ES2301871T3 - Corticosteroides encapsulados en vesiculas para el tratamiento del cancer. - Google Patents

Abstract

Uso de una composición que comprende un corticosteroide encapsulado en una microvesícula de tiempo de circulación largo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores sólidos primarios y/o secundarios de un cáncer no linfático.

Description

Corticosteroides encapsulados en vesículas para el tratamiento del cáncer.

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende un corticosteroide, en el tratamiento de un cáncer o en la inhibición de un crecimiento canceroso. De manera más específica, la invención se refiere a un método para dirigir un corticosteroide hacia un tejido tumoral.

De manera aún más específica, la presente invención tiene como objetivo proporcionar el uso de esas composiciones en el tratamiento de cánceres no linfáticos, y preferiblemente de neoplasias malignas sólidas (no hematológicas) y metástasis (tumores sólidos primarios y secundarios) y corresponde por lo tanto al campo de la oncología.

Los corticosteroides, tales como los glucocorticoides, se han propuesto como componentes activos en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, Coleman ha descrito en Biotherapy 4(1) (1992), 37-44 que en la terapia antitumoral, se suelen utilizar glucocorticoides por su potencial anti-inflamatorio y antiemético, y para el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas debido a su eficiente actividad citolítica sobre las células de origen linfoide.

En el tratamiento de tipos de cánceres linfáticos, p. ej., leucemia linfática crónica y aguda, linfomas de tipo Hodgkin y de tipo no-Hodgkin, los esteroides han manifestado actividad antitumoral. Esto no sorprende ante el hecho de que las células de origen linfático pueden ser suprimidas por acción de los corticosteroides (actividad inmunosupresora).

Un ejemplo de este tratamiento se divulga en el documento US-A-6.090.800 en el que se describen vesículas, liposomas y micelas que contienen profármacos esteroideos solubles en lípidos. En este documento se indica que "los esteroides, tales como la cortisona y la dexametasona, son potentes inmunosupresores y se usan para tratar procesos tales como enfermedades autoinmunitarias, rechazo al trasplantes de órganos, artritis, inflamaciones dérmicas, de las membranas mucosas y oftálmicas, así como procesos neoplásicos, tales como linfomas". Además, esta Patente de EE. UU. instruye sobre el direccionamiento específico hacia receptores de IL-2 dispuestos sobre células T.

Otros informes en la década de los años 1.980 y 1.990 demostraron que los glucocorticoides podrían también desacelerar el crecimiento de los tumores sólidos. Varios estudios mostraron que este efecto no apuntaba directamente a las células tumorales, sino que más bien estaba mediado por una interferencia con la vascularización del tumor, (véase en este sentido, p. ej., Folkman y col. en Science 221(4612) (1983), 719-723; Lee y col. en Cancer Res. 47(19) (1987), 5021-5024; McNatt y col. en J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15(5) (1999) 413-423; y Crowley y col. en Oncology 45(4) (1988), 331-335). El mecanismo exacto de la interferencia, sin embargo, no se conoce con claridad. Se ha sugerido que está mediado por una inhibición de la proliferación y migración de células endoteliales (Cariou y col. en Cell. Biol. Int. Rep. 12(12) (1988), 1037-1047), por el recambio de las membranas basales (Folkman y col. (ibídem); Ingber y col. en Endocrinology 119(4) (1986), 1768-1775) y/o por la inhibición de factores proangiogénicos (como el activador del plasminógeno y el factor de crecimiento del endotelio vascular) (Blei y col. J. Cell Physiol. 155(3) (1993), 568-578; Nauck y col. en Eur. J. Pharmacol. 341(2-3) (1998), 309-315). Además, la hipótesis de que los procesos inflamatorios que tienen lugar en el tumor y alrededor del tumor son importantes en la cascada angiogénica, sugiere que la acción inmunosupresora de los glucocorticoides puede también estar implicada (Bingle y col. en J. Pathol. 196(3) (2002), 254-265; O'Byrne y Dalgleish en Br. J. Cancer 85(4) (2001), 473-483).

Uno de los inconvenientes de la estrategia de usar corticosteroides en una terapia dirigida a tumores sólidos es la necesidad de utilizar dosis altas (típicamente de 100 - 200 mg/kg por día) durante períodos de tiempo prolongados, para obtener una inhibición significativa del crecimiento tumoral. Estas dosis inevitablemente producen graves efectos secundarios y se ha demostrado que son causantes de morbilidad y mortalidad como resultado de una inmunosupresión grave en animales experimentales.

En el estado de la técnica se ha propuesto que un suministro selectivo de glucocorticoides al tejido tumoral podría ser una estrategia atractiva para aumentar las concentraciones locales de fármacos. Esto reduciría la dosis total y, con ello, disminuiría la probabilidad de aparición de efectos secundarios. Por ejemplo, el documento US-A-5.762.918 tiene como objetivo el suministro selectivo de esteroides a células endoteliales de tumores, a través de la conjugación con compuestos polianiónicos y en especial con heparina (fragmentos). Se indica una inhibición máxima del tumor de aproximadamente el 65% a una dosis de cortisol de 35 mg/kg por día, durante 8 días.

Más en particular, se reivindica que el conjugado corticosteroide-heparina, descrito en dicho documento US-A-5.762.918, es capaz de suministrar el corticosteroide a las células del endotelio vascular de manera más selectiva. Estudios in vivo realizados en ratones demostraron que una dosis diaria de 1 mg de cortisol-heparina durante 9 días producían una disminución del tumor del 65%, comparada con una disminución del 40% en ratones tratados con cortisol libre y heparina libre. La dosificación por kg de peso corporal no se especificó pero se ha encontrado tanto en modelos con ratones como en modelos con Múridos que un conjugado cortisol-heparina es capaz de obtener una disminución del 65% en la tasa de crecimiento tumoral cuando se administra en una dosis diaria de 35 mg/kg durante 8 días.

