ES2300808T3 - Procedimiento para la evolucion in vitro de polipeptidos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la fabricación y asignación de ácidos nucleicos y de los polipéptidos codificados de este modo, que comprende las etapas siguientes: a) la compartimentación de ácidos nucleicos junto con una mezcla de transcripción-traducción in vitro en una emulsión de agua en aceite, b) la expresión in vitro de los polipéptidos de fusión codificados por los ácidos nucleicos en los microcompartimentos de la emulsión de agua en aceite, siendo unido cada ácido nucleico al polipéptido de fusión para el cual codifica, comprendiendo los polipéptidos de fusión en cada caso por lo menos una porción de péptido I constante y por lo menos una porción de péptido II variable y siendo los polipéptidos de fusión enlazados de forma covalente en la etapa b), a través de la porción de péptido I, con el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión, y siendo el número de polipéptidos de fusión enlazados de este modo por ácido nucleico un número entero que se puede definir.

Description

Procedimiento para la evolución in vitro de polipéptidos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la fabricación y asignación de ácidos nucleicos y a los polipéptidos codificados de este modo, que se pueda utilizar para la selección evolutiva de polipéptidos in vitro. El procedimiento según la invención hace posible no sólo la asignación de ácidos nucleicos a los polipéptidos codificados por ellos sino, además, la selección y el aislamiento de ácidos nucleicos, los cuales codifican polipéptidos con propiedades seleccionadas. Además, la invención está orientada a la utilización de (citosina-5-)-metiltransferasas y a la utilización de polipéptidos de fusión o de complejos de polipéptido de fusión-ácido nucleico enlazados de forma covalente con ellas en el procedimiento según la invención.

La fabricación de polipéptidos con propiedades seleccionadas (propiedades de enlace específicas, propiedades específicas como por ejemplo catálisis, activación o inhibición de actividades biológicas) tiene un gran interés comercial. Los polipéptidos con estas propiedades deben ser identificados y aislados a partir de un gran número de variantes de polipéptido. Un procedimiento como éste supone, en último término, una imitación de la evolución natural. En una primera etapa, se fabrica por regla general un gran número de mutantes de polipéptido genéticamente distintos. En una segunda etapa estos mutantes de polipéptido se seleccionan de acuerdo con determinadas propiedades deseables. Este procedimiento para la fabricación de diversidad y la consiguiente selección selectiva se puede repetir tantas veces como se quiera. Al mismo tiempo debe poderse asignar sin embargo la información genética (genotipo) al polipéptido (fenotipo), lo que se lleva a cabo generalmente mediante unión física de ambos entre sí.

En la actualidad, se conoce una serie de procedimientos para la selección de ácidos nucleicos codificadores de polipéptido. Estos procedimientos aprovechan diferentes estrategias, con el fin de unir físicamente entre sí el genotipo y el fenotipo de una biblioteca de polipéptido.

La tecnología denominada "Phage-Display" se utiliza con éxito para la selección de polipéptidos con propiedades de enlace determinadas (Compendio en Clackson T. y Wells J.A. (1994) In vitro selection from protein and peptide libraries. Trends Biotechnol. 12(5): 173-84). Ambos portan partículas de fago, los polipéptidos (fenotipo) sobre su superficie y la información genética (genotipo) en el interior. La unión física entre el ácido nucleico (ADN) y el producto genético (proteína) tiene lugar, durante la producción de la partícula de fago, en el interior de células bacterianas. Para ello se conocen tecnologías similares en las cuales los portadores del fenotipo y genotipo son, en lugar de partículas de fago, células de levadura (Yeast Display) o células bacterianas (Bacterial Cell Display). A estas tecnologías es común que, para la fabricación de bibliotecas de polipéptido, las moléculas de ADN codificadoras de variantes de polipéptido deban ser introducidas en células. La fabricación de grandes cantidades de ADN circular y su transformación en células es sin embargo muy compleja. Además, el tamaño de las bibliotecas de polipéptido está limitado. Únicamente con gran esfuerzo se pudieron fabricar bibliotecas con 10^{11} variantes de polipéptido. De forma rutinaria se clonan bibliotecas con 10^{8} a 10^{9} variantes de polipéptido.

En otro procedimiento para la selección evolutiva de polipéptidos se unen los polipéptidos que hay que seleccionar, mediante fusión con una proteína que enlaza ADN, el Lac Repressor, a los ácidos nucleicos codificadores (Cull M.G. et al. (1992) Screening for receptor ligands using large libraries of peptides linked to the C terminus of the lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(5): 1865-9). La proteína Repressor une los polipéptidos con los plásmidos codificadores mediante enlaces no covalentes a una secuencia Lac Operator sobre el plásmido. Para garantizar que los polipéptidos enlazan con los ácidos nucleicos que codifican para ellos, la reacción tiene lugar en el interior de células bacterianas. Mediante la unión in vitro de genotipo y fenotipo está limitado también en esta tecnología el tamaño de la biblioteca de polipéptido, dado que la fabricación de grandes cantidades de ADN circular y la transformación de estas en células es muy compleja. El enlace no covalente utilizado en la presente memoria de los ácidos nucleicos con los polipéptidos exige condiciones de reacción muy suaves durante el procedimiento de selección posterior. Por ello no se pueden seleccionar, condicionado por el enlace no covalente, polipéptidos con propiedades de enlace muy buenas (complejos de larga vida con cinética de disociación lenta (k_{off} bajo), dado que se disociarían durante los tiempos de incubación necesarios para selecciones de este tipo el ácido nucleico y el polipéptido.

En el denominado procedimiento "Ribosome Display" (o también Polysome Display) se unen polipéptidos sobre la superficie de ribosomas con los ácidos nucleicos que codifican para ellos (Roberts R.W. (1999) Totally in vitro protein selection using mRNA-protein fusions and ribosome display. Curr. Opin. Chem. Biol. 3(3): 268-73). La unión se produce cuando se para la traducción del ácido ribonucleico. El polipéptido que se forma queda unido, junto con el ARNm codificador, al ribosoma. Con este procedimiento se aislaron polipéptidos (por ejemplo péptidos, anticuerpos y anquirinas) que se unen específicamente a diferentes polipéptidos diana. El procedimiento tiene la ventaja de que tiene lugar completamente in vitro, con lo cual se pueden fabricar bibliotecas de polipéptidos más grandes (>10^{12}). Un inconveniente de la tecnología Ribosome Display es la necesidad de la selección de polipéptidos bajo determinadas condiciones (elevada concentración de sal, baja temperatura), para las cuales los complejos ARN/ribosoma/polipéptido son estables, las cuales no corresponden sin embargo necesariamente también a las condiciones del procedimiento de selección de polipéptido utilizado.

En otro procedimiento para la unión de fenotipo y genotipo se enlaza en primer lugar ARNm de forma covalente a puromicina, la cual es enlazada entonces al polipéptido codificado-ARNm. Durante el procedimiento, llamado "in vitro Virus", es traducido ARNm, que lleva un grupo puromicina en el extremo 3'. Cuando el ribosoma alcanza el extremo de la zona codificada (Open Reading Frame) del ARNm, el grupo puromicina es enlazado de forma covalente al polipéptido que se forma. Otra desventaja del procedimiento es que el genotipo está codificado por ARNm. Un ARNm puede ser desintegrado enzimáticamente por impurezas de ARNasa muy pequeñas. Se conocen diferentes procedimientos emparentados con el "in vitro Virus", en los cuales el ARN es sustituido, mediante procedimientos complejos, por ADN más estable (Roberts R.W. y Szostak JW. (1997) RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94(23): 12297-302: Patente US nº 6.281.344: Nucleic acid-protein fusion molecules and libraries).

Se propuso también un procedimiento para la unión in vitro de fenotipo y genotipo, el cual se basa en la propiedad de Nicking del iniciador de replicación del bacteriófago P2A de E. coli (FitzGerald. K. (1999) In vitro display technologies - new tools for drug discovery. Drug Discovery Today, Vol. 5, nº 6). El iniciador de replicación es una endonucleasa, la cual rompe la cadena del ADN y al mismo tiempo es unida, mediante un grupo tirosina, de forma covalente al extremo 5' del ADN. Dado que durante la producción bacteriana de proteínas la traducción tiene lugar ya durante la transcripción, la proteína de fusión P2A-polipéptido nueva formada entra en contacto con su ADN codificador. La actividad cis del enzima debe permitir el acoplamiento del genotipo y el fenotipo in vitro. Sin embargo, no se conoce ningún polipéptido cuyas propiedades hayan sido mejoradas mediante este procedimiento.

Otro procedimiento conocido para la unión in vitro del fenotipo y el genotipo se basa en la unión no covalente pero altamente afín de aptámeros-ARNm con proteínas Tat del HIV1 (Fujita S. et al. (2002) Novel approach for linking genotype to phenotype in vitro by exploiting an extremely strong interaction between RNA and protein. J Med. Chem. 45(8): 1598-606). La unión del genotipo y el fenotipo tiene lugar, como en el procedimiento "Ribosome Display" e "in vitro Virus", durante la traducción in vitro. El procedimiento tiene la desventaja de que existe el peligro de que los componentes se disocien. Además, el procedimiento se basa en el ARNm para la codificación del genotipo, el cual es susceptible de desintegración-ARNasa.

Un procedimiento similar se basa en la unión de conjugados streptavidina-polipéptido con el ácido nucleico biotinado que los codifica en microcompartimentos (Doi N. y Yanagawa H. (1999) STABLE: protein-DNA fusion system for screening of combinatorial protein libraries in vitro. FEBS Lett. 457(2): 227-30). Para garantizar la conjugación cis de genotipo y fenotipo, se transcriben y traducen en este procedimiento los conjugados streptavidina-polipéptido en compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite. Cada compartimento contiene a lo sumo un ácido nucleico. Tras la traducción de los conjugados streptavidina-polipéptido éstos se pueden unir al ADN codificador biotinado en el compartimento. Los conjugados polipéptido-ácido nucleico pueden ser extraídos a continuación de la emulsión y ser sometidos a un procedimiento de selección que se basa en las propiedades deseadas. Una limitación de este procedimiento es, sin embargo, la expresión ineficiente de streptavidina en la mezcla de transcripción/tra-
ducción.

