ES2295433T3 - Vectores de expresion y promotores para la expresion de genes heterologos. - Google Patents
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Abstract
Un vector que comprende un promotor que puede unirse operativamente a un gen que codifica una proteína heteróloga, en el que el promotor induce la expresión de cualquier proteína heteróloga unida operativamente, en presencia de nucleótidos, pudiendo tener o no dichos nucleótidos un grupo fosfato y en el que la secuencia promotora es un promotor xapA, que comprende un sitio de unión ribosomal que tiene la secuencia siguiente: AGGAGG xxxxx o AGGAGG xxxxxx o AGGAGA xxxxx o AGGAGA xxxxxx
Description
Vectores de expresión y promotores para la
expresión de genes heterólogos.
La presente invención se refiere a nuevos
vectores y secuencias de ácido nucleico, que comprenden promotores
que se inducen por nucleótidos (con o sin un grupo fosfato). La
invención se refiere además a vectores de expresión que utilizan
elementos del operón de la xantosina y a métodos para la producción
de proteínas heterólogas.
La expresión de genes clonados introducidos en
bacterias es aún el mecanismo más ampliamente utilizado para
producir grandes cantidades de una proteína de interés para fines
diagnósticos y terapéuticos. Con el fin de producir eficazmente
proteínas en un anfitrión procariota, un promotor fuerte, regulado
es un elemento esencial del sistema de expresión. Los promotores y
los sistemas de expresión que se conocen en la técnica incluyen los
promotores pL y pR del bacteriófago lambda, que pueden regularse por
un represor sensible a la temperatura que reprime la transcripción
a partir de ese promotor a temperaturas bajas y que permite la
expresión de la proteína heteróloga mediante una inducción por la
temperatura (EP-A-41767) o
alternativamente mediante la utilización de un sistema
antirrepresor inducible que puede inducirse utilizando
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) a temperaturas más bajas, aún utilizando los promotores
fuertes pL/pR (WO 98/48025). Sin embargo, las temperaturas altas
dan lugar rutinariamente a la formación de la proteína heteróloga
como agregados insolubles, o cuerpos de inclusión, lo que requiere
posteriormente etapas de replegamiento costosas para las que se
utilizan compuestos químicos tóxi-
cos.
cos.
Otros promotores incluyen el operón lac y
derivados, tales como el promotor trp-lac o el
promotor tac (EP-A-67540) que se ha
utilizado para producir niveles altos de proteínas en E.
coli. Este promotor se induce en presencia de IPTG. Con el fin
de someter al promotor a la represión, debe utilizarse junto con un
plásmido que sobreproduzca el represor lac o en una cepa de E.
coli que produzca la proteína represora lac. Los promotores
basados en el promotor T7 (EEUU5869320) que utilizan la polimerasa
de ARN T7, expresada de manera inducible, se utilizan
rutinariamente en los laboratorios de investigación para
sobreproducir proteínas, de nuevo utilizando IPTG. Sin embargo, la
fuerza de dichos promotores puede dar lugar de nuevo a la producción
de cuerpos de inclusión, o agregados, de las proteínas
heterólogas.
Escherichia coli, una bacteria
Gram-negativa, es capaz de crecer en xantosina como
única fuente de carbono (Hammer-Jespersen et
al., 1980). Esto ocurre a través de la inducción y utilización
de genes del operón de la xantosina, que comprende al menos tres
genes, localizados a aproximadamente 52' en el cromosoma de E.
coli (Figura 1) (Seeger et al., 1995). Los genes del
operón son xapA, xapB y xapR. XapA codifica la xantosina
fosforilasa, que cataliza la degradación del enlace
N-glicosídico de las moléculas de nucleósidos lo
que resulta en una base libre y una
pentosa-1-fosfato. Las bases libres
pueden utilizarse posteriormente en las vías de recuperación de
purina y pirimidina y también como una fuente de nitrógeno (Nygaard,
1983) y la molécula de pentosa puede utilizarse posteriormente como
una fuente de carbono, lo que explica la capacidad de E.
coli de crecer en medio mínimo con xantosina. La función de la
proteína xapB no se ha resuelto totalmente pero parece ser, por su
homología con otras proteínas y por su localización celular, una
proteína de transporte de membrana, implicada casi seguro en el
transporte de nucleósidos a través de la membrana celular (Seeger,
supra). XapR muestra una homología significativa con la
familia LysR de proteínas reguladoras de la transcripción,
proteínas de unión al ADN implicadas en la activación génica
(Henikoff et al., 1988) y parece que se expresa
constitutivamente. Los genes xapA y xapB parece que se
co-expresan y la expresión de xapA se encuentra sólo
en presencia de xantosina y la proteína xapR (Seeger,
supra). La proteína xapR, si es realmente un miembro de la
familia LysR, se uniría a regiones específicas del promotor xapA,
permitiendo la unión posterior de la Polimerasa de ARN de E.
coli y la transcripción posterior de los genes xapA (y xapB).
Dichas proteínas de unión al ADN parecen reconocer una secuencia
consenso complementaria invertida ATATTGTTT (Bohannon 1989) y
parece que dicha región existe en la región del promotor xapA
(Figura 2) 120pb antes del extremo 5' del inicio de la
transcripción (CCAATACAGTTTT) y la secuencia correspondiente a 40pb
antes del extremo 5', superponiéndose a la región -35
(AAAACTGTATTGG) (Seeger, supra). Las secuencias de los genes
que comprenden el operón de la xantosina de E. coli se han
depositado en numerosas bases de datos públicas en línea, por
ejemplo, en la base de datos Genbank, accesible a través de la
página principal del Nacional Center for Biotechnology Information
(NCBI), Bethesda, Maryland, EEUU en www.ncbi.nlm.nih.gov,
utilizando los números de registro AE000328, D90869, D90870 o
X73828.
La presente invención se refiere a la expresión
de proteínas heterólogas utilizando un vector de expresión y
sistema de expresión nuevo, que evita los problemas de los cuerpos
de inclusión insolubles asociado con la inducción por la
temperatura o con promotores muy fuertes y que no requiere la
utilización de inductores tóxicos, tales como IPTG, que requerirían
procedimientos de validación costosos para verificar su ausencia
cuando se producen proteínas terapéuticas.
