede usarse para transferir un segmento de
ARN o ADN de un organismo a otro. Los vectores son particularmente
útiles para manipular constructos genéticos y diferentes vectores
pueden tener propiedades particularmente apropiadas para expresar
proteína(s) en un receptor durante procedimientos de
clonación y pueden comprender diferentes marcadores seleccionables.
Los plásmidos bacterianos son vectores usados normalmente.
La invención se basa en el uso de
polinucleótidos aislados que derivan de un gen nativo de un primer
hospedador, que es un hospedador procariótico, reduciendo el
contenido de dinucleótidos 5'CpG de dicho gen nativo en al menos un
80% sin cambiar la secuencia aminoacídica de la proteína o
polipéptido codificado por dicho gen nativo. Estos polinucleótidos
demuestran un nivel aumentado de expresión una vez introducidos en
una célula de un segundo hospedador, que es un eucariota, en
comparación con el nivel de expresión del gen nativo.
La invención se refiere al objeto definido en
las reivindicaciones, más particularmente a:
- -
- un procedimiento para aumentar la capacidad de un gen procariótico nativo aislado de expresarse en un hospedador eucariótico, que comprende modificar la secuencia nucleotídica de dicho gen procariótico nativo aislado reduciendo su contenido de dinucleótidos 5'CpG3' en al menos un 80%, sin cambiar la secuencia aminoacídica de la proteína o polipéptido codificado por dicho gen procariótico nativo;
\newpage
- -
- el uso de un gen procariótico modificado, en el que el contenido de dinucleótidos 5'CpG3' de la secuencia de codificación de dicho gen procariótico modificado es al menos un 80% menor que el del gen procariótico nativo, y adicionalmente en el que la secuencia aminoacídica de la proteína o polipéptido codificado por dicho gen procariótico modificado no está cambiada en comparación con la codificada por dicho gen procariótico nativo:
- -
- para aumentar la expresión de dicha proteína o polipéptido en una célula hospedadora eucariótica ex vivo o in vitro en comparación con el nivel de expresión alcanzado cuando se usa dicho gen procariótico nativo,
- -
- para preparar un animal transgénico no humano que tiene una expresión aumentada de dicha proteína o polipéptido en comparación con el nivel de expresión alcanzado cuando se usa dicho gen procariótico nativo.
En condiciones de expresión adecuadas, estos
polinucleótidos demuestran un nivel de expresión modificado una vez
introducidos en una célula del segundo hospedador, en comparación
con el nivel de expresión del gen nativo. El contenido de
motivo(s) de regulación epigenética se modifica para
aumentar el nivel de expresión de los polinucleótidos.
Un ejemplo específico de un oligonucleótido
adecuado según la invención es un polinucleótido que deriva de un
gen procariótico cuyo número de dinucleótidos 5'CpG3' se ha
reducido hasta un 99,3% para aumentar su expresión en un hospedador
eucariótico. Los siguientes ejemplos describen dos genes LacZ
modificados de una fuente bacteriana, a saber "LagZ"
(SEC ID Nº 1) y "LagoZ" (SEC ID Nº 2) que tienen
respectivamente 52 y 2 dinucleótidos CpG en comparación con los 291
CpG encontrados en el gen LacZ nativo. Se encontró que estos genes
tienen una expresión aumentada en embriones de ratón en comparación
con el gen LacZ no modificado.
Pueden producirse vectores de expresión, células
y organismos vivos modificados genéticamente para comprender y/o
expresar cualquiera de los polinucleótidos aislados según la
invención. Las células y organismos vivos "modificados
genéticamente" integrarían y expresarían preferiblemente un ADN
extraño insertados en los mismos. Los procedimientos bien conocidos
para insertar fiablemente un ADN extraño en células y/u organismos
vivos incluyen: transformación bacteriana, transgénesis,
transformación de células madre, transfección vírica e inserción de
cromosoma artificial. Una vez insertado, el ADN extraño puede
encontrarse integrado en el genoma del hospedador o encontrarse en
forma no integrada (episómica, plasmídica o vírica). Puede
insertarse también en un cromosoma artificial o en un genoma
independiente tal como en el genoma de una bacteria que parasita
una célula eucariótica. En una realización preferida, la invención
se refiere a microorganismos con un gen LacZ modificado que tiene
un menor contenido de CpG y, más particularmente, a los
microorganismos depositados en la CNCM con los números
I-1691 e I-2354.
Un procedimiento para expresar en un segundo
hospedador un polinucleótido aislado derivado de una secuencia
génica nativa de un primer hospedador puede comprender la etapa de
proporcionar un polinucleótido aislado para el que se desea la
expresión modificando la secuencia de ácido nucleico del gen nativo
para modificar su contenido nucleotídico en al menos un motivo de
regulación epigenética específico del segundo hospedador. El
polinucleótido aislado muestra así un nivel aumentado de expresión
cuando se introduce en una célula del segundo hospedador en
comparación con el nivel de expresión del gen nativo en el segundo
hospedador. El procedimiento comprende generalmente también la
etapa de introducir el polinucleótido aislado en el segundo
hospedador usando un procedimiento seleccionado preferiblemente del
grupo que comprende transgénesis, transfección vírica,
transformación bacteriana, inserción de cromosoma artificial o
recombinación homóloga como se da a conocer, por ejemplo, por
Cappuchi y col. (Trends Genetics, 1989, 5:
70-76) o por Brulet y col. en la patente europea nº
419.621.
Las modificaciones de secuencia de ácido
nucleico son modificaciones conservativas, de modo que la secuencia
aminoacídica de la proteína/polipéptido expresado por el gen nativo
permanece sin cambios. El motivo de regulación epigenética
comprende dinucleótidos 5'CpG3' y el segundo hospedador es un
eucariota.
Un procedimiento para medir los niveles de
expresión de un gen que tiene al menos un motivo de regulación
epigenética comprende las etapas de:
- a)
- proporcionar un vector que comprende una secuencia reguladora y un gen indicador;
- b)
- insertar en el vector un polinucleótido modificado según la invención que codifica, o es sustancialmente complementario de, el gen para el que se va a medir la expresión; haciéndose dicha inserción entre la secuencia reguladora y el gen indicador del vector;
- c)
- inducir la expresión del polinucleótido insertado; y
- d)
- ensayar los niveles de expresión de dicho gen.
Típicamente, las etapas c) y d) se realizan una
vez se ha introducido el vector en un hospedador adecuado. Este
procedimiento es particularmente útil para evaluar el promotor en
sistemas biológicos, para comparar la actividad de metilación en
sistemas biológicos y/o para identificar proteínas de unión a ADN
metilado desconocidas.
Un procedimiento para expresar una secuencia
génica o un fragmento de la misma en una célula hospedadora in
vitro o in vivo comprende las etapas de insertar en la
célula hospedadora un gen procariótico modificado según la
invención; e inducir su expresión.
Las modificaciones en la secuencia génica
aislada son modificaciones conservativas de dinucleótidos 5'CpG3'
que se introducen usando procedimientos de mutagénesis
dirigida.
Puede usarse un gen procariótico modificado
según la invención para comparar la actividad de metilación en un
sistema biológico y/o identificar proteínas de unión a ADN metilado
desconocidas. Dicho procedimiento puede usarse para medir los
niveles de expresión de un gen que tiene al menos un motivo de
regulación epigenética usando un vector que tiene una secuencia
reguladora y un gen indicador. Más particularmente, este
procedimiento comprende las etapas de:
- a)
- insertar en un vector una secuencia polinucleotídica modificada, modificada según la invención, teniendo dicho vector una secuencia reguladora y un gen indicador, y estando realizada dicha inserción entre dicha secuencia reguladora y dicha secuencia indicadora;
- b)
- inducir la expresión de la secuencia polinucleotídica; y
- c)
- ensayar sus niveles de expresión.
Puede usarse un gen procariótico modificado
según la invención en la fabricación de un medicamento para la
inducción de una respuesta inmunitaria protectora in vivo,
ex vivo o in vitro. Dicho oligonucleótido aislado
modificado según la invención puede ayudar a y aumentar el uso de
procedimientos de vacuna de ADN in vivo. Podría concebirse
también una mejor respuesta de células T mediante una estimulación
in vitro de linfocitos de un paciente contra un
polinucleótido de interés no natural según la invención, en
comparación con la respuesta de células T contra un polinucleótido
nativo natural.
Más particularmente, el procedimiento de la
invención para la fabricación de un medicamento para inducir en un
segundo hospedador, que es un hospedador eucariótico, una respuesta
inmunitaria protectora in vivo, ex vivo o in
vitro contra un producto génico de un primer hospedador, que es
un hospedador procariótico, podría comprender las siguientes
etapas:
- a)
- preparar al menos un polinucleótido derivado del gen de un primer hospedador según la invención;
- b)
- fabricar un medicamento que comprende al menos un polinucleótido de la etapa a) o un fragmento del mismo para administración al segundo hospedador, y opcionalmente,
- c)
- medir in vitro o ex vivo la respuesta inmunitaria obtenida contra dicho producto génico.
Un gen procariótico modificado según la
invención puede usarse para la fabricación de un medicamento para la
prevención de enfermedades autoinmunes frente a motivos de CpG
metilados endógenos, ADN usado en terapia genética o celular o
cualquier secuencia hospedadora similar. Es más, los polinucleótidos
aislados de la invención, sin o con un número reducido de secuencias
de control nucleotídicas epigenéticas, fragmentos de las mismas o
vectores que las contienen, podrían usarse en la fabricación de un
medicamento para minimizar una respuesta de células T contra las
células T o tejidos tratados con ellos. La invención proponía por
tanto un nuevo concepto de vacunas de ADN basado en
reducir/eliminar las secuencias de control nucleotídicas
epigenéticas de un polinucleótido entero que codifica un antígeno, o
sólo una porción del mismo, codificando todavía el polinucleótido
modificado un antígeno inmunoactivo.
Los siguientes ejemplos se pretende que ilustren
adicionalmente ciertas realizaciones preferidas de la invención y
no se pretende que limiten el alcance de la invención.
La metilación de la posición 5 de los residuos
de citosina en el ADN 5 está asociada a la represión transcripcional
en vertebrados y plantas con flor. Las proteínas de unión a
metilcitosina (MDB) poseen un dominio represor transcripcional que
se une a correpresores que incluyen histona desacetilasas (HDAC).
Estos complejos multiproteicos pueden incorporarse a nucleosomas.
La acetilación de residuos de lisina en las histonas H2A, H2B, H3 y
H4 tiene un J papel permisivo para controlar el acceso de
activadores transcripcionales a los nucleosomas. Las histona
acetiltransferasas son frecuentemente coactivadoras de la
transcripción. Muchos experimentos han demostrado que la metilación
de secuencias CpG en un gen silencia de forma dominante la
transcripción mediante el ensamblaje de un conjunto nucleosómico
represivo. Esta represión puede anularse mediante inhibidores de
histona desacetilasas tales como tricostatina A (TSA) o butirato de
sodio (NaB) o mediante medicamentos de desmetilación tales como
5-azacitidina. Por lo tanto, se establece una
relación causal directa entre el silenciamiento transcripcional
dependiente de la metilación de ADN y la modificación de la
cromatina mediante acetilación/desacetilación de histona. La
metilación de ADN está probablemente implicada en el silenciamiento
de elementos transponibles, retrotransposones y ADN provírico como
función de defensa del hospedador que inactiva las secuencias
parásitas. La metilación de ADN está también directamente implicada
en el sellado genómico parental y la inactivación de promotor en el
origen de ciertos cánceres. Finalmente, la metilación es necesaria
para el desarrollo de los mamíferos debido a que los embriones que
no pueden mantener niveles de metilación normales mueren después de
la gastrulación. El genoma de mamífero contiene tanto regiones ricas
en CpG como regiones pobres en CpG. Aquellas ricas en CpG,
denominadas islas de CpG, están a menudo asociadas al promotor de
genes, y generalmente no están metiladas. Aquellas pobres en CpG
están generalmente metiladas. Hasta el momento, no hay un papel o
propiedad específico asociado a ninguno de estos dos tipos de
regiones.