Se conocen también otros procedimientos para el acoplamiento del genotipo y el fenotipo los cuales se basan también en la compartimentización de ADN junto con una mezcla de transcripción/traducción en una emulsión de agua en aceite (Sepp A. et al. (2002) Microbead display by in vitro compartmentalisation: selection for binding using flow cytometry. FEBS Lett. 532(3): 455-8; patente US nº 6.489.103: In vitro sorting method). En un procedimiento de este tipo se utilizaron bolitas como portadores de genotipo y fenotipo. Sobre cada bolita se fijó un fragmento de ADN codificador y un gran número de anticuerpos específicos de secuencia de péptido. El fragmento de ADN porta la información genética para una secuencia de péptido, la cual está fusionada con un polipéptido variable. Las bolitas son encerradas, en compartimentos separados de una emulsión de agua en aceite, junto con una mezcla de transcripción/traducción. Los conjugados polipéptido-péptido expresados son inmovilizados sobre las bolitas mediante unión a los anticuerpos. El procedimiento adolece del inconveniente de que también, en este caso se pueden disociar el genotipo y el fenotipo bajo las condiciones de contorno del procedimiento de selección. A causa de ello existe el peligro de un intercambio de conjugados polipéptido-péptido entre diferentes bolitas y, por consiguiente, el de una asignación errónea del genotipo y el fenotipo.

En otro procedimiento para el acoplamiento de genotipo y fenotipo in vitro se unen polipéptidos de fusión metilasa-polipéptido a ADN (patente US nº 5.856.090; DNA-methylase linking reaction). El ADN contiene la secuencia de reconocimiento de la metilasa 5'-GGCC-3', siendo sustituida la tercera base (citidina) por fluorodeoxicitidina (F). La nueva secuencia 5'-GGFC-3' sirve como inhibidor de suicido (también denominado "Mechanism based Inhibitor"). Las proteínas de fusión metilasa-polipéptido que reaccionan con esta secuencia quedan unidas de forma irreversible al ADN. Además, el ADN circular, el cual contiene la secuencia 5'-GGCC-3' y que al mismo tiempo porta el gen para un polipéptido de metilasa, se introduce en células bacterianas. Al medio de alimentación de estas células se le añade fluorodeoxicitidina la cual es incorporada en la secuencia 5'-GGCC-3' durante la replicación del plásmido. Las proteínas de fusión metilasa-polipéptido pueden enlazar de forma covalente al plásmido. El procedimiento adolece del inconveniente de que el número de proteínas de fusión metilasa, las cuales son enlazadas al plásmido, no se puede definir con precisión. Los mutantes de polipéptido que se expresan bien son inmovilizados en mayor número sobre el plásmido, lo que conduce a que un mutante de polipéptido que se exprese bien con propiedades de enlace medias a causa de efectos de avididad pueda superar, en el procedimiento de selección, a un mutante de polipéptido que enlace muy bien que se exprese peor. Además, a causa de la unión in vitro del genotipo y el fenotipo, el tamaño de la biblioteca de polipéptido está también limitado en esta tecnología.

La solicitud de patente internacional WO 98/37186 da a conocer un procedimiento para la fabricación de una biblioteca de expresión de proteínas, en el cual las proteínas están enlazadas de forma covalente con el ADN que las codifica. Los conjugados de proteína utilizados codifican para una zona que enlaza proteína-ADN (proteína A del fago P2; P2A) y una zona de display (la proteína que hay que investigar).

Del resumen de la publicación, mencionada en la solicitud de patente mencionada anteriormente, de Liu Y. y Haggard-Ljungquist E., Nucleic Acid Research, 22, pp. 5204-5210 (1994) hay que extraer sin embargo que la proteína A del fago P2 purificada utilizada para el enlace covalente del ADN no enlaza con ADN de doble cadena que contiene ori, sino únicamente con ADN de cadena sencilla que contiene ori, lo que pone de manifiesto que es necesaria una estructura de ADN especial y/o una proteína especial para hacer accesible el ori para la proteína A. Esta limitación se ha observado también para otras proteínas con idéntica función. En la parte experimental de esta publicación se establece concretamente que se forman cuerpos de inclusión de proteína A y que no se puede detectar ninguna proteína soluble. Esta proteína debería por ello ser desnaturalizada primero y a continuación plegada in vitro. La expresión de esta proteína en forma funcional es por ello muy ineficiente.

El documento WO 98/37186 mencionado más arriba llama además la atención acerca de que el P2A debe ser activado primero mediante ADNss. El sistema descrito en la presente memoria era tan ineficiente que el propio solicitante (Isogenica) valora en una solicitud posterior (WO 04 022 746) la solicitud precedente del modo siguiente:

\quad

``Otro procedimiento de la técnica anterior, la tecnología de representación covalente o CDT se describe en el documento WO98/37186. Este procedimiento se basa en el enlace covalente de la proteína a ADN para retener el enlace del genotipo al fenotipo a través de una acción cis dela proteína de reticulación. Este procedimiento enseña que son necesarios dos requisitos para utilizar con éxito esta técnica. En primer lugar, las proteínas son necesarias para interactuar in vitro con la secuencia de ADN que las codifica (acción cis), y en segundo lugar, dichas proteínas deben establecer un enlace covalente con su propia muestra de ADN. Este procedimiento adolece del inconveniente de que el ADN se modifica químicamente y esto puede evitar la recuperación e identificación del péptido de unión de interés.

\quad

Existe la necesidad de obtener procedimientos in vitro de construcción de bibliotecas de péptidos más versátiles además de los procedimientos descritos anteriormente, que pueden permitir la selección directa de la actividad de unión, así como la actividad enzimática, y que permiten la producción eficaz de estructuras de péptidos complejas, al tiempo que también permiten la recuperación de material genético intacto que codifica el péptido de interés''.

Por lo tanto, hay que establecer que un enlace covalente del genotipo y el fenotipo no tenía ninguna aplicación práctica, condicionado por deficiencias del sistema.

Para un enlace de polipéptidos con el ADN que los codifica hay que tener en cuenta, por lo tanto, que la unión al ADN es específica, y que se enlaza un número definido de moléculas de polipéptido por molécula de ADN. Esto último es importante ya que en el transcurso de procedimientos de selección el número de polipéptidos, que están enlazados a una molécula de ADN, puede ser decisivo para el resultado del experimento. Si se seleccionan, por ejemplo proteínas que enlazan específicamente, un efecto de avididad puede conducir a que sean seleccionados los polipéptidos con una menor afinidad, debido a que están enlazados varios polipéptidos a una molécula de ADN. Esto es deseable en raras ocasiones, cuando es difícil obtener proteínas enlazantes respecto de una molécula determinada. En este caso se intenta seleccionar en primer lugar proteínas enlazantes con una afinidad baja para a continuación, partiendo de estas, fabricar proteína altamente afín. La selección de anticuerpos mediante la tecnología Phage Display ha demostrado que es muy difícil seleccionar anticuerpos con alta afinidad, cuando se encuentra más de un anticuerpo sobre la superficie del fago (Winter G. et al. (1994) Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12: 433-55).

Por lo tanto, la presente invención se plantea el problema de proporcionar un procedimiento el cual no adolezca de los inconvenientes del estado de la técnica. En especial debe poder controlarse, en un procedimiento de este tipo, el número de polipéptidos los cuales son enlazados por moléculas de ADN. De este modo se puede evitar por ejemplo un efecto de avididad. El procedimiento debe ser más rápido y eficiente, por ejemplo tener tiempos de incubación cortos y evitar ciclos celulares que requieren mucho tiempo. Otro problema consiste en proporcionar una unión entre genotipo y fenotipo la cual sea suficientemente robusta para llevar a cabo procedimientos de selección bajo muchas y, frecuentemente también, duras condiciones de contorno.

Además, la presente invención se plantea el problema de proporcionar un procedimiento con el cual se puedan seleccionar, de manera eficiente, no complicada y rápida, ácidos nucleicos de acuerdo con las propiedades de la proteína codificada. Preferentemente, con este procedimiento se puede no sólo seleccionar un ácido nucleico según las propiedades de proteína codificadas sino que, mediante modificación y optimización, en ciclos individuales o múltiples del procedimiento, se puede optimizar evolutivamente.

Los problemas que se plantea la invención se resuelven mediante el procedimiento según la reivindicación 1.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la fabricación y asignación de ácidos nucleicos y los polipéptidos codificados por ellos, el cual comprende las etapas siguientes:

a)

la compartimentación de ácidos nucleicos junto con una mezcla de transcripción-traducción in vitro en una emulsión de agua en aceite,

b)

la expresión in vitro de los polipéptidos de fusión codificados por los ácidos nucleicos en los microcompartimentos de la emulsión de agua en aceite, siendo unido cada ácido nucleico al polipéptido de fusión para el cual codifica,

comprendiendo los polipéptidos de fusión en cada caso por lo menos una porción de péptido I constante y por lo menos una porción de péptido II variable y siendo los polipéptidos de fusión enlazados de forma covalente en la etapa b), a través de la porción de péptido I, con el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión, y siendo el número de polipéptidos de fusión enlazados de este modo por ácido nucleico un número entero que se puede definir.

Este procedimiento posibilita la asignación y fabricación de ácidos nucleicos con los polipéptidos codificados por ellos. Una unión de este tipo del genotipo y el fenotipo es imprescindible para procedimientos de selección en el caso de grandes cantidades de ácidos nucleicos basados en las propiedades de la proteína codificada por ellos, dado que de lo contrario cada ácido nucleico y/o cada proteína debe ser almacenada y utilizada individualmente en un reci-
piente.

Se descubrió sorprendentemente que el enlace covalente, utilizado en este procedimiento in vitro, conecta el genotipo (ácido nucleico) y el fenotipo (la proteína) de forma estable entre sí y permite un control preciso de la relación entre la proteína y el ácido nucleico.

