ES2299473T3 - Inhibidor de c1 humano producido en la leche de mamiferos transgenicos. - Google Patents
Inhibidor de c1 humano producido en la leche de mamiferos transgenicos. Download PDFInfo
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Abstract
Mamífero no humano comprendiendo: un segmento de ADN de codificación de un inhibidor de C1 humano operativamente enlazado a por lo menos una secuencia reguladora eficaz para promover la expresión del segmento de ADN en las células de las glándulas mamarias del mamífero y un segmento de codificación de un péptido señal funcional en las células mamarias del mamífero; donde el segmento de ADN de codificación del inhibidor de C1 puede ser expresado en las células de las glándulas mamarias de una forma adulta del mamífero o un descendiente hembra del mismo para producir el inhibidor de C1 en la leche del mamífero no humano.
Description
Inhibidor de C1 humano producido en la leche de
mamíferos transgénicos.
La presente invención reside en los campos de la
genética recombinante y de la medicina, y se refiere a la
producción transgénica de inhibidor de C1 y su uso como molécula
terapéutica, p. ej. en terapia de sustitución en pacientes con
angioedema hereditario o pacientes que requieren
inmunosupresión.
El inhibidor de C1 humano, también conocido como
inhibidor de C1 esterasa, es una sustancia bien conocida e
identificada. El inhibidor de C1 pertenece a la superfamilia de
inhibidores de serina proteinasa y es el único inhibidor de C1r y
C1s del sistema complementario y es el inhibidor más importante del
factor XIIa y de la calicreína del sistema de contacto. Además el
inhibidor de C1 inhibe también otras serina proteasas de los
sistemas de coagulación y fibrinolíticos como el factor XI,
activador plasminógeno tipo tejido y fibrinolisina (Schapira M.
et al. 1985, Complement 2:111 / Davis A.E. 1988, Ann. Rev.
Immunol. 6:595).
El inhibidor de C1 es codificado por un único
gen en el cromosoma 11 y consiste en 8 exones y 7 intrones. Toda la
secuencia genómica es conocida y codifica una proteína de 500
aminoácidos, incluyendo una secuencia señal de 22 aminoácidos
(Carter P. et al. 1988, Euro. J. Biochem. 173, 163). El
inhibidor de C1 de plasma es una glicoproteina de aproximadamente
105 kDa y es muy glicosilada, hasta el 50% de su masa molecular
consiste en hidratos de carbono.
Actualmente sólo el inhibidor de C1 obtenido de
sangre humana, bien alta o parcialmente purificado es usado y
aprobado en algunos países europeos para el tratamiento del
angioedema hereditario. Esta es una enfermedad provocada por una
deficiencia genética del inhibidor de C1 y caracterizada por ataques
de edema subepitelial sin erosiones bien circunscrito como
consecuencia de un aumento local de la vasopermeabilidad (Cicardi
M. et al 1998, Immunobiol. 199: 366). Los tres sitios
principalmente implicados son: tejido subcutáneo (extremidades,
cara, genitales, nalgas), órganos abdominales y vías respiratorias
superiores (laringe). La inflamación del moco intestinal puede ser
muy doloroso y el edema laríngeo es una situación que pone la vida
en peligro.
Se utiliza tratamiento profiláctico usando
andrógenos o agentes fibrinolíticos para reducir el número y
gravedad de ataques pero éstos no son eficaces contra las crisis
agudas y además inducen efectos secundarios que son incompatibles
con una terapia a largo plazo (Zurlo J. et al 1990, Fertility
and sterility 54: 64).
Se ha intentado la terapia de sustitución con el
inhibidor de C1 para el tratamiento en caso de ataques agudos. No
obstante, el producto aislado del plasma plantea un riesgo
sustancial de contaminación. Las preparaciones de plasma de
inhibidor de C1 usadas actualmente son productos tratados con vapor
o pasteurizados. El tratamiento térmico es una precaución para
eliminar agentes infecciosos nacidos en la sangre. Aunque se tome
precauciones para la eliminación/inactivación de los virus sigue
habiendo un riesgo de transmisión de virus tales como el VIH y el
virus de la hepatitis (De Filippi F. et al. 1998,
Transfusion 38: 307). Además del problema de seguridad también
suponen desventajas la falta de disponibilidad de inhibidor de C1
de plasma purificado así como los altos costes
implicados.
implicados.
FR-A-2 601 034
expone la producción del inhibidor de C1 en bacterias
recombinantes. WO 96/03051 expone mamíferos transgénicos no humanos
que producen procolágeno o colágeno en su leche.
EP-A-O 586 909 expone el uso de
inhibidor de C1 derivado de plasma para la profilaxis y terapia del
síndrome de pérdida capilar y fallo circulatorio en una variedad de
condiciones. WO 92/22320 expone la producción del inhibidor de C1 o
variantes del mismo en células CHO y el uso del mismo para tratar
respuestas sistémicas inflamatorias. Hack et al. (1992,
Lancet, 339: 378) expone la sustitución del inhibidor de C1 en
sepsis. WO 91/06650 expone muteínas del inhibidor de C1 con
resistencia mejorada para el seccionamiento proteolítico para el
uso como agentes antiinflamatorios para el tratamiento de
sepsis.
Se ha descrito la producción del inhibidor de C1
funcional en células COS o CHO por técnicas de ADN recombinante
(ver p. ej. Eldering E. et al. 1988, J. Biol. Chem. 263:
11776). No obstante, el rendimiento descrito en el rango \mug/ml
es demasiado bajo para el uso terapéutico. No sería de esperar que
la expresión del inhibidor de C1 en microorganismos produzca la
modificación correcta postranslacional del inhibidor funcional, y
por lo que sabemos, no se ha intentado.
En un aspecto, la invención provee mamíferos
transgénicos no humanos que expresan el inhibidor de C1 humano en
su leche. Tales mamíferos tienen un transgen comprendiendo un
segmento de ADN recombinante que codifica un inhibidor de C1
operativamente enlazado a por lo menos una secuencia reguladora
eficaz para promover la expresión del segmento de ADN en células de
las glándulas mamarias del mamífero transgénico no humano y un
segmento que codifica el péptido señal funcional en las células
secretoras mamarias del mamífero transgénico no humano. El
transgen, en una forma adulta del mamífero no humano o una hembra
descendiente del mamífero no humano, es capaz de expresar el
segmento de ADN recombinante en las células mamarias para producir
una forma del inhibidor de C1 que es segregada por las células
mamarias secretoras de leche del mamífero no humano transgénico. El
inhibidor de C1 es preferiblemente expresado en la leche en una
concentración de al menos 1 mg/ml.
La invención también se refiere a métodos para
proveer inhibidor de C1 humano. Tales métodos implican la
recuperación de la leche del mamífero transgénico no humano adulto
o su descendiente hembra según la reivindicación 1. Opcionalmente,
el inhibidor de C1 puede ser ulteriormente purificado de la leche.
En algunos métodos, el inhibidor de C1 es formulado con un soporte
farmacéutico como una composición farmacéutica.
La invención proporciona además leche de un
animal no humano comprendiendo un inhibidor de C1 humano. El
inhibidor de C1 preferiblemente tiene una concentración de al menos
1 mg/ml y un índice de funcionalidad de al menos 0,9.
La invención también provee composiciones
farmacéuticas comprendiendo inhibidor de C1 humano y un soporte
farmacéutico. El inhibidor de C1 puede obtenerse de leche u otras
fuentes. En algunas de estas composiciones, el inhibidor de C1
humano está libre de otras proteínas humanas. En alguna
composición, el inhibidor de C1 humano es puro en al menos el 98% o
99% p/p.
La invención también provee métodos para tratar
a un paciente que padece o es susceptible de padecer una
deficiencia de inhibidor de C1 usando las composiciones indicadas
arriba.
En otro aspecto, la invención provee el uso de
inhibidor de C1 humano purificado en la producción de un
medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible
de padecer una deficiencia de inhibidor de C1. En algunos usos, el
inhibidor de C1 humano está libre de otras proteínas humanas y en
algunos métodos, el inhibidor de C1 humano es puro en al menos el
98% o 99%.
La invención provee además un método para
purificar inhibidor de C1 humano. Tal método implica cargar una
muestra comprendiendo inhibidor de C1 humano en una columna de
intercambio catiónico bajo condiciones en las que el inhibidor de
C1 humano se une a la columna. El inhibidor de C1 humano es luego
eluido de la columna de intercambio catiónico. El eluato es cargado
en una columna de intercambio aniónico bajo condiciones en las que
el inhibidor de C1 humano se une a la columna. El inhibidor de C1
humano es luego eluído de la columna de intercambio aniónico. El
eluato es cargado en una columna de intercambio iónico metálico
bajo condiciones en las que las proteínas residuales contaminantes
se unen a la columna. El eluato conteniendo el inhibidor de C1
humano es luego recogido de la columna de intercambio fónico
metálico. El método indicado arriba es particularmente adecuado
para separar el inhibidor de C1 humano del inhibidor de C1 de
conejo u otro no humano.
Fig. 1A. Representación esquemática de los dos
fragmentos de superposición usados para microinyección. El
fragmento promotor de \alphaS1-caseína bovina
está indicado por una barra negra, los exones del inhibidor de C1
por barras grises, los intrones del inhibidor de C1 y la secuencia
flanqueadora por la línea gruesa negra. El sitio de recombinación
(recubrimiento) está marcado por la cruz. No se sabe si hay sitios
EcoRI en la región flanqueante 3'.
Fig. 1B. Representación esquemática del único
fragmento genómico usado para microinyección.
El término "identidad substancial" u
"homología substancial" significa que dos secuencias
peptídicas, cuando están óptimamente alineadas, tal como por los
programas GASP o BESTFIT usando los grosores del espacio que falta,
comparten al menos el 65 por ciento de identidad de secuencia,
preferiblemente al menos 80 o 90 por ciento identidad de secuencia,
más preferiblemente al menos el 95 por ciento de identidad de
secuencia o más (p. ej. el 99 por ciento de identidad de
secuencia). Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no
son idénticas, difieren por sustituciones de aminoácidos
conservadoras.
El término "substancialmente puro" o
"aislado" significa que una especie objetivo ha sido
identificada y separada y/o recuperada de un componente de su
entorno natural tal como leche, células de cultivo de tejido no
humano o una fuente natural. Por ejemplo, un inhibidor de C1 humano
substancialmente puro o aislado producido por medios recombinantes
en células de un ser no humano está libre de otras proteínas
humanas con las cuales existe por naturaleza. Normalmente, la
especie objetivo es la especie predominantemente presente (es
decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie
individual en la composición), y preferiblemente una fracción
sustancialmente purificada es una composición donde la especie
objetivo comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en
una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición substancialmente pura comprenderá más
de aproximadamente el 80 a 90 por ciento en peso de todas las
especies macromoleculares presentes en la composición y más
preferiblemente 90, 95, 99 o 99,9%. Más preferiblemente, la especie
objetivo es purificada hasta la homogeneidad esencial (las especies
contaminantes no pueden ser detectadas en la composición por
métodos de detección convencionales) donde la composición consiste
esencialmente en derivados de una única especie macromolecular.