Si las secuencias m^{5}CpG complejadas con
MBD-HDAC son represores transcripcionales potentes,
entonces la inserción natural o artificial de secuencias de ADN en
el genoma (u otras modificaciones genéticas tales como
translocaciones o deleciones) que conducen a una nueva distribución
o creación de regiones ricas en CpG podrían conducir a condiciones
de silenciamiento epigenético. Por ejemplo, la introducción de
genes bacterianos ricos en CpG o de ADNc artificiales en el genoma
podría inducir su silenciamiento. Sin embargo, no hay una
demostración directa in vivo de la represión de un gen
endógeno mediante metilación ni de ninguna de estas
especulaciones.
Un modo directo y sencillo de demostrar esto y
de probar estas especulaciones sería comparar la expresión de
moléculas que se diferencian sólo en su contenido de CpG. Se
describen aquí dos moléculas modificadas del gen LacZ bacteriano
rico en CpG (9,24%). Estas dos moléculas, denominadas LagZ y LagoZ,
tienen un contenido de CpG de un 1,65% (cercano al valor de los
genomas vertebrados fuera de la isla de CpG) y de un 0,06%,
respectivamente. Codifican la misma
\beta-galactosidasa que LacZ, por lo tanto la
expresión del gen puede seguirse en células individuales del
organismo sano. Por tanto, estas moléculas podrían formar la base de
un potente sistema para responder a preguntas fundamentales
referentes a los controles epigenéticos yuxtapuestos a los genes
durante el desarrollo y la gametogénesis.
El reemplazo de los dinucleótidos CpG de la
secuencia LacZ consistió en la amplificación por PCR de un plásmido
que comprendía el gen nlsLacZ (Bonnerot y col., 1987) y del gen
nlsLagZ usando un par de cebadores que comprenden las mutaciones
deseadas. Se realizaron las reacciones de PCR usando 1 ng de ADN
plasmídico en un tampón: Tris-HCl 50 mM (pH 8,8),
BSA 150 \mug/ml, (NH_{4})_{2}SO_{4} 16 mM,
MgCl_{2} 4,5 mM, 250 pM de cada dNTP, 1,25 U de ADN polimerasa
Taq (CETUS^{TM}), 0,078 U de ADN polimerasa Pfu^{(exo+)}
(STRATAGENE^{TM}), 20 pmoles por par de cebadores nucleotídicos.
La amplificación se realizó durante 30 ciclos (1 min 94ºC, 1 min
65ºC, 6 min 72ºC). Después, la banda correspondiente al producto de
amplificación se aisló del gel de agarosa al 1%, se purificó y se
recircularizó. Para hacer esto, se trató el producto de PCR durante
15 min a 12ºC con 100 pM de cada dNTP, 5 5 U de ADN polimerasa T4
(USB), en un tampón que comprendía NaCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 1 mM
(pH 7,2), BSA 50 \mug/ml. A continuación, se fosforiló el ADN
durante 30 min a 37ºC en ATP 30 mM, 30 U de polinucleótido cinasa
(Biolabs), en un tampón que comprendía NaCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 7,8), MgCl_{2} 10 mM,
ditiotreitol 10 mM, BSA 25 \mug/ml. Se realizó el ligamiento
durante una noche a 16ºC en ATP 20 mM, 5 U Weiss de ADN ligasa T4,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), MgCl_{2} 10 mM,
ditiotreitol 10 mM, BSA 25 \mug/ml. Se usa después el producto de
ligamiento para transfectar bacterias mediante electroporación. Se
aislaron las bacterias que expresaban una
\beta-galactosidasa funcional. Se digirió el ADN
plasmídico con enzimas de restricción que permiten la selección de
clones mutados.
Se microinyectaron los diversos constructos en
embriones de ratón en la etapa de 1 célula según un protocolo
conocido (Bonnerot y Nicolas, 1993). Se cultivaron los embriones
durante 24 horas y se midió la actividad
\beta-galactosidasa según la técnica "MUG"
descrita por Forlani y Nicolas (Trends Genet. 1996).
La Figura 1 es una comparación de la secuencia
génica de LacZ con las secuencias génicas de LagZ (SEC ID Nº 1) y
LagoZ (SEC ID Nº 2), que se obtuvieron mediante mutagénesis
dirigida. El análisis de estas secuencias 5 muestra que no se
crearon regiones (A+T) ni (C+G) durante la mutagénesis. Sin
embargo, aparecieron muchas mutaciones durante los muchos ciclos de
PCR. Once de estas mutaciones han dado como resultado la sustitución
de aminoácidos. Estas sustituciones son: E(24) ->K,
E(93) ->K, K (120) ->S, F(139) ->L,
R(432) ->G, T(644) ->I, E(715) ->G,
S(753) ->R, T(755) ->A, D(901) ->G,
R(988) ->G. Como puede observarse, no ocurrió ninguna
mutación puntual en el dominio que se extiende desde el nucleótido
1341 al nucleótido 2076. Por tanto, esta zona parece no ser
flexible, puesto que cualquier modificación en la misma suprime la
actividad enzimática \beta-galactosidasa.
Se prepararon dos microorganismos que comprenden
LagZ y LagoZ transformando células XL1 Blue de E. coli con
los plásmidos según la invención usando protocolos y condiciones
estándar. Se depositaron las células XL1 de E. coli
transformadas en la "Collection Nationale de Cultures de
Microoganisms" (CNCM) con los números 1-1691
(pPytknlsLagZ depositado el 16 de abril de 1996)
el-2354 (pBSEF Lago LTR el 25 de noviembre de
1999).
La Tabla A compara el contenido de nucleótidos
G+C y la relación observada/esperada (O/E) de dinucleótidos CpG
para los tres genes. Según criterios bien conocidos, el gen LacZ
corresponde a una isla muy rica en CpG, puesto que su O/E es
superior a 0,6 (Larsen y col. 1992). El gen LagZ corresponde a una
secuencia pobre en CpG con una O/E cercana a la relación observada
en el genoma, fuera de la isla rica en CpG. El gen LagoZ
corresponde a una secuencia enteramente desprovista de CpG. Dicha
situación no se encuentra nunca en el genoma. El contenido de C+G de
los genes LagZ y LagoZ permanece cercano al 50%.
Se combinaron los genes LacZ, LagZ y LagoZ con
diversos promotores para ensayar si los genes LagZ y LagoZ siguen
poseyendo la capacidad de transcribirse y traducirse a pesar de las
239 modificaciones introducidas en el gen LagZ y las 291
modificaciones introducidas en el gen LagoZ. Algunos de estos
promotores son conocidos por controlar la expresión de genes
desprovistos de especificidad de tejido tales como el promotor de la
subunidad a del factor de elongación de la traducción 1
(E1F\alpha) (Uetsuki y col., 1989) y el promotor de hipoxantina
fosforribosiltransferasa (HPRT). Los resultados presentados en la
presente memoria se refieren a construcciones E1FaLacZ, E1FaLagZ y
E1F\alphalagoZ. Se inyectaron estas construcciones en pronúcleos
masculinos de cigotos de ratón y en el núcleo de uno de los dos
blastocitos embrionarios en la etapa de 2 células. Para el gen
E1F\alphaLagoZ, se ensayaron dos tipos de moléculas: el plásmido
entero que seguía conteniendo secuencias externas del gen rico en
CpG y un fragmento en el que se eliminaron estas secuencias. No se
observaron diferencias entre ambos experimentos. En cada caso se
observó expresión y el marcaje correspondiente al marcaje de una
enzima que tiene una secuencia orientada al núcleo. Algunos de los
cigotos que han permanecido bloqueados en la etapa de 1 célula eran
positivos. No se observó diferencia cuantitativa en la actividad
enzimática \beta-galactosidasa (Tabla B). Como
resultado, ninguna de las mutaciones introducidas fortuitamente
afectó significativamente a la actividad
\beta-galactosidasa ni a la localización nuclear
conferida por la secuencia orientadora nis nuclear (Bonnerot y
col,. 1987).
Este estudio ha mostrado que la ausencia total
de CpG en la parte de codificación de un gen de 3000 pb (una
situación que no tiene equivalencia en el genoma de mamíferos) no
tiene efecto a corto plazo sobre la expresión de este gen. Es más,
los niveles de expresión del gen LagoZ fueron similares (si no
mayores) a los de los genes LacZ y LagZ. Esto se aplica a genes
dispuestos en un entorno nuclear de un pronúcleo masculino en etapa
de 1 célula, así como en el entorno nuclear cigótico de la etapa de
2 células. Estas dos etapas corresponden a dos etapas diferentes de
la maquinaria transcripcional del genoma, que son antes y después de
la adquisición por el embrión de la distancia de activación de la
competencia (Forlani y Nicolas, 1996). Las expresiones de LagZ y
LagoZ demuestran por tanto que las modificaciones introducidas en
la secuencia de ADN primaria no crearon ningún sitio que fuera
reconocido por un supresor presente en estas etapas. Además, el
nivel cuantitativo similar de actividad
\beta-galactosidasa de los tres genes demuestra
que no se ha creado ningún patrón responsable del ajuste ni ninguna
otra modificación de las propiedades del ARN o la enzima durante la
mutagénesis.
Los resultados presentados en la presente
memoria se obtuvieron combinando los genes LacZ, LagZ y LagoZ con la
zona del promotor (promotor, primer exón y primer intrón) de la
subunidad a del factor de elongación de la traducción 1
(HSEF1\alpha). Puesto que este gen es uno de los genes que se
transcribe y traduce a altos niveles en las células, se previó una
expresión normal de los tres genes, incluso en células diferenciadas
no terminales. La siguiente etapa era por tanto ensayar si podían
obtenerse niveles similares de expresión en células en una etapa
diferente de desarrollo, particularmente en células somáticas en
las que la metilación genómica alcanza niveles
máximos.
máximos.
\vskip1.000000\baselineskip
Numerosos estudios han demostrado un efecto
represor del CpG metilado (mCpG) sobre la expresión génica en
células diferenciadas vertebradas (Hsieh, 1994; Kudo, 1998; Goto y
Monk, 1998; Jones y col., 1998; Collas, 1998). Este efecto represor
de mCpG es igualmente eficaz cuando se metilan la parte promotora o
sólo la parte estructural del gen (Trasler y col., 1990) (Komura y
col., 1995; Nan y col., 1997; Singal y col., 1997). Sin embargo, la
densidad de mCpG debe alcanzar un valor umbral para inducir la
represión (Hsieh, 1994; Komura y col., 1995; Kass y col., 1997; Nan
y col., 1997; Goto y col., 1998). Los CpG metilados no tienen que
agruparse en forma de una isla densa para evitar la expresión.
