ES2296530A1 - Compuestos lanzadera a traves de la barrera hematoencefalica y construcciones lanzadera-cargo. - Google Patents
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Abstract
Compuestos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo.Los compuestos de fórmula (I), donde R{sub,1} y R{sub,3} son H o (C{sub,1} C{sub,4}) alquilo; R{sub,2} es H o un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos de 1-4 anillos; X{sub,1} es un birradical (C{sub,1}-C{sub,8})-alquilo derivado de una cadena de carbono lineal o ramificada; y X{sub,2} es -NH-, -NH-(CH{sub,2}){sub,1-3}-COO-, -NH-(CH{sub,2})1-3-S- ó -NH-CO-(CH{sub,2}){sub,1-3}-S-, son útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica (¿blood brain barrier¿, BBB). Las construcciones BBB lanzaderas cargo son útiles como medicamentos, siendo el cargo una sustancia susceptible de formar un enlace amida o un enlace éster o un enlace disulfuro con X{sub,2}, y siendo incapaz de atravesar la barrera hematoencefálica por sí mismo.
Description
Compuestos lanzadera a través de la barrera
hematoencefálica y construcciones
lanzadera-cargo.
Esta invención se relaciona con los campos de la
medicina, investigación y diagnóstico, y más específicamente a
compuestos nuevos que actúan como lanzaderas a través de la barrera
hematoencefálica ("blood-brain barrier", BBB)
para la liberación de sustancias que no pueden atravesar la BBB por
sí mismas. También se relaciona con construcciones BBB
lanzadera-cargo y a su uso como medicamento.
Muchos de los principales problemas terapéuticos
actuales requieren el tratamiento del cerebro. Esto incluye
enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y la enfermedad
de Alzheimer, pero también enfermedades del sistema nervioso
central como la esquizofrenia, la epilepsia y el desorden bipolar.
También el cáncer cerebral, el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) y hasta ciertos aspectos de la obesidad se pueden incluir
como dianas farmacológicas localizadas dentro del cerebro. En
muchos casos existen compuestos prometedores para su tratamiento,
pero debido a sus problemas de transporte en la BBB más del 98% de
estos medicamentos potenciales no llegan a la etapa de
desarrollo.
La BBB es un filtro natural dentro del cuerpo
que sólo permite que ciertas sustancias pasen de la sangre al
cerebro. Es un mecanismo de defensa natural diseñado para mantener
las substancias nocivas fuera del cerebro. Controla la composición
del fluido extracelular del cerebro independiente de las
fluctuaciones dentro de la sangre. Es también impermeable para
muchos compuestos ambientales y medicamentos.
La base anatómica de la BBB es principalmente
las uniones herméticas en las células endoteliales de los
microvasos cerebrales. Los microvasos cerebrales forman una
membrana continua sin fenestraciones y las uniones herméticas entre
ellas son responsables de la alta resistencia eléctrica
transendotelial. Los transportadores específicos median el acceso de
ciertas moléculas importantes para el cerebro, como la glucosa,
aminoácidos aislados e iones. Otros compuestos o medicamentos son
dependientes de la difusión a través de las bicapas lipídicas de las
membranas endoteliales lo que requiere un cierto grado de
lipofilicidad de estos compuestos.
Hay diferentes campos terapéuticos donde hay la
necesidad de encontrar nuevos medicamentos que puedan cruzar la BBB
para llegar a su sitio diana. Por ejemplo, el cerebro podría servir
de reservorio oculto para la replicación viral del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH). El VIH en el cerebro y en el
líquido cerebro-espinal podría ser particularmente
resistente a la quimioterapia debido al fracaso de los medicamentos
anti-retrovirales a penetrar la BBB. El virus puede
cruzar la BBB durante la infección primaria o en un estadio tardío.
La infección resultante lleva a un número de desórdenes del sistema
nervioso central como el complejo de demencia relacionado con el
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y la encefalopatía
por VIH.
El cáncer cerebral puede ser contado entre las
enfermedades más mortales e intratables. En la actualidad el
tratamiento del cáncer cerebral consiste en cirugía, radioterapia
utilizando rayos X de alta energía u otros tipos de radiación y
quimioterapia utilizando medicamentos anticancerígenos o
citotóxicos. Estos medicamentos anticancerígenos pueden alcanzar las
células cancerígenas donde quieran que estén en el cuerpo, pero en
el caso de los tumores cerebrales no todos los medicamentos
quimioterapéuticos son apropiados, porque la mayoría de ellos no
pueden cruzar la barrera hematoencefálica (cf. D. Fortin et
al., "Enhanced chemotherapy delivery by intraarterial
infusion and blood brain barrier disruption in malignant brain
tumors", Cancer 2005, vol. 103, pp.
2606-15).
Otro campo de interés es el de las enfermedades
psiquiátricas, como la esquizofrenia. La esquizofrenia afecta casi
un 1% de la población. Aunque se están utilizando medicamentos
anti-psicóticos, hay necesidad de encontrar nuevos
y mejores medicamentos sin los efectos secundarios no deseados de
los existentes. En la búsqueda de estos medicamentos novedosos la
BBB es la barrera que el medicamento necesitará cruzar para llegar
a su sitio
diana.
diana.
Otro campo de interés es el de las enfermedades
neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson. La enfermedad
de Parkinson es uno de los desórdenes neurodegenerativos más
importantes, afectando a un 3% de la población mayor de 65 años.
Actualmente no hay terapia preventiva para la enfermedad de
Parkinson. El tratamiento actual consiste en mejorar los síntomas
motores por suplementación del neurotransmisor deficiente dopamina.
Como la dopamina no cruza la BBB, desde los 60 se está utilizando
un precursor de la dopamina, la L-dopa, en el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo,
frecuentemente se observan efectos secundarios severos al cabo de
unos pocos años de terapia con L-dopa. La
L-dopa cruza la BBB utilizando el transportador de
aminoácidos y una vez dentro se transforma en dopamina por la
descarboxilasa de L-aminoácidos aromáticos.
Por último, otro campo de interés es el de la
epilepsia, un síndrome de disfunciones episódicas del cerebro que
afecta a casi un 1% de la población general. Alrededor de un 30% de
las epilepsias se clasifican como sintomáticas ya que se asocian a
una lesión identificable del sistema nervioso central, mientras que
el resto de ellas no tienen causas identificadas. La terapia médica
actual para la epilepsia es en gran parte sintomática y está
dirigida a controlar los ataques en individuos afectados. Si lo
medicamentos antiepilépticos fallan, una lobectomía temporal, una
operación que implica extirpar la región del cerebro donde se
originan los ataques, proporciona un tratamiento alternativo. Esta
operación es muy exitosa en la mayoría de los casos, pero falla en
algunos, y además muchos individuos son reacios a someterse a
cirugía que implique extirpar partes del cerebro.
En todos estos casos, se conocen muchos
compuestos prometedores para su tratamiento, aunque, debido a sus
problemas de transporte en la BBB, no se desarrollan más. La
investigación en estos campos ha seguido varias aproximaciones.
Algunos métodos de administración de medicamentos al cerebro, sea
para terapia o para diagnosis, son técnicas invasivas, como la
administración intracraneal, la administración por alteración de la
integridad de la BBB o la disrupción osmótica. Otros métodos de
administración de medicamentos al cerebro tienen efectos
secundarios indeseados derivados de la administración a dosis
altas.
Otra aproximación es la modificación del
medicamento. Estas modificaciones incluyen por ejemplo la reducción
del tamaño del medicamento o el incremento de su lipofilicidad,
pero no siempre es posible introducir estas modificaciones. En el
caso de introducir una modificación irreversible es necesario que
no altere la actividad del medicamento una vez llegue al sitio
diana. En el caso de una modificación bioreversible, es necesario
encontrar un enzima o proceso químico que recupere el medicamento
activo una vez el profármaco está dentro del sistema nervioso
central.
Otra aproximación es la administración por
conjugación a un portador biológico. Esta estrategia usa
anticuerpos monoclonales que se unen al receptor de transferrina y
sufren una endocitosis mediada por receptor, como caballos de Troya
moleculares de los compuestos con un uso terapéutico que no pueden
cruzar la BBB por sí mismos.
Así, a pesar de todos los esfuerzos en
investigación invertidos en el pasado, todavía hay una necesidad de
encontrar sustancias con utilidad farmacológica o de diagnóstico
que puedan atravesar la BBB.
Los inventores proporcionan nuevos compuestos, a
los que se hace referencia como compuestos "lanzadera", los
cuales tienen la habilidad de atravesar la BBB y son capaces de
entrar en el cerebro fármacos u otras sustancias tales como agentes
de diagnóstico, a las que se hace referencia como "cargos",
que no pueden atravesar la BBB por sí mismas. Los compuestos
lanzadera son biodegradables y biocompatibles, no tienen toxicidad
intrínseca y antigenicidad puesto que están hechos de
aminoácidos.