La expresión "número entero que se puede definir", tal como se utiliza en relación con la presente invención, significa que la secuencia o estructura del ácido nucleico define, mediante el número de secuencias de reconocimiento para proteínas que ligan ácidos nucleicos, en el interior el número preciso de los polipéptidos de fusión que se enlazarán a ella, es decir, los predetermina.

Condición previa para el procedimiento según la invención es que el ácido nucleico codifique para un polipéptido de fusión, el cual comprende en cada caso por lo menos una porción de péptido I constante, la cual enlaza con el ácido nucleico que codifica en péptido de fusión, y que en cada caso comprenda por lo menos una porción de péptido II variable, la cual es utilizada en procedimientos de selección adecuados para la selección de los ácidos nucleicos buscados.

El enlace covalente entre el ácido nucleico y el polipéptido garantiza, durante la selección de los polipéptidos, la estabilidad del complejo bajo condiciones de contorno, parcialmente, duras sin que el enlace entre ácido nucleico y polipéptido se vea lesionado.

En una forma de realización preferida el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de la extracción de la emulsión de agua en aceite de los complejos polipéptido de fusión-ácido nucleico fabricado en la etapa b).

Mediante la extracción de los complejos polipéptido de fusión-ácido nucleico de la emulsión de agua en aceite se pueden preparar los complejos para las etapas siguientes, por ejemplo procesos de elección/selección. También se pueden utilizar otros procedimientos de purificación y/o aislamiento familiares para el experto en la materia en este campo.

En otra forma de realización preferida el procedimiento según la invención comprende adicionalmente la etapa de la selección de aquellos complejos polipéptido de fusión-ácido nucleico cuya porción variable de polipéptido de fusión presenta propiedades deseadas. Estas propiedades pueden ser un enlace específico a otras moléculas. por ejemplo proteínas, péptidos, metales, polímeros, etc. o también determinadas funciones biológicas tales como un efecto catalítico o la activación o inhibición de otras moléculas o sistemas biológicos, por ejemplo sistemas libres de células y sistemas de células o también sistemas de tejidos. La totalidad del procedimiento según la invención se lleva a cabo preferentemente in vitro. La etapa de selección puede incluir sin embargo también la utilización por ejemplo de células y tejidos. El experto en la materia dispone como procedimientos de selección de todos los procedimientos conocidos en este sector para la selección de proteínas, los cuales se pueden adaptar en cada caso de forma rutinaria a las particularidades en su caso del complejo ADN-polipéptido de fusión correspondiente. La única condición previa para procedimientos de selección de este tipo es que no se vea afectado, es decir modificado o destruido, ni el polipéptido de fusión ni el ADN o el enlace entre ambos. Como procedimiento de selección se pueden utilizar procedimientos de Screening típicos, en los cuales se analiza un gran número de sustancias de forma simultánea como una totalidad, aunque también procedimientos de selección, en los cuales el resultado se determina individualmente para cada sustancia analizada (en este caso complejos ADN-proteína). Como procedimiento de selección se puede utilizar uno o varios, iguales o distintos, de forma paralela o uno tras otro. Las formas de realización a título de ejemplo de procedimientos de selección se muestran en los ejemplos.

Otra forma de realización de procedimiento según la invención comprende, en su caso, tras una etapa de extracción precedente, la amplificación de las moléculas de ácido nucleico seleccionadas. Mediante la amplificación se separa de nuevo el genotipo seleccionado del fenotipo. Los ácidos nucleicos amplificados se puede utilizar ahora para la fabricación de las proteínas y péptidos codificadores o recorrer de nuevo también un procedimiento según la invención, por ejemplo con uno o varios otros procedimientos de selección, con el fin de hacer de este modo una selección secundaria.

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En una forma de realización especialmente preferida el procedimiento según la invención comprende adicionalmente la etapa de la mutación casual u orientada de los ácidos nucleicos resultantes del procedimiento. Por mutación debe entenderse por ejemplo la sustitución, el borrado, la modificación química o la introducción de uno o varios nucleótidos durante o tras la amplificación de la etapa e). Una mutación casual u orientada permite introducir el ácido nucleico, seleccionado ya con respecto a propiedades modificadas, de nuevo en el procedimiento según la invención y, por consiguiente, optimizarlo mediante el mismo o diferentes procedimientos de selección. De esta manera se puede continuar optimizando según la invención, por ejemplo, un ácido nucleico cuyo producto de proteína se ha elegido ya como específicamente enlazante. El experto en la materia puede optimizar, con el procedimiento según la invención, ácidos nucleicos o sus productos de polipéptido con vistas a una acción de activación, inhibición o
catalización.

En otra forma de realización preferida el procedimiento según la invención comprende la etapa de la repetición una o varias veces de uno de los procedimientos anteriores con el mismo procedimiento de selección o diferentes procedimientos de selección para la optimización de los ácidos nucleicos seleccionados, en su caso tras mutación simple o múltiple de los ácidos nucleicos.

Preferentemente, los ácidos nucleicos utilizados en el procedimiento según la invención son ARNr, ARNm o ADN de doble cadena. Son especialmente preferidos los ácidos nucleicos ADN y preferidos de forma muy especial los ADN lineales, debido a que estos se pueden fabricar de forma especialmente rápida y sencilla mediante Polymerase Chain Reaction.

En otra forma de realización preferida los ácidos nucleicos utilizados en el procedimiento según la invención son ácidos nucleicos modificados químicamente, en especial ADN modificado químicamente. El ADN modificado químicamente es aquel que contiene otros nucleótidos diferentes a los usuales y/o elementos constituyentes químicos adicionales diferentes a las cuatro bases A, T, G y C presentes de forma natural. Las modificaciones de este tipo pueden ser útiles por ejemplo para el enlace covalente a la porción de péptido I constante del polipéptido de fusión codificado. Si la modificación no puede ser introducida mediante amplificación usual se puede introducir, por ejemplo, la(s) modificación(ones) directamente antes de la etapa de compartimentación a) o en la etapa de amplificación e) con la ayuda de Primers correspondientemente modificados. Otros procedimientos químicos para la introducción de modificaciones en ácidos nucleicos son conocidos por el experto en la materia y pueden encontrar utilización en la presente invención.

Preferentemente, cada microcompartimento de emulsión de agua en aceite utilizado en el procedimiento según la invención comprende no más de un ácido nucleico. De este modo se puede asegurar que la asignación de un ácido nucleico al polipéptido codificado por él, es decir el enlace de ambos, no conduce a informaciones falsas durante el procedimiento de selección.

Una asignación de este tipo se asegura, en microcompartimentos fabricados a partir de emulsión de agua en aceite, generalmente mediante los que tienen un diámetro medio de 1 \mum a 2 \mum, representando los microcompartimentos de este tamaño formas de realización preferidas de la presente invención.

En el procedimiento según la invención está conectada en cada caso preferentemente de forma covalente una porción de péptido I constante con una molécula de ácido nucleico. Esta relación 1:1 impide efectos de avididad, fallos y en especial un impedimento estérico de la porción de proteína durante procesos de selección en los cuales la selección depende también de la accesibilidad de las zonas que median en la selección.

En una forma de realización preferida la porción de péptido I constante del polipéptido de fusión es una (citosina-5)-metiltransferasa.

Se ha demostrado sorprendentemente que las metiltransferasas se enlazan in vitro con gran estabilidad a ácidos nucleicos y que, además, se puede transcribir y traducir fácilmente in vitro. El enlace ADN de estas uniones resiste también bajo las duras condiciones experimentales de la mayoría de los procedimientos de selección para proteínas. Sorprendente es también su utilización para ADN lineal. Hasta ahora se han utilizado metiltransferasas únicamente in vitro en células, con el fin de unirse a plásmidos circulares.

Las (citosina-5)-metilasas de ADN están presentes tanto en organismos procariotas como eucariotas. Las secuencias de aminoácido de los miembros de la familia de las (citosina-5)-metiltransferasas procariotas presentan un grado elevado de homología. Esta homología aparece con mayor fuerza en 10 regiones conservadas de esta proteína. Todas las (citosina-5)-metiltransferasas transmiten un grupo metilo del cofactor S-adenosilmetionina a la posición 5 de una citosina en el ADN.

Preferentemente, el grupo metilo se selecciona de entre el grupo de metiltransferasas, el cual comprende M.Hae III, M.Hha I, M.Hpa I, M.Msp I y Alu I.

A continuación, se muestran las metiltransferasas preferidas mencionadas más arriba y su secuencia de reconocimiento ADN.

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M. Hae III	Haemophilus aegypticus	5'-GGCC-3'
M. Hha I	Haemophilus haemolyticus	5'-GCGC-3'
M. Hpa I	Haemophilus parainfluenzae	5'-CCGG-3'
M. Msp I	Moraxella species	5'-CCGG-3'
Alu I	Arthrobacter luteus	5'-AGCT-3'

Otras metilasas que se pueden utilizar según la invención son conocidas por el experto en la materia, o se pueden encontrar con facilidad (por ejemplo en el catálogo de New England Biolabs, los cuales comercializan enzimas purificados).

Junto a las metilasas mencionadas con anterioridad, se pueden utilizar según la invención también otras proteínas o péptidos conocidos por el experto en la materia, con el fin de enlazar ADN de forma covalente. Preferentemente se trata de proteínas terminales.

De fagos de Streptomyces pneumoniae y E. coli (Bsp. Phi29, Cp-1 y PRD1) se conocen, por ejemplo, proteínas que enlazan de forma covalente con ADN. Otras proteínas de este tipo existen en virus, por ejemplo adenovirus, en plásmidos lineales (Bsp. S1, Kalilo) y también en bacterias (por ejemplo Streptomyces).