Un inconveniente de esta estrategia es la derivatización química requerida para unir el costicosteroide al compuesto polianiónico y, en particular, a la heparina. La unión resultante entre el corticosteroide y la heparina debe ser lo suficientemente estable para llegar hasta el tumor, pero lo suficientemente reversible para permitir la disociación del corticosteroide. Además, con el fin de solucionar problemas relacionados con el efecto anticoagulante de la heparina, se deben seleccionar heparinas especificadas o sus derivados.

Aunque el titular de la Patente mencionado en el documento US-A-5.762.918 reivindica que el corticosteroide tiene una actividad mejorada, debido a que es suministrado específicamente por la heparina a las células endoteliales del tumor o de los alrededores del tumor, este mecanismo no se ha demostrado ni ha sido apoyado por datos. Sobre la base de los datos presentados, la única conclusión que se puede sacar es que el conjugado heparina-corticosteroide tiene una actividad más alta. Por otra parte, se señala que el comportamiento farmacocinético del conjugado no se ha estudiado. La heparina usada tiene un peso molecular bajo, lo que produce su eliminación eficiente por los riñones. Esto hace que probablemente el conjugado sea también excretado por los riñones, dando como resultado el hecho de que un direccionamiento específico del conjugado hacia el tumor no sea altamente efectivo.

El conjugado es, según se afirma en el documento US-A-5.762.918, dependiente de un acoplamiento estable entre el corticosteroide y la heparina, y de la escisión de este acoplamiento en el sitio del tumor. La naturaleza del enlace es crítica y difícil de controlar. Una escisión prematura o una degradación demasiado baja del acoplamiento, da lugar a una actividad menos efectiva.

Dicho documento US-A-5.762.918 afirma además, aunque haciendo referencia a los problemas asociados con dosis demasiados altas de corticosteroides en el tratamiento de un cáncer a.o., que hay "otros medios para alterar las propiedades farmacológicas de un fármaco, que incluyen una biodistribución alterada y una toxicidad disminuida. La encapsulación en liposomas implica la incorporación de las moléculas del fármaco en el interior de una "cápsula" de materiales lipídicos, normalmente compuesta por vesículas unilamelares y multilamelares de diferentes fosfolípidos. Lamentablemente, la capacidad para formar liposomas estables de un agente particular es algo limitada, ya que la estabilidad de los liposomas es una función de diversos parámetros tales como la lipofilia del fármaco y otras consideraciones estructurales. Por lo tanto, la encapsulación en liposomas ha resultado no ser aplicable a un amplio espectro de agentes. Además, la capacidad de una encapsulación en liposomas para alterar la biodistribución es impredecible en el mejor de los casos. Por lo tanto, esa encapsulación no ha proporcionado un medio particularmente satisfactorio y extensamente aplicable para efectuar el direccionamiento de un fármaco seleccionado de una manera uniforme y específica de tejido".

Existe una necesidad constante de terapias alternativas y de composiciones terapéuticas.

Además, un objetivo de la presente invención es encontrar un método para dirigir corticosteroides hacia un tejido tumoral para, o en, el tratamiento, retardo o inhibición del cáncer, en particular es un objetivo para tratar, retardar o inhibir el crecimiento de tipos de cánceres sólidos y no linfáticos.

De manera más específica, la presente invención se dirige a un método que usa microvesículas para encapsular corticosteroides, y al uso de estos sistemas para el suministro dirigido a tumores.

De acuerdo con la presente invención, actualmente se ha descubierto que una composición que comprende un corticosteroide, encapsulada en unos tipos particulares de microvesículas, se puede usar para fabricar un medicamento útil en el tratamiento del cáncer.

Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende un corticosteroide encapsulado en una microvesícula de tiempo de circulación largo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores sólidos primarios y/o secundarios de un cáncer no linfático y especialmente en oncología. Se encontró que dicha composición inhibe el crecimiento tumoral, en particular el crecimiento de tumores sólidos, y se puede por lo tanto usar para conseguir este efecto en el tratamiento del cáncer y especialmente en oncología.

Las microvesículas de tiempo de circulación largo tienen una farmacocinética muy favorable, un comportamiento favorable en cuanto a la distribución en tejidos y una semivida eficiente. Además, se observa una asociación estable entre el corticosteroide y el sistema de transporte, las microvesículas, siempre que la carga del corticosteroide sea eficiente. Se observa también una buena disponibilidad biológica en el sitio en el que se requiere la actividad. Sin desear estar obligado por ninguna teoría, se formula la hipótesis de que las microvesículas presentan una interacción con los macrófagos en el tumor. Esto significaría que dicho tipo de células podría estar regulado por disminución en una terapia antitumoral, o que puede liberar los corticosteroides encapsulados para permitir la interacción con otros tipos celulares en el tumor y en los alrededores del tumor.

En una realización preferida la microvesícula de tiempo de circulación largo es un liposoma, una nanocápsula o una micela polimérica. Preferiblemente, la microvesícula tiene una carga neutra o negativa en condiciones fisiológicas.

Otras microvesículas adecuadas de tiempo de circulación largo pueden estar basadas en lipoproteínas, y especialmente en lipoproteínas de alta densidad y en lipoproteínas de baja densidad, y en compuestos miméticos de lipoproteínas o en neo-lipoproteínas.

Se ha descubierto que las microvesículas de tiempo de circulación largo, y en especial los liposomas, nanocápsulas y micelas poliméricas de tiempo de circulación largo, son capaces de suministrar eficientemente fármacos corticosteroideos a un sitio específico, es decir, a un tumor. En particular, la presente invención proporciona un medicamento para, o en, el tratamiento del cáncer, adecuado para administrar corticosteroides, y especialmente glucocorticoides, en dosificaciones relativamente bajas. De acuerdo con la invención, se han observado inhibiciones efectivas del crecimiento tumoral en realizaciones particulares con dosificaciones relativamente bajas de sólo 20 mg/kg peso corporal por semana.