Cuando se dispersan en varias kilobases, los mCpG siguen siendo
eficaces (Boyes y Bird, 1991; Hsieh, 1994; Nan y col., 1997; Goto y
col., 1998). Los efectos represores de la metilación de ADN están
probablemente mediados indirectamente, puesto que estos efectos se
anulan en trans mediante oligonucleótidos metilados in vitro
así como in vivo (Boyes y Bird, 1991; Nan y col., 1997) y
puesto que la represión aparece sólo después de un retardo de
varias horas en sistemas de expresión transitorios (Buschhausen y
col., 1987; Kass y
col., 1997).
col., 1997).
Las proteínas de unión a ADN metilado (MBD) son
mediadores probables del efecto biológico de mCpG (Hendrich y Bird,
1998; Kudo, 1998). Las MBD actúan como parte de complejos
multiproteicos. Por ejemplo, la MeCP2 se asocia con ADN metilado del
genoma somático (Nan y col., 1996) en forma de un complejo que
incluye Sin3A y las histona desacetilasas HDAC1 y HDAC2 (Nan y col.,
1998; Jones y col., 1998). Así, es concebible que la represión
dependiente de MCpG sea debida, al menos en parte, a la remodelación
de la estructura de la cromatina mediante desacetilación de histona
(Jones y col., 1998). Además, la MeCP2 puede inhibir la expresión
génica a distancia del promotor (Nan y col., 1997). Sin embargo, la
implicación in vivo de este complejo en la expresión génica
sigue siendo hipotética, puesto que sólo se han analizado hasta
ahora sistemas artificiales en los que la MeCP2 está dirigida hacia
ADN mediante un dominio de unión a ADN GAL4 y no por su dominio de
unión a ADN apropiado (Nan y col., 1998). Se sugiere que este
sistema puede operar de hecho in vivo por las observaciones
de genes reprimidos mediante metilación que consiguen la expresión
después de tratamiento con inhibidores de desacetilasas (Boyes y
Bird, 1992; Hsieh, 1994; Singal y col., 1997; Jones y col., 1998;
Nan y col., 1998). La MBD1, otra proteína MBD, se incluye también
en un complejo grande de 800 kD (MeCPI) (Boyes y Bird, 1992), cuyos
componentes no están determinados todavía. Todos estos rasgos
sugieren que los mCpG y las proteínas MBD asociadas constituyen un
sistema represivo no específico general de la transcripción génica
en células diferenciadas.
El patrón de metilación del genoma y de los
genes se mantiene en células somáticas en división, como se
ejemplifica mejor por los casos de ADN hipometilado o hipermetilado
introducido en células (Hsieh, 1994; Howell y col., 1998; Kudo,
1998). En contraposición, este patrón es dinámico durante el
desarrollo y la gametogénesis (Monk y col., 1987; Sanford y col.,
1987; Trasler y col., 1990; Ariel y col., 1991; Kafri y col., 1992;
Ghazi y col., 1992; Warnecke y Clark, 1999; Martin y col., 1999).
La metilación global del genoma es máxima en el embrión en la
gastrulación y mínima en células de blastocito. El esperma y
ovocitos presentan un nivel intermedio de metilación y se observa
desmetilación durante las primeras escisiones del embrión (Monk y
col., 1987; Sanford y col., 1987; Rougier y col., 1998). El ADN de
células germinales masculinas y femeninas a
12,5-14,5 dpc está hipometilado (Monk y col.,
1987).
El patrón de metilación de algunos genes
endógenos sigue también este esquema general. En particular, casi
sistemáticamente se observa una hipometilación en la etapa de
blastocito, se observa una metilación más fuerte en las siguientes
etapas y en tejidos somáticos y una hipometilación al inicio de la
gametogénesis masculina y femenina (Kafri y col., 1992; Warnecke y
Clark, 1999, Martin y col., 1999). Sin embargo, además de este
patrón general, se han observado numerosas variaciones en genes
específicos que ilustran la existencia de procesos complejos de
metilación y desmetilación, particularmente durante la
gametogénesis masculina y en tejidos somáticos (Trasler y col.,
1990, Kafri y col., 1992; Groudine y Conkin, 1985; Warnecke y
Clark, 1999). En algunos casos, el nivel de metilación parece estar
correlacionado con la expresión (Trasler y col., 1990; Zhang y col.,
1998; Goto y col., 1998; Salvatore y col., 1998; Cameron y col.,
1999), pero en otros no se encuentra dicha correlación (Weng y col.,
1995; Zhang y col., 1998; Warnecke y Clark, 1999). En al menos un
caso, la metilación del promotor parece no cambiar tanto si se
expresa el gen o si no (Warnecke y Clark, 1999). En otro caso la
densidad global en lugar de sitios específicos distingue los alelos
expresados de los no expresados, lo que sugiere que el
funcionamiento de un gen no requiere necesariamente desmetilación en
sitios particulares (Salvatore y col., 1998). Por tanto, el
concepto de expresión génica específica de tejido que está
controlada por una desmetilación selectiva no está completamente
verificado (Trasler y col., 1990; Walsh y Bestor, 1999). Estudios
recientes, aún incompletos, de la metilación del ADN de genes
endógenos mediante secuenciación con bisulfito que permite la
detección del estado de metilación de todos los CpG de un gen de
una sola célula confirman estos datos y revelan una asombrosa
heterogeneidad del patrón de metilación de genes en diferentes
células para cualquier etapa analizada (Salvatore y col., 1998;
Warnecke y Clark, 1999; Cameron y col., 1999).
El efecto represivo indirecto de la metilación y
el patrón dinámico de metilación durante el desarrollo plantean una
paradoja potencial que, si se resuelve, tendría consecuencias
importantes para nuestra comprensión de la evolución de la
secuencia de genes ubicuos y específicos de tejido en vertebrados.
Es más, si a una cierta densidad de CpG metilado, las proteínas MBD
actúan como un sistema represor indirecto general sobre la expresión
génica y si la densidad de CpG metilado de genes varía en gran
medida en algunas etapas, entonces la expresión génica debería ser
sensible a estas variaciones. De otro modo, para conservar su
expresión espaciotemporal específica de tejido o ubicua, la
secuencia de genes tendría que adaptarse diferencialmente a estas
condiciones.
Resulta crucial ensayar in vivo si la
expresión génica es de hecho sensible a las fluctuaciones de la
metilación durante el desarrollo, pero hasta el momento, ningún
sistema ha permitido ensayar esta hipótesis.
Se describe aquí dicho sistema y los primeros
resultados del ensayo de esta hipótesis. El sistema experimental
usado compara en ratones transgénicos la expresión de un gen
indicador LacZ para el que la densidad de secuencia CpG es mayor
(8,6%, 302 sitios para 3,5 kb) que la de genes endógenos y el mismo
gen indicador cuyo nivel de CpG se ha reducido mediante mutagénesis
dirigida a un porcentaje cercano al de genes endógenos (2,2%, 78
sitios para 3,5 kb). Para poder explorar diferentes etapas durante
el desarrollo y la gametogénesis, estos dos genes se han combinado
con un promotor fuerte de un gen ubicuo, codificando el gen el
factor de elongación de la traducción humana EF1 (Uetsuki y col.,
1989). Se ha estudiado también la expresión de gen indicador rico
en CpG controlado por un promotor ubicuo débil, el promotor del gen
de hipoxantina fosforribosiltransferasa humana, asociado o no a la
región de control de minilocus de \beta-globina
(Talbot y col. 1989). Los resultados muestran que, en periodos de
hipometilación genómica, se expresan tanto genes indicadores pobres
en CpG como ricos en CpG asociados a promotores ubicuos, mientras
que se expresa sólo el indicador pobre en CpG en periodos de
hipermetilación genómica en células embrionarias y somáticas
después de la implantación. Además, se muestra que los transgenes
ricos en CpG se reprimen en varias etapas durante la gametogénesis
masculina y femenina y, dependiendo del origen parental, en el
embrión temprano, en el que se observa una expresión fuerte sólo
para transgenes pobres en CpG. Esta es la primera prueba de que la
expresión génica in vivo está regulada por las fluctuaciones
de un sistema de control negativo dependiente de CpG. Finalmente,
esta represión de transgenes ricos en CpG puede invertirse
completamente por factores activadores en trans específicos de
tejido en células especializadas y anularse mediante tratamiento
con inhibidores de histona desacetilasas en embriones
preimplantación. Esto sugiere que varios de los efectos represores
dependientes de CpG observados durante el desarrollo y la
gametogénesis están mediados por la desacetilación de histona de
cromatina.
Se han descrito anteriormente constructos de
HPRTnisLacZ y HPRTnIsLacZDCR en (Bonnerot y col., 1990) y (Bonnerot
y Nicolas, 1993a). Contienen el promotor del gen de hipoxantina
fosforribosiltransferasa humana (HPRT) que impulsa la expresión de
una \beta-galactosidasa orientada al núcleo
(nisLacZ). La HPRTnIsLacZDCR contiene los cuatro sitios
hipersensibles a ADNasa I de LCR del gen de
\beta-globina humana (Talbot y col., 1989). Se
aisló el inserto EFnisLacZ de 7,9 kb del plásmido pBSEFntsLacZdenh
en forma de un fragmento
XhoI-NotI-NotI (digestión parcial
con XhoI). El pBSEFntsLacZdenh derivaba de
pEF321-CAT, amablemente proporcionado por Kim D.W.
(Kim y col., 1990). Se ligó el fragmento
HindIII-ScaI de 2,3 kb de
pEF321-CAT que contenía la porción (+1) a (+1561)
del gen EF1\alpha. humano (promotor, exón 1 e intrón 1), más 730
pb de la secuencia no traducida 5' (Uetsuki y col., 1989) (después
de relleno con Klenow) con un fragmento SalI de 9,5 kb de
pBSGAdLTRnIsLacZ (Bonnerot y col., no publicado) que contenía el
gen indicador nisLacZ y la señal de poliadenilación del virus de
leucemia murina de Moloney en un esqueleto plasmídico
pBluescript.
Se redujo el contenido de LacZ de 9,2% a 2,2%,
un porcentaje cercano al del genoma de mamífero, mediante
mutagénesis. Se usó una técnica de reacción en cadena de polimerasa
(PCR) en la que los cebadores oligonucleotídicos mutagénicos se
diseñaron para conservar la integridad de la secuencia aminoacídica
de la proteína indicadora de \alpha-galactosidasa.
Se verificó la secuencia de ADN del LacZ mutado mediante
secuenciación.
Para la construcción de pBEFnlsLacZdenh, se
reemplazó nisLacZ por nlsLagZ después de ligamiento del fragmento
LagZ Avril-BamHI de 3,5 kb de pPytknlsLagZ con el
fragmento Avril-BamHI de 3,5 kb de
pBEFnlsLacZ\deltaenh, que carece de nIsLacZ. Se digirió el
plásmido resultante pBEFnlsLagZ\deltaenh con
XhoI-NotI (XhoI parcial), obteniéndose el inserto
EFnIsLagZ de 7,90 kb.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirieron los plásmidos para retirar las
secuencias de ADN vectorial y se purificaron los insertos en perlas
de vidrio. Se generaron ratones transgénicos como se describe en
Forlani y col. (Forlani y col., 1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Se recuperaron embriones preimplantación de
cruces entre hembras o machos (B6D2) F1 y machos o hembras
transgénicos, respectivamente, como se describe en (Forlani y col.,
1998; Vemet y col., 1993). Se extrajeron ovarios y testículos de
los embriones a diferentes edades según los protocolos descritos en
(Hogan y col., 1986). Se identificaron los testículos embrionarios
por la presencia de cordones seminales. Después de la extracción, se
realizaron tinción con X-Gal y crioseccionamiento
como se describe en (Bonnerot y Nicolas, 1993).