La proteína terminal (TP) del bacteriófago phi29 es la que se ha estudiado mejor. Se conecta al extremo 5' del ADN. Durante la replicación del genoma de phi29 se conecta el extremo de la cadena de ADN recién sintetizada con la proteína terminal (mecanismo de Protein Priming). Para ello se necesita sin embargo un complejo cuaternario de "TP-ADN antiguo", polimerasa de ADN phi29 y TP "nuevo". Este sistema no se puede practicar sin embargo en sistemas de expresión in vitro con reticulación directamente a continuación. Meijer, W.J.J., Horcajadas J.A., Salas M., phi29 familiy of phages, Microbiology and Molecular Biology Reviews (2001), p. 261-287.

Especialmente preferida para la realización del procedimiento según la invención es la metiltransferasa Hae III de Haemophilus aegypticus.

Se prefiere muy especialmente en este contexto la utilización de un ácido nucleico modificado, el cual comprende la secuencia 5'-GGFC-3', siendo F 5-fluorodeoxicitidina, como secuencia de reconocimiento de la metiltransferasa.

Otro aspecto de la invención se refiere a la utilización de reactivos preferidos para la realización del procedimiento según la invención.

Una forma de realización preferida es al mismo tiempo la utilización de por lo menos una (citosina-5)-metiltransferasa en un procedimiento según la invención.

Otra forma de realización preferida es al mismo tiempo la utilización de polipéptidos de fusión o de complejos ácido nucleico-polipéptido de fusión enlazados de forma covalente con ellos en un procedimiento según la invención, los cuales comprenden en cada caso por lo menos una porción de péptido I constante y por lo menos una porción de péptido II variable, siendo enlazados o estando enlazados de forma covalente los polipéptidos de fusión, a través de la porción de péptido I, con el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión y siendo el número de los polipéptidos de fusión enlazados de esta manera por ácido nucleico un número entero que se puede definir.

A continuación se explican, a título de ejemplo, a partir de las figuras, las etapas individuales del procedimiento de la presente invención.

En una primera etapa A en la Figura A se encierra una colección 1 de genes (biblioteca ADN 1) ligeramente diferentes entre sí junto con una suspensión, la cual hace posible la expresión de estos genes (solución de transcripción/traducción), en la fase de agua de una emulsión de agua en aceite 3A. Esto sucede preferentemente de tal manera que por cada compartimento de agua 3B existe como máximo un ácido nucleico (preferentemente una molécula de ADN lineal 2). Mediante los componentes de la solución de transcripción/traducción se expresa como polipéptido el gen existente en el compartimento de agua.

Los polipéptidos de fusión 5 fabricados de acuerdo con la invención comprenden las dos porciones de péptido I y II. La porción de péptido I 5A es un polipéptido, el cual puede reaccionar con un grupo químico existente en la molécula de ADN o con el propio ácido nucleico. Este grupo químico (estrella *, en la presente memoria en el extremo izquierdo del ADN 2) puede estar o bien dispuesto en la secuencia del ADN 2 o ser agregado en uno de los extremos del ADN 2. Mediante la reacción química se forma entre el polipéptido y la molécula de ADN un enlace covalente y con ello un complejo polipéptido-ADN 6. La porción péptido II 5B variable es un polipéptido, cuyas propiedades son determinadas por la etapa de selección según la invención. Mediante el procedimiento según la invención tiene lugar finalmente una evolución in vitro.

Los complejos de fusión ADN-polipéptido 6 son separados, una vez realizado el enlace, de la emulsión preferentemente mediante extracción (etapa B). Se obtiene de este modo una colección 4 de complejos ADN-polipéptido 6, en los cuales las moléculas de ADN 2 están enlazadas de forma covalente a los polipéptidos 5A/5B, siendo enlazada cada molécula de ácido nucleico 2 a aquel polipéptido de fusión 5 para el cual codifica.

Con la colección 4 de complejos de fusión ADN-polipéptido 6 se eligen, se someten a cribado o se seleccionan, en el procedimiento según la invención, polipéptidos con propiedades seleccionadas, es decir predeterminadas. (Etapa C). La selección de polipéptidos que enlazan específicamente tiene lugar, por ejemplo, mediante purificación de afinidad. Para ello se añade la colección 4 de complejos poliéptido-ADN 6 a una molécula diana 8 inmovilizada, contra la cual hay que encontrar un polipéptido 7 que enlace específicamente. Los complejos polipéptido-ADN que no enlazan son retirados por lavado.

A continuación (etapa D) se amplifica la información genética de los polipéptidos 7 enlazados mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) y se separan de esta manera del complejo. Mediante la amplificación se obtiene una nueva colección 9 de genes, con la cual se puede llevar a cabo otro complejo polipéptido-ADN y ciclo de selección (camino E). Tras un número suficiente de etapas de selección según la invención de este tipo, los fragmentos de ADN seleccionados se pueden o bien mutar de nuevo para otros ciclos o se pueden clonar para una caracterización mayor de los polipéptidos codificados (camino F).

Mediante el procedimiento según la invención se puede imitar en la probeta el proceso de evolución, la generación de diversidad, la supervivencia de los mejores mediante selección de variantes ventajosas, y multiplicación y generación de nueva diversidad. Las ventajas con respecto a tecnologías existentes comprenden por ejemplo:

a)

La totalidad del procedimiento tiene lugar in vitro, es decir, se evitará la transformación de células vivas, la cual es limitante para el tamaño de la Library.

b)

El complejo polipéptido-genotipo no contiene ventajosamente ARN. Por consiguiente, no tiene importancia alguna el peligro de una contaminación con ARNasa (al contrario que en otros métodos in vitro como Ribosome Display o ARNm Display).

c)

El procedimiento según la invención hace posible una fabricación sencilla de bibliotecas de ADN. Dado que hay que llevar a cabo únicamente PCR, no es necesaria ni una digestión de restricción, ni una ligación o una transformación de células. Gracias a ello resulta un fuerte acortamiento de la necesidad de tiempo para la fabricación de una biblioteca de ácido nucleico (pocos días en lugar de varias semanas). Por ello se pueden llevar a cabo varios ciclos de selección/evolución, uno tras otro y con una complejidad pequeña, en un tiempo relativamente corto.

d)

Se genera un enlace covalente entre polipéptido (fenotipo) y ADN (genotipo), el cual tiene la ventaja de que, tras la extracción realizada en su caso de los complejos de fusión polipéptido/ADN de la emulsión, está garantizada la estabilidad de los complejos.

e)

Preferentemente se enlaza por molécula de ácido nucleico únicamente un único polipéptido de fusión. Para un efecto de avididad mínimo y una sensibilidad aumentada se hace posible con ello la elección/selección de aglutinantes altamente afines (Display monovalente).

De acuerdo con la invención se utiliza para la compartimentación una emulsión de agua en aceite. Para ello se forman muchos compartimentos de agua pequeños, rodeados por aceite, los cuales sirven para conectar espacialmente un ácido nucleico/gen (preferentemente molécula de ADN) y sus productos genéticos. La compartimentación hace posible conectar el genotipo del gen con las propiedades seleccionadas del producto (ARN o polipéptido) codificado por él, es decir el fenotipo. La asignación espacial y limitación garantizan la asignación unívoca mediante el enlace covalente.

Durante la fabricación de la emulsión de agua en aceite hay que tener cuidado que la emulsión sea tan estable que los genes/ácidos nucleicos y sus productos genéticos (ARNm y polipéptidos) no se puedan difundir entre diferentes compartimentos produciéndose de este modo una asignación errónea. Los compartimentos de agua no deben por lo tanto fundirse entre sí. La emulsión de agua en aceite es estabilizada, preferentemente, mediante la adición de agentes tensioactivos (por ejemplo Span 80, Tween 80) a la fase de aceite (por ejemplo aceite mineral). De este modo se puede evitar una separación espontánea de la fase de agua y de aceite.

En la Figura 2 se representan esquemáticamente los procesos en el interior de un microcompartimento o compartimento de agua de una emulsión de agua en aceite. Por cada compartimento de agua se encuentra preferentemente como máximo una molécula de ADN 2 con por ejemplo un inhibidor de suicido (por ejemplo una secuencia de reconocimiento de (citosina-5)-metiltransferasa) o un grupo químico (símbolo de estrella). En una primera etapa (III, transcripción) se sintetiza ARNm 10, partiendo de la molécula de ADN 2 que se encuentra en el compartimento de agua, la cual se utiliza como molde para una segunda etapa (IV, traducción). De esta manera se expresa la proteína de fusión o polipéptido de fusión 5 (formada por los dominios 5A y 5B). Este polipéptido de fusión 5 reacciona con el inhibidor suicida (*) en o sobre la molécula de ADN (etapa V) y forma de este modo un complejo ADN-Polipéptido 6 (comp. la Fig. 1). Esta conexión de genotipo y fenotipo hace posible la elección/selección de los genes mediante propiedades del fenotipo. La amplificación que viene a continuación (en la presente memoria Polymerase Chain Reaction, PCR) de los genes seleccionados da lugar a una multiplicación de las moléculas de ADN determinadas en el procedimiento de selección. Si únicamente un polipéptido forma un enlace covalente con una molécula de ADN, la cual no codifica este polipéptido, entonces se pueden seleccionar moléculas de ADN las cuales no codifican para polipéptidos con propiedades escogidas. Por ello es importante, en el procedimiento según la invención para la evolución in vitro, que los polipéptidos sean acoplados con sus genes correspondientes.

El tamaño de los compartimentos de agua 3B es muy importante para garantizar de forma eficiente, por un lado, la expresión de los genes (patente US nº 6.489.103 B1, In vitro sorting Method) y, por el otro, el enlace de moléculas de ADN 2 con polipéptido de fusión 5 expresado. La eficiencia de enlace depende del tamaño del compartimento de agua, debido a que la reacción de enlace es un proceso bimolecular. Esto significa que la velocidad del acoplamiento aumenta con el aumento de la concentración del ADN y de la proteína acoplada.