De acuerdo con esto, un primer aspecto de la
presente invención proporciona un vector, que comprende un promotor
que puede unirse operativamente a un gen que codifica una proteína
heteróloga, en el que el promotor induce la expresión de cualquier
proteína heteróloga unida operativamente, en presencia de
nucleótidos, pudiendo tener o no dichos nucleótidos un grupo
fosfato y en el que la secuencia promotora es un promotor XapA que
comprende un sitio de unión ribosomal que tiene lo siguiente
AGGAGGxxxxx o AGGAGGxxxxxx o AGGAGAxxxxx o
AGGAGAxxxxxx.
AGGAGAxxxxxx.
Puede que el grupo fosfato de la molécula sea un
éster fosfato. Puede haber uno o más grupos fosfato unidos.
El vector puede ser cualquiera, incluyendo un
plásmido o un bacteriófago. Preferiblemente, el vector es un vector
de expresión inducible.
La inducción del promotor se realiza mediante la
presencia de nucleótidos en el medio (habitualmente medio de
cultivo).
El término "nucleótidos sin o con un grupo
fosfato" incluye tanto nucleótidos como nucleósidos.
Según la presente invención, los nucleótidos
incluyen una o más de cualquiera de las moléculas de nucleósido que
contiene uno o más grupos fosfato unidos covalentemente a una
molécula de azúcar, que puede ser de la forma oxi, desoxi o
didesoxi. Los ejemplos de éstas incluyen: adenosina trifosfato
(ATP), guanosina trifosfato (GTP), citidina trifosfato (CTP),
timidina trifosfato (TTP) y uridina trifosfato (UTP). Las formas
didesoxi de éstas (escritas habitualmente como dATP, dCTP, dGTP y
dTTP y conocidas habitualmente como bases) forman la estructura
básica del ADN. Las formas oxi de éstas (escritas habitualmente como
ATP o rATP, CTP o rCTP, GTP o rGTP, UTP o rUTP y conocidas
habitualmente como bases de ARN) forman la estructura básica del
ARN.
Según la presente invención, los nucleósidos
incluyen uno o más de cualquier compuesto que comprende una purina
o pirimidina unida mediante un enlace N-glicosídico
a un azúcar, particularmente una molécula de azúcar de oxi o desoxi
o didesoxi-ribosa. Los ejemplos de dichos
nucleósidos incluyen las formas oxi, desoxi y didesoxi de
adenosina, guanosina, inosina, citidina, timidina, uridina,
xantosina y derivados de éstas.
La xantosina se conoce en la clasificación USPTO
como: 536/27.8. También se conoce como xantosina ó
9-beta-D-ribofuranosil
xantina (número del Chemical Abstract Service
5968-90-1) e incluye el compuesto
bien como una sal anhidra o como una sal dihidrato. Los nombres
sinónimos para la xantosina son: Xantina ribósido,
9-beta-D-ribofuranosil-9H-purina-2,6-diol
y
9-beta-D-ribofuranosil-9H-purina-2,6-(1H,3H)-diona.
Las concentraciones preferidas de nucleótidos
como inductor están en el intervalo de 0,01 a 10 mg/ml, más
preferiblemente de 0,1 a 1 mg/ml.
Puede utilizarse cualquier promotor que pueda
unirse operativamente al gen que codifica una proteína heteróloga y
en el que el promotor induce la expresión de cualquiera de dichas
proteínas heterólogas unidas operativamente, en presencia de
nucleótidos.
Las etapas para unir operativamente secuencias
de ácido nucleico son muy conocidas en la técnica y actualmente se
basan mayoritariamente en la utilización de enzimas de restricción
para cortar el ácido nucleico y de polimerasas para unir el ácido
nucleico. Los ejemplos de dichas etapas se muestran en la sección de
los ejemplos.
El promotor puede inducirse directamente o
indirectamente mediante la presencia de nucleótidos. Los promotores
adecuados incluyen los de un gen xapA. Es aceptable cualquier gen
xapA. La región promotora xapA de E. coli se muestra en la
Figura 1a. Las regiones modificadas del promotor xapA, incluidas en
la presente invención, se muestran en las Figuras 1b y 1c. Estas
regiones modificadas incluyen sitios útiles de enzimas de
restricción.
Además de esta secuencia, puede utilizarse
cualquier secuencia modificada si dicha secuencia induce la
expresión de una secuencia de ácido nucleico unida operativamente
en presencia de nucleótidos o nucleósidos. Por ejemplo, la
secuencia modificada puede ser una secuencia sustancialmente
homóloga. Una secuencia sustancialmente homóloga tiene
preferiblemente al menos 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 100% de
identidad de secuencia con la secuencia definida.
"% de identidad" es una medida de la
relación entre dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido,
determinada comparando sus secuencias. En general, las dos
secuencias que se quieren comparar se alinean para proporcionar una
correlación máxima entre las secuencias. El alineamiento de las dos
secuencias se examina y se determina el número de posiciones que
proporciona una correspondencia exacta de aminoácidos o nucleótidos
y se divide por la longitud total del alineamiento y el resultado
se multiplica por 100 para proporcionar un % de identidad. El % de
identidad puede determinarse sobre la longitud completa de la
secuencia que se quiere comparar, lo que es particularmente
adecuado para secuencias con la misma o similar longitud o para
secuencias que son altamente homólogas o sobre longitudes más
cortas definidas lo que es más adecuado para secuencias de
longitudes diferentes y con una menor homología.
Los métodos para comparar la identidad de dos o
más secuencias son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden
utilizarse los programas disponibles en el Wisconsin Sequence
Analysis Package versión 9.1 (Devereux J et al., Nucl
Acid Res 12 387-395 (1984), disponible en
Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EEUU) tales como
BESTFIT y GAP.
BESTFIT utiliza el algoritmo de "homología
local" de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics,
2:482-489, 1981) y encuentra la mejor región única
de similitud entre dos secuencias. BESTFIT es más adecuado para
comparar dos secuencias de polinucleótidos o dos secuencias de
polipéptidos que tienen una longitud diferente, asumiendo el
programa que la secuencia más corta representa una parte de la más
larga. En comparación, GAP alinea dos secuencias encontrando una
"similitud máxima" según el algoritmo de Neddleman y Wunsch (J.
Mol. Biol. 48:443-354, 1970).