Así, un primer aspecto de la presente invención
se refiere a proporcionar compuestos lanzadera de fórmula (I), o
sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o solvatos de los
mismos, incluyendo estereoisómeros o mezclas de
estereoisómeros,
donde: R_{1} y R_{3} son
radicales independientemente seleccionados entre H y
(C_{1}-C_{4})-alquilo; R_{2}
es H o un C-radical derivado de uno de los sistemas
de anillo conocidos de 1-4 anillos; siendo los
anillos saturados, parcialmente insaturados o aromáticos; siendo
los anillos aislados o parcialmente/totalmente fusionados y
teniendo 5-6 miembros; siendo cada miembro
independientemente seleccionado entre C, CH, CH_{2}, N, NH, O y S;
estando uno o más de los átomos de hidrógeno de estos miembros
opcionalmente sustituido por sustituyentes seleccionados entre
(C_{1}-C_{6})-alquilo y
(C_{1}-C_{6})-alcoxilo; X_{1}
es un birradical
(C_{1}-C_{8})-alquilo derivado
de una cadena de carbono lineal o ramificada; y X_{2} es un
birradical seleccionado entre -NH-,
-NH-(CH_{2})_{1-3}-COO-,
-NH-(CH_{2})_{1-3}-S- y
-NH-CO-(CH_{2})_{1-3}-S-.
Compuestos preferidos son aquéllos de fórmula
(I) donde los miembros del anillo en R_{2} son C, CH o CH_{2}.
Compuestos más preferidos son aquéllos donde X_{1} es -CH_{2}-
y R_{2} es fenilo, ciclohexilo, 2-naftilo o
1-pirenilo, o aquéllos compuestos donde X_{1} es
n-hexilo y R_{2} es H. Especialmente preferidos
son aquellos compuestos donde R_{1} y/o R_{3} son metilo. Todos
estos compuestos se pueden preparar a partir de
N-metil aminoácidos lo que incrementa la vida media
de las construcciones en el cuerpo, evitando la degradación por
diferentes peptidasas en la sangre o asociada a microvasos
cerebrales.
Los compuestos más preferidos son los
siguientes: el compuesto de fórmula (I) con R_{1} = H; R_{2} =
fenilo, X_{1} = CH_{2}, R_{3} = CH_{3} y X_{2} = NH; el
compuesto de fórmula (I) con R_{1} = CH_{3}; R_{2} = fenilo,
X_{1} = CH_{2}, R_{3} = CH_{3} y X_{2} = NH; y el
compuesto de fórmula (I) con R_{1} = H; R_{2} = fenilo, X_{1}
= CH_{2}, R_{3} = CH_{3} y X_{2} =
-NH-(CH_{2})-COO-. También se hace referencia a
estos tres compuestos como DKP
Phe(p-NH_{2})-N-MePhe, DKP
N-MePhe-N-MePhe(p-NH_{2}) y DKP
Phe(p-NH-CH_{2}-COOH)-N-MePhe
respectivamente, DKP indicando dicetopiperazina.
Los compuestos de fórmula (I) tienen la
capacidad de transportar al cerebro sustancias, llamadas cargos,
que no pueden atravesar la BBB por sí mismas. Así, otro aspecto de
la invención se refiere a los usos de los compuestos de fórmula (I)
como BBB-lanzaderas. El uso de estos compuestos hace
posible por ejemplo que la investigación de nuevos fármacos no esté
limitada sólo a compuestos que pueden atravesar la BBB por sí
mismos.
El mecanismo de transporte a través de la BBB de
los compuestos de fórmula (I) es por difusión pasiva y este
mecanismo es independiente de la configuración L o D de los
aminoácidos. Así, una de las ventajas principales de los compuestos
de fórmula (I) es que se pueden preparar a partir de L o D
aminoácidos, o incluso de mezclas racémicas.
Los compuestos de fórmula (I) tienen grupos
funcionales apropiados para la unión covalente de cargos
manteniendo la actividad original del cargo, hasta que alcanza el
lugar de acción. Así, otro aspecto de la presente invención es
proporcionar construcciones de fórmula (II), llamadas construcciones
BBB lanzadera-cargo,
donde R_{1}, R_{2}, R_{3},
X_{1} y X_{2} son como se define anteriormente, incluyendo las
preferencias mencionadas; y Z es un radical derivado de una
sustancia susceptible de formar un enlace amida o éster o disulfuro
con X_{2}, siendo dicha sustancia incapaz de atravesar la barrera
hematoencefálica por sí misma. Las sustancias de las que deriva el
radical Z incluyen una gran variedad de sustancias que tienen
utilidad farmacológica o de diagnóstico. Estas sustancias pueden
ser principios activos farmacéuticos, en particular agentes
antiretrovirales, agentes anticancerígenos, agentes
anti-psicóticos, agentes antineurodegenerativos o
agentes antiepilépticos. Ejemplos de principios activos
farmacéuticos son la dopamina o la baicalina. La dopamina es un
neurotransmisor clave en el sistema nervioso central, en particular
la disminución de la dopamina estriatal se asocia con condiciones
clínicas del parkinsonismo. La baicalina, es un inhibidor
flavonoide no-nucleósido de la transcriptasa
reversa ("flavonoid non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitor", NNRTI), aislado de la planta de
medicina tradicional china Scutellaria Baicalensis Georgi.
Ambos compuestos muestran propiedades interesantes pero no pueden
atravesar la BBB. En particular, como se ilustra en los ejemplos,
las construcciones de fórmula (II) permiten que tanto la dopamina
como la baicalina tengan un futuro en su camino a convertirse en
fármacos comerciales, evitando los efectos secundarios de la terapia
actual, y siendo una técnica no invasiva comparada con las
existentes.
Las sustancias de las que deriva Z también
incluyen otras sustancias que sería interesante transportar al
cerebro pero que no lo pueden hacer de manera adecuada solas, por
ejemplo los agentes de diagnóstico para "Magnetic Resonance
Imaging" (MRI). Entre los aparatos clínicos utilizados para
diagnosticar cáncer, la MRI destaca como una potente modalidad de
obtención de imágenes no invasiva ni destructiva que proporciona
imágenes internas de organismos vivos sin límite de profundidad del
análisis y con una resolución de 10-100 \mum. Es
una técnica muy valiosa ampliamente utilizada en diagnóstico e
investigación del cáncer. Para llevar a cabo la MRI se necesitan
agentes de contraste. Los agentes de contraste se pueden utilizar
como métodos de diagnóstico para enfermedades del sistema nervioso
central tales como la enfermedad de Alzheimer o el cáncer cerebral,
o como herramienta para una exploración
pre-operativa con MRI que guiará al cirujano. En
todos estos casos el agente de contraste utilizado necesita
atravesar la BBB. Ejemplos de agentes de contraste incluyen
nanopartículas magnéticas tales como nanopartículas de óxido de
hierro superparamagnético. Otros agentes de diagnóstico incluyen
colorantes o sondas fluorescentes tales como la carboxifluoresceina
y derivados, el amarillo lucifer, la rodamina o el rojo texas.
Los compuestos lanzadera de fórmula (I) pueden
estar formados por aminoácidos naturales y
no-naturales y/o sus derivados. Los compuestos de
fórmula (I) y las construcciones lanzadera-cargo de
fórmula (II) se pueden generar total o parcialmente por síntesis
química. Aminoácidos apropiados para la preparación de compuestos
de fórmula (I) están disponibles comercialmente. Los compuestos de
fórmula (I) y las construcciones de fórmula (II) se pueden preparar
fácilmente, por ejemplo, según síntesis en fase líquida o,
preferiblemente, métodos de síntesis de péptidos en fase sólida, de
los cuales hay descripciones generales ampliamente disponibles (cf.
p. ej. J.M. Stewart et al., "Solid Phase Peptide
Synthesis", 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford,
Illinois 1984; E. Atherton et al., "Solid Phase Peptide
Synthesis, A Practical Approach", IRL Press 1989; and P.
Lloyd-Williams et al., "Chemical Approaches
to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press Inc, Boca
Raton, Florida, USA, 1997); o se pueden preparar en solución, o por
cualquier combinación de fase sólida, fase líquida y química en
solución. Por ejemplo, primero completando la porción
BBB-lanzadera y entonces, después de eliminar
cualquiera de los grupos protectores presentes, por introducción
del cargo en la solución.
Los compuestos de fórmula (I) donde R_{1} y/o
R_{3} son metilo se pueden preparar a partir de N-metil
aminoácidos. Los N-metil aminoácidos utilizados se pueden
incorporar utilizando fragmentos comerciales o vía
N-metilación en fase sólida utilizando el aminoácido que no
está N-metilado correspondiente. La N-metilación de
los derivados de aminoácido se puede llevar a cabo utilizando
métodos descritos (cf. Biron et al., Science 2006,
vol. 12, pp. 213-219; Yang et al.,
Tetrahedron Letters, 1997, vol. 38, pp.