La concentración del ADN indica, cuantas moléculas de una sustancia se pueden encontrar por unidad de volumen. En la presente invención existe preferentemente como máximo una molécula de ADN por compartimento de agua, debido a que con ello se obtienen complejos de fusión geno-fenotipo. Por este motivo desciende la concentración de ADN con la tercera potencia del aumento de diámetro del compartimento de agua. De este modo una molécula de ADN en un compartimento de agua con 2 \mum de diámetro da una concentración de 0,4 nM, mientras que para una molécula de ADN en un microcompartimento de 1 \mum de diámetro se calcula una concentración de 3,2 nM. Se pueden hacer las mismas reflexiones para el polipéptido expresado. El tamaño preferido (es decir, el diámetro preferido) de los compartimentos de agua para la presente invención se encuentra entre 1 \mum y 2 \mum.

Con un diámetro de compartimento medio de 1 \mum se pueden formar en 1 ml de emulsión aproximadamente 10^{11} compartimentos. Es deseable formar un número lo más alto posible de compartimentos ya que entonces se puede trabajar con bibliotecas de ADN más grandes. Sin embargo, no habría que quedarse por debajo de un cierto tamaño mínimo de los compartimentos de agua ya que de lo contrario, de acuerdo con la patente US nº 6.489.103, no tendrían sitio en ellos todas las moléculas que se necesitan para la expresión de los polipéptidos.

Existe una cierta tolerancia del proceso según la invención con respecto a una selección positiva errónea en el primer ciclo de selección. Si, por ejemplo, accede más de un fragmento de ADN a un compartimento, entonces es posible que sea unido un fenotipo seleccionado de manera errónea con un genotipo no deseado. Si el complejo se aísla en la siguiente selección, entonces su ADN es multiplicado mediante la amplificación PCR. Los genotipos seleccionados de forma positiva por error no suponen ningún problema ya que pueden ser eliminados en uno de los ciclos de selección siguientes.

La emulsión de agua en aceite puede fabricarse, por ejemplo, mediante simple mezcla de la fase acuosa y orgánica. La mezcla se puede conseguir mediante diferentes métodos descritos en la bibliografía (Finch C.A. et al. (1993) Encapsulation and controlled Release. Spec. Publ.-R. Soc. Chem. 138, 35). Por ejemplo, la fase de aceite se puede remover con un agitador magnético, mientras que la fase acuosa se añade lentamente por goteo. Tras la adición de la fase acuosa se continúa removiendo usualmente durante un tiempo determinado hasta que los compartimentos de la emulsión presentan la distribución de tamaños deseada. La duración de la agitación y la velocidad de agitación son parámetros muy importantes para la distribución de tamaños de los compartimentos de agua (Tawfik D.S. and Griffiths A.D. (1998) Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat. Biotechnol. 16(7), 652).

Para que sea posible expresar polipéptidos en una emulsión de agua en aceite partiendo de fragmentos de ADN lineales o circulares, hay que introducir en los compartimentos, junto con el ADN, la maquinaria para la síntesis de proteínas. Esta maquinaria consta de un sistema de transcripción/traducción in vitro acoplado entre sí. Se puede obtener una serie de productos comerciales para este fin. La expresión de polipéptidos libre de células en una emulsión de agua en aceite se describió ya en 1992 en la bibliografía (Nametkin S.N. et al. (1992) Cell-free translation in reversed micelles. FEBS 309, 330). El rendimiento de un polipéptido expresado en una emulsión de agua en aceite es usualmente algo menor en solución no compartimentada. La medida del descenso del rendimiento depende del polipéptido expresado (patente US 2002/119459, Optical sorting method).

Los complejos polipéptido-ADN se pueden extraer, tras la expresión de los polipéptidos y su acoplamiento con ADN, en la fase acuosa de la emulsión. Para ello se centrifuga la emulsión y los compartimentos de agua descienden al fondo del recipiente de reacción. Los compartimentos de agua forman un sedimento, si bien están todavía intactos. El resto aceitoso se retira de forma usual. Ahora se puede extraer la fase acuosa de la fase de aceite (comp. Tawfik D.S., y Griffiths A.D., 1998).

Preferentemente, el experimento de selección propiamente dicho se lleva a cabo con los complejos de fusión polipéptido-ADN extraídos.

Además, la molécula para la cual se busca por ejemplo un polipéptido enlazante, puede ser inmovilizada sobre una superficie fija. Esta superficie puede ser la resina de una columna de cromatografía, una superficie de plástico o pequeñas bolitas (Beads). Los complejos de fusión polipéptido-ADN, los cuales se pueden enlazar a la molécula inmovilizada, quedan también sobre la superficie fija, cuando el sistema es lavado. Tras el lavado, los complejos de fusión polipéptido-ADN que han quedado pueden ser retirados mediante elución de la superficie y ser amplificados acto seguido mediante PCR. En caso de utilización de las bolitas se pueden amplificar las moléculas de ADN que han quedado, en su caso, directamente tras el lavado (sin elución). Mediante la amplificación se obtiene una nueva biblioteca de ADN nueva seleccionada. Con esta se puede llevar a cabo o bien directamente un ciclo de formación de complejo y de selección o se pueden introducir nuevas mutaciones, con el fin de aumentar la diversidad de la biblioteca de ADN. Los procedimientos de mutagénesis se describen en la bibliografía y son conocidos por el experto en la materia.

A continuación se describe, a título de ejemplo, una forma preferida para la realización de la invención:

Para el acoplamiento del polipéptido y el ácido nucleico se utiliza la proteína Hae III metilasa de Haemophilus aegypticus (M.Hae III) (ATCC 1116). La M.Hae III metila en la secuencia de reconocimiento 5'-GGCC-3' la tercera base desde la izquierda (citidina, C). Un fragmento de ADN, en el cual esta citidina es sustituida por 5-fluordeoxicitidina (F) (5'-GGFC-3'), sirve como secuencia de reconocimiento de inhibidor suicida (también llamado Mechanism based Inhibitor) para la Hae III metilasa y es el lugar del enlace covalente entre ADN y polipéptido. Este inhibidor de suicido fue desarrollado para el reconocimiento de la estructura tridimensional de la M.Hae III metilasa en complejo con su sustrato (Chen L. et al. (1991) Direct identification of the active-site nucleophile in a ADN (cytosine-5)-methyltransferase. Biochemistry 30, 11018). Mediante la utilización de oligonucleótidos, los cuales contienen la base 5-fluorodeoxicitidina modificada, se pueden montar de forma sencilla los puntos de enlace mediante PCR en el ADN, el cual se utiliza más tarde para los experimentos de selección. Los oligonúclidos modificados con 5-fluorodeoxicitidina se pueden obtener comercialmente (Microsynth, Balgach, Suiza).

El polipéptido que debe ser modificado en cuanto a sus propiedades mediante evolución in vitro según la invención, es ligado al extremo C de la metilasa. La proteína de fusión comprende, por lo tanto, al menos dos dominios, de los cuales uno (Hae III metilasa) es responsable del acoplamiento covalente al ADN, mientras que el otro dominio determina las propiedades que hay que seleccionar.

Una biblioteca de ADN, formada por fragmentos de ADN lineales, los cuales codifican para la proteína de fusión M.Hae III, es introducida, junto con solución de transcripción/traducción y el cofactor S-adenosilmietionina (SAM) en una emulsión de agua en aceite. El ADN es transcrito en los compartimentos de agua y el ARNm que se forma es traducido. De esta manera se forman proteínas de fusión M.Hae III, las cuales reaccionan con la 5-fluorodeoxicitidina y forman un enlace covalente con el ADN. Tras la extracción de los complejos de proteína de fusión ADN-metilasa de la emulsión de agua en aceite se puede llevar a cabo un experimento de elección/selección, para obtener o bien un polipéptido específicamente enlazante o uno que actúe alostéricamente con propiedades seleccionadas.

Figuras

La presente invención se explica a partir de las figuras.

la Fig. 1 muestra un esquema del ciclo de selección según la presente invención;

la Fig. 2 muestra una representación esquemática de los procesos dentro de un microcompartimento de una emulsión de agua en aceite;

la Fig. 3a muestra la estabilidad de la distribución de tamaños de los compartimentos de agua en la emulsión de agua en aceite;

la Fig. 3b muestra el diámetro preferido de los compartimentos de agua entre 1 \mum y 2 \mum;

la Fig. 4 muestra el enlace covalente de ADN con M.Hae III metilasa;

la Fig. 5 muestra la elección, en este caso selección, de complejos M.Hae III-His-tag-DANN mediante cromatografía de afinidad de Ni;

las Figs. 6a/b la elección, en este caso selección mediante cromatografía de afinidad de Ni, de los complejos de ADN M.Hae III-His-tag y Flag-tag tras expresión in vitro de los polipéptidos y formación de los complejos ADN-M.Hae III correspondientes.

Lista de signos de referencia

A

encierro de la biblioteca de ADN en microcompartimentos

B

extracción de la emulsión

C

selección de los polipéptidos con las propiedades determ.

D

amplificación de la información genética de los polipéptidos enlazados (PCR)

E

otro ciclo de selección

F

clonación de los polipéptidos codificados

III

transcripción

IV

traducción

1

biblioteca de ADN

2

molécula de ADN

*

grupo químico, Suicide Inhibitor

3A

emulsión de agua en aceite

3B

compartimento de agua

4

colección de fusiones ADN-polipéptido, complejos polipéptido-ADN

5

polipéptidos de fusión

5A

péptido parcial I constante

5B

péptido parcial II variable

6

fusión ADN-polipéptido o complejo polipéptido-ADN

7

polipéptidos enlazados

8

moléculas diana inmovilizadas

9

nueva colección de genes

10

ARNm.

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La invención se explica a continuación a título de ejemplo, de forma no limitativa, a partir de las formas de realización preferidas de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1

Este ejemplo muestra la fabricación de una emulsión de agua en aceite con propiedades físicas ventajosas.

Se añadieron 50 \mul de una fase acuosa (mezcla congelada transcripción/traducción (Roche), con aproximadamente 100 ng de ADN (Molde para la expresión, la cantidad se puede variar) y 80 \muM de S-adenosilmetionina a 950 \mul de una fase de aceite helada (aceite mineral (Sigma, M-5904), 4.5% (v/v) Span 80 (Fluka) y 0.5 % (v/v) Tween 80 (Fluka), recién preparado).