GAP es más adecuado para comparar secuencias que
tienen aproximadamente la misma longitud y se espera un alineamiento
sobre la longitud total. Preferiblemente, los parámetros "Peso
del Hueco" y "Peso de la Longitud" utilizados en cada
programa son 50 y 3 para secuencias de polinucleótidos y 12 y 4 para
secuencias de polipéptidos, respectivamente. Preferiblemente, los %
de identidades y similitudes se determinan cuando las dos secuencias
que se quieren comparar están alineadas de manera óptima.
También se conocen en la técnica otros programas
para determinar la identidad y/o similitud entre dos secuencias,
por ejemplo la familia BLAST de programas (Altschul et al.,
J. Mol. Biol., 215:403-410, (1990) y
Altschul et al., Nuc Acids Res.,
25:289-3402 (1997), disponibles en el
National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda,
Maryland, EEUU y accesible a través de la página principal de NCBI
en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W.R. y Lipman
D.J., Proc. Nat. Acad. Sci., USA,
85:2444-2448 (1988), disponible como parte
del Wisconsin Sequence Analysis Package).
En relación con la presente invención,
"condiciones astringentes" se refiere a las condiciones de
lavado utilizadas en un protocolo de hibridación. En general, las
condiciones de lavado deben ser una combinación de temperatura y
concentración de sal de manera que la temperatura de
desnaturalización es aproximadamente 5 a 20ºC por debajo de la
T_{m} calculada del ácido nucleico que se está estudiando. La
T_{m} de una sonda de ácido nucleico de 20 bases o menos se
calcula en condiciones estándar (1M NaCl) como [4ºC x (G+C) + 2ºC x
(A+T)], según las reglas de Wallace para oligonucleótidos cortos.
Para fragmentos de ADN más largos, puede utilizarse el método del
vecino más próximo, que combina termodinámica sólida y datos
experimentales, según los principios mostrados en Breslauer et
al., PNAS 83:3746-3750 (1986). Las
condiciones óptimas de sal y temperatura para la hibridación pueden
determinarse fácilmente en experimentos preliminares en los que se
inmovilizan muestras de ADN en filtros y se hibridan con la sonda de
interés y se lavan en condiciones de diferentes astringencias.
Aunque las condiciones para PCR pueden ser diferentes de las
condiciones estándar, la T_{m} puede utilizarse como guía para la
estabilidad relativa esperada de los cebadores. Para cebadores
cortos de aproximadamente 14 nucleótidos, se utilizan temperaturas
de hibridación bajas de aproximadamente 44ºC a 50ºC. La temperatura
puede ser mayor dependiendo de la composición de bases de la
secuencia de cebador utilizada. Las condiciones astringentes
adecuadas son aquellas en las que se evita la hibridación no
específica. Las condi-
ciones astringentes adecuadas son 0,5xSSC/1%SDS/58ºC/30 min para una sonda de oligonucleótido de 21mer.
ciones astringentes adecuadas son 0,5xSSC/1%SDS/58ºC/30 min para una sonda de oligonucleótido de 21mer.
El vector puede comprender además un elemento
regulador con el que interaccionan los nucleótidos con el fin de
regular el promotor. El elemento regulador es preferiblemente una
secuencia de ácido nucleico. Cuando el elemento regulador es un gen
xapR, puede ser necesario que se exprese con el fin de que la
proteína expresada interaccione con los nucleótidos y regule el
promotor, para una expresión incrementada de cualquier proteína
heteróloga.
Lo más preferiblemente, según la invención, el
elemento regulador es de un gen xapR. Es aceptable cualquier gen
xapR. El gen xapR de E. coli se muestra en la Figura 2.
Además de esta secuencia xapR dada, puede
utilizarse cualquier secuencia xapR modificada que actúe de la misma
manera sobre el promotor. Por ejemplo, la secuencia modificada
puede ser una secuencia xapR sustancialmente homóloga (como se ha
definido anteriormente). Puede necesitarse que la secuencia xapR se
exprese. Las secuencias xapR modificadas adecuadas están descritas
en Jorgensen y Dandanell, 1999.
Se piensa que la proteína xapR expresada se une
a regiones específicas del promotor xapA, permitiendo la unión
posterior de la Polimerasa de ARN y la transcripción posterior de
cualquier gen heterólogo unido operativamente.
Con el fin de que xapR u otros elementos
reguladores se expresen puede ser necesario que el vector comprenda
un promotor más que está unido operativamente al elemento regulador
para controlar su expresión. Preferiblemente, dicho promotor es un
promotor constitutivo o inducible, de manera que el elemento
regulador se expresa constitutivamente. El promotor adicional puede
ser un promotor xapR o cualquier otro promotor constitutivo o
inducible conocido, tal como los promotores lac, trc, lambda pR,
lambda pL o trp.
En una alternativa, el elemento regulador que
regula la expresión por el promotor, puede estar presente pero no
como parte del vector en el que está presente el promotor inducible.
El elemento regulador (preferiblemente con promotor constitutivo o
inducible) puede estar presente en una célula como parte de otro
vector o integrado en el genoma de la célula.
El vector del primer aspecto de la invención
puede tener o no un gen unido operativamente que codifica una
proteína heteróloga. La forma del vector sin dicho gen puede
denominarse un "casete vacío" que permite la adición de
cualquiera de dichos genes para utilizarse en la expresión de ese
gen. La adición es por etapas conocidas en la técnica
(predominantemente la utilización de enzimas de restricción de corte
y polimerasas de unión), ejemplos de las cuales se proporcionan en
los ejemplos.
Cualquier gen que codifica cualquier proteína
heteróloga puede insertarse en el vector del primer aspecto de la
invención. Los ejemplos de dichos genes incluyen los que codifican
citoquinas, hormonas, quimioquinas, enzimas, antígenos, etc
(preferiblemente formas humanas). Las citoquinas incluyen
interleuquinas, por ejemplo, interleuquina-4
humana. Las hormonas incluyen la hormona de crecimiento humana. La
proteína heteróloga producida puede ser una proteína de fusión, por
ejemplo, unida a un péptido líder, para la secreción en el espacio
periplásmico o en el medio extracelular, utilizando péptidos líder
como ompA o peIB o un polipéptido secundario, unido
operativamente a la proteína heteróloga, cuya función puede ser
evitar la degradación proteolítica de la proteína heteróloga o
proporcionar una etiqueta de afinidad para la purificación o ayudar
en la solubilización de la proteína heteróloga. Los ejemplos de
dichos polipéptidos secundarios incluyen tioredoxina, proteína de
unión a maltosa, etiquetas de histidina y dichos polipéptidos
secundarios pueden incluir o no sitios de escisión para la
eliminación del polipéptido secundario mediante escisión selectiva
utilizando medios químicos o enzimáticos. Los ejemplos de éstos
incluyen bromuro de cianógenos, tripsina, enteroquinasa y Factor
Xa.