\vskip1.000000\baselineskip
Se recuperaron embriones recién recogidos o
cultivados para el análisis de la expresión transgénica en embriones
preimplantación en los momentos apropiados, y se analizaron
inmediatamente por tinción con X-Gal durante una
noche a 300ºC (Vemet y col., 1993). Se tiñeron los órganos
embrionarios y adultos durante dos días a 300ºC y las criosecciones
durante una noche a 300ºC (Bonnerot y col., 1990). En algunos
experimentos, se usó la cuantificación de la actividad
\beta-galactosidasa para seleccionar machos
adultos según su expresión transgénica en testículos. Se extrajo
quirúrgicamente un solo testículo de tal modo que los machos
transgénicos pudieran aparearse posteriormente con hembras (B6D2)
F1 para generar embriones preimplantación.
Se cortó en dos partes el testículo extraído. Se
fijó la primera parte en PFA al 4% y se tiñó con
X-Gal. Se usó la segunda mitad para recuperar
proteínas y para medir la actividad \beta-gal
usando un ensayo que mide la escisión del sustrato fluorogénico
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactósido
(Forlani y Nicolas 1996).
\vskip1.000000\baselineskip
Para este estudio, se ha usado el gen indicador
bacteriano LacZ porque es una región rica en CpG según los
criterios definidos por (Larsen y col., 1992), con un contenido de
G+C superior al 50% (%(G+C) 54,4%) y una relación observada de CpG
observado frente a esperado (O/E) superior a 0,6 (O/E=1,17), que es
una diana potencial para proteínas de unión a CpG metilado y sus
parejas asociadas (Hendrich y Bird, 1998) (Jones y col., 1998).
Para comparación, se ha construido un gen LacZ pobre en CpG
modificado, del que se reemplazaron 224 sitios de CpG mediante
mutagénesis dirigida para conseguir la característica de secuencia
no rica en CpG con un %(G+C) de 48,9% y una O/E de 0,37. Este nuevo
indicador se ha denominado LagZ y, como con LacZ, se usó como
indicador en asociación con una señal de localización nuclear para
identificar fácilmente la expresión en todos los tejidos y en todas
las etapas durante la embriogénesis (Bonnerot y col., 1987). Estas
dos secuencias se han fusionado con un promotor muy fuerte que
codifica el factor de elongación de la traducción humana
EF1\alpha, cuya expresión es ubicua en el ratón (Fig. 2) (Hanaoka
y col., 1991). Para examinar un transgén con una relación diferente
entre elementos activadores en cis y represores en cis, se fusionó
nls LacZ con un promotor más débil, aunque ubicuo, del gen
hipoxantina fosforribosoltransferasa humana (HPRT) (Fig. 2)
(Bonnerot y col., 1990). Finalmente, se combinó el transgén
HPRTLacZ con la región de control de minilocus del gen de
6-globina para determinar el efecto de este elemento
activador fuerte sobre una estructura potencialmente reprimida en
un linaje somático específico (Bonnerot y Nicolas, 1992).
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar si el contenido de CpG u otras
diferencias de secuencia entre los genes LacZ y LagZ influían en su
expresión en ausencia de metilación, se microinyectaron los
constructos de ADN EFLacZ y EFLagZ (desprovistos de secuencias
plasmídicas) en forma de insertos en pronúcleos masculinos de óvulos
fertilizados a las 20-22 hphCG. Se analizó después
la expresión mediante tinción con X-Gal, una vez se
han escindido los óvulos (46-48 hphCG). Ambos
insertos se expresaron en aproximadamente la mitad de los óvulos
inyectados (se microinyectaron once óvulos para cada inserto) y su
nivel de expresión era comparable (datos no mostrados). Por lo
tanto, el promotor del gen EF1\alpha es capaz de impulsar la
expresión de ambos genes indicadores en el embrión escindido, y
todos los elementos en trans necesarios para expresión están
presentes en esta etapa. Las diferencias de secuencias, incluyendo
su contenido de CpG, no cambian el nivel de expresión.
Sin embargo, un análisis de la expresión
transitoria de los insertos no 5 revela cómo evoluciona la expresión
durante el desarrollo, ni la influencia del pase transgénico a
través de la gametogénesis. Para estudiar estas cuestiones, se
generaron ratones transgénicos que contenían EFLagZ (EFLagZ1 a 3) y
EFLacZ (EFLacZ1 a 4) como transgenes estables. En todas las siete
líneas, se integró el transgén en un autosoma.
\vskip1.000000\baselineskip
La metilación global del genoma es mínima en
blastocitos y máxima en células de embriones implantados (Monk y
col., 1987) (Kafri y col., 1992) (Sandford y col., 1987). Para
comprobar si LagZ y LacZ son sensibles a estos cambios globales, se
analizó primero el patrón de expresión de las líneas transgénicas
en estas dos etapas.
En la etapa de blastocito, las tres líneas
EFLagZ y las cuatro EFLacZ expresaron el transgén, demostrando que,
cualquiera que sea el contenido de CpG, el gen indicador está en un
estado permisivo para expresión (datos no mostrados). Además, el
origen parental del transgén no afectó a la expresión excepto para
la línea EFLacZ1 en la que no se expresó el transgén heredado por
vía materna.
Después de la implantación, el patrón de
expresión de las líneas EFLagZ era claramente diferente del de las
líneas EFLacZ. A los 13,5 dpc, ninguna de las líneas EFLacZ
expresaba el transgén, ni en tejidos extraembrionarios tales como
el saco vitelino y en embriones (datos no mostrados). Sin embargo,
en ambos casos, la expresión era variada, con sólo una fracción de
las células expresando LagZ. Por ejemplo, en el saco vitelino, el
marcaje se distribuyó en agrupaciones de células que sugieren en
gran medida una transmisión clonal del estado de expresión
permisivo, puesto que se sabe que el crecimiento es coherente
(Gardner y Lawrence, 1985). Además, se seguía detectando expresión
transgénica en adultos EFLagZ en una variedad de tejidos (datos no
mostrados). En contraposición, en ratones EFLacZ no se observó nunca
expresión en tejidos adultos. Por lo tanto, aparece una expresión
diferencial correspondiente al contenido de CpG del transgén
después de la implantación y se mantiene posteriormente a lo largo
del desarrollo y en la madurez. A partir de estos resultados, se
concluye que, incluso en combinación con un promotor activo ubicuo
fuerte, un alto contenido en CpG conduce a una inactividad génica
completa, mientras que un bajo contenido en CpG conduce a actividad
génica en al menos una fracción de las células. Debido a que la
comparación entre la expresión de estos dos transgenes dio una
información valiosa sobre la implicación de la densidad de CpG en la
inactividad génica, se analizó a continuación la expresión de
EFLacZ y EFLagZ durante la gametogénesis y el desarrollo temprano,
puesto que la información referente al estado de metilación de
estas etapas de desarrollo no está tan clara como en blastocitos y
células somáticas.
\vskip1.000000\baselineskip
La metilación genómica global fluctúa durante la
ovogénesis. El genoma materno está desmetilado en células
germinales primordiales, después se desmetila adicionalmente
durante
preleptoteno-leptoteno-cigoteno
(P-L-Z) y finalmente se metila en
una etapa desconocida, de tal modo que se alcanza un nivel de
metilación moderado en las etapas terminales de la ovogénesis (Monk
y col., 1987). En contraposición, el análisis del estado de
metilación de los transgenes individuales durante la ovogénesis ha
mostrado que, en general, los transgenes maternos permanecen
hipermetilados (Chaillet, 1994).
Se examinó la expresión transgénica en las
líneas transgénicas EFLagZ y EFLacZ durante la ovogénesis en
gónadas femeninas de embriones E12.5, en las que los ovocitos
estaban en las etapas P-L-Z de la
profase I y también en el adulto en que los ovocitos estaban
bloqueados en la metafase II (Fig. 3A). Se analizaron también
ovocitos ovulados y estos se corresponden a los gametos
transcripcionalmente inactivos (Schultz, 1986).
En las líneas EFLagZ, se expresa el transgén
virtualmente en todas las células germinales femeninas, tan
temprano como en la etapa de preleptoteno de la profase I (13,5
dpc). Se detectó también una actividad \beta-gal
continua en todas las etapas posteriores: en la etapa de paquiteno
(15,5-16,5 dpc y nacimiento), durante la fase de
crecimiento en diploteno (empezando a 8 dpp) y en la metafase II en
la gónada adulta (datos no mostrados).
Como se esperaba, no se detectó actividad
\beta-gal en los ovocitos ovulados
transcripcionalmente silenciosos (Fig. 3B). La expresión idéntica y
continua del transgén EFLagZ observada para diferentes líneas
durante la ovogénesis confirma que el patrón de expresión es
independiente del sitio de integración (dependiente de transgén) y
demuestra que los activadores en trans para el promotor del gen EF1
son constitutivamente activos en ovocitos hasta la detención
transcripcional que caracteriza la etapa terminal de la ovogénesis.
La línea EFLagZ3 expresaba también el transgén durante la
ovogénesis, pero sólo transitoriamente a los 16,5 dpc (Fig. 3B);
este efecto es probablemente debido a un efecto de posición del
transgén (véase a continuación).
En contraposición, ninguna de las líneas EFLacZ
ricas en CpG expresaba el transgén durante la ovogénesis (no
mostrado). En la línea ELFacZ4, no se expresó nunca el transgén y
en EFLacZ1, EFLacZ2 y EFLacZ3, se expresó sólo transitoriamente el
transgén en la etapa de paquiteno de la profase I (16,5 dpc para
las líneas EFLacZ1 y 2) y el nacimiento (EFLacZ3) (Fig. 3B). En el
ovario adulto, sólo la línea EFLacZ2 expresó el transgén y sólo en
unos pocos gametos al inicio de la fase de crecimiento (no
mostrado). Esta ausencia de expresión en preleptoteno, leptoteno,
cigoteno y después de la etapa de diploteno es, por lo tanto,
dependiente de transgén. La expresión del transgén EFLagZ en las
correspondientes etapas indica que la ausencia de expresión no es
debida a una falta de activadores en trans para el promotor del gen
EF1\alpha
Tomados en conjunto, estos resultados revelan
que la etapa de paquiteno de la ovogénesis es particular, porque se
expresan ambos transgenes EFLagZ y EFLacZ. Este periodo de
expresión en paquiteno está flanqueado por dos periodos de
represión que son dependientes de CpG; señaladamente los transgenes
EFLacZ se silencian al inicio de la etapa de diploteno en ovocitos
en crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios de metilación global durante la
espermatogénesis indican que el genoma paterno está desmetilado en
células germinales primordiales y se encuentra después metilado en
esperma a un nivel intermedio (Monk y col., 1987). No se conoce
casi nada respecto a la evolución de la metilación global entre
estas dos etapas de gametogénesis masculina. El análisis de la
metilación de varios genes que contienen CpG en posiciones
específicas ha mostrado que pueden ocurrir eventos tanto de
desmetilación como de metilación en células meióticas (Trasler y
col., 1990; Ariel y col. 1991; Kafri y col., 1992).
En el embrión masculino, los gonocitos se
dividen de 12,5 a 16,5 dpc, después se detienen en GI (Vergouwen y
col., 1991). En el nacimiento, la primera ola espermatogénica
empieza con la aparición de espermatogonios de tipo A. A los 8 dpp
aparecen espermatogonios de tipo B y, dos días después,
espermatocitos primarios (las etapas de preleptoteno, leptoteno y
cigoteno) que surgen de la división de espermatogonios de tipo B
(Kluin y de Rooij, 1981). Finalmente, aparecen espermatocitos
primarios en la etapa de paquiteno, junto con espermátidas redondas
post-meióticas a los 14 y 20 dpp, respectivamente.