La adición tuvo lugar gota a gota en un vasito de píldoras (Forma Vitrum AG, 40,0 x 18,75 mm) durante 2 minutos. Durante la adición por goteo de la fase acuosa en 5 etapas cada uno de 10 \mul se extrajo con un agitador magnético (Heidolph MR 1000) a 2.200 rpm (revoluciones por minuto). Tras la adición de la fase acuosa se continuó removiendo a 2.200 rpm durante 5 minutos, con el fin de conseguir la distribución de tamaños deseada de los compartimentos.

En las Figuras 3a y 3b, se muestran distribuciones de tamaños de compartimentos de agua de una emulsión de agua en aceite, las cuales se obtuvieron como se ha descrito anteriormente. Sobre el eje X están indicados los diámetros de los microcompartimentos (PD, en \mum) en escala logarítmica. Los valores del eje Y (% WP) indican la porción de la fase acuosa en un microcompartimento del tamaño correspondiente (WP, en % del volumen total de la fase acuosa).

La Figura 3a muestra las distribuciones de tamaños de una emulsión de agua en aceite en instantes diferentes. Se fabricó una emulsión y se determinó inmediatamente después la distribución de tamaños de los compartimentos de agua mediante dispersión de luz (tiempo t_{1} = 0 h, curva 1 continua). La misma medición se llevó a cabo otra vez, después de haber guardado la emulsión de agua en aceite durante 96 horas a temperatura ambiente (tiempo t_{2} = 96 h, curva 2 de trazos). Las distribuciones de tamaños representadas por estas dos curvas 1 y 2 no se diferencian de forma significativa; las emulsiones son estables. Las distribuciones de tamaños se midieron con el Mastersizer X (Malvern Instruments Ltd., RU).

La Figura 3b muestra la reproducibilidad de tres emulsiones de agua en aceite, las cuales se fabricaron como se ha descrito más arriba. Los perfiles de las distribuciones de tamaños (1 línea continua; 2, línea de puntos y 3, línea de trazos) no se diferencian de forma significativa; las emulsiones son reproducibles. Las distribuciones de tamaños se midieron con el Mastersizer X (Malvern Instruments Ltd., RU).

Ejemplo 2

Este ejemplo muestra el enlace covalente de ADN con polipéptido.

Se utilizó un fragmento de ADN de 268 bp de longitud con una secuencia de reconocimiento 5'-GGFC-3' para los experimentos de acoplamiento en este caso mostrados (F = 5-fluorodeoxicitidina). 2 nM de ADN se incubaron en tampón de reacción (New England Biolabs, 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM ditriotreitol) junto con M.Hae III (38 nM) y 80 \muM de S-adenosilmetionina (SAM) (New England Biolabs), durante un tiempo diferente, a 37ºC (15, 30, 60, 120, 180 y 240 min.). Las reacciones se pararon durante 15 min. mediante calentamiento a 70ºC (inactivación de M.Hae III). Las muestras se analizaron sobre un gel de urea 10% TBE desnaturalizante (Novex). El gel fue teñido con SYBR green II (Molecular Probes, Oregón, USA). De esta manera se pudieron hacer visibles ácidos nucleicos de una sola cadena (comp. con la Fig. 4).

En el primer carril M del gel formado en la Figura 4 está colocado un marcador de tamaño (10 bp ladder, Invitrogen). En los carriles 2-7 están colocadas, de izquierda a derecha, las muestras con un tiempo de incubación creciente (encima del carril está indicado, en minutos, en cada caso un tiempo de incubación de 15'-240'). Los carriles X, Y y Z muestran tres controles negativos:

X:

muestra sin cofactores SAM;

Y:

muestra sin M.Hae III metilasa;

Z:

muestra sin el fragmento de ADN (268 bp) utilizado para las reacciones.

La utilización de un gel desnaturalizante y el calentamiento anterior a 70ºC aseguran que se asocian con ADN únicamente M.Hae III enlazados de forma covalente. El ADN enlazado con M.Hae III se desplaza sobre el gel con mayor lentitud que el ADN no enlazado. En la Fig. 4 se puede reconocer con claridad que con el aumento del tiempo de incubación aumenta de intensidad la banda superior. Esto significa que con el aumento del tiempo de incubación se enlazan cada vez más moléculas de ADN a M.Hae III.

Tras aproximadamente 2 horas las intensidades de la banda superior e inferior son aproximadamente iguales.

En una molécula de ADN de doble cadena sólo una cadena contiene el inhibidor suicida. Cuando en cada secuencia de reconocimiento 5'-GGFC-3' - y con ello en cada cadena doble de ADN - está enlazado de forma covalente M.Hae III, entonces la mitad de todas las cadenas individuales de ADN está enlazada con metilasa. Dado que la banda superior y la inferior muestran la misma intensidad sobre el gel, existe el mismo número de cadenas individuales de ADN no modificadas que de asociadas con M.Hae III. Esto significa que la conexión tuvo lugar cuantitativamente después de aproximadamente 2 h.

Ejemplo 3

En este ejemplo se expresan in vitro proteínas de fusión M.Hae III.

Para la expresión de proteínas de fusión M.Hae III se utilizó un sistema de transcripción/traducción (RTS E. coli HY Kit, Roche Applied Science, Suiza) que se puede obtener comercialmente. Para poder expresar un gen con este sistema in vitro hay que colgar en el extremo 5' y en el 3' secuencias de ADN reguladoras. Esto tiene lugar mediante PCR solapante (PCR assembly). Las secuencias se pueden obtener comercialmente (RTS E. coli Linear Template Generation Set, His-tag, Roche Applied Science, Suiza).

Con el fin de introducir el inhibidor suicida 5'-GGFC-3' mediante PCR en el ADN se llevó a cabo otra PCR con los fragmentos de ADN obtenidos mediante el Linear Template Generation Set. Como Primer (oligonucleótido) se utilizaron Lin ext ba y Hae sub fo. Hae sub fo posee una secuencia de reconocimiento para Hae III metilasa con una 5-fluorodeoxicitidina (Suicide Inhibitor). La PCR se llevó a cabo con las siguientes temperaturas:

94ºC (3 min.) \longrightarrow [94ºC (1 min.) \longrightarrow 58ºC (1 min.) \longrightarrow 72ºC (3 min.)]_{30 \ ciclos} \longrightarrow 72ºC (5 min.) \longrightarrow 4ºC.

Los productos de la PCR se purificaron con el QIAquick PCR Purification Kit de Qiagen.

Secuencia de Lin ext ba

5'-GAT GCC GGC CAC GAT GCG TCC GGC -3'

Secuencia de Gae sub fo

5'- C GTC ATG GFC TAT GCG GGC GAC CAC ACC CGT CCT GTG GAT -3'

Los moldes de ADN que codifican para M.Hae III-His tag, M.Hae III-Flag tag, M.Hae III-Calmodulin-His tag y M.Hae III-ED-B-His tag, se fabricaron de la misma manera (ED-B: Extra Domain B de fibronectina). Las fusiones con Hae III metilasa se colgaron todas de su extremo C. Las proteínas de fusión se expresaron en solución libre y en emulsión.

Expresión en solución libre

Se incubaron 200 ng de cada molde de ADN en 25 \mul de mezcla de transcripción/traducción in vitro (Roche Applied Science) durante 3 h a 30ºC.

Expresión en emulsión

Se vertieron 300 ng de cada molde de ADN en 50 \mul de mezcla de transcripción/traducción in vitro helada (Roche Applied Science). Las emulsiones de agua en aceite se prepararon como se ha descrito arriba. Las emulsiones acabadas fueron incubadas durante 3 h a 30ºC. Tras expresión de los polipéptidos y la formación de los complejos de fusión ADN-polipéptido se extrajo la fase acuosa de la emulsión. Las emulsiones fueron centrifugadas, durante 6 minutos, a 10'000 rpm, el sobrante de aceite fue absorbido y se añadieron 150 \mul de PBS a la emulsión sedimentada.

A continuación, se añadió 1 ml de dietiléter saturado con agua helado, y la muestra se mezcló bien con el Vortex. El recipiente de reacción se dejó de pie para que se pudiesen separar la fase orgánica y la acuosa. La fase acuosa se retiró entonces, de debajo de la fase orgánica, con una pipeta, se vertió en un recipiente de reacción separado y se incubó durante 10 minutos a 40ºC, con el fin de dejar que se evaporasen los restos de dietiléter.

La magnitud de expresión se analizó mediante Western Blot (detección: conjugado anti-His-HRP (Sigma) o: anti-Flag (Sigma) con conjugado anti-ratón (Sigma)). Al mismo tiempo se demostró que en emulsión se obtuvo aproximadamente el 20% del rendimiento de expresión esperado en solución libre. Únicamente la proteína de fusión M.Hae III-Calmodulin-His tag no se pudo detectar en la expresión en emulsión. No se detectaron fragmentos de la proteína de fusión, lo que permite concluir acerca de una actividad de proteasa baja.

Se analizó asimismo la actividad de metilasa de las proteínas de fusión expresadas. Mediante metilización de la secuencia diana 5'-GCGGCCGC-3' se puede proteger un fragmento de ADN de la digestión con el enzima de restricción Not I. Cuando se incuba un fragmento de ADN que contiene un sitio de corte Not I con proteínas de fusión M.Hae III, ya no puede ser cortado después por Not I.

Las soluciones de transcripción/traducción en las que se expresó en cada caso una proteína de fusión M.Hae III, fueron incubadas con un fragmento de ADN que contiene un Not I. Después se investigó si los fragmentos de ADN pueden ser cortados todavía con Not I. En todos los casos estudiados las proteínas expresadas eran activas. Una excepción la constituyó la proteína de fusión, expresada en agua en aceite, M.Hae III-Calmodulin-His tag, la cual protegió el ADN con el sitio de corte de Not I únicamente a la mitad. Esto permite concluir que hay un nivel de expresión profundo.