Además, se ha encontrado que con el uso de los corticosteroides presentes en las microvesículas de la invención, se observa una apoptosis masiva de las células tumorales en el centro del tumor, que puede estar relacionada con un suministro deficiente de sangre al tumor. Además, hay una indicación de que el tumor está encapsulado en tejido conjuntivo. De manera particular, en un modelo en ratones, se observa una pérdida de unión del tumor al tejido subyacente. Una evaluación al microscopio parece mostrar una formación de tejido conjuntivo que encapsula al tumor.

Sin desear estar obligado por ninguna teoría, se piensa que las microvesículas usadas en la presente invención se acumulan en sitios de tejidos malignos, tales como los tumores, como resultado de la mayor permeabilidad de la vasculatura del tumor en comparación con la del endotelio sano, lo que permite una mejor ubicación y una mejor retención del corticosteroide en estos sitios.

Las microvesículas de tiempo de circulación largo usadas de acuerdo con la presente invención, típicamente tienen un diámetro medio de partícula menor que 450 nm, y preferiblemente menor que 300 nm, determinado mediante dispersión dinámica de la luz usando un sistema Malvern 4700^{TM} equipado con un láser de He/Ne, y preferiblemente de aproximadamente 40 nm - 200 nm. Además, como se puede observar en los ejemplos prácticos (véase más abajo), las microvesículas de la invención tienen una polidispersidad bastante pequeña, lo que significa que la distribución de los tamaños de partícula es reducida. Preferiblemente, la polidispersidad que se calcula por medio del programa informático perteneciente al equipo de dispersión dinámica de la luz, es menor que 0,25 y más preferiblemente es menor que 0,2.

Preferiblemente, las microvesículas de tiempo de circulación largo usadas en las composiciones de la invención son liposomas de tiempo de circulación largo. Con esos tipos de microvesículas de tiempo de circulación largo, se ha encontrado (véase más abajo) que el crecimiento tumoral se puede reducir en más del 65% e incluso en hasta el 90% en comparación con los controles, a una dosis de solamente 20 mg/kg de peso corporal por semana, en unas 2-3 semanas.

Esos liposomas de tiempo de circulación largo ya se conocían en la técnica, incluso combinados con corticosteroides, especialmente con corticosteroides solubles en agua. Más en particular, en el documento WO-A-02/45688 se ha descrito que estos sistemas liposómicos conocidos son útiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, dirigido a sitios específicos. Para la preparación de composiciones adecuadas para usar en la presente invención, los métodos de preparación descritos en el documento WO-A-02/45688 se incorporan aquí como referencia.

En este documento WO-A-02/45688, los sistemas de liposomas descritos en el documento EP-A-0 662 820 se adaptan para hacerlos "de tiempo de circulación largo".

El documento EP-A-1 044 679 se refiere a liposomas que contienen un fármaco incluido en ellos, de los que se dice que poseen una estabilidad garantizada en sangre. Además, estos liposomas tienen una propiedad de direccionamiento activo hacia áreas ricas en proteoglucanos. Estas áreas se crean porque en algunas enfermedades tiene lugar una sobreproducción de proteoglucanos; dichos proteoglucanos mantienen las superficies celulares aniónicas. Para dirigir los liposomas hacia estas superficies aniónicas, los liposomas necesitan tener una naturaleza catiónica. Para ello, dichos liposomas requieren la presencia de un compuesto básico que recoja la carga positiva dentro de un intervalo de pH fisiológico.

Los liposomas de la presente invención no requieren la propiedad de direccionamiento activo descrita en el documento EP-A-1 044 679. Es decir, no se requieren grupos de direccionamiento específicos para conducir a las vesículas de manera selectiva hacia los sitios de los tumores. Sin embargo, para aumentar la selectividad a un grado aún más alto, es posible unir o incorporar anticuerpos específicos del tumor o ligandos de receptores o compuestos alimenticios en la superficie externa de las microvesículas para aumentar así las posibilidades de interacción con las células tumorales o con las células situadas en o alrededor del tumor.

El "direccionamiento" de los liposomas neutros u opcionalmente con carga negativa de la presente invención está controlado por la mayor permeabilidad anteriormente identificada de la vasculatura del tumor. Es decir, la presente invención se basa en su mayor parte en una acumulación pasiva más que en un direccionamiento activo.

Los liposomas útiles en la presente invención no deben tener carga positiva y por lo tanto no deben comprender componentes que den a los liposomas una carga positiva a pH fisiológico; es decir, a pH fisiológico, que es un pH entre 6 y 8, la carga total del liposoma que se ha usar en la presente invención, debe ser neutra o negativa.

Los liposomas preferidos están basados en lípidos formadores de vesículas no cargados. Los lípidos formadores de vesículas neutros o no cargados conducen a un tiempo de circulación largo adecuado. Típicamente pueden estar presentes lípidos con carga negativa en una concentración de 5% - 10% en moles. Los lípidos preferidos para usar para preparar microvesículas, usados en la invención comprenden fosfolípidos y esfingolípidos saturados en combinación con colesterol y/o ergosterol y sus derivados.

Para garantizar una estabilidad adecuada en el sistema de circulación de la sangre, debe de haber una concentración de esteroles del 10% - 50% en moles en el material de las microvesículas. Se describen constituyentes adecuados para liposomas en los documentos WO-A-02/45688 y EP-A-0 662 820 anteriormente identificados.

Más preferiblemente, los liposomas contienen al menos uno de los tipos de conjugados polímero-lípido, tales como lípidos en forma de derivado con polietilenglicol (PEG). Los conjugados polímero-lípido adecuados tienen un peso molecular entre 200 Dalton y 30.000 Dalton.

Otros candidatos adecuados para ser usados en estos conjugados polímero-lípido son polímeros solubles en agua tales como: poli(derivados de carbohidratos), polímeros de vinilo solubles en agua (p. ej., poli(vinil-pirrolidona), poliacrilamida, y poli(acriloilmorfolina) y (poli(metil/etil-oxazona). Estos polímeros se acoplan al lípido a través de moléculas de anclaje convencionales.