Un segmento de ADN es operativamente enlazado
cuando es colocado en una relación funcional con otro segmento de
ADN. Por ejemplo, el ADN para una secuencia señal es operativamente
enlazado al ADN que codifica un polipéptido si es expresado como
una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un
promotor o intensificador es operativamente enlazado a una
secuencia de codificación si estimula la transcripción de la
secuencia. Generalmente, las secuencias de ADN que son
operativamente enlazadas están contiguas, y en el caso de una
secuencia señal tanto contigua como en fase de lectura. No
obstante, los intensificadores no necesitan estar contiguos con las
secuencias de codificación cuya transcripción controlan. El enlace
es realizado por ligadura a sitios de restricción convenientes o en
adaptadores o enlaces insertados en lugar de los mismos.
Un segmento de ADN exógeno es un heterólogo a la
célula (p. ej., de una especie diferente a la célula), u homólogo a
un segmento de ADN de la célula pero en una posición innatural en
el genoma de la célula huésped. Los segmentos de ADN exógenos son
expresados para producir polipéptidos exógenos.
En un mamífero transgénico, todas, o
sustancialmente todas las células de la línea germinal y somáticas
contienen un transgen introducido en el mamífero o un ancestro del
mamífero en una fase embrionaria temprana.
La invención provee además una composición
farmacéutica comprendiendo inhibidor de C1 humano purificado. En
algunas de estas composiciones, el inhibidor de C1 humano está
libre de otras proteínas humanas. En alguna composición, el
inhibidor de C1 humano es puro en al menos el 98% o 99% p/p.
La invención también provee métodos para tratar
a un paciente que padece o es susceptible de padecer una
deficiencia de inhibidor C1 usando las composiciones indicadas
arriba.
En otro aspecto, la invención provee el uso del
inhibidor de C1 humano purificado en la producción de un
medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible
de padecer una deficiencia de inhibidor de C1. En algunos usos, el
inhibidor de C1 humano está libre de otras proteínas humanas y en
algunos métodos, el inhibidor de C1 humano es puro en al menos el
98% o 99%.
La presente invención se refiere a la producción
efectiva y segura de inhibidor de C1 humano en la leche de animales
transgénicos, purificación del inhibidor de C1 de la leche u otras
fuentes, y usos terapéuticos del mismo. Los resultados
proporcionados por la aplicación muestran que el inhibidor de C1
puede ser producido en una concentración altísima en la leche y en
una forma que es apropiadamente plegada y postranslacionalmente
modificada para conferir actividad inhibitoria (enzima). A
diferencia del inhibidor de C1 derivado de plasma, el inhibidor de
C1 producido por animales transgénicos está libre del riesgo de
transmisión de agentes infecciosos transmitidos por la sangre. Los
animales usados para la producción del producto transgénico son una
población homogénea y pueden ser controlados mejor que los donantes
de plasma suministrando de ese modo un punto de partida mucho más
seguro para el aislamiento del inhibidor de C1. Esto hace la forma
recombinante del inhibidor de C1 más segura que el producto de
plasma para uso clínico.
La invención provee mamíferos transgénicos no
humanos que secretan inhibidor de C1 humano en su leche. La
secreción es conseguida por incorporación de un transgen que
codifica un inhibidor de C1 y al menos una secuencia reguladora
capaz de una expresión objetiva del gen en la glándula mamaria. El
transgen es expresado, y, postranslacionalmente modificado dentro
de la glándula mamaria, y luego segregado en la leche.
Se demostró que la secuencia de ADNc del
inhibidor de C1 codifica una proteína de 500 aminoácidos,
incluyendo una secuencia señal de 22 aminoácidos (Bock et
al. 1986, Biochem. 25: 4292-4301). Toda la
secuencia genómica humana del inhibidor de C1 es conocida y muestra
que el gen comprende 7 intrones (Carter P. et al. 1988, Eur.
J. Biochem. 173: 163). Los mamíferos transgénicos que expresan
variantes alélicas, cognadas e inducidas de cualquier secuencia
prototípica descrita en esta referencia están incluidos en la
invención. Tales variantes normalmente muestran una identidad
sustancial de secuencia a nivel de aminoácidos con genes de
inhibidor de C1 conocidos. Tales variantes normalmente hibridizan a
un gen conocido bajo condiciones astringentes o reaccionan de forma
cruzada con anticuerpos a un polipéptido codificado por uno de los
genes conocidos. Otros ejemplos de secuencias de ADNc y genómicas
están disponibles en GenBank. En la medida en que se requieran
secuencias clonadas adicionales de genes de inhibidor de C1, estas
pueden ser obtenidas de bibliotecas de ADNc o genómicas (de humano)
usando secuencias de inhibidor de C1 conocidas.
Los transgenes son diseñados para la expresión
objetivo de un inhibidor de C1 humano recombinante para la glándula
mamaria de un mamífero transgénico no humano que hospeda el
transgen. El procedimiento básico implica enlazar operativamente un
segmento de ADN exógeno que codifique la proteína con una secuencia
señal, y una secuencia reguladora eficaz para promover la expresión
del segmento de ADN exógeno. Normalmente, la secuencia reguladora
incluye un promotor y un potenciador. El segmento de ADN puede ser
un fragmento genómico, minigen (genómico con uno o más intrones
omitidos), ADNc, YAC, una quimera de dos genes de inhibidor C1
diferentes, o un híbrido de cualquiera de estos. La inclusión de
secuencias genómicas generalmente conduce a niveles más altos de
expresión.
En constructos genómicos, no es necesario
retener todas las secuencias intrónicas. Por ejemplo, algunas
secuencias intrónicas pueden ser eliminadas para obtener un
transgen más pequeño que facilite las manipulaciones de ADN y la
microinyección posterior. Ven Archibald et al., WO 90/05188
(incorporado como referencia en su totalidad a todos los efectos).
La eliminación de algunos intrones es también útil en algunos
ejemplos para incrementar los niveles de expresión. La eliminación
de uno o más intrones para reducir los niveles de expresión para
asegurar que se complete substancialmente la modificación
postranslacional también puede ser deseable. También es posible
suprimir alguno o todos los exones no codificantes. En algunos
transgenes, los nucleótidos seleccionados en secuencias de
codificación del inhibidor de C1 son mutados para eliminar los
sitios de seccionamiento proteolítico.
Dado que el uso al que están destinados los
inhibidores C1 producidos por mamíferos transgénicos es normalmente
la administración a seres humanos, la especie de la que se obtiene
el segmento de ADN de codificación de una secuencia de inhibidor de
C1 es preferiblemente humana. Análogamente si el uso al que es
destinado fuera una terapia veterinaria (p. ej., de un caballo,
perro o gato), es preferible que el segmento de ADN sea de la misma
especie.
Las secuencias reguladoras tal como un promotor
y potenciador son de un gen que es exclusivamente o al menos
preferiblemente expresado en la glándula mamaria (es decir, un gen
específico de la glándula mamaria). Los genes preferidos como
fuente de promotor y potenciador incluyen
\beta-caseína, \kappa-caseína,
\alphaS1-caseína,
\alphaS2-caseína,
\beta-lactoglobulina, proteína de ácido de
lactosuero, y \alpha-lactoalbumina. El promotor y
potenciador son normalmente aunque no siempre obtenidos del mismo
gen específico de la glándula mamaria. Preferiblemente este gen es
de la misma especie de mamífero que el mamífero en el que se debe
expresar el transgen. También se pueden usar secuencias de
regulación de expresión de otra especie tal como aquellas de genes
humanos. La secuencia señal debe ser capaz de dirigir la secreción
del inhibidor de C1 de la glándula mamaria. Las secuencias señales
adecuadas pueden ser derivadas de genes de mamífero que codifiquen
una proteína segregada. Las secuencias señales naturales de
inhibidores C1 son adecuadas. Además de tales secuencias señales,
las fuentes preferidas de secuencias señales son la secuencia señal
del mismo gen del que se ha obtenido el promotor y el potenciador.
Opcionalmente se incluyen secuencias reguladoras adicionales en el
transgen para optimizar los niveles de expresión. Las secuencias de
este tipo incluyen regiones flanqueantes 5', regiones transcritas
pero no traducidas 5', secuencias intrónicas; regiones transcritas
pero no traducidas 3', sitios de poliadenilación, y regiones
flanqueantes 3'. Tales secuencias son normalmente obtenidas bien
del gen específico de la glándula mamaria donde el promotor y el
promotor son obtenidos o del gen del inhibidor de C1 que está siendo
expresado. La inclusión de tales secuencias produce un medio
genético que simula aquel de un auténtico gen específico de la
glándula mamaria y/o que de un auténtico gen de inhibidor de C1.
Este medio genético produce en algunos casos (p. ej.,
\alphaS1-caseína bovina) la expresión más alta del
gen transcrito. De forma alternativa, las regiones flanqueantes 3'
y las regiones no traducidas son obtenidas de otros genes
heterólogos tal como el gen de \beta-globina o
genes víricos. La inclusión de las regiones no traducidas 3' y 5'
de un gen de inhibidor de C1 u otro gen heterólogo puede también
aumentar la estabilidad del transcrito.
En algunas formas de realización, se incluye
aproximadamente 0,5, 1, 5, 10, 15, 20 ó 30 kb de la secuencia
flanqueante 5' de un gen específico de la glándula mamaria en
combinación con aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20 ó 30 kb de la
secuencia flanqueante 3' del gen de inhibidor de C1 que está siendo
expresado. Si la proteína es expresada de una secuencia de ADNc, es
ventajoso incluir una secuencia intrónica entre el promotor y la
secuencia de codificación. La secuencia intrónica es preferiblemente
una secuencia híbrida formada por una porción 5' de una secuencia
interpuesta desde el primer intrón de la región específica de la
glándula mamaria de la que se obtiene el promotor y una porción 3'
de una secuencia interpuesta de una secuencia interpuesta IgG o gen
de inhibidor de C1. Ver DeBoer et al., WO 91/08216
(incorporado en su totalidad como referencia a todos los efectos).
Otro transgen preferido para expresar un ADNc del inhibidor de C1
está basado en el kit de vector de expresión pBC1, que está
comercialmente disponible en Invitrogen (Carlsbad, CA). El vector
pBC1 comprende el promotor de \beta-caseína
caprina así como partes del gen de \beta-caseína
caprina, que incluyen varios exones e intrones, al igual que
secuencias no traducidas 3'. La inserción del ADNc del inhibidor de
C1 en el único sitio de inserción Xhol de pBC1 producirá un ARN
quimérico comprendiendo las secuencias de ADNc del inhibidor de C1
flanqueadas por el exón de la \beta-caseína
caprina y secuencias de intrón. No obstante, tras la unión apropiada
de esta molécula de ARN quimérico, sólo las secuencias del ADNc del
inhibidor de C1 son traducidas.
Un transgen preferido para expresar una proteína
de inhibidor de C1 a partir de secuencias genómicas comprende una
secuencia genómica del inhibidor de C1 que codifica toda la
secuencia de codificación y un péptido señal, una secuencia 3' UTR
y una secuencia flanqueante 3', operativamente enlazada a un
fragmento de \alphaS1-caseína 5' conteniendo
secuencia(s) reguladora(s) suficiente(s) para
la expresión directa de la proteína de inhibidor de C1.
La información de la secuencia de ADN para todos
los genes específicos de la glándula mamaria indicados arriba está
disponible en al menos uno, y frecuentemente en varios organismos.