7307-7310). La N-alquilación de aminoácidos
unidos a la resina se puede llevar a cabo en tres etapas: (a)
protección y activación con cloruro de
o-nitrobencenosulfonilo (O-NBS);
(b) reacción de Mitsunobu y (c) eliminación de
O-NBS. Los grupos protectores adecuados necesarios
durante la síntesis de los compuestos BBB-lanzadera
son ampliamente conocidos en la técnica (cf. e.g., Greene et
al., "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed.,
1991 John Wiley & Sons, Inc. Somerset, N.J.) e incluyen
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), y
t-butoxicarbonilo (Boc).
Otro aspecto de la invención se refiere a las
composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad
terapéuticamente efectiva de las construcciones
lanzadera-cargo de fórmula (II) junto con cantidades
apropiadas de excipientes o portadores farmacéuticos. La persona
experta en la materia escogerá la vía de administración adecuada
mediante métodos usuales. La cantidad de la construcción a ser
administrada, la velocidad y el tiempo de administración, dependerá
de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando. La
naturaleza precisa del portador u otros excipientes dependerá de la
ruta de administración, que puede ser oral, nasal o por inyección,
p. ej. cutánea, subcutánea o intravenosa.
Una composición que comprende una construcción
según la presente invención se puede administrar sola o en
combinación con otros tratamientos, tanto simultáneamente o
secuencialmente dependiendo de la condición a tratar. Otro aspecto
de la presente invención se refiere a las construcciones de la
presente invención para uso como medicamento. En particular la
invención también se refiere al uso de las construcciones de fórmula
(II) donde Z es un radical de dopamina para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Por
lo tanto, la invención está relacionada con un método de
tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano,
que padece o es susceptible de padecer la enfermedad de Parkinson,
el método comprendiendo la administración de una cantidad
terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (II) con Z
derivado de dopamina, junto con diluyentes o portadores
farmacéuticamente aceptables.
La invención también se refiere al uso de las
construcciones de fórmula (II) donde Z deriva de la baicalina para
la preparación de un medicamento para el tratamiento del complejo
de demencia relacionado con el SIDA o de la encefalopatía por VIH.
Por lo tanto, la invención está relacionada con un método de
tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano,
que padece o es susceptible de padecer el complejo de demencia
relacionado con el SIDA o la encefalopatía por VIH, el método
comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente
efectiva de un compuesto de fórmula (II) con Z derivado de
baicalina junto con diluyentes o portadores farmacéuticamente
aceptables.
Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. A lo
largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra
"comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras
características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen
de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Los siguientes
ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende
que sean limitativos de la presente invención.
Los aminoácidos protegidos, espaciadores
bifuncionales y resinas fueron suministrados por: Luxembourg
Industries (Tel-Aviv, Israel), Neosystem
(Strasbourg, Francia), Calbiochem-Novabiochem AG
(Laüfelfingen, Suiza), Bachem AG (Bubendorf, Suiza) o Iris Biotech
(Marktredwitz, Alemania). Otros reactivos y solventes utilizados se
resumen en la Tabla 1.
Consideraciones generales sobre la
síntesis. La elongación del péptido en fase sólida y otras
manipulaciones en fase sólida se realizaron manualmente en jeringas
de polipropileno provistas de un disco poroso de polietileno. Los
solventes y reactivos solubles se eliminaron por succión. Los
lavados entre las diferentes etapas sintéticas se realizaron con
dimetilformamida (DMF) (5 x 0.5 min) y diclorometano (DCM) (5 x 0.5
min) utilizando 10 mL de solvente/g de resina cada vez.
Tests identificativos. Los tests
utilizados para la identificación y control de las síntesis fueron
los siguientes: A) Ensayo colorimétrico de Kaiser para la detección
en fase sólida de aminas primarias unidas (cf: E. Kaiser et
al., "Color test for detection of free terminal amino groups
in the solid-phase synthesis of peptides";
Anal. Biochem. 1970, vol. 34, pp. 595-598);
B) Test de De Clercq para aminas secundarias unidas a fase sólida
(cf. A. Madder et al., "A novel sensitive colorimetric
assay for visual detection of solid-phase bound
amines". Eur. J. Org. Chem. 1999, pp.
2787-2791). El ensayo de De Clercq se realiza
lavando primero una pequeña muestra de la resina (aprox. 1 mg) con
DMF (4x1 minutos) y DCM (4x1 minutos). A la resina se le añaden
diez gotas de solución del reactivo (0.002 M p-nitrofenil
éster de rojo disperso 1 en MeCN) y la mezcla resultante se
calienta a 70ºC durante 10 minutos. La solución es entonces
decantada y la resina lavada con DMF hasta que se obtiene un
sobrenadante transparente. La presencia de aminas secundarias es
indicada por bolas de resina de color rojo.
Protocolos utilizados durante la síntesis de las
construcciones de fórmula (II): Fueron sintetizadas en una escala
de 100 \mumoles utilizando los siguientes métodos y
protocolos;
Acondicionamiento inicial de la resina.
Las síntesis empiezan con el condicionado de la resina
4-metilbenzilhidrilamina (p-MBHA). Esto se
hace lavando la resina 5 veces con diclorometano (DCM) por 30
segundos cada vez seguidos de un lavado con una solución de ácido
trifluoroacético (TFA) 40% en DCM (1 x 30 s + 2 x 5 min). Este
tratamiento ácido es seguido por una etapa de neutralización con
N,N-diisopropiletilamina (DIEA) 5% en DCM (3 x 2 min) y
finalmente lavando la resina 5 veces con DCM por 30 segundos cada
vez.
Síntesis del ácido
4-hidroximetil-3-nitrobenzoico
(espaciador bifuncional Nbb). En un balón de fondo redondo
provisto con un sistema de reflujo, se colocaron 4.5 g (17.3
mmoles) de ácido
4-bromometil-3-nitrobenzoico
y se añadió una solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (135 mL).
La reacción se agitó y se mantuvo a 90-95ºC. El
avance de la reacción se monitorizó por cromatografía de capa fina
(TLC) (cloroformo/MeOH/AcOEt, 100:50:0.1, v/v) o por HPLC de una
alícuota acidificada en un gradiente lineal 0-100%
MeCN en 15 minutos en una columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x
5 \mum, 100 \ring{A}, Waters) el tiempo de retención para el
producto final: 7.12 min; tiempo de retención para el producto
inicial: 10.39 min. La reacción se completó en 30 minutos. La
solución obtenida se filtró en caliente y la reacción se paró con
HCl (12N) hasta un pH entre 1-2 y se extrajo con
AcOEt (3 x 100 mL), se combinaron las diferentes fracciones
orgánicas, se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCl y se
secaron sobre MgSO_{4} anh. El AcOEt fue evaporado al vacío. El
producto se obtuvo como un sólido amarillo pálido con un 80% de
rendimiento. El producto se caracterizó por HPLC (t_{r}) 7.12 min
(gradiente lineal 0-100% en 15 minutos),
HPLC-MS (196 Da) y R_{f} = 0,3 por TLC
(Cloroformo/MeOH/AcOEt, 100:50:0.1, v/v),
NMR-^{1}H 400 MHz en CD_{3}OD: Señales: 2H:
singulete 4.98 ppm, 1 H: doblete, 7.96 ppm (J:21 Hz), 1H: doblete
de dobletes, 8.26 ppm (4 Hz, 20 Hz), 1H: doblete, 8.56 ppm (4
Hz).
Acoplamiento del ácido
4-hidroximetil-3-nitrobenzoico
(espaciador bifuncional Nbb) a la resina p-MBHA. El
espaciador bifuncional Nbb se acopló a la resina p-MBHA
utilizando 5 equivalentes de Nbb disueltos en DCM y 5 equivalentes
de N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) como reactivo
acoplante. La mezcla se dejó reaccionar toda la noche. El solvente
se eliminó por succión, la resina lavada a fondo y la reacción fue
monitorizada con el test de Kaiser.
Eliminación del grupo Boc. La eliminación
del grupo protector tert-butoxicarbonil (Boc) se hizo con
40% (v/v) TFA en DCM utilizando 2 tratamientos de 10 minutos
cada.
Eliminación del grupo Fmoc. La
eliminación del grupo protector
9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) se hizo con 20%
(v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos
cada.
Acoplamiento del primer aminoácido al
espaciador bifuncional Nbb. Para el acoplamiento del primer
aminoácido a la resina ya modificada con el espaciador bifuncional
se utilizó el protocolo siguiente: se añadieron secuencialmente a
la resina derivado del aminoácido (4 equiv.),
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) (4 equiv.) y
dimetilaminopiridina (DMAP) (0.4 equiv.) disueltos en DCM
(1-3 ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se
repitió una vez.
Acoplamiento del segundo aminoácido. El
derivado protegido del segundo aminoácido se acopla al primer
aminoácido ya anclado a la resina utilizando el protocolo
siguiente: se añadieron secuencialmente a la resina el aminoácido
protegido (5 equiv.) en DMF (1–3 mL/g resina) y hexafluorofosfato de
(7-azabenzotriazol-1-iloxi)
tris(pirrolidin)fosfonio (PyAOP) (5 equiv) seguidos
de 15 equiv. de N,N-diisopropiletilamina (DIEA). La mezcla
se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h.