Convenientemente, la concentración de los conjugados polímero-lípido es del 0% - 20% en moles, y preferiblemente del 1% - 10% en moles, basada en la relación molar total de los lípidos formadores de vesículas.

La presencia de estos conjugados polímero-lípido tiene un efecto favorable sobre el tiempo de circulación. Sin embargo, seleccionando cuidadosamente las composiciones lipídicas específicas y las especificaciones físicas, se pueden obtener tiempos de circulación largos adecuados sin usar un conjugado polímero-lípido. Por ejemplo, liposomas de 50 nm - 100 nm de diestearilfosfatidilcolina y colesterol y/o esfingolípidos como la esfingomielina.

Los liposomas pueden contener adicionalmente uno o más tipos de lípidos formadores de vesículas cargados, p. ej, fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina, (di)estearilamina, fosfatidilserina, dioleoil-trimetil-amonio-propano, ácidos fosfatídicos y hemisuccinato de colesterol.

Típicamente, la concentración de los lípidos formadores de vesículas cargados es del 0% - 15% en moles, preferiblemente del 0% - 10% en moles, basada en la relación molar de los lípidos formadores de vesículas.

Cuando en esta descripción se hace referencia a cargado/no cargado/anfipático, etc., esta referencia se refiere a condiciones fisiológicas.

Por lo tanto, en una realización preferida la presente invención se refiere al uso de una composición, en la que la microvesícula es un liposoma que comprende un lípido formador de vesículas no cargado, un 0% - 20% en moles de un conjugado polímero-lípido y preferiblemente un polietilenglicol, un 0% - 50% en moles de un esterol y un
0% - 10% en moles de un lípido formador de vesículas cargado. Los liposomas tienen un diámetro medio de partícula preferido en el intervalo de tamaños entre aproximadamente 40 nm - 200 nm.

Las micelas poliméricas que han de ser usadas en la presente invención se pueden preparar de acuerdo con el método descrito en el documento EP-A-1 072 617 adaptado de acuerdo con el método anteriormente descrito para la preparación de liposomas.

Las microvesículas de tiempo de circulación largo tienen una semivida en circulación de al menos 3 horas, y especialmente de al menos 6 horas. La semivida en circulación se define, como la persona experta en la técnica entiende, como el tiempo en el que la segunda fase lineal del perfil logarítmico de eliminación de la microvesícula, por ejemplo, una microvesícula liposómica, alcanza el 50% de su concentración inicial, que es la concentración extrapolada en plasma a t = 0.

En una realización preferida, el medicamento que ha de ser usado para, o en, el tratamiento de un cáncer es un medicamento de aplicación parenteral o local. Sin embargo, también es posible la aplicación a través de la vía oral o pulmonar.

Al contrario que, por ejemplo, el sistema ilustrado en el documento US-A-6.090.800, que requiere profármacos esteroideos solubles en lípidos, el corticosteroide es más preferiblemente un corticosteroide soluble en agua. La expresión "soluble en agua" se define aquí como que tiene una solubilidad a una temperatura de 25ºC de al menos 10 g/l de agua o de agua tamponada a pH neutro.

Los corticosteroides solubles en agua que se pueden usar ventajosamente de acuerdo con la presente invención son sales de amonio y de metales alcalinos preparadas a partir de corticosteroides, que contienen un grupo hidroxilo libre, y ácidos orgánicos, tales como ácidos alifáticos de C_{2}-C_{12}, ácidos dicarbónicos saturados e insaturados, y ácidos inorgánicos, tales como ácido fosfórico y ácido sulfúrico. Asimismo, las sales de adición de ácido de los corticosteroides se pueden encapsular ventajosamente en las vesículas, preferiblemente en liposomas, más preferiblemente en PEG-liposomas de tiempo de circulación largo. Si más de uno de los grupos de la molécula de corticosteroide está disponible para la formación de sales, pueden ser útiles mono-sales así como di-sales. Como sales de metales alcalinos, las sales de sodio y potasio son las preferidas. También se pueden usar otros derivados de corticosteroides, cargados positivamente o negativamente. Son ejemplos específicos de corticosteroides solubles en agua el fosfato sódico de betametasona, fosfato sódico de desonida, fosfato sódico de dexametasona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, fosfato disódico de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, fosfato sódico de prednisolona, succinato sódico de prednisolona, hidrocloruro de prednisolamato, fosfato disódico de prednisona, succinato sódico de prednisona, fosfato disódico del acetónido de triamcinolona y fosfato disódico del acetónido de triamcinolona. Además de los corticosteroides solubles en agua, también se pueden usar ventajosamente derivados lipófilos de corticosteroides, preparados a partir de corticosteroides que contienen uno o más grupos hidroxilo libres y ácidos carbónicos lipófilos, alifáticos o aromáticos. Son preferidos los corticosteroides esterificados con uno o dos ácidos alquil-carbónicos, tales como el ácido palmitílico y el ácido estearílico, que contienen más de 10 átomos
de C.

Los corticosteroides adecuados incluyen por ejemplo dipropionato de alclometasona, amcinonida, monopropionato de beclometasona, 17-valerato de betametasona, ciclometasona, propionato de clobetasol, butirato de clobetasona, propionato de deprodona, desonida, desoximetasona, acetato de dexametasona, valerato de diflucortolona, diacetato de diflurasona, diflucortolona, difluprednato, pivalato de flumetasona, flunisolida, acetato del acetónido de fluocinolona, fluocinonida, pivalato de fluocortolona, acetato de fluormetolona, acetato de fluprednideno, halcinónido, halometasona, acetato de hidrocortisona, medrisona, acetato de metilprednisolona, furoato de mometasona, acetato de parametasona, prednicarbato, acetato de prednisolona, prednilideno, rimexolona, pivalato de tixocortol y hexacetónido de triamcinolona.