Ver, p. ej., Richards et al., J. Biol. Chem. 256,
526-532 (1981) (\alpha-lactalbumin
rat); Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12,
8685-8697 (1984) (rat WAP); Jones et al., J.
Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985)) (rat
\alpha-casein); Yu-Lee &
Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (rat
\gamma-casein)); Hall, Biochem. J. 242,
735-742 (1987) (\alpha-lactalbumin
human); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (bovine
\alphas1 and \kappa casein cDNAs); Gorodetsky et al.,
Gene 66, 87-96 (1988) (bovine \beta casein);
Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178,
395-401 (1988) (bovine \kappa casein); Brignon
et al., FEBS Left. 188, 48-55 (1977) (bovine
\alphaS2 casein); Jamieson et al., Gene 61,
85-90 (1987), Ivanov et al., Biol. Chem.
Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988),
Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (bovine
\beta lactoglobulin); Vilotte et al., Biochimie 69,
609-620 (1987) (bovine
\alpha-lactalbumin) (incorporado en su totalidad
como referencia a todos los efectos). La estructura y función de los
distintos genes de proteínas de la leche ha sido evaluada por
Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098
(1993) (incorporado en su totalidad como referencia a todos los
efectos). En la medida en que se puedan necesitar datos adicionales
de la secuencia, se podrían clonar fácilmente secuencias
flanqueantes de las regiones ya obtenidas usando las secuencias
existentes como sondas. Las secuencias reguladoras específicas de
la glándula mamaria de distintos organismos son asimismo obtenidas
seleccionando las bibliotecas de tales organismos usando secuencias
de nucleótidos cognadas conocidas o anticuerpos para las proteínas
cognadas como sondas.
Las estrategias generales y transgenes
ejemplares utilizando secuencias reguladoras de
\alphaS1-caseína para la expresión de una proteína
recombinante a la glándula mamaria están descritos con más detalle
en DeBoer et al., WO 91/08216 y WO 93/25567 (incorporado en
su totalidad como referencia a todos los efectos). También se han
descrito ejemplos de transgenes que utilizan secuencias reguladoras
de otros genes específicos de la glándula mamaria. Ver, p. ej.,
Simon et al., Bio/Technology 6, 179-183
(1988) y WO 88/00239 (1988) (\beta-lactoglobulin
regulatory sequence for expression in sheep); Rosen, EP 279,582 and
Lee et al., Nucleic Acids Res. 16, 1027-1041
(1988) (\alpha-casein regulatory sequence for
expression in mice); Gordon, Biotechnology 5, 1183 (1987) (WAP
regulatory sequence for expression in mice); WO 88/01648 (1988) y
Eur. J. Biochem. 186, 43-48 (1989)
(\alpha-lactalbumin regulatory sequence for
expression in mice) (incorporado en su totalidad como referencia a
todos los efectos).
Los transgenes anteriormente descritos son
introducidos en mamíferos no humanos. Muchos mamíferos no humanos,
incluyendo roedores tales como ratones y ratas, conejos, ovinos
tales como oveja, caprinos tales como cabras, porcinos tales como
cerdos, y bovinos tales como vacunos y búfalos, son adecuados. Los
bovinos ofrecen la ventaja de dar grandes cantidades de leche,
mientras que los ratones tienen las ventajas de ofrecer una fácil
transgénesis y reproducción. Los conejos ofrecen un punto
intermedio de estas ventajas. Un conejo puede producir 100 ml de
leche al día con un contenido de proteína de aproximadamente 14%
(Ver Buhler et al., Bio/Technology 8, 140 (1990))
(incorporado en su totalidad como referencia a todos los efectos), y
aún pueden ser manipulados y criados usando los mismos principios e
instalaciones similares que con los ratones. Normalmente no se
emplean mamíferos no vivíparos tales como erizo u ornitorrinco.
En algunos métodos de transgénesis, los
transgenes son introducidos en los pronúcleos de ovocitos
fertilizados. Para algunos animales, tales como ratones y conejos,
la fertilización es realizada in vivo y los óvulos
fertilizados son quirúrgicamente extraídos. En otros animales,
particularmente bovinos, es preferible extraer los óvulos de
animales vivos o del matadero y fertilizar los óvulos in
vitro. Ver DeBoer et al., WO 91/08216. La fertilización
in vitro permite introducir un transgen en células
sustancialmente sincrónicas en una fase óptima del ciclo celular
para la integración (no más tarde de la fase S). Los transgenes son
normalmente introducidos por microinyección. Ver US 4,873,292. Los
ovocitos fertilizados son luego cultivados in vitro hasta
obtener un embrión para la preimplantación conteniendo
aproximadamente 16-150 células. El estadio de
16-32 células de un embrión es descrito como una
mórula. Los embriones para la preimplantación conteniendo más de 32
células son denominados blastocistos. Estos embriones muestran el
desarrollo de una cavidad blastocele, normalmente en la fase de 64
células. Los métodos para cultivar ovocitos fertilizados para el
estadio de preimplantación están descritos por Gordon et al.,
Methods Enzymol. 101, 414 (1984); Hogan et al., Manipulation
of the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, C.S.H.L. N.Y. (1986)
(mouse embryo); Hammer et al., Nature 315, 680 (1985)
(rabbit and porcine embryos); Gandolfi et al. J. Reprod.
Fert. 81, 23-28 (1987); Rexroad et al., J.
Anim. Sci. 66, 947-953 (1988) (ovine embryos) y
Eyestone et al. J. Reprod. Fert. 85, 715-720
(1989); Camous et al., J. Reprod. Fert. 72,
779-785 (1984); y Heiman et al.
Theriogenology 27, 5968 (1987) (bovine embryos) (incorporados en su
totalidad como referencia a todos los efectos). A veces los
embriones para la preimplantación son almacenados congelados
durante un periodo de espera hasta la implantación. Los embriones de
preimplantación son transferidos al oviducto de una hembra con
embarazo simulado dando como resultado el nacimiento de un animal
transgénico o quimérico dependiendo del estadio de desarrollo en el
que el transgen es integrado. Los mamíferos quiméricos pueden ser
reproducidos para formar verdaderos animales transgénicos de
línea
germinal.
germinal.
De forma alternativa, los transgenes pueden ser
introducidos en células madres embrionarias (ES). Estas células son
obtenidas de embriones de preimplantación cultivados in
vitro. Bradlei et al., Nature 309,
255-258 (1984) (incorporado en su totalidad como
referencia a todos los efectos). Los transgenes pueden ser
introducidos en tales células por electroporación o microinyección.
Las células madres son adecuadas para introducir transgenes en
lugares cromosómicos específicos a través de recombinación homóloga.
Por ejemplo, un transgen de codificación del inhibidor de C1 puede
ser introducido en una ubicación genómica en la que se vuelve
operativamente enlazado a una secuencia reguladora endógena que
puede dirigir la expresión de la secuencia de codificación a la
glándula mamaria. Las células madres transformadas son combinadas
con blastocistos de un animal no humano. Las células madres
colonizan el embrión y en algunos embriones forman o contribuyen a
la línea germinal del animal quimérico resultante. Ver Jaenisch,
Science, 240, 1468-1474 (1988) (incorporado en su
totalidad como referencia a todos los efectos). De forma
alternativa, las células madres pueden ser usadas como una fuente de
núcleos para el trasplante en un ovocito fertilizado enucleado,
dando origen a un mamífero transgénico.
En otra forma de realización, los animales
transgénicos, preferiblemente mamíferos no humanos conteniendo un
transgen capaz de expresar el inhibidor de C1 son producidos por
métodos que implican transferencia nuclear. Se pueden emplear
varios tipos de células como donantes de núcleos para ser
transferidos en ovocitos. Se pueden obtener células donantes de
todos los tejidos de animales transgénicos que contengan un
transgen del inhibidor de C1, tales como células embrionarias,
fetales o de adulto, en varios estadios de diferenciación, que va
desde indiferenciado a completamente diferenciado, en varios
estadios del ciclo celular, p. ej. tanto células inertes como
proliferativas, y obtenidas de tejidos somáticos o de línea
germinal (ver WO 97/07669, WO 98/30683 y WO 98/39416, cada una
incorporada en su totalidad como referencia a todos los efectos). De
forma alternativa, se obtienen núcleos donantes de células
cultivadas in vitro en las que un transgen del inhibidor de
C1 es introducido usando métodos convencionales tales como
transfección de Ca-fosfato, microinyección o
lipofección y que posteriormente han sido seleccionadas o
clasificadas por la presencia de un transgen o una integración
específica de un transgen (ver WO 98/37183 y WO 98/39416, cada una
incorporada en su totalidad como referencia a todos los efectos).
Los núcleos donantes son introducidos en ovocitos mediante fusión,
inducida eléctrica o químicamente (ven cualquiera de WO 97/07669,
WO 98/30683 y WO 98/39416), o por microinyección (ver WO 99/37143,
incorporada en su totalidad como referencia a todos los efectos).
Los ovocitos trasplantados son posteriormente cultivados para
desarrollar en embriones que son posteriormente implantados en los
oviductos de animales hembra con embarazo simulado, dando como
resultado el nacimiento de descendencia transgénica (ver cualquiera
de WO 97/07669, WO 98/30683 y WO 98/39416).
Otro método de transgénesis usa vectores basados
en retrovirus para introducir el transgen deseado. Ejemplos de
vectores de este tipo incluyen el vector retrovírico derivado
(pseudotipo VSV-G) de la glicoproteína G del virus
vesicular stomatitis (VSG-G) MoMLV como han descrito
Yee et al. (1994, Meth. Cell. Biol. 43:
99-112, incorporado en su totalidad como referencia
a todos los efectos). Los ovocitos de mamífero no humano,
preferiblemente bovino, detenidos en la metafase II de la segunda
división meiótica antes de la fertilización son infectados con tal
vector pseudotipo VSV-G como han descrito Chan
et al (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 95:
14028-14033, incorporado en su totalidad como
referencia a todos los efectos) para producir descendencia
transgénica. De forma alternativa, en vez de producir un animal
genéticamente modificado, un órgano restringido, preferiblemente
una glándula mamaria es transformada por infección retrovírica para
hacer proteínas farmacéuticas. La infusión de vectores
retroviricos, llevando las secuencias que codifican el inhibidor de
C1, en glándulas mamarias no humanas para infectar las células
epiteliales mamarias permite la producción de la proteína del
inhibidor de C1 en la leche de estos animales (Archer et
al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 91:
6840-6844, incorporado en su totalidad como
referencia a todos los efectos).
Para la producción de animales transgénicos
conteniendo dos o más transgenes, los transgenes pueden ser
introducidos simultáneamente usando el mismo procedimiento que para
un único transgen. De forma alternativa, los transgenes pueden ser
inicialmente introducidos en animales separados y luego combinados
en el mismo genoma al reproducir los animales. De forma
alternativa, se produce un primer animal transgénico conteniendo uno
de los transgenes. Un segundo transgen es luego introducido en
ovarios fertilizados o células madres embrionarias de ese animal.