El solvente se eliminó por filtración, la resina se lavó tal como se
indica a arriba, y el acoplamiento se repitió 2 veces más. Se
comprobó la extensión del acoplamiento por el test de De
Clercq.
N-alquilación del
aminoácido. Este proceso se puede dividir en tres pasos:
(a) Protección y activación con cloruro de
o-nitrobenzenesulfonilo (O-NBS):
Para realizar la protección se añadieron a la resina 4 equiv.
O-NBS y 10 equiv. de colidina en N-metil
pirrolidona (NMP). La reacción se dejó con agitación manual
intermitente durante 1 h y este paso se repitió una vez y se
comprobó por test de Kaiser.
(b) Reacción de Mitsunobu: Los reactivos de
Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina y 10 equiv. de MeOH en THF anh.
se añadieron a la resina y se dejaron durante 1 minuto, después sin
filtrar se añadieron 5 equiv. de diisopropil azodicarboxilato
(DIAD) en THF anh. y se dejaron por otros 10 minutos.
(c) Eliminación del O-NBS: Para
proceder a la eliminación del O-NBS se añadieron 10
equiv. de \beta-mercaptoetanol y 5 equiv. de
1,8-diazabiciclo-[5.4.0]-undec-7-ene
(DBU) en NMP a la resina y la mezcla se dejó reaccionar durante 5
minutos bajo atmósfera de argón. Este proceso se repitió una
vez.
Introducción del fragmento de anclaje:
Depende de la naturaleza del fragmento de anclaje. Por ejemplo, el
fragmento se puede introducir por aminación reductiva añadiendo 5
equiv. de ácido glioxílico
(H-CO-COOH) en DMF con 1% AcOH a la
resina y dejándolo durante 30 min. El disolvente y los reactivos se
eliminaron por filtración, se lavó la resina y entonces se
añadieron 3 equiv. de NaBH3CN en DMF con 1% AcOH para realizar la
reducción durante 1 h.
Acoplamiento del cargo. Dependiendo de la
naturaleza del cargo, estará unido a la BBB lanzadera a través de
diferentes tipos de enlaces químicos.
Para cargos con un grupo COOH (p. ej.
baicalina): Se utilizó la correspondiente BBB lanzadera provista
con un grupo NH_{2} y se reaccionó con 5 equiv. de
Cargo-COOH, utilizando 5 equiv. hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-il-N-oxi-tris(pirrolidin)
fosfonio (PyBOP) y 15 equiv.
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt) como reactivos acoplantes y 15 equiv. de
N,N-diisopropiletilamina (DIEA) como base en DMF durante 2
h.
Para cargos con un grupo amina o alcohol (p. ej.
dopamina): Esta reacción se hizo en dos pasos: primero se activó el
grupo carboxílico con 5 equiv. de
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) y 5 equiv. de HOAt en
DMF durante 30 min, después se eliminó el solvente por succión y se
lavó la resina. El acoplamiento se realizó utilizando 5 equiv.
NH_{2}-Cargo en DMF. La mezcla se dejó reaccionar
con agitación manual intermitente toda la noche. El disolvente se
eliminó por filtración, se lavó la resina.
Neutralización-ciclación y
escisión en un paso: Se llevó a cabo por tratamiento de la resina
con DIEA 10% en DCM (3 x 10 minutos). Se recogió el filtrado y el
DCM se evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en H_{2}O:
MeCN (1:1) y se liofilizó.
La identidad de los diferentes compuestos
sintetizados fue confirmada utilizando la espectrometría de masas
"Matrix Assisted Laser Desorption/lonization" (MALDI)
(Instrumento: MALDI Voyager DE RP
time-of-flight (TOF) PE Biosystem)
o HPLC-MS (Instrumento: Waters modelo Alliance
2796, bomba cuaternaria, detector UVNis modelo 2487,
ESI-MS modelo Micromass ZQ y software Masslynx
versión 4.0) utilizando una columna Symmetry 300 C_{18} (150 x 3.9
mm x 5 \mum), 300 \ring{A}. 1 mL/min flujo, solventes: A:
H_{2}O con 0.1% ácido fórmico; B: MeCN con 0.07% ácido fórmico. Su
pureza fue controlada por HPLC de fase inversa utilizando una
columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters), 1 mL/min flujo, solventes: A: H_{2}O con 0.045% TFA; B:
MeCN con 0.036% TFA, Instrumento: Waters modelo Alliance 2695
formado por una bomba cuaternaria, un detector diodo array modelo
966, controlado por el software Millenium versión 3.5.
Los compuestos fueron purificados si era
necesario por HPLC fase inversa utilizando una columna Symmetry
C_{18} (100 x 30 mm x 5 \mum, 100 \ring{A}, Waters), 10
mL/min flujo, solventes: A: H_{2}O con 0.1% TFA; B: MeCN con 0.1%
TFA, Instrumento: Waters system con una bomba cuaternaria,
autoinyector Simple Manager 2700, detector UV/Vis modelo 2487 y un
Fraction collector II, controlado por el software Masslynx versión
3.5.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos siguientes se han utilizado
L-aminoácidos.
Ejemplo
1
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el
siguiente protocolo: Derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Boc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 \mumoles,
184.2 mg), DIPCDI (4 equiv., 400 \mumoles, 62 \muL) y DMAP (0.4
equiv., 40 \mumoles, 4.9 mg) disueltos en DCM
(1-3 ml/g resina) se añadieron secuencialmente a la
resina. La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por succión,
la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez.
Entonces se realizó la eliminación del Boc utilizando TFA 40% en
DCM (sin hacer el paso de neutralización). Alternativamente el
primer aminoácido puede ser unido como
Boc-Phe-OH y entonces después de
eliminar el Boc realizar la N-alquilación en la resina
utilizando el protocolo que puede dividirse en tres pasos: (a)
protección y activación con O-NBS, (b) reacción de
Mitsunobu, (c) eliminación del O-NBS.
El derivado protegido del aminoácido
(Boc-Phe(p-NH-Fmoc)-OH)
fue acoplado al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando
el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a la resina el
aminoácido protegido
(Boc-Phe(p-NH-Fmoc)-OH,
5 equiv., 500 \mumoles, 251.3 mg) en DMF (1-3
mL/g resina) y PyAOP (5 equiv., 500 \mumoles, 260.2 mg) seguidos
de 15 equiv. DIEA (1500 \mumoles, 255 \muL). La mezcla se dejó
reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El
disolvente se eliminó por filtración, la resina se lavó y el
acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del
acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq.
El grupo Boc se eliminó utilizando TFA 40% en
DCM (sin realizar el paso de neutralización). Finalmente la
neutralización-ciclación y escisión todo en un paso
se realizó por tratamiento de la resina con DIEA 10% en DCM 3 veces
durante 10 min cada una. Se recogieron los filtrados, se evaporó el
DCM bajo N_{2} y el residuo se disolvió en H_{2}O: MeCN (1:1) y
se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de
desalado utilizando la resina DOWEX MR-3 Mixed Bed
toda la noche.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando
una columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5 \mum, 100
\ring{A}, Waters), DKP
Phe(p-NH-Fmoc)-N-MePhe t_{r}: 13.17
min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): DKP
Phe(p-NH-Fmoc)-N-MePhe 545.7 Da.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el
siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a la resina el
derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Boc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 \mumoles,
184.2 mg), DIPCDI (4 equiv., 400 \mumoles, 62 \muL) y DMAP (0.4
equiv., 40 \mumoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3
ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó entonces por
succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una
vez.
Entonces se realizó la eliminación del Boc
utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización).
Alternativamente el primer aminoácido puede unirse como
Boc-Phe-OH y entonces después de la
eliminación del Boc llevar a cabo la N-alquilación en la
resina utilizando el protocolo que puede dividirse en tres pasos:
(a) protección y activación con O-NBS, (b) reacción
de Mitsunobu, (c) eliminación del O-NBS. El derivado
protegido de aminoácido del segundo aminoácido se acopló al primer
aminoácido ya anclado a la resina utilizando el protocolo
siguiente: se añadieron secuencialmente a la resina el aminoácido
protegido
(Fmoc-Phe(p-NH-Boc)-OH,
5 equiv., 500 \mumoles, 251.3 mg) en DMF (1-3
mL/g resina) y PyAOP (5 equiv., 500 \mumoles, 260.2 mg) seguidos
de 15 equiv. DIEA (1500 \mumoles, 255 \muL). La mezcla se dejó
reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El
disolvente se eliminó por filtración, se lavó la resina y el
acoplamiento se repitió 2 veces más. La extensión del acoplamiento
fue controlada por el test de De Clercq.