Ejemplo 4

Este ejemplo muestra la selección, en este caso selección de un fragmento de ADN, mediante cromatografía de afinidad de níquel, que está unida a M.Hae III-His tag. Cuando el mismo fragmento de ADN no está por el contrario acoplado a una proteína M.Hae III-His tag, no es seleccionado.

Primero se acopló ADN con el M.Hae III-His tag, gracias a que se incubó un molde de ADN que codifica para M.Hae III con M.Hae III-His tag obtenido de forma recombinante.

Se incubaron 2 nM de ADN en tampón de reacción (New England Biolabs, 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM ditriotreitol) junto con 350 ng de M.Hae III-His tag y 80 \muM de S-adenosilmetionina durante una hora y media a 37ºC (volumen de reacción total: 30 \mul). En el control negativo se suprimió el M.Hae III-His tag.

Tras la incubación se añadieron 50 \mul de tampón A (50 mM NaH_{2}PO_{4}, 300 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol, 0,1% de Tween 20 (Fluka) pH = 8,0).

Se añadieron 20 \mul de Ni-NTA Magnetic Agarose Beads (Qiagen, nº de cat. 36111) y la muestra se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.

Los Ni-NTA Agarose-Beads magnéticos fueron lavados cuatro veces, con la ayuda de un Magnetic Separator (MPC-S, Dynal, Noruega), con 100 \mul de tampón B (50 mM NaH_{2}PO_{4}, 300 mM de NaCl, 20 mM de Imidazol, 0,1% de Tween 20, pH = 8.0).

Tras el último proceso de lavado se resuspendieron los Ni-NTA Magnetic Agarose Beads en 100 \mul de agua estéril.

Con 1 \mul de Beads de níquel lavados se analizó la cantidad de ADN restante mediante PCR cuantitativa (Wang A.M. et al. (1989) Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 9717). En esta PCR se amplificaron únicamente los 331 últimos pares de bases en el extremo 3'- del molde. Como Primer se utilizaron los oligonucleótidos Hae end ba (downstream) y Hae sub fo short 2 (upstream). Como ADN competidor se utilizó el molde (0,1 pM), el cual codifica para la proteína de fusión M.Hae III-ED-B-His tag. Con los Primers indicados más arriba se amplifica, partiendo de este molde, un fragmento de ADN de 577 bp de longitud. Tras la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados, las muestras se aplicaron sobre un gel de agarosa (1,4%).

El gel de agarosa se muestra en la Figura 5. En los carriles 1 y 4 está cargado un marcador de tamaño (Smart Ladder, Eurogentech). La banda situada justo por debajo de la marca de 600 bp es el fragmento de ADN, el cual se añadió como competidor a la PCR. La banda inferior es el fragmento de ADN de 331 bp de longitud, que fue incubado con el enzima M.Hae III-His tag. En el carril 2 se aplicó el experimento, en el carril 3 el control negativo sin M.Hae-His tag. En el carril 5 se añadieron a la solución de PCR, como comparación cuantitativa, 0,1 pM de la molécula de ADN de 331 bp. El carril 6 muestra el resultado de la PCR únicamente con ADN competidor (control negativo).

Ejemplo 5

Expresión in vitro de los polipéptidos de fusión M.Hae-His tag y de M.Hae-Flag tag y elección a continuación, en este caso selección, mediante cromatografía de afinidad.

Los genes que codifican para M.Hae III-His tag (I) y M.Hae III-Flag (II) tag fueron clonados en el plásmido pIVEX 2.3d (Roche Applied Science, Suiza) según un procedimiento de uso corriente para el experto en la materia. Se incubaron en cada caso 500 ng de ambos plásmidos en 25 \mul de mezcla de transcripción/traducción (Roche Applied Science, Suiza) a lo largo de 2 h a 30ºC. Adicionalmente, se incubaron moldes de ADN lineales (de cada uno 50 ng), los cuales codifican asimismo para M.Hae III-His tag (III) y M.Hae III-Flag tag (IV), asimismo en 25 \mul de mezcla de transcripción/traducción, a lo largo de 2 h a 30ºC. La expresión de los polipéptidos se comprobó mediante Western Blot (ver también el ejemplo 3).

A las muestras I a IV se añadieron 50 \mul de tampón A (50 mM NaH_{2}PO_{4}, 300 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol, 0,1% de Tween 20 (Fluka) pH = 8.0). Se añadieron 20 \mul de Ni-NTA Magnetic Agarose Beads (Qiagen, nº de cat. 36111) y las muestras fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Los Ni-NTA Agarose-Beads magnéticos fueron lavados seis veces, con la ayuda de un Magnetic Separator (MPC-S, Dynal, Noruega), con 100 \mul de tampón B (50 mM NaH_{2}PO_{4}, 300 mM de NaCl, 20 mM de Imidazol, 0,1% de Tween 20, pH = 8,0). Tras el último proceso de lavado se resuspendieron los Ni-NTA Magnetic Agarose-Beads en 100 \mul de PBS. Con 1 \mul de los Beads de níquel lavados se analizó la cantidad de los restantes mediante PCR.

Para la PCR se utilizaron los Primers M.Hae Nco ba (downstream) y M.Hae Xho His fo (upstream). Con estos Primers se amplifica un fragmento de ADN de 1020 bp. Para la PCR se utilizó el siguiente programa de temperaturas:

94ºC (3 min.) \longrightarrow [94ºC (1 min.) \longrightarrow 55ºC (1 min.) \longrightarrow 72ºC (90 seg.)]_{25 \ ciclos} \longrightarrow 72ºC (3 min.) \longrightarrow 4ºC.

Las muestras I a IV de PCR se aplicaron para su análisis sobre un gel de agarosa (1,4%) (comp. las Figuras 6a y 6b).

La Figura 6a muestra el experimento de selección con el ADN de plásmido como molde para la transcripción/traducción in vitro. En el carril situado más a la derecha (M) se cargaron 5 \mul de un marcador de tamaño (Smart Ladder, Eurogentech). En el primer carril (I) desde la izquierda se cargó la muestra, en la cual había sido introducido el plásmido, que codifica para M.Hae III-His tag, para la transcripción/traducción in vitro. En el carril (II) central se cargó la muestra, en la cual se había introducido el plásmido, el cual codifica para M.Hae III-Flag tag, para la transcripción/traducción in vitro.

La Fig 6b muestra el experimento de elección, en este caso experimento de selección con el ADN lineal como molde para la transcripción/traducción in vitro. En el carril situado más a la izquierda (M) se cargaron 5 \mul de un marcador de tamaño (Smart Ladder, Eurogentech). En el carril (III) central se cargó la muestra, en la cual había sido introducido el ADN lineal, el cual codifica para M.Hae III-His tag, para la transcripción/traducción in vitro. En el carril (IV) derecho se cargó la muestra, en la cual había sido introducido el ADN lineal, que codifica para M.Hae III-Flag tag, para la transcripción/traducción in vitro.

A partir de las intensidades de las bandas de ADN sobre el gel de agarosa de la Fig. 6a y de la Fig. 6b se puede reconocer con claridad que el ADN acoplado con polipéptido de fusión M.Hae III-His tag fue seleccionado y amplificado con cromatografía de afinidad de níquel, mientras que el ADN acoplado con polipéptido de fusión M.Hae III-Flag tag no sobrevivió al ciclo de selección.

Ejemplo 6

A continuación se seleccionan, a título de ejemplo, moléculas de ADN lineal sobre la base de las propiedades de enlace de las proteínas codificadas por las mismas.

Para ello, se fabricó un molde de ADN, el cual codifica para la proteína de fusión M.Hae III-Calmodulin. Este molde de ADN se fabricó de la misma forma que en el ejemplo 3.

Se preparó una mezcla de transcripción/traducción, según las indicaciones del fabricante del Kit (RTS E. coli HY Kit, Roche Applied Sciences) refrigerada sobre hielo. Se añadieron de tal manera 40 \mul de mezcla de transcripción/traducción, 5 \mul de S-adenosilmetionina (concentración final 80 \muM), 100 ng molde de ADN de M.Hae III-Calmodulin (aproximadamente 5 x 10^{10} moléculas) y agua que se alcanzó en total un volumen de 50 \mul. El ADN se añadió poco antes de emulsionar. Para la preparación de la emulsión se añadió la fase acuosa etapa a etapa (5 x 10 \mul durante 2 min.) a 950 \mul de la fase de aceite, como se describe en el ejemplo 1.

Para la expresión de las proteínas y la obtención de los complejos covalentes proteína-ADN, las muestras se incubaron a 30ºC durante 150 min. Después se extrajo la fase de agua, la cual contiene las fusiones ADN-proteína, consecuentemente de la emulsión. Las muestras fueron centrifugadas durante 10 min. a 7.000 revoluciones por minuto, después de lo cual los compartimentos de agua sedimentaron en el fondo del recipiente de reacción. El sobrante (fase de aceite) fue aspirado y se añadieron 150 \mul de tampón (tampón formado por: TBS (solución salina tritamponada) con 1 mM de CaCl_{2} (= TBSC), pH 7,4, 5 \muM de fragmentos de ADN de doble cadena biotinados para el bloqueo de las bolitas magnéticas que se utilizarán más tarde [5'-biotina-GGA GCT TCT GCA TTC TGT GTG CTG-3' (Qiagen)], 1 \muM de fragmentos de ADN de doble cadena que compiten [5'-ATC TAA GGC CAA TGT ACT AGA CGG CCA TTC CAG ATG CAG GCC AAG CGT ACA TAC GGC CTA GCT AAA TCA AGG CCG TAT CGT-3', la secuencia de sustrato para M.Hae III en negrita, Qiagen)], seguido de 1 ml de dietileter. Después la muestra fue agitada con un Vortex durante 2 x 10 seg. Una vez realizada la separación de la fase de agua de la de aceite se retiró la fase acuosa, situada debajo, con una pipeta y se secó en una placa agujereada-24 durante 10 min., para que el dietiléter restante pudiese evaporarse por completo.