En algunas formas de realización, los transgenes cuya longitud
excedería de otro modo aproximadamente 50 kb, son construidos como
fragmentos de superposición. Tales fragmentos de superposición son
introducidos en un ovocito fertilizado o hemocitoblasto embrionario
simultáneamente y experimentan una recombinación homóloga in
vivo. Ver Kay et al., WO 92/03917 (incorporado en su
totalidad como referencia a todos los efectos).
Los mamíferos transgénicos de la invención
incorporan al menos un transgen en su genoma como se ha descrito
anteriormente. La introducción de un transgen en el primer estadio
celular produce normalmente animales transgénicos y su progenie en
los que sustancialmente todas las células de la línea germinal y
somáticas (con la excepción posible de algunas pocas células que
hayan sufrido mutaciones somáticas) contienen el transgen en sus
genomas. La introducción de un transgen en un estadio posterior
produce animales mosaicos o quiméricos. No obstante, algunos de
tales animales que tienen un transgen incorporado en su línea
germinal pueden ser reproducidos para producir transgénicos en los
que sustancialmente todas las células somáticas y de línea germinal
contengan un transgen. La transgénesis vírica de células de
glándula mamaria normalmente produce un mamífero transgénico en el
que el transgen está presente sólo en las células de glándula
mamaria. Tal mamífero no transmite su línea germinal a futuras
generaciones. El transgen dirige la expresión de un segmento de ADN
que codifica una proteína del inhibidor de C1 al menos
predominantemente a la glándula mamaria. El inhibidor de C1 puede
ser segregado a niveles altos de al menos 100, 500, 1000, 2000,
5000 o 10.000, 20.000 ó 50.000 \mug/ml. Sorprendentemente, los
mamíferos transgénicos de la invención exhiben sustancialmente una
salud normal. La expresión secundaria de proteínas de inhibidor de
C1 en tejidos distintos a la glándula mamaria no ocurre en un grado
suficiente para causar efectos deletéreos. Además, la proteína del
inhibidor de C1 exógeno es segregada de la glándula mamaria con una
eficiencia suficiente que hace que no se presenten problemas por
depósitos que obstruyan el aparato secretor.
La edad en la que los mamíferos transgénicos
pueden empezar a producir leche, evidentemente, varía con la
naturaleza del animal. Para bovinos transgénicos, la edad es
aproximadamente dos años y medio de forma natural o seis meses con
estimulación hormonal, mientras que para ratones transgénicos la
edad es aproximadamente 9-11 semanas. Obviamente,
sólo los miembros hembra de una especie sirven para producir leche.
No obstante, los machos transgénicos son también de valor para
reproducir descendientes hembras. El esperma de los machos
transgénicos puede ser almacenado congelado para la posterior
fertilización in vitro y generación de descendencia
hembra.
Los mamíferos no humanos transgénicos adultos
hembras producen leche que contiene concentraciones altas de
proteína de inhibidor de C1 humano exógeno. La purificación del
inhibidor de C1 de la leche puede efectuarse desnatando la leche
transgénica por centrifugado y eliminando la grasa, seguido de la
eliminación de la caseína por centrifugado de alta velocidad seguida
de filtración estática (es decir, filtración estática usando
sucesivamente tamaños de filtro en declive) o filtración de flujo
transversal, o; eliminación de caseínas directamente por filtración
cruzada. La proteína puede ser purificada de leche, si se desea, en
virtud de su propiedades diferenciadoras físicas y químicas (ver
Generally Scopes, Protein Purification
(Springer-Verlag, N.Y., 1982)) Prograis et
al., (1985) J. Medicine 16 (1-3):
303-350; Pilatte et al., (1989) J. Immunol.
Methods 120: 37-43, Reboul et al., (1977)
Febs Lett. 79: 45-50, Alsenz et al., (1987)
J. Immunol. Methods 96: 107-114, Ishizaki et
al., (1977) J. Biochem. 82: 1155-1160. Las
condiciones de purificación deberían separar preferiblemente el
inhibidor de C1 humano del inhibidor de C1 endógeno del mamífero no
humano transgénico.
Se pueden utilizar todas las cromatografías
catiónica, aniónica y de afinidad por metal para la purificación de
la proteína de inhibidor de C1 humano, de la leche u otras fuentes,
tales como cultivos de células recombinantes o fuentes naturales.
Algunos métodos usan más de una de estas fases, y algunos métodos
usan las tres fases. Aunque las fases pueden ser realizadas en
cualquier orden, un orden preferido es ejecutar la cromatografía
catiónica, seguido de cromatografía aniónica, seguido de
cromatografía de afinidad por iones metálicos.
La cromatografía catiónica puede ser realizada,
por ejemplo, usando perlas grandes de Sepharose^{TM} o
carboximetilcelulosa. Se usa un tampón de carga bajo en sal (p.
ej., 20 mM de citrato sódico, 0,02 M de cloruro sódico). El
inhibidor de C1 humano puede ser eluido en una concentración de sal
superior (p. ej., 20 mM de citrato sódico, 0,2 M de cloruro
sódico). El eluato que contiene inhibidor de C1 humano es luego
sometido a cromatografía
aniónica.
aniónica.
La matriz de una columna aniónica puede ser un
material tal como celulosa, dextrano, agarosa o poliestireno. El
ligando puede ser eitilaminoetilo (DEAE), polietilenoimina (PEI) o
un amonio cuaternario ejemplo de grupo funcional. La resistencia de
una columna de intercambio de aniones se refiere al estado de
ionización del ligando. Las columnas de intercambio iónico fuerte,
tales como aquellas que tienen un ligando de amonio cuaternario,
soportan una carga positiva permanente. En columnas de intercambio
aniónico débil, tales como DEAE y PEI, la existencia de la carga
positiva depende del pH de la columna. Las columnas de intercambio
aniónico son generalmente cargadas con un tampón bajo en sal a un
pH por encima del pI del inhibidor de C1 humano (). Las columnas
son lavadas varias veces en tampón bajo en sal para eluir las
proteínas que no se unen. Las proteínas que se han unido son luego
eluidas usando un tampón con mayor concentración de sal. Q
Sepharose FF es una columna de intercambio aniónico preferida
porque este material es relativamente poco costoso comparado con
otras columnas de cambio aniónico y tiene un tamaño de perlas
relativamente grande adecuado para la purificación a gran escala.
Bajo condiciones específicas, el inhibidor de C1 humano puede ser
eluido de la columna Q Sepharose FF sin eluir el inhibidor de C1 de
conejo u otras proteínas encontradas en la leche de conejo. Para
obtener una buena unión de a-glucosidasa humana
ácida a la columna de Q Sepharose FF, la columna es preequilibrada
en un tampón bajo en sal (es decir, menos de 50 mM, tal como tampón
de fosfato sódico). El pH del tampón debería ser aproximadamente
7,0 +/1,0 para obtener una buena unión del inhibidor de C1 humano a
la columna. El inhibidor de C1 humano es luego eluido por elución
gradual o por gradientes con una concentración mayor de sal. La
elución gradual es más tratable para la purificación a gran escala.
Muchos inhibidores de C1 humanos cargados pueden ser eluidos de una
columna Q FF en una fase (a aproximadamente 0,25 M de sal) con
relativamente alta pureza.
La cromatografía de afinidad metálica es
conducida usando una matriz, tal como Sepharose^{TM} y un ión de
metal enlazado, tal como cobre, zinc, níquel, cobalto o calcio.
También se pueden usar grupos orgánicos quelantes tal como ácido
iminodiacético. La columna es equilibrada a un pH de aproximadamente
6-8 con una sal no quelante (p. ej., cloruro
sódico) presente en una concentración relativamente alta p. ej.,
mayor de 0.2 M. Bajo estas condiciones, las proteínas residuales
contaminantes se unen a la columna, mientras que el inhibidor de C1
humano no, y puede ser fácilmente eluido.
Un procedimiento de purificación ejemplar es
descrito en la sección de ejemplos. Este procedimiento proporciona
una preparación de inhibidor de C1 que es pura en al menos el 98% o
99% (p/p) respecto a todos los contaminantes y contiene menos del
0,5%, 0,1% 0 0,05% del inhibidor de C1 de conejo (p/p). Se usa una
purificación adicional para obtener preparaciones de inhibidor de C1
con una pureza de al menos el 99%, preferiblemente al menos el
99,5%, más preferiblemente el 99,8% y más preferiblemente el
99,9%.
El inhibidor de C1 humano purificado de la leche
u otras fuentes encuentra uso en la sustitución o complementación
del inhibidor de C1 endógeno en pacientes que padecen de angioedema
hereditaria, una enfermedad caracterizada por la ausencia o
deficiencia de inhibidor de C1 funcional endógeno. Un paciente que
tenga una deficiencia genética u otra dando como resultado una
insuficiencia de inhibidor de C1 funcional puede ser tratado
administrando inhibidor de C1 exógeno al paciente. Los pacientes que
necesitan un tratamiento de este tipo pueden ser identificados por
un edema subepitelial sin erupciones como resultado de un aumento
local en la vasopermeabilidad (Cicardi M. et al 1998,
Immunobiol. 199: 366). Los tres sitios principalmente implicados
son: tejido subcutáneo (extremidades, cara, genitales, nalgas),
órganos abdominales y vías respiratorias superiores (laringe). La
inflamación de la mucosa abdominal puede ser muy dolorosa y el edema
laríngeo supone una situación que pone en peligro la vida.
Alternativa o adicionalmente, los pacientes
pueden ser diagnosticados con análisis bioquímico. Los ensayos
diagnósticos son frecuentemente realizados en plasma sanguíneo y
comprenden ensayos sobre el inhibidor de C1 funcional y
antigénicos, y determinación de los niveles de componentes
complentarios C4 y C2. Los niveles de componentes complementarios C4
y C2 son generalmente muy reducidos durante los ataques de
angioedema, y a veces también entre ataques, aunque en menor
medida. Los niveles de componentes complementarios C4 y C2 son
reducidos debido a la activación existente y consumo de los
componentes C4 y C2 por esterasa C1. En pacientes con angioedema
adquirida, el componente complementario C1 o subcomponente C1q son
generalmente reducidos junto a los niveles de los componentes C4 y
C2. Los pacientes con angioedema hereditaria pueden ser clasificados
en pacientes tipo I o tipo II. El tipo I más común está
caracterizado por niveles bajos de inhibidor de C1 circulante como
consecuencia de lesiones genéticas que suprimen la expresión del
alelo afectado (ver Tosi, M., 1998; Immunobiol. 199: 358 - 365). La
deficiencia tipo II, con niveles normales de C1 antígeno de
inhibidor, es predominantemente provocado por mutaciones puntuales
dando como resultado la expresión de una proteína disfuncional
(Tosi, M., 1992; "Molecular genetics of C1 inhibitor and
hereditary angioedema" en: Complement in health and disease. 2ª
ed., Whalei, Loos, y Weiler Eds.). Asimismo los pacientes pueden
también ser diagnosticados detectando mutaciones homozigotas o
heterozigotas en el gen del inhibidor de C1. El diagnóstico se hace
preferiblemente detectando la deficiencia de inhibidor de C1 o por
análisis de ADN antes de que aparezcan los síntomas. En la
descendencia de familias que se saben que tienen miembros que
padecen de angioedema hereditaria, es a veces aconsejable comenzar
un tratamiento profiláctico incluso antes de que se pueda hacer un
diagnóstico definitivo.