Las etapas de diferenciación terminal, que implican la generación
de espermátidas alargadas y espermatozoides ocurren durante los
siguientes 15 días (Fig. 3A).
El análisis de la primera ola de
espermatogénesis en las líneas ELFagZ indica que su transgén se
expresa continuamente en células germinales masculinas. Se detectó
actividad \beta-gal muy tempranamente en
gonocitos (12,5-13,5 dpc), así como en
espermatogonios de tipo A en el nacimiento y espermatogonios de
tipo B a los 8 dpp. Se mantuvo este patrón en todas las etapas en
testículos adultos, para los que se examinaron todas las etapas de
espermatogénesis incluyendo espermátidas alargadas (datos no
mostrados).
De forma similar, todas las líneas ELFacZ
mostraron actividad \beta-gal en células
germinales masculinas (no mostrado); sin embargo, la actividad
\beta-gal se detectó por primera vez en el
nacimiento cuando aparecieron espermatogonios de tipo A, ya que no
había actividad detectable en gonocitos. Además, el número de
espermatogonios de tipo A \beta-gal+ en líneas
ELFacZ era menor que en líneas ELFagZ. Desde el nacimiento hasta el
8 dpp, aumentó el número de células germinales ELFagZ
3-gal+, que representan espermatogonios de tipo A y
B. En testículos adultos, se observó actividad
\beta-gal en espermatogonios de tipo A hasta la
etapa de espermátida redonda (no mostrado). La expresión idéntica y
continua del transgén ELFagZ observada para todas las líneas EFLagZ
durante la espermatogénesis (Fig. 3B) confirma que el patrón de
expresión es dependiente de transgén y demuestra que los activadores
en trans para el promotor del gen EF1\alpha están
constitutivamente activos en gametos masculinos durante toda la
espermatogénesis.
En resumen, antes de la espermatogénesis, la
expresión del gen EFLagZ empieza poco después del periodo de
transición entre células germinales primordiales en E13.5 y la
expresión de EFLacZ se retarda hasta la primera aparición de
espermatogonios de tipo A. Después de esta sucesión diferencial en
la activación, se detecta la expresión de ambos transgenes hasta la
detención transcripcional en la etapa de espermátida redonda. Estos
datos sugieren que existe un estado no permisivo para la expresión
en gonocitos masculinos en relación con el alto contenido de CpG y
que aparece después una condición favorable en células
espermatogónicas de tipo A, que anula este estado represivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Hay una expresión diferencial del transgén
EFLacZ en células germinales masculinas y femeninas, que persiste
hasta la detención transcripcional en ambos tipos de gametos
maduros. Durante la gametogénesis, la expresión del transgén EFLacZ
mediada por el sexo está mediada por la represión de la expresión
transgénica materna en la etapa de diploteno con respecto a su alto
contenido de CpG. Para determinar si esta expresión dependiente del
sexo del transgén EFLacZ se mantiene en el embrión después de la
fertilización, se analizó la expresión transgénica en ratones EFLagZ
y EFLacZ mediante la tinción con X-Gal de embriones
(datos no mostrados). Para estudiar la expresión de transgén de
origen paterno y materno, se obtuvieron embriones de la progenie
tanto de transgénicos masculinos como femeninos cruzados con
animales B6D2 F1.
En todas las líneas EFLagZ, se expresó el
transgén independientemente de su origen parental tan tempranamente
como en la etapa de 2 ó 4 células hasta la etapa de blastocito. En
líneas EFLacZ, se expresó el transgén desde la etapa de 4 células a
la etapa de blastocito, pero sólo cuando se transmitía por un
macho. En contraposición, cuando el transgén EFLacZ derivaba de una
hembra, su expresión se detectaba siempre después y no antes de la
etapa de mórula. Por lo tanto, una expresión dependiente del origen
parental, relacionada también con su contenido de CpG, caracteriza
el transgén EFLacZ durante las primeras escisiones embrionarias del
embrión. Esta expresión diferencial puede compararse con
observaciones previas realizadas durante la gametogénesis.
Sorprendentemente, para ambos transgenes la expresión en embriones
de etapa de escisión evoca la expresión observada en células
germinales: para los transgenes EFLagZ paterno y materno o EFLacZ
paterno, que se expresan durante la mayoría de la gametogénesis, se
detecta una expresión temprana durante las primeras escisiones
después de la fertilización (embriones de 2 y 4 células); y el
transgén EFLacZ materno, que no se expresa durante la mayoría de
las etapas ovocíticas, se encuentra expresado después de la
fertilización en etapas posteriores (concretamente,
mórula-blastocitos). Estos resultados sugieren en
gran medida que el estado transcripcional permisivo o no permisivo
de los transgenes en gametos en diferenciación se mantiene durante
las primeras escisiones del embrión.
Estos resultados sugieren que la regulación
ejercida sobre los transgenes EFLacZ y EFLagZ en el embrión
temprano está determinada anteriormente durante la gametogénesis.
Las siguientes observaciones argumentan esta continuidad
gameto-cigótica. En algunas líneas EFLacZ, en
particular EFLacZ1, se observó una expresión variada en las células
germinales contenidas en el tubo seminal adulto de un macho a otro
en la misma línea ((Fig. 3C), expresión cuantitativa adulta). Por
lo tanto, durante la gametogénesis, la transición entre gonocitos y
espermatogonios no es seguida por la anulación de un estado
transcripcional no permisivo en todas las células germinales. Si se
postula que existe de hecho una continuidad gameto- cigótica,
entonces debería observarse una correlación entre el nivel de
expresión transgénica en el testículo adulto de un macho y la
proporción de embriones preimplantación
\beta-gal+ que han heredado su transgén de este
mismo macho. Esta comparación se ha hecho usando dos machos EFLacZ1
seleccionados basándose en la actividad \beta-gal
medida en uno de los testículos extraídos quirúrgicamente. Se
cruzaron machos EFLacZ1 que expresan una alta o baja actividad
\beta-gal con hembras no transgénicas para generar
embriones de 4 células (datos no mostrados). El macho transgénico
con una actividad \beta-gal muy baja en células
germinales generó embriones f3-gal sólo, mientras
que aquel con actividad I3-gal alta en células
germinales generó embriones \beta-gal+. Estos
resultados establecen una correlación entre el estado 5
transcripcional del transgén EFLacZ en gametos masculinos y el de
embriones preimplantación, apoyando el concepto de una continuidad
gameto-cigótica de este estado transcripcional.
Ya se ha reseñado en la presente memoria
anteriormente que los transgenes EFLacZ se expresan en la etapa de
blastocito. Debido a que los transgenes transmitidos por vía
materna se reprimen durante las primeras escisiones, se ha
investigado con más detalle en cuál etapa se anula esta represión
dependiente del sexo. En la etapa de mórula, una cierta fracción de
los embriones que portan el transgén materno era ya
\beta-gal+ y esta fracción aumentó adicionalmente
en la etapa de blastocito. La anulación de la represión del
transgén materno empieza en la etapa de mórula y parece ser
progresiva (no mostrado).
Se ha observado también que varias líneas EFLacZ
y una línea EFLagZ (EFLagZ3) se caracterizaban por una expresión
variada de su transgén durante la espermatogénesis. Las células
germinales \beta-gal+ se disponían en agrupaciones
a lo largo del cordón seminal y la actividad
\beta-gal global (MUG) era baja (Fig. 3B). Por lo
tanto, sólo se anulaba el estado no permisivo para la expresión
transgénica en una fracción de gonocitos (EFLagZ3) y
espermatogonios de tipo A y B (líneas EFLacZ). Se observó el
ejemplo más obvio de esto para EFLacZ4. Sorprendentemente, en esta
línea el transgén transmitido por vía paterna era activo sólo en la
etapa de mórula (no mostrado). Puesto que la etapa de mórula es
también el periodo en que se anula la represión de los transgenes
maternos, la etapa de mórula-blastocito parece
corresponder a un periodo de desarrollo en que se anulan todas las
represiones gaméticas, aplicadas tanto a transgenes EFLacZ
masculinos como femeninos.
Para ensayar si los mecanismos reguladores
descritos para EFLacZ eran específicos de este promotor, se
fusionaron otros promotores con el gen LacZ y se usaron para generar
ratones transgénicos (Fig. 2). Se usó el promotor débil del gen
hipoxantina fosforribosiltransferasa humana (HPRT) expresado
ubicuamente para estos estudios y se analizó también un constructo
que combina el promotor HPRT con potenciadores específicos
hematopoyéticos derivados de la región de control del locus de
\beta-globina (HPRT-DCR). Se
analizaron dos líneas transgénicas que contenían el inserto HPRT
(líneas HPRTLacZ1 y HPRTLacZ3), junto con siete líneas que contenían
el inserto HPRT-DCR (líneas DCR1 a 7). Se examinaron
los patrones de expresión transgénica durante la gametogénesis y las
primeras escisiones del embrión del mismo modo que para las líneas
EFLagZ y EFLacZ descritas anteriormente. En primer lugar, como se
reseña anteriormente, ninguna de las líneas HPRTLacZ ni HPRTLacZDCR
expresó ubicuamente el transgén en embrión postimplantación, lo que
confirma una represión general del transgén en células somáticas
(datos no mostrados) (Bonnerot y col., 1990; Bonnerot y Nicolas,
1993a).
\newpage
En segundo lugar, las células germinales
masculinas en todas las líneas HPRTLacZ y seis de las siete líneas
DCR expresaron el transgén, al menos en espermatocitos de paquiteno
(Tabla 2A). Ninguna de las líneas DCR expresó su transgén en
gonocitos. En lugar de ello, la expresión empezó en diferentes
momentos según la línea: el nacimiento para DCR1 y DCR6, a los 8 dpp
para DCR4 y 7 y a los 10 dpp para DCR2 y DCR3. En testículos
adultos, se detectó también fácilmente la expresión en la etapa de
paquiteno y en todas las etapas hasta el desarrollo de espermátidas
redondas. Sin embargo, se observaron variaciones en la intensidad
de tinción de línea a línea. En particular, la tinción en ratones
HPRTLacZ era menor que en ratones DCR (datos no mostrados). El
análisis cuantitativo de la actividad
\beta-galactosidasa en testículos adultos
confirmó este resultado (Tabla 1 A).
En tercer lugar, en células germinales
femeninas, se detectó una expresión transgénica transitoria entre
los 12,5 dpc y los 2,5 dpp durante la etapa de paquiteno en cinco
líneas DCR (Tabla 2B). Para todas las líneas DCR, este periodo de
expresión era seguido por un periodo de represión partiendo de la
etapa de diploteno y siguiendo hasta la etapa de crecimiento
completo del ovocito en ovarios adultos. Por lo tanto, junto con las
observaciones realizadas durante la espermatogénesis, estos datos
indican que la expresión dependiente del sexo observada durante la
gametogénesis para el transgén EFLacZ ocurre también cuando el gen
LacZ rico en CpG está controlado por el promotor HPRT.
Para determinar si la expresión gamética
dependiente del sexo de los transgenes HPRTLacZ y DCR está
correlacionada con el efecto parental en la etapa de escisión de
embrión (como para líneas EFLacZ), se ensayo la expresión de
transgenes paternos y maternos. Probablemente debido a la debilidad
del promotor HPRT, se detectó la expresión de LacZ sólo mediante
tinción con X-gal en cigotos detenidos con
afidicolina para los que se amplifica la señal (véase Material y
Procedimientos para una descripción más detallada de esta
técnica).