De estos corticosteroides, el fosfato disódico de prednisolona, succinato sódico de prednisolona, fosfato disódico de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, fosfato disódico de dexametasona y fosfato disódico de betametasona son los preferidos.

Los esteroides, carentes de la acción de los glucocorticoides o mineralocorticoides, denominados esteroides angiostáticos, se ha demostrado que inhiben el crecimiento de tumores con menos efectos secundarios asociados con los glucocorticoides/mineralocorticoides. Se han conseguido resultados muy buenos con estos corticosteroides angiostáticos, preferiblemente con los esteroides que contienen una cetona C20 pero que carecen de una cetona C3, tales como tetrahidrocortisona, tetrahidrocortisol y tetrahidro-S o uno de sus análogos funcionales.

Los corticosteroides tópicos que experimentan una eliminación eficiente tan pronto como estos fármacos se hacen disponibles en la circulación general, tienen un interés especial. Sus ejemplos son budesonida, flunisolida y propionato de fluticasona, rimexolona, butixocort y beclometasona, y sus derivados. Preparando una forma soluble en agua de un derivado lipófilo de los esteroides tópicos anteriormente mencionados y encapsulándolos en microvesículas, preferiblemente en liposomas con PEG, de acuerdo con la presente invención, actualmente es posible administrar por vía sistémica esos corticosteroides con el fin de llegar a un suministro de fármacos específico de sitios de tumores. De esta manera se evitan los efectos adversos asociados con el tratamiento sistémico y problemas sobrepuestos, que son inherentes a los corticosteroides, tales como una eliminación rápida. En este sentido, el fosfato disódico de budesonida ha resultado ser una sal de gran interés.

Como se ha indicado, las microvesículas usadas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar según métodos usados en la preparación de los liposomas convencionales y de PEG-liposomas, según se describe en, p. ej., en el documento EP-A-0 662 820 o en el documento WO 02/45688. La carga pasiva de los componentes activos en el interior de los liposomas disolviendo los corticosteroides en la fase acuosa es suficiente para conseguir una encapsulación lo más alta posible, pero también se pueden utilizar otros métodos. Los componentes lipídicos usados en la formación de los liposomas se pueden seleccionar entre diversos lípidos formadores de vesículas, tales como fosfolípidos, esfingolípidos y esteroles. Una sustitución (completa o parcial) de estos componentes básicos, por p. ej., esfingomielinas y ergosterol resultó ser posible. Para una encapsulación efectiva de los corticosteroides, preferiblemente los solubles en agua, en las microvesículas, evitando de esta manera la pérdida del fármaco por las microvesículas, han resultado ser útiles especialmente los componentes fosfolipídicos que contienen cadenas acílicas saturadas rigidificantes. Los efectos beneficiosos observados después de una única inyección de los PEG-liposomas solubles en agua que contienen corticosteroides, según la invención, son muy favorables.

Además, una composición usada de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más componentes adicionales.

En este sentido, la presente invención también se refiere al uso de una composición según la invención, composición que comprende adicionalmente una heparina (un derivado). Preferiblemente, el derivado de heparina no afecta a la coagulación de la sangre.

En otra realización preferida, la composición que se ha de usar en la presente invención comprende adicionalmente un componente que facilita el suministro del corticosteroide al tumor, preferiblemente una heparina o un fragmento de heparina. Estos componentes que facilitan el suministro de los corticosteroides se encuentran descritos con más detalle en el documento US-A-5.762.918, documento que en lo que se refiere a la descripción de estos componentes, se incorpora aquí como referencia.

Las composiciones que se han de usar de acuerdo con la presente invención también pueden contener o comprender convenientemente al menos uno de los compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en agentes citostáticos y agentes citotóxicos, preferiblemente al menos uno de los componentes seleccionados entre el grupo que consiste en doxorrubicina y taxol.

\newpage

Por otra parte, se puede hacer un uso adecuado de las composiciones que comprenden al menos uno de los compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en inmunomoduladores e inmunosupresores. Ejemplos de estos componentes son metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, muramil-peptidos, citoquionas y penicilamina.

En un aspecto adicional, la presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas nuevas que comprenden una microvesícula de tiempo de circulación largo, un corticosteroide contenido en ella, y al menos uno de los compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en heparina y derivados de heparina.

Además, la presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden una microvesícula de tiempo de circulación largo y un corticosteroide contenido en ella, en el que el corticosteroide es tetrahidrocorticosterona.

En otro aspecto más, la presente invención se dirige a composiciones farmacéuticas que comprenden una microvesícula de tiempo de circulación largo, un corticosteroide contenido en ella y al menos uno de los agentes citostáticos o citotóxicos (diferente de un corticosteroide) seleccionados preferiblemente entre el grupo que consiste en antraciclinas (derivados), inhibidores de la topoisomerasa I y alcaloides de la vinca.

Sin desear estar obligado por ninguna teoría, se formula la hipótesis de que la apoptosis que se produce en el centro del tumor, por acción de los corticosteroides de las microvesículas, da lugar a una disminución de la salida de los agentes citostáticos hacia el exterior del tumor. Además, quizá la encapsulación anteriormente mencionada, hecha por tejido conjuntivo estimulado por los corticosteroides de las microvesículas, desempeñe también un papel.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una microvesícula de tiempo de circulación largo, en forma de un liposoma que comprende un lípido formador de vesículas no cargado, un 0% - 20% en moles de un lípido anfipático formador de vesículas, en forma de derivado con polietilenglicol, y un 0% - 10% en moles de un lípido formador de vesículas cargado negativamente, liposomas que tiene un diámetro medio de partícula seleccionado en el intervalo de tamaños entre aproximadamente 40 nm - 200 nm.