En algunos métodos, el inhibidor de C1 humano
purificado de leche u otra fuente es administrado en forma
purificada junto con un soporte farmacéutico como una composición
farmacéutica. La forma preferida depende del modo de administración
y uso terapéutico deseados. El soporte farmacéutico puede ser
cualquier sustancia compatible no tóxica adecuada para administrar
los polipéptidos al paciente. Como soporte se puede usar agua
estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes. En las
composiciones farmacéuticas también se pueden incorporar
adyuvantes, agentes tamponantes, agentes dispersantes y similares
farmacéuticamente aceptables.
La concentración del inhibidor en la composición
farmacéutica puede variar mucho, es decir, de menos de
aproximadamente 0,1% en peso, normalmente siendo de al menos
aproximadamente 1% en peso hasta 20% en peso o más.
Para la administración oral, la sustancia activa
puede ser administrada en formas de dosificación sólidas, tal como
cápsulas, comprimidos y polvos, o en formas de dosificación
líquidas, tal como elixires, jarabes y suspensiones.
El (los) componente(s) activo(s) puede(n) ser encapsulado(s) en cápsulas de gelatina junto con ingredientes inactivos y soportes en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina de sodio, talco, carbonato magnésico y similares. Ejemplos de ingredientes adicionales inactivos que pueden ser añadidos para proporcionar el color, sabor, estabilidad, capacidad tamponadora, dispersión deseables u otras características conocidas deseables son óxido de hierro rojo, gel de sílice, lauril sulfato de sodio, dióxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Se pueden utilizar diluyentes similares para hacer tabletas comprimidas. Tanto los comprimidos como las cápsulas pueden ser fabricadas como productos de liberación sostenida para proporcionar la liberación continua de medicación durante un periodo de horas. Los comprimidos pueden ser revestidos de azúcar o una película para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger el comprimido de la atmósfera, o ser revestida de forma entérica para la desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificación líquidas para la administración oral pueden contener colorantes y aromatizantes para aumentar la aceptación del paciente.
El (los) componente(s) activo(s) puede(n) ser encapsulado(s) en cápsulas de gelatina junto con ingredientes inactivos y soportes en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina de sodio, talco, carbonato magnésico y similares. Ejemplos de ingredientes adicionales inactivos que pueden ser añadidos para proporcionar el color, sabor, estabilidad, capacidad tamponadora, dispersión deseables u otras características conocidas deseables son óxido de hierro rojo, gel de sílice, lauril sulfato de sodio, dióxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Se pueden utilizar diluyentes similares para hacer tabletas comprimidas. Tanto los comprimidos como las cápsulas pueden ser fabricadas como productos de liberación sostenida para proporcionar la liberación continua de medicación durante un periodo de horas. Los comprimidos pueden ser revestidos de azúcar o una película para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger el comprimido de la atmósfera, o ser revestida de forma entérica para la desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificación líquidas para la administración oral pueden contener colorantes y aromatizantes para aumentar la aceptación del paciente.
El inhibidor de C1 es preferiblemente
administrado parenteralmente. Las preparaciones de inhibidor de C1
para la administración parenteral deben ser estériles. La
esterilización es fácilmente realizada por filtración a través de
membranas de filtración estériles, antes de o tras la liofilización
y reconstitución. La vía parental para la administración del
inhibidor de C1 es acorde con los métodos conocidos, p. ej.
inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal,
intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o
intralesional. El inhibidor de C1 es administrado continuamente por
infusión o por inyección de bolo. Una composición típica para
infusión intravenosa podría estar compuesta por de 100 a 500 ml de
NaCl al 0,9% estéril o glucosa al 5% opcionalmente complementada
con una solución de albúmina al 20% y 100 a 500 mg del inhibidor de
C1. Una composición farmacéutica típica para inyección
intramuscular estaría compuesta por, por ejemplo; 1 - 10 ml de agua
tamponada estéril y 1 a 100 mg del inhibidor de C1 de la presente
invención. Los métodos para preparar composiciones parenteralmente
administrables son muy conocidos en la técnica y están descritos
con más detalle en varias fuentes, incluyendo, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing,
Easton, PA, 1980) (incorporado en su totalidad como referencia a
todos los efectos).
La presente invención provee métodos efectivos
para tratar la deficiencia de inhibidor de C1 usando inhibidor de
C1 humano exógeno. El inhibidor de C1 también puede ser usado para
tratar otra enfermedades donde la actividad del sistema
complementario clásico (componente C1 activado) y/o actividad del
sistema de contacto (factor XIIa, calicreína, factor XIa) contribuye
a indeseadas respuestas inmunológicas o inflamatorias. Tales
enfermedades incluyen infarto de miocardio (WO 95/06479);
respuestas sistémicas inflamatorias adquiridas entre las cuales
sepsis severa, shock séptico, ARDS (síndrome de insuficiencia
respiratoria del adulto), disfunción múltiple de órganos y
preeclampsia (WO 92/22320: Genentech Inc); síndrome de pérdida
capilar y fallo circulatorio en casos de quemaduras graves,
politraumas, operaciones con circulación extracorpórea (EP
0586909), infusión de citoquina terapéutica (p. ej. IL2),
enfermedad aguda por rechazo del receptor después de un trasplante
alogeneico (o autológico) de médula ósea. Otras indicaciones pueden
ser trastornos en los que el exceso de activación del sistema
complementario y/o de contacto, y/o consumo de inhibidor de C1 o
deficiencia de inhibidor de C1 funcional (relativo) ha sido
implicado en la fisiopatología, tal como meningitis, artritis
reumatoide, rechazo hiperagudo después de un alo- o xenotransplante
y pancreatitis.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención son normalmente administradas por vía intravenosa. En
algunas circunstancias también es posible la administración
intradérmica, intramuscular u oral. Las composiciones pueden ser
administradas para el tratamiento profiláctico de individuos que
padecen o sufren el riesgo de padecer una enfermedad, en una
cantidad suficiente para prevenir, retrasar o reducir la gravedad de
la enfermedad subsecuente. Para usos terapéuticos, las
composiciones farmacéuticas son administradas a un paciente que
padece una enfermedad estable en una cantidad suficiente para
reducir la gravedad de los síntomas y/o prevenir o detener el
desarrollo ulterior de síntomas. Una cantidad adecuada para
conseguirlo es definida como una "dosis terapéutica o
profilácticamente efectiva". Tales dosis efectivas dependerán de
la gravedad de la enfermedad y del estado general de la salud del
paciente. Una dosificación efectiva es aquella necesaria para
conseguir una concentración en plasma de al menos aproximadamente
50 \mug de inhibidor de C1 funcional por ml de plasma,
preferiblemente al menos aproximadamente 100 \mug de inhibidor de
C1 funcional por ml de plasma, más preferiblemente al menos
aproximadamente 200 \mug de inhibidor de C1 funcional por ml de
plasma, y más preferiblemente al menos aproximadamente 250 \mug
de inhibidor de C1 funcional por ml de plasma. Normalmente estas
concentraciones en plasma de inhibidor de C1 funcional son
mantenidas durante al menos 1 hora, preferiblemente al menos 4
horas, más preferiblemente al menos 12 horas, y más preferiblemente
al menos 24 horas.
En los métodos presentes, el inhibidor de C1 es
normalmente administrado en una dosificación de aproximadamente 10
mg/kg de masa corporal del paciente o más por semana a un paciente.
Frecuentemente las dosificaciones son mayores de 10 mg/kg por
semana. Los regímenes de dosificación pueden variar de 10 mg/kg por
semana hasta por lo menos 1000 mg/kg por semana. Normalmente los
regímenes de dosificación son 10 mg/kg por semana, 20 mg/kg por
semana, 30 mg/kg por semana, 40 mg/kg por semana, 60 mg/kg por
semana, 80 mg/kg por semana y 120 mg/kg por semana. En regímenes
preferidos se administra 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg una vez, dos
veces o tres veces por semana. El tratamiento es normalmente
continuado durante al menos 4 semanas, a veces 24 semanas, y a
veces durante la vida del paciente. El tratamiento es
preferiblemente administrado por vía intravenosa. Opcionalmente,
los niveles del inhibidor de C1 son vigilados tras el tratamiento
(p. ej., en el plasma) y se administra otra dosificación cuando se
detecta que los niveles descienden sustancialmente por debajo p.
ej., del 40%, del 30%, o del 20% de los valores en personas
normales. Alternativamente, en algunas condiciones, puede ser
deseable conseguir niveles superiores a los normales, p. ej. 150%
de los niveles normales; 200% de los niveles normales o incluso 300%
de los niveles normales.
El inhibidor de C1 humano producido en la leche
de animales transgénicos tiene varios otros usos. Por ejemplo, el
inhibidor de C1 puede ser usado como un reactivo de control en kits
para el diagnóstico in vitro de actividad de inhibidor de C1
endógeno. Alternativamente, el inhibidor de C1 puede ser
inmovilizado en dispositivos extracorporales para eliminar
anticuerpos del inhibidor anti-C1 de los
pacientes.
Se construyó un grupo de dos vectores de
expresión conteniendo partes de superposición de la secuencia
genómica del gen del inhibidor de C1 humano. Juntos, estos
plásmidos contienen el promotor de
\alphaS1-caseína bovina y la secuencia genómica
del inhibidor de C1 humano completa. Todos los fragmentos del
inhibidor de C1 usados fueron derivados del clon P1
DMDC-HFF#1-1112-69,
obtenido de Genome Systems Inc. (8620 Pennell Drive, St. Louis,
Missouri 63114), que fue aislado de una genoteca humana P1 por PCR
con dos cebadores específicos del inhibidor de C1 (Apéndice
1A).
El plásmido p\alphaS1/5'C1, que incluye 6,3 kb
de secuencias reguladoras de \alphaS1-caseína
bovina fundidas en la parte 5' del gen del inhibidor de C1, fue
construido como sigue. Primero, el pKUN1 [Konings, 1986 Gene 46,
269-76] fue digerido con EcoRI y SalI
y ligado al enlazador 1 (Apéndice 1B), seguido de la eliminación
del sitio ClaI rellenándolo con Klenow y ligando. Del
plásmido resultante pKUN2\DeltaC, se hizo pKUN2\DeltaCNBS
ligando el enlazador 2 (Apéndice 1C) en los sitios NotI y
SalI. El enlazador 2 proporcionó un sitio ClaI, 19
pares de bases del exón de \alphaS1-caseína (con
el primer C mutado a un T para prevenir la metilación del sitio
ClaI), los 6 pares de bases flanqueando normalmente el sitio
de inicio de traducción ATG del inhibidor de C1 ATG, y un sitio
SflI compatible con el sitio BglI en el gen del
inhibidor de C1 que se superpone al ATG. Luego el enlazador 3
(Apéndice 1 D) fue ligado en los sitios SflI y MluI de
pKUN2\DeltaCNBS, dando como resultado el plásmido
pKUN2\DeltaCEV. El enlazador 3 introdujo un segundo sitio
SflI compatible con el siguiente sitio BglI en el gen
de inhibidor de C1, situado 4,8 kb corriente abajo del ATG, y un
sitio NotI. Posteriormente, el fragmento BglI de 4,8
kb fue clonado del clon P1 (supra) en los sitios SflI
defosforilados del plásmido pKUN2\DeltaCEV, dando como resultado
el constructo pK-BglI-C1. Este
constructo no tiene el exón 1 ni los primeros 16 pares de bases del
exón 2, que juntos forman la mayor parte de la región 5' UTR (región
no codificante) del inhibidor de C1 pero sigue teniendo el codón de
inicio traduccional ATG, que está localizado en el exón 2. De este
plásmido, el fragmento de 4,85 kb ClaI-SalI fue
clonado en el plásmido p(-8 kb,CS) (solicitud de patente WO
93/25567), dando como resultado el plásmido
p\alphaS1/5'-C1. Este enlaza el fragmento del
inhibidor de C1 al fragmento del promotor de 6,2 kb
NotI-ClaI de \alphaS1-caseína bovina
que incluye el primer exón 1 de 20 pares de bases de
\alphaS1-caseína (base de datos EMBL, número de
entrada X59856; [Koczan, 1991. Nucleic Acids Res. 19,
5591-5596]), directamente flanqueados por el sitio
de ClaI usado en la fase de clonación.