Se tiñeron 24 horas después óvulos fertilizados
recuperados a las 24 hphCG, en el momento en que los embriones de
control alcanzaron la etapa de 2 células (Tabla 2). Todas las
líneas que expresaron el transgén durante la espermatogénesis
expresaron también el transgén en embriones detenidos en 1 célula.
Sorprendentemente, ninguna de estas líneas expresó el gen
transmitido por vía materna y este efecto parental se siguió
observando cuando los embriones se cultivaron en la etapa de 2 y 4
células de líneas DCR6 y DCR7. Por lo tanto, la expresión
transgénica dependiente del sexo persiste a lo largo de varias
escisiones después de la fertilización.
Se ensayó la idea de una continuidad
gameto-cigótica para el estado transcripcional en
líneas HPRTLacZ y DCR comparando la expresión en embriones
preimplantación de transgenes heredados de dos machos de la misma
línea (DCR4, DCR7 y HPRTLacZ1), seleccionados por diferencias en su
actividad \beta-gal en células germinales adultas.
En todos los casos, el transgén transmitido por machos con una alta
actividad \beta-gal en testículos se expresó
también en embriones de etapa de escisión; mientras que los
embriones derivados de machos que muestran una baja actividad
\beta-gal en testículos no expresaron el transgén
(datos no mostrados).
Finalmente, se estudió la expresión de
transgenes LacZ que contenían los promotores específicos de tejido
Hoxb-7 (Kress y col., 1990) o
AchR\alpha(Klarsfeld y col., 1991). Sin embargo, la
expresión del transgén paterno no se detectó en células germinales
de testículo adulto ni en embrión de 2 células bloqueado con
afidicolina (datos no mostrados). En contraposición, se observó la
expresión específica de tejido de estos dos promotores, como se
esperaba, en embriones postimplantación (Kress y col., 1990;
Klarsfeld y col., 1991).
Tomados conjuntamente, estos resultados
demuestran que la regulación descrita para el transgén EFLacZ en
células somáticas durante la gametogénesis y en las primeras
escisiones después de la fertilización (expresión diferencial
parenteral, continuidad gameto-cigótica) no es
específica del promotor EF1\alpha, si no que se aplica a la
asociación de un LacZ rico en CpG con el promotor más débil HPRT.
Sin embargo, el gen LacZ tiene que combinarse con secuencias
promotoras de un gen ubicuo para expresarse en células germinales y
el embrión. Las secuencias promotoras mínimas (secuencias TATA y
GAAT) contenidas en los promotores específicos de tejido
Hoxb-7 y AchRa. parecen incapaces de impulsar un
nivel detectable de expresión en estas células.
Se está haciendo cada vez más evidente que al
menos parte de la represión transcripcional dependiente de las
islas de CpG metilado está mediada por la desacetilación de histona.
Es más, se ha mostrado que el complejo McCP2/Sin3A/histona
desacetilasa se une a CpG metilado (Nan y col., 1998) (Jones y col.,
1998) y una gran fracción de las desacetilasas de las células están
complejadas con MeCP2 (Bestor, 1998). Para ensayar si este mecanismo
podría ser responsable del estado transcripcional no permisivo
establecido durante la gametogénesis y heredado por el embrión, se
trataron embriones de etapa de escisión con los inhibidores de
desacetilasa butirato de sodio (NaB) y tricostatina A (TSA), dos
inhibidores de histona desacetilasas (Yoshida y col., 1995).
Se estudiaron los transgenes LacZ de DCR6 y DCR7
puesto que el transgén de ambos orígenes parentales se expresa en
un pequeño número de embriones de 2 células o ninguna. En ambos
casos, se obtuvo una anulación de la represión en embriones
tratados con NaB o TSA (Fig. 4A). Esto sugiere en gran medida que
el mecanismo de represión del transgén LacZ materno está mediado por
histona desacetilasas al nivel de cromatina. Puesto que se ha
mostrado que esta represión está también relacionada con el alto
contenido en CpG de LacZ, puede implicar que las histona
desacetilasas actúan sobre el ADN metilado.
Se ensayó también el efecto de NaB sobre los
transgenes paternos reprimidos que caracterizan ciertas líneas
transgénicas. Por ejemplo, en las líneas DCR3, DCR1 y DCR5, se
reprimió la expresión del transgén en un 82, 97 y 100% de los
embriones detenidos en 1 célula, respectivamente (Tabla 2). En las
tres líneas, se observó la anulación de la represión en una fracción
de los embriones tratados con NaB (Fig. 4B) y pareció estar
relacionada con el porcentaje de embriones no tratados
\beta-gal+: cuando mayor es el porcentaje de
\beta-gal+ (18%, 3% y 0% para DCR3, DCR1 y DCR5,
respectivamente) en embriones no tratados, mayor es la proporción
de embriones \beta-gal+ después de tratamiento
con NaB (100%, 70% y 10% respectivamente). Por lo tanto, como los
transgenes maternos, estos datos sugieren que los transgenes
paternos pueden estar localmente reprimidos al nivel de cromatina
por histona desacetilasas en algunos embriones. Además, la
correlación entre el porcentaje de embriones
\beta-gal+ antes y después del tratamiento con NaB
sugiere que diferencias cuantitativas y no cualitativas en el nivel
de inhibición dan cuenta de las diferencias observadas entre líneas
transgénicas y entre transgenes en la misma línea. Estas
diferencias cuantitativas pueden ser el resultado del grado
relativo de metilación de CpG y pueden determinar la dependencia
relativa de la actividad histona desacetilasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si el estado represivo de
HPRTLacZ en células embrionarias puede invertirse cuando se activa
el desarrollo de un activador específico de linaje, LCR, se
expandió una observación anterior (Bonnerot y Nicolas, 1993a)
examinando en eritrocitos nucleados la presencia de actividad
\beta-gal en saco vitelino a los 8,5 y 10,5 dpc y
en el hígado fetal a los 15,5 dpc. Todas las líneas DCR expresaron
el transgén en eritrocitos, incluyendo aquellas que exhibían una
anulación incompleta del estado represivo gamético durante el
desarrollo temprano (DCR1, DCR3, DCR4 y DCR5, datos no mostrados).
Además, se ha mostrado ya que ambos transgenes HPRTLacZ y DCR están
activados por elementos dependientes de sitio de integración, y
estos elementos funcionan probablemente de manera análoga a LCR.
Debido a que la expresión dependiente de sitio implica muchos tipos
celulares, el estado represivo puede anularse completamente por
activadores en muchos tejidos somáticos, si no todos.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta comparación entre la expresión de los
transgenes LagZ y LacZ es el primer trabajo que demuestra in
vivo la influencia de la densidad de CpG de la región
transcrita de un gen sobre su expresión, que muestra que las
variaciones de la metilación global durante el desarrollo y la
gametogénesis influyen en la expresión génica y que describe las
variaciones de represión en etapas específicas de desarrollo.
Ofrece un nuevo conocimiento sobre: (1) la capacidad de los
sistemas reguladores dependientes de CpG de inducir un estado
transcripcional no permisivo para genes in vivo, (2) la
anulación de este estado en gametos y células embrionarias, (3) la
aparición de desmetilación cíclica al nivel de genes
individuales.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a que la actividad de los promotores
usados en este estudio depende de factores de transcripción
ubicuos, que permanecen relativamente constantes en la célula en
todas las etapas de desarrollo (Kim y col., 1990; Hanaoka y col.,
1991), las fluctuaciones de la expresión transgénica deben ser
resultado principalmente de modificaciones de elementos responsables
del control negativo, tales como los complejos represores
dependientes de mCpG que modifican la estructura de cromatina
(Boyes y Bird, 1991; Boyes y Bird, 1992; Nan y col., 1998; Hendrich
y Bird, 1998; Jones y col., 1998). Varios argumentos implican a
sistemas negativos dependientes de CpG, y en particular a la
metilación de CpG, en la regulación de la mayoría de las
variaciones en la expresión transgénica (resumida en la Figura 5) en
lugar de otras variaciones pasando por estos sistemas. En primer
lugar, las transiciones entre periodos de inactividad y expresión
génica para los transgenes LagZ y LacZ no se definían nunca
abruptamente sino que en lugar de ello se extienden a lo largo de
varias etapas gaméticas o embrionarias que implican un mecanismo
progresivo en lugar de un fenómeno cualitativo rápido. En segundo
lugar, se observa un fenómeno notable entre el patrón de expresión
del indicador LacZ rico en CpG y los cambios en la metilación
genómica durante la gametogénesis y desarrollo temprano, los dos
periodos de máxima hipometilación correspondientes a las etapas de
blastocito y paquiteno de la ovogénesis (Monk y col., 1987; Kafri y
col., 1992; Rougier y col., 1998; Warnecke y Clark, 1999). En estas
dos etapas, se expresaron los transgenes EFLacZ, EFLagZ y
HPRTLacZDCR en la mayoría de las líneas. De forma similar, justo
después de la implantación del embrión, un periodo de metilación
máxima, se observó la expresión de sólo el transgén pobre en CpG
(EFLagZ). En tercer lugar, durante la etapa de escisión de embrión,
un periodo de transición crucial entre un estado no permisivo y un
estado permisivo para transgenes LacZ, los inhibidores de histona
desacetilasa anulan casi completamente la represión de transgenes
maternos, y la de transgenes paternos sigue reprimida. Demuestra
que ambos ejemplos de represión son resultado de la desacetilación
de cromatina. Tomados conjuntamente con la expresión diferencial de
los transgenes LagZ y LacZ en estas etapas, estos descubrimientos
sugieren en gran medida que esta desacetilación es dependiente de
CpG. Por lo tanto, puede implicar los complejos McCP2/Sin3A/HDAC.
Otra indicación de que un sistema mCpG represor está activo en
embrión temprano proviene de la observación de que los genes
metilados se reprimen en estas etapas tempranas de desarrollo en
ratones (Goto y col., 1998) y en Xenopus Laevis (Jones y
col., 1998).
Se ha mostrado en sistemas in vitro y en
células diferenciadas, respectivamente, que el ADN metilado
artificialmente está indirectamente reprimido por proteínas MBD
(Nan y col., 1998; Jones y col., 1998) y que esta represión es sólo
eficaz cuando se alcanza un cierto nivel de metilación (Hsieh,
1994; Komura y col., 1995; Kass y col., 1997; Nan y col., 1997; Goto
y col., 1998). Estos resultados demuestran que la presencia en las
regiones transcritas de una secuencia que contiene una alta densidad
de CpG puede crear un estado transcripcional no permisivo. En
células de embrión aproximadamente a 7,5 dpc y en células
somáticas, casi todos los CpG, excepto aquellos en islas de CpG de
promotores, están metilados (Monk y col., 1987; Bird, 1992; Kafri y
col., 1992). Por lo tanto, el estado no permisivo de transgenes
LacZ en células embrionarias justo después de la implantación y
después en células somáticas puede ser atribuido a su iniciación de
un sistema represivo dependiente de CpG. Entre las cuatro
combinaciones de secuencias ensayadas, sólo la que contiene un
promotor fuerte (E1F\alpha) y baja densidad de CpG (LagZ) escapa,
aunque parcialmente, a esta represión. Por lo tanto, además de ser
un control que demuestra la implicación de los CpG en la regulación
de la expresión, muestra también que incluso una secuencia con una
baja densidad de CpG puede reprimir. Esto sugiere que el sistema
represivo in vivo está determinado por un umbral crítico de
mCpG.