La eliminación del grupo Fmoc y la
ciclación-escisión se realizó en un paso utilizando
20% (v/v) piperidina en DMF, 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se recogieron los filtrados, la DMF se evaporó bajo presión reducida
y el residuo se disolvió en H_{2}O: MeCN (1:1) y se liofilizó.
Para eliminar las sales y los subproductos del Fmoc restantes el
compuesto se purificó por HPLC de fase inversa utilizando una
columna Symmetry C_{18} (100 x 30 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters).
Caracterización del producto: HPLC fase inversa:
gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una
columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters), DKP Phe(p-NH-Boc)-N-MePhe
t_{r}: 11.04 min. Espectrometría de masas
(MALDI-TOF): DKP
Phe(p-NH-Boc)-N-MePhe 424.1 Da.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Preparación de la DKP
Phe(p-NH_{2})-N-MePhe
(compuesto de fórmula (I) con R_{1} = H; R_{2} = fenilo,
X_{1} = CH_{2}, R_{3} = CH_{3}, X_{2} =
NH)
La DKP Phe(p-NH_{2})-N-MePhe
puede ser preparada fácilmente a partir de los compuestos obtenidos
en los Ejemplos 1 o 2 por desprotección del grupo Boc o Fmoc
respectivamente en solución.
En el caso de un grupo Boc, el grupo Boc se
eliminó utilizando TFA 50% en DCM durante 1 h. Entonces el DCM se
evaporó bajo presión reducida y el residuo se disolvió en H_{2}O:
MeCN (1:1) y se liofilizó.
En el caso de un grupo Fmoc, el compuesto se
disolvió en 1 mL de DMF y a la solución a 0ºC, se le añadieron 50
\muL de dietilamina (DEA). La reacción se dejó que llegará a
temperatura ambiente y se dejó a temperatura ambiente durante 3h
bajo agitación. Para eliminar la base y los subproductos restantes
del Fmoc el compuesto se purificó por HPLC fase inversa utilizando
una columna Symmetry C_{18} (100 x 30 mm x 5 \mum, 100
\ring{A}, Waters).
Caracterización del producto: HPLC fase inversa:
gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una
columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters), DKP Phe(p-NH_{2})-N-MePhe t_{r}: 6.30
min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): DKP
Phe(p-NH_{2})-N-MePhe 324.1 Da. Rendimiento
(después de la purificación): DKP
Phe(p-NH_{2})-N-MePhe 8%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Preparación de la DKP
N-MePhe-N-MePhe(p-NH_{2}) (compuesto de
fórmula (I) con R_{1} = CH_{3}; R_{2} = fenilo, X, = CH_{2},
R_{3} = CH_{3}, X_{2} =
NH)
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el
siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente a la resina el
derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Fmoc-Phe(p-NH-Boc)-OH,
4 equiv., 400 \mumoles, 201 mg), DIPCDI (4 equiv., 400 \mumoles,
62 \muL) y DMAP (0.4 equiv., 40 \mumoles, 4.9 mg) disueltos en
DCM (1-3 ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar
con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se
repitió una vez. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina
en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. La
N-alquilación de los aminoácidos unidos a la resina se hizo
siguiendo el protocolo que se puede dividir en tres pasos: (a)
Protección y activación con O-NBS: Para realizar la
protección y activación se añadieron a la resina 4 equiv.
O-NBS (400 \mumoles, 89 mg) y 10 equiv. de
colidina (1000 \mumoles, 132 \muL) en NMP. La reacción se dejó
con agitación manual intermitente durante 1 h y este paso se
repitió una vez y se controló por test de Kaiser; (b) reacción de
Mitsunobu: Los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina (500
\mumoles, 131 mg) y 10 equiv. de MeOH (1000 \mumoles, 24 \muL)
en THF anh. se añadieron a la resina y se dejaron durante 1 minuto,
después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de DIAD (500 \mumoles,
98 \muL) en THF anh. y se dejaron otros 10 minutos; (c)
Eliminación del O-NBS: Para proceder a la
eliminación del O-NBS se añadieron a la resina 10
equiv. de \beta-mercaptoetanol (1000 \mumoles,
70 \muL) y 5 equiv. de
1,8-diazabiciclo-[5.4.0]-undec-7-ene
(DBU) (500 \mumoles, 75 \muL) en NMP y la mezcla se dejó
reaccionar durante 5 minutos bajo atmósfera de argón. Este proceso
se repitió una vez.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a
la resina el aminoácido protegido
(Boc-N-MePhe-OH, 5 equiv., 500 \mumoles,
191.9 mg) en DMF (1-3 mL/g resina) y PyAOP (5
equiv., 500 \mumoles, 260.2 mg) seguidos de 15 equiv. DIEA (1500
\mumoles, 255 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación
manual intermitente durante 1 h. El disolvente se eliminó por
filtración, la resina se lavó y el acoplamiento se repitió 2 veces
más. La extensión del acoplamiento se controló por el test de De
Clercq. Los grupos Boc se eliminaron utilizando TFA 40% en DCM (sin
realizar el paso de neutralización). Finalmente la
neutralización-ciclación y escisión todo en un paso
se realizó por tratamiento de la resina con DIEA 10% en DCM 3 veces
durante 10 min cada una. Se recogieron los filtrados, el DCM se
evaporó bajo N_{2} y el residuo se disolvió en H_{2}O: MeCN
(1:1) y se liofilizó. Para eliminar las sales el compuesto se
purificó por HPLC fase inversa utilizando una columna Symmetry
C_{18} (100 x 30 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters).
Waters).
Caracterización del producto: HPLC fase inversa:
gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una
columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters), DKP N-MePhe-N-MePhe(p-NH_{2})
t_{r}: 6.39 min. Espectrometría de masas
(MALDI-TOF): DKP
N-MePhe-N-MePhe(p-NH_{2}) 337.7 Da.
Rendimiento (después de la purificación): DKP
N-MePhe-N-MePhe(p-NH_{2}) 7,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se prepararon los siguientes compuestos
dicetopiperazina DKP
Phe(p-NH-Baicalina)-N-MeX donde X:
fenilalanina (Phe) (5a), ciclohexilalanina (Cha) (5b),
2-naftilalanina (2Nal) (5c),
1-pirenilalanina (1PirenilAla) (5d),
homofenilalanina (HomoPhe) (5e), y ácido
2-amino-octanoico (Oct) (5f)
utilizando la misma metodología.
\vskip1.000000\baselineskip
Las síntesis se realizaron en una escala 100
\mumoles/cada. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la
resina ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó
el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a la resina el
derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Boc-X-OH o
Fmoc-X-OH, 4 equiv., 400 \mumoles,
Boc-Phe-OH 106.1 mg,
Boc-HomoPhe-OH 111.7 mg,
Boc-Cha-OH 108.6 mg,
Boc-Oct-OH 103.7 mg,
Fmoc-2Nal-OH 175 mg,
Fmoc-1PirenilAla-OH 204.6 mg),
DIPCDI (4 equiv., 400 \mumoles, 62 \muL) y DMAP (0.4 equiv., 40
\mumoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g
resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por succión,
la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez.
Entonces se realizó la eliminación del grupo Boc o Fmoc utilizando
TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización) o 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno
para la eliminación del grupo Fmoc. La N-alquilación del
aminoácido unido a la resina se realizó siguiendo el protocolo que
puede dividirse en tres pasos: (a) Protección y activación con
O-NBS: Para realizar la protección y activación se
añadieron a la resina 4 equiv. O-NBS (400
\mumoles, 89 mg) y 10 equiv. de colidina (1000 \mumoles, 132
\muL) en NMP. La reacción se dejó con agitación manual
intermitente durante 1 h y este paso se repitió una vez más y
controlado por el test de Kaiser; (b) reacción de Mitsunobu: se
añadieron a la resina los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv.
trifenilfosfina (500 \mumoles, 131 mg) y 10 equiv. de MeOH (1000
\mumoles, 24 \muL) en THF anh. y se dejó durante 1 minuto,
después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de DIAD (500 \mumoles,
98 \muL) en THF anh. y se dejó durante 10 minutos; (c)
eliminación del O-NBS: Para proceder a la
eliminación del O-NBS se añadieron a la resina 10
equiv. de \beta-mercaptoetanol (1000 \mumoles,
70 \muL) y 5 equiv. de DBU (500 \mumoles, 75 \muL) en NMP y
la mezcla se dejó reaccionar durante 5 minutos bajo atmósfera de
argón. Este proceso se repitió una vez.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido fue acoplado al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo.