El segundo vector, pIC20R/3'-C1
fue hecho por digestión del clon P1 (supra) con SpeI,
seguido de ligadura del fragmento SpeI de 20 kb conteniendo
los exones 4-8 más aproximadamente 5,5 kb de ADN
flanqueando 3', en el sitio de XbaI defosforilado de pIC20R
[Marsh, 1984 Gene 32, 481-485]. La superposición
entre p\alphaS1/5'-C1 y
pIC20R/3'-C1 fue de 2,0 kb.
También se hizo un constructo único conteniendo
el gen de inhibidor de C1 humano completo fundido en el promotor de
\alphaS1-caseína bovina. Primero, se digirió el
plásmido pK-BglI-C1 del inhibidor
(supra) con SpeI y SalI y se ligó al enlazador
4 (Apéndice 1E), dando el plásmido
pK-BgSpL-C1. Luego, el fragmento
SpeI de 20 kb del clon P1 (supra) fue clonado en
pK-BgSpL-C1 digerido con
SpeI y defosforilado. Del vector resultante, nombrado
pCBSpeIC1, se ligó un fragmento ClaI-SalI de 22 kb
conteniendo toda la región de codificación de C1 más 5,5 kb de ADN
flanqueando 3' en p(-Bkb,CS) (supra) y se digirió con
ClaI y SalI. El constructo final fue denominado
p6,2C1-INH2.
p6,2C1-INH2.
Se produjeron ratones transgénicos por inyección
pronuclear de ovocitos fertilizados, esencialmente como ha sido
descrito por Hogan et al.; 1986; "Manipulating the Mouse
Embryo", Cold Spring Harbour Press NY.
p\alphaS1-5'C1 (ver figura 1A) fue digerido con
NotI, dando un fragmento de 11,3 kb que fue aislado por
purificación en gel y electroelución. De forma similar se preparó un
fragmento ScaI-EcoRV de 15,8 kb de
pIC20R/3'-C1, extendiéndose desde el intrón de 3 a
2 kb más allá del último exón. Ambos fragmentos fueron combinados
(en una concentración de 3 ng/\mul) e inyectados en el pronúcleo
de ovocitos de ratón fertilizados, que fueron implantados en el
útero de ratones nodrizas con embarazo simulado. Se analizó la
inserción del constructo de gen genómico de inhibidor de C1 humano
en la descendencia por transferencia de Southern de ADN aislado de
colas recortadas. Se controló si se había producido una
recombinación homóloga correcta entre los fragmentos de
superposición sobre borrones de Southern y por PCR. Se obtuvieron
33 ratones transgénicos, 31 de los cuales contenían transgenes
correctamente recombinados. 17 de esos 31 ratones fueron
seleccionados para la reproducción ulterior usando análisis FISH
para excluir animales con sitios de integración múltiple y/o un
nivel alto de mosaicismo.
Se digirió p6,2C1-INH2 con
NotI y SalI, produciendo un fragmento de 28,2 kb
(Figura 1 B). Se usó una solución de este fragmento en una
concentración de 3 ng/\mul para la microinyección en ovocitos de
ratón, como se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron 30 ratones
transgénicos, 12 de los cuales fueron seleccionados para la
reproducción ulterior por análisis FISH.
Se generaron conejos transgénicos según el
protocolo siguiente. Cada animal donante hembra (de raza Nueva
Zelanda blanco) fue tratado subcutáneamente durante 3 días con FSH
porcino (Sigma). En el primer y el segundo día se inyectó 0,5 U a
aprox. 8 am y 6 pm. En el tercer día se inyectó 0,5 U a aprox. 8 am
y a 11 pm. En el cuarto día, las hembras fueron apareadas (con
sementales de la raza Nueva Zelanda blanco) a las 2 pm. Directamente
tras el apareamiento se inyectaron las hembras intramuscularmente
con 150 U de Pregnil (Organon humano). En el día quinto los
animales donantes fueron sacrificados a las 9 am por una inyección
intravenosa de T61 (Hoechst Roussel Vet) y los embriones recogidos
por enjuague. Usando el espacio de tiempo relativamente largo entre
el apareamiento y el sacrificio de los animales, no fue necesario
tratar los embriones con hialuronidasa ni por microdisección para
eliminar células circundantes que se liberaron espontáneamente. Se
mantuvieron los embriones en un medio RD (1:1 (v/v) mezcla de
RPMI-1640 y medio de Eagle modificado con medio de
Dulbecco (modificación de glucosa alta) complementado con 100 U de
penicilina-G/ml, 100 mg de sulfato de
estreptomicina/ml y 15 mg de Fracción V BSA/ml; Carney E.W. y Foote
R.H. (1991) J. Reprod. Fert. 91:113-123) a 39ºC. Se
realizaron microinyecciones (2-3 picolitros por
ovocito) inmediatamente y los embriones fueron reimplantados en
ambos oviductos (10-15 embriones por cada lado) de
hembras receptoras. Las hembras receptoras fueron preparadas por
inyección subcutánea de 15 U de Folligon de caballo (Intervet) en
el día 2. En el cuarto día, las hembras receptoras recibieron una
inyección intramuscular con 0,33 ml de Receptal (0,0014 mg
buserelini, Hoechst Roussel Vet.).
Inicialmente se generaron unos conejos usando
los constructos de superposición. El análisis de PCR mostró que no
sólo el transgen correctamente recombinado estaba presente sino
también los fragmentos 5' y 3' ligados no recombinados. En tal
configuración, el exón 4 es duplicado. No es deseable tener copias
reordenadas del transgen, como las que podrían surgir en
transcritos aberrantes y, por lo tanto, en moléculas de proteína
desviadas. En consecuencia, se decidió usar sólo el constructo
genómico único para la generación de conejos transgénicos para la
producción comercial de inhibidor de C1.
Se digirió p6,2C1-INH2 con NotI
y SalI, produciendo un fragmento de 28,2 kb (Figura 1B). Se
usó una solución de este fragmento en una concentración de 3
ng/\mul para la microinyección en ovocitos de conejo fertilizados.
Se generaron diez conejos transgénicos y se analizaron por PCR,
transferencia Southern y FISH. Una línea (3358) no contenía una
copia completa del transgen. Las restantes nueve líneas fueron
reproducidas para obtener leche para el análisis de expresión.
Se analizó la leche de ratones transgénicos y
controles no transgénicos por un radioinmunoensayo de unión de
enzimas (para una descripción del ensayo ELISA, ver Apéndice 2;
para los datos de expresión ver tablas 1, 2 y 3). El ensayo ELISA
mide las cantidades totales del inhibidor de C1 (tanto activo como
inactivo). Los niveles medios del inhibidor de C1 obtenido en los
ratones transgénicos hechos con los fragmentos de superposición
variaron de 0,04 - 5 mg/ml. Algunas muestras individuales de las
líneas de mayor producción contenían más de 20 mg/ml. Los niveles
medios del inhibidor de C1 obtenido en los ratones transgénicos
hechos con el único fragmento varió de 0,1 \mug/ml - 10 mg/ml.
Algunas muestras individuales de la línea de mayor producción (5903)
contenían más de 20 mg/ml.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se analizó la leche de conejos transgénicos y
controles no transgénicos por dos ensayos diferentes (para una
descripción de estos ensayos ELISA, ver Apéndice 2B; para los datos
de expresión ver tabla 4). El ensayo ELISA evalúa la cantidad total
de proteína de inhibidor de C1 antigénica presente en la leche,
mientras que el ensayo de actividad de inhibidor de C1 mide la
cantidad de inhibidor de C1 funcionalmente activo. Los niveles
medios de inhibidor de C1 activo obtenido en los conejos
transgénicos variaron de 0,05 - 20 mg/ml. Algunas muestras
individuales de las líneas de mayor producción contenían más de 25
mg/ml.
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La presencia de R-C1INH en leche
fue confirmada por inmunotransferencia y análisis de
SDS-PAGE de fracciones que fueron obtenidas después
de la purificación de leche de conejo no transgénico. Del nivel
estimado de R-C1INH y la concentración de
rH-C1INH en leche transgénica se concluyó que era
necesaria la separación. La separación de rH-C1INH
de R-C1INH fue conseguida usando cromatografía de
intercambio de aniones en Q Sepharose (Pharmacia) a pH 5,5 y 7,0.
La diferencia en elución fue aproximadamente 0,1 M de cloruro
sódico, que es bastante conveniente para la fabricación.
Se descongeló eche de conejo transgénico de
línea 2972p teniendo una concentración de rH-C1INH
de 15 g/l, se agrupó y diluyó con 1 volumen de 20 mM de citrato
sódico pH 5,5. El pH después de la dilución fue de 7,0. La leche
diluida fue posteriormente filtrada sobre un filtro Polygard® de 25
\muM (Millipore) y desnatada por centrifugado continuo a
temperatura ambiente. Se aplicaron doscientos mililitros de leche
desnatada en una columna SP Sepharose de perlas grandes (Pharmacia)
(50/15) que fue equilibrada en 20 mM de citrato sódico pH 7,0 +
0,05 M de cloruro sódico. El caudal lineal fue 60 cm/h. Después de
cargarla, la columna fue lavada con 5 volúmenes de columna de 20 mM
de citrato sódico pH 7,0 + 0,05 M de cloruro sódico y el
rH-C1INH unido fue eluido con una fase de 20 mM de
citrato sódico pH 7,0 + 0,2 M de cloruro sódico. El
rH-C1INH eluido fue filtrado a través de 0,22
\muM; diluido 3 veces en 20 mM de fosfato sódico pH 7,0 y
aplicado con un caudal lineal de 60 cm/h en una columna Q Sepharose
de alto rendimiento (Pharmacia) (50/20), equilibrada en 20 mM de
fosfato sódico pH 7,0 + 0,05 M de cloruro sódico. Después de lavar
la columna con 10 volúmenes de 20 mM de fosfato sódico pH 7,0 +
0,05 M de cloruro sódico a un caudal lineal de 90 cm/h el
rH-C1INH unido fue eluido con una fase de 20 mM de
fosfato sódico pH 7,0 + 0,25 M de cloruro sódico. El caudal lineal
durante la elución fue 60 cm/h. La fracción
rH-C1INH fue posteriormente cargada en una columna
de Quelación Sepharose de flujo rápido cargada con Zinc (Pharmacia)
(50/15) con un caudal lineal de 60 cm/h en 20 mM de fosfato sódico
pH 7,0 + 0,25 m de cloruro sódico. La fracción de proteína que no
fue absorbida por la columna fue concentrada y el tampón cambió a
suero salino tamponado con fosfato usando una membrana de 50
cm^{2} Biomax-30 (Millipore). El
rH-C1INH concentrado fue filtrado a través de 0,22
\muM, dividido en partes alícuotas y almacenado por debajo de
-70ºC.