Durante la extracción de la fase de agua se habían incubado, durante 15 min., en cada caso 25 \mul de bolitas magnéticas revestidas con streptavidina (Dynabeads, Dynal, Noruega) con péptido que enlaza calmodulina biotinado (400 nM, biotina-CAAARWKKAFIAVSAANRFKKIS (Montigiani et al., 1996)) o con anticuerpos M2 anti-Flag biotinados (bolitas 2 \mul/50 \mul, anticuerpos M2, Sigma-Aldrich). El péptido que enlaza calmodulina se utilizó para seleccionar las fusiones ADN de M.Hae III-Calmodulin que se encuentran en la fase de agua de la emulsión, mientras que el anticuerpo anti-Flag se utilizó como control negativo. Tras la incubación de las bolitas magnéticas con péptidos o anticuerpos estas fueron lavadas una vez con TBSC 0,1% Tween 20 (Fluka). A continuación las bolitas se bloquearon durante 15 min., a temperatura ambiente, con fragmentos (5 \muM) de ADN biotinados [(5'-biotina-GGA GCT TCT GCA TTC TGT GTG CTG-3' (Qiagen)].

La fase de agua extraída se dividió en dos mitades y se mezcló con las bolitas magnéticas preparadas como se ha descrito anteriormente. Una de las mitades de la fase de agua se añadió a bolitas revestidas con péptidos que enlazan calmodulina, mientras que la segunda mitad se incubó con bolitas revestidas con anticuerpo anti-Flag. Las dos muestras se incubaron durante 45 min. a temperatura ambiente y se agitaron suavemente cada 10 min.

Las bolitas magnéticas fueron lavadas a continuación, con la ayuda de un Magnetic Separator (Dynal, Noruega), seis veces con en cada caso 100 \mul de TBSC 0,1% Tween 20 (Fluka) y una vez con 100 \mul de TBSC, para retirar de la superficie de las bolitas magnéticas las fusiones ADN-proteína no enlazantes. Tras el lavado las bolitas magnéticas fueron suspendidas en 100 \mul de agua.

Se estudió a continuación cuántas proteínas de fusión ADN-M.Hae III-Calmodulin se habían seleccionado mediante enlace a los péptidos que enlazan calmodulina o las bolitas magnéticas revestidas con anticuerpos anti-Flag. Este análisis se llevó a cabo con el procedimiento, de uso corriente para el experto en la materia, de la "Real-time Polymerase Chain Reaction" (Real PCR) (con el sistema TaqMan^{TM} de Applied Biosystems). Como molde para el Real-Time PCR se utilizaron 0,1 \mul del total de 100 \mul de bolitas magnéticas que flotan en el agua. Cada muestra se midió tres veces.

En la muestra en la cual se habían utilizado para la selección bolitas magnéticas revestidas con péptidos que enlazan calmodulina, se pudieron detectar sobre 0,1 \mul de bolitas 7,8(\pm1,1) x 10^{5} moléculas de DNA. En el control negativo con anticuerpos anti-Flag se midieron por el contrario únicamente 6,9(\pm1,4) x 10^{2} moléculas de ADN (entre paréntesis las desviaciones típicas de las mediciones). Por lo tanto se seleccionaron 1.130 veces más moléculas de ADN, que codifican para M.Hae III-Calmodulin, cuando las bolitas magnéticas habían sido revestidas en lugar de con anticuerpo anti-Flag con péptidos que enlazan calmodulina. El mismo ensayo se llevó a cabo también con otras proteínas de fusión M.Hae III (con los correspondientes anticuerpos sobre las bolitas magnéticas) y se obtuvieron resultados similares. La relación (experimento/control negativo) del número de moléculas de ADN seleccionadas osciló al mismo tiempo entre 557 y 6.897.

Ejemplo 7

Para poder trabajar con bibliotecas con moléculas de ADN modificadas (por ejemplo mediante adición, sustitución, borrado) es posible con el procedimiento aquí descrito seleccionar de la biblioteca únicamente conjugados de fusiones proteína-ADN tales que posean las propiedades de enlace deseadas.

Por ello se llevaron a cabo experimentos modelo con mezclas formadas por dos moldes de ADN diferentes. Un molde codificaba para la proteína de fusión M.Hae III-Clamodulin, el otro para M.Hae III-ED-B. Los moldes se fabricaron de la misma manera a la descrita en el ejemplo 3. El experimento se llevó a cabo, si no se describe algo distinto, de acuerdo con el protocolo del ejemplo 6.

A la mezcla de transcripción/traducción se le añadió una mezcla con un total de 10^{9} moléculas de ADN, en la cual codificaron 4.200 veces más moléculas de ADN de la proteína de fusión M.Hae III-ED-B que de M.Hae III-Calmodulin. El experimento de selección se llevó a cabo con bolitas magnéticas las cuales habían sido revestidas o bien con péptidos que enlazan calmodulina o con anticuerpos anti-Flag (M2, Sigma-Aldrich). El resultado del experimento se evaluó mediante Real-time PCR. Las bolitas magnéticas no se utilizaron sin embargo directamente para el Real-time PCR sino que las moléculas de ADN seleccionadas fueron amplificadas en primer lugar en una PCR con los Primers Ampl ba (5'-CCC GCG AAA TTA ATA CGA CTC A-3', Qiagen) y Ampl fo (5'-AAA ACC CCT CAA GAC CCG TT-3', Qiagen). La PCR se llevó a cabo con el siguiente programa de temperaturas:

94ºC (3 min.) \longrightarrow [94ºC (45 seg.) \longrightarrow 51ºC (1 min.) \longrightarrow 72ºC (100 seg.)]_{35 \ ciclos} \longrightarrow 72ºC (3 min.) \longrightarrow 4ºC.

Las relación entre moléculas de ADN que codifican para M.Hae III-ED-B y M.Hae III-Calmodulin se midió, tras dilución de las muestras de 1:10^{5} en agua, mediante Real-time PCR [con muestras TaqMan^{TM} específicamente para los genes de ED-B o calmodulina (Microsynth, Balgach, Suiza)]. Para las mediciones se utilizó 1 \mul de las soluciones de ADN diluidas, llevándose a cabo cada medición tres veces. En el caso del control negativo (anticuerpos anti-Flag sobre las bolitas magnéticas) no se pudieron detectar moléculas de ADN que codifiquen para M.Hae III-Calmodulin. En la muestra, en la cual se habían utilizado bolitas magnéticas con péptidos que enlazan calmodulina, se detectaron 1,4(\pm0,2) x 10^{6} moléculas de ADN que codifican para M.Hae III-ED-B y 5,1(\pm0,7) x 10^{4} moléculas de ADN que codifican para M.Hae III-Calmodulin (entre paréntesis la desviación típica de las mediciones). La relación de M.Hae III-ED-B con respecto a M.Hae III-Calmodulin fue en consecuencia de 27 tras la selección. Mediante comparación de las relaciones de las moléculas de ADN en la mezcla de salida (4200) y tras la selección (27) resulta un enriquecimiento de 153 para las moléculas de ADN que codifican M.Hae III-Calmodulin.

Claims (19)

1. Procedimiento para la fabricación y asignación de ácidos nucleicos y de los polipéptidos codificados de este modo, que comprende las etapas siguientes:

a)

la compartimentación de ácidos nucleicos junto con una mezcla de transcripción-traducción in vitro en una emulsión de agua en aceite,

b)

la expresión in vitro de los polipéptidos de fusión codificados por los ácidos nucleicos en los microcompartimentos de la emulsión de agua en aceite, siendo unido cada ácido nucleico al polipéptido de fusión para el cual codifica,

comprendiendo los polipéptidos de fusión en cada caso por lo menos una porción de péptido I constante y por lo menos una porción de péptido II variable y siendo los polipéptidos de fusión enlazados de forma covalente en la etapa b), a través de la porción de péptido I, con el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión, y siendo el número de polipéptidos de fusión enlazados de este modo por ácido nucleico un número entero que se puede definir.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa siguiente:

c)

la extracción de los complejos polipéptido de fusión-ácido nucleico, fabricados en la etapa b), de la emulsión de agua en aceite.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa siguiente:

d)

la selección de complejos polipéptido de fusión-ácido nucleico que presentan unas propiedades deseadas.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa siguiente:

e)

la amplificación de las moléculas de ácido nucleico seleccionadas.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa siguiente:

f)

la mutación casual u orientada de uno o varios nucleótidos durante o tras la amplificación de la etapa e).

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa siguiente:

g)

la repetición una o varias veces de uno de los procedimientos descritos en las reivindicaciones 1 a 5.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los ácidos nucleicos son ARNr, ARNm o ADN.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los ácidos nucleicos son ADN.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los ácidos nucleicos son ADN de doble cadena, preferentemente ADN de doble cadena lineal.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los ácidos nucleicos son ADN modificado químicamente.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que cada microcompartimento de la emulsión de agua en aceite no comprende más de un ácido nucleico.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que los microcompartimentos fabricados en la emulsión de agua en aceite presentan un diámetro medio de 1 \mum a 2 \mum.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, en el que en cada caso está enlazada de forma covalente una porción de péptido I con una molécula de ácido nucleico.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la porción de péptido I constante del polipéptido de fusión es una (citosina-5)-metiltransferasa.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la metiltransferasa se ha seleccionado de entre el grupo constituido por M.Hae III, M.Hha I, M.Hpa I, M.Msp I y Alu I.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la metiltransferasa Hae III es metiltransferasa de Haemophilus aegypticus.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el ácido nucleico modificado comprende la secuencia 5'-GGFC-3' y F es 5-fluorodeoxicitidina.

18. Utilización de por lo menos una (citosina-5)-metiltransferasa en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Utilización de polipéptidos de fusión o de complejos ácido nucleico-polipéptido de fusión enlazados de manera covalente con los mismos en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, que comprenden en cada caso una porción de péptido I constante y una porción de péptido II variable, siendo conectados o estando conectados de forma covalente los polipéptidos de fusión, a través de una proporción de polipéptido I, con el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión, y siendo el número de los polipéptidos de fusión enlazados de esta manera por unidad de ácido nucleico un número entero que se puede definir.