Se añadieron secuencialmente a la resina el
aminoácido protegido
(Boc-Phe(p-NH-Fmoc)-OH,
5 equiv., 500 \mumoles, 260.3 mg) en DMF (1-3 mL/g
resina) y PyAOP (5 equiv., 500 \mumoles, 260.2 mg) seguidos de 15
equiv. DIEA (1500 \mumoles, 255 \muL). La mezcla se dejó
reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El
disolvente se eliminó por filtración, la resina se lavó y el
acoplamiento se repitió 2 veces más. La extensión del acoplamiento
se controló por el test de De Clercq. El grupo Fmoc fue eliminado
utilizando 20% (v/v) piperidina en DMF, 2 tratamientos de 10
minutos cada uno fueron utilizados para la eliminación del grupo
Fmoc. Acoplamiento del cargo con un grupo COOH (p. ej. Baicalina) a
un grupo amino: Para el acoplamiento del cargo a la
BBB-lanzadera anclada en la resina se utilizó el
siguiente protocolo: Cargo-COOH (Baicalina) (5
equiv., 500 \mumoles, 224 mg) en DMF (1-3 mL/g
resina), PyBOP (5 equiv., 500 \mumoles, 260.2 mg) y HOAt (15
equiv., 1500 \mumoles, 196 mg) se añadieron secuencialmente a la
resina seguidos de 15 equiv. DIEA (1500 \mumoles, 255 \muL). La
mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante
2 h. El disolvente se eliminó por filtración, la resina se lavó y el
acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se
controló por el test de Kaiser. El grupo Boc fue eliminado
utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización).
Finalmente la neutralización-ciclación y escisión
todo en un paso se realizó por tratamiento de la resina con DIEA 10%
en DCM 3 veces durante 10 min cada una. Se recogieron los
filtrados, el DCM se evaporó bajo N_{2} y el residuo se disolvió
en H_{2}O: MeCN (1:1) y se liofilizó. El producto es purificado
si es necesario.
Caracterización del producto: HPLC fase inversa:
gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una
columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters), compuesto 5a t_{r}: 9.30 min, compuesto 5b t_{r}: 8.65
min, compuesto 5c t_{r}: 9.48 min, compuesto 5d t_{r}: 9.50 min,
compuesto 5e t_{r}: 8.87 min, compuesto 5f t_{r}: 10.47 min.
(Confirmado por HPLC-MS). Espectrometría de masas
(MALDI-TOF): compuesto 5a: 752.2 Da, compuesto 5b:
758.1 Da, compuesto 5c: 801.4 Da, compuesto 5d: 876.3 Da, compuesto
5e: 766.1 Da, compuesto 5f: 745.4 Da. Rendimiento (después de
purificación): compuesto 5a: 1.2%, compuesto 5b: 2.4%, compuesto 5c:
2.5%, compuesto 5d: 1.4%, compuesto 5e: 1.7%, compuesto 5f:
1.1%.
Ejemplo
6
Los siguientes compuestos DKP
Phe(p-NH-CH_{2}-CO-Dopamina)-N-MeX
donde X: fenilalanina (Phe) (6a), ciclohexilalanina (Cha) (6b),
2-naftilalanina (2Nal) (6c),
1-Pirenilalanina (1PirenilAla) (6d),
homofenilalanina (HomoPhe) (6e), y ácido
2-amino-octanoico (Oct) (6f), se han
preparado utilizando la misma metodología.
Las síntesis se realizaron en una escala 100
\mumoles/cada. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la
resina ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó
el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a la resina el
derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Boc-X-OH o
Fmoc-X-OH, 4 equiv., 400 \mumoles,
Boc-Phe-OH 106.1 mg,
Boc-HomoPhe-OH 111.7 mg,
Boc-Cha-OH 108.6 mg,
Boc-Oct-OH 103.7 mg,
Fmoc-2Nal-OH 175 mg,
Fmoc-1PirenilAla-OH 204.6 mg),
DIPCDI (4 equiv., 400 \mumoles, 62 \muL) y DMAP (0.4 equiv., 40
\mumoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g
resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 30 min. El disolvente fue entonces eliminado
por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió
una vez. Entonces la eliminación del grupo Boc o Fmoc se realizó
utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización)
o bien 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10
minutos cada uno para la eliminación del grupo Fmoc. La
N-alquilación de los aminoácidos unidos a la resina se
realizó siguiendo el protocolo que puede ser dividido en tres
pasos: (a) Protección y activación con O-NBS: Para
realizar la protección y activación 4 equiv. O-NBS
(400 \mumoles, 89 mg) y 10 equiv. de colidina (1000 \mumoles,
132 \muL) en NMP se añadieron a la resina. La reacción se dejó
con agitación manual intermitente durante 1 h y este paso se
repitió una vez y se controló por el test de Kaiser; (b) reacción
de Mitsunobu: Los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina
(500 \mumoles, 131 mg) y 10 equiv. de MeOH (1000 \mumoles, 24
\muL) en THF anh. fueron añadidos a la resina y se dejaron durante
1 minuto, después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de DIAD (500
\mumoles, 98 \muL) en THF anh. y se dejó durante otros 10
minutos; (c) eliminación del O-NBS: Para proceder a
la eliminación del O-NBS 10 equiv. de
\beta-mercaptoetanol (1000 \mumoles, 70 \muL)
y 5 equiv. de DBU (500 \mumoles, 75 \muL) en NMP fueron
añadidos a la resina y la mezcla se dejó reaccionar durante 5
minuto bajo atmósfera de argón. Este proceso se repitió una vez.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido fue acoplado al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo. se añadieron a la resina el
aminoácido protegido
(Boc-Phe(p-NH-Fmoc)-OH,
5 equiv., 500 \mumoles, 260.3 mg) en DMF (1–3 mL/g resina) y
PyAOP (5 equiv., 500 \mumoles, 260.2 mg) seguidos de 15 equiv.
DIEA (1500 \mumoles, 255 \muL). La mezcla se dejó reaccionar
con agitación manual intermitente durante 1 h. El disolvente se
eliminó por filtración, la resina se lavó y el acoplamiento fue
repetido 2 veces más. La extensión del acoplamiento se controló por
el test de De Clercq test. El grupo Fmoc se eliminó utilizando 20%
(v/v) piperidina en DMF, se llevaron a cabo 2 tratamientos de 10
minutos cada uno para eliminar el grupo Fmoc. La introducción del
grupo funcional para el anclaje del cargo se realizó por aminación
seductiva. Este proceso se realiza utilizando el siguiente
protocolo: se añadió a la resina ácido glioxílico
(H-CO-COOH) (5 equiv., 500
\mumoles, 37 mg) en DMF con 1% AcOH (1–3 mL/g resina y la mezcla
se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min.
El disolvente se eliminó por filtración y la resina se lavó.
Entonces se añadió a la resina NaBH3CN (3 equiv., 300 \mumoles,
18.8 mg) en DMF con 1% AcOH y se dejó reaccionar durante 1 h. El
disolvente se eliminó por filtración y se lavó la resina. El
acoplamiento del cargo con un grupo NH_{2} (p. ej.. dopamina) a
un grupo ácido carboxílico fue realizado en dos pasos: Primero el
ácido carboxílico se activó con DIPCDI (5 equiv., 500 \mumoles,
78 \muL) y HOAt (5 equiv., 500 \mumoles, 68 mg) en DMF durante
30 min, después de esto el disolvente se eliminó por succión y la
resina se lavó. El acoplamiento se realizó utilizando 5 equiv.
NH_{2}-Cargo (dopamina) (5 equiv., 500 \mumoles,
98 mg) en DMF. La mezcla se dejó reaccionar toda la noche. El
disolvente se eliminó por filtración, la resina se lavó.
El grupo Boc fue eliminado utilizando TFA 40% en
DCM (sin realizar el paso de neutralización). Finalmente la
neutralización-ciclación y escisión todo en un paso
se realizó por tratamiento de la resina con DIEA 10% en DCM 3 veces
durante 10 min cada uno. Se recogieron los filtrados, se evaporó el
DCM bajo N_{2} y el residuo se disolvió en H_{2}O: MeCN (1:1) y
liofilizó. El producto se purifica si es necesario.
Caracterización del producto: HPLC fase inversa:
gradiente lineal de 15 a 65% MeCN en 15 minutos utilizando una
columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters), compuesto 6a t_{r}: 7.83 min, compuesto 6b t_{r}: 9.36
min, compuesto 6c t_{r}: 9.61 min, compuesto 6d t_{r}: 11.75
min, compuesto 6e t_{r}: 7.85 min, compuesto 6f t_{r}: 10.58
min. (Confirmado por HPLC-MS). Espectrometría de
masas (HPLC-MS): compuesto 6a: 516.5 Da, compuesto
6b: 522.5 Da, compuesto 6c: 566.2 Da, compuesto 6d: 640.4 Da,
compuesto 6e: 530.3 Da, compuesto 6f: 510.4 Da. Rendimiento
(después de la purificación): compuesto 6a: 10.8%, compuesto 6b:
7.2%, compuesto 6c: 10.9%, compuesto 6d: 9.6%, compuesto 6e: 9.1%,
compuesto 6f: 8.2%.