Un segundo aspecto de la invención proporciona
un vector de expresión, que comprende un ácido nucleico aislado,
que comprende un gen regulador de xapR del operón de la xantosina
junto con un promotor de un gen xapA.
El promotor xapA puede ser como se describe en
la presente memoria en la Figura 1a e incluye cualquier secuencia
sustancialmente homóloga, también como se ha descrito en la presente
memoria anteriormente.
El gen xapR puede ser como se describe en la
presente memoria en la Figura 2 e incluye cualquier secuencia
sustancialmente homóloga, también como se ha descrito en la presente
memoria anteriormente.
El ácido nucleico puede comprender también un
promotor más que está unido operativamente al gen xapR. Dicho
promotor es como se ha descrito en el primer aspecto de la
invención. Puede ser del promotor xapR o puede ser cualquier
promotor inducible o constitutivo. El promotor xapR puede ser como
se describe en la presente memoria en la Figura 2.
El vector o vector de expresión del primer y
segundo aspecto puede comprender, por supuesto, otros elementos,
tales como marcador de selección fenotípico, tal como resistencia a
antibióticos, gen o genes de replicación, etc.
Un tercer aspecto de la invención proporciona
una secuencia promotora xapA que comprende un sitio de unión
ribosomal que tiene una cualquiera de las secuencias siguientes:
AGGAGG xxxxx
AGGAGG xxxxxx
AGGAGA xxxxx
AGGAGA xxxxxx
en las que x es cualquier base.
Las bases opcionales (x) pueden ser las
descritas en el Ejemplo 2 (taccc o tatccc).
Las secuencias de ácido nucleico del tercer
aspecto pueden comprender las secuencias 5', también como se muestra
en el Ejemplo 2. Las secuencias de ácido nucleico del tercer
aspecto pueden ser parte de una secuencia promotora. La secuencia
promotora puede ser de un promotor xapA. Las secuencias de ácido
nucleico del tercer aspecto de la invención pueden ser parte de un
vector, como se ha descrito según el primer aspecto de la
invención.
Un cuarto aspecto de la invención proporciona
una célula anfitriona, que comprende uno o más vectores o secuencias
de ácido nucleico, según uno cualquiera del primer, segundo o
tercer aspecto de la invención. Dicha célula anfitriona puede ser
cualquiera, preferiblemente aquellas que pueden utilizarse en
cultivo para proporcionar una producción de proteínas a escala
comercial. Los ejemplos de dichas células anfitrionas incluyen E.
coli, Bacillus sp. y levaduras tales como
Saccharomyces y Pichia.
El vector y/o ácido nucleico se introduce en la
célula anfitriona mediante cualquier técnica, tal como
transformación, electroporación etc.
Un quinto aspecto de la invención proporciona un
método para la expresión de una proteína heteróloga, comprendiendo
el método cultivar las células anfitrionas, según el cuarto aspecto
de la invención en condiciones que inducen la expresión de la
proteína heteróloga. Dichos métodos son muy conocidos en la técnica
(véase, por ejemplo, "Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology" 2a Edición, Demain A, y Davies J, 1999). Las
condiciones adecuadas incluyen cultivar dichas células anfitrionas
transformadas en un medio de cultivo que contiene nutrientes que
cumplen los requerimientos de dichas células anfitrionas, tales como
fuentes de carbono y nitrógeno, vitaminas y elementos traza, junto
con un compuesto adecuado para seleccionar las células que contienen
el vector de expresión, que puede contener un marcador selectivo,
tal como un gen de resistencia a antibióticos. Las células se
cultivan en condiciones en las que se consigue un crecimiento
óptimo, respecto al pH, que varía típicamente de
pH6-8, temperatura, que varía típicamente de
20-42C y también con un suministro de oxígeno, que
varía de 10-50%, siendo 30% un valor óptimo típico.
Las células se crecen en dichas condiciones hasta que se alcanza
una densidad adecuada, momento en el que se añade el inductor en una
cantidad suficiente para conseguir la inducción máxima del vector
de expresión en las células y, consecuentemente, permitiendo la
expresión de la proteína de interés. Se permite que la inducción
continúe durante el tiempo óptimo, definido empíricamente, momento
en el que se puede recoger la proteína de interés.
El método puede comprender además la
purificación de la proteína heteróloga. Dichas etapas de
purificación también son conocidas en la técnica (véase, por
ejemplo, "Protein Purification", 2a Edición, Janson,
J-C y Ryden, L, 1998). Las etapas básicas para la
extracción de la proteína heteróloga producida intracelularmente
implican típicamente una etapa de rotura de las células, mediante
varios métodos, por ejemplo, homogeneización o lisis química o
congelación-descongelación o ultrasonidos. La
proteína intracelular que estaba presente en el extracto soluble
podría capturarse mediante una amplia variedad de etapas
cromatográficas muy conocidas en la técnica, por ejemplo,
cromatografía de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica, de
afinidad, cromatografía de fase reversa, de exclusión por tamaño o
de filtración en gel y ultrafiltración. Típicamente, se utilizan
etapas cromatográficas adicionales para purificar más la proteína
heteróloga de proteínas e impurezas contaminantes de la célula
anfitriona, lo que resulta en una proteína altamente purificada. La
proteína intracelular que estaba presente en la parte insoluble del
extracto, por ejemplo, presente como cuerpos de inclusión, podría
solubilizarse utilizando varios métodos conocidos en la técnica,
utilizando compuestos tales como guanidina, urea o dodecil sulfato
sódico, por ejemplo y purificarse posteriormente utilizando una o
más etapas cromatográficas como se ha mencionado anteriormente. La
proteína heteróloga que se ha producido en el espacio periplásmico,
utilizando un vector de expresión que utiliza un péptido líder como
se ha descrito anteriormente, podría liberarse de dicho espacio
utilizando un choque osmótico, para liberar los contenidos del
espacio periplásmico en el medio, utilizando compuestos tales como
sacarosa o sulfato de magnesio o lisozima/EDTA, después de lo cual
se utiliza una o más etapas cromatográficas para purificar dicha
proteína.