La presente invención se ilustrará ahora con más detalle por medio de los siguientes ejemplos no limitativos y de los dibujos, en los que:

Figura 1: Distribución en tejidos de liposomas marcados con ^{lll}In a las 24 h después de su administración intravenosa en ratones C57B1/6 que portan un tumor B16 o en ratones Balb/c que portan un tumor C26. Los tumores pesaron aproximadamente 1 g. Media \pm S.D., n = 5 animales/grupo experimental;

Fig 2: Efecto de la dosis de PLP libre o de PLP liposómico sobre el crecimiento tumoral, en ratones que portan B16 o C26. Los ratones recibieron una inyección única de la dosis indicada y de la formulación de PLP en el día en el que los tumores se hicieron palpables. Se informa sobre el volumen del tumor una semana más tarde. Media \pm S.D. N = 5 ratones/grupo experimental;

Fig 3: Efecto del tamaño del tumor sobre los efectos antitumorales de PLP libre o PLP liposómico en ratones portadores de B16 o C26. Los ratones recibieron o una inyección única o inyecciones múltiples, de una dosis de PLP de las formulaciones indicadas de 20 mg/kg. Las flechas indican el tratamiento. Se informa sobre Media \pm S.D.
N = 5 ratones/grupo experimental; y

Fig 4: Imágenes al microscopio de tejido tumoral 1 semana después de un tratamiento con una dosis de PLP liposómico de 20 mg/kg. Los ratones recibieron una inyección única de PLP liposómico en el día 7 después de la inoculación de las células tumorales.

A: Las flechas indican la ocurrencia de una apoptosis masiva en el centro del tumor.

Los asteriscos señalan los vasos sanguíneos;

B: Ampliación de A. La flecha señala una obstrucción de vasos sanguíneos.

Ejemplos Materiales y métodos Preparación de liposomas

Se prepararon liposomas de tiempo de circulación largo disolviendo dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) (del inglés, " Dipalmitoylphosphatidylcholine") (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemania), colesterol (Chol) (Sigma, St. Louis, EE. UU.) y polietilenglicol 2000-diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) (DSPE, del inglés, " Distearoylphos-phatidylethanolamine") (Lipoid GmbH), en una relación molar de 1,85:1,0:0,15 respectivamente, en cloroformo:meta-
nol (2:1, v:v) en un matraz de fondo redondo. Se usaron típicamente tamaños de los lotes de 1.000 - 2.000 \mumoles de lípidos totales. En el caso de la formulación de liposomas de tiempo de circulación corto, el PEG-DSPE se reemplazó por la cantidad correspondiente de fosfatidilglicerol de huevo (EPG) (del inglés, " Egg Phos-phatidylglycerol") (Lipoid GmbH). Se preparó una película lipídica a presión reducida en un evaporador rotatorio y se secó en una corriente de nitrógeno. Los liposomas se formaron por adición de una disolución acuosa de una concentración de 100 mg/ml de fosfato disódico de prednisolona (PLP) (del inglés, " Prednisolone disodium phosphate") (BUFA B. V. Uitgeest, Países Bajos). El derivado fosfato de prednisolona soluble en agua se usó para garantizar la encapsulación estable en los liposomas. En el caso del marcaje de los liposomas con ^{lll}In-oxina (Mallinckrodt Medical, Petten, Países Bajos), los liposomas se formaron por adición de un tampón de DTPA 5 mM/Hepes 10 mM/NaCl 135 mM, pH 7, a la película lipídica, según un procedimiento descrito por Boerman y col., en J. Nucl. Med. 36 (9) (1995), 1639-44. El tamaño de los liposomas se redujo mediante múltiples etapas de extrusión a través de membranas de policarbonato (Nuclepore, Pleasanton, EE. UU.) con un tamaño de poro final de 50 nm. El poro fue de 400 mm en la preparación de los liposomas de tiempo de circulación corto. El material no encapsulado se retiró mediante diálisis con cambio repetido del tampón, frente a tampón de Hepes 10 mM/NaCl 135 mM, pH 7, a 4ºC.

El tamaño medio de partícula de los liposomas de tiempo de circulación largo se determinó que era de 0,1 \mum mediante dispersión dinámica de la luz, con un valor de polidispersidad de \sim0,1, mientras que los liposomas de tiempo de circulación corto tuvieron un tamaño de partícula de 0,5 \mum y una polidispersidad de \sim0,2. El valor de polidispersidad varía entre 0 y 1. Un valor de 1 es indicativo de grandes variaciones en el tamaño de partícula, mientras que un valor de 0 es indicativo de un sistema monodisperso perfecto. Por lo tanto, las presentes preparaciones mostraron una variación limitada del tamaño de partícula. La cantidad de lípido en la dispersión de liposomas se determinó mediante una determinación colorimétrica de fosfato según Rouser (Lipids 5 (1970), 494-496).

La concentración de PLP en los liposomas se determinó mediante HPLC. El PLP se extrajo con acetato de etilo y se concentró en presencia de una corriente de nitrógeno. Las muestras se diluyeron en un volumen adecuado de etanol:agua (1:1, mol:mol) y 100 \mul de muestra o de un estándar se inyectaron en un sistema de RP-HPLC equipado con una columna 100 RP-18 (5 \mum, 125 mm x 4 mm). Acetonitrilo:agua (75%:25%, v:v), pH 2. El cálculo se realizó usando el programa informático Millenium (Waters Associates Inc.). Los liposomas contuvieron 25 \mug - 35 \mug de PLP/\mumol de lípido.

Células

Células B16 de melanoma murino y células C26 de carcinoma de colon murino se cultivaron a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%, en medio DMEM (Gibco, Breda, Países Bajos) que contenía suero de ternera fetal al 10% (v/v) complementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 IU/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y anfotericina B (Gibco) 0,25 \mug/ml.

Animales

Se obtuvieron ratones macho Balb/c y C57B1/6 (de 6 - 8 semanas de edad) procedentes de Charles River, se encerraron en jaulas estándar, con comida estándar para roedores y agua disponible ad libitum, y con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los experimentos se llevaron a cabo conforme a las regulaciones nacionales y fueron aprobados por el comité ético local sobre experimentación animal.