La recuperación de este proceso fue vigilado
usando un ensayo ELISA específico para rH-C1INH y
fue alrededor del 40%. Además la actividad de
rH-C1INH se mantuvo durante toda la purificación
como se determinó por la inhibición de C1s. La pureza fue
determinada sobre el 99% por SDS-PAGE y
cromatografía de exclusión de tamaño y sobre el 99,95% usando un
ensayo ELISA específico que detecta proteínas huéspedes presentes
en leche de conejo.
Se filtró rH-C1INH purificado
(100 \mul, 2 mg/ml) a través de una columna de filtración en gel
Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia) en suero salino tamponado con
fosfato + 0.15 M de cloruro sódico con un caudal de 0,5 ml/min
(Äkta explorer 10 system, Pharmacia). Se detectó la elución de
proteína por absorción a 205 nm. Se determinó el porcentaje de
picos de elución por integración usando el software Unicornio
(Pharmacia).
La presencia relativa de impurezas relacionadas
con el huésped (HRI) en el producto final fue determinada por un
enzimoinmunoanálisis cuantitativo (ELISA). Se generó la unión de
anticuerpos policlonales al inhibidor de C1 humano sin unión al
inhibidor de C1 de conejo inmunizando conejos con inhibidor de C1
humano. Se generaron anticuerpos específicos contra las proteínas
de leche de conejo por inmunización de ovejas y cabras con proteínas
de leche y de lactosuero. Se evaluó la especificidad de los
antisueros por análisis de transferencia Western. Se seleccionaron
aquellos antisueros que reaccionaron con la mayoría si no todas la
proteínas de leche de conejo. Se purificó toda la fracción IgG en
una columna Protein G Sepharose según las instrucciones del
fabricante (Pharmacia). Se usó el IgG purificado para el desarrollo
del sándwich ELISA.
Se revistieron placas de microtitulación
(Polysorp, Nunc) durante toda la noche a temperatura ambiente con 5
\mug/ml de IgG purificado en 0,1 M de carbonato sódico pH 9,4.
Después de lavar con PBS/0,02% Tween-20, los
pocillos fueron incubados con muestras diluidas en PBS/0,3% BSA/0,1%
Tween-20/10 mM EDTA durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después de lavar con PBS/0,02% Tween-20
se incubaron los pocillos con IgG marcado con peroxidasa (1:2000 en
PBS/0,3% BSA/0,1% Tween-20) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Después de otro lavado se añadió la solución
de sustrato (kit de sustrato ImmunoPure TMB, Pierce). Se detuvo la
conversión del sustrato por la adición de 2 M de H_{2}SO_{4} y
se leyeron las placas a 450 nm en un lector de placas SLT 340 ATTC
(SLT Labinstruments) usando el software BIOLISE. Se realizaron
todas las incubaciones con volúmenes de 100 \mul.
Se calculó la cantidad total de impurezas
relacionadas con el huésped, expresada como partes por millon (ppm)
en base al peso/peso a partir de la reactividad de las muestras de
rH-C1INH purificado en comparación con un estándar
de leche cuya concentración de proteína fue determinada por el
ensayo Bicinconínico (Pierce) usando albúmina de suero bovino como
estándar.
Como control, se purificó el inhibidor de C1 de
conejo de plasma de conejo. La purificación fue efectuada por
precipitación con polietilenoglicol, captura por cromatografía de
intercambio de cationes, purificación intermedia por cromatografía
de afinidad con lectina, y refinado por cromatografía de
intercambio de aniones.
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Depósitos de leche de las líneas 2972q, 2972p y
2977q fueron mezclados con volúmenes iguales de 20 mM de citrato
sódico pH 5,5 después de lo cual se ajustó el pH a 7,0. La leche
diluida fue desnatada por centrifugado a 1300 g durante 20 minutos
a 4ºC y posteriormente sometida a cromatografía de intercambio de
cationes en una columna SP Sepharose equilibrada en 20 mM de
citrato sódico pH 7,0 (tampón A). Después de cargarla, la columna
fue lavada con tampón A y las proteínas unidas fueron eluidas con
0,15 M de cloruro sódico en tampón A con un caudal lineal de 60
cm/h. Las fracciones de elución conteniendo el inhibidor de C1,
como se determinó con el ensayo ELISA específico (ver Apéndice 2BI),
fueron agrupadas y microfiltradas (0,45 \muM), seguido de
filtración a través de una columna de gelfiltración Superdex 200 (en
20 mM de fosfato sódico, conteniendo 0,15 M de NaCl con un caudal
lineal de 15 cm/h). Las fracciones conteniendo inhibidor de C1
fueron agrupadas, divididas en partes alícuotas y almacenadas por
debajo de -50ºC. La recuperación de cada fase fue determinada como
superior al 90%. La pureza, como se determinó usando
SDS-PAGE cuantitativo (ver Apéndice 3), fue superior
al 98%.
También se filtró Cetor ® (= inhibidor de C1
purificado de plasma humano agrupado, CLB, Holanda) usado como
control en estudios de caracterización en Superdex 200 según las
mismas condiciones mencionadas anteriormente.
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El índice de funcionalidad (F.I.), definido como
la proporción entre inhibidor de C1 funcionalmente activo y
antígeno de inhibidor de C1 total, es dado en la tabla 5. La
cantidad de antígeno de inhibidor de C1 total es medido usando un
ensayo ELISA como se describe en el Apéndice 2BI. La cantidad de
C1INH funcionalmente activo es determinada usando la prueba de
actividad C1INH, como se describe en el Apéndice 2BI1.
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Las diferentes preparaciones de inhibidor de C1
fueron analizadas en 4-20% SDS-PAGE
bajo condiciones reductoras y no reductoras. Todas las
preparaciones de inhibidor de C1 migran como una única banda bajo
condiciones tanto reductoras como no reductoras y las bandas son
reconocidas por anticuerpos de inhibidor anti-C1 de
conejo (DAKO, A0253) en transferencia Western. Bajo condiciones no
reductoras Cetor® tiene un peso molecular aparente de
aproximadamente 105 kDa, mientras que los tres inhibidores de C1
recombinantes diferentes tienen un peso molecular aparente de
aproximadamente 96 kDa. Bajo condiciones reductoras los pesos
moleculares aparentes son aproximadamente 95 kDa para Cetor® y 80
kDa para las preparaciones de C1INH recombinantes.
El análisis de secuencias fue realizado por
degradación del C-terminal (Boyd LV et al.
(1992) Anal. Biochem. 206, 344-352; Boyd VL et
al. (1995) J. Organic Chem. 60, 2581-2587) con
un secuenciador automatizado (modelo 477A, Applied Biosystems)
usando protocolos, reactivos, productos químicos y materiales de
Applied Biosystems (Warrington, Reino Unido y Foster City,
California, EEUU). Los aminoácidos ATH gradualmente liberados fueron
identificados con una HPLC en línea (modelo 120A, Applied
Biosystems) en base a sus tiempos de elu-
ción.
ción.
Se encontraron secuencias
C-terminal idénticas en las diferentes
preparaciones de inhibidor de C1 recombinante y Cetor®. En cada
muestra, la secuencia principal mostró un Ala en el
C-terminal. Debido a las limitaciones del método de
análisis, no se pudieron determinar los aminoácidos en la posición 2
a 4 (empezando desde el C-terminal). El análisis de
las señales menores revela que no hay ninguna heterogeneidad
aparente en el C-terminal en las diferentes
preparaciones de inhibidor de C1 recombinante y Cetor®.
\vskip1.000000\baselineskip
Leche congelada de la línea 2972p, 11 kg en
total, fue almacenada congelada, descongelada y agrupada. Después
de la descongelación se añadió una cantidad igual de 20 mM de
citrato sódico pH 5,5. La leche diluida fue filtrada sobre 25
\muM y desnatada por centrifugado continuo a temperatura ambiente.
La leche desnatada fue aplicada posteriormente con un caudal de 60
cm/h en una columna SP Sepharose de perlas grandes (Pharmacia,
Suecia) (450/15) que fue equilibrada en 20 mM de citrato sódico pH
7,0 + 0,02 M de cloruro sódico. Después de cargarla, la columna fue
lavada con 5 volúmenes de columna de 20 mM de citrato sódico pH 7,0
+ 0,02 M de cloruro sódico y el rH-C1INH unido fue
eluido con una fase de 20 mM de citrato sódico pH 7,0 + 0,2 M de
cloruro sódico. El rH-C1INH eluido fue filtrado a
través de 0,2 \muM e incubado durante 6 horas a 25ºC en presencia
de Tween 80 al 1% (Merck, Alemania) y Tri (n) butil fosfato al 0,3%
(Merck, Alemania) para inactivar los virus desarrollados. Después de
la inactivación vírica la agrupación fue diluida 3 veces en 20 mM
de fosfato sódico pH 7,0, filtrado sobre 0,2 \muM y aplicado con
un caudal de 60 cm/h en una columna Q Sepharose de alto rendimiento
(Pharmacia, Suecia) (450/15) que fue equilibrada en 20 mM de
fosfato sódico pH 7,0 + 0,05 M de cloruro sódico. Después de lavar
la columna con 5 volúmenes de columna de 20 mM de fosfato sódico pH
7,0 + 0,05 M de cloruro sódico, el rH-C1INH fue
eluido con una fase de 20 mM de fosfato sódico pH 7,0 + 0,22 M de
cloruro sódico. El eluato de la columna Q Sepharose fue
posteriormente diluido 2 veces en 20 mM de fosfato sódico pH 7,0,
filtrado sobre 0,2 \muM y aplicado con un caudal de 30 cm/h en una
columna Sepharose quelante de flujo rápido cargada con zinc
(Pharmacia, Suecia) (450/15), equilibrada en 20 mM de fosfato
sódico pH 7,0 + 0,1 M de cloruro sódico. Después de la carga, la
columna fue lavada con 20 mM de fosfato sódico pH 7,0 + 0,1 M de
NaCl y se recogió la fracción de proteína que no fue absorbida por
la columna. Esta fracción de proteína fue ulteriormente filtrada
sobre filtración 0,2 \muM seguida de filtración sobre una membrana
Vira/Gard 500 (AG/T, EEUU) para eliminar los posibles contaminantes
víricos. En un experimento posterior un filtro Planova 15N de Asahi
(Japón) sustituyó la membrana Vira/Gard. Después de esta filtración
vírica, el rH-C1INH fue concentrado y el tampón
cambiado a 20 mM de citrato sódico pH 7,0 usando una membrana
Biomax-10 (Millipore, EEUU). El
rH-C1INH concentrado fue filtrado a través de 0,1
\muM, colocado en viales y almacenado a -20ºC. En un experimento
posterior se añadió sacarosa al 6,5% al rH-C1INH
concentrado, que fue posteriormente filtrado a través de 0,1
\muM, colocado en viales y liofilizado.