Esto conduce a la sugerencia de que es el
equilibrio global entre activadores y esta represión dependiente de
CpG lo que controla la actividad de un gen. Para un gen que
contiene el promotor EF1\alpha,. el umbral para inactivación en
células somáticas parece estar cercano a un 2% de CpG en la región
de codificación, con un %(G+C) de un 48,9% y una O/E de 0,37. Esto
está apoyado por el hecho de que la región de codificación del gen
EF1\alpha humano ubicuo reemplazado por el gen indicador contiene
un 1,3% de CpG con un %(C+G) de 41% y una O/E de 0,29. El uso de un
gen indicador que carece de más CpG que LagZ y su asociación con
promotores de diferente fuerza debería permitir definir el umbral
al que la expresión de un gen se vuelve insensible a estos efectos
reguladores negativos.
Estas conclusiones conducen a sugerir la
siguiente hipótesis. Ya que el 82% de los genes con una expresión
amplia tienen una región transcrita pobre en CpG (Larsen y col.,
1992), se sospecha que sus promotores pueden tener una baja
tolerancia por el contenido de CpG y que la secuencia de genes
ubicuos puede haber evolucionado hacia una escasez de CpG para
contrarrestar el efecto inhibidor masivo e indiscriminado del
sistema represor dependiente de CpG.
\vskip1.000000\baselineskip
El transgén HPRTLacZDCR que combina un promotor
relativamente débil con una secuencia rica en CpG está en un estado
transcripcional no permisivo en células embrionarias después de
implantación. Sin embargo, sorprendentemente esta represión se
anula completamente por LCR en linajes embrionarios y
hematopoyéticos fetales, y también por elementos activadores en el
sitio de integración, que confieren a los transgenes el patrón de
expresión dependiente de la posición también observado en las
líneas HPRTLacZ (Bonnerot y col., 1990; Bonnerot y Nicolas, 1992).
Estos resultados indican que el estado represivo dependiente de CpG
no prevalece frente a la activación específica de tejido. De forma
similar, se ha mostrado que los potenciadores pueden anular la
inhibición de ADN metilado en un sistema in vitro y en
células diferenciadas (Boyes y Bird, 1991).
Si se sigue la idea de que la actividad génica
está controlada por el equilibrio global entre activadores y la
represión dependiente de CpG que actúa sobre la estructura de
cromatina, entonces la anulación de la represión por LCR y
activadores del estado no permisivo de LacZ se conseguiría mediante
elementos de orientación capaces de contrarrestar la acción de los
complejos de MBD. Desde este punto de vista, resulta notable
observar que varios de tos factores asociados a la ARN polimerasa II
y varios factores de transcripción son acetilasas (Brownell y
Allis, 1996; Struhl, 1998). Por lo tanto, estos elementos tienen el
potencial de contrarrestar la desacetilación de histonas por íos
complejos MBD-HDAC y cambiar así la estructura de
cromatina.
Entonces, la combinación artificial de un
promotor ubicuo, una región rica en CpG y un activador especifico
de linaje imita notablemente las propiedades fundamentales de un
gen especifico de tejido. Resulta notable que, como con los
transgenes LacZ, casi todos tos genes específicos de tejido
contienen también una secuencia rica en CpG en su región transcrita
(Larsen y col., 1992). Si estas islas de CpG trabajaran como
elementos inhibidores en tejidos somáticos usando el proceso
descrito aquí para el gen LacZ, entonces la función de tos
activadores transcripcionales seria anular una represión activa. Ya
que esto no necesita la desmetilación de CpG, si no en lugar de ello
la orientación de elementos capaces de contrarrestar la acción de
proteínas MBD (tales como acetilasas), se resolvería la paradoja
aparente de activación de un gen en ausencia de desmetilación.
\vskip1.000000\baselineskip
¿Hay un control del desarrollo para el
establecimiento del estado transcripcional no permisivo de
transgenes?. Estos resultados sugieren que, en las etapas de
mórula-blastocito, esta represión no se ha
establecido todavía (o no es eficaz todavía sobre la expresión
génica). Entonces, antes de la diferenciación celular, entre la
etapa de blastocito y tos 7,5-10,5 dpc, la
desaparición específica de expresión de LacZ indica que la represión
es eficaz. Esta inhibición se refiere tanto a tejidos embrionarios
como extraembrionarios. Es importante observar que, puesto que el
proceso es intrínseco a células, cada célula puede responder
individualmente. Esto puede explicar la heterogeneidad observada
entre células en embriones EFLagZ. De nuevo, estas observaciones
evocan el estado de metilación de genes y del genoma observado en
tejidos embrionarios y extraembrionarios (Monto y col., 1987) y la
heterogeneidad de la metilación de genes en diferentes células
observada usando secuenciación con bisulfito (Salvatore y col.,
1998; Warnecke y Clark, 1999; Cameron y col., 1999).
Tanto en células germinales masculinas
(gonocitos) como femeninas (etapas
PI-Lp-Zy), justo antes de la entrada
en gametogénesis, los transgenes ricos en CpG están en un estado no
permisivo mientras que los transgenes pobres en CpG están activos
(Fig. 5). Esta represión dependiente de CpG de los transgenes evoca
la establecida en la implantación del embrión, y sugiere un nivel
de metilación suficiente para la represión de transgenes LacZ. Sin
embargo, puesto que la expresión de transgenes LagZ es mayor en
células germinales que en células embrionarias y somáticas, el
equilibrio de activación/represión en células germinales puede
inclinarse hacia una actividad génica en lugar de hacia un estado
represivo.
En la espermatogénesis, aparecen espermatogonios
de tipo A LacZ \beta-gal+ y su número aumenta
entre 0 y 8 dpp. Un estudio más detallado indicará si la anulación
de la no permisividad es específica de espermatogonios de tipo A o
si se refiere también a etapas posteriores, especialmente etapas
post-meióticas. Pero, claramente, esta anulación no
ocurre en los espermatogonios A precedentes, y particularmente en
células madre (espermatogonios de tipo A). Es más, si fuera este el
caso, la heterogeneidad de expresión observada durante la
gametogénesis para ciertas líneas transgénicas desaparecería con el
envejecimiento de los machos. Esta heterogeneidad se mantiene
estrictamente durante largos periodos, como se muestra por el mismo
nivel de expresión en gametos del mismo macho después de un periodo
de seis meses.
¿Qué mecanismo anula el estado transcripcional
no permisivo en espermatogonios de tipo A?. Es un serio candidato la
metilación de ADN, porque se ha mostrado que los transgenes LacZ que
siguen reprimidos a la entrada de la gametogénesis masculina están
reprimidos en el embrión de 2 células y son activables mediante
inhibidores de histona desacetilasas. Sugiere que sus CpG están
metilados y que aquellos de los transgenes activos están no
metilados (si no, deberían estar reprimidos). Si es ese realmente el
caso, entonces ocurriría una primera desmetilación del gen LacZ a la
entrada de las células en la espermatogénesis y después en la etapa
de mórula-blastocito. Varios estudios indican que
el ADN de esperma está relativamente metilado (menos que en células
somáticas pero más que en células germinales tempranas) (Monk y
col., 1987; Warnecke y Clark, 1999) pero otros sugieren un bajo
nivel de CpG metilado (Trasler y col., 1990).
Durante la ovogénesis, en la etapa de paquiteno,
ambos transgenes LagZ y LacZ están activos, aunque la anulación de
su estado no permisivo empieza en diferentes momentos según las
líneas transgénicas. Puesto que el genoma en células germinales
femeninas está mínimamente metilado (Monk y col., 1987), es
tentador atribuir este estado de actividad a la desmetilación de
CpG. Más tarde, en la etapa de diploteno, todos los transgenes LacZ
están de nuevo en estado no permisivo que se anula sólo en la etapa
de mórula-blastocito. Durante las primeras
escisiones del embrión, se consigue la anulación del estado no
permisivo de los transgenes LacZ maternos mediante la inhibición de
histona desacetilasas, mientras que los transgenes LagZ maternos
están ya activos. Todas estas observaciones sugieren que el estado
no permisivo en ovocitos es debido a la metilación de CpG. Muchos
estudios indican que el ADN de ovocitos maduros está metilado (Monk
y col., 1987; Kafri y col., 1992). Este estudio sugiere que al
nivel de genes individuales, ocurre una desmetilación máxima en
ovocitos en la etapa de paquiteno, seguido de una remetilación
activa en la etapa de diploteno, y finalmente desmetilación de los
transgenes maternos que ocurre en el embrión en la etapa de
mórula-blastocito. Aunque más compleja que la
espermatogénesis, la situación aquí descrita para los transgenes
maternos corresponde de nuevo a un ciclo de
desmetilación/metilación.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos datos indican que los transgenes ricos en
CpG están sometidos a control negativo en células embrionarias y
somáticas y se activan por elementos de control positivos tras la
diferenciación celular. Esto es compatible con el concepto de un
control negativo global del genoma (Bird, 1995), incluso para genes
específicos de tejido, mediante la metilación de CpG, y compatible
con el concepto de activación génica por el equilibrio entre este
control negativo global y activadores que actúan sobre la
estructura de cromatina.
Si la represión del gen LacZ rico en CpG refleja
el control negativo del genoma, entonces además de células
embrionarias y somáticas, otras etapas experimentan también este
control incluyendo: las células extraembrionarias, las células
madre de células germinales masculinas (tanto gonocitos como
espermatogonios) y las células germinales femeninas en etapas de
PI-Lp-Zy y diploteno. En
consecuencia, el control negativo del genoma estaría siempre
asociado a la actividad de células especializadas, excluyendo sólo
las células multipotenciales de embriones en escisión.
En dos periodos durante la vida del organismo,
las células parecen no imponer este control negativo: en la etapa
de mórula-blastocito, en la etapa de paquiteno
durante la ovogénesis y la correspondiente etapa durante la
espermatogénesis. Sin embargo, la anulación del control negativo en
estas células no parece estar mediado por elementos activadores en
trans del complejo represivo, si no mediante la desmetilación de
CpG. Parecería más fácil y más eficaz anular la represión génica en
estas etapas inhibiendo temporalmente la expresión de uno o más
componentes del complejo represor que modificar todos los CpG del
genoma. Por lo tanto, la desmetilación cíclica del genoma es
probablemente necesaria para más que simplemente la activación
génica específica en células en estas etapas de desarrollo.
Tanto el mantenimiento de un mecanismo regulador
negativo global como el mantenimiento de una desmetilación
periódica son aparentemente cruciales para el organismo. Sin
embargo, el mantenimiento de un mecanismo represor basado en la
metilación de ADN representa una pesada carga genética y
epigenética tanto para el genoma (mediante las células germinales)
como para el organismo (mediante las células somáticas). Las
propiedades de EFLagZ ilustran este punto porque incluso la
densidad de CpG de este transgén es cercana a la de genes endógenos
pobres en CpG. De forma similar, los genes específicos de tejido
que contienen regiones ricas en CpG serían también particularmente
susceptibles a este mecanismo represivo. Debido a que el patrón de
metilación se transmite clonalmente, la represión de estos genes se
mantendría y acumularía en las células hija. La hipometilación
general del genoma al inicio de la embriogénesis puede servir por lo
tanto para contrarrestar la represión de los genes. La consecuencia
de esta hipometilación es una ganancia inmediata del embrión y el
organismo y una ganancia genética, mediante células germinales de
la siguiente generación. La metilación general que sigue a la
desmetilación ocurre en decenas o cientos de células individuales
(Warnecke and Clark, 1999). Este evento policlonal es también
ventajoso para el organismo, puesto que la inactivación
potencialmente inapropiada causada por esta remetilación no afectará
a cada célula del embrión, y las células con un patrón de
metilación incorrecto pueden eliminarse en última instancia.