Distribución tisular de PEG-liposomas marcados con ^{lll}In en ratones portadores de tumor

Se inocularon 1 x 10^{5} células B16 o células C26 por vía subcutánea en el costado de ratones C57B1/6 o de ratones Balb/c respectivamente. Al alcanzar un volumen de tumor de aproximadamente 1 cm^{3}, se inyectó a los ratones por vía i.v. 25 \mumoles de lípido/kg (que corresponden a 30 x 10^{6} cpm/ratón) de liposomas marcados con ^{lll}In. A las 6 h y 24 h después de la inyección los animales se sacrificaron, se extrajo una muestra de sangre, y el tumor, pulmón, hígado, bazo y riñones se diseccionaron, se pesaron y se hizo un recuento de la radioactividad. Véase en este sentido la Figura 1 en relación con los resultados.

Inhibición del crecimiento tumoral Efecto de la dosis

Los ratones recibieron una única inyección intravenosa de una dosis indicada de PLP libre o de PLP liposómico en el momento en el que el tumor se hizo palpable. Siete días después del tratamiento, se midió el tamaño de los tumores y se calculó el volumen de los tumores conforme a la ecuación V = 0,52 x a^{2} x b, en la que a es el diámetro superficial más pequeño y b es el diámetro superficial más grande.

Efecto del tamaño de los tumores

PLP libre o PLP liposómico se administró por vía i.v. en una dosis de 20 mg/kg en los días 1, 7 y 14, o mediante una única inyección en el día 7 o en el día 14, después de la inoculación de las células tumorales. Como referencia, los tumores B16F10 se hicieron palpables alrededor de los 7 días y los tumores C26 se hicieron palpables alrededor de los 11 días después de la inoculación de las células tumorales. El tamaño de los tumores se midió con regularidad y el volumen de los tumores se calculó según se ha descrito anteriormente.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante el ANOVA de un factor, con la prueba a posteriori de Dunnett, usando el programa GraphPad InStat versión 3.05 para Windows, GraphPad Software (San Diego, EE. UU). Los datos se transformaron logarítmicamente para corregir las diferencias significativas entre las S.D. de los grupos, cuando convino, según la prueba de Bartlett. El coeficiente de correlación de los rangos de Spearman se calculó para identificar la respuesta frente a la dosis.

Resultados Distribución en tejidos de liposomas de tiempo de circulación largo

La distribución en tejidos de liposomas de tiempo de circulación largo después de una inyección i.v. en ratones portadores de tumores C26 o B16 se muestra en la figura 1. El 15% de la dosis inyectada de liposomas marcados radiactivamente estaba aún presente en la circulación en ambos modelos de ratones, 24 h después de la inyección.

Aproximadamente el 7% - 10% de la dosis inyectada pudo recuperarse del tejido tumoral tanto en el modelo C26 como en el modelo B16F10. Aproximadamente la misma cantidad estaba presente en los hígados de los dos grupos experimentales. Se recuperaron cantidades relativamente bajas de liposomas en bazo, riñón y pulmón en las dos cepas de ratones.

Efecto de la dosis de PLP libre o PLP liposómico sobre el crecimiento tumoral

Para comparar el efecto de diferentes dosis de PLP libre o PLP liposómico sobre el crecimiento de los tumores, los ratones portadores del tumor B16 o del tumor C26 recibieron una inyección única de una de las dos formulaciones en el momento en el que el tumor se hizo palpable. Una semana después de la inyección, el volumen de los tumores fue más pequeño cuando se usó una dosis creciente de PLP liposómico en los dos modelos de ratones (B16: coeficiente de correlación de Spearman r = -0,92 (p < 0,001); C26 coeficiente de correlación de Spearman r = -0,82 (p < 0,01)). La dosis de PLP de 20 mg/kg fue la dosis máxima que se pudo administrar en el caso de la formulación liposómica a la vista del volumen de inyección.

El tratamiento de los ratones portadores del tumor B16 o del tumor C26 con una dosis de PLP libre de 20 mg/kg o 50 mg/kg no produjo volúmenes de tumor significativamente diferentes, comparados con los animales de control tratados con tampón. Véase en este sentido la Figura 2 que muestra los resultados.

Efecto del tamaño de los tumores

Para determinar el efecto del momento de la inyección del PLP libre o del PLP liposómico sobre la inhibición del crecimiento tumoral, las formulaciones se inyectaron en una dosis de 20 mg/kg en los días 1, 7 y 14, o mediante una inyección única en el día 7 o en el día 14. Véase en este sentido la Figura 3 que muestra los resultados.

Modelo de B16

Ni el PLP liposómico ni el PLP libre inhibieron el crecimiento tumoral en ratones portadores del tumor B16 entre el día 1 y el día 7. Los tumores se hicieron palpables justo en ese momento en todos los grupos.

Entre el día 7 y el día 14, después de una segunda inyección en el día 7, el PLP liposómico produjo una inhibición del crecimiento tumoral del 92% en comparación con los controles (p < 0,05), mientras que el PLP libre no redujo el volumen de los tumores. En el día 14, los ratones recibieron una tercera inyección. En el día 17 algunos de los ratones del grupo que recibió PLP libre y del grupo de control, tuvieron que ser sacrificados selectivamente debido al gran tamaño de sus tumores (>2 cm^{3}), mientras que el volumen medio de los tumores en el grupo que recibió PLP liposómico fue aproximadamente un 79% menor (p < 0,01).

Después de una inyección única de PLP liposómico o de PLP libre en el día 7, un volumen de tumor significativamente más pequeño se observó solamente después del tratamiento con PLP liposómico, con una inhibición media del crecimiento tumoral del 89% en el día 14 y del 67% en el día 17 en comparación con los controles (p < 0,05, en ambos momentos). Una inyección única en el día 14 mostró una imagen similar y en el día 17 los tumores tratados con PLP liposómico fueron el 58% más pequeños que los controles (p < 0,05).