Un séptimo aspecto de la invención proporciona
la utilización de uno o más vectores o secuencias de ácido
nucleico, según uno cualquiera del segundo o tercer aspecto de la
invención en la producción de una proteína heteróloga.
Todas las características preferidas de los
diferentes aspectos de la invención se aplican entre sí, mutatis
mutandis.
Es el objeto de esta invención proporcionar
vectores de expresión, que comprenden un promotor y un represor
regulador, que procede de un operón para el metabolismo de la
xantosina en E. coli para la expresión de proteínas
heterólogas con valor comercial. En una realización particular de la
invención, la proteína reguladora xapR, junto con su promotor, se
aíslan e introducen en un vector de expresión junto con un gen
heterólogo unido operativamente al promotor del gen xapA. El vector
de expresión resultante se transforma en una célula anfitriona
adecuada, que se crece posteriormente en condiciones adecuadas para
conseguir un crecimiento óptimo. La expresión de la proteína
heteróloga no se produce hasta la adición de xantosina, que
posteriormente activa la proteína xapR, permitiendo que se una a la
región promotora xapA, permitiendo la expresión de la proteína
heteróloga a partir del promotor xapA.
Es un objeto adicional de esta invención
proporcionar nuevas secuencias del sitio de unión ribosomal para el
operón de la xantosina, que tienen unos niveles incrementados de
expresión de proteínas heterólogas, en los que se han hecho cambios
específicos respecto al sitio natural de unión ribosomal del operón
xapA, como se detalla en la primera realización, y en el que se ha
utilizado un método de cribado para identificar aquellas mutaciones
que resultan en unos niveles de expresión incrementados.
Es un objeto adicional de esta invención
proporcionar un método para la producción de proteínas heterólogas
utilizando un sistema de expresión inducible con nucleótidos, tales
como xantosina. En los ejemplos siguientes, se describe la
construcción de los vectores de expresión inducibles con xantosina y
la utilidad de la invención se ilustra utilizando la producción de
la hormona de crecimiento humana (hGH) y la
interleuquina-4 humana en E. coli.
Es evidente para un experto en la técnica que
pueden expresarse otros genes en el sistema descrito en la presente
memoria. Además, dicho sistema podría estar integrado en el genoma
de E. coli, u otros organismos, o podría construirse un
sistema de expresión similar utilizando genes homólogos de operones
de la xantosina de otros organismos, incluyendo géneros tales como
Salmonella, Pseudomonas, Bacillus o Streptococcus, etc.
La presente invención se describe con referencia
a las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1a muestra la secuencia de nucleótidos
de la región promotora xapA de E. coli.
(RBS - Sitio de Unión Ribosomal)
La Figura 1b muestra la secuencia de nucleótidos
de la región promotora xapA de E. coli junto con sitios de
restricción nuevos HindIII y NdeI.
La Figura 1c muestra la secuencia de nucleótidos
de la región promotora xapA de E. coli junto con sitios de
restricción nuevos HindIII y NcoI.
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos
y de aminoácidos del gen xapR de E. coli (mayúscula) y la
región promotora xapR (minúscula cursiva) junto con nuevos sitios de
restricción BamHI y KpnI.
La Figura 3 muestra los vectores pUC19x, pXap1a
y pXap1b.
La Figura 4 muestra el mapa de
pXap1b-\betagal.
La Figura 5 muestra los mapas de Xap
1a-hGH y de pXap-IL4.
La Figura 6 muestra el análisis proteico de
fracciones pXap-hGH:
(A)-SDS-PAGE;
(B)-Transferencia Western.
Carriles:
1) proteína hGH estándar; 2) Marcador de Peso
Molecular;
- \quad
- Carriles 3-7 Medio LB
3) inducción 0 h: 4) inducción 2 h; 5) inducción
3 h; 6) inducción 4 h; 7) inducción 6 h
- \quad
- Carriles 8-12 Medio Definido
8) inducción 0 h: 9) inducción 2 h; 10)
inducción 3 h; 11) inducción 4 h; 12) inducción 6 h.
En la parte A de la figura, la proteína de
interés es la que está presente más claramente y abundantemente
(indicada con una flecha) y que ha migrado con el estándar de
proteína del carril 1.
En la parte B, la Transferencia Western muestra
(mediante un anticuerpo específico) que la proteína esperada está
presente.
La Figura 7 muestra el análisis proteico de las
fracciones pXap-IL4 a 20ºC y 28ºC:
(A) SDS-PAGE; (B) Transferencia
Western.
- \quad
- Carril M: Marcadores Proteicos.
- \quad
- Carriles 1-4: 20C, inducción 0h, 2 h, 5 h y toda la noche.
- \quad
- Carriles 5-7: 28C, después de una inducción de 2 h, 5 h y toda la noche. Carril Std: IL4 estándar.
En la parte A de la figura, la proteína de
interés es la que está presente más claramente y abundantemente
(indicada con una flecha) y que ha migrado con el estándar de
proteína del carril marcado Std en la parte derecha.
En la parte B, la Transferencia Western muestra
(mediante un anticuerpo específico) que la proteína esperada está
presente.
La presente invención se describe ahora con
referencia a los ejemplos siguientes no limitativos:
\vskip1.000000\baselineskip
Los materiales y métodos utilizados se describen
a continuación y la invención se ilustra en los ejemplos. Como
apoyo a la mayoría de los métodos, se hace referencia a los libros
siguientes: Sambrook et al., (1989) "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", 2^{a} Edición y Miller, J. (1972)
"Experiments in Molecular Genetics", ambos de Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, EEUU y Dieffenbach C.W. y
Dveksler G.S. (1995); PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York.