Ejemplo
7
Preparación de la DKP
Phe(p-NH-CH_{2} COOH)-N-MePhe
(compuesto de fórmula (I) con R_{1} = H; R_{2} = fenilo, X_{1}
=CH_{2}, R_{3} = CH_{3}, X_{2} =
NHCH_{2}COO)
La síntesis se realizó en una escala de 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el
siguiente protocolo: se añadieron a la resina el derivado de
aminoácido 4 equiv., 400 \mumoles,
Boc-Phe-OH 106.1 mg, DIPCDI (4
equiv., 400 \mumoles, 62 \muL) y DMAP (0.4 equiv., 40
\mumoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g
resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por succión,
la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez.
Entonces se realizó la eliminación del grupo Boc utilizando TFA 40%
en DCM (sin realizar el paso de neutralización). La
N-alquilación del aminoácido unido a la resina se realizó
siguiendo el protocolo que puede dividirse en tres pasos: (a)
protección y activación con O-NBS: Para realizar la
protección y activación se añadieron a la resina 4 equiv.
O-NBS (400 \mumoles, 89 mg) y 10 equiv. de
colidina (1000 \mumoles, 132 \muL) en NMP. La reacción se dejó
con agitación manual intermitente durante 1 h y este paso se
repitió una vez y controló por el test de Kaiser. (b) reacción de
Mitsunobu: Los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina
(500 \mumoles, 131 mg) y 10 equiv. de MeOH (1000 \mumoles, 24
\muL) en THF anh. se añadieron a la resina y se dejó durante 1
minuto, después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de DIAD (500
\mumoles, 98 \muL) en THF anh. y se dejó otros 10 minutos. (c)
eliminación del O-NBS: para proceder ala
eliminación del O-NBS 10 equiv. de
13-mercaptoetanol (1000 \mumoles, 70 \muL) y 5
equiv. de DBU (500 \mumoles, 75 \muL) en NMP se añadieron a la
resina y la mezcla se dejó reaccionar durante 5 minuto bajó
atmósfera de argón. Este proceso se repitió una vez.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo. se añadieron secuencialmente a
la resina el aminoácido protegido
(Boc-Phe(p-NH-Fmoc)-OH,
5 equiv., 500 \mumoles, 260.3 mg) en DMF (1-3 mL/g
resina) y PyAOP (5 equiv., 500 \mumoles, 260.2 mg) seguidos de 15
equiv. DIEA (1500 \mumoles, 255 \muL). La mezcla se dejó
reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El
disolvente se eliminó por filtración, la resina se lavó y el
acoplamiento se repitió 2 veces más. La extensión del acoplamiento
se controló por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó
utilizando 20% (v/v) piperidina en DMF, se utilizaron 2
tratamientos de 10 minutos cada uno para eliminar el grupo Fmoc. La
introducción del grupo funcional para el anclaje del cargo se
realizó por aminación reductiva. Este proceso se realizó utilizando
el siguiente protocolo: se añadieron a la resina el ácido glioxílico
(H-CO-COOH) (5 equiv., 500
\mumoles, 37 mg) en DMF con 1% AcOH (1-3 mL/g
resina), y la mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por filtración
y la resina se lavó. Entonces se añadió a la resina NaBH3CN (3
equiv., 300 \mumoles, 18.8 mg) en DMF con 1% AcOH y se dejó
reaccionar durante 1 h. El disolvente se eliminó por filtración y
la resina se lavó. El ácido carboxílico se modificó con un éster de
metilo en dos pasos: Primero el ácido carboxílico se activó con
DIPCDI (5 equiv., 500 \mumoles, 78 \muL) y HOAt (5 equiv., 500
\mumoles, 68 mg) en DMF durante 30 min, después de esto el
solvente se eliminó y la resina se lavó. El acoplamiento se realizó
utilizando 5 equiv. de MeOH (500 \mumoles, 8 \muL) en DMF. La
mezcla se dejó reaccionar toda la noche. El disolvente se eliminó
por filtración, la resina se lavó. El grupo Boc se eliminó
utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización).
Finalmente la neutralización-ciclación y escisión
todo en un paso se realizó por tratamiento de la resina con DIEA
10% en DCM 3 veces durante 10 min cada. Se recogieron los
filtrados, el DCM se evaporó bajo N_{2} y el residuo se disolvió
en H_{2}O: MeCN (1:1) y liofilizado. Después el éster metílico se
hidrolizó con 1.5 equiv. LiOH (150 \mumoles, 6.3mg) en
H_{2}O:MeOH (1:1) agitando a temperatura ambiente durante 30 min.
Entonces la solución se acidificó y liofilizó. El producto se
purificó.
Caracterización del producto: HPLC fase inversa:
gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una
columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters), DKP
Phe(p-NH-CH_{2}-COOH)-N-MePhe
t_{r}: 7.86 min (Confirmado por HPLC-MS).
Espectrometría de masas (HPLC-MS): DKP
Phe(p-NH-CH_{2}-COOH)-N-MePhe
381.0 Da. Rendimiento (después de la purificación): DKP
Phe(p-NH-CH_{2}-COOH)-N-MePhe
13%.
Ejemplo
8
Ensayo paralelo de permeabilidad en membrana
artificial (PAMPA). El método de evaluación escogido es el
ensayo paralelo de permeabilidad en membrana artificial (PAMPA),
que permite predecir o evaluar solo este mecanismo de transporte.
En términos generales, es un método simple, automatizable con un
alto rendimiento, que tiene un bajo coste y solo requiere una
pequeña cantidad del compuesto a probar. El método PAMPA
originariamente introducido por Kansy en Roche utiliza una membrana
artificial en forma de bicapas de fosfolípidos soportadas en un
filtro (cf. M. Kansy et al., "Physicochemical high
throughput screening: Parallel artificial membrane permeability
assay in the description of the absorption processes" J. Med.
Chem. 1998, vol. 41, pp. 1007-1010). La membrana
de fosfolípidos mimetiza la membrana celular, pero no tiene los
medios para el transporte activo o paracelular de las moléculas
fármaco. Es una herramienta muy práctica para evaluar el transporte
de compuestos por difusión pasiva. Esta técnica permite la
evaluación de compuestos puros, crudos e incluso mezclas de
compuestos.
El ensayo PAMPA se utiliza para determinar la
capacidad de las construcciones BBB lanzadera-cargo
para cruzar la BBB por difusión pasiva. La permeabilidad efectiva
de los compuestos se midió por triplicado a una concentración
inicial de 200 \muM. La solución tampón se preparó a partir de la
concentrada comercializada por plON siguiendo sus indicaciones. El
pH fue ajustado a 7.4 utilizando una solución NaOH 0.5M. El
compuesto de interés se disolvió a la concentración deseada (200
\muM).
El sándwich de PAMPA se separó y el pocillo
donador se rellenó con 200 \muL de la solución del compuesto a
estudiar. La placa aceptora se colocó en la placa donadora
asegurándose que la parte inferior de la membrana estuviera en
contacto con el tampón. Se añadieron 4 \muL de mezcla de
fosfolípidos (20mg/mL) en dodecano a cada pocillo y se añadieron a
cada pocillo aceptor 200 \muL de la solución tampón. La placa se
cubrió e incubó a temperatura ambiente en una atmósfera saturada de
humedad durante 4 horas bajo agitación orbital de 100 rpm. Después
de 4 horas, 150 \muL/pocillo de la placa donadora y 150
\muL/pocillo de la paca aceptora se transfirieron a viales de
HPLC y 100 \muL/cada muestra fueron inyectados en una columna de
HPLC fase inversa, columna Symmetry C_{18} (150 x 4.6 mm x 5
\mum, 100 \ring{A}, Waters). El transporte fue también
confirmado por espectrometría MALDI-TOF y
HPLC-MS de alícuotas de los pocillos aceptores. La
mezcla de fosfolípidos utilizada es un extracto polar de lípidos de
cerebro porcino. Composición: fosfatidilcolina (PC) 12.6%,
fosfatidiletanolamina (PE) 33.1%, fosfatidilserina (PS) 18.5%,
fosfatidilinositol (PI) 4.1%, ácido fosfatídico 0.8% y 30.9% de
otros compuestos. La permeabilidad efectiva fue calculada utilizando
la siguiente ecuación:
donde:
t tiempo (horas)
C_{A}(t) Concentración de
compuesto en el pocillo aceptor a tiempo t
C_{D}(t_{0}) Concentración de
compuesto en el pocillo donador a 0 h
Como control, se evaluó en paralelo el
transporte de propranolol y se calculó el balance de materia para
todos los compuestos estudiados para detectar si tenía lugar
retención de compuesto en los fosfolípidos.
Los diferentes compuestos se evaluaron por
ensayo PAMPA. El ensayo PAMPA solo mide el transporte por difusión
pasiva, así el transporte positivo medido para estos compuestos
indica que estos compuestos tienen un transporte positivo a través
de la BBB in vivo por difusión pasiva.
Uno debe considerar que probablemente la
BBB-lanzadera óptima puede variar según el cargo
unido.