Modelo C26

Ni el PLP liposómico ni el PLP libre inhibieron el crecimiento tumoral en ratones portadores del tumor C26 entre el día 1 y el día 7. Los ratones recibieron una segunda inyección en el día 7. Los tumores se hicieron palpables alrededor del día 10. Tanto en el día 14 como en el día 21, el volumen medio de los tumores de los animales tratados con PLP liposómico fue el 89% más pequeño que el de los controles, pero fue sólo significativamente más pequeño en el día 21 (p < 0,01). El PLP libre no inhibió el crecimiento tumoral. Después de una inyección única de PLP liposómico o de PLP libre en el día 7, el volumen de los tumores no fue significativamente más pequeño con ninguno de los dos tratamientos en comparación con los controles. Aunque el volumen medio de los tumores fue del 66% en el día 14 y del 67% en el día 21, fue menor en los ratones tratados con PLP liposómico en comparación con los controles. Una inyección única en el día 14 produjo un volumen de los tumores el 78% más pequeño en el día 21, en los animales tratados con PLP liposómico (p < 0,05).

Efecto del tiempo de circulación de los liposomas

Para determinar si la formulación liposómica tiene importancia en la eficacia terapéutica, se ensayaron una formulación liposómica de PLP de tiempo de circulación corto y una formulación liposómica de PLP de tiempo de circulación largo. Ambas formulaciones se inyectaron en el día 14 después de la inoculación de las células tumorales en los ratones portadores del tumor C26. Resultó que la inhibición sobre el tumor de los liposomas de tiempo de circulación corto no fue tan pronunciada y duró menos que la de los liposomas de tiempo de circulación largo, y no fue significativamente diferente de la de los animales tratados con disolución salina.

Análisis de la cantidad de PLP o de PL en tejidos

Las concentraciones de PLP y prednisolona (PL) a las 24 h después de una inyección de PLP liposómico, en hígado, bazo y tejido tumoral, se determinaron mediante análisis por HPLC. La Figura 4 muestra que la cantidad más alta de PLP (\pm 5 \mug) estaba presente en el tumor, cantidad que fue similar a presente en forma de PL. Los niveles de PLP o PL en el bazo fueron relativamente bajos. En tejido hepático apenas se pudo detectar PLP, pero se encontró una cantidad elevada de PL. Ya que tampoco se detectó el PLP añadido a un tejido hepático de control para preparar la línea estándar, el contenido en PL de este tejido probablemente se ha sobrestimado como resultado de la elevada actividad enzimática existente en los homogeneizados de hígado. No se detectaron ni PLP ni PL en ninguno de estos tejidos a las 24 horas de la inyección de PLP libre.

La evaluación al microscopio del tejido tumoral tratado con PLP liposómico, 1 semana después de una dosis única de 20 mg/kg, mostró una apoptosis masiva de las células tumorales en el centro del tumor. Además, se muestra la presencia de coágulos de sangre en vasos sanguíneos mayores que obstruyen el flujo de sangre al tumor. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Claims (14)

1. Uso de una composición que comprende un corticosteroide encapsulado en una microvesícula de tiempo de circulación largo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores sólidos primarios y/o secundarios de un cáncer no linfático.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la microvesícula es un liposoma, una nanocápsula o una micela polimérica, microvesícula que tiene una carga neutra o negativa en condiciones fisiológicas.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que las microvesículas son liposomas que comprenden un lípido formador de vesículas no cargado, un 0% - 20% en moles de un lípido anfipático formador de vesículas, en forma de derivado con polietilenglicol, un 0% - 50% en moles de un esterol y un 0% - 10% en moles de un lípido formador de vesículas cargado negativamente, liposomas que tienen un diámetro medio de partícula seleccionado en el intervalo de tamaños entre aproximadamente 40 nm - 200 nm.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que la microvesícula tiene una semivida en circulación de al menos 6 horas.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento es un medicamento para aplicación parenteral o para aplicación local.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende al menos uno de los agentes que afectan a la cascada de coagulación de la sangre.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende adicionalmente un componente que interacciona con el corticosteroide sobre el tumor, preferiblemente una heparina o un fragmento de heparina.

8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende al menos uno de los compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en agentes citostáticos y agentes citotóxicos, comprendiendo preferiblemente al menos uno de los compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en antraciclinas, doxorrubicina, taxol, inhibidores de la topoisomerasa I y alcaloides de la vinca.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende al menos uno de los componentes seleccionados entre el grupo que consiste en inmunomoduladores e inmunosupresores.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el corticosteroide es un corticosteroide soluble en agua y preferiblemente un corticosteroide angiostático, más preferiblemente tetrahidrocorticosterona o uno de sus análogos funcionales.

11. Una composición farmacéutica que comprende una microvesícula de tiempo de circulación largo, un corticosteroide contenido en ella y al menos uno de los compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en heparina y derivados de heparina.

12. Una composición farmacéutica que comprende una microvesícula de tiempo de circulación largo y un corticosteroide soluble en agua contenido en ella, en la que el corticosteroide es tetrahidrocorticosterona.

13. Una composición farmacéutica que comprende una microvesícula de tiempo de circulación largo, un corticosteroide contenido en ella y al menos uno de los agentes citostáticos y/o citotóxicos (distintos de un corticosteroide) seleccionados entre el grupo que consiste en doxorrubicina y taxol.

14. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 11 - 13, en la que la microvesícula de tiempo de circulación largo es un liposoma que comprende un lípido formador de vesículas no cargado, un 0% - 20% en moles de un conjugado polímero-lípido y un 0% - 10% en moles de un lípido formador de vesículas cargado negativamente, liposomas que tienen un diámetro medio de partícula seleccionado en el intervalo de tamaños entre aproximadamente 40 nm - 200 nm.