Ejemplo
1
El gen XapR, junto con su propia secuencia
promotora, se amplificó del ADN genómico de E. coli a partir
de la cepa MG1655 (ATCC # 700926) utilizando el cebador directo xap2
(SEQ_ID1) 5'-ACGGTACCTTTTGCTATCTGC
GATTTGCG-3' y el cebador inverso xap5 (SEQ_ID2) 5'-CTCATTAAAAGGATCCGCGGCTCTGCTCTTCAG-3'. La mezcla de reacción contenía Tampón Pfu (20 mM Tris-HCl pH8,8 a 25ºC; 10 mM sulfato de amonio; 10 mM cloruro de potasio; 0,1% Tritón X-100; 0,1 mg/ml albúmina de suero bovino y 2 mM sulfato de magnesio), 0,25 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 500 ng de ADN genómico de E. coli, 50 pmoles de cada cebador, 1,25 unidades de polimerasa de ADN Pfu (MBI Fermentas) y agua hasta un volumen final de 50 \mul. El método de amplificación por PCR utilizado fue el siguiente:
GATTTGCG-3' y el cebador inverso xap5 (SEQ_ID2) 5'-CTCATTAAAAGGATCCGCGGCTCTGCTCTTCAG-3'. La mezcla de reacción contenía Tampón Pfu (20 mM Tris-HCl pH8,8 a 25ºC; 10 mM sulfato de amonio; 10 mM cloruro de potasio; 0,1% Tritón X-100; 0,1 mg/ml albúmina de suero bovino y 2 mM sulfato de magnesio), 0,25 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 500 ng de ADN genómico de E. coli, 50 pmoles de cada cebador, 1,25 unidades de polimerasa de ADN Pfu (MBI Fermentas) y agua hasta un volumen final de 50 \mul. El método de amplificación por PCR utilizado fue el siguiente:
\global\parskip0.990000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1 ciclo de:
- 94ºC
- 5 minutos de desnaturalización inicial
- 72ºC
- parada (adición de la polimerasa)
\vskip1.000000\baselineskip
14 ciclos de:
- 65ºC
- 1 minuto de hibridación (-1ºC descenso por ciclo)
- 72ºC
- 5 minutos de elongación
- 94ºC
- 1 minuto de desnaturalización
\vskip1.000000\baselineskip
19 ciclos de:
- 55ºC
- 1 minuto de hibridación
- 72ºC
- 5 minutos de elongación (+0,02 minutos de incremento por ciclo)
- 94ºC
- 1 minuto de desnaturalización
- 55ºC
- 1 minuto de hibridación
- 72ºC
- 7 minutos de elongación final
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó un fragmento de 1,2 kb
correspondiente al gen xapR. El fragmento de ADN resultante de esta
reacción de PCR se analizó en un gel de 0,8% TAE/agarosa teñido con
0,1 \mug/ml de bromuro de etidio. El fragmento se purificó
posteriormente del gel.
\vskip1.000000\baselineskip
La región promotora de xapA se amplificó por PCR
del ADN genómico de E. coli a partir de la cepa MG1655
utilizando el cebador directo xap1 (SEQ_ID3)
5'-CCAAGCTTAGCATAATTCCCTATGCCGATC-3'
y el cebador inverso fosforilado xp4 (SEQ_ID4)
5'-GAACCTGAGACATATGTATCCTTTTG-3' o
xapNco R fosforilado (SEQ_ID5)
5'-GTGGTCACCATGGGTATCCTTTTTCTG TAG
G-3' utilizando la mezcla de reacción descrita
anteriormente. El método de amplificación utilizado fue el
siguiente:
1 ciclo de:
- 94ºC
- 5 minutos de desnaturalización inicial
- 72ºC
- Parada (adición de la polimerasa)
\vskip1.000000\baselineskip
35 ciclos de:
- 65ºC
- 1 minuto de hibridación
- 72ºC
- 0,5 minutos de elongación
- 94ºC
- 1 minuto de desnaturalización
\vskip1.000000\baselineskip
1 ciclo de:
- 65ºC
- 1 minuto de hibridación
- 72ºC
- 3 minutos de elongación final
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó un fragmento de 270 pb
correspondiente al promotor xapA. El fragmento de ADN resultante de
estas reacciones de PCR se analizó en un gel de 1% TAE/agarosa
teñido con 0,1 \mug/ml de bromuro de etidio y de nuevo se
purificó del gel.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El primer vector que se construyó fue pUC19X.
Para construir este vector, pUC19 se digirió con SacI y
NdeI y las protuberancias resultantes se rellenaron
utilizando la polimerasa de ADN T4 (Promega) según las
instrucciones del fabricante. El fragmento de 2,4 kb resultante se
autoligó y se transformó en células XL1-Blue
competentes (Stratagene). Los productos de PCR purificados, el gen
xapR y el promotor xapA, como se ha descrito anteriormente, se
insertaron en pUC19X utilizando las endonucleasas de restricción
BamHI y KpnI del gen xapR y HindIII y
HincII para el promotor xapA. Los plásmidos resultantes se
denominaron pXap1a y pXap1b y se diferencian sólo por la presencia
de un único sitio NcoI o NdeI. Los mapas de la
construcción inicial y de las construcciones del vector de expresión
se proporcionan en la Figura 3.
La construcción se diseña de manera que la
proteína xapR, bajo el control de su propio promotor (incorporado
en el producto de PCR como se ha descrito anteriormente), se expresa
constitutivamente. El promotor xapA se inserta en una región
adecuada del vector y permite la clonación de genes heterólogos en
el sitio NcoI (pXap1a) o en el sitio NdeI (pXap1b).
Esto garantiza que dicho gen heterólogo esté posicionado
correctamente respecto a la región promotora del promotor xapA,
respecto al sitio de inicio de la transcripción, el sitio de unión
ribosomal y el sitio de unión de la Polimerasa de ARN del promotor,
lo que permite la expresión correcta de la proteína heteróloga
después de la inducción con xantosina, pero no la expresión no
inducida en ausencia de xantosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El gen de la
\beta-galactosidasa de E. coli
(\beta-Gal) se obtuvo inicialmente mediante la
amplificación por PCR del gen \beta-gal del ADN
genómico de E. coli a partir de la cepa MG1655 utilizando los
métodos de amplificación descritos anteriormente, con los cebadores
siguientes - \beta-Gal-1 (SEQ_ID6)
5'-ATATGGGCCCATGGATCCCGTCGTTTTAC-3'
y \beta-Gal-2 (SEQ_ID7)
5'-AGTGTGAAGCTTATTATTTTTGACACCAG-3'.