Por otro lado, un periodo extendido de
hipometilación genómica podría causar potencialmente trastornos
celulares (Foss y col., 1993) (Finnegan y col., 1996; Kakutani y
col., 1996) y esto podría explicar porqué una metilación rápida
sigue a una desmetilación en la etapa de blastocito y porqué el
genoma femenino se metila en la etapa de diploteno antes de la fase
de crecimiento. En este último caso, la metilación podría ser
necesaria también para evitar la expresión inapropiada de genes
cuyos productos podrían acumularse en el óvulo y posiblemente
transmitirse por vía materna al embrión.
Los genes ubicuos pueden haber evolucionado
hacia un contenido menor de CpG en respuesta al mantenimiento de
este sistema de control negativo dependiente de CpG global. En
apoyo de esta idea está el hecho de que el 82% de los genes con una
expresión amplia carecen de islas de CpG fuera de sus promotores
(Larsen y col., 1992). Esto podría permitirlos escapar del sistema
de regulación activador/represor. Los genes específicos de tejido
evolucionaron probablemente hacia un mecanismo más refinado, que
implicaba activadores en cis y trans, para superar esta represión
dependiente de CpG. Es más, se ha mostrado que es una función de la
maquinaria transcripcional modificar la cromatina en una
conformación activa (Struhl, 1996). Se ajusta al concepto de
actividad génica basada en un equilibrio entre control negativo
global y activadores que actúan sobre la estructura de cromatina.
Por lo tanto, parece paradójico que la mayoría de los genes
específicos de tejido hayan conservado al menos una región rica en
CpG, localizada habitualmente fuera del promotor (Larsen y col.,
1992). Estas observaciones sugieren que esta región rica en CpG
podría usarse para inhibir la actividad génica específica de tejido
mediante un mecanismo general, particularmente en etapas de
desarrollo en que el control negativo de dichos genes es esencial,
tales como el periodo de diversificación de tejido aproximadamente
a 8 dpc. A este respecto, es interesante observar que los mutantes
nulos de metiltransferasa (dnmt 1) o MeCP2 exhiben letalidad en
esta etapa (Li y col., 1992; Tate, y col., 1996).
Para concluir, todas estas observaciones
sugieren que el genoma de mamífero no está simplemente controlado
por la activación por encima de niveles basales, si no que también
está reprimido activamente. Dicho sistema permite una regulación
más discreta y un amplio intervalo de niveles de actividad génica
mediante la actividad combinada de activadores y represores. Dicho
mecanismo de ajuste con respecto a la actividad génica podría dar
como resultado, a su vez, la elaboración de redes reguladoras más
complejas. Otras funciones asociadas generalmente a la metilación
en mamíferos son el control sobre la difusión de secuencias
repetidas de transposones y sellado genómico (Walsh y Bestor,
1999), y podrían constituir algunos usos secundarios de este
mecanismo más fundamental.
Tabla
1
Se obtuvieron los embriones de animales cruzando
machos o hembras transgénicos con animales (B6D2) F1 para analizar
la expresión transgénica paterna (tabla inferior) y materna (tabla
superior). Se recuperaron las gónadas a diferentes etapas de
desarrollo y se tiñeron con X-gal. La expresión en
células germinales se expone a continuación: -: células
\beta-gal -; +: células
\beta-gal+ e y: pocas células
\beta-gal+. Los números entre las flechas
representan el número total de embriones macho o hembra
examinados.
1: cinco hembras transgénicas eran
\beta-gal+ en gónadas; 2: un macho transgénico
era \beta-gal+ en gónadas; 3: un macho era
\beta-gal+ en gónadas; 4: cinco machos
transgénicos eran \beta-gal+ en gónadas y nd: no
determinado. La última columna de la tabla inferior designa la
expresión cuantitativa del transgén paterno en testículo adulto. Se
cuantificó la actividad \beta-gal con el sustrato
fluorogénico de \beta-galactosidasa, MUG. La
actividad \beta-gal del testículos de control era
de 41,5 x 10^{-7} unidades \beta-gal medido con
un valor medio de 12 testículos de control.
Tabla
2
Se aparearon machos o hembras transgénicos con
animales (B6D2) F1 para analizar la expresión transgénica paterna y
materna. Todos los ratones transgénicos usados eran homocigóticos
excepto los ratones DCR4.
A lo largo de este documento, se hace referencia
a una serie de artículos de la bibliografía científica. Aquellos
artículos que pueden encontrarse en la bibliografía científica se
enumeran a continuación:
\bulletAriel, M., McCarrey, J.
and Cedar, H. (1991). Methylation patterns of
testis-specific genes, Proc Natl Acad Sci USA
88, 2317-2321
\bulletBestor, T.H. (1998).
Gene silencing. Methylation meets acetylation [news; comment].
Nature 393, 311-312
\bulletBird, A. (1992). The
essentials of DNA methylation. Cell 70,
5-8
\bulletBird, A.P. (1995). Gene
number, noise reduction and biological complexity [see comments].
Trends Genet 11, 94-100
\bulletBonnerot, C., Grimber,
G., Briand, P. and Nicolas, J.F. (1990).
Patterns of expression of position-dependent
integrated transgenes in mouse embryo. Proc Natl Acad Sci US
87, 6331-6335
\bulletBonnerot, C. and
Nicolas, J.-F. (1992). Manipulation of expression of a
position-dependent transgene by the
b-globin locus control region. Submitted to
Nature
\bulletBonnerot, C. and
Nicolas, J.-F. (1993). Application of LacZ gene
fusions to post-implantation development. In Methods
in Enzymology: Guide to techniques in mouse development, vol. 225
(ed. A. Press), pp. 451-469. SanDiego (California):
Wassarman, P.M. and DePamphilis, M.L.
\bulletBonnerot, C. and
Nicolas, J.F. (1993a). Lineage control of an
integration site-dependent transgene combined with
the b-globin locus control region. C.R. Acad.
Sci. Paris 316, 352-357
\bulletBonnerot, C.,
Rocancourt, D., Briand, P., Grimber, G. and
Nicolas, J.F. (1987). A
b-galactosidase hybrid protein targeted to nuclei as
a marker for developmental studies. Proc. Natl. Acad. Sci.
84, 6795-6799
\bulletBoyes, J. and Bird, A.
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a methyl-CpG binding protein. Cell 64,
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\bulletBoyes, J. and Bird, A.
(1992). Repression of genes by DNA methylation depends on
CpG density and promoter strength: evidence for involvement of a
methyl-CpG binding protein. EMBO J 11,
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\bulletBrownell, J.E. and
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occasions: linking histone acetylation to chromatin assembly and
gene activation. Current Opinion in Genetics &
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\bulletBuschhausen, G., Wittig,
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Chromatin structure is required to block transcription of the
methylated herpes simplex virus thymidine kinase gene. Proc Natl
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\bulletCameron, E.E., Bachman,
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\bulletChaillet, J.R. (1994).
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Aunque se han descrito varias realizaciones de
la invención, se entenderá que la presente invención es susceptible
de una modificación adicional, y se pretende que esta solicitud
cubra cualquier variación, uso o adaptación de la invención
siguiendo la invención e incluyendo aquellas modificaciones de la
presente descripción que entran en el conocimiento o práctica
acostumbrada a la que pertenece la invención, y como pueden
aplicarse a los rasgos esenciales anteriormente expuestos en la
presente memoria y que entran dentro de los límites de las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de los documentos citados por el
solicitante se incluyó exclusivamente para informar al lector. No
es parte integrante de la patente europea. Esta se confeccionó con
el máximo cuidado, pero la Oficina Europea de Patentes no asume,
sin embargo, ningún tipo de responsabilidad por posibles errores u
omisiones.
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\bullet US 5874416 A [0004]
\bullet WO 9852581 A [0005] [0005] [0005]
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<110> INSTITUT PASTEUR CENTRE NATIONAL DE
LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
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<120> POLINUCLEÓTIDOS AISLADOS QUE TIENEN
UN CONTENIDO REDUCIDO O AUMENTADO DE MOTIVOS DE CONTROL EPIGENÉTICO
Y USOS DE LOS MISMOS
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<130> B4752IP
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<140> PCT/EP 00/12793
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<141>
12-06-2000
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<150> CANADÁ Nº 2.291.367
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12-06-1999
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<211> 3150
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> misc feature
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<222> (1)..(3150)
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<223> Secuencia de ácido nucleico de
LacZ
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<400> 1
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<211> 3150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: gen derivado de LacZ
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Secuencia de ácido nucleico de
LagZ
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artificial: gen derivado de LacZ
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LagZ
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Claims (12)
1. Un procedimiento para aumentar la capacidad
de un gen procariótico nativo aislado de expresarse en un
hospedador eucariótico, caracterizado porque comprende
modificar la secuencia nucleotídica de dicho gen procariótico
nativo aislado reduciendo su contenido de dinucleótidos 5'CpG3' en
al menos un 80%, sin cambiar la secuencia aminoacídica de la
proteína o polipéptido codificado por dicho gen procariótico
nativo.
2. El uso de un gen procariótico modificado, en
el que el contenido de dinucleótidos 5'CpG3' de la secuencia de
codificación de dicho gen procariótico modificado es al menos el
80% menor que el del gen procariótico nativo y además en el que la
secuencia aminoacídica de la proteína o polipéptido codificado por
dicho gen procariótico nativo no cambia en comparación con la
codificada por dicho gen procariótico nativo, para aumentar la
expresión de dicha proteína o polipéptido en una célula hospedadora
eucariótica ex vivo o in vitro en comparación con el
nivel de expresión alcanzado cuando se usa dicho gen procariótico
nativo.
3. El uso de un gen procariótico modificado, en
el que el contenido de polinucleótidos 5'CpG3' de la secuencia de
codificación de dicho gen procariótico modificado es al menos el
80% menor que la del gen procariótico nativo y además en el que la
secuencia aminoacídica de la proteína o polipéptido codificado por
dicho gen procariótico modificado no cambia en comparación con la
codificada por dicho gen procariótico nativo, para preparar un
animal transgénico no humano que tiene una expresión aumentada de
dicha proteína o polipéptido en comparación con el nivel de
expresión alcanzado cuando se usa dicho gen procariótico
nativo.
4. El procedimiento o uso de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, caracterizado
porque dicho contenido de dinucleótidos 5'CpG3' es al menos un 99%
menor que el de dicho gen procariótico nativo.
5. El procedimiento o uso de la reivindicación
4, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica
modificada está completamente desprovista de dinucleótidos
5'CpG3'.
6. El procedimiento o uso de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, caracterizado
porque dicha secuencia nucleotídica modificada es una secuencia del
gen LacZ modificada.
7. El procedimiento o uso de la reivindicación
8, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica
modificada comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo constituido por la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2.
8. Un polinucleótido aislado, que comprende una
secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por
la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2.
9. Un vector de expresión caracterizado
porque comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación
8.
10. Una célula hospedadora aislada,
caracterizada porque se transforma con el vector de
expresión de la reivindicación 9.
11. Un microorganismo recombinante seleccionado
de los microorganismos depositados en la C.N.C.M. con los números
de acceso 1-1691 el-2354.
12. Un organismo transgénico no humano que se ha
modificado genéticamente para incluir y/o expresar un
polinucleótido aislado de la reivindicación 8.
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