En las Tablas 4 y 5, se puede ver como el uso de
la construcción BBB lanzadera-cargo permite que
cargos que no cruzan ellos mismos, como la baicalina y la dopamina,
pueden ahora cruzar la membrana por difusión pasiva.
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La dopamina y la baicalina son cargos difíciles
que no pueden cruzar la BBB por difusión pasiva en absoluto. Las
construcciones BBB lanzadera-cargo basadas en
N-MeOct y N-Me2Nal han sido las más
optimas para hacer cruzar cargos como la dopamina y la
baicalina.
\newpage
Para evaluar las BBB-lanzaderas
y las construcciones BBB lanzadera-cargo, se
utilizó una técnica cromatográfica, IAMC (immobilized artificial
membrane chromatography) desarrollada por Pidgeon (cf. A. Albert,
Chemical aspects of selective toxicity. Nature 1958, vol.
182, pp. 421-423). Esta técnica utiliza moléculas de
fosfolípido covalentemente inmovilizadas a partículas de sílice a
una alta densidad como fase estacionaria. Se ha utilizado para
purificar proteínas de membrana, para inmovilizar enzimas y para
predecir el transporte a través de barreras biológicas. Exhibe una
buena correlación con los ensayos celulares in vitro y es
muy práctica en términos de alto rendimiento. La interacciones de
IAMC incluyen interacciones iónicas, lipofílicas y de enlaces de
hidrógeno que se pueden combinar bajo el parámetro conocido como
fosfolípofilicidad.
Los tiempos de retención se determinaron
utilizando una columna IAMC con fosfatidilcolina (PC), el
fosfolípido más encontrado en las membranas celulares, inmovilizado
(10 x 4.6 mm, 12 \mum, 300 \ring{A}, IAM.PC.DD2 columna, Regis
Technologies Inc.). Los compuestos se detectaron por absorción de UV
a 220 nm. Los cromatogramas se obtuvieron utilizando un HPLC
trabajando isocráticamente con una fase móvil que contenía 10 mM
tampón fosfato, 2.7 mM KCI y 137 mM NaCl a pH 7.4 y 20% MeCN (flujo
0.5 mL/min). Los tiempos de retención (t_{r}) se transformaron a
factores de capacidad (k_{IAM}) según la ecuación siguiente:
k_{IAM} = (t_{r} - t_{0})/t_{0}, donde t_{r} es el tiempo
de retención del compuesto estudiado y t_{0} es el tiempo de
retención de un compuesto que no será retenido por la columna (e.g.
ácido cítrico). Como control, se estudió el propranolol.
Las BBB-lanzaderas y las
construcciones BBB lanzaderas-cargo también se
evaluaron por IAMC (Cromatografía de membrana artificial
inmovilizada), una técnica cromatográfica que mide la
fosfolipofilicidad de nuestros compuestos, su tendencia a
interaccionar con la fosfatidilcolina inmovilizada covalentemente.
Ver resultados en la Tabla 6 y 7.
La IAMC muestra que las construcciones
BBB-lanzaderas con baicalina exhiben valores de
k_{IAM} mejorados (Tabla 6) y lo mismo ocurre en el caso de las
construcciones BBB lanzadera-cargo basadas en
dopamina (Tabla 7). Estos compuestos muestran mejores
fosfolipifilicidad, llegando a factores de capacidad altos
(k_{IAM}).
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Claims (19)
1. Compuesto de fórmula (I), o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato del mismo,
incluyendo cualquier estereoisómero o mezclas de
estereoisómeros,
donde:
R_{1} y R_{3} son radicales
independientemente seleccionados entre el grupo formado por H y
(C_{1}-C_{4})-alquilo;
R_{2} es H o un C-radical
derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos de
1-4 anillos; siendo los anillos saturados,
parcialmente insaturados o aromáticos; siendo los anillos aislados
o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo 5-6
miembros; siendo cada miembro independientemente seleccionado entre
C, CH, CH_{2}, N, NH, O y S; estando uno o más de los átomos de
hidrógeno de estos miembros opcionalmente sustituido por
sustituyentes seleccionados entre el grupo formado por
(C_{1}-C_{6})-alquilo y
(C_{1}- C_{6})-alcoxilo;
X_{1} es un birradical
(C_{1}-C_{8})-alquilo derivado
de una cadena de carbono lineal o ramificada; y
X_{2} es un birradical seleccionado entre el
grupo formado por -NH-,
-NH-(CH_{2})_{1-3}-COO-,
-NH-(CH_{2})_{1-3}-S- y
-NH-CO-(CH_{2})_{1-3}-S-.
2. Compuesto según la reivindicación 1, donde
los miembros del anillo en R_{2} se seleccionan entre C, CH y
CH_{2}.
3. Compuesto según la reivindicación 2, donde
X_{1} es -CH_{2}- y R_{2} se selecciona entre el grupo
formado por fenilo, ciclohexilo, 2-naftilo y
1-pirenilo.
4. Compuesto según la reivindicación 2, donde
X_{1} es n-hexilo y R_{2} es H.
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 3-4, donde R_{1} y/o R_{3} son
metilo.
6. Compuesto según la reivindicación 3 que se
selecciona entre el grupo formado por: el compuesto de fórmula (I)
con R_{1} = H; R_{2} = fenilo, X_{1} = CH_{2}, R_{3} =
CH_{3} y X_{2} = NH, el compuesto de fórmula (I) con R_{1} =
CH_{3}; R_{2} = fenilo, X_{1} = CH_{2}, R_{3} = CH_{3}
y X_{2} = NH, y el compuesto de fórmula (I) con R_{1} = H;
R_{2} = fenilo, X_{1} = CH_{2}, R_{3} = CH_{3} y X_{2}
= NHCH_{2}COO.
7. Construcción de fórmula (II),
donde:
R_{1}, R_{2}, R_{3}, X_{1} y X_{2} son
como se definen en la reivindicación 1, y Z es un radical derivado
de una sustancia susceptible de formar un enlace amida o un enlace
éster o un enlace disulfuro con X_{2}, siendo dicha sustancia
incapaz de atravesar la barrera hematoencefálica por sí misma.
8. Construcción según la reivindicación 7, donde
los miembros del anillo en R_{2} se seleccionan entre C, CH y
CH_{2}.
9. Construcción según la reivindicación 8, donde
X_{1} es CH_{2} y R_{2} se selecciona entre el grupo formado
por fenilo, ciclohexilo, 2-naftilo y
1-pirenilo.
10. Construcción según la reivindicación 8,
donde X_{1} es n-hexilo y R_{2} es H.
11. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 9-10, donde R_{1} y/o R_{3}
son metilo.
12. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 7-11, donde Z es un radical
derivado de un principio activo farmacéutico seleccionado entre el
grupo formado por agentes antiretrovirales, agentes
anticancerigenos, agentes anti-psicóticos, agentes
antineurodegenerativos y agentes antiepilépticos.
13. Construcción según la reivindicación 12,
donde el principio activo farmacéutico es la dopamina.
14. Construcción según la reivindicación 12,
donde el principio activo farmacéutico es la baicalina.
15. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente efectiva de la construcción como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 7-14,
junto con cantidades apropiadas de excipientes o portadores
farmacéuticos.
16. Uso de un compuesto de fórmula (I) definido
en cualquiera de las reivindicaciones 1-6 como
lanzadera a través de la barrera hematoencefálica.
17. Construcción de fórmula (II) definido en
cualquiera de las reivindicaciones 7-14 para su uso
como medicamento.
18. Uso del compuesto de la reivindicación 13,
para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la
enfermedad de Parkinson.
19. Uso del compuesto de la reivindicación 14,
para la preparación de un medicamento para el tratamiento del
complexo de demencia relacionado con el SIDA o la encefalopatía por
VIH.
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| WO2005054279A1 (en) * | 2003-11-21 | 2005-06-16 | Orthogen Ag | Delivery peptides, their constructs with active agents and use |
-
2006
- 2006-09-01 ES ES200602296A patent/ES2296530B1/es active Active
-
2007
- 2007-08-28 WO PCT/ES2007/000499 patent/WO2008025867A1/es active Application Filing
- 2007-08-28 US US12/439,490 patent/US8008492B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0614886A1 (en) * | 1992-07-30 | 1994-09-14 | Drug Delivery System Institute, Ltd. | Compound capable of intracerebral residence and use thereof |
| WO2005054279A1 (en) * | 2003-11-21 | 2005-06-16 | Orthogen Ag | Delivery peptides, their constructs with active agents and use |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TEIXIDO et al., Journal of Peptide Science 2005, vol. 11, páginas 789-804. "Evolutionary combinatorial chemistry, a novel tool for SAR studies on peptide transport across the blood brain barrier. Design, synthesis and evaluation of a first generation of peptides", ver páginas 792-795. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008025867A1 (es) | 2008-03-06 |
| US8008492B2 (en) | 2011-08-30 |
| ES2296530B1 (es) | 2009-04-01 |
| US20100010011A1 (en) | 2010-01-14 |
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