El fragmento de PCR se ligó entonces en el vector de expresión
pSE420 (Invitrogen) utilizando digestiones dobles NcoI/HindIII y se
utilizaron para transformar células DH5 químicamente competentes
(Gibco-BRL). Los clones positivos se identificaron
mediante análisis de restricción.
Posteriormente, el gen de la
\beta-galactosidasa se clonó en uno de los
vectores pXap, concretamente pXap1b, mediante digestión de
pSE420-\beta-Gal con
HindIII seguido de la obtención de extremos romos del
fragmento utilizando la enzima de Klenow y una digestión posterior
con NcoI.
El fragmento purificado se introdujo entonces en
pXap1b digerido de manera similar, para estar en marco con el
promotor xapA. Después de ligar y de transformar, los clones
positivos se identificaron por la aparición de color azul cuando se
plaquean en placas LAXX (placas de Agar LB/Ampicilina suplementadas
con 1 mg/ml de Xantosina, 80 \mug/ml de X-gal).
La xantosina induce la expresión del gen \beta-gal
que forma posteriormente un producto de color azul por la
hidrólisis del sustrato X-gal. Las colonias azules
positivas se cribaron para detectar actividad
\beta-Gal mediante el ensayo de Miller (1972) y
una de dichas colonias se denominó plásmido
pXap1b-\beta-Gal (Figura 4).
Con el fin de desarrollar vectores nuevos con
una expresión incrementada, se realizó PCR mutagénica en el
plásmido pXap1b-\beta-Gal, con el
fin de cambiar el sitio de unión ribosomal (RBS) natural y analizar
si existe una expresión incrementada. Se construyeron dos de dichos
mutantes, RBS1 y RBS2. RBS1 se diseñó para reemplazar el RBS
natural de xapA, AGGA, con la secuencia RBS consenso más fuerte
AGGAGG. RBS2 se diseñó para introducir una secuencia RBS igual de
fuerte AGGAGA, más una base adicional entre el RBS y el codón de
inicio, ya que se ha observado que la alteración del espacio entre
el RBS y el codón de inicio puede afectar los niveles de expresión,
bien de manera positiva o negativa, en otros sistemas de expresión
(Marquis et al., 1986; Chen et al., 1994).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido
pXap1b-\beta-Gal se amplificó por
PCR utilizando los cebadores siguientes:
pXapRBS1A
5'-CCTACAGAAAAAGGAGGTACCCATGGATCCCGTCG-3'
(SEQ_ID12) junto con
\vskip1.000000\baselineskip
pXapRBS1B
5'-CGGGATCCATGGGTACCTCCTTTTTCTGTAGGGTGG-3'
(SEQ_ID13) para el mutante RBS1 y
\global\parskip0.900000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
pXapRBS2A
5'-CCCTACAGAAAAAGGAGATATCCCATGGATCCCGTCGTTTTACAACG-3'
(SEQ_ID14) junto con
\vskip1.000000\baselineskip
pXapRBS2B
5'-CGACGGGATCCATGGGATATCTCCTTTTTCTGTAGGGTGGAATCTAACG-3'
(SEQ_ID15) para el mutante RBS2, en reacciones independientes,
utilizando las condiciones siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción fue como se ha descrito en
el ejemplo 1, excepto en que se utilizó 1 ng de
pXap1b-\beta-Gal purificado como
molde. Las condiciones de reacción utilizadas fueron:
1 ciclo de:
- 94ºC
- 5 minutos de desnaturalización inicial
- 72ºC
- parada (adición de la polimerasa)
\vskip1.000000\baselineskip
18 ciclos de:
- 55ºC
- 1 minuto de hibridación
- 72ºC
- 15 minutos de elongación
- 94ºC
- 1 minuto de desnaturalización
La endonucleasa de restricción DpnI
(Fermentas) se añadió a la mezcla de reacción y se incubó a 37ºC
durante 2 horas. Se utilizaron 5 \mul de la mezcla de reacción
para transformar células DH5 químicamente competentes de E.
coli y las células transformadas se plaquearon en placas LAXX
como se ha descrito anteriormente. Se cribaron varias colonias
positivas azules y se identificaron por digestión de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se crecieron cultivos de
pXap1b-\beta-Gal y de mutantes RBS
positivos, transformados en células DH5 competentes, a 37ºC en
medio definido suplementado con ampicilina y se indujeron con 1
mg/ml de xantosina (concentración final) con el fin de determinar
su actividad \beta-galactosidasa, determinada por
el ensayo ONPG (Miller, 1972) (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se piensa (Chen et al., 1994) que un
espaciado de 5 nucleótidos (nt) entre el RBS y el codón de inicio
ATG es el espaciado óptimo en los promotores de E. coli. Este
es el caso en el RBS de xapA natural. La alteración del RBS de
pXap1b-\beta-Gal con la secuencia
consenso AGGAGG resultó en unos niveles de expresión mayores (RBS1)
y, sorprendentemente, un incremento del espaciado entre la secuencia
consenso y el codón de inicio (RBS2) incrementó aún más los niveles
de expresión.
Regiones RBS de los plásmidos RBS1 y RBS2,
comparadas con el plásmido
pXap1b-\beta-Gal.
CCACCCTACAGAAAAAGGAtacccATGGATC-pXap1b-\beta-Gal
(espaciado de 5nt)
CCACCCTACAGAAAAAGGAGGtacccATGGATC-pXap1b-\beta-Gal-RBS1
(espaciado de 5nt)
CCACCCTACAGAAAAAGGAGAtatcccATGGATC-pXap1b-\beta-Gal-RBS2
(espaciado de 6nt)
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El gen de la hormona de crecimiento humana (hGH)
se amplificó por PCR a partir del plásmido phgh107
(ATCC#40011) utilizando cebadores hGH-Nde (SEQ_ID8) 5'-AAGAATCCCATATGTTCCCAACCATTCCCTTAT
CC-3' y hGH-Rev (SEQ_ID9) 5'-CGCGGATCCAAGCTTATTAGAAGCCACAGCTGCCCTCC-3'.
(ATCC#40011) utilizando cebadores hGH-Nde (SEQ_ID8) 5'-AAGAATCCCATATGTTCCCAACCATTCCCTTAT
CC-3' y hGH-Rev (SEQ_ID9) 5'-CGCGGATCCAAGCTTATTAGAAGCCACAGCTGCCCTCC-3'.