La recuperación de este proceso fue del 37%
usando un ensayo ELISA específico para rH-C1INH.
Además se conservó la actividad de rH-C1INH durante
toda la purificación como se determinó por la inhibición de C1s. Se
determinó una pureza superior al 99% por cromatografía de exclusión
por tamaño y superior al 99,999% usando un ensayo ELISA específico
que detecta proteínas huéspedes presentes en la leche de conejo. La
cantidad de R-C1INH endógeno fue cuantificada por
debajo de 1 ppm.
\newpage
Apéndice
1
Apéndice
2
Los niveles de expresión del inhibidor de C1 en
leche de ratón fueron determinados usando un ensayo ELISA según
Veerhuis et al. (1998) [Veerhuis; 1998 Acta Neuropatol 96,
287-296]. En resumidas cuentas, se revistieron
placas de 96 pocillos de ELISA con anticuerpos monoclonales de
inhibidor anti-C1, seguido de una incubación con
muestras de leche. Se detectó el inhibidor de C1 unido usando
anticuerpo de inhibidor anti-C1 de conejo marcado
con biotina seguido de una incubación con estreptavidina marcada
con peroxidasa y una reacción colorimétrica con
(3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) TMB. El desarrollo
de color fue detenido después de 20 minutos con 100 \mul/pocillo
de 2 M de H_{2}SO_{4} y leído a 450 nm con un lector de placas
340 ATTC (SLT Labinstruments), usando el software BIOLISE (versión
1.65). Todas las incubaciones fueron realizadas a temperatura
ambiente (1 hora) y entre cada incubación, los pocillos fueron
lavados 5 veces con suero salino tamponado con fosfato (PBS)
conteniendo Tween-20 al 0,02%. Se usaron diluciones
en serie de plasma humano normal (NP) agrupado como referencia para
calcular los niveles de inhibidor de C1 en leche. Según los
estándares CLB, NP contiene 275 \mug/ml de inhibidor de C1.
Se revistieron placas de 96 pocillos con 3,5
\mug/ml de anticuerpos de inhibidor de anti-C1 de
conejo (DAKO, A0253) en suero salino tamponado con fosfato, pH 7,4
(PBS) (100 \mul/pocillo) durante toda la noche a temperatura
ambiente. Después del lavado, los pocillos fueron incubados con 100
\mul/pocillo de muestras de leche diluida durante 1 hora a
temperatura ambiente. Se detectó el inhibidor de C1 unido usando
100 \mul/pocillo de anticuerpos de inhibidor
anti-C1 de conejo marcado con peroxidasa diluidos
1:5000 (1 hora a temperatura ambiente) y se visualizó con 100
\mul/pocillo de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (=
TMB, ImmunoPure TMB Substrate Kit, Pierce 34021) como sustrato. Se
detuvo el desarrollo de color después de 20 minutos con 100
\mul/pocillo de 2 M de H_{2}SO_{4} y se leyeron a 450 nm con
un lector de placas 340 ATTC (SLT Labinstruments), usando el
software BIOLISE (versión 1.65). Los resultados fueron calculados
por referencia a las diluciones en serie del inhibidor de C1
purificado de plasma (Sigma, E0518) (0-130 ng/ml).
Todas las diluciones de las muestras (leche) y conjugados fueron
preparadas en PBS/2% leche/0,1% Tween-20.
Se incubaron muestras de leche diluida de 25
\mul con 25 \mul 1,5 \mug/ml de C1s (Kordia, Holanda/ Enzyme
Research Lab. Inc., EEUU) en pocillos de una placa de 96 pocillos,
durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después, se determinó la
actividad de los C1s restantes añadiendo 25 \mul de 1 mM
Pefachrome® C1E-5019 (Kordia, Holanda/Pentapharm
Ltd., Suiza, PF 087-31). Inmediatamente después de
la adición del sustrato cromogénico el cambio en absorbencia a 450
nm fue vigilado durante 45 minutos a 37ºC usando un lector de
placas 340 ATTC (SLT Labinstruments), usando el software BIOLISE
(versión 1.65). Los resultados fueron relacionados con una curva de
calibración preparada por diluciones en serie de inhibidor de C1
purificado de plasma (Sigma, E0518) (0-6
\mug/ml). Las muestras de leche y los C1s fueron diluidos en
PBS/0,1% Tween-20. Se diluyó Pefachrome®
CIE-5019 en agua
destilada.
destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
3
El inhibidor de C1 obtenido de Sigma (Sigma,
E0518) y las diferentes preparaciones de inhibidor de C1 purificado
recombinante fueron diluidos en PBS/0,1% Tween-20 y
mezclados con un volumen igual de tampón de muestra no reducido
(Tris-glicina (pH 6,8) Novex, LC2676). Las
concentraciones de las muestras de calibración variaron entre 1
\mug/ml y 25 ng/ml y las preparaciones de inhibidor de C1
purificado recombinante tenían una concentración de 500 \mug/ml.
10 \mul de cada muestra fue aplicada a 4-20%
SDS-PAGE (Tris-glicina, Novex,
EC60252) y los geles fueron hechos fluir y teñir de plata según
procedimientos estándares. Se midió la intensidad de las distintas
bandas individuales en gel usando un Multilmager Fluor S^{TM}
(BIO-RAD). La intensidad de las diferentes muestras
de calibración fue representada en un gráfico con respecto a la
cantidad de proteína cargada en el gel y la mejor curva fue ajustada
a través de los puntos. Se calculó la cantidad de impureza (ng) en
las diferentes preparaciones de inhibidor de C1 usando la curva de
calibración. El porcentaje de impureza de una muestra es la
cantidad relativa de impurezas totales en comparación con la
cantidad total de proteína cargada en el gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos relacionados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea.
Aquella ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet FR 2601034 A [0007]
- \bullet WO 9707669 A [0039] [0039] [0039]
- \bullet WO 9603051 A [0007]
- \bullet WO 9830683 A [0039] [0039] [0039]
- \bullet EP 0586909 A [0007] [0056]
- \bulletWO 9839416 A [0039] [0039] [0039] [0039]
- \bullet WO 9222320 A [0007] [0056]
- \bullet WO 9837183 A [0039]
- \bullet WO 9106650 A [0007]
- \bullet WO 9937143 A [0039]
- \bullet WO 9005188 A [0029]
- \bullet WO 9203917 A [0041]
- \bullet WO 9108216 A [0032] [0035] [0037]
- \bullet WO 9506479 A [0056]
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Inhibidor de C1 producido en la
leche de animales transgénicos
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> Inhibidor de C1 transgénico
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<140> BO 44205
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<150> EP
00200320.0-2105
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<151>
2000-01-31
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 00200810.0
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-03-07
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<150> US 60/179310
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
<15C> US 60/187580
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-03-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctctcagat cttccacagc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtcttca cctgctctgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador-1 sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgacgaatt cggcccccgg ggccgcggcc gca
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador-1 antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttgcggc cgcggccccg ggggccgaat tcg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador-2 sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgcatcg atttgcttct ttccagtctt ggcccagatg gccccatgga cgcg
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador-2 antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgacgcgtc catggggcca tctgggccaa gactggaaag aagcaaatcg atgc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador-3 sentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggccgacgg ccaacatggc cgcggccgcg atatca
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador-3 antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgtgatat cgcggccgcg gccatgttgg ccgtcgccat ct
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador-4 sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtgcggc cgctgatcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador-4 antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgactgatc agcggccgca
\hfill20
Claims (20)
1. Mamífero no humano comprendiendo:
- un segmento de ADN de codificación de un inhibidor de C1 humano operativamente enlazado a por lo menos una secuencia reguladora eficaz para promover la expresión del segmento de ADN en las células de las glándulas mamarias del mamífero y un segmento de codificación de un péptido señal funcional en las células mamarias del mamífero;
donde el segmento de ADN de
codificación del inhibidor de C1 puede ser expresado en las células
de las glándulas mamarias de una forma adulta del mamífero o un
descendiente hembra del mismo para producir el inhibidor de C1 en
la leche del mamífero no
humano.
2. Mamífero no humano según la reivindicación
1, donde la concentración del inhibidor de C1 en la leche es al
menos 1 mg/ml.
3. Mamífero no humano según la reivindicación 1
ó 2, que es un ratón, conejo, cabra, oveja, porcino o bovino.
4. Mamífero no humano según la reivindicación
3, que es un conejo o bovino.
5. Mamífero no humano según cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 4, donde el segmento de ADN recombinante es
ADNc.
6. Mamífero no humano según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, donde el segmento de ADN
recombinante es genómico.
7. Mamífero no humano según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, donde el segmento de ADN
recombinante es un ADNc genómico híbrido.
8. Mamífero no humano según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, donde el péptido señal es un
péptido señal del inhibidor de C1.
9. Mamífero no humano según cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 8, donde el segmento de ADN de codificación
del inhibidor de C1, la secuencia reguladora y el segmento de
codificación del péptido señal son insertados en la línea germinal
del mamífero.
10. Método para proveer el inhibidor de C1
comprendiendo: recuperar la leche de la forma adulta del mamífero
transgénico no humano o su descendiente hembra tal y como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9.
11. Método según la reivindicación 10,
comprendiendo además incorporar la leche en un producto
alimenticio.
12. Método según la reivindicación 10,
comprendiendo además la purificación del inhibidor de C1 de la
leche.
13. Método según la reivindicación 12, donde el
inhibidor de C1 es puro en al menos el 95%.
14. Método según las reivindicaciones 12 ó 13,
comprendiendo además la mezcla del inhibidor de C1 con un soporte
farmacéutico para la administración oral, intramuscular,
intradérmica o intravenosa.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 10 - 14, donde la concentración de proteína de
inhibidor de C1 en la leche es al menos 1 mg/ml.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 10 - 15, donde el inhibidor de C1 tiene un índice
de funcionalidad de al menos 0,9.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12 - 16, donde la purificación del inhibidor de C1
de la leche comprende las fases de:
- cargar una muestra comprendiendo el inhibidor de C1 en una columna de intercambio catiónico bajo condiciones en las que el inhibidor de C1 se une a la columna;
- eluir el inhibidor de C1 de la columna de intercambio catiónico;
- cargar el eluato en una columna de intercambio aniónico bajo condiciones en las que el inhibidor de C1 se une a la columna;
- eluir el inhibidor de C1 de la columna de intercambio aniónico;
- cargar el eluato en una columna de intercambio iónico metálico bajo condiciones en las que las proteínas residuales contaminantes se unen a la columna;
- recoger el eluato que contiene el inhibidor de C1 de la columna de intercambio iónico metálico.
18. Método según la reivindicación 17, donde la
muestra comprende además inhibidor de C1 de conejo; y el eluato de
la columna de intercambio iónico metálico tiene una proporción más
alta de inhibidor de C1 humano sobre inhibidor de C1 de conejo que
la muestra.
19. Método según la reivindicación 18, donde la
proporción es al menos 500:1.
20. Uso de inhibidor de C1 humano producido en
un método tal y como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 10 - 19 en la producción de un medicamento para
tratar un paciente que padece de o es susceptible de padecer una
deficiencia de inhibidor de C1.
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