Las condiciones y los parámetros de
amplificación fueron como se ha descrito en el ejemplo 1. El
fragmento amplificado se clonó en pXap1a utilizando los sitios de
restricción NdeI/BamHI (Figura 5). La producción de
la hormona de crecimiento humana por este nuevo clon se ensayó en la
cepa TG1 de E. coli, a 30ºC tanto en medio complejo (LB)
como definido (Miller, 1992).
La expresión de hGH se indujo mediante la
adición de 1 mg/ml de xantosina a los cultivos. La presencia y la
identidad de la hormona de crecimiento humana producida se confirmó
mediante SDS-PAGE y mediante análisis por
transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal y se
detectó utilizando IgG-AP de cabra
anti-ratón de BIO-RAD según las
instrucciones del fabricante (Figura 6). Los análisis de
densitometría mostraron que la proteína hGH recombinante
representaba más del 20% de las proteínas celulares totales, incluso
después de sólo 2 horas de inducción, en los dos medios.
El gen de la interleuquina-4
(IL-4) se amplificó por PCR a partir de un plásmido
hIL-4 - pPlc299hIL4 (Dr. Nico Mertens, VIB,
Bélgica) utilizando cebadores IL4-Nde (SEQ_ID10)
5'-AAGAATCCCATATGCACAAGTGCGATAT
CACC-3' e IL4-Rev (SEQ_ID11) 5'-AAGGATCCCAAGCTTAGCTCGAACACTTTGAATATTTC-3'.
CACC-3' e IL4-Rev (SEQ_ID11) 5'-AAGGATCCCAAGCTTAGCTCGAACACTTTGAATATTTC-3'.
Las condiciones y los parámetros de
amplificación fueron como se ha descrito anteriormente (Sección:
amplificación por PCR del gen XapR). El fragmento amplificado se
clonó en pXap2a utilizando los sitios de restricción
NdeI/BamHI (Figura 5). La presencia y la identidad de
la interleuquina-4 se evaluó a 20ºC y 28ºC en medio
LB. La expresión de IL-4 se indujo mediante la
adición de 1 mg/ml de xantosina a los cultivos y se confirmó
mediante SDS-PAGE y mediante análisis por
transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal y se
detectó utilizando IgG-AP de cabra
anti-ratón de BIO-RAD según las
instrucciones del fabricante (Figura 7). Los análisis de
densitometría mostraron que la IL-4 recombinante
constituía más del 30% de las proteínas celulares totales, a las dos
temperaturas.
Bohannon, D y Soneshein, A
(1989); J Bact 171: 4718-27
Chen E, et al. (1994);
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Biotecnol S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> vectores y promotores para expresión
génica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> -
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB2002/005888
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-12-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PT102704
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-12-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggtacctt ttgctatctg cgatttgcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcattaaaa ggatccgcgg ctctgctctt cag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagcttag cataattccc tatgccgatc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacctgaga catatgtatc cttttg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtcacca tgggtatcct ttttctgtag g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatgggccc atggatcccg tcgttttac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgtgaagc ttattatttt tgacaccag
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagaatccca tatgttccca accattccct tatcc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca agcttattag aagccacagc tgccctcc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipaagaatccca tatgcacaag tgcgatatca cc
\hfill32
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<210> 11
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleotídico para
PCR
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipaaggatccca agcttagctc gaacactttg aatatttc
\hfill38
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<210> 12
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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PCR
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\hfill35
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<212> ADN
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<220>
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PCR
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\hfill49
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<211> 1232
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> CDS
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<222> (241)..(1140)
\newpage
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<400> 16
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<210> 17
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<400> 20
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Claims (19)
1. Un vector que comprende un promotor que puede
unirse operativamente a un gen que codifica una proteína
heteróloga, en el que el promotor induce la expresión de cualquier
proteína heteróloga unida operativamente, en presencia de
nucleótidos, pudiendo tener o no dichos nucleótidos un grupo fosfato
y en el que la secuencia promotora es un promotor xapA, que
comprende un sitio de unión ribosomal que tiene la secuencia
siguiente:
AGGAGG xxxxx o
AGGAGG xxxxxx o
AGGAGA xxxxx o
AGGAGA xxxxxx
2. Un vector, según la reivindicación 1, que es
un plásmido o un bacteriófago.
3. Un vector, según la reivindicación 1, que es
un vector de expresión inducible.
4. Un vector, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el promotor induce la expresión
de la proteína heteróloga unida operativamente en presencia de
xantosina.
5. Un vector, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un elemento regulador
que regula la expresión por el promotor.
6. Un vector, según la reivindicación 5, en el
que el elemento regulador es una secuencia de ácido nucleico.
7. Un vector, según la reivindicación 6, en el
que el elemento regulador es de un gen xapR.
8. Un vector, según cualquiera de las
reivindicaciones 6 ó 7, en el que un promotor adicional se une
operativamente al elemento regulador.
9. Un vector, según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que el promotor adicional es un
promotor inducible o constitutivo.
10. Un vector, según la reivindicación 8, en el
que el promotor adicional es de un promotor xapR.
11. Un vector, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, que comprende un gen que codifica una
proteína heteróloga.
12. Un vector, según la reivindicación 11, en el
que el gen que codifica una proteína heteróloga codifica una
citoquina, quimioquina, hormona, enzima o antígeno.
13. Un vector de expresión, que comprende un
ácido nucleico aislado, que comprende el gen regulador xapR del
operón de la xantosina junto con un promotor de un gen xapA.
14. Una secuencia promotora de xapA, que
comprende un sitio de unión ribosomal que tiene la secuencia
siguiente:
AGGAGG xxxxx o
AGGAGG xxxxxx o
AGGAGA xxxxx o
AGGAGA xxxxxx
15. Una célula anfitriona, que comprende uno o
más vectores o secuencias de ácido nucleico, según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Un método para la expresión de una proteína
heteróloga, comprendiendo el método cultivar las células
anfitrionas, según la reivindicación 15, en condiciones que inducen
la expresión de la proteína heteróloga.
17. Un método según la reivindicación 16, que
comprende además purificar la proteína heteróloga.
18. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 ó 17, en el que la proteína heteróloga es una
citoquina, quimioquina, hormona, enzima o antígeno.
19. Utilización de uno o más vectores o
secuencias de ácido nucleico, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 en la producción de una proteína
heteróloga.
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